Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Пектолитические ферменты высших базидиомицетов

ВАК РФ 03.00.24, Микология

Автореферат диссертации по теме "Пектолитические ферменты высших базидиомицетов"

НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ ІНСТИТУТ БОТАНІКИ їм. М.Г.ХОЛОДНОГО

ТРУТНЕВА Ірина Анатоліївна

ПЕКТОЛІГИЧНІ ФЕРМЕНТИ ВИЩИХ БАЗИДІАЛЬНИХ ГРИБІВ

03.00.24 - Мікологія

АВТОРЕФЕРАТ дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук

ргБ ОД

1 6 0"Т

На щ ‘у

Київ - 1995

Дисертацією є рукопис. ■ .' ■

Робота виконана у лабораторії біохімії та біотехнології грибів Інституту,, ботаніки їм...М.Г. Холодного. НАН України та-."лабораторії клітинної біології та біотехнології-'грибіі.-Інституту клітинної біології та генетичної інженерії НАН України.

Науковий керівник доктор біологічних наук •

• Даниляк Микола Ілліч ..

Офіційні опоненти - доктор біологічних наук • .

' . Бухало Ася Сергіївна

- кандидат біологічних наук -. ,. Айзенберг Вікторія Леонідовна

А . ' ' - • ,

Провідна організація - Донецький державний університет *'■

Захист відбудеться

........... год. на засіданні, спеціалізованої вченої ради _

Д 50.06.01 в Інституті ботаніки їм. М.Г.Холодного НАН України •’ за адресою:. 252004. Київ-4. вул. Терещенківеька.- 2 . .

З дисертацією можна ознайомитися в бібліотеці Інституту ботанЬ ки їм. М.Г.Холодного НАН України за адресою: 252025. Київ-25. вул. В.Житомирська, 28.

Автореферат розії

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради

кандидат біологічних наук

",М'.и 1995

Р

Актуальність проблеми. Ферментні системи відіграють визначальну роль у життєдіяльності вищих базидіальних грибів. Останні за допомого» екзоклітшш .ферментних комплексів розкладакть у природних умовах величезні кількості рослинних залишків, що містять складні біополімери - пектшові речовини, целюлозу, лігнін та геміцелюлози. Ці біополімери розпадаються до моноцукрів 1 служать основним джерелом живлення грибіз указаної групи. Від активності й ефективності екзоклітинких 'ферментів прямо залежать всі інші метаболічні процеси, ріст та розвиток цих грибів.

Актуальність вивчення питань, пов'язаних з функціонуванням екзокліткнних ферментів базидіальних грибів, має два аспекти. По-перше, це пізнання глибоких фундаментальних процесів перетворення основних органічних речовин ■ у природних екосистемах. “По-дру{;&,::це; використання вищих базидіальних грибів у різких біотехнологічних процесах, коли потрібно провести підбір грибів.' продуцентів та відповідних субстратів; а також опткмізувати параметри технології.

. Вибір пектолітичних ферментів вищих базидіальних грибів як об'єкта дослідження обумовлений тим. що. по-перше, базидіальні гриби є головною групою організмів-редуцентів біополімерів рослинного походження. 1. по-друге, в великому комплексі екзоклітин-них ферментних систем пектинази займають особливе місце - вони першими вступають у контакт з рослинними субстратами 1 відкривають доступ до клітинних стінок для Інших груп ферментів. Такий вибір також актуальний у зв'язку з тим. що ця група ферментів вищих базидіальних грибів досліджена найбільш слабо.

У зв'язку з цим метою даної роботи є дослідження основних властивостей, закономірностей функціонування пектиназ"вищих базидіоміцетів та можливостей їх використання в біотехнології: Для

' -4- . . ■ .

досягнення поставленої мети були Сформульовані такі задачі:. '

- вивчити пектолітичну активність культур вищих базидіоміцетів 1 встановити закономірності'Між рівнем активності та належністю до певних систематичних та екологічних груп; .

- з'ясувати вплив умов культивування грибів на продукування

пектолітичних ферментів; .. ■.

- встановити'склад пектолітичного комплексу та вивчити деякі фізико-хімічні властивості цих ферментів вищих базидіальних грибів;

- розробити науково обгрунтовані принципи використання пек-

толітичних ферментів вищих базидіальних грибів для конверсії рослинних відходів і одержання біологічно активних речовин в біотех-нологічних процесах. ■ . , . '; - . 1

Положення, що виносяться на захист:

' - активність . пектолітичних ферментів вищих базидіоміцетів

обумовлюється як систематичним положенням, так 1 належністю до певних екологічних груп грибів: ' ■ ' ,

- пектолітичні комплекси вищих базидіальних грибів при за-

гальній подібності відрізняються за кількісним складом полігалак-туроназ і пектинестераз в ізозимних спектрах та за їх фізико-хі-мічними властивостями від пектиназ дейтероміцетів; • ,

- грйби-ксилотрофи є перспективними для біоконверсіІ багато-

. ' • ' ... , - '• . _

тонажних лігноиелвлозних відходів та обробки лікарської рослинної сировини з метою одержання біологічно активних речовин. •

Наукова новизна. Подана робота є першим систематизованим дослідженням, в якому на базі'аналізу відомих даних та результатів власних порівняльних досліджень.123 штамів 68 видів вищих ■ базидіальних грибів показані основні закономірності вияву актив- ; ності пектолітичних ферментів в залежності від їх систематичної та екологічної належності. ‘ ' ' ■ ' . ' ■ .

