Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Параметры восприимчивости и иммунного ответа к Salmonella typhimurium у мышей, генетически отличных по чувствительности к туберкулезу

ВАК РФ 03.02.03, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Параметры восприимчивости и иммунного ответа к Salmonella typhimurium у мышей, генетически отличных по чувствительности к туберкулезу"

Балунец Денис Викторович

Параметры восприимчивости и иммунного ответа к Salmonella typhimuriiim у мышей, генетически отличных по чувствительности к туберкулезу

03.02.03 -Микробиология 14.03.09 - Клиническая иммунология, аллергология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

1 7 05В 2011

Москва 2011

4854297

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф. Гамалеи» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации

Руководители:

кандидат биологических наук Нестеренко Людмила Николаевна доктор биологических наук, профессор Апт Александр Соломонович

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук Белый Юрий Федорович доктор медицинских наук Бремеев Владимир Витальевич

Ведущая организация:

Федеральное государственное учреждение здравоохранения Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб» Роспотребнадзора

Защита диссертации состоится «25» февраля 2011 г. в 11 час. на заседании Диссертационного Совета Д 208.130.01 при ФГБУ «НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздравсоцразвития России (123098 г. Москва, ул. Гамалеи, 18) С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздравсоцразвития России

Автореферат разослан «25» января 2011 года

Ученый секретарь

Диссертационного Совета доктор медицинских наук,

, профессор^, ММ^ Е. В. Русакова

Общая характеристика работы Актуальность проблемы

Одной из важнейших проблем инфекционной патологии является проблема взаимодействия паразит-хозяин. В настоящее время доказано, что генетические особенности организма хозяина оказывают существенное влияние на восприимчивость к инфекционным агентам и течение инфекционного процесса. Помимо генетической индивидуальности, у человека на восприимчивость к инфекционным агентам оказывают влияние множество других факторов, таких как условия и образ жизни, прием различных лекарственных препаратов (антибиотики, иммуностимуляторы и иммунодепрессанты) и др. Однако эти факторы только модулируют механизмы восприимчивости к инфекциям, контролируемые генетическими параметрами.

Поскольку в контроле восприимчивости к инфекциям принимает участие большое количество генов, многие из которых могут взаимодействовать друг с другом, исследование генетических механизмов контроля инфекционных болезней очень затруднено, особенно в гетерогенных популяциях человека. Высокая степень гомологии геномов мыши и человека (~85%) значительно облегчает поиск генов-кандидатов, участвующих в контроле тяжести течения к различным инфекциям, в модельных системах и обуславливает целесообразность проведения исследований по иммуногенетике инфекций на инбредных линиях мышей.

Использование в качестве моделей инбредных животных разных линий способствовало обнаружению ряда генов, для которых были идентифицированы гомологи у человека. В частности, некоторые из таких генов были открыты на моделях инфекций, вызванных внутриклеточно паразитирующими возбудителями (Fortier А., 2005; Fortin А., 2007). Исследования физиологических характеристик и генов, участвующих в контроле инфекций, на модели лабораторных животных позволят не только понять основы патогенеза этих инфекций, но и перейти от генетики

восприимчивости к инфекциям у животных к генетике чувствительности и резистентности у человека и определению групп риска к определенным инфекциям.

Несмотря на таксономические различия, разницу в развитии патологических процессов и тропизме к органам-мишеням, многие внутриклеточные патогены обладают сходными свойствами, позволяющими им выживать внутри клетки-хозяина. Получены доказательства существования общих генетических механизмов контроля инфекций, вызванных таксономически неродственными внутриклеточными патогенами. Так, например, мутации в генах, кодирующих ИФН-у, ФНО-а и рецепторы к ним, приводят к высокой чувствительности к инфекциям, вызванным М. tuberculosis, М. bovis, М. avium (Decker Т., 2002; Patel S., 2008), L. monocytogenes, S. etnterica serovar Typhimurium, С. pneumonia (Decker Т., 2002; Lengeling A., 2001). Описаны мутации в гене iNOS, кодирующем индуцируемую NO-синтетазу, которые повышают чувствительность к М. tuberculosis, L. monocytogenes, С. pneumoniae, S. enterica serovar Typhimurium (Lengeling A., 2001). Большинство подобных исследований были проведены на мышах, несущих индуцированные мутации, приводящие к потере функции гена (генетически сконструированные нокаут-мутации), то есть применялся подход так называемой «обратной генетики». (Rydstrom А., 2007; Moreira С. G., 2010; North R., 2004; Flynn J. L., 2006).

