Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Особенности взаимоотношений в системе: возбудитель обыкновенной корневой гнили зерновых - яровая пшеница на разных уровнях организации

ВАК РФ 03.00.16, Экология

Автореферат диссертации по теме "Особенности взаимоотношений в системе: возбудитель обыкновенной корневой гнили зерновых - яровая пшеница на разных уровнях организации"

,* 2 0. < На правах рукописи

2 7 »по?

ХИЯНЯ1С СЕРГЕЙ ВИТАЛЬЕВИЧ

ОСОБЕННОСТИ ВЗАИМООТНОШЕНИЙ В СИСТЕМЕ: ЕОЗБУДЯТЕЛЬ ОБЕХ-КОЗЕННОЗ ГЮРНЕВОЙ ГНШШ ЗЕРНСС.'Х - ЯРОВАЯ ППЕ1ШЦА НА РАЗНЫХ УРОВНЯХ ОРГАНИЗАЦИЯ

СПЕЦИАЛЬНОСТЬ 03.00.16 - экология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Красноярск 1997

Работа выполнена в Красноярском государственном аграрном университете

Научный руководитель: кандидат биологических наук В.А.Рогинская

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, ведущий научный сотрудник Г.И.Гирс,

кандидат биологических наук, доцент Т.И.Громовых

Ведтсая организация: Красноярский ;Яаучно-исследова-тельский институт сельского хозяйства

Задета состоится " /*/ " 1997 года

в_час на заседании диссертационного совета Л 120.45.01

при Красноярском государственном аграрном университете по адресу: 660049. Красноярск:49, проспект Мира, 88.

С диссертацией ыокно ознакомиться в библиотеке Красноярского государственного аграрного университета

Автореферат разослан _"___ 1997 года

Ученый секретарь диссертационного совета, д. с.-х.н. .прсф.

Р.М.Бабинцева

Актуальность проблемы. Разрушение природных экосистем, внедрение интенсивных технологий земледелия привели в XX веке к значительному росту вредоносности заболеваний, вызываемых различными фитопатогенныыи микроорганизмами. Кардинально решить проблему мозсно только при переходе к возделывании устойчивых к заболеваниям сортов.

Получение таких сортов методами традиционной селекции наталкивается на ряд препятствий главными из которых является высокая изменчивость фктопатогенннх микроорганизмов, трудоемкость и продолжительность селекционных работ, отсутствие надежных методов и критериев полевел оценки селащискнсго материала. В этой связи в последние годы наблзэдается значительный рост интереса к таким нетрадиционным подходам, как использование .клеточных и тканевых культур в селекции растений на устой • чивость к заболеваниям.

Осноенши препятствия!®, затруднял™».« пирское прачткчес-коа использование методов клеточкой селекции, оставтся слабая изученность процессов, протеказздх в система патоген-хозяин на клеточном уровне, недостаток информации о механизмах. леза^их з основе роста растительных клеток и тканей в присутствии метаболитов патогена в культуре in vitro, отсутствие разработанных критериев и методов отбора устойчивых к заболеваниям ферм в клеточных популяциях.

В частности, больной теоретический и практический интерес представляет изучение систеиа: возбудитель обыкновенной корневой гнили зерновых - яровая пгеница. Являясь однш из наиболее распространенных инфекционных заболеваний пзэккцы н ячменя в зонах с ■ континентальный климатом, обыкновенная ксЫсзая гниль зерновых вызывает ежегодные потери от 15-203 до 502 урезая в основных зернопроизводящих районах шра.

Цель и задачи исследования. Цель в настоящей работы было изучение особенностей реакции яровой ппеницы на метаболиты возбудителя обыкновенной корневой гнили 'зерновых на разных уровнях организации для последующей разработки технологии отбора устойчивых к заболеванию $орм в культуре клеток, а такзе создание исходного материала, перспективного с точки зрения дальнейшей езлекции на устойчивость к заболевании для условий Сибири.

Для дееттаенил поставленной цели необходимо было- регуь следующие задачи:

- оценить возможность вовлечения в процесс клеточной селекции районированных в Сибири я перспективных к районированию сортов и селекционных линий яровой пшеницы, подобрать условия, обеспечивающие максимальный выход растений-регенерантов в кал-лусной культуре исследуемых генотипов;

- изучить особенности взаимодействия различных генотипов яровой пшеницы с возбудителем обыкновенной корневой гнили зерновых на уровне культуры клеток;

- разработать методы и критерии отбора, обеспечиваючие высокую эффективность селекции пшеницы на устойчивость к токсинам возбудителя в каллусной культуре;

- провести селекцию различных генотипов яровой пвеницы на устойчивость к токс1..;ам возбудителя обыкновенной корневой гнили зерновых в каллусной культуре и получить растения-регене-ранты;

- провести лабораторную оценку растений-регенерантов и отобрать линии, перспективные для дальнейшей селекции на устойчивость к патогену.

