Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Особенности цитогенетического действия фиторегуляторов в первичном каллусе

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Особенности цитогенетического действия фиторегуляторов в первичном каллусе"

г г: ол 'I в ; л !»-?'7

На правах рукописи

КАРЛОВ Геннадий Ильич

ОСОБЕННОСТИ ЦИТОГЕНЕТИЧЕСКОГО ДЕЙСТВИЯ ФИТОРЕГУЛЯТОРОВ В ПЕРВИЧНОМ КАЛЛУСЕ

Специальность 03.00.23 — биотехнология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

МОСКВА 1997

Работа выполнена на кафедре сельскохозяйственной биотехнологии Московской сельскохозяйственной академии имени К- А. Тимирязева.

Научный руководитель — доктор биологических наук, профессор Л. И. Хрусталева.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук 3. Б. Шамина; кандидат биологических наук С. В. Иванова.

Ведущее учреждение — НИИ сельскохозяйственной биотехнологии.

Защита состоится . "г .... 1997 г.

в ..... часов на заседании диссертационного совета

Д. 120.35.07 в Московской сельскохозяйственной академии имени К. А. Тимирязева.

Адрес: 127550, г. Москва, ул. Тимирязевская, 49. Ученый совет ТСХА.

С диссертацией можно ознакомиться в Центральной научной библиотеке ТСХА.

Автореферат разослан . ЗР . . 1997 г.

Ученый секретарь диссертационного совета — кандидат наук

А. С. Лосева

"Перестав сыть спорной, мысль перестает быть интересной" У. Хэзлитт

Актуальность проблемы. Особое место среди индукторов нестабильности генома в культуре In vitro отводится фитогор-монам (D'Amato, 1985). Цитогенетическая вариабельность в культуре, а именно возникновение миксоплоидных популяций происходит из-за палисоматии исходного экслланта и нарушения механизма деления клеток (Шамина, 1988), которые в свою очередь могут регулироваться фиторегуляторами. Почти ничего неизвестно о цитофизиологическом и цитогенетическом действи фитогормонов в клетках зкспланта в момент их дедифференци-ровки.

Способность фиторегуляторов при их экзогенном внесении в концентрациях выше физиологических вызывать структурные нарушения хромосом показана многими исследователями (Сварниц-кая, Гаврилова,1976, Араратян,1981, Ервандян,1987). При изучении онтогенетических эффектов фиторегуляторов в низких Физиологических концентрациях традиционным методом ана!)аз-но-метафазного анализа аберраций хромосом не выявлено их мутагенного действия (Араратян,1981). Однако появились отдельные сообщения о том, что компоненты питательной среды In vitro способны увеличивать частоту сестринских хроматидных обменов (СХО) (LI.Zhang,1990,Píjnacker.Ferwerda,1994). Пока нет единого мнения о механизмах формирования СХО. Тем не менее доказано, что частота сестринских хроматидных обменов является очень чувствительным показателем для определения потенциальных повреждений ДНК, вызываемых химичесютми мутагенами, по сравнению с оценкой геномных и хромосомных мутаций (Tice et al.,1984). Оценка цитогенетических эффектов фиторегуляторов методом СХО до настоящего времени не проводилась.

Учитывая ватаую роль фиторегуляторов , функционировании генома, можно ожидать, что даже незначительные колебания концентрации и соотношения гормонов в питательной среде могут привести к структурно-функциональным изменениям в наследственном аппарате клетки. Наличие геномных и хромосомных нарушений затрудняет использование тканей или клеточных систем для генетической трансформации ( Karp,1992. McElroy, Ja-cobsen, 1995). Изучение факторов и услое:ш, которые обеспе-

чивают стабильность генома составляет неотъемлимую и важную часть в клеточной и генетической инженерии растений и является залогом сохранения экспрессии в геноме реципиента встроенной ДНК.

Цели и задачи Целями данной работы являлось установить какие изменения вызывают фиторегуляторы в кинетике клеточного цикла и структуре хромосом на ранних этапах дедиференци-ровки клеток экспланта, а также роль фиторегуляторов в нестабильности экспрессии генов в растениях-регенерантах, полученных после культивиров^.лия in vitro каллусов трансгенных растений.