Однако в природных популяциях подобные серьезные генетические дефекты, как правило, быстро элиминируются естественным отбором и поэтому практически не влияют на реальный уровень генетического разнообразия. Скорее, его определяют количественные различия в функциональной активности продуктов генов со слабым или умеренным уровнем влияния на сложный фенотип, к тому же взаимодействующих между собой (Апт А. С., Кондратьева Т. К., 2008). Такие генетические детерминанты получили название «локусы количественных признаков» (QTL - англ. quantitative trait loci). Некоторые QTL, участвующие в контроле

восприимчивости и тяжести течения инфекций, вызванных внутриклеточными патогенами, были картированы с применением методов «прямой генетики», т. е. на основе различий по чувствительности к инфекции неродственных инбредных линий мышей и сегрегационного генетического анализа на гибридах (Апт, Кондратьева, 2008; Fortin et al., 2007). Данная работа также использует этот подход.

Мы решили проверить, нет ли генетических аналогий в контроле чувствительности мышей к туберкулезу с контролем чувствительности к другим бактериям с внутриклеточным типом паразитирования. В настоящей работе проведен анализ течения инфекционного процесса, вызванного таксономически неродственным микобактериям патогеном - Salmonella enterica serovar Typhimurium. S. typhimurium - микроорганизм со схожим с М. tuberculosis механизмом паразитирования внутри макрофагов, но поражающий не легкие, а печень и селезенку. Как и многие другие внутриклеточные патогены (в том числе М. tuberculosis), сальмонеллы паразитируют внутри вакуолей (фагосом) клетки-хозяина и препятствуют их слиянию с лизосомами, что приводит к длительному персистированию внутри макрофагов.

Целью работы явилась экспериментальная проверка гипотезы о сходстве иммунологических и генетических механизмов контроля инфекций, вызванных Salmonella typhimurium и M. tuberculosis, в модели на мышах.

В соответствии с поставленной целью в процессе выполнения диссертационной работы предстояло решить следующие задачи:

1. Сравнить восприимчивость к инфекции и тяжесть инфекционного процесса, вызываемого S. enterica серовар Typhimurium, у линейных мышей с генетически детерминированной высокой (I/St) и низкой (A/Sn) чувствительностью к туберкулезу.

2. Оценить показатели иммунного ответа и охарактеризовать местные воспалительные реакции в брюшной полости у мышей линий I/St и A/Sn при сальмонеллезной инфекции

3. Оценить характер наследования признака чувствительности к исследуемой инфекции (рецессивный, доминантный, промежуточный) среди потомков первого поколения (I/St х A/Sn)Fl.

4. Оценить характер расщепления признака чувствительности к сальмонеллезной инфекции среди потомков возвратного скрещивания [I/St х (I/St х A/Sn)Fl]BCl по динамике гибели мышей в сравнении с родительскими линиями.

5. Определить, не сцеплен ли признак чувствительности к сальмонеллезной инфекции с локусами 3-й, 9-й и 17-й хромосом, участвующих в контроле тяжести течения экспериментального туберкулеза у мышей линий I/St и A/Sn.

Научная новизна

• Впервые проведен сравнительный анализ течения инфекционного процесса, вызываемого внутриклеточно паразитирующей бактерией Salmonella enterica serovar Typhimurium, у инбредных линий мышей с генетически детерминированными различиями по чувствительности к Mycobacterium tuberculosis,

• Впервые показано, что чувствительные к туберкулезу мыши I/St чувствительны и к сальмонеллезной инфекции.

• Впервые показано наследование признака устойчивости к сальмонеллезной инфекции по типу сверхдоминирования (гетерозис).

• Впервые показано, что локус 9-й хромосомы, участвующий в контроле туберкулезной инфекции, влияет на устойчивость к сальмонеллезу.

• Установлено сходство контроля сальмонеллезной и туберкулезной инфекции у инбредных мышей A/Sn и I/St по многим параметрам: срок жизни после заражения, количество высеваемых из органов бактерий,

бактериостатические функции макрофагов, развитие выраженной местной воспалительной реакции у чувствительной линии, полигенный контроль признака восприимчивости к инфекции.