Научная новизна. Впервые отработана и оптимизирована технология получения морфогенного каллуса для различных генотипов пшеницы, районированных и перспективных к районированию в Сибири. Показано, . что индивидуальный подбор возраста эксапанта позволяет существенно поеысить частоту морфогенеза в каллусной культуре яровой пшеницы. Впервые проведён сравнительный анализ действия различных образцов культурального фильтрата Н.sativum на контрастные по устойчивости к заболеванию генотипы яровой пшеницы на уровне интактных растений, изолированных зародышей и каллусных культур. В действии культурального фильтрата выявлены как фитотоксические, так и фитогормональные эффекты, обнаружена связь между полевой устойчивостью к патогену и устойчивостью к токсической компоненте культурального фильтрата в культуре in vitro. Впервые проведено детальное изучение факторов, влияющих на эффективность клеточной селекции яровой пшеницы на устойчивость■ к токсическим метаболитам возбудителя обыкновенной .корневой гнили зерновых. Установлено, что чувствительность к токсинам определяется как генотипическими, так и моофологическими особенностями каллусной ткани, а также временем инкубации на селективной среде, разработаны методы и критерии отбора, обеспечивающие высокую эффективность селекции

гаеница на устойчивость к токсинам возбудителя з каллусной культуре. Впервые проведена клеточная селекция сибирских сортов яровой гпеницы на устойчивость к токсическим метаболитам вксокопатогенного штамма Н. sativum из региональной популяши возбудителя i "шкносенкой корневой гнили зерновых. Среди полученных в результате селекции растений-регенерантсв выявлены линии, существенно превосходяще исходную форму по устойчивости к патогену d лабораторная условиях.

Практическая анэдго тасть. Разработанная методик Moser бить использована для массового скрипте., а устойчивых к заболеванию генотепоз ппеницы в культура in vitro. Созданные в результате работа новые фота яровой гшешад могут служить основой для создания нсзах сортов, обладающих устойчивость» к обыкновенной корневой гнили зерновых, что позволит существенна снизить потери урокал от данного заболевания.

А[Шрбация_2аботи^ Результаты исследования представлены на 6-м Международном конгрессе по патологии растений (Мсктреаль. 1393), на научней конференции профессорско-преподавательского состава КрасГАУ (Красноярск. 1993), на заседании ученого совета околого-биотехнологкческого факультета КрасГАУ.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано сень пабот.

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, методической части, результатов и с б сужения. Материала диссертации излэтеш на 165 страницах текста, содержат 19 таблиц, 11 рисунков и 3 фотографий. Библиография содержит 202 источника отечественной ч зарубежной литературы.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОД! ИССЛЕДОВАНИЙ

3 качестве объектов исследования были использован-»; 20 сортов и селекционных линий яровой пзеницы: Скала. Омская-*?, Омская-12, Лотесценс-IG, Красноярская-33, Целикная-21. Crja-тсвская-29, Лэ?есценс-25. Алэнькая-23, Гштссценс 32S9/M1S2. Сибирская-3, Безенчукская-98, !1!Шьтурум-553. Стшля. ум-94. Заволяская. Русак. Ир~гаанка-10. Тулунская-12 (Tritic:::: aestivuia). Гораеи»п?ме-53 (Tri Si сип duran).

-¡сплантами для интуиции каллуса слулонпи нззеелкя saoci...-

ни, выделенные на стадии молочной - начала восковой спелость (10 - 21-е сутки после опыления), помещенные на модифицированную среду Мурасиге и Скуга с 2 мг/л 2,4Д. Культивирование каллусов проводили при постоянном освещении и температуре 26 С, пересевы на свегус среду осуществляли каждые 30 суток

Для получения токсинов использовали зысокопатогенкьы итачы S30 из региональной коллекции возбудителя обыкновенной корневой гнили зерновых, выращенный в глубинных условиях на жидкой среде Чапека. Изучение биологического действия культу-рального фильтрата проводили на семенах, проростках, изолированных зародышах и каллусах пшеницы сортов Красноярская-83 и Скала. Для клеточной селекции били использованы сорт Красноярская-83 и селекционные линии Лвтесценс-16 и Латесцонс 322Э/М182. Отбора начинали через 5 месяцев после индукции каллуса, и проводили в течение 4-х пассааей по различны?.! селекционным схемам. Оценку устойчивости к патогену полученных в результате селекции линий проводили методом листовой диагностики. Для оценки использовали 14-сугочкые проростки, контроле;-.: сл'/еили проростки исходных генотипов.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Культуральные свойства исследуемых сортов

Наш проверена возможность получения каллусов к регенерации растений у изучаемых генотипов при использовании в качестве экеппанта как зрелых, гак и незрелых зародышей.

Все изученные сорта способны к образовании каллуса \\ъ зрелых зародывей с частотой 95-1002. Каллус образуется из ги-покотиля, мезокотилл и зпикотиля зародыаа. Как правило, каллусы, .полученные из зрелых зародыией, способны только к образовании корней. Частота ризогенеза варьирует от 0 до 5СК е зависимости от генотипа. Среди изученных генотипов только Пютес-цеис-16, Скала и Лятесценс-25 проявили способность регенерировать побеги в каллусной культуре, полученной из зрелых зародышей с частотой 16.7, 10.7 и 5.0% соответственно.