- 5 - .

У ; ряда видів з різних систематичних груп досліджена залежність 'Між рівнем продукування пектиназ та умовами культивування грибів та підібрані, оптимальні умови для перспективних грибів -продуцентів., . ... ■ , ' .

■ Виділення та розділення комплексу, пектолітичних ферментів

• вищих базидіальних грибів дозволило встановити фракції білкових ■ форм , полігалактуроназ, екзополігалактуроказ та пектинестераз з різною, молекулярною касою та .питомою активністю, а також виділити та дослідити множинні молекулярні форми пектолітичного комплексу на прикладі таких грибів, як:.Corlolusiiirsutus (Wolf.: Fr.) Quel. ,.Ta~Calvatia utriforals,(Bull.: Pers.). Jaap..

, Розроблені та обгрунтовані, , наукові принципи підбору грибів-продуцентів та використання пектолітичних ферментів для біоконверсії рослинних'■ відходів сільського господарства та деяких ■ Інших виробництв. ;а також для одержання біологічно активних речовин'з лікарської рослинної сировини. .

: Одержані результати-.мають важливе значення дл??, розуміння фізіології вищих базидіоміцетів та обгрунтування наукових принципів біотехнологічних процесів з використанням цих грибів.

Практичне значення роботи. Робота має практичне значення для розробки, методичних основ.біотехнологічних процесів, з використанням вищих базидіальних грибів/, в ній подані відомості та науково обгрунтовані/ принципи'підбору грибів-продуцентів з певних систематичних, груп, у відповідності до:поставленої: практичної задачі.

. Досліджені;;та відібрані;штами-продуценти грибів, перспективні для одержання:пектолітичних ферментів; та.повної біоконверсії лігноце-далозної сире зики. ; • . / . : ■ . .. . ,

.Депоновано у колекцію чистих .культур .Інституту ботаніки їм. М.Г.Холодного НАН-України'такі.штами грибів, що:перспективні для біоконверсії рослинної .сировини: відходів, сільського господарства - ' ■

та інших виробництв. ; ; ■ - .

Отримані вихідні дані по оптимумам pH. температурі та ’ ‘ .* ' * . ^ \ стабільності Ферментів, що можуть бути-використані в бІотехно-'

логічних процесах для гідролізу лікарської рослинної' сировини .

для збільшення виходу біологічно активних речовин. '

Одержані наукові та практичні результати можуть бути .вико-,.

ристані' при створенні промислових біотехнологій. при написанні

монографічних робіт по ферментним системам та, біотехнології

грибів та при підготовці курсів лекцій для студентів ВУЗІВ;

Апробація роботи. Матеріали роботи доповідались та обговорю- .

вались на VI конференції молодих вчених-ботаніків України-

(м.Київ. 1979), на-Всесоюзному симпозіумі ’'Применение,и получение

иммобилизованных'ферментов в научных исследованиях, промышленное-

та и медицине "(Ленинград. 1930), на Всесоюзній конференції "Ми-

целиальные грибы (физиология, биохимия, биотехнология)"(Пущи-,..

А , '■ ■ V.- ,

но,1982). на II Всесоюзній нараді "Производство высших сьедобных грибов в СССР". (Чернигів, 1985), на X конгресі мікологів Європи ' (Таллінн. 1989), на III Всесоюзній конференції "Биосинтез целлюлозы и других компонентов клеточной стенки"( Казань,. 1990), на , наукових засіданнях відділу мікології Інституту ботаніки їм. М.Г. Холодного НАН України, на засіданнях мікологічної секції УБТ. . ’ \ ■ Публікації результатів досліджень. За матеріалами ди- . сертації опубліковано 45 робіт: з них 1 монографія» 9 статей. • нові елементи роботи захищені 7 авторськими свідоцтвами,СРСР на" винаходи. В монографії "Ферментные'системы.вусших базидиальных . ' грибов" дисертантом написані стор. 137-163, 176-1ВЗ, 221-228. У . співавторстві з Л. Г. Дудченко опубліковані статті уУкр.; ботан.. ■. , журналі, 'а ' також подані матеріали на конференції •та ,з‘Дзди УБТ та ряд інших, які написані у результаті спільної творчої участі ; , співавторів. В роботах, що зроблені у співавторстві-з іншими’,. .

І. А.Трутнева виконувала, планувала та обговорювала ту частину, що стосувалася пектолітичних ферментів.

Структура і об'єм роботи. Дисертація об'ємом 162 сторінок складається з вступу. 6 розділів, висновків, списку використаної літератури. Ілюстрована 2і таблицями та ЗО рисунками.

