Особенности свободнорадикального окисления при гипо- и гиперкортикоидных состояниях

Синицкий, Антон Иванович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Особенности свободнорадикального окисления при гипо- и гиперкортикоидных состояниях
ВАК РФ 03.01.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Особенности свободнорадикального окисления при гипо- и гиперкортикоидных состояниях"

На правах рукописи

Синицкий Антон Иванович

ОСОБЕННОСТИ СВОБОДНОРАДИКАЛЬНОГО ОКИСЛЕНИЯ ПРИ ГИПО- И ГИПЕРКОРТИКОИДНЫХ СОСТОЯНИЯХ

03.01.04 - биохимия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

2 8 НОЯ 2013

Челябинск - 2013

005539832

Работа выполнена на кафедре биохимии Государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «ЮжноУральский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Научный консультант

Доктор биологических наук, профессор

Цейликман Вадим Эдуардович

Официальные оппоненты

Дубинина Елена Ефимовна доктор медицинских наук, профессор, ФГБУ «Санкт-Петербургский научно-исследовательский психоневрологический институт им. В.М. Бехтерева Минздрава России, отделение клинико-диагностических исследований психоневрологических больных, главный научный сотрудник

Галян Сергей Леонидович доктор медицинских наук, профессор, ГБОУ ВПО «Тюменская государственная медицинская академия» Минздрава России, кафедра биологической химии, заведующий кафедрой

Никоноров Александр Александрович доктор медицинских наук, профессор, ГБОУ ВПО «Оренбургская государственная медицинская академия» Минздрава России, кафедра биологической химии, заведующий кафедрой

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное учреждение «Научно-исследовательский институт биохимии» Сибирского отделения Российской академии медицинских наук.

Защита диссертации состоится « » декабря 2013 года в часов на заседании Диссертационного совета Д 208.117.02 при Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «ЮжноУральский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации, по адресу: 454092, г. Челябинск, ул. Воровского, 64.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Южно-Уральский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации.

Автореферат разослан «_»_2013 года.

Ученый секретарь Диссертационного совета, доктор медицинских наук

Н.В. Тишевская

Общая характеристика работы

Актуальность темы исследования и степень ее разработанности

Подавляющее большинство метаболических процессов в организме позвоночных животных регулируется глюкокортикоидными (ГКГ) гормонами (Меркулов В.М., Меркулова Т.И. Вавиловский журнал генетики и селекции.-2011,-Том 15, № 4; Sapolsky, R., M. Romero, A. Munck Endocrine Revies.-2000.-№l). Уникальное разнообразие и распространенность эффектов ГКГ, очевидно, связаны с их основной функцией: эндокринной регуляцией стресса и адаптационных процессов. Метаболические эффекты ГКГ при стрессе на сегодняшний день детально изучены. Наиболее заметным из них является влияние на углеводный обмен, мобилизация липидов и аминокислот, ограничение синтеза белка и стимуляция протеолиза в различных типах мышц и др. (Dejean С., Richard D. Rev. Med. Interne. -2013,- 34(5); Munck A. Steroids. -2005.-70(4)).

Одним из наиболее важных метаболических процессов, наряду с биоэнергетикой, обменом углеводов и липидов, является свободнорадикальное окисление. Активные формы кислорода (АФК) в физиологических условиях участвуют во многих регуляторных и метаболических процессах. В тканях происходит непрерывная генерация АФК, которая обеспечивает сохранение нормального метаболического фона, необходимого для функциональной активности клеток (Дубинина, Е.Е. Продукты метаболизма кислорода в функциональной активности клеток (жизнь и смерть, созидание и разрушение). Физиологические и клинико -биохимические аспекты, 2006). Поэтому любая стрессовая реакция организма, как и любой адаптивный процесс, закономерно сопровождается изменениями свободнорадикального окисления, а окислительный стресс является одним из важнейших звеньев адаптации организма на клеточном уровне (Jones, D.P. Am. J. Physiol. Cell. Physiol. - 2008.- 295(4)).

По этой причте изменения свободнорадикального окисления и функция антиоксидантной системы, сопровождающие воздействие самых разных стрессоров, патологических и адаптивных процессов - одно из наиболее активно развиваемых научных направлений последних десятилетий (Pardon, М.С. Brain research reviews.-2007.-№54; Kovacs, P., Juranek, I., Stankovicova, T., et al. Pharmazie.-1996.-№51). Из работ этих и многих других авторов сегодня очень много известно об особенностях свободнорадикального окисления в условиях стресса. Но, к сожалению, имеется очень мало данных о том, какие из этих изменений связаны с действием ГКГ при стрессе, а какие реализуются по механизмам, не зависящим от функции ГГАС.

Между тем, известно, что ГКГ принимают участие и в регуляции процессов свободнорадикального окисления. Сегодня известно о глюкокортикоидной регуляции NO-синтазы (Liu Y., Mladinov D., Pietrusz J.L. et al. Cardiovascular Research.-2009.-№81), глутатионпероксидазы (Patel R., Mcintosh L., McLaughlin J. Journal of Neurochemistry.-2002.-№82),

ксантиноксидазы, СОД, каталазы, (Vallelian F., Schaer С.А., Kaempfer T., et al. Blood.-2010.-9;116(24)), скорости продукции АФК (Cuong Т.Т., Chul-Su Y., Jae-Min Y. et al. Life Sciences.- 2009.- №85), НАДФ-оксидазы (Seo J.S., Park J.Y., Choi J. et al. The Journal of Neuroscience. - 2012.-32(28)), моноаминоксидазы (Carlo P., Violani В., Del-Rio M. et al. Brain Res. - 1996. -711(4)). Следовательно, от функционального состояние ГГАС, которое в свою очередь, определяется, прежде всего, частотой, длительностью, кратностью, и характером действующих стрессоров, могут зависеть и многие особенности свободнорадикального окисления.