При использовании в качастве экспланта незрелых зоросеггй все изучаоыые генотипа образуют каллус с частотой S4-100X. Каллус образуется как из щитка, так и непосредственно из заре-

дывевых органов. Соотношение халт/са различного типа о значительной степени определяется возрастом зкепланта. Максимальнее количество каллуса из щитка образуется з культуре згроаюей. взятых на стадии поздней молочной спелости, минимальное - з культуре зародышей средней молочной спелости.

Мсрфогенотические способности каллусов различного происхождения различаются с достоверностью 0.939. Каллус, полученный из щитка, способен к спонтанной регенерации лобегоп на среле с 2,4Д в течение длительного времени после индукции. Частота побегообразования зависит от генотипа и возраста зародыша, использованного для получения каллуса..Каллус, сформировавшийся непосредственно из зародышевых органов, при перзсс— зах образует только корки. Частота ризегенеза колеблется з широких пределах в зависимости от генотипа и возраста зародыша.

Как правило, наибольшей способность» к регенерации посе-гон обладают каллусы, полученные из зародааей на стали ранней и поздней молочной спелости, наименьшей - каллуса, полученные из зародышей средней молочной спелости. Однако данное наблюдение справедливо не для всех изученных генотилез (рис. 1).

''cîri.LLUnira- !Q TaDj^oti-f 5»-;J

."•"С. 1. Влияние зозраста эксплента на частоту регенараакл

лссп-гоз у различных генотипез пвен:!ш: ! - ранняя молочная спелость; II - средняя молочная спелость ; III - поздняя молочная спелость..

Дисперсионный анализ полученных данных показал, что наряду с достоверным влиянием генотипа (р=0.9999) и возраста зародыша (р-0.99ЭЭ) на способность каллуса к регенерации, наблюдается достоверный эффект взаимодействия "возраст-генотип" (р=0.9599).. Это означает, что возраст зародыпа, оптимальный для получения морфогенного каллуса, у пшеницы в значительной степени зависит от генотипа.

Исходя из анализа литературных дачных, мокно м>едполо-гить, что наблюдавшийся нами повышенный выход морфогенного каллусз на стадии ранней и поздней молочной спелости обусловлен последовательной лиготической активностью сначала эпиблас-та (ранняя молочная спелость), а потоп - щитка (поздняя молочная спелость). Выявленное нами взаимодействие "генотип-возраст" при изучении частоты образования морфогенного каллуса свидетельствует об индивидуальных ссобсннсстях развития заро-даей у исследуемых генотипов п демонстрирует необходимость тщательного подбора возраста зкеаланта индивидуально для каждого вводимого в культуру генотипа гшеницы.

Наибольший интерес для клеточной селекции среди изученных генотипов представляет Скала, Лзтесценс-16, Красноярская-83, Лвтесценс 3229/М482, Лотесценс-25, Оыская-12, Омская-9, Цези-у;.'-Э4. Заволжская, Русак, Иртышанка-10, Тулунская-12. При пра-вильк "л подборе возраста эксапанта частота образования морфо-генного каллуса у данных генотипов составляет от 10 до 50%, способность к регенерации растений сохраняется в течение 5-12 месяцев.

Изучение влияния различных ауксиноз и цитокининов на регенерацию побегов в длительно культивируемой каллусной культуре различных .сортов пшеницы показало, что, хотя содервание фи-тогоршнов в среде достоверно влияет на частоту регенерации растений, степень этого влияния относительно невысока и проявляется в основном в эффекте взаимодействия "ауксин-цитокикин". Показатель силы влияния для' взг. содействия составил 8. 4% при достоверности 0.95, в то время как показатели силы влияния линейных эффектов для цитокининов и ауксинов равны 0.9% и 1.655 соответственно. В целом среди цитокининов наиболее эффективным □начался кинетин в концентрации 1.0 мг/л, а среди ауксинов -в-ИУК в концентрации 2.0 мг/л, однако статистически достоверные различия как ыеаду цитокининами, так и между ауксинами по

способности индуцировать побегообразование не обнаружены. Из 24 исследованных комбинаций фитогормонов только три ( кинетин 1.0 мг/л + 2.4Д 0.1 мг/л, кинетин 1.0 мг/л + в-ИУК 2.0 мг/л. зеатин 0.2 мг/л *■ в-ИУК 0.2 мг/л ) превзопли безгсрмональнуп среду по частоте побегообразования, однако достоверность различий не доказана.

Таким образом, изучение каллусогенеза и регенерации растений у исследуемых генотипов показало перспективность использования в качестве экспланта незрелых зародышей, выделенных на стадии начала полочной - начала восковой спелости семян. Из 20 изученных генотипов гпеницы 12 показали высокую способность к образованию ыор^огенного каллуса, что открывает возможность их дальнейшего использования в клеточной селекции.