Для достижения этих целей были поставлены следующие задачи:

1. Отработать метод учета СХО и изучить цитогенетичес-кую активность фиторегуляторов в низких физиологически активных концентрациях в модельном тесте - клетки корневой меристемы ячменя.

2. Изучить влияние фиторегуляторов на частоту СХО в первичном каллусе ячменя

3. Установить влияние фиторегуляторов на продолжительность клеточного цикла и кинетику его прохождения в корневой меристеме ячменя.

4. Определить динамику полиплоидизации клеток в первичном каллусе в зависимости от плоидности, генотипа экспланта, а также концентрации и соотношения гормоноб в питательной среде

5. Провести сравнительный анализ экспрессии трансгена (GUS) у растений регенерантов,'полученных из каллусов трансгенного табака, культивируемых на питательной среде содержащей различные фиторегуляторы.

Научная новизна работы. Изучена роль фиторегуляторов в в индукции нестабильности генома на ранних этапах дедиффе-ренцировки клеток в культуре in vitro.

Впервые показано, что фиторегуляторы являются индукторами сестринских хроматидных обменов в первичном каллусе и клетках корневой меристемы растений на примере ячменя.

Показана важность баланса фиторегуляторов в индукции СХО в первичном каллусе ячменя.

Установлено, что фиторегуляторы влияют на продолжительность клеточного цикла и кинетику его прохождения.

Установлена зависимость степени полиплоидизации в первичном каллусе люцерны от генотипа, уровня плоидности и по-лисоматии исходного экспланта.

Впервые проведен анализ экспрессии трансгена (GUS) у растений регенерантов, полученных из каллусов трансгенного табака, культивируемых на питательной среде содержащей различные фиторегуляторы.

Теоретическая и практическая значимость работы. Выполнение указанных задач позволило установить роль фиторегуля-торов в индукции нестабильности генома в культуре in vitro.

Результаты могут послужить для • оптимизации процессов трансгеноза, широко используемого в настоящее время для решения разного рода практических и теоретических задач биотехнологии.

Метод сестринских хроматидных обменов может быть использован как чувствительный тест для оценки цитогенетичес-ких эффектов компонентов питательных сред для культуры in vitro.

Предлагается при выполнении трансгеноза и дальнейшем культивировании in vitro трансгенных клеток избегать использования 2,4-Д в питательных средах.

Обьем и структура работы. Диссертационная работа изложена на _ страницах машинописного текста и содержит_ тгДлиц,

рисунков и включает_ литературных источника.

Апробация работы Материалы диссертации докладывались на пленарном заседании секции "Экспрессия генома" ежегодного симпозиума общества физиологов растений "Физико-химические основы физиологии растений" (Пущино,1995). в институте ботаники Венского университета (Вена, Австрия,1992), на кафедре генетики Гронингенского университета (Гронинген, Нидерланды. 1991), в институте селекции и репродукции с/х растений CPRß-DLO (Вагенинген, Нидерланды, 1996), на кафедре генетики Сельскохозяйственного университета г.Вагенингена (Нидерланды, 1997), на международной конференции "Регуляторы роста и развития растений" (Москва, 1995), на международном симпозиуме "In situ conservation" (Анталия. Турция, 1996), на еже-

годных конференциях молодых ученых ТСХА (Москва, 1994,1995). а так же на ежегодной научной конференции ТСХА (Москва. 1995)

Благодарности. Автор выражает сердечную признательность своему научному руководителю проф. Л.И.Хрусталевой за внимание и неоценимую помощь при постановке и обсуждении экспериментов . зав. кафедрой с/х биотехнологии В.С.Шевелухе, старшему научному сотруднику Г.Н. Андреевой, Г.Н.Артамоновой и другим сотрудникам кафедры за поддержку при выполнении работы. Автор благодарит Б.В. Мазина и А.А.Шаденкова за любезно ; предоставленный материал.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