Практическая значимость

Несмотря на важную роль наследственности в контроле инфекционных болезней, генетический контроль иммунитета и защиты от инфекции остается мало изученным. Это во многом объясняется тем, что вклад индивидуальных локусов отличается количественно и качественно в зависимости от механизмов вирулентности патогена и генетической основы хозяина. Многоступенчатое взаимодействия хозяина и патогена, определяющее исход болезни, делает крайне сложным выявление индивидуальных генов, вовлеченных в эти процессы. Хотя настоящая работа носит фундаментальный характер, полученные результаты могут оказаться важными для понимания развития патологических процессов у человека в зависимости от генетических особенностей, а также выявить новые генетические локусы, участвующие в контроле таксономически различных внутриклеточных патогенов, что позволит усовершенствовать методы раннего выявления групп риска и понять основы патогенеза этих инфекций. По результатам диссертационной работы подготовлены Методические Рекомендации «Определение устойчивости/ чувствительности инбредных мышей к инфекции, вызванной Salmonella etnterica serovar Typhimurium» одобренные на Совете по внедрению научных достижений в практику ФГБУ «НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздравсоцразвития России (протокол №13 от 15 октября 2010 г.).

Положения, выносимые на защиту

1. Мыши линий A/Sn и I/St, оппозитные по восприимчивости к туберкулезной инфекции, также оппозитны по восприимчивости к сальмонеллезной инфекции по следующим показателям: срок жизни после заражения, характер макрофагального ответа, параметры локального иммунного ответа и местной

воспалительной реакции на ранней стадии инфекции

2. Наследование признака устойчивости к инфекции по типу сверхдоминирования (генетический гетерозис), продемонстрированное ранее на модели легочного туберкулеза, обнаружено и для сальмонеллезной инфекции. Показано сцепление признака устойчивости к сальмонеллезной инфекции с локусом D9Mit89 9-й хромосомы, совпадающим по локализации с локусом Tbs2, участвующим в контроле туберкулезной инфекции у мышей I/St иА/Sn.

Апробация работы

Материалы диссертации были доложены на X и XI Всероссийских научных Форумах с международным участием «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» в 2005 и 2006 гг.; на III научной конференции с международным участием «Проблемы инфекционной патологии в регионах Сибири, Дальнего Востока и Крайнего Севера» в Новосибирске в 2006 г.; на Всероссийской научной конференции с международным участием «Физиология и генетика микроорганизмов в природных и экспериментальных системах» в 2009 г; на 3-м Конгрессе Европейских Микробиологов в Гетеборге, Швеция, в 2009 г.

Апробация диссертации состоялась на научной конференции отделов медицинской микробиологии, иммунологии, генетики и молекулярной биологии бактерий ФГБУ «НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздравсоцразвития России 12 ноября 2010 г.

Публикации

По результатам исследований опубликовано 9 научных работ, в том числе 5 статей в изданиях, рекомендованных ВАК РФ.

Структура и объем диссертации

Диссертация состоит из «Введения», трех глав «Обзора литературы», описания «Материалов и Методов», четырех глав «Собственных исследований»,

«Обсуждения», «Выводов» и «Списка литературы» (3 отечественных и 211 зарубежных источников). Работа изложена на 108 страницах, иллюстрирована 5 таблицами, 9 рисунками.

Материалы и методы Лабораторные животные. Исследования выполнены на мышах инбредных линий I/StSnEgYCit (I/St), A/JsnYCit (A/Sn), BALB/cJCit (BALB/c), а также гибридах (A/Sn x I/StJFl. (I/St x BALB/c)Fl и [I/St x (A/Sn x I/St)Fl]BCl, поддерживаемых в виварии ФГБУ «НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздравсоцразвития России. Племенные ядра линий I/St и A/Sn были получены из лаборатории иммуногенетики ЦНИИТ РАМН. Воду и корм животные получали ad libitum. В опытах использовали мышей обоего пола, весом 14-16 грамма. Линия I/St восприимчива, а линия A/Sn относительно устойчива к туберкулезу. Обе линии несут аллель Nramprí.

Штаммы бактерий, выращивание бактериальной культуры и инфекция.

В работе использовали умеренно вирулентный штамм С53 S. enterica серовар Typhimurium. Это - клинический изолят, полученный от доктора F. Norel (Франция). Стандартные условия включали культивирование бактерий в жидкой среде Luria-Bertani (LB - бульон) фирмы «DIFCO», USA, при 37°С 12 часов и посевы культур в разведениях на чашки Петри с SS-агаром фирмы (Pronadisa), Испания. Мышей заражали внутрибрюшинно S. typhimurium по общепринятой методике дозами 10 или 102 КОЕ на мышь.

Результаты исследований

Продолжительность жизни мышей при заражении Salmonella typhimurium. Анализ динамики выживаемости мышей при заражении дозами 100 и 10 микробных клеток выявил более высокую устойчивость к инфекции животных линии A/Sn по сравнению с линиями I/St и BALB/c (Рис. 1).