Влияние метаболитов возбудителя обыкновенной корневой гнили зерновых на семена, изолированные зародыии ч кал-лусные культуры яровой пшеницы

Для успешной селекции с использованием культурального фильтрата необходимо, чтобы он содергал весь набор токсических вецеств, участвующих в патогенезе. Известно, что токсические свойства культурального фильтрата Н. sativum значительно ь.оня-ются а запис:г.:ости от времени и условий культивирования. В этой связи правильный подбор возраста культуры гриба, используемой для получения культурального фильтрата, может стать необходимым условием успешного проведения клеточной селекции на устойчивость к обыкновенной корневой гнили.

Мы изучили влияние культурального фильтрата Н.sativum, отобранного на различных стадиях культивирования гриба, на каллусние культуры, изолированные зародыши и интактные .растения яровой пшеницы с целью установления времени культивирования . патогена, обеспечивающего максимум токсичности фильтрата наряду с эффгчтивным раздачением генотипов по чувствительности к токсинам в каллусной культуре.

Фитотоксическое действие культурального фильтрата, проявляющееся б достоверной снижении всхожести семян и ингибирсва-нии накопления сухой биомассы проростков, отмечено уже на 4-е сутки культивирования гриба. В течение первых 6 суток.культивирования увеличение токсичноог.. культурального фильтрата про-

исходило параллельно с ростом гри5г, после чего скорость накопления токсических метаболитов снижалась. После 8-х сутск фитотоксичность культурального фильтрата практически не менялась, в то Ереыя как накопление биомассы патогена придолкалось в течение всего периода культивирования (10 суток).

Обнаружено токсическое действие культурального фильтрата на изолированнее зародыши и каллусные культуры изучаемых сортов, проявившееся в достоверном (р=0.599) снижении частоты каллусогенеза и ингибировании роста каллусов (рис. 2).

Рис. 2. Влияние культурального фильтрата на рост каллусов

Красноярской-83 (---) и Скалы (-):

1 - б-суточная культура гриба;

2 - 8-суточная культура гриба;

3 -10-суточная культура гриба

Реакция сортов на токсическое действие культурального фильтрата в условиях in vitro в целом била однотипной. По частоте каллусогенеза и удельному приросту каллусов на средах, сэдергачих культуральнай фильтрат патогена, коэффициенты кор-

реляции мезду Скалой и Красноярской-03 составили соответственно +0.39 и +0.93. При общей налравленкссти реакций на действие токсинов Н. БаШиш между сортами выявились достоверные различия по чувствительности каллусных культур. Сравнение дозовых кривых по критерию Фииера показало, что каллуса сорта Красно-ярская-83 с достоверностью 0.95 более устойчивы к культураль-ному фильтрату патогена, чем каллусы сорта С!<ала. Максимальные межсортовые различия выявлены при • "¡пользовании 6-8-суточного культурального фильтрата в концентрации 30-БСл (см. рис. 2).

Обнаружено высокое сходство в реакции изолированных зародышей, каллусных культур и интактных растений пшеницы на токсические метабс иты патогена. Максимальная корреляция между фитотсксичностью гриба для проростков и каллусов пшеницы сорта Скала наблюдалась при самой высокой из испытанных концентраций (50%). При этом коэффициенты корреляции составили меаду массой корней и частотой калпусогенеза +0.84, ■ между массой корней и удельным приростом каллуса +0.96. Сходство в реакции на токсические метаболиты возбудителя обыкновенной корневой гнили зер-нозых каллусов, изолированных зародшей и интактных растений позволяет предположить сходный механизм дейстзия токсинов патогена на растительные объекты с различным уровнем организации.

Наряду с токсическим действием метаболитов гриба отмс *ено стимулирующее действие культурального фильтрата на процессы органогенеза в каллусной культуре и культуре зародышей сбоях сортов. Под влиянием культурального фильтрата в концентрации 10-30% наблюдалось достоверное увеличение частоты прямого прорастания зародышей на среде для яаллусогенеза. Максимальная частота прорастания (92-100%) установлена на среде с 20% культурального фильтрата. 3 контроле этот показатель составил 23.1% для Красноярской-83 и 38.5% для Скалы. Кроме этого, отмечено образование корней в культуре зародьппей под ■ влиянием .метаболитов патогена, чего не наблюдалось в контроле.

Сортовые различия по частоте прорастания зародышей на фоне культурального фильтрата Н.заЦ-ли нэ обнаружены. В то зе время частота индуцированного метаболитами патогена ризогенеяа у Красноярской-83 была с достоверностью 0.9Э эыше, чем у Скала. как з культуре зародышей, так и в калдуснсй культур:.

Полученные данные были исслелсзаня методами фактсрнсго гиализа, в основе котооого ..сжит представление о гсм. -ио

большое число наблюдаемых признаков определяется ограниченным набором недоступных непосредственному наблюдению общих факторов. Взаимосвязь мезду изучаемыми признаками на 80.6% удалось объяснить действием трех факторов.