., Розділ І. ПЕКТОЛІТИЧНІ ФЕРМЕНТИ ЯК СКЛАДОВА ЧАСТИНА-Ф5РМЕН-. ■ ' ' ТНИХ СИСТЕМ ВИЩИХ БАЗИДІАЛЬНИХ ГРИБІВ ’

. Ферментні системи вищих базидіальних грибів відіграють основну роль в біодеструкції природних складних субстратів. Для-більшості вищих базидіоміцетів характерним субстратом є деревина та рослинні залишки лісної підстилки. Здатність цих організмів до деструкції „висохомолекулярних субстратів зберігається в умовах культури. Вони синтезують та виділяють у середовище фер-мейтні системи., що каталізують перетворення таких рослинних бґ~ • ополімерів як полісахаріди, білки., лігнін. /В біодеструкції '-цих субстратів рослинного походження велике значення.мають цёлюла-•зи^ ксиланази. хітинази, лігнолітичні, пектолітичні ферменти,'а також протеїнази. Пектолітичні ферменти відіграють ключову роль в цих'-процесах.,.тому що вони є одними'з перших які вступають в контакт з субстратом. ’ ' • . ; '

. Пектолітичний комплекс добре вивчений у фітопатогенних грибів. тоді як.ретельних ,досліджень по; пектолітичним ,ферментам вищих базидіальних грибів'до цього'"часу не проводилося. • г , ; ; Розділ дї.г - об'єкти =та. методи досліджень -

• ; Об'ектада;1 досліджень, були культури вищих базидіальних грибів; ^йфШрк . ^Зі.'Ш^екцІІ ВІН РАН1 їм. СВ./її Комарова. Інституту

' і * ь'' ' ' ’ * ' ч ^ " ’ ~ ' ’ 4 ' ‘ • ■” ' ’

ботаніки Дм.',К.Г. Холодного НАН Україні!, Інституту мікробіології чеської'.; Ай;, всьогі.ігз штама; 68 видів з порядків ВоІеШеа.. Адагісаіез'. ; - - ;дрпуї і-орізбгаіез./Яиззиіагез та групи порядків сазізгопусисез: в. роботі ' прийняті ?а основу системи М.Мозера:

• ' - а - ■ .

(Moser,1983) для агарикальних грибів та В.Юліха (Jullch,1984) для афілофоральних та гастероміцетальних грибів.

Вирощування чистих культур вищих.базидіальних грибів'здійснювали. на рідких поживних середовищах глибинним- методом та методом поверхневої плівки. За основу прийняте поживне середовище Норкранс (Norkrans, 1950) з різними модифікаціями. ^ .

Для визначення пектинестеразної активності використовували титрометричний метод Кертеца в модифікації Ліфішіць { Унифицирование методов— 1967). Активність ендополігалактуронази визначали віскозиметричним методом, активність екзополігалактуронази методом,що базується на урахуванні збільшейня вмісту відновних груп у , результаті дії Ферментів ! ( Унифицирование методов —1967). Визначення білка проводили за методом Лоурі (Lowry & аі.. 1952). Вибіркову сорбцію ферментного комплексу з культу-рольного фільтрату здійснювали за допомогою карбоксильного каті-оніту., типу "кмт (біокарб Т). Очищення ферментних препаратів від пігментів та баластного білка проводили на аніоніті ФАФ (Самсонов и др.., .1975). , . ''

Пєльхроматографік) ферментних препаратів здійснювали на уль- , трагелі :,АСА";54.,,,Диск-електрофорез в поліакріламідному гелі про-. . водили за.-методом Девіса (Маурер. 1971).. Аналітичне Ізофокусуван-ня у градієнті:густини сахарози здійснювали у колонці, лінійний, градієнт за допомогою суміші амфолітів. -Характер,

ристику . вищистаних пектинів давали за методикою Г. В. БузіноІ -(Бузина,i960)-- . ‘ "

Лікарську; -сировину обробляли ферментним препаратом .з Coriolus hirsute .нестерильно. Ефірну олій м'яти одержували ме-1, тодом дистиляції -3--водяним паром у апараті Гінзберга, (Ермаков и : др., 1972). Визначення діосгеніну проводили фотометрично (Пасеш-;' 'ниченко и др.. 1972). контроль якості діосгеніну проврдали'за ‘

допомогою хроматографії( Фонин и др.. 1976).

Характеристика дії ферментного препарату з C.hirsutus на вихід виноградного соку та його технологічні показники проведена за методами технохіміч.і&го та технологічного контролю в виноробстві ( Методы технохимического _______ 1980). •

Математична обробка результатів експерименту складалась в оцінці найбільш вирогідного значення величини, яка вивчалася. Обробка даних проводилась згідно прийнятим методам статистичної обробки експериментів (Кокунин. . 1975; Маслов. 1978). В роботі 'приведені статистично достовірні результати.

