Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Ответ устойчивых к апоптозу трансформированных клеток на действие рентгеновского излучения

ВАК РФ 03.03.04, Клеточная биология, цитология, гистология

Автореферат диссертации по теме "Ответ устойчивых к апоптозу трансформированных клеток на действие рентгеновского излучения"

На правах рукописи

уаа^

ШИШКОВА Жанна Валерьевна

ОТВЕТ УСТОЙЧИВЫХ К АПОПТОЗУ ТРАНСФОРМИРОВАННЫХ КЛЕТОК ИА ДЕЙСТВИЕ РЕНТГЕНОВСКОГО ИЗЛУЧЕНИЯ

03.03.04 - клеточная биология, цитология, гистология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 5 НАГ! 2014

Санкт-Петербург 2014

005548280

005548280

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институт цитологии Российской академии наук, Санкт-Петербург

Научный руководитель:

Официальные оппоненты:

Ведущая организация:

кандидат биологических наук Поспелова Татьяна Викторовна Институт цитологии РАН

кандидат биологических наук, доцент Спивак Ирина Михайловна Институт цитологии РАН Санкт-Петербург

доктор медицинских наук, профессор Имянитов Евгений Наумович Федеральное Государственное Бюджетное Учреждение «НИИ онкологии им. H.H. Петрова» Минздрава России Санкт-Петербург

Федеральное Государственное Бюджетное Учреждение «Российский научный центр радиологии и хирургических технологий» Минздрава России Санкт-Петербург

Защита диссертации состоится «30» мая 2014 года в 12 часов на заседании

Диссертационного совета Д 002.230.01 на базе Института цитологии РАН по адресу:

194064 Санкт-Петербург, Тихорецкий пр., д.4.

Адрес электронной почты Института: cellbio@mail.cytspb.rssi.ru

Сайт: http://www.cytspb.rssi.ru

Факс: 8(812) 297-35-41

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института цитологии РАН Автореферат разослан «¿§> апреля 201^г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук

/ Е.В. Каминская

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Несмотря на значительный прогресс в борьбе с опухолевыми заболеваниями, они остаются, по данным Всемирной организации здравоохрания (ВОЗ), одной из основных причин смерти в мире.

Как правило, действие современных противоопухолевых препаратов направлено на индукцию апоптотической гибели клеток. Апоптоз, или программированная клеточная гибель, является важнейшей тумор-супрессорной программой, которая активируется в ответ на различные виды стресса для предотвращения пролиферации клеток с повреждениями ДНК, мутациями или нарушениями событий клеточного цикла. В процессе неопластической трансформации или противоопухолевой терапии клетки приобретают устойчивость к апоптозу, что приводит к формированию некурабельных, агрессивных вариантов опухолей.

Альтернативной апоптозу тумор-супрессорной программой является клеточное старение, подавляющее пролиферацию клеток при внеплановой экспрессии онкогенов или повреждении ДНК. В опухолевых клетках старение может индуцироваться в ответ на действие генотоксических и дифференцировочных агентов, а также ремоделирование хроматина (Marks et al., 2004; Rodier and Campisi, 2011). Стареющие клетки необратимо останавливают полиферацию, однако сохраняют метаболическую активность и приобретают характерные морфо-функциональные признаки, включающие гипертрофию, распластывание клетки на субстрате, экспрессию ассоциированной со старением p-i алактозидазы (SA-p-Gal), активацию компонентов ответа на повреждение ДНК (DNA Damage Response, DDR-ответ), а также экспрессию и секрецию факторов роста и воспаления (Campisi and d'Adda di Fagagna, 2007). Известно, что устойчивые к апоптозу клетки сохраняют способность реализовать программу клеточного старения (Roninson, 2003), в связи с этим активация старения рассматривается как одна из наиболее перспективных стратегий подавления пролиферации опухолевых клеток.

К числу событий, решающих успех противоопухолевой терапии, относится активация аутофагии (Kondo and Kondo, 2006), являющейся эволюционно консервативным механизмом, обеспечивающим выживание клеток при различных видах стресса. Помимо цитопротекторного действия аугофагия может вызывать клеточную гибель (Majuri et al., 2007), что в случае устойчивых к апоптозу клеток приобретает первостепенное значение.

Координирующую роль в регуляции процессов старения, аутофагии и клеточной гибели играет фосфоинозитид-3-киназа (PIKK) mTOR, формирующая два комплекса mTORCl и mTORC2, различающихся по структуре и функциям. Основная роль в регуляции программы старения принадлежит комплексу mTORCl (Blagosklonny, 2012), который служит сенсором энергетического состояния клетки. Он активируется питательными веществами и ростовыми

факторами и регулирует синтез белков, биогенез рибосом, транскрипцию и аутофагию (Laplante and Sabatini, 2009).

Изучение закономерностей ответа устойчивых к апоптозу клеток на действие ДНК-повреждающих факторов, запускающих альтернативные апоптозу тумор-супрессорные программы, является важной задачей современной биологии, поскольку это необходимо для выяснения механизмов, приводящих к рецидивам опухолей и развитию устойчивости опухолевых клеток, а также поиска новых эффективных подходов противоопухолевой терапии.

Цели и задачи исследования Целью настоящей работы являлось изучение закономерностей ответа на повреждение ДНК при действии ионизирующего излучения (IR) и возможности активации тумор-супрессорной программы старения в устойчивых к апоптозу опухолевых клетках, полученных путем переноса онкогенов Е1А и Е1В-19кДа в эмбриональные фибробласты крысы. В задачи исследования входило:

1. Оценить антипролиферативное действие IR на устойчивые к апоптозу трансформированные клетки по способности вызывать блоки клеточного цикла, подавлять репликацию ДНК и пролиферацию.

2. Определить возможность активации программы клеточного старения в устойчивых к апоптозу трансформантах в ответ на действие IR и ее зависимость от длительности DDR-ответа и репарации ДНК.

3. Оценить обратимость программы старения и возможность активации аутофагии в устойчивых к апоптозу трансформантах в зависимости от активности комплекса mTORC 1 после облучения.

4. Сравнить эффективность активации программы клеточного старения в ответ на облучение или действие ингибитора гистоновых деацетштаз бутирата натрия на трансформированные клетки, устойчивые к апоптозу.

Основные положения, выносимые на защиту

1) Облучение устойчивых к апоптозу клеток Е1А+Е1В вызывает G2/M блок клеточного цикла с последующим возобновлением репликации ДНК в отсутствие клеточного деления.

2) Сохранение высокой репликативной активности после облучения трансформантов Е1А+Е1В в условиях подавленной пролиферации коррелирует с высоким уровнем экспрессии аденовирусного онкобелка Е1А и приводит к формированию гигантских полиплоидных жизнеспособных клеток с высокой генетической нестабильностью.

3) Персистенция фокусов DDR в клетках Е1А+Е1В после облучения является следствием нарушения репарации ДНК и приводит к активации обратимой программы старения.

4) В основе обратимости программы старения, индуцированной действием ГО. в устойчивых к апоптозу клетках, лежит снижение активности комплекса тТ(ЖС1.

5) Падение активности комплекса тТСЖС1 в трансформантах Е1А+Е1В после действия ГО вызывает активацию аутофагии, которая не приводит к гибели облученных клеток.

6) Преодоление ГО-индуцированного старения устойчивыми к апоптозу трансформантами сопровождается формированием новой популяции быстро пролиферирующих клеток нормального размера и плоидности.

7) В отличие от ГО, ингибитор гистоновых деацетилаз бутират натрия индуцирует полноценную программу необратимого старения в устойчивых к апоптозу трансформантах.

Научная новизна работы. В настоящей работе впервые показано, что нарушение координации процессов репликации ДНК и пролиферации в облученных клетках Е1А+Е1В, устойчивых к апоптозу, коррелирует с высоким уровнем экспрессии аденовирусного онкобелка Е1А, являющегося активатором репликации. Это приводит к формированию гигантских полиплоидных клеток, демонстрирующих признаки высокой генетической нестабильности, включающие формирование микроядер, многополярные митозы, асинхронную конденсацию хромосом и нарушение прикрепления хромосом к веретену деления. Впервые показано, что устойчивые к апоптозу клетки характеризуются нарушением ПОИ-ответа, что связано с изменением кинетики формирования и диссоциации ШЖ-фокусов, включающих рАТМ, гистон уН2АХ и белок 53ВР1. Впервые установлено, что длительная активация ООК-сигналиша в устойчивых к апоптозу клетках Е1А+Е1В связана с задержкой активации ключевых компонентов репарации ДНК путем гомологичной рекомбинации (НИ.) и негомологичного воссоединения концов (ЫНЕ1) - рекомбиназы Каё51 и киназы ОЫЛ-РК и приводит к индукции программы клеточного старения. Однако клетки Е1А+Е1В способны преодолевать индуцированное облучением старение и восстанавливать пролиферативную активность. Обратимость программы старения в устойчивых к апоптозу клетках после облучения связана с падением активности киназы тТОКС1 и активацией аутофагии. Впервые показано, что, в отличие от действия ГО, ингибитор гистоновых деацетилаз (НОАС) бутират натрия СЫаВЩ) активирует необратимую программу старения в устойчивых к апоптозу клетках.