Порой фактор, имеющий максимальную информационную нагрузку (58.0%), отражает фитотоксические свойства культурально-го фильтрата. Его воздействие проявляется в снижении всхожести семян, ингибировании роста проростков и каллусных культур, снижении частоты каллусообразования в, культуре зародьшей и частоты ризогенеза в каллусной культуре обоих сортов. В то се время с указанный фактором наблюдается достаточно высокая положительная корреляция ризогенеза в культуре изолированных зародышей, и практически отсутствует связь частоты прямого прорастания зародитЭто позволяет трактовать первый фактор как комплекс токсических метаболитов патогена, оказывающих сходное действие на растительные объекты с различным уровнем организации. Положительная нагрузка на частоту ризогенеза в культуре изолированных зародышей обоих сортов указывает на возрастание частоты индуцированного ризогенеза у зародышей пзеницы по мере возрастания фитотоксичности культурального фильтрата. Моено предположить, что ризоген^з в культуре зародышей индуцируется одним из токсинов, продуцируемых грибом, что в целом не противоречит современным представлениям п структуре и свойствах известных токсиноз данного патогена. Индукция ризогенеза в культуре зародьшей практически не связана со стимуляцией прямого прорастания зародышей ( коэффициенты корреляции метлу этими признаками составляй1 0.317 для Скалы и 0.148 для Красноярской БЗ), что отражается и в величине факторных нагрузок. Это свидетельствует о том, что прорастание и ризогенез стимулируются различными компонентами культурального фильтрата гриба.

Второй щявленный в результате анализа фактор (информационная нагрузка 17.3«) связан в основном со стимуляцией прорастания зародышей Скалы и Красноярской 83 на среде для каллусо-генеза. На долю этих признаков приходится свыге 55« информации, содержащейся в данном факторе. Кроме этого, со вторш фактором в некоторй степени связана частота ризогенеза в кал-лусной культуре Красноярской 83. Таким образом, второй фактор мзгно интерпретировать как гчдерхациеся в кульгуральнш фильтрате вещества фитогсрмонального действия, не связанные с ток-

жческими метаболитами. Действие указанных веществ проявляется ! основном в индукции прямого прорастания зародышей на среде с !,4Д. Такое действие, в частности, могут оказывать цитокинины, >анее обнаруженные в культуральном фильтрате Н.sativum.

Третий фактор связан почти исключительно с ризогенезом б саллусной культуре обоих сортов. Для Скалы и Красноярской 83 таечены близкие по значении, но противоположные по знаку наг->узки на этот признак. Можно предположить, что эффект обуслсв-юн различной чувствительностью сортов к веществам, стиыулнру->щим ризогенез в каллусной культуре. В таком случае концентрата, оптимальная для ризогенеза в культуре каллусов одного юрта, может оказаться ингибирующей для другого сорта.

Для изучения динамики изменения биологических свойств :ультурального фильтрата точки, соответствующие различны).! кон-[ентрациян 6-, 8- и 10-суточного фильтрата, были спроецированы ;а плоскость, образованную первым и вторым фактора:.»! (рис. 3).

✓ \ 'A i i Q / i

'О

'а*;

II

ис. 3. Проекции точек, соогветствусцих образцам 6- (Q). 8- (©) и 10-суточного (&) культурального фильтрата (КФ) на плоскость, образованную 1-м (I) и 2-я (II) факторами: 1 - 1055 КФ; 2'- 202 КФ; 3 - 50% КФ; ©- контроль

3

V

- 1-1 -

Из рисунка • 3 видно, что хотя соотношение токсического и гормонального факторов в процесса культизкровашя гриба несколько меняется, образцу культурального фильтрата различаются в основном ке по времени культивирования, а по концентрации.

Кластерный анализ, -проведенный по всему комплексу изучаемых признаков, подтвердил, что образца куль^уральнс~о фильтрата. начиная с 6-х суток культивирования гриоа, группируются в первую очередь не по возрасту культуры, а по концентрации, используемой в эксперименте. Зто свидетельствует о достаточно высокой стабильности биологических свойств культурального фильтрата возбудителя обыкновенной корневой гнили зерног к, начиная с 6-х суток выращивания патоген?1 в глубинной культуре.

Отбср яровой пяеницы на устойчивость к обыкновенной корневой гнили в культуре ткани

Отборы проводились по двум селекционным схемам. По первой схеме каллусы помещали на среду с высоким (40%) содераанием культурального фильтрата уае в первом селекционном пассаге. По второй схемой каллусы предварительно инкубировали в течение одного пассава на среде с низким (20%) содержанием культурального фильтрата.

Как видно из представленных в таблице 1 данных, токсический эффект, выразившийся в снижении удельного прироста каллусов, проявился уже в первом пассале на среде с 40% культурального фильтрата. При этом между генотипами выявились существенные различия по устойчивости каллусов к токсическому действию культурального Фильтрата. Так, если каллусы Лютесцёнс-16 и Красноярской 83 под. действием 40% культурального фильтрата снизили •удельный прирост по 'сравнении с контролем в первом пассазе соответственно на 36.2 и 50.8%, то каллусы Лятесценс 3229/М482 - толькЬ на 14.7%. Различия каллусов по чувствительности к культуральноыу фильтрату патогена соответствуют различиям мзду генотипами по полевой устойчивости к инфекции.