Длительное воздействие стрессоров нередко приводит к дестабилизации ГГАС, выраженность которой может постепенно увеличиваться, что приводит, согласно современным представлениям, к перепроизводству ГКГ, стойкой гиперкортизолемии, формированию так называемой «аллостатической нагрузки», развитию гиперкортикоидного состояния и «болезней адаптации» (McEwen В.S. Physiol. Rev. - 2007. - № 3). Тем не менее, имеются данные и другого характера, в которых внимание акцентируется на снижении уровня гормонов коры надпочечников при патологии стрессорного характера. В настоящее время это доказано в случае хронической боли (Heim С., Ehlert U., Hanker J., et al. Psychosom. Med.-1998.-60(3)), синдрома хронической усталости (Juster R.P., Sindi S., Marin M.F., et al. Psychoneuroendocrinology. - 2011.- 36(6)), а также фибромиалгии (Maes M., Lin A., Bonaccorso S., et al. Acta Psychiatr. Scand. - 1998.-98(4)). Кроме того, показано, что при синдроме посттравматического стрессорного расстройства, формирующегося у участников боевых конфликтов (Pitman R.K., Orr S.P. Biol. Psychiatry.- 1990.-№2), лиц, переживших различного рода жизненные драмы (жертв изнасилований (Bicanic I.A., Postma R.M., Sinnema G. Psychoneuroendocrinology.- 2013,- 38(3)), больных, страдающих различными фатальными заболеваниями от онкологической патологии до ВИЧ -инфекции (Norbiato G. Ann. N.Y. Acad. Sei. - 2012.-1262; Glover D., Poland R. Psychoneuroendocrinology. - 2002. - 27(7)), наблюдается длительное снижение уровня кортизола. Некоторые исследователи полагают, что именно сниженный уровень глюкокортикоидов определяет степень тяжести стрессорных расстройств (Steudte S., Stalder T., Dettenborn L., et al. Psychiatry Res.-2011.-30;186(2-3)).

Таким образом, дестабилизация ГГАС с последующим развитием гипо — или гиперкортикоидного состояния зачастую является основой для развития большого количества различных заболеваний. При этом весьма вероятным последствием такой дестабилизации является развитие окислительного стресса.

Цель исследования

Дать комплексную оценку состояния свободнорадикального окисления при гипо — и гиперкортикоидных состояниях, сопряженных с дисфункцией ГГАС и нарушением адаптивных процессов.

Задачи исследования

1. Охарактеризовать особенности свободнорадикального окисления и функцию ГГАС при экспериментальных стрессорных воздействиях.

2. Установить особенности свободнорадикального окисления и функцию ГГАС при введении экзогенного глюкокортикостероида.

3. Выявить глюкокортикоид - зависимые изменения свободнорадикального окисления в структурах головного мозга при экспериментальных стрессорных воздействиях, сопоставить их с изменениями поведенческой активности.

4. Выявить глюкокортикоид - зависимые изменения свободнорадикального окисления в печени и почках при экспериментальных стрессорных воздействиях, сопоставить их с активностью биотрансформации глюкокортикоидов.

5. Выявить глюкокортикоид - зависимые изменения свободнорадикального окисления в органах кроветворения и иммуногенеза при экспериментальных стрессорных воздействиях, сопоставить их с изменениями гуморального и клеточного иммунитета.

6. Установить и охарактеризовать особенности свободнорадикального окисления при клинических состояниях, сопровождающиеся нарушением адаптивных процессов и лабораторными проявлениями гипо- и гиперкортикоидных состояний.

Методология и методы исследования

Экспериментальный раздел работы выполнен на 643 беспородных лабораторных крысах обоего пола массой 240 - 280 г. Для моделирования изучаемых состояний применялись модели иммобилизационного и гипокинетического стресса. Были использованы два режима повторных иммобилизаций.

Первый режим воспроизводился путём трехкратных одночасовых иммобилизаций с интервалом между воздействиями в 24 часа. Согласно данным, полученным ранее (Цейликман В.Э. автореф. дис. ... д-ра биол. наук - М., 1998. - 46 е.), при таком способе моделирования хронического стресса развивается и доминирует толерантная стратегия адаптации. Авторы концепции адаптационных стратегий аргументировано декларируют гомологичность толерантного гипобиоза и «стадии истощения» стресс-синдрома (Кулинский В.И., Ольховский И.А. Успехи современной биологии. - 1992. - Вып. 5 - 6.). Толерантный гипобиоз развивается у гомойотермных животных и человека вслед за стресс-реакцией, если она не обеспечивает адаптивный эффект (Волчегорский И.А., Долгушин H.H., Колесников О.Л., Цейликман В.Э. Экспериментальное моделирование и лабораторная оценка адаптивных реакций организма. - Челябинск, 2000).

(Волчегорский И.А., Долгушин И.И., Колесников O.JL, Цейликман В.Э. Роль иммунной системы в выборе адаптационной стратегии организма -Челябинск, 1998), наличие поведенческих расстройств тревожно -депрессивного характера и снижение чувствительности к глюкокортикоидам (Волчегорский И.А., Цейликман В.Э., Смирнов Д.С. и др. Проблемы эндокринологии. - 2003.-Т.49, №5).

Гипокинетический стресс моделировали путём помещения животных в специальные клетки-пеналы. Продолжительность воздействия составляла 24 часа (острый гипокинетический стресс) и 72 часа (пролононгирование воздействия до трех суток). После завершения гипокинезии наблюдалось нарушение регуляции ГГАС по механизму отрицательной обратной связи и увеличение уровня кортикостерона в крови. Причём увеличение продолжительности гипокинезии приводило к более выраженной дестабилизации ГТАС.

Для изучения регуляции функциональной активности ГГАС использовали дексаметазоновый тест, который проводился после завершения гипокинезии по схеме, учитывающей особенности циркадной ритмики ГГАС у лабораторных крыс (Рыбникова Е.А., Самойлов М.О., Миронова В.И., и соавт. Журнал неврологии и психиатрии. - 2007. - №7). В качестве оценочного показателя функционирования механизмов обратной связи использовали изменения уровня кортикостерона в плазме крови до (исходный уровень) и через 6 часов после введения дексаметазона (KRKA, Словения; внутрибрюшинно в дозе 5 мкг / кг).

Для оценки ГКС - зависимых изменений свободнорадикального окисления животным вводили глюкокортикостероидный препарат триамцинолона ацетонид (кеналог, Veb Berlin-Chemie, Германия, доза: 2 мг/кг, подкожно). С той же целью применялся глюкокортикоидный антагонист RU38486 (Mifepristone, Sigma). Животные получали антагонист в дозе 10 мг/кг интрагастрально перед каждым эпизодом иммобилизационного стресса. Режим введения выбран исходя из данных литературы (Wulsin A.C., Herman J.P., Solomon M.B. Psychoneuroendocrinology.- 2010.-35(7)) и особенностей фармакокинетики RU38486 (U.S. Food and Drug Administration [Электронный ресурс]: офиц. сайт URL: http://vvwvv.fda.gov/default.htm). Для изучения МАО - зависимых изменений свободнорадикального окисления использован селективный ингибитор МАО-Б депренил (ЮМЕКС, Sanofi / Chinoin, Венгрия) в дозе 10 мг/кг за 1 час до начала каждого сеанса иммобилизационного стресса. Выделение структур головного мозга крыс производилось в соответствии с рекомендациями, изложенными в работе (Glowinski J., Iversen L.L. // J. Neurochem. - 1966. - Vol. 13.).