Личный вклад автора. Все экспериментальные процедуры, описанные в работе, были проведены автором лично. Анализ подготовленных автором проб на проточном цитофлуориметре осуществлял с.н.с. Института цитологии РАН Аксенов Н. Д. Материалы, вошедшие в представленную работу, обсуждались и публиковались совместно с соавторами и научным руководителем.

Научно-практическое значение работы. Полученные данные имеют важное фундаментальное значение для понимания новых механизмов выживания опухолевых клеток, устойчивых к апоптозу. В настоящем исследовании показано, что устойчивые к апоптозу клетки способны преодолевать клеточное старение, индуцированное IR, но не действием HDAC ингибитора NaBut. Результаты работы могут быть использованы для дальнейшего изучения механизмов выживания устойчивых к апоптозу опухолевых клеток после действия ДНК-повреждающих факторов, а также для поиска новых эффективных подходов к лечению онкологических заболеваний. Оценка координации процессов клеточного старения и аутофагии может иметь практическое значение для планирования противоопухолевой терапии. Материалы диссертации могут быть использованы в учебных курсах по клеточной биологии, биологии опухолевых клеток и механизмам их резистентности.

Апробация работы. По теме диссертации опубликовано 4 статьи в рецензируемых научных журналах, основные положения представлены и обсуждены на 5 международных и российских конференциях: международной конференции «Cell Senescence in Cancer and Ageing» (Хинкстон, Кембридж, Великобритания, 2013 г.), международной школе-конференции для молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2013 г.), Третьем Съезде Общества клеточной биологии (Санкт-Петербург, 2012 г.), международной конференции «ЕМВО Meeting 2011» (Ницца, Франция, 2012 г.), Всероссийском симпозиуме «Биология клетки в культуре» (Санкт-Петербург, 2006 г.).

Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, раздела «Материалы и методы исследования», результатов, обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы. Материалы диссертации изложены на J3j> страницах машинописного текста и содержат 3& рисунков и £ таблиц^. Работа выполнена при финансовой поддержке программы Российской академии наук (МКБ-РАН), Российского фонда фундаментальных исследований (грант № 13-04-00552) и программы Санкт-Петербургского государственного университета (1.38.247.2014).

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Клеточные линии и их культивирование. В работе использовали эмбриональные фибробласты крысы (REF) и полученную из них трансформированную клеточную линию. Для трансформации использовали район HindlllG аденовируса типа 5 человека, кодирующий белок Е1А и вирусный аналог антиапоптотического белка человека Bcl-2 - Е1В-19 кДа. Клетки культивировали при 37 °С в атмосфере, содержащей 5 % СОг, на пластиковых чашках в среде Игла в модификации Дальбекко с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки, 100 ед/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина. Клетки подвергали рентгеновскому

облучению в дозе 6 Гр или культивировали с NaBut в концентрации 10 мМ и анализировали в течение 20 сут, смену питательной среды производили через каждые двое суток.

Кривые роста. Клетки сеяли на пластиковые чашки диаметром 30 мм в трех повторах, с начальной плотностью 3x104 клеток на чашку. Кривые роста строили на основании ежедневного подсчета клеток в камере Горяева.

Оценку анализа жизнеспособности клеток проводили методом прижизненной окраски акридиновым оранжевым и бромистым этидием. Клетки выращивали на покровных стеклах и помещали в смесь акридинового оранжевого и бромистого этидия (1:1) в PBS и немедленно анализировали с помощью микроскопа Leica TCP SP5 (Leica Microsystems, Германия). Процентное содержание живых клеток вычисляли в результате подсчета 200 клеток в трех независимых экспериментах.

Оценка жизнеспособности клеток по клоногенной выживаемости. Жизнеспособность клеток оценивали по эффективности формирования клонов в редком посеве, как было описано ранее (Шитикова и др., 2011). Подсчет клонов производили с помощью микроскопа Zeiss Pascal (Carl Zeiss AG, Германия) при увеличении 10х 10.

Антитела. В качестве первых антител использовали: El А, рибосомный белок S6, pS6, р4Е-ВР, pATMSer1981, 53ВР1, p-p53Ser'5, LAMP1, GAPDH (все Cell Signaling Technology, США), Rad51 (Santa Cruz Biotechnology, США), BrdU (GenTex, США), yH2AX и pDNA-PKcsSer2056 (Abeam, Великобритания), а-тубулин (Sigma, США), LC3 (MBL, Япония); и вторых антител: Alexa-fluor 488, Alexa-fluor 568 (все Invitrogen, США), антитела против иммуноглобулинов кролика и мыши, конъюгированные с пероксидазой хрена (Sigma, США).

Проточная цитометрия. Анализ распределения клеток по фазам клеточного цикла проводили, как описано ранее (Шитикова и др., 2011).

Исследование морфологии клеток. Морфологические изменения клеток изучали на препаратах, окрашенных гематоксилином и эозином, как описано ранее (Pospelova et al., 2013). Анализ препаратов проводили в проходящем свете при увеличении 10x40, на микроскопе Zeiss Pascal (Carl Zeiss AG, Германия).

Анализ активности ß-галактозидазы, ассоциированной со старением (SA-ß-Gal). Клетки выращивали на покровных стеклах, фиксировали параформальдегидом и окрашивали, как описано ранее (Pospelova et al., 2013). Степень активации SA-ß-Gal в клетках определяли с помощью микроскопа Zeiss Pascal, при увеличении 10x20. Процентное содержание SA-ß-Gal-положительных клеток определяли после подсчета 200 клеток в трех независимых экспериментах.

Определение плоидности гигантских клеток с помощью окраски по Фельгену. Клетки выращивали на покровных стеклах, фиксировали холодным метанолом (-20 °С), подвергали гидролизу в 5н растворе HCl и инкубировали в реагенте Шиффа.

Образцы последовательно промывали свежими сернистыми водами, водой высокой степени очистки и обезвоживали в 96 %-ном этаноле. Изображения получали с помощью микроскопа Axioscope - DFC360 (Carl Zeiss AG, Германия), содержание ДНК рассчитывали как интегральную оптическию плотность при помощи программного обеспечения компании VideoTesT (Санкт-Петербург, Россия) для 100 клеток в трех независимых экспериментах.

Иммуноблотинг. Экстракцию тотального белка, разделение белков в SDS-PAAG проводили по стандартным методикам. Детекцию иммунокомплексов осуществляли методом усиленной хемилюминесценции (ECL, Fisher Scientific,США).

Нммунофлуоресцентная окраска клеток и конфокальная микроскопия. Окраску клеток проводили, как описано ранее (Pospelova et al., 2013). Препараты анализировали с использованием лазерного сканирующего микроскопа Leica TCP SP5 (Leica Microsystems, Германия). Подсчет числа фокусов уН2АХ, 53ВР и рАТМ осуществляли для 200 клеток в трех независимых экспериментах. Анализ интенсивности флуоресценции проводили с помощью программы ImageJ (U.S. National Institutes of Health, США).

Анализ синтеза ДНК no включению бромдезоксиуридина (BrdU). Клетки выращивали на покровных стеклах, добавляли 10 мкМ/мл BrdU (BD, США) и инкубировали в течение 1 ч для определения числа клеток, реплицирующих ДНК. Клетки фиксировали холодным метанолом (-20 °С), денатурировали ДНК обработкой 2.5н раствором HCl с последующей нейтрализацией 0.2М боратным буфером (pH 8). Препараты окрашивали с помощью антител к BrdU и анализировали, как описано для иммунофлуоресцентной окраски. Процентное содержание BrdU-положительных клеток вычисляли на основе подсчета 200 клеток в трех независимых экспериментах.

Анализ разрывов ДНК с помощью щелочного гель-электрофореза одиночных клеток (метод ДНК-комет). Выявление разрывов ДНК проводили, как описано ранее (Pospelova et al., 2009). Анализ ДНК-комет осуществляли с помощью программного обеспечения CaspLab (CaspLab.com).

Статистический анализ. Проводился с помощью программы Microsoft Excel 2010 (Microsoft Corporation, США).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Устойчивые к апоптозу трансформанты Е1А+Е1В отвечают на облучение блоком G2/M и подавлением пролиферации, с сохранением репликативной активности ДНК, приводящей к формированию гигантских полиплоидных клеток с высокой генетической нестабильностью. Для оценки антипролиферативного действия рентгеновского излучения на устойчивые к апоптозу клетки была исследована способность трансформантов Е1А+Е1В реализовать блоки клеточного цикла, а также прекращать репликацию ДНК и пролиферацию.