Дзухфасгорный дисперсионный анализ подтвердил достоверность ингибируицего влияния культурального фильтрата на прирост глллусов в первом пассахе (р=0.999!. а тан;:._ достоверность различий между' сортами по реакции каллусов токсины

Под действием культурзльного Фильтрата, наряду с ¡тнгкби-роэанном роста каллусов, произошло значительное увеличение Енутрясортог-ого варьирования по удельному приросту (с 1.5-2.4 раза по сравнения) с контролен). В то время как больЕинстго каллусов дали на фоне 40% культурального фильтрата незначительный прпрорст или да^е снижение игссн, еютилнсь линии, ке уступаацке по приросту кзнгрольккм каллусс?! или превосходящие их (см. табл. 1).

Табл^а 1

Влияние культурзльного ^пльтрата на рост каллуссз в первом пасса~э

Генотгп Прирост Кокцэнтрация культуральксга

фильтрата. %

0 20 40

Лзтесцонс-! б 1'Л5К!2'гГСз!?Л 10.0 3.9. -£1.4

мзкскзльг&'З 235.6 С07.& 402.!

среди Л 57 104.9 02.1

* козСФкцкент ьариэдм. % * 8.7 82.2 116.5

Красноярская 83 каваальгегй 42.6 -12.0 -32.7

кскаазлыс-Я 231Л -112.2 452.9

средний 133.7 126.1 6-3.3

козуйкциВ'Гт огригцш,* 53.9 01.1 124.9

Лзтесценс (М-ЖаЛЬНУЙ -20. о 0.0 -1Р.З

3229/Н4В2 мэксш'глы-кн •150. 8 410.3 010.7

средний МО. 5 535.0 ш.з

коэффициент Е£р>:пц;я!. % 67.3 70.5 105.8

* - огкопенчс лгатсрски к среднему приросту, яфзгекно? в 3

В ходе второго гагсека на срэдэ с кулътуралък^ фильтрате:! произошло даяьнепгсэ шеогсгэ удсл^-аго п?;фзста пглт/сез. Сргсиекне ргегтеделегкй ¡пллусов по помосту в пзрзем и оторс-^ пасса~ах на селектипкой среде показало, что еда ппссзг ка среде с зцеэккм содержание:« культуралы-гго с?:-:льтрата кэ пргаел

к существенному обогащению популяции каллусов устойчивыми к токсинам Н.sativum .линиями. Можно , предположить, что одного 30-сутсчного пассажа нэ достаточно для полного ингибирования чувствительных к токсинам каллусов в силу замедленного поступ-» ления токсинов в участки каллуса, не соприкасающиеся непосредственно с питательной средой.

После второго пассажа на среде с культуральным фильтрате« все каллусы были перенесены на среду, свободную от токсических метаболитов, для размножения. Каллусы, давшие заметный прирост на среде без токсинов,' были в четвертом пассаже помещены на среду с 40% культурального фильтрата. Одновременно ~ отзелектированными, на среду с культуральным фильтратом были помещрны каллусы из контрольной группы, не проходившие в первом и втором пассажах отбор на среде с токсином. В таблице 2 проводится сравнение селектированных и контрольных каллусов по способности к росту на среде с культуральным фильтратом Н. sativum.

Таблица 2

Сравнение прироста селектированных и неселектированных каллусов (линия Лютесцен'с-16) на среде с 405Е культураль-ного фильтрата

Вариант опыта Тип каллусов Количество Средний Максимальны

каллусов, удельный удельный пт прирост.% прирост.%

10% культуральный фильтрат

Селектированные 90 26.8 59.4

Неселектированные 60 -2.4 41.2

Контроль

Неселектированные 21 50.0 121.4.

Как видно из представленных данных, каллусы, прошедшие в течете двух пассажей отбор на среде с культуральным фильтратом, существенно превосходили контрольную группу пс. устойчивости к токсическим метаболитам Н.БаШша.

Полученные в ходе селекции растения-регенеранты, а такие

сомаклональные пинии, полученные из контрольных каллусов, были вкрацены в условиях светокультуры и использованы для лабораторной сценки устойчивости к патогену.

Бг1ьпннство полученных в результате селекции in vitro линий продемонстрировав повышенную по сравнения с исходной формой устойчивость к патогену. Так, из 20 полученных в ходе отбора линий сорта Краснокрская-83 6 превосходили исходную форму по устойчивости более чем на 50", 6 - на 18-26%. Три линии практически ке отличались по степени поражения от контрольных растений 5 показали несколько более высокую восприимчивость к патогену. Наибол! «ей устойчивостью к патогену отличались растения, полученные по,втором-четвертом пассате при кепельзеза-ь'ии селекцгаглсн схсиы 1.

Таким образен, удлинение ' времени пребывания каллуссз на среде с культурапькьы фильтратом с едкого до двух и более пас-сагей суц-зствекко повазает эффективность отбора устойчивых лн-ний. Большое число Форм, обладающих повышенной устойчивостью к возбудителя обкшозенкоЯ корневой гкили зерновых среди полученных в результат - клеточной селекции растений-регенерантов свидетельствует о правильности выбранного подхода.