Продолжительность жизни мышей линии BALB/c составила 5,0 ± 0,8 дня, мышей линии I/St - 7,2 ± 0.9 дня, мышей линии A/Sn - 16±1.5 дня (Р < 0,001). Гибриды (I/St х BALB/c)Fl, полученные от скрещивания двух чувствитель- ных линий, оказались более устойчивыми к сальмонеллезу, чем резистентная к сальмонелле линия A/Sn, и переживали инфекцию. Гибриды (I/St х A/Sn)Fl также переживали инфекцию (срок жизни после заражения более 25 дней).

10 15

время, сутки

Рис. 1. Динамика продолжительности жизни мышей линий A/Sn, I/St и BALB/c и гибридов F1 (I/St х BALB/c) после заражения сальмонеллами.

Таким образом, наследование признака устойчивости к сальмонеллезной инфекции у гибридов, полученных от скрещивания чувствительной (I/St) и устойчивой (A/Sn), и даже двух разных чувствительных линий (I/St и BALB/c), имеет характер сверхдоминирования (генетический гетерозис). Гетерозис - это усиление количественных признаков у гибридов между генетически различными особями за счет гетерозиготности по многим генам, блокирующей экспрессию рецессивных аллелей, снижающих пенетрантность (например, жизнеспособность). Таким образом, можно предположить, что чувствительность к сальмонеллезной инфекции обусловлена несколькими рецессивными аллелями.

Размножение сальмонелл в органах. Поскольку мыши линии A/Sn оказались более устойчивыми к инфекции, можно было ожидать, что количество бактерий в органах этих мышей будет ниже. Высев бактерий из селезенок и перитонеальных смывов проводили через 2, 4, 6, 24, 48 и 120 часов (ранняя стадия инфекции) и через 2, 4, 6, 8, 10 и 12 суток (поздняя стадия инфекции). На ранней стадии инфекции в течение короткого интервала были выявлены значительные межлинейные различия по количеству сальмонелл, высеваемых из перитониальной полости и селезенок: через 24 часа после заражения количество сальмонелл у мышей I/St, было на 3 порядка выше по сравнению с мышами A/Sn (Рис. 2).

i torn

- мыииА/Sn

- ыьшКЬ

0 2 4 в 24 30 48 120 Время (часу)

3 1000

0 2 4 в 24 30 4» 120 Вр«мя поел* мраюнмя (часы)

Рис. 2. Количество сальмонелл, высеваемых из селезенок (А) и перитониальных лаважей (Б) мышей A/Sn и I/St на ранней стадии инфекции

Этот эффект был кратковременным: разница в количестве высеваемых бактерий быстро снижалась и к 3-м суткам после заражения исчезала.

На поздних стадиях инфекции мыши линии A/Sn более эффективно контролируют размножение сальмонелл по сравнению с мышами линии I/St. Количество высеваемых из селезенки бактерий у животных A/Sn постепенно снижалось (примерно в 1000 раз на 12 сутки по сравнению с 4 сутками после

заражения), в то время как у мышей I/St оставалось стабильным в течение 4-8 суток (Рис. 3).

100000

к

I

10000- Й-

1000

10

3 5 7 10 12 . in» ВРемя <ДКИ>

-О-A/Sn

Рис. 3. Количество КОЕ сальмонелл, высеваемых из селезенок мышей линий A/Sn и I/St на поздней стадии инфекции.

Быстрое размножение сальмонелл на ранней стадии инфекции у чувствительных мышей, по-видимому, приводит к развитию сальмонеллеза по типу острой инфекции, что оказывает значительное влияние на срок жизни после заражения. В таком случае, можно предположить, что у чувствительных животных нарушен механизм естественной резистентности, прежде всего связанный с функцией фагоцитов.

Антибактериальная активность перитониальных макрофагов мышей линий I/St и A/Sn. Для того, чтобы выяснить, не связана ли разница в восприимчивости к сальмонеллезной инфекции между линиями I/St и A/Sn с различиями в способности макрофагов, локализованных непосредственно в очаге инфекции, подавлять размножение бактерий, было проведено изучение антибактериальной активности перитониальных макрофагов обеих линий in vitro. Перитониальные макрофаги были выделены, очищены и инфицированы

в соотношениях сальмонелла:макрофаг 100:1 и 10:1. Оценку способности макрофагов подавлять размножение сальмонелл проводили по определению количества сальмонелл (КОЕ/лунку) высевом на питательную среду в динамике (Рис. 4).