Поведенческие реакции животных изучались с использованием теста «приподнятый крестообразный лабиринт» (Beizung С., Griebel G. Behav. Brain. Res. - 2001.- 125(1-2)) и актографа «открытое поле», эти тесты считаются одной из наиболее адекватных и чувствительных моделей для изучения тревожности у лабораторных грызунов (Rodgers R.J., Cole J.C.

Physiol. Behav. -1993. - Oct; 54(4)). Оценка гуморального и клеточного иммунитета производилась в соответствии с рекомендациями, изложенными в монографии (Волчегорский И.А., Долгушин И.И., Колесников O.JL, Цейликман В.Э. Экспериментальное моделирование и лабораторная оценка адаптивных реакций организма. - Челябинск, 2000).

Клинический раздел работы посвящен изучению особенностей свободнорадикального окисления при состояниях, сопровождающихся лабораторными проявлениями дисфункции ГГАС (гипо - или гиперкортикоидные состояния) и нарушениями процессов адаптации. В исследование включены доношенные новорожденные дети с нарушениями адаптации, развивавшимися в раннем постнатальном периоде (раздел исследований проведен совместно с к.м.н. Поповой А.С. и к.м.н. Крупицкой Л.И.); пациенты с диагнозом «посттравматическое стрессовое расстройство» (раздел исследований проведен совместно с к.м.н. Бояриновой Н.В. и врачом высшей квалификационной категории Шатровой М.А.); пациенты с психическими и поведенческими расстройствами, вызванными употреблением алкоголя (раздел выполнен совместно с к.м.н. Виноградовым Д.Б., к.м.н. Паначевым И.В., к.м.н. Мингазовым А.Х.).

Содержание продуктов перекисного окисления липидов (ПОЛ) оценивали спектрофотометрически в липидном экстракте исследуемых тканей (Волчегорский И.А., Налимов А.Г., Яровинский Б.Г., Лифшиц Р.И. Вопросы медицинской химии. - 1989. - № 1). Определение содержания конечных продуктов перекисного окисления липидов производилось методом Львовской Е.И. с соавт. (Львовская Е.И., Волчегорский И.А., Шемяков С.Е. и др. Вопр. мед. химии.-1991. - №37), малонового диальдегида в крови (ТБК - реактивные продукты) по реакции с тиобарбитуровой кислотой (Камышников, В. С. Справочник по клинико-биохимическим исследованиям и лабораторной диагностике. - Москва, 2004.). Интенсивность аскорбат-индуцированного ПОЛ изучали, используя рекомендации Львовской Е.И. (Львовская, Е. И. Нарушение процессов липидной пероксидации при термической травме и патогенетическое обоснование лечения антиоксидантами из плазмы крови : автореф. дисс. ... д-ра мед. наук. - Челябинск, 1998). Уровень спонтанной и металл -катализируемой окислительной модификации белков (ОМБ) в исследуемых тканях оценивали по образованию динитрофенилгидразонов (Дубинина Е.Е., Бурмистров С.О., Ходов Д.А. и соавт. Вопр. мед. химии.- 1995,- №4). Активность моноаминоксидазы - Б определялась альдегидометрическим методом с использованием в качестве субстрата солянокислого бензиламина (Волчегорский И.А., Скобелева Н.А., Лифшиц Р.И. Вопросы медицинской химии. - 1991. - Т. 37, Вып. 1). Активность супероксидцисмутазы оценивали по методу С. Чевари и соавт. (Чевари С., Чаба И., Секей Й. Лаб. дело. - 1985. - № 11), активность ксантиноксидазы - по методу Hashimoto (Hashimoto S. Analytical biochemistry. - 1974. - Vol. 62). Определение активности глутатионпероксидазы в гемолизатах эритроцитов проводили по методу,

описанному Власовой С.Н. и соавт. (Власова С. Н., Шабунина Е. И., Переслегина И. А. Лаб. дело. - 1990. - №8.). Содержание церулоплазмина в сыворотке крови изучали модифицированным методом Равина (Камышников, В. С. Справочник по клинико-биохимическим исследованиям и лабораторной диагностике. - Москва, 2004.). Активность катал азы оценивали по методу М.А. Королюк и соавт. (Королюк М. А., Иванова JI. И., Майорова И.Г. Лаб. дело. - 1988. - № 1). Содержание кортизола в сыворотке крови определялось с использованием набора реагентов «КОРТИЗОЛ - ИФА — БЕСТ» (Вектор - Бест, Россия). Содержание кортикостерона -флюорометрическим микрометодом Балашова Ю.Г. (Балашов Ю.Г Физиол. журн. СССР им. Сеченова. - 1990. - №2.). Активность llß-гидроксистероиддегидрогеназы определялась с использованием методического подхода, описанного О.П.Черкасовой (Черкасова О.П. Бюллетень экспериментальной биологии и медицины 2006.- Т.141, №1). Для оценки монооксигеназных активностей использовалась микросомальная фракция печени, полученная методом низкоскоростного центрифугирования в присутствии ионов Са2+ (Kamath S., Rubin Е. Biochem. Biophys. Res. Commun. 1972.-6;49(1)). Оценку эритромицин N - деметилазной активности (ЭРНД-активность, СУРЗА-зависимое монооксигенирование) осуществляли по методу J.Werringloer (Werringloer J. Methods Enzymol.-1978.-v.52).

Результаты обрабатывались общепринятыми методами дескриптивной статистики и выражались в виде среднеарифметической (М) и её стандартной ошибки (m). Статистически значимые различия определяли с использованием критериев непараметрической статистики: Манна-Уитни (U), Вальда-Вольфовица (WW), а также параметрического критерия Стьюдента (t - тест) (после проверки изучаемой выборки на нормальность распределения (критерий Шапиро-Уилкса) и равенство дисперсий (критерий Левина)). Для проведения кластерного анализа использован метод К-средних (K-means). Статистические взаимосвязи изучали при помощи непараметрического корреляционного анализа, выполняя расчёт коэффициентов корреляции рангов по Спирмену (Rs). Для обработки результатов исследования использован пакет прикладных программ Statistica 8.0 for Windows.