Обосновании выбора объекта исследований При выборе культур для экспериментов руководствовались удобством использования данной культуры для изучения тех или иных цито-генетических эффектов фиторегуляторов. Так в опытах по анализу влияния фиторегуляторов на уровень СХО целесообразно было использовать обьект (культуру) с крупными хромосомами и небольшим их числом, а так же с отработанной технологией получения первичного каллуса на данном обьекте. Этим требованиям более всего подходил ячмень, у которого число хромосом 2п=14 и их размер варьирует в районе 5-12 мкм. Для этого обьекта хорошо отработана технология получения первичного каллуса в присутствии различных концентраций 2.4-Д, 6-БАП и сахарозы.

В случае сравнительного изучения 2,4-Д и ИУК на процес-■ сы, происходящие в первичном каллусе, а так же их влияния на инактивацию трансгена в растениях регенерантах целесообразно было использовать табак, для которого хорошо отработана система регенерации растений после длительного культивирования • In vitro, а так же имеется целый ряд трансгенных расте- '

НИИ.

Для экспериментов по выявлению факторов влияющих на степень полисоматии исходного экспланта нами была использована люцерна, для которой получены ряд линий с различным генотипом и уровнем плоидности.

В работе использовали следующие фиторегуляторы: • 2,4-Д

(Serva, D 8407). ИУК (Serva, I 2886), кинетин (К 0753), зеа-ТИН (Z 0876) и 6-ВАЛ (В 9395).

Дифференциальное окрашивание сестринских хроматид проводили после инкубации материала в растворе BrdC (10 мг/л) по методу флюоресценция плюс Гимза (Perry,1973), с некоторыми модификациями.

Культуру первичного каллуса люцерны получали на среде Гамборга В5 с добавлением 250 мг/л NH4NO3, 8 мг/л 2,4-Д. 8 мг/л кинетина, 1 мг/л НУК

Первичный каллус ячменя индуцировали из незрелых зародышей на среде Гамборга В5 с добавлением следующих вариантов фиторегуляторов и сахарозы: 1.30 г/л сахароза, 2. 45 г/л сахароза, 3. 1мг/л 2,4-Д+ЗО г/л сахароза, 4. 2мг/д 2,4-Д +30 г/л сахароза, 5. 2мг/л 2,4-Д + 45 г/л сахароза, 6. 2мг/л 2,4-Д + 0,5 мг/л б-БАП + 45 г/л сахароза

Измерение продолжительности клеточного цикла проводили кофеиновым методом (Gimenez-Martln et al., 1965).

Денситометрию проводили на постоянных давленных препаратах, окрашенных по Фелыену (холодный гидролиз) на микроскопе Axlophot под маслянной иммерсией при увеличении 100x2,0, при длине волны 520 нм, с использованием системы анализа изображений ИБАС-2000, по специальна написанной программе. 0 количестве ДНК в ядре судили по оптической плотности, выраженной в условных единицах 1.0.D. В зависимости от эксперимента в каждом варианте измеряли 1.0.D. 200-500 ядер не менее чем от трех образцов.

Митотический индекс считали на давленных препаратах. Для каждого срока фиксации подсчитывали 1500-3000 клеток.

Культуру каллусов табака получали на среде Мураси-ге-Скуга в присутствии 30 г/л сахарозы и фиторегуляторов в двух сочетаниях: 1.2мг/л ИУК+0,2 мг/л кинетин; 2. 2мг/л 2.4-Д+0.2 от/л кинетин. После четырех субкультивирований каллус переносился на среду для регенерации побегов.

Наличие или отсутствие экспрессии тр-шсгена (GUS) в растениях регенерантах определяли модифицированным нами методом по Jefferson (1987).

Статистическую обработку результатов проводили стандартными методами, а также с использованием программ математического обеспечения ИБАС-2000 - Classl и Class 2

РЕЗУЛЬТАТЫ

1. Влияние фиторегуляторов на частоту сестринских хро-матидных обменов (СХО) в корневой меристеме ячменя.