Розділ III. ПОРІВНЯЛЬНЕ ДОСЛІДЖЕННЯ ПЕКТОЛІТИЧНОІ АКТИВНОСТІ ВИЩИХ БАЗИДІАЛЬНИХ ГРИБІВ РІЗНИХ СИСТЕМАТИЧНИХ ТА ЕКОЛОГІЧНИХ ГРУП

• . Проведене порівняльне , дослідження . грибів 'з порядків

; Boletal^s;/ Agarlcales. Russulales. Aphyllophorales, а також -групи порядків Gasteromycetes показало, що активність пектолі-тичних ферментів має певну залежність від систематичного положення грибів. Найбільша активність пектиназ встановлена у представників порядку Agarlcales (роди Panus. Phollota) та порядку Aphyllophorales ; (роди Corlolus, Funalla. Fomltopsls. Laetiporus, Trametes). Особливий інтерес викликає рід Corlolus. Види С. hlrsutus. С.pubescens.. С.versicolor, C.zonatus при знач. них штамових відмінностях мають високий рівень активності позаклітинних полігалактуроназ. Представники інших родів порядку Agarlcales. а також порядків Boletales, Russulales. та груш порядків Gasteromycetes-мали значно менший рівень активності пек. - ’ ^ • - . • ■ ' ‘ тиназ. . . _ ■ ' „• •' - ■ ■ ■ ■ .

. Екологічна належність грибів є визначальним фактором, .який обумовлює активність: пектолітичкого комплексу. У ксилотрофів порядків Agarlcales та Aphyllophorales була встановлена найвища

'активність пектолітичних ферментів, що добре узгоджується з положенням в екосистемах. Деревина є одним з важкодоступних джерел поживних речовин для мікроорганізмів, тільки наявність ферментних систем, в тому числі пектолітичного комплексу, забезпечує доступ до складного, проте найбільш поширеного у природі, комплексу біополікерів. Підстилкові сапротрофи та мікорізні гриби мають незначний рівень активності пектиназ. Пектолітичні ферменти ймовірно відіграють для них більшу роль в Інших метаболі-тичних процесах," ніж в утилізації субстратів. Представники цих екологічних груп грибів використовують легкодоступні та модіфі-ковані субстрати 1 у них немає необхідності у продукуванні високоактивних позаклітинних ферментів, _ ' . ' : .. . - .

В результаті відібрало ряд штамів, що є перспективними для подальшої роботи:, з порядку Agarlcales - Panus tigrlnus, шт, 122. Pleurotus cornucoplae. шт. 1.14, Pfiollota adlposa, шт. 163. Phollota squarrosa, шт. 60. Armlllariella meilea. шт, 125, a no-, рядку Apftyllophorales - Phelllnus. -pini. m. 88, Foraltopsls plnlcola. шт. 138, 139. 141. 142; Funalla trogll. шт. 96, 97.

Gloephyllum sepiarlura. шт. 8. 35, Laetlporus sulphureus. шт. 13. 14, 15, 84. Oxyporus obducens. шт. 85, Polyporus brumalIs,

шт. 105, Traoietes suaveolens. шт. 23.24. Corlolus hlrsutus. ШТ. 18. 19. • 20. 113.' 136. 137, Corlolus pubescens. ШТ. 17.

Corlolus versicolor. ШТ. 7, 44. 94. 129, 131, 132. Corlolus.

zonatus. шт. 21. 22. Irpex lacteus. шт. 144, з Gasteromycetes -Calvatla utrlformis, шт. 57. . -' •. - - ■ ■

Розділ IY. ВПЛИВ УМОВ КУЛЬТИВУВАННЯ НА ПРОДУКУВАННЯ ПЕКТОЛІ-. ТИЧНИХ ФЕРМЕНТІВ &ИЩИМИ БАЗИДІАЛЬНИМИ ГРИБАМИ .

Умови культивування * продуцентів поряд з підбором активних: штамів є одним-з найважливіших факторів регуляції їх активності. Нами проведено дослідження.залежності активності пектолітич-

них ферментів від таких Факторів, як спосіб культивування, джерела вуглецю та азоту, підбір дешевих субстратів для продукування цих ферментів. -

Дослідження . різних способів культивування для одержання пектолітичних ферментів показали, що глибинний спосіб культивування дозволяє досягти більш високого рівня цих ферментів. Це обумовлено, в основному, кращою аерацією та доступністю компонентів середовища порівняно з методом поверхневої плівки.

; Легкодоступні джерела вуглецю - моаоцукри та дицукри. сприяли накопиченню . біомаси міцелію при. незисокій активності пекти-наз. Буряковий пектин, його гіохідні та субстрати з високим вмістом пектину, сприяли продукуванню активного комплексу пектолітич-них ферментів. Відмічена пряма залежність активності ендополіга-лактуроназ від кількості карбоксильних груп в пектинах. Важко; гідролізуємі субстрати, такі як: тирса деревини, лігнін, солома та інші , дозволяли отримати порівняно активні пектолітичнї'. фер-. менти при . одержанні різних Ферментних препаратів комплексної : дії. : : / • '

Гриби-ксилотрофи здатні здійснювати біодеструкцію складних рослинних , комплексів біополімерів. тому їх можна використовувати як субстрат для культивування грибів з метою'одержання фер-, ментких препаратів. Використання цих джерел сировини дає можливість. біоконвєрсіГбагатотонажних відходів , дозволяє розширити сировинну базу, мікробіологічного продукту та вирішити екологічні проблеми» Пов'язані з цими відходами. '