Степень достоверности, апробация результатов, личное участие автора

Степень достоверности полученных результатов диссертации подтверждается их теоретическим анализом, личным участием автора во всех экспериментах, проведенных с помощью современных методик, сертифицированного оборудования и реактивов; актами внедрения результатов работы в учебный процесс и проверки первичной документации; статистической обработкой полученных данных и публикацией материалов диссертации в статьях, докладах на большом числе научных конференций.

Основные положения работы изложены и представлены на пятой Российской конференции «Гипоксия: механизмы, адаптация, коррекция» (Москва, 2008); IV съезде биохимиков и молекулярных биологов

(Новосибирск, 2008); II Международной научно - практической конференции, посвященной 75-летию ЧГПУ «Адаптация биологических систем к естественным и экстремальным факторам среды» (ЧГПУ, Челябинск, 2008); 6 Международной научно-практической конференции «Достижения фундаментальных наук в решении актуальных проблем медицины» (Астрахань, 2008); Всероссийской конференции «Актуальные проблемы теоретической и прикладной биохимии», посвященной 80-летию со дня рождения профессора Р.И.Лифшица (Челябинск, 2009); 2nd European congress of Immunology «Immunity for life Immunology for health» (Berlin, Germany, 2009); XXXVI International Congress of Physiological Sciences (IUPS2009) Function of Life: Elements and Integration (Kyoto, Japan, 2009); региональной научно-практической конференции, посвященной 70-летию доктора медицинских наук, профессора П.Н. Шараева (Ижевск, 2010); 7th World congress on Stress, (Gorlaeus Laboratoria, University of Leiden, The Netherlands, 2010); международной пироговской научной конференции студентов и молодых ученых (Москва, 2011); III Международной научно-практической конференции «Фундаментальные и прикладные проблемы стресса» (Витебск, 2013); 43rd Annual Meeting of the International Society of Psychoneuroendocrinology (ISPNE) «Stress, Rhythm & Blues» (The Netherlands, Leiden, 2013); IV международном симпозиуме «Взаимодействие нервной и иммунной систем в норме и патологии» (Санкт - Петербург, 2013).

В диссертации представлены результаты исследований, выполненных лично автором или с его непосредственным участием на кафедре биохимии государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Южно-Уральский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации. Личный вклад автора в настоящую работу состоит в постановке целей и задач, проведении экспериментов, обработке, анализе и обобщении полученных результатов.

Положения, выносимые на защиту

1. Развитие оксидативного стресса в ЦНС при редкочередующихся повторных иммобилизациях происходит по МАО-Б - зависимому механизму. Повторные четырехкратные иммобилизации с интервалом между воздействиями 72 часа вызывают увеличение активности церебральной МАО-Б, сопряженное с развитием оксидативного стресса. Предварительное введение селективного ингибитора МАО предупреждает постстрессорное увеличение активности фермента и усиление свободнорадикального окисления.

2. Глюкокортикоиды участвуют в «позитивной» регуляции свободнорадикального окисления в ЦНС при ежедневных иммобилизациях. В условиях ежедневных одночасовых иммобилизаций предварительное введение глюкокортикоидного антагониста приводит к более выраженному постстрессорному снижению интенсивности

свободнорадикального окисления в различных структурах головного мозга.

3. Повышение окислительной модификации белков в печени при ежедневных одночасовых иммобилизациях, сопряженное с увеличением активности МАО-Б, имеет глюкокортикоид - зависимый характер. На фоне предварительного введения глюкокортикоидного антагониста происходит ограничение стрессорного прироста активности МАО-Б и ограничение окислительной модификации белков.

4. Глюкокортикоиды участвуют в «негативной» регуляции свободнорадикального окисления в печени при редкочередующихся иммобилизациях. При редкочередующихся одночасовых иммобилизациях наблюдается усиление свободнорадикального окисления в печени. На фоне введения глюкокортикоидного антагониста происходит дополнительное постстрессорное увеличение содержания молекулярных продуктов ПОЛ и усиление окислительной модификации белков.

Научная новизна

В экспериментах, проведенных с использованием антагониста глюкокортикоидных рецепторов, впервые показано, что ГКГ - зависимая регуляция свободнорадикального окисления в головном мозге зависит от режима стрессорных воздействий. При редкочередующихся иммобилизациях глюкокортикоидные гормоны оказывают стимулирующее действие на процессы свободнорадикального окисления, усиливая перекисное окисление липидов и окислительную модификацию белков, а при ежедневных иммобилизациях - ограничивают чрезмерную супрессию свободнорадикального окисления. Продемонстрировано ГКГ — зависимое прооксидантное действие церебральной моноаминоксидазы при редкочередующихся иммобилизациях. Показано, что ГКГ - зависимые изменения свободнорадикального окисления сопряжены с изменениями поведенческой активности животных: при редкочередующихся иммобилизациях наблюдали развитие анксиогенных расстройств, при ежедневных — усиление анксиолитических реакций.

Впервые показано, что глюкокортикоиды оказывают супрессивное действие на окислительную модификацию белков печени при редкочередующихся иммобилизациях, а при ежедневных иммобилизациях наблюдается ее активация и снижение содержания белка в органе. При различных режимах иммобилизационного стресса продемонстрированы разнонаправленные изменения биотрансформации глюкокортикостероидов в печени: при редкочередующихся иммобилизациях выявлено ограничение бр-гидроксилирования и усиление 11(3 - гидроксилирования ГКГ, а при ежедневных иммобилизациях наблюдалось усиление бр-гидроксилирования при неизменном уровне 11Р — гидроксилирования. Показан ГКГ — зависимый характер изменений активности моноаминоксидазы в печени при ежедневных иммобилизациях.

Выявлены ГКГ - зависимые изменения свободно - радикального окисления в органах кроветворения и иммуногенеза при иммобилизационном стрессе. Показано, что при редкочередующихся иммобилизациях ГКГ оказывают стимулирующий эффект на липопероксидацию в тимусе, супрессивное действие на окислительную модификацию белков в селезенке, ограничивают окислительную модификацию белков и прирост антиоксидантного резерва в костном мозге. При ежедневных иммобилизациях ГКГ, напротив, оказывают супрессивное действие на липопероксидацию в тимусе и стимулирующее действие на окислительную модификацию белков; в костном мозге выявлено ГКГ - зависимое усиление окислительной модификации белка. Показано, что изменения свободнорадикального окисления в селезенке при ежедневных иммобилизациях имеют ГКГ - независимый характер. Наблюдаемые изменения свободнорадикального окисления в органах кроветворения и иммуногенеза сопровождались изменениями интенсивности реакции гиперчувствительности замедленного типа, характеризующей клеточный иммунный ответ: при ежедневных иммобилизациях наблюдалось ее усиление, а при редкочередующихся - ослабление.