Методом проточной цитометрии было показано, что в ответ на облучение исследуемые клетки реализовали G2/M блок, после чего вновь вступали в клеточный цикл (Рис. 1. А). При этом в популяции отмечалось накопление полиплоидных клеток (Рис. 1, А), которое говорит о нарушении G2/M чекпоинт-контроля в трансформантах Е1А+Е1В. Согласно данным по включению BrdU, репликация ДНК в облученных клетках сохранялась в течение длительного времени (Рис. 1. Б), однако анализ кривых роста показал полное подавление клеточной пролиферации в периоде первых по седьмые сутки после облучения (Рис. I, В).

Контроль IR4 4

IR 18ч

ь:

IR 24 ч

IR 48 ч

19.1 5: 27.2

Poly. 11.0 1

S: 35.1 Poly: 18.3

2С 4С 8С 2С 4С 8С

Контроль IR 1 сут

DSPI» » Д ' ' »l» •? 0 >* Ö*. *« ' •« ,,^5 мкм t> 7.5 мкм

IR 2 сут IR 15 сут

4 'Л 7.5 мкм 7,5 мкм

350

О 300 3 250

X

¡2 200 QJ

* 150 О

5 loo

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 11 И 15 16 17 18 19 70 21 Время, сут

Рисунок 1. Рентгеновское излучение вызывает в2/М блок клеточного цикла в клетках Е1А+Е1В и временную остановку пролиферации при сохранении репликации ДНК. (А) Распределение клеток по фазам клеточного цикла в контроле и после облучения. По горизонтальной оси указано содержание ДНК. Показано процентное содержание клеток в в фазе и доля полиплоидных клеток. (Б) Анализ репликации ДНК в клетках Е1А+Е1В до и после облучения по включению Вгби. (В) Динамика пролиферации клеток Е1А+Е1В в контрольной и облученной популяциях. Указаны средние значения по трем повторам и стандартные ошибки среднего.

Сохранение репликации ДНК при подавленном клеточном делении в трансформантах Е1А+Е1В приводило к формированию гигантских многоядерных высокополиплоидных клеток с нарушенной морфологией (Рис. 2, А и Б). Методом окраски ДНК по Фельгену и последующим измерением интегральной оптической плотности было обнаружено, что через одни сутки после облучения содержание ДНК в клетках достигало 24С - 26С (Рис. 2, Б), а уже через трое суток популяция была представлена клетками с содержанием ДНК 16С - 60С (Рис. 2, Б). Более того, гигантские клетки продолжали реплицировать ДНК (Рис. 1, Б),

и на двадцатые сутки плоидность клеток могла превышать 1000С (Рис. 2, Б), что говорит о нарушении координации процессов репликации и пролиферации в облученных трансформантах.

Конститутивная репликация ДНК в клетках Е1А+Е1В может быть связана с высоким уровнем экспрессии аденовирусного белка El А, который инактивирует негативный регулятор перехода клеток из Gl в S фазу - белок pRb, приводя к высвобождению транскрипционного фактора E2F и тем самым способствуя транскрипции генов S-фазы (Bagchi et al., 1990; Hiebert et al., 1992; Johnson et al., 1993). Действительно, экспрессия E1A, в особенности его 128изоформы, являющейся активатором репликации ДНК и пролиферации (Quinlan and Grodzicker, 1987), оставалась высокой на протяжении всего срока исследования клеток (Рис. 2, В).

а

\

2.5 мкм

В

VHS - -•«¿•Ш-;2ЬЁ1А

-■ I щ _ -GAPDH

jf 1 2 3 1 5 7 10 15 20

^ Время после IR, сут

^ Контроль

Рисунок 2. Репликация ДНК при подавленной пролиферации приводит к формированию гигантских полиплоидных клеток с нарушенной морфологией и высокой генетической нестабильностью. , (А) Микрофотографии контрольных и облученных клеток, окрашенных гематоксилином и эозином, проходящий свет, увеличение 10*40. (Б) Гистограмма распределения клеток Е1А+Е1В по содержанию ДНК в зависимости от времени после облучения. (В) Вестерн-блот анализ экспрессии Е1А в клетках \ Е1А+Е1В до и после облучения. (Г) Признаки генетической нестабильности в облученных клетках Е1А+Е1В: (а) - формирование хромосомных мостов в ходе деления клеток, (б) - многополярный митоз и асинхронная конденсация хромосом, (указано стрелками).

Таким образом, в основе формирования гигантских высокополиплоидных клеток в устойчивых к апоптозу трансформантах Е1А+Е1В лежит неконтролируемая репликативная активность при подавленной пролиферации.

Облученные клетки демонстрировали признаки высокой генетической нестабильности, такие как формирование микроядер (Рис. 2, А) и многополярных митозов (Рис. 2, Г). Кроме того, было обнаружено образование хромосомных мостов, нарушение прикрепления хромосом к веретену деления и их асинхронная конденсация (Рис. 2, Г). В основе генетической нестабильности исследуемых клеток, помимо IR-индуцированных разрывов и перестроек хромосом, может лежать увеличение плоидности клеток. Известно, что увеличение содержания ДНК осложняет процессы контроля за целостностью генома и способствует генетической нестабильности (Cornai, 2005). Генетическая нестабильность является одной из важнейших характеристик опухолевых клеток, которая лежит в основе их генетической пластичности и повышает эффективность отбора путем селекции наиболее быстро пролиферирующих, устойчивых вариантов.

Облученные клетки Е1А+Е1В характеризуются нарушением DDR-omeema и персистенцией фокусов DDR. В ответ на действие IR происходит быстрая активация и накопление факторов DDR-ответа, таких как рАТМ, -/Н2АХ и 53ВР1, в местах повреждений ДНК и формирование фокусов DDR. В норме фокусы DDR выявляются уже через 3 мин после облучения, достигая максимального количества и размера через 30 мин и диссоциируют через 24 ч (Sedelnikova et al., 2003). Длительная персистенция фокусов DDR может приводить к апоптозу или активации программы старения (Fumagalli et al., 2012; Nöda et al., 2012).

Активацию DDR-ответа в клетках E1A+EIB определяли, исследуя динамику формирования фокусов рАТМ, уН2АХ и 53ВР1. Известно, что начальным этапом DDR-ответа после повреждения ДНК является фосфорилирование киназы ATM по Serl 981 (рАТМ) и ее транслокация в ядро, где она активирует модуляторы DDR-ответа: гистон Н2АХ и белок 53ВР1, формирующие молекулярную платформу для привлечения факторов репарации к сайтам повреждений. Одновременно с этим происходит ATM-зависимое фосфорилирование тумор-супрессорного белка р53 по Serl5, которое необходимо для остановки клеточного цикла и осуществления чекпоинт-контроля. В клетках Е1А+Е1В формирование фокусов рАТМ отмечалось уже через 30 мин после облучения (Рис. 3, А), и одновременно происходило фосфорилирование белка р53 (Рис. 3, Б). Однако в течение длительного времени после облучения наблюдалась персистенция фокусов рАТМ (Рис. 3, А). Нарушение диссоциации фокусов рАТМ в клетках Е1А+Е1В приводило к пролонгированной DDR-зависимой активации р53, сохраняющейся через одни сутки после облучения (Рис. 3, Б).

Б

р-р53 (Serl 5)

GAPDH

|> ЗОмин 1 5 10 15 20 ^ сут, после IR

Рисунок 3. Анализ активации раннего этапа DDR-ответа по фосфорилированию ATM и р53 в клетках Е1А+Е1В после облучения. (А) Иммунофлуоресцентный анализ формирования и персистенции фокусов рАТМ в клетках Е1А+Е1В. (Б) Вестерн-блот анализ ATM-зависимой активации р53 в клетках Е1А+Е1В.

Формирование фокусов уН2АХ и 53ВР1 в трансформантах Е1А+Е1В происходило с разной кинетикой. Максимальное число фокусов уН2АХ отмечалось уже через 30 мин после действия 1R (Рис. 4, А и Б), однако число фокусов 53ВР1 в исследуемых трансформантах достигало максимума только через одни сутки после облучения (Рис. 4. А и В), что говорит о задержке активации 53ВР1. Кроме того, облученные клетки Е1А+Е1В развивали более слабый ответ на повреждение ДНК, чем REF, поскольку формировали меньшее число фокусов уН2АХ и 53ВР1. Так, через 30 мин после действия IR среднее число фокусов уН2АХ в клетках Е1А+Е1В было в два раза ниже, а фокусов 53ВР1 в десять раз меньше, чем в REF, использованных в качестве контроля (Рис. 4. Б и В). В нормальных фибробластах фокусы

рАТМ, уН2АХ и 53ВР1 полностью исчезали через одни сутки после облучения, тогда как в клетках Е1А+Е1В они персистировали вплоть до двадцатых суток (Рис. 4). Таким образом, в клетках Е1А+Е1В нарушено как формирование, так и диссоциация фокусов ООЯ-ответа. что приводит к их персистенции.