Метод выявления сестринских хроматид основан на инкорпорации Вгс1С в молекулу ДНК в течение двух циклов репликации. Необходимым условием проведения эксперимента является подбор оптимальной концентрации Вгс1С и времени прохождения двух циклов репликации.

Опыты были проведены на двухдневных проростках семян ярового ячменя Зазерский 85. Наиболее подходящим временем инкубации оказалось 24 часа. Как видно из табл.1 наиболее оптимальной концентрацией оказалось 15 мг/л. В дальнейшем эта концентрация использовалась во всех вариантах экспериментов для подсчета СХО.

После двух циклов репликации в присутствии Вгс1С и фито-регуляторов, было получено четкое дифференциальное окрашивание по методу ГБР (флюоресценция плюс Гимза). Подсчет частоты СХО был проведен в расчете на хромосому.

Таблица 1

Степень выявления сестринских хроматид в корневой меристеме ячменя в зависимости от концентрации ВгсЮ в инкубационном растворе

Концентрация ВгйС (мг/л) / Степень выявления сестринских хроматид

2.5 Не выявляются

5,0 Не выявляются

10 • Слабо

15 Четкое

20 • Четкое

В контроле ( при инкубации проростков в присутствии только ВгсЭС) частота сестринских хроматидных обменов колебалась в пределе 0,37 на хромосому и практически не зависела от времени постановки эксперимента (Рис. 1,2). Максимальное количество СХО не превышало 3 обменов на хромосому.

Ауксины. В присутствии ауксинов (ИУК и 2,4-Д) при увеличении концентрации с 0.5 мг/л до 5 мг/л частота СХО значительно увеличивалась (Рис. 1). Так если при наименьшей концентрации ауксинов эта цифра незначительно превышала контрольную, то при наивысшей эти значения более чем в два-три раза превышали контроль. Наибольший эффект увеличения частоты СХО обнаружен для 2,4-Д. Интересно отметить, что для выявления сестринских хроматид в присутствии ауксинов при концентрации более чем 2мг/л, время инкубации приходилось увеличивать с 24 часов до 30, что свидетельствовало о задержке клеточного цикла ауксинами.

Цитокинины. Из изученных цитокининов наибольшее влияние на частоту СХО оказывали зеатин и кинетин (Рис. 2). Значительное повышение СХО отмечается, начиная с концентрации 1 мг/л. При этом наблюдается четкий доза-зависимый эффект. Для выявления сестринских хроматид в присутствии зеатина и кине-тина в концентрации 5 мг/л, так же как и в случае с ауксинами, время инкубации проростков приходилось увеличивать. Для 6-БАП картина изменения частоты СХО с увеличением концентрации была иной. Не наблюдалось доза-зависимого эффекта. Так максимальный уровень СХО отмечен при концентрации 1 мг/л. Дальнейшее повышение концентрации 6-БАП до 5 мг/л приводило к снижению уровня СХО до значения близкого к контрольному.

Итак, проведенные нами исследования в модельной тест-системе показали, что фиторегуляторы значительно повышают частоту сестринских, хроматидных обменов в корневой меристеме ячменя. При этом наиболее сильным индуктором СХО является 2,4-Д, который в концентрации 5 мг/л, более чем в три раза увеличивает частоту СХО по сравнению с контролем.

2. Влияние компонентов питательной среды на частоту СХО в первичном каллусе ячменя.

В экспериментах на корневой меристеме ячменя тест на индукцию СХО фитсрегуляторами дал положительный результат,

Рис.1 Влияние ауксинов на частоту СХО г. корневой меристеме ячменя сорта Зазерский 85

С X

О 1

н а

0.8 -

X Р

0 06 м с о

м 04 У

0.2 "

I

Концентрация, мг/л

Контроле -4- 2.4-Д -*- ИУК

Рис.2 Влияние цитокининов на частоту СХО в корневой меристеме ячменя сорта Зазерский 85