Впервые в экспериментах с использованием агониста глюкокортикоидных рецепторов триамцинолона ацетонида, показано, что его введение приводит к развитию гипокортикоидного состояния, сопровождающегося развитием оксидативного стресса: в головном мозге и органах кроветворения и иммуногенеза выявлена активация свободнорадикального окисления, в печени — супрессия. Предварительные иммобилизации модифицировали эффекты экзогенного

глюкокортикостероида. Установлено, что введение экзогенного ГКГ приводит к снижению содержания циркулирующего кортикостерона, содержания кортикостерона в надпочечниках и снижением их массы, что свидетельствует о развитии надпочечниковой недостаточности. Развитие вторичной надпочечниковой недостаточности сопровождалось снижением ферментативной активности глутатионпероксидазы, глутатионтрансферазы, ксантиноксидазы и миелопероксидазы в крови. Установлено, что на фоне угнетения антиоксидантной защиты после введения экзогенного глюкокортикоида наблюдалось усиление липопероксидации в головном мозге. В структурах головного мозга усиление свободнорадикального окисления имело свои особенности. При этом усиление

свободнорадикального окисления в гиппокампе проявляется повышением содержания изопропанол-растворимых и гептан-растворимых Шиффовых оснований, а в гипоталамусе повышен уровень металл - катализируемого окисления белков. В среднем и продолговатом мозге после введения экзогенного глюкокортикоида наблюдается увеличение активности МАО-Б и повышение содержания карбонилированных белков. Показано, что ежедневные одночасовые иммобилизации влияют на глюкокортикоид -зависимую регуляцию свободнорадикального окисления через снижение

активности каталазы в различных структурах головного мозга, а редкочередующиеся - через повышение активности фермента.

Показано, что на фоне надпочечниковой недостаточности, вызванной введением экзогенного глюкокортикостероида, в печени наблюдается интенсификация свободнорадикального окисления, что проявляется увеличением содержания гептан-растворимых кетодиенов и сопряжённых триенов. При этом усиливается активность ферментов, обеспечивающий тканевой метаболизм глюкокортикоидов - lip ГСДГ и изоформ цитохрома Р450 семейства CYP3A. Установлено, что редкочередующиеся одночасовые иммобилизации, предшествующие введению экзогенного

глюкокортикостероида, ограничивают активность 11(3-ГСДГ в печени, что сопряжено с относительным повышением содержания кортикостерона.

Обнаружено, что гипоплазия иммунных органов, вызванная введением экзогенного глюкокортикоида ассоциировалась со снижением окислительной модификации белков. Предварительные редкочередующиеся иммобилизации ограничивали гипоплазию тимуса и интенсивность перекисного окисления липидов в органе.

Установлено, что при разнообразных клинических проявлениях общего адаптационного синдрома, сопровождающихся лабораторными проявлениями гипо — или гиперкортикоидных состояний, наблюдаются признаки активации свободно - радикального окисления. При гиперкортикоидных состояниях наблюдается преобладание процессов окислительной модификации белка, напрямую зависящее от выраженности подъема уровня кортизола в крови. При гипокортикоидных состояниях наблюдаются проявления карбонильного стресса.

Теоретическая и практическая значимость работы

Впервые проведена комплексная оценка взаимосвязей между свободно - радикальным окислением и нарушением функций ГГАС при стрессе. Продемонстрированы глюкокортикоид - зависимые изменения свободно -радикального окисления в структурах головного мозга, печени и почках, органах кроветворения и иммуногенеза и их зависимость от режима стрессорных воздействий. Сформированы представления о кортиколиберин -независимом механизме развития поведенческих расстройств в условиях аллостатической нагрузки. Обосновано представление о МАО-Б -зависимой индукции оксидативного стресса в условиях десенситизации к глюкокортикоидам.

Полученные в работе данные могут стать основой для разработки новых методов выявления и патогенетической коррекции поведенческих и иммунных расстройств, связанных с аллостатической нагрузкой. Данные, характеризующие механизмы изменения чувствительности к глюкокортикоидным гормонам при аллостатической нагрузке, могут быть использованы при терапии препаратами глюкокортикоидов.

Публикации

Соискатель имеет 84 опубликованные работы, из них по теме диссертации - 34 научные работы общим объёмом 104 страницы, в том числе 23 статьи в научных журналах и изданиях, включенных в перечень рецензируемых научных журналов и изданий для опубликования основных научных результатов диссертаций, а также 7 работ в зарубежных научных изданиях. 17 работ опубликованы в материалах всероссийских и международных конференций и симпозиумов; имеется 3 публикации в электронных научных изданиях.

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 310 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, главы собственных исследований, обсуждения результатов, выводов. Библиографический указатель включает 465 источников: 134 - на русском языке и 331 - иностранный. Работа содержит 48 таблиц, 15 рисунков.

Основное содержание работы

Глюкокортикоид - зависимые изменения свободнорадикального окисления при стрессе

Для выявления глюкокортикоид - зависимых изменений свободнорадикального окисления при стрессорных воздействиях использовано два экспериментальных подхода. Первый подход базируется на экспериментальном воспроизведении стресса на фоне «отмены» действия ГКГ, при введении антагониста ГР - RU 38486. Его эффекты доказаны in vivo и in vitro, где он с достаточной специфичностью блокировал действие ГКГ через ГР остро или в течение длительных периодов (Sapolsky, R., М. Romero, A. Munck Endocrine Revies.-2000.-№1). Второй экспериментальный подход основан тесте глюкокортикоид - зависимой гипоплазии иммунных органов, который также используется и для интегральной оценки метаболических эффектов глюкокортикоидов и чувствительности тканей к ГКГ (Волчегорский И.А., Долгушин И.И., Колесников О.Л., Цейликман В.Э. -Челябинск, 2000).

Глюкокортикоид - зависимые изменения свободнорадикального окисления в структурах головного мозга при стрессе

Кора головного мозга

Стресс, воспроизводимый путем четырехкратных одночасовых иммобилизаций с интервалом между воздействиями 72 часа (РЧИМ), сопровождался усилением липопероксидации и металл - катализируемой окислительной модификации белков в коре головного мозга (таблица 1): статистически значимо увеличивалось содержание вторичных продуктов ПОЛ и алифатических кетондинитрофенилгидразонов (в ответ на индукцию Fe27 Н202). Одной из очевидных причин активации свободнорадикального окисления в данном случае являлось увеличение активности

моноаминоксидазы - Б (таблица 1), генерирующей в качестве ко продукта реакции пероксид водорода, что подтверждается наличием корреляционных взаимосвязей между активностью фермента и содержанием первичных гептан-растворимых продуктов ПОЛ (1^=0,83; Р=0,038). МАО - зависимый характер прооксидантных сдвигов в головном мозге при РЧИМ был также продемонстрирован в отдельной серии экспериментов с использованием селективного ингибитора МАО-Б (Цейликман В.Э., Синицкий А. И., Поярков К. А. [и др.], Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2009. -Т. 147, № 12).