Контроль

IR 30 мин

IR 1 сут

IR 5 сут

IR 20 сут

уН2АХ I •

■З.П'.Г' * - ■ » • '

П'Л-Ï

vHMX 5 мкм • - з 5 м км .. 5мкм - Ь . 9 " 5 мкм 7.5 мкм

REF

. \ 1 а

" \ s N

Е1А+Е1В

сут, после IR

о. во пг

к 70 m

£ 60

Я 50 Iп

m 40

О

_о 20

о 10 с

s о

REF

Е1А+Е1В -■--}

30 мин 1

10 20

сут, после IR

Рисунок 4. Кинетика формирования и диссоциации фокусов уН2АХ и 53ВР1 в трансформантах Е1А+Е1В после облучения. (А) Персистенция фокусов уН2АХ и 53ВР1 в клетках Е1А+Е1В, иммунофлуоресцентная окраска. Сравнительные диаграммы кинетики формирования фокусов уН2АХ-(Б) и 53ВР1 - (В) в клетках Е1А+Е1В и REF. Указаны средние значения по трем повторам и стандартные ошибки среднего.

Персистенция фокусов DDR в клетках Е1А+Е1В после действия IR является следствием нарушения репарации ДНК. Известно, что персистирующие фокусы могут маркировать не только места разрывов ДНК, но также и зоны с измененной структурой хроматина. Для выяснения зависимости персистенции фокусов от существования разрывов ДНК в облученных клетках Е1А+Е1В, было исследовано формирование комет гель-электрофорезом одиночных клеток. Разрывы ДНК в облученных клетках выявлялись не только сразу после облучения, но и через длительное время после действия IR (Рис. 5, А и В) в отсутствие гибели клеток (Рис. 5, Б). Кроме того, все клетки в популяции формировали кометы (Рис. 5, В) в течение четырех суток после облучения, в этот период не изменялись длина хвоста и момент хвоста комет (Рис. 5, Г и Д), отражающих степень повреждения ДНК. Однако начиная с пятых суток наблюдалось снижение данных показателей и уменьшение числа клеток, образующих кометы (Рис. 5, В, Г и Д).

Среди повреждений ДНК, вызываемых IR, наиболее опасными для клетки являются двойные разрывы (DSBs), так как они могут приводить к накоплению мутаций или гибели клетки. Репарация DSBs в клетках млекопитающих осуществляется посредством гомологичной рекомбинации (HR) и негомологичного воссоединения концов (NHEJ). В связи с нарушением DDR-ответа и персистенцией повреждений ДНК в клетках Е1А+Е1В была исследована активация факторов репарации: ДНК-рекомбиназы Rad51, участвующей в HR-репарации, и киназы DNA-PK, необходимой для репарации путем NHEJ.

Согласно результатам иммунофлуоресцентной окраски, через 30 мин после облучения в клетках Е1А+Е1В отсутствовал белок Rad51 (Рис. 6, А). Незначительное увеличение интенсивности флуоресценции Rad51, отражающее накопление белка репарации, отмечалось только через одни сутки после облучения (Рис. 6, А). Однако на пятые сутки после действия IR содержание Rad51 увеличивалось более чем в десять раз и оставалось высоким до двадцатых суток. В отличие от трансформантов Е1А+Е1В, в REF, использованных в качестве контроля, HR-репарация активировалась уже через 30 мин после действия IR и завершалась через одни сутки после облучения (Рис. 6, А).

В облученных клетках Е1А+Е1В была исследована активация киназы DNA-PK согласно фосфорилированию каталитической субъединицы DNA-PKcs по Ser2056 (DNA-PKcsSer~'b6). Несмотря на накопление DNA-PKcsSer205i' уже через несколько минут после облучения (Рис. 6, Б) она оставалась активированной длительное время после действия IR (Рис. 6, Б). Как ив случае с Rad51, интенсивность флуоресценции DNA-PKcsSer2056 существенно возрастала на пятые сутки после облучения и оставалась высокой до двадцатых суток (Рис. 6, Б). В отличие от клеток Е1А+Е1В , REF завершали репарацию ДНК путем NHEJ уже через одни сутки после действия IR (Рис. 6, Б). Полученные данные указывают на нарушение репарации ДНК путем HR и NHEJ в устойчивых к апоптозу клетках Е1А+Е1В.

2 3 5 7 10 15 20 Время после Ш, сут

, 1 э 1 Ю 15 20 Время после Щ, сут

Рисунок 5. Нарушение активации ОйИ-ответа и репарации ДНК в клетках Е1А+Е1В приводит к длительной персистенции нерепарированных повреждений. (А) Анализ разрывов ДНК методом гель-электрофореза одиночных клеток. (Б) Анализ жизнеспособности клеток в зависимости от времени после облучения на основе подсчета клеток, окрашенных акридновым оранжевым и бромистым этидием. Диаграммы изменения частоты образования комет - (В), длины хвоста - (Г) и момента хвоста комет - (Д), в зависимости от времени после облучениям. Длина хвоста и момент хвоста комет указаны в относительных единицах. На диаграммах даны средние значения по трем повторам и стандартные ошибки среднего.

Нужно отметить, что значительное увеличение интенсивности флуоресценции Яас)51 и ОЫА-РКс88ег2,1М' в клетках Е1А+Е1В, отражающее содержание данных белков, в период с пятых по двадцатые сутки после действия 1Я, коррелировало с постепенным уменьшением числа клеток с повреждениями и степенью повреждения ДНК (Рис. 5 и 6, А, Б). Полученные данные говорят о неспособности трансформантов Е1А+Е1В репарировать повреждения ДНК в течение четырех суток после облучения, однако указывают на возможность восстановления репаративной способности после этого времени. Кроме того, формирование облученными клетками Е1А+Е1В микроядер, содержащих уН2АХ и Яас)51 (Рис. 6, В), указывает на элиминацию поврежденной ДНК из клеток, что также может приводить к уменьшению числа клеток с повреждениями и степени повреждения ДНК и тем самым способствовать поддержанию жизнеспособности облученных трансформантов.

Таким образом, формирование комет, нарушение кинетики активации ключевых компонентов репарации ДНК, таких как 11ас151 и ЭЫА-РК, а также интенсивное образование микроядер говорят о дефектах репарации ДНК в облученных клетках Е1А+Е1В, приводящих к персистенции повреждений ДНК и продолжительной активации ОйЯ-сигналинга.

А

Rad51

DNA-PKcs

S2056

■ Е1А+Е1В □ REF

III

и 1 —--——'-— i? 30 мин 1 5 10 20

сут, после IR

ЭАР ПаиЗ ' ЬА=>| ' , -.„• - -

Рисунок 6. Кинетика активации ключевых компонентов репарации ДНК путем HR и NHEJ в клетках Е1А+Е1В нарушена. (А) Анализ активации Rad51 в клетках Е1А+Е1В и REF. (Б) Анализ активации DNA-PK по накоплению DNA-PKs2m в клетках Е1А+Е1В и REF. По вертикальной оси показана интенсивность флуоресценции в относительных единицах. На диаграммах (А) и (Б) указаны средние значения по трем повторам и стандартные ошибки среднего. (В) Элиминация поврежденной ДНК путем формирования микроядер, содержащих /Н2АХ и Rad51.

В ответ на облучение устойчивые к апоптозу трансформанты Е1А+Е1В активируют обратимую программу старения. Продолжительная активация DDR-сигнапинга является одним из главных индукторов клеточного старения (d'Adda di Fagagna, 2008). Персистенция DDR фокусов может быть следствием нарушения репарации повреждений ДНК, образовавшихся в результате генотоксического воздействия или репликативного стресса, а также может отражать изменения структуры хроматина, возникающие в ходе старения (Di Micco et al., 2006; Pospelova et al., 2009; Fumagalli et al., 2012).

Наряду с экспрессией SA-p-Gal, персистирующие фокусы DDR относятся к широко используемым маркерам клеточного старения. Как было показано, фокусы DDR персистировали в облученных трансформантах Е1А+Е1В в течение длительного времени (Рис. 4). Активация SA-p-Gal в клетках Е1А+Е1В отмечалась на пятые сутки после действия IR,

и к десятым суткам наблюдалось накопление 8А-р-Оа1-положительных клеток (Рис. 7, А и Б). Кроме того, облученные клетки приобретали характерные для старения морфологические изменения, такие как увеличение размера и распластывание на субстрате (Рис. 2, А). Таким образом, можно заключить, что продолжительная активация ООП-сигнального каскада, связанная с нарушением репарации ДНК. приводит к активации старения в устойчивых к апоптозу клетках Е1А+Е1 В.