. ; РОЗДІЛ 5. 00БЛИВ0СТІ ФЕРМЕНТНОГО ПЕКТОЛІТЙЧНОГО КОМПЛЕКСУ ; ‘' • ВИЩИХ БАЗИДІАЛЬНИХ ГРИБІВ -

. Для характеристики пектолітичного комплексу ферментів з ви-

\щнй:' базидіалшюс грибів согіоіив МтэиШэ та Саіуаїіа

- -ЛІ* ■ • ■. - • . . ' : ' •

иігіГогаіз нами дана оцінка ступеня гетерогенності та компонен-

тного складу в порівнянні з промисловим ферментним препаратом пектофоєтидіном з Aspergillus' foetldus. Ферментні препарати з вищих базидіальних грибів отримані спиртоосадженням з культу-ральних фільтратів та попередньо очищені від пігментів та баластного білка на аніоніті ФАФ, а потім з використанням гель-хрома-тографії на ультрагелі АСА-54 встановлені молекулярні маси відповідних ферментів пектолітичного комплексу. В препаратах з C.hlrsutus та С. utrlformis виявлено 3 групи білкових комплек- . сів з активністю пектолітичних ферментів.. Для С. hlrsutus 22.2% . ендополігалактуроназноі та 38.IX екзололігалактуроказної активності є формами з молекулярною масою 45-50 кДа. Ш та,6.8% відповідно з молекулярною масою біля 10 кДа. Подібне розподілення цих ферментів характерне і для C.utrifcrmis, Пектинестерази С.' . hlrsutus мають молекулярну масу 60 кДа, С. utrlformis має 2 фор-, ми з молекулярною масо» 45 та 60 кДа. Для пектофоєтидіна полігалактуронази та пектинестёрази розподілені в 5 групах білкових піків з молекулярною масою 60. 45-50. 22 та біля 10 кДа.

При хроматографічному розділі на ДЕАЕ- целюлозі пектолітичного комплексу C.hlrsutus виявлено, 5 білкових Піків,де яких по- : казаний розподіл питомої активності пектиназ (ркс.і). 1

При ізофокусуванні в лінійному градієнті pH одержані відмінності у розподілі ізоелектричних точок різних ферментів пек- ,

толітичного комплексу’ для C.hlrsutus. та A. foetldus; Для ;

С. hlrsutuspi зони для полігалактуронази .- 5.4; 4.9; 4.-4; 4.1: .

З', 0; 2,1; ' для. екзополігалактуронази - 5,4; 5. 0; 3.6; 3.0; 2.2;

для пектинестерази - 4.0 12.8. Для пектофоєтидіну pi зони для . полігалактуронази - , 5,8; 4,5; 3'. 4; для екзополігалактуронази - ' 5,4; 5.0; 3.6; 3,0; 2/2: для Пектинестерази-6,0;5.6;3.0. 1

розподіл білка (Е ); 2 - розподіл активності полігалактуронази; З' .'- розподіл, активності,екзополігалактуронази;. 4 - розподіл активності пектинестерази ' : : . ■ -

. При вивченні гідролізу різних пектинів ферментними препаратами з вищого базидіоміцета С. hlrsutus та дейтероміцета показана ^подібність одержаних продуктів гідролізу в обох, випадках.

При вивченні деяких фізико-хімічних властивосте/і ферментів пектолітичного‘ комплексу встановлені, оптимуми pH та температури для окремих ферментів та їх-стабільність в залежності від температури;'- " ;■ > : ' ''

. ' _ і4 - • - ' .

Розділ 6. ФЕРМЕНТНІ ПРЕПАРАТИ З ВИЩИХ БАЗИДІАЛЬНИХ ГРИБІВ У БІОТЕХНОЛОГІЧНИХ ПРОЦЕСАХ .

6.1. Використання ферментного препарату з . С.МгэиШэ для збільшення виходу біологічно активних'речовин з лікарської сировини ' .

Е наших дослідженнях, -що проведені спільно з РНДІ лікарських рослин, розроблений спосіб одержання сапогенінів з кореневищ діоскореі дельтовидно! шляхом обробки сировини промисловим ферментним препаратом пектоаваморіном ПЮХ та ферментним препаратом з С. Шгзишэ. Ці ферментні препарати є комплексними з переважанням активності пектиназ. Використання ферментного, препарату з вищого .базидіоміцета С. МгэиШэ для обробки кореневищ

Рис. 2. Динаміка виходу діосгеніну при обробці кореневищ. Ді< кореї дельтовидно! ферментними' препаратами: 1 - пектоаваморіном; 2 - препаратом з СоПоХиэ МмиШэ г. •

Тонкошарова хроматографія діосгеніну свідчить/ що.при використанні ферментних препаратів, поліпшується якість кінцевогі

продукту, б ньому не виявлений побічний продукт ДІЄН. якт утворюється, внаслідок розпаду діосгеніну.

Ферментацію рослин м'яти перцевої проводили Ферментним препаратом з С. МгвиШв в порівнянні з промисловим препаратом пек-тофоєтидіном. Вихід ефірнаїолії при використанні препарата з С. шгзишэ на 17-20%. а препарату пектофоетидіну - на 1-15% вице по відношенню до контролю без ферментативної обробки сировини.