Таблица 1 - Изменения свободнорадикального окисления в коре головного мозга и поведенческой активности животных при воспроизведении редкочередующихся иммобилизаций на фоне введения антагониста глюкокортикоидных рецепторов (М±т)

Показатель Контроль (п=9) Четырехкратные иммобилизации (п=9) Четырехкратные иммобилизации + RU38486 (п=9)

Окислительная модификация белка (индукция Ре2+/Нг02), мкмоль / г белка 4,45±0,27 * 9,54±1,07 10,59±1,55

Диеновые конъюгаты (гептановая фаза), е.о.и. 0,5±0,03 0,53±0,004 ** 0,417±0,043

Кетодиеиы и сопряжённые триены (гептановая фаза), е.о.и. 0,1±0,02 * 0,17±0,02 ** 0,111±0,023

Диеновые конъюгаты (изопропанольная фаза), е.о.и. 0,47±0,01 0,52±0,02 ** 0,457±0,019

Кетоднены и сопряжённые триены (изопропанольная фаза), е.о.и. 0,13±0,02 * 0,206±0,015 ** 0,138±0,007

МАО-Б, нмоль/мин/г ткани 2,54±0,21 * 3,22±0,13 ** 2,32±0,10

Каталаза, мкмоль/мин/г ткани 32,13±4,4 * 20,22±0,77 21,0±1,38

Тест «Открытое поле»

Локомоция (смена квадратов актографа) 15,6±5,344 * 0,5±0,342 ** 7,2±2,956

Ориентировочная реакция (вертикальные стойки) 8,2±1,2 * 1,667±0,558 3,8±1,934

Анксиогенные дефекации 1,4±0,678 * 4,333±0,919 ** 1,2±0,583

* - статистически значимые отличия от контрольной группы, Р<0,05 ** - статистически значимые отличия от группы «РЧИМ» е.о.и.- единицы окислительного индекса

При этом, после завершения редкочередующихся иммобилизаций наблюдалось статистически значимое снижение активности каталазы в коре

головного мозга (таблица 1) при неизменной активности супероксиддисмутазы и каталазы. Четырехкратный иммобилизационный стресс вызывает угнетение поведенческой активности крыс. Это проявилось уменьшением показателей локомоции и ориентировочной реакции животных при тестировании в "открытом поле" (таблица 1), при одновременном увеличении показателя анксиогенной дефекации. Выявленные корреляционные взаимосвязи между активностью моноаминоксидазы и количеством пересечений границ квадратов актографа (115= -0,84, Р=0,034), указывают на возможность МАО - зависимого характера поведенческих расстройств.

Воспроизведение того же режима иммобилизационного стресса на фоне введения глюкокортикоидного антагониста не привело к увеличению содержания молекулярных продуктов ПОЛ, активности МАО-Б в коре головного мозга и нарушениям поведения: значения этих показателей были статистически значимо ниже соответствующих показателей группы «РЧИМ», и находились на уровне контрольных. Но при этом глюкокортикоидный антагонист не оказал влияния на стресс - опосредованное металл -катализируемое окисление белков и ограничение активности каталазы (таблица 1).

Следовательно, наблюдаемые изменения перекисного окисления липидов, активности МАО-Б в коре головного мозга и поведенческой активности являются ГКГ - зависимыми, а ГКГ оказывают стимулирующее действие на липопероксидацию в коре головного мозга при редкочередующихся иммобилизациях.

Интенсивность и направленность ГКГ - зависимых изменений свободнорадикального окисления зависела от режима воздействий. Стресс, воспроизводимый путем трехкратных ежедневных одночасовых иммобилизаций (интервал между воздействиями составлял 24 часа, ЕИМ), напротив, вызвал ограничение интенсивности свободнорадикального окисления в коре головного мозга (таблица 2): статистически значимо уменьшалось содержание вторичных неполярных продуктов ПОЛ и алифатических кетондинитрофенилгидразонов основного характера (как на базальном уровне, так и в ответ на индукцию Ре2+/ Н202). Данный режим иммобилизационного стресса не сопровождался изменением активности МАО-Б в коре головного мозга. Воспроизведение ежедневных иммобилизаций на фоне введения глюкокортикоидного антагониста привело к дополнительному ограничению ПОЛ и окислительной модификации белков: значения этих показателей были статистически значимо ниже соответствующих показателей группы «ЕИМ», и находились значительно ниже контрольных. При этом, введение антагониста глюкокортикоидных рецепторов никак не повлияло на активность МАО-Б (таблица 2).

Предварительные ежедневные иммобилизации также сопровождались уменьшением показателей локомоции (с 51,75±4.27 в контрольной группе до 32,75±4,75 в опытной, Р < 0,01), исследовательско - ориентировочной

деятельности (с 17,67±2,93 в контрольной группе до 9,50±1,38 в опытной, Р < 0,05.) при тестировании в "открытом поле". В отличие от РЧИМ, при ЕИМ снижался уровень дефекации (с 1,51±0,37 до 1,01±0,09, Р < 0,05), что отражает торможение эмоциональной реакции страха. Наблюдаемые поведенческие расстройства сопровождаются усилением анксиолитических реакций. Это проявляется в увеличении времени пребывания в открытых рукавах (с 32,67±8,92 сек. в контроле (п = 9) до 241,87 сек. в группе «стресс» (п=8), Р<0,01) и сокращении времени пребывания в закрытых рукавах «крестообразного лабиринта» по сравнению с контролем. Наблюдаемые сдвиги принципиально отличаются от таковых при РЧИМ и свидетельствуют о развитии у стрессированных животных поведенческих расстройств по типу поведения болезни или «sickness behavior».