Главным признаком старения является необратимая остановка пролиферации, однако согласно кривой роста подавление пролиферации в трансформантах Е1А+Е1В отмечалось только в течение шести суток после облучения, а затем наблюдался прирост числа клеток в популяции (Рис. 1, В). В период с десятых по двадцатые сутки после облучения было обнаружено почти двадцатикратное уменьшение числа 8А-Р-Оа1-положительных клеток (Рис. 7, Б) и появление в популяции клеток нормального размера, не экспрессирующих 8А-р-Оа1 (Рис. 7, А), а также накопление клеток нормальной плоидности (Рис. 2, Б). В отсутствие клеточной гибели это говорит об обратимости старения, вызванного действием 1Я в устойчивых к апоптозу трансформантах.

Таким образом. II? не способно вызвать необратимую программу старения в устойчивых к апоптозу клетках Е1А+Е1В, а приводит к полиплоидизации, высокой генетической нестабильности, активации обратимого старения с последующим восстановлением пролиферации.

Рис. 7. Облученные клетки Е1А+Е1В активируют обратимую программу клеточного старения. (А) Экспрессия ЭА-р-ва! в облученных клетках: (а) - 8А-р-ва1-положительные гигантские клетки, (б) - 5Аф-ва1-негативные клетки нормального размера. Микрофотографии сделаны в проходящем свете, увеличение 10x20. (Б) Диаграмма изменения доли 5А-р-ва1-положительных клеток в зависимости от времени после облучения.

Обратимость /Я-индуцированного старения в клетках Е1А+Е1В связана с подавлением активности тТО!{С1 и активацией аутофагии. Считается, что в основе активации необратимой программы старения лежит повышение активности комплекса тТСЖО. тогда как его подавление приводит к отмене героконверсии, то есть к отмене перехода покоящихся клеток, еще сохраняющих способность к пролиферации, в состояние старения (В^овЫоппу, 2012). В связи с этим была исследована активность комплекса тТ(ЖС1 после действия которую оценивали по фосфорилированию его мишеней - рибосомного белка Б6 и ингибитора фактора инициации трансляции белка 4Е-ВР1.

1

^ Время после 1И сут ^ Время после 1К сут

# 1 2 3 4 5 7 10 15 20 ^ 1 2 5 4 5 7 10 15 20

1.00 0.89 0 90 0.:? 0.19 0.22 С-23 0.19 020 0.18 рБ6 ¡ 50 0.93 0.77 026 0/1 0.Д 023 0.19 С.0/ 0.10 р4Е-ВР1

В

л с О а.

и 1/1 сс

Рис. 8. Облучение вызывает подавление активности тТОИС1 и активацию аутофагии в трансформантах Е1А+Е1В. (А) Снижение активности комплекса тТОРС1 в облученных клетках Е1А+Е1В, числа показывают результаты денситометрии. (Б) Вестерн-блот анализ конверсии ЮЗ-/ в 1СЗ-Н. (В) Колокализация 1СЗ и 1.АМР1 указывает на формирование аутолизосом.

Активация программы старения в исследуемых трансформантах происходила на фоне изменения активности комплекса тТ(ЖС1. В первые дни после облучения активность тТСЖС1 оставалась высокой, а затем значительно снижалась и оставалась подавленной до двадцатых суток после облучения (Рис. 8, А). Таким образом, снижение активности тТ(ЖС1 в облученных клетках Е1А+Е1В может быть фактором, предопределяющим обратимость программы старения.

Известно, что подавление активности mTORCl приводит к активации аутофагии. Действительно, одновременно с падением активности mTORCl в клетках Е1А+Е1В отмечалась конверсия цитоплазматической изоформы белка LC3-I в форму LC3-II (Рис. 8, Б), связанную с мембранами аутофагосом, а также колокализация LC3 с белками лизосомной мембраны LAMP1 (Рис. 8, В), что roBoptrr об активации аутофагии и формировании аутолизосом в облученных клетках.

Отсутствие интенсивной гибели облученных трансформантов Е1А+Е1В и сохранение высокой жизнеспособности гигантских полиплоидов в течение всего срока эксперимента (Рис. 5, Б) позволяет заключить, что аутофагия в этом случае обладает цитопротекторным действием и повышает жизнеспособность облученных клеток. Несмотря на данные ряда авторов о положительной роли аутофагии в активации программы старения (Young et al, 2009). известно, что она также может способствовать преодолению старения и репрограммированию клеток (Menendez et al, 2011).

HDAC-ингибитор NaBut вызывает подавление репликации ДНК, остановку пролиферации и включает необратимую программу старения в клетках Е1А+Е1В. В связи с тем, что повреждение ДНК не является эффективной антипролиферативной стратегией в устойчивых к апоптозу клетках, мы сравнили действие IR и модификатора структуры хроматина - HDAC ингибитора NaBut. Ингибиторы HDAC являются перспективными противоопухолевыми препаратами, которые способны вызывать дифференцировку, апоптоз и старение в различных типах опухолевых клеток (Marks et al., 2004).

А СП

MOD

70 X 900

5.» Ъ. so \ 2 800 700

1 £ 50- i * 600

£ £ 1 § 5Ш

1 S зо| I S

i § "О 20- * 200

сБ 11 * изо

О 1 0

-13SE1A -I2S61A

Время инкубация с NaBut, сут

8рм инкубации с NaSut, е.ут

1 ; 5 4 s б ? а * гсн ¡гт*¡s к tr к turn бремя, сут

Рис. 9. МзЕМ подавляет репликацию ДНК и пролиферацию в клетках Е1А+Е1В . (А) Диаграмма изменения количества клеток, реплицирующих ДНК, в зависимости от времени обработки ЫаВЛ (Б) Динамика пролиферации клеток Е1А+Е1В в контрольной и обработанной ЫаВЖ популяциях. (В) Вестерн-блот анализ влияния МаВи( на экспрессию белка Е1Ав клетках Е1А+Е1В.

Исследование антипролиферативного действия №ВЩ показало, что он приводит к необратимому подавлению репликации ДНК и пролиферации в клетках Е1А+Е1В. не возобновляющихся через длительные сроки обработки (Рис. 9, А и Б). Как было показано, нарушение контроля клеточного цикла после действия Ш и перманентная репликация ДНК

в облученных клетках Е1А+Е1В коррелировали с высокой экспрессией аденовирусного онкогена Е1А(Рис. 2, В). В отличие от облучения, МаВШ подавлял экспрессию как 138, так и 12Б изоформ белка Е1А в устойчивых к апоптозу трансформантах уже на первые сутки воздействия (Рис. 9, В).

В результате необратимой остановки пролиферации трансформантов Е1А+Е1В при действии ИаВш активировалась программа старения, согласно накоплению в популяции клеток, экспрессирующих 5А-р-Оа1 (Рис. 10, А). При этом не отмечалось уменьшения числа 8А-р-Оа1-положительных клеток и прироста числа клеток в популяции по кривой роста через длительные сроки наблюдения (Рис. 9. Б, 10 А). Кроме того, клетки Е1А+Е1В не пролиферировали в клональном посеве уже через семь суток после обработки МаВш (Рис. 10, Б), что говорит о необратимости действия данного ингибитора на пролиферативный -потенциал клеток.

Таким образом, обработка устойчивых к апоггтозу клеток КаВШ приводит к подавлению репликации ДНК и пролиферации и индуцирует необратимую программу клеточного старения в отличие от ГО..

с №ВЛ, сут с сут

Рис. 10. ЫаВМ идуцирует необратимую программу старения в клетках Е1А+Е1В. Динамика накопления 5А-(3-ва1-положительных клеток - (А) и клоногенная выживаемость клеток Е1А+Е1В - (Б) в зависимости от длительности обработки ЫаВи1

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Действие ГО на устойчивые к апоптозу трансформанты Е1А+1В вызывает формирование гигантских высоко-полиплоидных клеток вследствие репликации ДНК в условиях подавленного клеточного деления. Устойчивость к апоптозу позволяет клеткам реплицировать ДНК даже в присутствии нерепарированных разрывов, обеспечивая сохранение жизнеспособности и достижение высокополиплоидного состояния. Ранее было показано, что увеличение содержания ДНК в клетке приводит к изменению организации хроматина, что осложняет правильное функционирование генетического материала, а также является причиной высокой генетической нестабильности. Более того, увеличение плоидности приводит

к изменению характера эксиресеиии генов за счет амплификации их копий и эпигенетических изменений, тем самым может способствовать экспрессии белков, обеспечивающих выживание клетки (Cornai et al., 2005).

Результаты нашей работы говорят о том, что в устойчивых к апоптозу опухолевых клетках, помимо подавления про-апоптотических и активации анти-апоптотических сигнальных каскадов, возможна активация различных программ, обеспечивающих выживание. К ним относятся полиплоидшация, высокая генетическая нестабильность и аутофагия, которые в условиях подавленной клеточной гибели увеличивают адаптативную способность клеток и дают возможность реализовать различные стратегии для обеспечения выживания популяции. Преодоление программы старения трансформантами Е1А+Е1В после действия IR завершалось появлением клеток с размером и содержанием ДНК близким к необлученным клеткам. Мы не знаем точных механизмов их образования, однако наиболее целесообразной для дальнейшей работы может быть концепция деполиплоидизации. Недавно было показано, что полиплоидизация является одним из способов, обеспечивающих выживание опухолевых клеток, а новая быстро пролиферирующая популяция может формироваться в результате деполиплоидизации путем многополярных митозов или редукции генетического материала за счет аутофагической деградации ДНК (Puig et al., 2008; Relio-Varona et al., 2012). Сформировавшаяся популяция пролиферирующих клеток характеризуется содержанием ДНК близким к диплоидному, а также более высокой степенью резистентности и злокачественности (Puig et al., 2008).