1 3 15 40 $4 88

Время после заражения (часы)

Рис. 4. Антисальмонеллезная активность макрофагов мышей линий A/Sn и I/St при заражении in vitro 100:1

В полном соответствии с результатами, полученными in vivo, подавление размножения сальмонелл начиналось раньше и происходило быстрее в макрофагах мышей A/Sn по сравнению макрофагами линии I/St в течение первых 3-х суток после заражения.

Показатели иммунного ответа и характеристика воспалительной реакции в брюшной полости у мышей линий I/St и A/Sn. Поскольку межлинейные различия в способности подавлять размножение сальмонелл in vivo и in vitro были наиболее выражены на ранних стадиях инфекции, оценку различий притока клеток иммунной системы и уровня ключевых цитокинов в брюшной полости проводили через 24 часа после заражения.

Для определения количества иммунных клеток осадок клеток из

перитонеальных смывов обрабатывали мечеными моноклональными антителами к поверхностным маркерам тканевых макрофагов F4/80, Т-лимфоцитов CD4 и CD8 и В-лимфоцитов (CD 19). Процентное содержание клеток определяли методом проточной цитофлуорометрии. Оказалось, что через 24 часа после инфекции макрофаги составляли около половины общего количества клеток, содержащихся в перитониальном экссудате, в то время как Т-клетки присутствовали в очень небольших количествах, как у линии I/St, так и A/Sn. У мышей резистентной линии A/Sn было выявлено значительно большее количество В-клеток CD19+ (Табл. 1).

Таблица 1. Инфильтрация брюшной полости мышей I/St и A/Sn

лимфоидными клетками через 24 часа после заражения

Линия мышей Содержание клеток в брюшной полости (% от общего числа живых клеток)

В (CD 19) Т (CD4) Т (CD8) МФ (F4/80)

A/Sn 36.8 ±3.8 1.7 ±0.5 0.5 ±0.1 45.8 ±3.8

I/St 16.4 ±4.8 0.9 ±0.3 0.7 ±0.1 48.4 ±6.6

Достоверность (?) 0.02 0.28 0.45 0.86

Поскольку образование антител при сальмонеллезе вносит существенный вклад в защиту хозяина, можно предположить, что выраженный В-леточный ответ у мышей линий A/Sn способствует устойчивости этой линии к инфекции.

Кроме того, методом ELISA была определена концентрация основных эффекторных и провоспалительны цитокинов (ИФН-у, ФНО-а, ИЛ-6, ИЛ-10,

ИЛ-12) в перитониальных лаважах мышей обеих линий через 24 часа после заражения сальмонеллами. Было показано достоверно (Р<0.05) большая концентрация провоспалигельных цитокинов TNF-a и IL-6 у мышей линии I/St по сравнению с мышами A/Sn на ранней стадии инфекции (Рис. 5).

1000

800

600

400

200 0

(а)ФНО-а

25 000 20 000 15 000 10 000

5 000 0

(6) ИЛ-6

A/Sn |/St

A/Sn I/St

Рис. 5. Содержание провоспалигельных цитокинов ТНФ-a (а) и ИЛ-6 (б) в брюшной полости мышей A/Sn и I/St через 24 часа после заражения

Как было показано выше, мыши линии A/Sn на ранней стадии инфекции эффективно контролируют размножение сальмонелл. Вероятно, в этот период не происходит заметной антигенной стимуляции иммунной системы мышей A/Sn, в то время как у мышей I/St интенсивное размножение сальмонелл приводит к индукции провоспалигельных цитокинов в брюшной полости. Содержание цитокинов ИФН-у, ИЛ-10 и ИЛ-12 было ниже порога чувствительности теста у мышей обеих линий.

Сегрегационный генетический анализ признака чувствительности к сальмонеллезной инфекции. Для выяснения характера наследования чувствительности к сальмонеллезной инфекции в нашей модели были получены и исследованы потомки возвратного скрещивания [I/St х F1 (I/St х A/Sn)]BCl. В работе было исследовано 236 особей обоего пола. Оценка чувствительности к инфекции проводилась по продолжительности жизни мышей после заражения. Характер распределения животных по продолжительности жизни после внутрибрюшинного заражения штаммом S. typhimurium С-53 представлен на Рис.6.

ill

it.,

10 20 30

Сутки после заражения

40

Рис. 6. Наследование чувствительности к сальмонеллезной инфекции среди потомков возвратного скрещивания [Ь^гхР 1 (1/8гхА/8п)]ВС

Расщепление признака чувствительности к сальмонеллезной инфекции у потомков возвратного скрещивания оказалось близким к нормальному распределению. Таким образом, учитывая высокий уровень резистентности гибридов Р1, наследуемый по доминантному типу, характер полученного распределения согласуется с гипотезой, что признак чувствительности к сальмонеллезной инфекции может быть обусловлен рецессивными аллелями

нескольких генов, которые у чувствительной родительской линии I/St находятся в гомозиготе.