Таблица 2 - Изменения свободнорадикального окисления в коре головного мозга при воспроизведении ежедневных иммобилизаций на фоне

введения антагониста глюкоко ртикоидных рецепторов (М±ш)

Показатель Контроль (п=10) Трехкратные ежедневные иммобилизации (п=10) Трехкратные ежедневные иммобилизации + RU38486 (п=10)

Окислительная модификация белка, мкмоль / г белка 1,68±0,42 * 1,63±0,28 ** 1,36±0,25

Окислительная модификация белка (индукция Ре27Н202), мкмоль / г белка 9,58±3,23 * 7,69±1,67 ** 6,33±1,35

Диеновые конъюгаты (гептановая фаза), е.о.и. 0,53±0,02 0,512±0,026 ** 0,441±0,024

Кетодиены и сопряжённые триены (гептановая фаза), е.о.и. 0,18±0,09 * 0,097±0,005 ** 0,084±0,003

Шиффовы основания (гептановая фаза), е.о.и. 0,02±0,01 0,032±0,006 0,039±0,008

Диеновые конъюгаты (изопропанольная фаза), е.о.и. 0,55±0,11 0,442±0,071 0,392±0,052

Кетодиены и сопряжённые триены (изопропанольная фаза), е.о.и. 0,22±0,06 0,169±0,061 0,116±0,017

Шиффовы основания (изопропанольная фаза), е.о.и. 0,05±0,01 0,066±0,01 0,072±0,019

МАО-Б, нмоль/мин/ г ткани 3,11±0,21 2,852±0,195 2,941 ±0,157

Каталаза, мкмоль/мин/г ткани 24,89±1,04 * 28,72±0,8 26,37±0,91

* - статистически значимые отличия от контрольной группы, Р<0,05 ** - статистически значимые отличия от группы «ЕИМ» е.о.и.- единицы окислительного индекса

Следовательно, изменения свободнорадикалъного окисления, наблюдаемые в коре головного мозга при ЕИМ, также являются ГКГ -зависимыми. В данном случае также можно говорить о стимулирующем действии ГКГ на процессы свободнорадикального окисления в коре головного мозга. Принципиальным отличием является данного режима воздействий является то, что при трехкратных иммобилизациях ГКГ не участвуют в усилении свободнорадикального окисления, но ограничивают его чрезмерную супрессию.

Гипоталамус и гиппокамп

В гипоталамусе после завершения РЧИМ наблюдалось усиление окислительной модификации белка и разнонаправленные изменения между содержанием гептан- и изопропанол-растворимых конечных продуктов ПОЛ (таблица 3). Кроме того, обнаружено увеличение активности каталазы (с 9,01±0,76 мкмоль/мин/г ткани в контрольной группе (п=8) до 20,11±1,94 мкмоль/мин/г ткани в опытной (п=10), Р=0,03).

Таблица 3 - Изменения свободнорадикального окисления в гипоталамусе и гиппокампе при воспроизведении редкочередующихся иммобилизаций на фоне введения антагониста глюкокортикоидных

Показатель Контроль (11=9) Четырехкратные иммобилизации (п=9) Четырехкратные иммобилизации + 1Ш38486 (п=9)

Гипоталамус

Окислительная модификация белка, мкмоль / г белка 1,32±0,18 * 2,76±0,4 1,89±0,34

Шиффовы основания (гептановая фаза), е.о.и. 0,07±0,004 * 0,051 ±0,007 ** 0,069±0,006

Шиффовы основания (изопропанольная фаза), е.о.и. 0,105±0,01 * 0,175±0,015 ** 0,1±0,009

Гиппокамп

Белок, % 1,016±0,166 ♦ 0,297±0,09 ** 0,56±0,096

Окислительная модификация белка, мкмоль / г белка 0,636±0,227 * 2,036±0,35 ** 0,48±0,089

Окислительная модификация белка (индукция), мкмоль / г белка 1,068±0,277 * 5,88±0,953 ** 1,986±0,617

* - статистически значимые отличия от контрольной группы, Р<0,05 * * - статистически значимые отличия от группы «РЧИМ» е.о.и.- единицы окислительного индекса

Введение глюкокортикоидного антагониста перед каждым из эпизодов иммобилизационного стресса привело в отмене указанных эффектов,

«возвращая» стресс - индуцированные изменения к уровню контрольных значений (таблица 3), что подтверждает наличие ГКГ - опосредованных механизмов изменения свободнорадикального окисления и указывает на их стимулирующий характер.

Данные корреляционного анализа указывают на возможную причастность процессов свободнорадикального окисления в гипоталамусе к развитию поведенческих расстройств, возникающих у животных после завершения РЧИМ. Выявлены зависимости между уровнем локомоции и окислительной модификацией белка (Я5= 0,84, Р=0,03); между исследовательской активностью и содержанием изопропанол-растворимых Шиффовых оснований (Я5= -0,97, Р=0,001); между количеством дефекаций и содержанием изопропанол-растворимых Шиффовых оснований (1^= 0,81, Р=0,04).

Подобная ситуация наблюдалась и в гиппокампе: выявлено преобладание окислительной модификации белка (таблица 3) при неизменном уровне ПОЛ, что, скорее всего, привело к уменьшению уровня белка в данном отделе головного мозга. Воспроизведение стресса на фоне блокады глюкокортикоидных рецепторов в значительной степени ограничило эти изменения. Следовательно, при РЧИМ наблюдается ГКГ -зависимая стимуляция окислительной модификации белка в гиппокампе. Уровень окислительной модификации белков в гиппокампе имел корреляционные взаимосвязи с количеством локомоций (Я5= -0,84, Р=0,03); и дефекаций (Я5= 0,9, Р=0,01) в актографе «открытое поле» у животных, подвергнутых РЧИМ.

После завершения ежедневных иммобилизаций в гипоталамусе наблюдались разнонаправленные изменения между ОМБ и ПОЛ (таблица 4).

Таблица 4 - Изменения свободнорадикального окисления в гипоталамусе и гиппокампе при воспроизведении ежедневных иммобилизаций на фоне введения антагониста глюкокортикоидных

Показатель Контроль (п=10) Трехкратные ежедневные иммобилизации (п=10) Трехкратные ежедневные иммобнлизации+ 1Ш38486 (п=10)

Гипо -таламус Окислительная модификация белка, мкмоль / г белка 2,11±0,35 * 4,26±0,741 6,93±1,77

Кетодиены и сопряжённые триены (изопропанольная фаза), е.о.и. 0,17±0,01 * 0,123±0,009 0,09±0,02

Гиппо-ками Окислительная модификация белка, мкмоль / г белка 0,2±0,02 * 0,10±0,02 ** 0,04±0,01

Кетодиены и сопряжённые триены (гептановая фаза), е.о.и. 0,23±0,03 * 0,08±0,02 ** 0,03±0,01

* - статистически значимые отличия от контрольной группы, Р<0,05; ** - статистически значимые отличия от группы «ЕИМ»; е.о.и.- единицы окислительного индекса

Введение глюкокортикоидного антагониста перед каждым из эпизодов стресса не привело к статистически значимым изменениям указанных параметров (таблица 4), что указывает на ГКГ - независимый характер прооксидантных сдвигов. Несмотря на отсутствие статистически значимых различий между группами «ЕИМ» и «ЕИМ + 1ШЗ 8486», прослеживается отчетливая тенденция к усугублению эффектов ГКГ, что говорит о супрессивном действии ГКГ.