ВЫВОДЫ

1. В облученных устойчивых к апоптозу трансформантах блок G2/M клеточного цикла и подавление пролиферации при сохранешш репликативной активности являются причиной формирования жизнеспособных гигантских полиплоидных клеток, характеризующихся высокой генетической нестабильностью.

2. Индукция программы старения в устойчивых к апоптозу клетках в ответ на облучение связана с персистенцией DDR-фокусов рАТМ, уН2АХ и 53ВР1 и длительной активацией DDR-сигналинга, которые являются следствием нарушения репарации ДНК путем гомологичной рекомбинации и негомологичного воссоединения концов, а именно задержки активации Rad51 и DNA-PK.

3. Преодоление программы клеточного старения, индуцированного IR, в устойчивых к апоптозу трансформантах обусловлено снижением активности комплекса mTORCl и активацией процесса аутофагии.

4. Использование IR не является эффективной противоопухолевой стратегией в отношении устойчивых к апоптозу опухолевых клеток, так как не приводит к их гибели или необратимому старению. В отличие от действия IR, применение модификатора

хроматина - ингибитора гистоновых деацетилаз NaBut, является перспективным подходом в борьбе с устойчивыми к апогггозу клетками, так как приводит к индукции необратимой программы старения.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Chitikova Z.V., Gordeev S.A., Bykova T.V., Zubova S.G., Pospelov V.A., Pospelova T.V. Sustained activation of DNA damage response in irradiated apoptosis-resistant cells induces reversible senescence associated with mTOR downregulation and expression of stem cell markers. Cell Cycle. 2014. 7; 13(9): 1424-1439.

2. Pospelova T.V., Chitikova Z.V., Pospelov V.A. An integrated approach for monitoring cell senescence. In Cell Senescence: Methods and Protocols. In the series "Methods in Molecular Biology" (Humana Press, series editor John Walker). 2013; 965:383^108.

3. Зубова С.Г., Шнтнкова Ж.В., Поспелова T.B. TOR-центрическая концепция регуляции митогенных, метаболических и энергетических сигнальных путей в клетке. Цитология. 2012; 54(8):589—602.

4. Шишкова Ж.В., Аксенов Н.Д., Поспелов В.А., Поспелова Т.В. Индукция клеточного старения ингибитором гистоновых деацетилаз бугиратом натрия в трансформантах грызунов, устойчивых к апоптозу. Цитология. 2011; 5(3): 235-242.

5. Chitikova Z.V., Gordeev S.A., Pospelov V.A., Pospelova T.V. Rescue from senescence of irradiated apoptosis resistant cells associates with expression of self-renewal markers and autophagy. Материалы международной конференции Cell Senescence in Cancer and Ageing. Хинкстон, Кембридж, Великобритания, 20-23 июля 2013 г. Abstracts. P. 12.

6. Шишкова Ж.В., Гордеев С.А., Поспелов В.А., Поспелова Т.В. Анализ активации альтернативных тумор-супрессорных программ в устойчивых к апоптозу клетках при действии облучения и ингибитора гистоновых деацетилаз. 17-я международная школа-конференция «Биология - наука XXI века». Пущино, 2-26 апреля 2013 г. Тезисы. С. 468.

7. Шнтнкова Ж.В., Гордеев С.А., Поспелова Т.В. Исследование тумор-супрессорных программ старения и аугофагической гибели в ответ на действие облучения в опухолевых клетках, устойчивых к апоптозу. Третий съезд Общества клеточной биологии. Санкт-Петербург, 16-18 октября 2012. Цитология. 54: 712-713.

8. Chitikova Z.V., Gordeev S.A., Pospelov V.A., Pospelova T.V. Survival of apoptosis-resistant cells after X-ray irradiation involves expression of stem cell markers and activation of autophagy. Материалы международной конференции The 4Л EMBO Meeting. Ницца, Франция, 22-25 сентября, 2012 г. Abstracts. P. 237.

9. Шитикова Ж.В., Аксенов Н.Д., Поспелова Т.В. Влияние ингибиторов пролиферации на индукцию программы старения в нормальных и трансформированных клетках

грызунов. Всероссийский симпозиум «Биология клетки в культуре». Санкт-Петербург, 17-19 октября 2006 г. Цитология. 48: 811.

СПИСОК ЦИТИРУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

Шишкова Ж.В., Аксенов Н.Д., Поспелов В.А., Поспелова Т.В. Цитология. 2011; 5(3): 235-242. d'Adda di Fagagna F. Nat Rev Cancer 2008;8(7):512-22. Bagchi S., Raychaudhuri P., Nevins J R. Cell. 1990;62(4):659-669. Blagosklonny M.V. Aging (Albany NY) 2012;4(3): 159-65. Campisi J., D'Adda di Fagagna F. Nat Rev Mol Cell Biol. 2007;8(9):729-40. Comai L. Nat Rev Genet. 2005;66:836-46. Di Micco R., Fumagalli M., Cicalese A., Piccinin S., Gasparini P., Luise C., Schurra

C., Garre' M., Nuciforo P.G., Bensimon A., Maestro R., Pelicci P.G., d'Adda di Fagagna F. Nature 2006;444(7119): 638-42. Fumagalli M., Rosiello F., Clerici M., Barozzi S„ Cittaro D„ Kaplunov J.M., Bucci G., Dobreva M., Matti V., Beausejour C.M., Herbig U., Longhese M.P., d'Adda di Fagagna F. Nat Cell Biol. 2012; 14(4):355-65. Hiebert S.W., Chellappan S.P., Horowitz J.M., Nevins J.R. Genes Dev 1992;6(2):177-85. Johnson D.J., Schwarz J.K., Cress W.D., Nevins J R. Nature. 1993;365:349-352. Kondo Y., Kondo S. Autophagy. 2006;2(2), 85-90. Laplante M., Sabatini

D.M. J Cell Sci. 2009; 122 (Pt 20):3589-94. Majuri M.C., Zalckvar E., Kimchi A., Kroemer G. Nat Rev Mol Cell Biol. 2007;8(9):741-52. Marks P.A., Richon V.M., Miller Т., Kelly W.K. Adv Cancer Res. 2004;9:137-68. Menendez J.A., Vellón L„ Oliveras-Ferraros С., Cufí S., Vazquez-Martin A. Cell Cycle 2011;10(21):3658-77. Noda A., Hirai Y., Hamasaki K., Mitani H„ Nakamura N., Kodama Y.J. Cell Sci 2012;125(22):5280-7. Pospclova T.V., Demidenko Z.N., Bukreeva

E.1., Pospelov V.A., Gudkov A.V., Blagosklonny M.V. Cell Cycle. 2009;8(24):4112-8. Pospelova T.V., Chitikova Z.V., Pospelov V.A. Methods Mol Biol. 2013;965:383-408. Puig P.E., Guilly M.N., Bouchot A., Droin N., Cathelin D., Bouyer F., Favier L., Ghiringhelli F., Kroemer G., Solary E„ Martin F., Chauffert B. Cell Biol Int. 2008;32(9):1031-43.QuinIan M., and Grodzicker T. J Virol. 1987;61(3):673-682. Relio-Varona S., Lissa D„ Shen S„ Niso-Santano M„ Senovilla L., Mariño G., Vitale I., Jemaá M., Harper F., Pierron G., Castedo M., Kroemer G. Cell Cycle. 2012;ll(l):170-6. RodierF., Campisi J. J Cell Biol. 2011;192(4):547-56. Roninson I.B. Cancer Res. 2003;63(11):2705-15. Sedelnikova O.A., Pilch D R., Redon C., Bonner W.M. Cancer Biol Ther. 2003;2(3):233-5. Young A.R., Narita M., Ferreira M., Kirschner K„ Sadaie M„ Darot J.F., Tavaré S„ Arakawa S„ Shimizu S., Watt F.M., Narita M. Genes Dev. 2009;23(7):798-803.

/

/ /

Подписано в печать «26» апреля 2014 г. Формат 60x84/16 Бумага офсетная. Печать офсетная. Усл. печ. л. 1,3. Тираж 100 экз. Заказ № 304630

Типография «Восстания -1» 191036, Санкт-Петербург, Восстания, 1.