6.2. Застосування ферментних препаратів.у процесах виробництва соків .

В роботі проведено дослідження, по, дії ферментного препарату з С. ьігзишз на вихід та технічні показники соку при обробці різних сортів винограду. Характеристика дії препарату проведена. за методами технохімічного та технологічного контролю в виноробстві, Для порівняння використовували промисловий препарат пектогівзморін ПОХ. який використовується в виноробній та соковій промисловості. Дослідження проведене на 4 сортах винограду -Аліготе, Каберне.Ркацителі, Трамінер.

. ; Таким чином, в результаті дослідження встановлено, що при використанні ферментного препарату з вищого базидіоміцета та препаратів з дейтероміцетів при переробці винограду різких сортів ;можливе підвищення ефективності виробництва виноградного соку. При' обробці ферментними препаратами з вищих базидіоміцетів в одержаному соці, збільшується, в основному,.. вміст фенольних сполук. вихід соку та швидкість фільтрації,', а також зменшується вміст суспензії.;; . ,'Л\ V Ч-; ' >' ■, . / ' '

Результати експериментальних досліджень з різними типами рослинних субстратів показують, що вищі- базидіальні .гриби є перспективними продуцентами ферментних: препаратів для біотехно-логічних процесів переробки сировини з метою одержання різних продуктів 1 біологічно активних речовин. :

висновки

1. Проведено порівняльне вивчення динаміки активності пек- | толітичних ферментів 123 штамів 68 видів вищих базидіальних грибів, які відносяться до порядків Воіеїаіез. АяагІсаІеБ,.' АрїіуПоріїогаїез, ішззиіаіез та групи порядків Савіеготусеїез. Серед досліджених вищих базидіоміцетів найбільш активним продукуванням дах ферментів характеризуються представники родин Роїурогасеае порядку АрЬуПорІїогаІез та Тгісйоїошаїасеае порядку Авагісаіез. ,

2. 'Активні продуценти пектолітичних ферментів відносяться

до ксилотрофів, що руйнують деревину за корозійним та деструктивними типами. Сапротрофи продукують менш активний комплекс пектолітичних ферментів. АКТИВНІСТЬ цих ферментів у мікоризних грибів слідова. .

3. Гриби, що руйнують деревину за корозійним типом, проду-

кують більш активний гідролітичний комплекс' пектолітичних ферментів порівняно з грибами-руйнівниками деревини за деструктивним ТИПОМ. ■ . ■ ' ,

4. На обраних нами модельних об'єктах Согіоіиз ШгэШиз та

Саіуаііа иггіГогтіБ вперше показана біохімічна складність комплексу вищих базидіальних грибів, який представлений множинними молекулярними формами полігалактуроназ та пектинестераз. Вони розрізняються за молекулярними масами, співвідношенням білкових комплексів, питомою . активністю та’Ізоелектричнйми точками. Доведено, що при загальній подібності до пектолітичного комплексу дейтероміцетів. пектинази базидіоміцетів характеризуються більшою кількістю множинних форм полігалактуроназ та меншим спектром пектинестераз. ' , - .. :

5. Встановлені Фізіко-хімічні властивості ,,пектолітичних ферментів вищих базидіальних грибів ,зк показниками pH , pH .

. . . - - ; . , ОПТ; . СІ

t°Cont. t°C„ для активних продуцентів, зокрема Corlolus hlrsutus. які є вихідними й визначально-регламентуючими для використання в біотехнології. * '

6. Відібрані ізтами вищих базидіоміцетів, такі як Согіоіиз hlrsutus. С. versicolor. Irpex lacteus. Funalia trogil. Pleurotus ostreatus, які мають високу біотехнологічну спрокоя-ність для повної біоконверсії лігноцелюлозних субстратів з ме~ тою одержання ферментних препаратів і збагачених білком кормів. Вперше використані відходи виробництва, зокрема гідролізний лігнін* гідрол, агрімус тощо. як ефективні субстрати для вищих базидіальних грибів. •- ... •

• 7. Вперше розроблені технологічні- способи обробки рослин- '

ної .лікарської сировини Ферментними препаратами, з-базидіального : гриба Corlolus hlrsutus, які дозволяють збільшити до 50% вяхід-v діосгеніну з кореневищ ' діоскореї дельтовидно! і на 3055.ВИХІД ефірної олії з.листя м'яти перцевої та покращити Якість,-кінце-’', вого продукту. " • ■' .. , ,

СПИСОК ПУБЛІЙАЦІЙ ПО ТЕМІ ДИСЕРТАЦІЇ , , \ J

' Даниляк Н.И., Сешчаевский,!'В.Д.| ДуДченко Л.Г. . .Трутнева И.А. Ферментные системычвысших базидиокицетов.- Киев:Наук, думка. 1939,- 280 с. . - . . " . -

Трутнева Ї.А.. Панасенко.Т.В. Порівняльне вивчення деяких гідролітичні^ ферментів /.у .'Agarlcus’ silvestris (Sch. et Fr.). Corlolus pubes.cehs, (Frv^Quel., Aspergillus nlger (van Tlegh.)/ Мікробіол.- вип. 4. - С. ,501.' . . . .