Анализ на сцепление с генетическими локусами, участвующими в контроле туберкулезной инфекции. Не ставя слишком сложной задачи по скринингу всего генома, нами была выполнена работа по определению сцепления признака чувствительности к сальмонеллезной инфекции с локусами D9Mit89, D3Mit299 и D17Mitl75, локализованными на 9-й, 3-й 17-й хромосоме, соответственно. Для этих локусов ранее было показано участие в контроле тяжести течения экспериментального туберкулеза у линий мышей и I/St и A/Sn.

Уровень чувствительности к инфекции оценивали по

продолжительности жизни мышей после заражения. Для проведения анализа использовали Д НК из ткани (хвостов) потомков возвратного скрещивания [I/St х F1 (I/St х A/Sn)]BCl, погибших на разные сроки.

Последовательности ДНК локусов D9Mit89, D3Mit299 и D17Mitl75 мышей I/St и A/Sn различаются по количеству микросателлитных маркеров -динуклеотидных повторов (СА)П, обладающих высоким полиморфизмом: в каждом таком локусе количество повторов п сильно варьирует в пределах популяции, но постоянно для каждой инбредной линии животных.

Наличие сцепления признака чувствительности к сальмонеллезной инфекции с генетическими локусами D9Mit89, D3Mit299 и D17MitI75 проверяли, используя метод ПЦР с праймерами, специфичными в отношении этих локусов. Этот подход основан на выявлении межлинейного полиморфизма исследуемых локусов, то есть сходству фланкирующих нуклеотидных последовательностей для праймеров, но различию по длине исследуемых микросателлитах у линий I/St и A/Sn. Электрофорез в 4 % агарозном или 8 % полиакриламидном геле позволяет выявить эту разницу. Гомозиты по исследуемому локусу формируют ПЦР-продукты одинакового размера с обеих хромосом, а гетерозиготы формируют продукты различного

размера, что визуально на электрофорезе определяется в виде наличия одного (гомозигота) или двух (гетерозигота) фрагментов ДНК определенного размера (см. Рис. 7 в качестве примера).

1,2,3, 4, 5 - ДНК мышей гибридов возвратного скрещивания [ШиЛ (1/Б1хА/8п)]ВС;

7 -ДНК мышей Ш;

8 - ДНК гибрида Р1(ШхА/8п); 9-ДНК мышей А/8п;

10 - отрицательный контроль

1, 2, 3, 4, 6 - ДНК гибридов возвратного скрещивания [I/StrxF 1 (I/StxA/Sn)]BC; 5 - маркер размера фрагментов ДНК (шаг 50 нп);

7 - ДНК мышей I/St;

8 -ДНК гибрида F l(I/StxA/Sn); 9-ДНК мышей A/Sn;

10 - отрицательный контроль

Рис. 7. Электрофореграмма продуктов ПЦР, полученных с праймерами, специфичными для локусов D9Mit89 (А) и D3Mit299(B)

Как было показано выше, расщепление признака чувствительности к сальмонеллезной инфекции у потомков возвратного скрещивания [I/St х Fl(I/St х A/Sn)]BC, близко к нормальному распределению, поэтому было трудно выделить группы с достоверно разными фенотипами. Вследствие этого, нами был проведен сравнительный анализ по соотношению гомозигот и гетерозигот по исследуемым локусам между высоко устойчивыми особями (срок жизни более 35 дней) и остальными мышами. Результаты статистически оценивали методом у2 (достоверность отклонения от соотношения 1:1 гомозигот и гетерозигот среди потомков возвратного скрещивания).

Анализ расщепления признака восприимчивости к сальмонеллезной

инфекции у потомков возвратного скрещивания показал, что только среди особей высоко резистентных к инфекции достоверно (Р < 0.01) преобладали гетерозиготы по локусу Б9Мк89 (Табл. 2).

Таблица 2. Соотношение гомозигот и гетерозигот среди мышей с продолжительностью жизни более 35 дней

Т1=1 А/1 Ш

Ожидаемое соотношение при отсутствии сцепления 23 23

Реальное соотношение 32 14

X2 =81+81/23= 7,04 п=1 Р< 0.01

В других группах животных (срок жизни менее 35 дней) отклонений от соотношения 1:1 гомозигот и гетерозигот не наблюдалось (0.99 < Р < 0.95). Не было выявлено сцепления признака устойчивости к сальмонеллезной инфекции с другими исследованными локусами, для которых был проведен аналогичный анализ и соответствующая статистическая обработка. Таким образом, полученные результаты могут свидетельствовать о наличии сцепления признака устойчивости к сальмонеллезу с локусом D9Mit89 9-й хромосомы, в котором ранее был картирован локус Tbs2, участвующий в контроле туберкулезной инфекции мышей линий A/Sn и I/St. Существует вероятность наличия общих механизмов генетического контроля туберкулезной и сальмонеллезной инфекций у мышей A/Sn и I/St.