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Шитикова, Жанна Валерьевна, Санкт-Петербург

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ИНСТИТУТ ЦИТОЛОГИИ

04201459157

ШИТИКОВА Жанна Валерьевна

ОТВЕТ УСТОЙЧИВЫХ К АПОПТОЗУ ТРАНСФОРМИРОВАННЫХ КЛЕТОК НА ДЕЙСТВИЕ РЕНТГЕНОВСКОГО ИЗЛУЧЕНИЯ

03.03.04 - клеточная биология, цитология, гистология Научный руководитель: к.б.н. Поспелова Т.В.

диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Санкт-Петербург

2014

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ И СОКРАЩЕНИЙ..........5

1. ВВЕДЕНИЕ....................................................................................................7

1.1. Актуальность проблемы...............................................................................7

1.2. Цели и задачи исследования........................................................................9

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ...............................................................................10

2.1. Этапы канцерогенеза..................................................................................10

2.2. Тумор-супрессорные програмы клетки....................................................13

2.3. Апоптоз........................................................................................................13

2.4. Клеточное старение....................................................................................16

2.4.1. Старение как тумор-супрессорная программа клетки.....................18

2.4.2 Маркеры клеточного старения.............................................................20

2.4.3. Роль DDR-ответа в индукции старения.............................................27

2.4.4. Молекулярные механизмы формирования фокусов DDR...............28

2.4.5. Механизмы репарации повреждений ДНК........................................31

2.5. Аутофагия....................................................................................................34

2.5.1. Формирование аутофагосом...............................................................36

2.5.2. Роль mTOR в регуляции старения и аутофагии................................38

2.6. Ингибиторы гистоновых деацетилаз как перспективные противоопухолевые препараты.................................................................42

2.7. Характеристика клеток El А+Е1В.............................................................44

2.8. Заключение..................................................................................................46

3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.............................................................................48

3.1. Материалы...................................................................................................48

3.1.1. Клеточные линии, использованные в работе....................................48

3.1.2. Антитела, использованные в работе..................................................48

3.2. Методы.........................................................................................................48

3.2.1. Культивирование клеток, облучение и обработка бутиратом

натрия...................................................................................................48

3.2.2. Построение кривых роста....................................................................49

3.2.3. Оценка жизнеспособности клеток......................................................49

3.2.4. Анализ эффективности клонирования в редком посеве..................49

3.2.5. Проточная цитофлуориметрия............................................................49

3.2.6. Морфологическая окраска клеток гемаотоксилином и эозином .... 50

3.2.7. Анализ активности асоциированной со старением

р-галактозидазы (8А-р-Оа1)...............................................................50

3.2.8. Анализ содержания ДНК в гигантских клетках с помощью

окраски по Фельгену и измерения интегральной оптической плотности.............................................................................................51

3.2.9. Иммуноблотинг....................................................................................51

3.2.10. Иммунофлуоресцентная окраска клеток и конфокальная микроскопия........................................................................................52

3.2.11. Имерение интенсивности флуоресценции......................................53

3.2.12. Анализ синтеза ДНК по включению ВгсЮ......................................53

3.2.13. Анализ синтеза ДНК по включения ЕсШ.........................................53

3.2.14. Анализ разрывов ДНК с помощью щелочного гель-электрофореза одиночных клеток............................................54

3.2.15. Анализ нуклеосомной фрагментации ДНК.....................................54

3.2.16. Статистический анализ......................................................................55

4. РЕЗУЛЬТАТЫ...................................................................................................56

4.1. Устойчивые к апоптозу трансформанты Е1А+Е1В отвечают на облучение блоком С2/М и подавлением пролиферации,

но сохраненяют способность реплицировать ДНК.................................56

4.2. Сохранение репликативной активности при подавленной пролиферации приводит к формированию гигантских полиплоидных клеток с высокой генетической нестабильностью........59

4.3. Устойчивые к апотозу трансформанты Е1А+Е1В характеризуются нарушением организации ядерной ламины и хроматина.......................65

4.4. Облученные клетки Е1А+Е1В характеризуются нарушением ОБЯ-ответа и персистенцией фокусов ББЯ...........................................67

4.5. Репарация ДНК в клетках Е1А+Е1В после облучения нарушена.........77

4.6. В ответ на облучение устойчивые к апоптозу трансформанты Е1А+Е1В активируют обратимую программу старения........................91

4.7. Активация обратимого старения, вызванного действием Ж, в устойчивых к апоптозу клетках Е1А+Е1В сопровождается экспрессией маркеров стволовых клеток.................................................94

4.8. Обратимость индуцированного облучением старения в клетках Е1А+Е1В связана с подавлением активности тТХЖ и активацией аутофагии.....................................................................................................96

4.9. Бутират натрия индуцирует необратимую программу клеточного старения в трансформантах Е1А+Е1В....................................................100

5. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ..................................................................105

ВЫВОДЫ.............................................................................................................115

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.....116

СПИСОК ЦИТИРОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ................................................118

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ И СОКРАЩЕНИЙ

AM® AAeH03HHM0H04>0c4)aT

AT® AfleH03HHTpH4)0C(|)aT

Atg Autophagy-related protein

AMPK 5' AMP-activated protein kinase

ATM Ataxia Telangiectasia Mutated

ATR Ataxia Telangiectasia and Rad3-related protein

BrdU 5-bromo-2'-deoxyuridine

BRCA1 Breast Cancer 1

BRCA2 Breast Cancer 2

53BP1 p53-Binding Protein 1

Cdk Cyclin-dependent kinase

Chk Checkpoint kinase

Cycl Cyclin

DAPI 4',6-diamidino-2-phenylindole

DDR DNA damage response

DNA-PK DNA-dependent protein kinase

DNA-PKcs DNA-dependent protein kinase catalytic subunit

DNA-SCARS DNA segments with chromatin alterations reinforcing

senescence

DSB Double Strand Break

4EBP1 Eukaryotic translation initiation factor 4E-binding

protein 1

EdU 5-3THHHJi-2'AeoKCHypHAHH

eIF4E Eukaryotic translation Initiation Factor 4E

ERK Extracellular Signal-regulated Kinase

GAPDH rjTHuepajn>flerHa-3-4>oc4)aT/iern^poreHa3a

HAT Histone Acetyl Transferase

HD AC Hystone Deacetylase

5

HDACI Hystone Deacetylase Inhibitor

HR Homologous Recombination

IL интерлейкин

IR ионизирующее излучение

LAMP Lysosomal-Associated Membrane Protein

LC3 Microtubule-associated protein 1А/IB-light chain 3

MDC1 Mediator of Damage Checkpoint protein 1

Mdm2 Mouse double minute 2

MRE11 Meiotic Recombination 11

mTOR mammalian Target Of Rapamycin

mTORCl mammalian Target Of Rapamycin Complex 1

mTORC2 mammalian Target Of Rapamycin Complex 1

NBS1 Nijmegen Breakage Syndrome 1

NHEJ Non-Homologous End Joining

PBS Phosphate Buffered Saline

PIKK phosphatidylinositol 3-kinase-related kinases

PI3K Phosphoinositide 3-Kinase

pRb Retinoblastoma protein

ROS Reactive Oxygen Species

RPA Replication Protein A

S6K p70 Ribosomal Protein S6 Kinase

SA-ß-Gal Senescence Associated beta Galactosidase

SAHF Senescence-Associated Heterochromatine Foci

SASP Senescence-Associated Secretory Phenotype

SMAC/DIABLO Second Mitochondria-derived Activator of Caspases

ssDNA single strand DNA

TSC1 Tuberous Sclerosis 1

TSC2 Tuberous sclerosis 2

ULK Unc-51-Like Kinase

XRCC4 X-ray Repair Cross-Complementing protein 4 6

1. ВВЕДЕНИЕ

1.1. Актуальность проблемы

Несмотря на значительный прогресс в борьбе с опухолевыми заболеваниями, они остаются, по данным Всемирной организации здравоохрания (ВОЗ), одной из основных причин смерти в мире.

Как правило, действие современных противоопухолевых препаратов направлено на индукцию апоптотической гибели клеток. Апоптоз, или программированная клеточная гибель, является важнейшей тумор-супрессорной программой, которая активируется в ответ на различные виды стресса для предотвращения пролиферации клеток с повреждениями ДНК, мутациями, или нарушениями событий клеточного цикла. В процессе неопластической трансформации или противоопухолевой терапии клетки приобретают устойчивость к апоптозу, что приводит к формированию некурабельных, агрессивных вариантов опухолей.

Альтернативной апоптозу тумор-супрессорной программой является клеточное старение, подавляющее пролиферацию клеток при внеплановой экспрессии онкогенов или повреждении ДНК. В опухолевых клетках старение может индуцироваться в ответ на действие генотоксических и дифференцировочных агентов, а также ремоделирование хроматина (Marks et al., 2004; Rodier and Campisi, 2011). Стареющие клетки необратимо останавливают полиферацию, однако сохраняют метаболическую активность и приобретают характерные морфо-функциональные признаки, включающие гипертрофию, распластывание клетки на субстрате, экспрессию ассоциированной со старением ß-галактозидазы (SA-ß-Gal), активацию компонентов ответа на повреждение ДНК (DNA Damage Response, DDR-ответ), а также экспрессию и секрецию факторов роста и воспаления (Campisi and d'Adda di Fagagna, 2007). Известно, что устойчивые к апоптозу клетки сохраняют способность реализовать программу клеточного старения (Roninson et al., 2003), в связи с этим активация старения рассматривается как

одна из наиболее перспективных стратегий подавления пролиферации опухолевых клеток.