V *• ‘-Луд^оцко^' ТВУТнева Ї.А.', Паяасенко. Т.В^ Пектолітична ; ajffffi^Hicfb- грибів '.роду,. Corlolus dual, У культурі/^Укр. ботан. .aypttl-1978. 35,. Н. Д . f С.- 66-70, ’ . -j’

Труїневд I,A.> ’Дудченко. ЛіГ. Дослідження активності позаклітинних фідополігалактуроназ.' агарякальних грибів у культурі

//Укр.ботан. журн.-І978.-35, N. 6.- С,625-628. ' . .

■ Трутнева I.А., Дудченко Л.Г. Пектолітичні фермента грибі

порядку Aphyllophorales// Укр. ботан..., журн. -1984.-41, N.5. ' -С.64-67; ’"'..Л;' ■■ Л

Дудченко Л.Г., Трутнева І.А. Пектолітична активність гасте роміцетальних грибів у культурі//Там ке.-і935.~42Д. і.-С. 45-48.

Дудченко Л.Ґ., Трутнева І.А. Пектолітичні ферменти базиді ального гриба Corlolus pubescens у культурі// Те же.-1985.-42.N. 2.-С.38-40. .

■ Семичаевский В.Д.. Трутнева И. А.. Портнова Л.В. Культивирс вание высших дерезоразрушающих базидиомицетов на лигноцеллюло: ных отходах //Превращения древесины при энзиматическом имикрс биологическом воздействиях. - Рига: Зинатне. 1985.- С. . 167-173..

А. С. СССР N.,1068477. МКИ С 12 N9/02, Способ получения KOI плекса ферментов/ Даниляк Н.И.. Семичаевский В.Д.. Мельничз Г.Г.. Яковенко В.В., Трутнева И;А.. ДудченкоЛ.Г. -0ny6j 23.01.1984. B.H.N.3 . ; ' ’ ; / ,

А. с. СССР N. 1084299.; ЩИ С 12. 9/02, С 12 1/14. Способ ПОЛ; чения комплекса внеклеточных .ферментов / Семичаевский В.Д.. Дг нилякН. И., Трутнева И. А. - Опубл. 07.04.1984. - Б. И. N.13. ,

А.с.СССР N. 1156695, МКИ Ф. 61 К 35/78, С 07 7/022. Спосі получения сапогенинов/ сытник К,м., даниляк Н.И., Дудчені Л.Г., ФонинВ.С., Трутнева И.А. -Опубл. 23.05.1985.-Б.И. N.10.

Трутнева И. А. Изучение комплекса пектолитических фермент^ у гоедста&й'Гелей высших базидиальных и плесневых грибов//' кбнф. "Молод, ученых-ботаников Украины: Материалы конф. (Кие февр. 1979 ¥. :ьШев; Наук, думка. -1979. -С. 212-214. v' V; ; ч,

' Трутаёва *Й. А. Изучение ферментов пектолитическойз'кошле; са у базидиомицетов 7/Там же.- С. 214-215. \

Дудченко Л.Г.. Трутнева И.'А. Характеристика пектолитическ

го комплекса ферментов различных таксонов высших базидиальных грибов//УП сьезд Украин. ботан. о-ва: Тез. докл.- Киев:Наук-, думка, 1982. -С. 351-352. 1 '

Дудченко' Л.Г.. Трутнева И.А.. Галузинфая Н.С., Елько А.И. Особенности пектолитического комплекса ферментов высших базиди-альных грибов//Мицелиальные грибы (физиология, биохимия, биотехнология): Тез. докл. Бсесоюз.конф. "Мицелиальные грибыШущино, 10-12 окт. 1983 -г:). -Пущино: Наука, 1983. - С. 127-128.

Дудченко Л.Г., Трутнева И.А., Галузинская Н.С., Елько А.И. Влияние "условий культивирования базидиальных грибов на актиз-ность пектолитических ферментов//Там же. - С. 139-140. .

Г Дудченко Л. Г., ' Трутнева И. А. .'Фокин B.C. Об использовании полиферментных систем высших базидйаль'ных грибов для гидролиза растительного сырья// Там.же.- С. 126-127,;, ■ . ■ . 1 І

Дудченко, Л.Г,, Трутнева И. А. Сьедобные агарикальные грибы-.' -источник внеклеточных пектолитических ферментов//П?ойзеодство. высших сьедобных.грибов в СССР: Тез. докл. II Всесовз.,сов. (Чер- •• нигов, 23-28 мая 1985 г.}. - Киев:Наук, думка, 1985.- С.25-28. Trutneva. I.А., Dudoftenko L.G. Peculiarities of pectdlytlc , enzymes‘"of higher Basldiomycetes // Xth Congr. of Europ. Mycol.