Выводы:

1. На модели сальмонеллезной инфекции у инбредных мышей с генетически детерминированными различиями восприимчивости к туберкулезу выявлено сходство контроля обеих инфекций. Сходство наблюдалось по следующим параметрам: срок жизни после заражения, характер макрофагального ответа, развитие выраженной местной воспалительной реакции у чувствительной линии, полигенный контроль признака восприимчивости к инфекции.

2. Показано, что срок жизни мышей I/St после заражения в 2 раза короче, чем срок жизни мышей A/Sn.

3. Обнаружена значительная межлинейная разница (примерно в 1 ООО раз) в количестве бактерий, высеваемых из брюшной полости и селезенок на сроке 24 часа после заражения. Этот эффект был кратковременным: разница в количестве высеваемых бактерий быстро снижалась и к 3-м суткам после заражения исчезала.

4. Межлинейная разница в количестве бактерий в очаге инфекции через 24 ч после заражения in vivo коррелировала с межлинейными различиями антисальмонеллезной активности перитониальных макрофагов in vitro.

5. Обнаружено, что количество макрофагов in vivo в очаге воспаления через 24 часа после заражения было одинаковым у мышей обеих линий, однако, количество провоспалительных цитокинов ФНО-а и ИЛ-6 у мышей чувствительной линии I/St было значительно выше, чем у мышей устойчивой линии A/Sn. У мышей линии A/Sn обнаружено достоверно большее количество В клеток CD19+.

6. Наследование признака устойчивости к инфекции по типу сверхдоминирования (генетический гетерозис), продемонстрированное ранее на модели легочного туберкулеза и свидетельствующее о полигенном характере генетического контроля этого признака, обнаружено и для сальмонеллезной инфекции.

7. Показано сцепление признака устойчивости к сальмонеллезу с локусом

D9Mit89 на 9-й хромосоме, где ранее был картирован локус Tbs2, участвующий в контроле туберкулезной инфекции. Существует вероятность участия локуса Tbs2 в генетическом контроле как туберкулезной, так и сальмонеллезной инфекций у мышей A/Sn и I/St.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Балунец, Д.В. Сравнительный анализ развития хламидийной и сальмонеллезной инфекции инбредных мышей чувствительных и устойчивых к Mycobacterium tuberculosis / Д.В. Балунец, JI.H. Нестеренко, Ю.С. Романова, Ю.С. Ашшкина, Н.И. Колкова, А.С. Апт // Медицинская иммунология. -2005.- Т. 7, № 5-6.- С.583-586.

2. Nesterenko, L.N. Mycobacterium tuberculosis-susceptible I/St mice develop severe disease following infection with taxonomically distant bacteria, Salmonella enterica and Chlamydia pneumoniae / L.N. Nesterenko D.V. Balunets, A.S. Tomova, J.M. Romanova, J.S. Alyapkina, N.A. Zigangirova, M.A. Kapina, E.V. Kondratieva, A.V. Pichugin, K.B. Majorov, and A.S. Apt // Clinical and Experimental Immunology. -2006.- V.146.- P. 93-100.

3. Балунец, Д.В. Восприимчивость к сальмонеллезу NRAMPT инбредных мышей чувствительных к туберкулезу / Д.В. Балунец, М.А. Калина, К.Б. Майоров, А.С. Апт // Бюллетень Московского общества испытателей природы.- 2009.- Т.114, выпуск 2.- С.21-23.

4. Нестеренко, JI.H. Течение хламидиоза легких у мышей инбредных линий, отличающихся по генетически детерминированной чувствительности к туберкулезу / Нестеренко JI.H., Аляпкина Ю.С., Пашко Ю.А., Кондратьева Е.В., Калина М.А., Балунец Д.В., Зигангирова Н.А., Романова Ю.М., Апт А.С. // Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. - 2010.- № 3.-С. 12-16.

5. Nesterenko, L. Chlamydia and Burkholderia pulmonary diseases of the Mycobacterium tuberculosis-susceptible I/St mice / L. Nesterenko, T. Stepanova, J.