Концентрация* иг/л -*- Контроль -+- Кинетин • Зеатин -в- б-БАП

поэтому мы использовали его для оценки роли компонентов питательной среды в повышении нестабильности генома in vitro. При культивировании 15 дневных зародышей на питательной среде без фиторегуляторов частота СХО была невысокой 0,30-0,33 в расчете на хромосому (Табл. 2). Эта цифра была несколько меньше, чем в случае с корневой меристемой. При повышении количества сахарозы в питательной среде с 30 г/л до 45 г/л уровень СХО практически не изменялся. Введение в среду синтетического аналога ауксина - 2,4-Д, значительно повышало частоту СХО. При этом повышение концентрации 2,4-Д с 1 мг/л до 2 мг/л приводило к увеличению частоты СХО с 0,51 до 0,67 в расчете на хромосому. Увеличение концентрации сахарозы при неизменном уровне 2,4-Д ье меняло уровень сестринских хроматидных обменов. Однако, добавление в питательную среду 6-БАЛ приводило к значительному снижению количества СХО до уровня 0,47 в расчете на хромосому. Эти данные могут свидетельствовать в пользу предположения о важности баланса фиторегуляторов в стабильности генома.

Таблица 2

Влияние компонентов питательной среды Гамборга В5 на частоту СХО в культуре первичного каллуса ячменя сорта Зазерский Р1^

Компоненты питательной среды Частота СХО td

30 г/л сахароза 0,30 ± 0.03 --

45 г'/л сахароза 0,33 ± 0,03 0,71

1 мг/л 2,4-Д + 30 г/л сахароза 0,51 * 0,04 4,20*

2 мг/л 2,4-Д + 30 г/л сахароза 0,67 ± 0.05 5,31*

2 мг/л 2,4-Д + 45 г/л сахароза 0,64 ± 0.05 4.63*

2 мг/л 2,4-Д +0,5 мг/л 6-ВАЛ + 0,47 ± 0,04 3,40"

45 г/л сахароза

* - статистически достоверная разница (td > 1,96)

Рис.3 Влияние 2,4-Д (2 мг/л) на распределение клеток по фазам клеточного цикла в корневой меристеме ячменя сорта Зазерский 85

Контроль в! Б вг

и. а

зг.ег

-¡.¡и

2,4-Д вг Б вг

и

ш

Таблица 3

Влияние фитогормонов и их синтетических аналогов (2мг/л) на продолжительность клеточного цикла в корневой меристеме ячменя сорта Зазерсгаш 85

Вариант Средняя продолжительность клеточного цикла

Контроль (Н2О) 12,0

2,4-Д 14,5

ИУК 14,0

Кинетин 13,0

Зеатин 14,0

6-БАП 10,5

Таким образом, из протестированных компонентов питательной среды наиболее выраженным эффектом обладала 2,4-Д, однако при добавлении в питательную среду синтетического аналога ци-токинина - С-БАП частота СХО снижалась.

3. Фиторегуляторы и клеточный цикл.

3.1. Продолжительность и кинетика клеточного цикла. Механизм образования СХО связан с возникновением одкоцепочечных разрывов ДНК, которые мог'ут приводить к задержке клеток в

5-фазе и G-2-фазе, что в конечном итоге ведет увеличению клеточного цикла. В данной серии экспериментов мы установили влияние экзогенных фиторегуляторов на продолжительность клеточного цикла и динамику его прохождения. Нами были испытаны 2,4-Д, ИУК, зеатин, кинетин и 6-БЛП в концентрации 2 мг/д. Все фито-регуляторы вызывали изменение продолжительности неточного цикла ( Табл.3). Наиболее сильный эффект оказывал 2,4,-Д. Этот синтетический аналог ауксина увеличивал продолжительность клеточного цикла на 2,5 часа по сравнению с контролем. ИУК ч зеатин увеличивали продолжительность на 2 часа, а кинетин всего на 1 час. Интересно отметить, что наименьший индуктор СХО,

6-ВАЛ, ускорял прохождение клеток по клеточному циклу.