Получению в результате клеточной селекции лим« представляют большой интерес в качестве неходких форм для дальнейшей селекции на устойчивость к обыкновенной корневой гнили зерновых.

Факторы, влияюцио на чувствительность пзоиицы к тешг-й«.-ким метаболитам Еозбудитеяа обыкновенной корневой гнили зерновых в условиях культуры ткани

Одной из причин неудачи попыток получения устойчивых растений методами клеточной селекции з ряде случаев является преимущественное влияние не гекогкпических, а физиолого-иорфаго-гических особенностей каллуса на устойчивость к солектирусдш факторам б культуре in vitro. В связи с этим при разработке технологии клеточной селекции необходимо максимально учитывать влияние всех факторов, определявших способность каллусоз к росту на селективных средах.

Нами было проведено изучение влияния »морфологии, исходной массы и происхождения каллусов на их способность к росту на

селеэтизшдс средах.

Было установлено, что каллусы, полученные .из разных индивидуальных гародьсей. достоверно различались по удельному приросту на среде с 4.0% культурального фильтрата. Достоверность внутрисортовых различий, обусловленных происхождением каллуса, по данному показателю в первом пассазе составила дл~ каллусов Яютесценс-16 - 0.94, для каллусов Красноярской-83 - 0.S8, для каллусов Лютесценс 3229/Ы482 - 0.999. При этом на долю различий, обусловленных происхождением, призлось от 10 до 30% от об^ей величины внутрисортсвой дисперсии по удельному приросту каллусов на среде с токсином.

В то хе время на среде с низкой концентрацией культурального фильтрата или в отсутствии токсических метаболитов не обнаружено достоверного влияния происхождения каллусов на удельный прирост. Таким образом, можно предположить, что под действием высокой концентрации культурального фильтрата возбудителя обыкновенной корневой гнили зерновых выявились внутрисорто-вн9 различия по чувствительности растений к токсинам патогена.

Существуют данные о том, что зародыш пшеницы существенно более устойчив к действию токсинов Н.sativum,• чем каллусная культура. В связи с этим, степень дифференциации может явиться селектирующим фактором при отборе каллусов на токсина:; патогена, что приведет к селекции не по реальной устойчивости, а по морфологическим свойствам каллуса.

проверили влияние наличия зон вторичной дифференциации на чувствительность каллусов " токсическим метаболитам возбудителя обыкновенной корневой гнили (рис. 4). Для всех изучае-кых генотипов отмечена статистически достоверная (р=0.99) повышенная устойчивость каллусов, имеющих зоны ■ вторичной дифференциации побегов, к токсинам возбудителя.

Было проанализировано влияние исходной массы каллуса в гатервале от 10 до 95 мг на эффективность клеточной селекции. Установлено, что для каллусов с небольшой исходной массой ( до 31 мг ) корреляция между удельным приростом в первом и втором паисагах на среде, с токсинами была достоверно выие, чем у более массивных каллусов. Коэффициенты корреляции состаьили для Дстесчснс-16 ссотзетственнс С. 52 против 0.22. дл; Красноярс-кой-33 - 9.28 против 0.11. Это можно объяснить тем, что н.з-ссльаю каллусы более доступны действии токсинов, что ведет к

элиминировании значительной част;; чувствительны;; генотипов уг.о ~ первой пассате.

Кргсчсрсегн-СЗ

Гис. 4. Злижне наличия зон вторичной к?.

удельный прирост каллусов провой гтзет?« на сре?з с токси;;еск:п.:и кстгбо/мтсун Н. езЪН'ип:.

Таким образом, способность каллусоз гсоныде к росту на сслзлтивкгх средгх с токагчссчкыи ыетабсизггагч возбудителя соккисеемнсП корневой гнили ьерноЕШ определяется кгд гг+слн-пичееккм;:, так. и ^игиологз-морфолзгичесхюги СБОйС7пзг<и каллуса. Достовернее пиугрисортовыс различия по чусстветельности к токсинам указывает на целесообразность предварительного отРоуз исходного материала для клгтечкой с&пскцик.

Увеличение степени да{{срекци2цич каллуса присолит г. г«:-ж его чувствительности к тскскнзн патогена, что югке яснить повкзениеи урспня организации растительной ткани, как следствие - включение,.! дополнительных ?:зхакиз:ш защити и>-,фа-.ции, недоступных на клеточной уроске. У:»с-гьгс;;;;2 ¡-.аглуса позволяет снизить влаяннз морфологических особагнсстсй /канн на ее чупствителькость к то.чеяаа.! патогена и тем повысить эффективность скрининга устойчивая *е?м при прсс сдали-: клегечнон сслск1п;н.