К числу событий, решающих успех противоопухолевой терапии, относится активация аутофагии (Kondo and Kondo, 2006), являющейся эволюционно консервативным механизмом, обеспечивающим выживание клеток при различных видах стресса. Помимо цитопротекторного действия аутофагия может вызывать клеточную гибель (Majuri et al., 2007), что в случае устойчивых к апоптозу клеток приобретает первостепенное значение.

Координирующую роль в регуляции процессов старения, аутофагии и клеточной гибели играет фосфоинозитид-3-киназа (PIKK) mTOR, формирующая два комплекса mTORCl и mTORC2, различающиеся по структуре и функциям. Основная роль в регуляции программы старения принадлежит комплексу mTORCl (Blagosklonny, 2012), который служит сенсором энергетического состояния клетки. Он активируется питательными веществами и ростовыми факторами и регулирует синтез белков, биогенез рибосом, транскрипцию и аутофагию (Laplante and Sabatini, 2009).

Изучение закономерностей ответа устойчивых к апоптозу клеток на действие ДНК-повреждающих факторов, запускающих альтернативные апоптозу тумор-супрессорные программы, является важной задачей современной биологии, поскольку это необходимо для выяснения механизмов, приводящих к рецидивам опухолей и развитию устойчивости опухолевых клеток, а также поиска новых эффективных подходов противоопухолевой терапии.

1.2. Цели и задачи исследования

Целью настоящей работы являлось изучение закономерностей ответа на поврежедние ДНК при действии ионизирующего излучения (III) и возможности активации тумор-супрессорной программы старения в устойчивых к апоптозу опухолевых клетках, полученных путем переноса онкогенов Е1А и Е1В-19кДа в эмбриональные фибробласты крысы.

В задачи исследования входило:

1. Оценить антипролиферативное действие ГО. на устойчивые к апоптозу трансформированные клетки по способности вызывать блоки клеточного цикла, подавлять репликацию ДНК и пролиферацию.

2. Определить возможность активации программы клеточного старения в устойчивых к апоптозу трансформантах в ответ на действие ГО, и ее зависимость от длительности БОЯ-ответа и репарации ДНК.

3. Оценить обратимость программы старения и возможность активации аутофагии в устойчивых к апоптозу трансформантах в зависимости от активности комплекса тТСЖС 1 после облучения.

4. Сравнить эффективность активации программы клеточного старения в ответ на облучение или действие ингибитора гистоновых деацетилаз бутирата натрия на трансформированные клетки, устойчивые к апоптозу.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 2.1. Этапы канцерогенеза

Превращение нормальной клетки в опухолевую является сложным многоступенчатым процессом, который включает в себя накопление мутаций, приводящих к активации сигнальных каскадов, способствующих выживанию и пролиферации опухолевых клеток, а также подавлению тумор-супрессорных механизмов, противостоящих опухолевой трансформации. В процессе трансформации клетки нарушается регуляция событий клеточного цикла, что приводит к неконролируемой пролиферации, не зависящей от наличия митогенных сигналов (Hanahan and Weinberg, 2000).

Деление клетки представляет собой ряд строго регулируемых последовательных событий, нарушение которых может привести к трансформации клетки и развитию опухли. На рисунке 1 представлена схема клеточного цикла, включающая основные компоненты его регуляции. Клетки, находящиеся в стадии покоя, называемой фазой GO клеточного цикла, получив сигнал к делению, вступают в фазу G1, где начинают синтез белков, необходимых для репликации ДНК и регуляции процесса деления. В этот период клетка принимает решение о дальнейшем прохождении или остановке клеточного цикла, так как практически до конца фазы G1 пролиферация зависит от присутствия ростовых факторов и только после прохождения точки рестрикции (R-point), находящейся на границе G1 и S фаз клеточного цикла процесс деления протекает независимо от внешних стимулов. Ключевыми регуляторами перехода из G1 в S фазу клеточного цикла являются транскрипционные факторы семейства E2F, обеспечивающие транскрипцию белков S-фазы, которые необходимы для репликации ДНК. В неактивном состоянии E2F находится в комплексе с белком pRB, однако при получении сигнала к делению этот комплекс диссоциирует, что приводит к высвобождению E2F и его активациии. В фазе S клеточного цикла происходит синтез ДНК, после чего в фазе G2 клетка подготавливается

ю

к делению и вступает в митоз (фаза М), в процессе которого формируются две дочерние клетки (Vermeulen et al., 2003).

Прохождение клетки по циклу реглируется комплексами циклинов (Cycl) и соответствующих циклин-зависимых киназ (Cdk) (Рис. 1). Негативными регуляторами активности Cdk являются ингибиторы циклин-зависимых киназ (Cdkl), включающие в себя два семейства: Ink4a и Cip/Kip. Известно, что повышенная экспрессия pl6/Ink4a, plMnk4d и p21/Wafl приводит к остановке в G1 фазе клеточного цикла, а также активации клеточного старения (Alcorta et al., 1996; Нага et al., 1996). Кроме этого, p21/Wafl, активация транскрипции которого зависит от тумор-супрессорного белка р53, отвечает за G2/M блок клеточного цикла. Нарушение экспрессии и делеция генов, кодирующих белки семейств Ink4a и Cip/Kip, часто наблюдаются в опухолевых клетках (Malumbres and Barbacid, 2001).

Нормальные клетки контролируют точность генетической информации на всех этапах клеточного цикла посредством остановок в сверочных точках, называемых чекпоинтами. На границе G1 и S фаз клеточного цикла перед началом синтеза ДНК клетка проверяет ее целостность. Правильность новосинтезированной ДНК проверяется на границе G2 и М фаз, а остановка в митозе необходима для проверки правильности прикрепления хромосом к веретену деления. При обнаружении дефектов в структуре ДНК клетка реализует остановку на границах G1/S и G2/M фаз клеточного цикла и осуществляет репарацию ДНК, после чего возобновляет прохождение по циклу. Если повреждения генома настолько велики, что репарация невозможна, клетки не могут выйти из блока, чтобы вновь приступить к делению, и гибнут апоптозом или активируют программу старения. Опухолевые клетки не способны осуществлять остановку пролиферации в ответ на удаление ростовых факторов и действие повреждающих агентов.

Рисунок 1. Схема регуляции клеточного цикла.

Они способны преодолевать чекпоинт-контроль и осуществлять деление даже при наличии нарушений в структуре ДНК. Это приводит к генетической нестабильности и дает возможность отбора наиболее устойчивых клеток, в результате чего формируются опухоли, резистентные к различным видам противоопухолевой терапии, включая облучение и цитостатические препараты (Malumbres and Barbacid, 2001).

В процессе эволюции опухолевые клетки преодолевают репликативное старение и приобретают неограниченный пролиферативный потенциал, а также устойчивость к апоптозу, являющемуся важнейшей тумор-супрессорной программой (Hanahan and Weinberg, 2000). Изменяется метаболизм и микроокружение опухолевой клетки, стимулируется неоангиогенез, активируется аутофагия, что позволяет ей получать питательные вещества, приобретать способность к инвазивному росту и метастазированию. (Hanahan and Weinberg, 2011).

2.2. Тумор-супрессорные програмы клетки

К числу клеточных программ, противостоящих опухолевой трансформации, относятся апоптоз, клеточное старение и некоторые виды неапоптотической гибели клеток, включая митотическую катастрофу, некроптоз (программируемый некроз) и в некоторых случаях аутофагию.

2.3. Апоптоз

Апоптоз явлется важнейшей тумор-супрессорной программой клетки. Он активируется в ответ на различные виды стресса для предотвращения пролиферации клеток, несущих повреждения ДНК, мутации, или утративших контроль за событиями клеточного цикла. Апоптотическая гибель клеток имеет важное значение в эмбриональном развитии организмов, иммунном и воспалительных ответах.

Клетки, активировавшие программу апоптоза, характеризуются специфическими морфологическими признаками: сжатие клетки, блеббинг

13

клеточной мембраны, конденсация хроматина и фрагментация ядра, которые позволяют отличить апоптоз от других типов клеточной гибели (Elmore, 2007; Galluzzi et al, 2012). Согласно принятым в настоящее время моделям, различают два типа апоптоза: митохондриальный и рецептор-зависимый (Рис. 2).

Митохондриальный путь контролируется внутриклеточными индукторами апоптоза и опосредуется активацией тумор-супрессорного белка р53. Такой тип апоптоза инициируется в ответ на повреждение ДНК и оксидативный стресс. При митохондриальном апо