Alyapkina, D. Balunec, E. Kondratieva, M. Kapina, N. Zigangirova, J. Romanova, A. Apt // Clinical Microbiology and Infection. -2010.- V.16, No.2.- P. S636.

6. Романова, Ю.М. Персистенция бактерий Burkholderia cenocepacia in vivo в зависимости от их способности к образованию биопленок / Ю.М. Романова, Т.В. Степанова, Л.Н. Нестеренко, Д.В. Балунец, A.JI. Андреев, Н.В. Шевлягина, Т.Г. Боровая, А.Л. Гинцбург // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунологии.- 2009.- № 4.- С. 29-33.

7. Нестеренко, JI.H. Nrampi мыши инбредной линии I/St чувствительны к развитию инфекций, вызываемых таксономически не родственными видами бактерий с внутриклеточным типом паразитизма / Л.Н. Нестеренко, Д.В. Балунец, Ю.С. Романова, Ю.С. Аляпкина, Н.А. Зигангирова, М.А. Капина, Е.В. Кондратьева, К.Б. Майоров, А.В. Пичугин, А.С. Апт // Материалы X Всероссийского научного Форума «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге». Медицинская иммунология. - 2006.- Т.8., № 2-3.- С.161-162.

8. Нестеренко, Л.Н. Экспериментальный сальмонеллез у мышей с генетически детерминированными различиями по восприимчивости к туберкулезу / Л.Н. Нестеренко, Д.В. Балунец, М.А. Капина, К.Б. Майоров, А.В. Пичугин, А.С. Апт // Материалы III научной конференции с международным участием «Проблемы инфекционной патологии в регионах Сибири, Дальнего Востока и Крайнего Севера- Новосибирск».- 2006.- С. 157158

9. Nesterenko, L.N. Mechanisms of susceptibility to infections: Mycobacterium tuberculosis-susceptible mice of the I/St strain develop severe diseases following infection with taxonomically distant intracellular bacteria / L.N. Nesterenko, D.V. Balunec, J.S. Alyapkina, E.V. Kondratieva, K.B. Majorov, A.S. Apt // Third Congress of European Microbiologists. - Gothenborg, Sweden.- 2009. - P.179.

Отпечатано в ООО «Компания Спутник+» ПД № 1-00007 от 25.09.2000 г. Подписано в печать 18.01.2011 Тираж 100 экз. Усл. п.л. 1,5 Печать авторефератов (495)730-47-74,778-45-60

Содержание диссертации, кандидата медицинских наук, Балунец, Денис Викторович

1.1 Актуальность проблемы.

1.2 Цель исследования.

1.3 Задачи исследования.

1.4 Научная новизна.

1.5 Практическая значимость.

2. Обзор литературы

2.1 Введение.

2.2 Патогенез сальмонеллезной инфекции.

2.3 Влияние макроорганизма на устойчивость/чувствительность к сальмонеллезной инфекции.

2.3.1 Ген81с11а1 (№1АМР1).

2.3.2 Ген х1<1.

2.3.3 Ген ТЬЯ4.

2.3.4 Гены МНС.

2.3.5 Гены, кодирующие НАДФ-оксидазу и Ж)-синтазу.

2.3.6 Гены цитокинов.

2.3.7 Локусы, контролирующие количественные признаки.

3. Материалы и методы

3.1 Линейные мыши.

3.2 Получение культуры & ^Ытиггит.

3.3 Экспериментальная сальмонеллезная инфекция.

3.4 Определение количества сальмонелл в органах зараженных мышей.

3.5 Получение макрофагов перитонеального экссудата.

3.6 Взаимодействие макрофагов с S.typhimurium.

3.7 Анализ клеток методом проточной цитофлуорометрии.

3.8 Определение продукции цитокинов методом ELISA.

3.9 Картирование генетических локусов, участвующих в контроле сальмонеллезной инфекции.

3.10 Статистическая обработка экспериментльных данных.

4. Результаты и обсуждение

4.1 Продолжительность жизни мышей при заражении Salmonella typhimurium.

4.2 Размножение сальмонелл в органах инфицированных животных.

4.3 Показатели иммунного ответа и характеристика воспалительной реакции в брюшной полости у мышей линий I/St и A/Sn.

4.3.1 Антибактериальная активность перитониальных макрофагов мышей линий I/St и A/Sn.

4.3.2 Показатели иммунного ответа и характеристика воспалительной реакции в брюшной полости у мышей линий I/St и A/Sn.

4.4 Сегрегационный генетический анализ признака чувствительности к сальмонеллезной инфекции.

4.5 Анализ на сцепление с генетическими локусами, участвующими в контроле туберкулезной инфекции.