ВЫВОДЫ

1. Изучение влияния культурального фильтрата Н. satlvua на icsjviycHLiO культуры, изолированные зародыши и штактные проростки яровой пшеницы ¡?ыязило как токсический, так я фитогор-иональный эффекты. Высокая корреляция в реакции объектов с различным уровнен организации на токсическую компоненту подтвердила возможность отбора устойчивых к токсинам фор и' в кал-лусной культуре с использованием культурального фильтрата в качестве селектирующего фактора.

2. Обнаружены достоверные различия как мезд сортами, так и мезду отдельными линиями в пределах сортов по чувствительности каллусных культур к токсическому действии культурального фильтрата. Межсортовые различия по чувствительности к культу-ральному фильтрату In vitro соответствуют различной чувствительности генотипов к патогену в полевых условиях.

3. Реакция каллусов на токсины патогена зависит как.от генетических, так и от физиолого-морфологических особенностей ткали, а такае от времени нахождения на селективной среде. Увеличение массы каллусов и наличие зон вторичной дифференциации побегоз существенно сникает чувствительность к токсинам, содержащимся в культуральной среде.

4. Эффективный скрининг устойчивых к токсическому действии культурального фига. :рата каллусных культур обеспечивается при использовании.небольшое (30-35 иг) каллусов, при этом вре-ия инкубации каллуса ка- среде с токсинами долзно составлять не ыенее двух 30-суточных пассаяей.

5. Селекционная схема, .при которой каллусы помещаются сразу на-високогоксичную среду (40 %■ культурального фильтрата), обладает существенными преимуществами по сравнении со схемой, предусматривающей постепенное повышение содержания токсинов в культуральной среде.

5. В результате проведенной клеточной селекции трех генотипов яровой гшеницы на устойчивость к токсина, возбудителя обыкновенной корневой ггаш зерновых получены устойчивые нл. • точные линии и более 40 растений-рогенерантов.

7. Значительное число полученных в результате селекции растсний-рзгенерантов при тестировании в лабораторных условиях

превзошли исходную форму по устойчивости к патогену.

8. Индивидуальный подбор возраста экспланта позволил получать морфогенные каллусные линии с достаточно высокой частотой пр?"тически у любого из 20 изученных генотипов яровой пшеницы. Предложенный способ оценки степени зрелости экспланта по морфологическим особенностям зерновки отличается простотой, надежностью и высокой воспроизводимостью в отличие от используемых в настоящее время показателей.

9. Среди районированных в Восточной Сибири сортов мягкой яровой ггеницы наибольший интерес для использования в клеточной селекции пре-ставляют Скала, Красноярская-83. Иртьпан-ка-10, Омская-9. 0мская-12. Тулунская-12 благодаря высокой способности к регенерации растений в культуре In vitro. При правильном подборе возраста экспланта выход иорфогенных каллусов у данных сортов составляет от 18 до 50SS. при этом способность к морфогенезу сохраняется на высокой уровне в течение 5-10 месяцев после индукции каллуса.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. • Иевелуха В. С., Рогинская В. А., йгашк С. В. Перспективы использования токсинов возбудителя обыкновенной корневой гнили зерновых в клеточной селекции //Сельскохозяйственная биология. - 1892. Вып. 3. - С. 45-51.

2. Шевелуха В. С., Рогинский В. 3.. Рогинская В. А.. Хияняк С. В. Сортовая специфика устойчивости яровой гпеницы к корневой гнили в условиях действия- стрессовых факторов //Вестник с.-х. науки. - 1992. Вып. 1. - С. 131-138.

3. Hljnuak S. V., Roginskaya V. A. In vitro selection of wheat for resistance against HelBlnthosporiua satlvua //Abst. 6th Intern. Congress of Plant Pathology. - Montreal. - 1993. -P. 178.

4. Хияняк С. В.. Рогинский Л. В., Борцова И. В. Оценка возможности использования различных видов Tritlcua в культ/ре ткани //Тез. докл. науч. конф. профессорско-преподавательского состава КрасГАУ. - Красноярск. - 1993. - С. 85-86.

5. Рогинская В. А., Хижняк С. В. Отбор яровой гпмкца а ^льтуре ткани на устойчивость к возбудителю обыкновенной корневой гнили зерновых //Тез. докл. науч. конф. rrpojecccpc-

ко-преподавательского состаза КрасГАУ. - Красноярск. - 1993. -С. 86-87.

6. Рогинская В. А., Хияняк С. В. Селекция яровой пшеницы на устойчивость к обыкновенной корневой гнили с помощью токсинов патогена в культуре ткачи //Вестник КрасГАУ - 1996. Вып.2. - С. 34-38.

7. Хинняк С. В. Факторы, влияющие на чувствительность каллусов пшеницы к токсическим метаболитам возбудителя обыкновенной корневой гнили зерновых //Вестник КрасГАУ - 1996. Вып. 2. - С. 38-40.

Лицензия на издательскую деятельность Р 020605 от 23-.07.52г.

И^рмационко-издЕгельская служба Красноярского государственного аграрного университета 650049,Красноярск,у.т .Ленина, IГ7

с

Подписано в печать 21.04.57г. ёормат 60x84/16 О&ьех 4,5 п.л.

Заказ

Тирал 100 о га. Бесплатно