Для того чтобы выяснить на какой именно фазе фиторегуля-торы вызывают задержку клеточного цикла нами была проведена денситометрия ядерной ДНК через 12 и 24 часа при совмесг юй инкубации проростков с фиторегуляторами в концентрации 2 мг/л. 2,4-Д, ИУК, зеатин и кинетин вызывали увеличение продолжительности S-фазы и задержку клеток на рубеже Gz/U. При этом наиболее выраженным эффектом обладал 2,4-Д (Рис. 3). 6-БАП практически не менял динамику прохождения клеточного цикла по сравнению с контролем.

Эти данные по замедлению клеточного цикла хороао уклады-' ваются в предлагаемую на сегодня модель образования СХО, которая построена на основе функциональной организации единицы репликации ДНК (Schubert, 1990).

3.2. Полисоматия в первичном каллусе. Наиболее распространенным типом геномных нарушений в культуре первичного каллуса является полиплоидия, которая чаще всего возникает в результате эндоредушшкации, связанной с нарушением клеточного цикла. Установленная способность фиторегуляторов влиять на

Рис.4 Митотический индекс (М.И.) в первичном каллусе табака при культивировании на 2.4-Д и ИУК содержащей средах

Дни культивирования

—В— ИУК —2,4-Д

Таблица А

Числа хромосом в делящихся клетках первичного каллуса табака на 5-й день от начала индукции.

Вариант опыта. Просмотрено метафаз Число хромосом на клетку Количество метафаз, X

24 48 96 >96

ИУК+кин. 48 10,5 . 83,3 6,3 -

2.4-Е>+кин. 38 5.3 86,8 5.3 2,6

Таблица 5

Процент полиплоидных клеток при культивировании незрелых зародышей ячменя сорта Зазерский 85

Компоненты питательной среды Процент полиплоидных клеток

0 день 3 день 13 день

2 мг/л 2,4-Л 2.6 12,2

2 мг/л 2.4-Д+ 0,5 мг/л 6-БАП 2,6 4.6 6.9

Б-фазу и выход клеток в митоз, послужило основанием для проведения серии экспериментов, где мы попытались установить зависит ли степень полиплоидизацчи клеток от используемого фиторе-гулятора и как влияет на этот показатель происхождение исходного экспланта, плоидность , генотип и вид вводимой культуры. Были использованы представители двудольных и однодольных: ячмень, табак и люцерна. Среди изученных видов наиболее высокий уровень полисоматии в исходных эксплантах был у лгчерны, количество полиплоидных клеток превышало 50* (Табл 6). Тканевое происхождение экспланта практически не влияло на процент полиплоидных клеток. Эксплантн из листовых пластин и междоузлий по числу полиплоидных клеток практически не отличалось внутри каждой формы. Резко отличалась от остальных форм сравнительно низким уровнем полиплоидных клеток в исходном экспланте диплоидная форма Д-16. Это дает основание предположить, что степень полиплоидии исходного экспланта контролируется генотипом.

Небольшое количество полиплоидных клеток было выявлено в незрелом зародыше ячменя - > ЗХ (Табл.5). В листовых пластинках табака полиплоидных клеток не обнаружено.

Для сравнительного изучения действия ИУК и 2,4-Д на процессы. происходящие в первичном каллусе, мы использовали пробирочную культуру растений табака. Более сильным инду. .тором пролиферации по сравнен™ с ИУК, оказалась 2,4-Д (рис.4). Эти данные хорошо коррелировали с результатами денситометрии ядерной ДНК. Уже на третий день большая часть клеток экспланта находилась в Б-фазе. В процессе культивирования возникали полиплоидные клетки, что подтверждено денситометрией ядерной ДКК и подсчетом чисел хромосом на 5-й день культивирования (Табл.4). В конце пассажа (31 день) уровень полисоматии был примерно одинаков для 2,4-Д и ИУК содержащей среды.

При культивировании незрелых зародышей ячменя на питательной среде с 2,4-Д (2 мг/л) количество полиплоидных гле-ток увеличивалось (табл.5 ). Уже на третий день их количество повышалось до 8Х. При добавлении в питательную среду б-БАП (0,5 мг/л).тенденция увеличения количества полиплоидных клеток была менее выраженной, по с равнению с первичным каллусом ' культивируемом только на 2,4-Д содержащей среде.