-Tallinn. Estonian SSR; Aug.'. 1989: Abst.-Tallinn, 1989. -P. 123. -' Трутнева И. А. ;'Экстрацелл»лярные я связанные d' мицелием пек*-толитические ., ферменты высший.- базидиальных ^грибов// Биосинтез

• целлрДозы и других компонентов клеточйой стенки: Тез. докл. III .Всесоюз;.конф,?ч- Казань,, '1990.С, 136'. -

"• .|ру^ева-^.А.'гДектолитические ферментазысших базидиомицетов Дйбсерташянасоиск&ние научной степени кандидата, биологических . йауік по спедааипьностй 03.00. £4 Микология. Институт ботаники им. ГЙ.;Г.Холод:-;огр; --Национальная академия наук Украины,- Киев, 1995.

. • Изучейие около 120-штаммов грибов из порядков Agarlcales,

Boletales. Russulales. Aphyllophorales. группы порядков . Gasteromycetes показало, что большинство из них продуцирует ак~ . тивный комплекс пектолитических ферментов. Соотношение активное-тей пектолитических ферментов и потенциальная способность высших базидиомицетов к их продуцированию определяется систематической и экологической принадлежностью изучеемых грибов. Микоризные грибы характеризуются медленным накоплением биомассы и низкими активностями пектолитических ферментов. .У напочвенных-сапротрофов отмечено более быстрое накопление биомассы и выше уровень активности пектолитических ферментов. Быстрое накопление ' биомассы и высокий уровень активности 'пектолитических ферментов характерен для ксилотрофов. Среди этой группы грибов отобраны возможные .продуценты пектолитических ферментов.' Важным фактором для продуцирования, пектиназ является состав питатель-ной среды. Сложные источники углерода' и лигноцеллюлозйые отходы могут быть использованы для, выращивания грибов и продуцирования пектолитических ферментов. Для исследования специфики ферментного комплекса высших базидиальных грибов выделен и очищен ферментный препарат из Corlolus hlrsutus и Calvatla utrlformls . Дана сравнительная оценка гетерогенности-пектолитическик Ферментных систем данных высших базидиомицетов и известного продуцента. Aspergillus foetldus. С использованием.гель-хроматографии на ультрагеле АСА-54 белков-маркеров и исследуемых, ферментных ;Пре-паратов были установлены молекулярные массы изучаемых пектиназ. Аналитическое: лзоФокусиоование этих , ферментных препаратов в .линейном градиенте pH выявило различия зон pi. отвечающих, полига-лактуроназной. экзополигалактуроназной и пектинэстеразной актив-. (юстях. Эти,, .данные свидетельствуют о мяогокомпснентности пекто-литических ферментсв; у изучаемыл';вксшнх ,. базидиом,,лцетов и значительном . сходстве с таковыми у ■дейгеромицетов. При*обработке

этими ферментными препаратами лекарственного сырья с целью ин тенсификации выхода биологически активных веществ, препарат.из С. hlrsutus способствовал увеличению выхода продукта, а также улучшению качества полученного продукта.’ '

КЛЮЧ0В1 СЛОВА: ВИЩ1 БАЗИД1АЛШ ГРИБИ, ФЕРМЕНТН1, СИСТЕМИ.

ПЕКТ0Л1ТИЧН1 ФЕРМЕНТИ. '

: . , • ‘ •*>

Trutneva I. A. Pectolytlc enzymes of higher Basidlpmycete Ph.D. thesis. Speciality 03.00.24-Mycology. Institute of Botany by M. G. Chdlodny. . National Academy of Sciences of the Ukraine.Kiev. 1995.,

The studies of over 120 strains of fungi fro® Agaricales, Boletales,Russulales.Aphyllophorales and' Gasteromycetes have shown that most of them possess an active complex of pectolytlc enzymes. The ratio of activities in pectolytlc enzymes and•? potential capacity of Higher Basldlomycetes to their production is mainly determined by the species and strain attribution as •, well as by ecological confinement of the fungi studied.- Besides their slow growth, ‘ raycorrhlzal fungi are. shown to be characterized by slight manifestation': of extracellular pectlnases. More considerable accumulation of biomass and the level of pectolytlc activity were typical of soil saprotrophs. Rapid accumulation of Ыошазз and a high level;of pectolytlc enzymes were peculiar to Wood-rotting saprotrophs. A crucial factor in pectlnase production is . the composition of the medium, лMlxedVcarbon "sources, and Ugnoceilulose- wastes can be used ..tq grow for:fungl-and production, pectic. enzymes. In order . to';'study the . speciflty of the enzymic complex of Higher ' Basidiomycetes the. enzymic preparation from Coriolus hlrsutus ■'aixj Calvatla utriformls were isolated and . purified. Heterogeneity of pectolytlc enzymic systems- of Higher

- 22 - . Basidlomyostes and Aspergillus foetidus was estimated in comparison. Molecular weights of the pectinases were established .using gel chromatography on ACA-54 ultragel of . protein-markers and the enzymic preparations under study. The analytical isofocusing of this enzymic preparations in the linear pH gradient has revealed differences in pi zones responding to the polygalacturonase.' exopolygalacturonase and pectlnesterase activities. These data indicate the multicomponent nature of pectinolytlc enzymes in the studied Higher Basldlomycetes and considerable similarity with those of Deuteromycetes. When treating medicine substrate with these enzymes in order to intensify the yield of biologically active substances. the preparation from C. hlrsutus favours an increase in the yield of product and improves the quality of the product. • .