В гиппокампе после завершения ЕИМ выявлены признаки ограничения свободнорадикального окисления. Воспроизведение ЕИМ на фоне введения ГР-антагониста усугубило стресс - индуцированные сдвиги свободнорадикального окисления (таблица 4), что свидетельствует о стимулирующем действии ГКГ.

Свободнорадикальное окисление в головном мозге при введении экзогенного глюкокортикостероида после завершения повторных иммобилизаций

Предварительные иммобилизации модифицировали эффекты экзогенного глюкокортикостероида (таблица 5) в головном мозге. При этом, редкочередующиеся иммобилизации отменяли эффекты препарата, а ежедневные - усиливали.

Введение триамцинолона ацетонида интактным животным приводило к снижению активности МАО-Б и увеличению содержания гептан-растворимых продуктов ПОЛ в головном мозге. Введение глюкокортикостероида животным, которые предварительно подвергались редкочередующимся иммобилизациям, не сопровождалось усилением липопероксидации и снижением активности МАО в головном мозге. Введение триамцинолона после завершения ежедневных иммобилизаций приводило к дополнительному приросту содержания гептан- и изопропанол — растворимых продуктов ПОЛ при неизменной активности МАО в головном мозге (таблица 5).

Таким образом, при редкочередующихся иммобилизациях ГКГ оказывают стимулирующее действие на процессы свободнорадикального окисления в исследованных структурах головного мозга, а при ежедневных иммобилизациях ГКГ ограничивают чрезмерную супрессию свободнорадикального окисления. Эти различия могут быть объяснены различным характером изменений чувствительности тканей ЦНС к действию ГКГ, что демонстрируют данные таблицы 5. Возможным последствием этих изменений являются поведенческие расстройства, имеющие свои особенности для каждого из режимов иммобилизаций.

Таблица 5 - Перекисное окисление липидов и активность МАО-Б в головном мозге при введении триамцинолона ацетонида после завершения иммобилизаций_

Показатель Контроль (п=12) Триамцинолона ацетонид (п=12) Четырехкратные иммобилизации + Триамцинолона ацетонид (п=12) Трехкратные ежедневные иммобилизации + Триамцинолона ацетонид (п=12)

Диеновые конъюгаты (гептановая фаза) 0,3±0,001 * 0,33±0,02 0,33±0,01 ** 0,34±0,02

Кетодиены н сопряженные триены (гептановая фаза) 0,1±0,001 * 0,13±0,015 #* 0,1±0,001 ** 0,16±0,0И

Диеновые конъюгаты (изопропанольная фаза) 0,52±0,007 0,53±0,007 0,56±0,001 0,5±0,05

Кетодиены и сопряженные триены (изопропанольная фаза) 0,22±0,003 0,24±0,01 ** 0,23±0,001 ** 0,36±0,05

МАО-Б (нмоль/мин/мозг) 9,19±0,1 * 8,96±0,09 ** 9,14±0,29 8,88±0,7

* - статистически значимые отличия от контрольной группы, Р<0,05 ** - статистически значимые отличия от группы «Триамцинолона ацетонид»

Глюкокортикоид - зависимые изменения свободнорадикального окисления в печени и почках при экспериментальных стрессорных воздействиях

Печень

После завершения редкочередующихся иммобилизаций в печени наблюдалось ограничение окислительной модификации белков, что проявлялось уменьшением содержания алифатических

кетондинитрофенилгидразонов основного характера с 10,552±0,357 мкмоль/ г белка в контрольной группе (п= 12) до 9,3 61 ±0,643 мкмоль / г белка в опытной (п=12), Р=0,012. Изменений липопероксидации и активностей изученных антиоксидантных ферментов при этом не выявлено. На фоне предварительной блокады глюкокортикоидных рецепторов уровень продуктов окислительной модификации белков увеличился до 13,749±0,984 мкмоль/ г белка. Таким образом, наблюдаемое ограничение окислительной модификации белка при РЧИМ связано с супрессивным действием ГКГ.

Редкочередующиеся иммобилизации сопровождались увеличением содержания циркулирующего кортикостерона на 18,5% (с 21,61±4,3 в

контроле (п=8) до 25,61±5,31, в опытной (п=8) группе Р=0,015). Особенностью РЧИМ также является снижение активности изоформы цитохрома Р450 СУРЗА, осуществляющей биотрансформацию глюкокортикоидов путём 6Р - гидроксилирования с 0,564±0,04 нмоль/мин/г ткани в контрольной группе (п=5) до 0,409±0,022 нмоль/мин/гр в группе стресс (п=7), Р = 0,039. При этом существенно увеличивается активность другого важного пути биотрансформации глюкокортикостероидов в печени, 1 ф-гидроксистероиддегидрогеназы: с 0,786±0,053 мкмоль/мин/г белка в контрольной группе (п=10) до 2,275± 0,176 мкмоль/мин/г белка в опытной (п=8), Р=0,003.

После завершения последнего эпизода ежедневных иммобилизаций снижалась масса печени, уменьшалось содержание белка в органе (таблица 6).

Таблица 6 - Влияние трехкратных ежедневных иммобилизаций и глюкокортикоидного антагониста на окислительную модификацию белков и активность МАО - Б в печени крыс (М±т)__

Масса печени, г 6,09±0,28 * 5,36±0,17 5,75±0,33

Общий белок, % 36,35± 2,35 * 30,81±2,39 ** 37,96±3,95

Окислительная модификация белка, мкмоль/г белка 3,16±0,29 * 3,99±0,32 ** 2,82±0,31

МАО - Б, нмоль/мин/ орган 270,9±33,34 * 236,21±19,75 ** 285,96±27,82

* - статистически значимые отличия от контрольной группы, Р<0,05 ** - статистически значимые отличия от группы «ежедневные иммобилизации»

При этом, на фоне отсутствия статистически значимых изменений по содержанию молекулярных продуктов ПОЛ и активностей изученных ферментов-антиоксидантов (каталаза, СОД, глутатионпероксидаза), усиливалась окислительная модификация белков. Предварительное введение глюкокортикоидного антагониста привело к значительному ограничению выраженности постстрессорного усиления карбонилирования белков в печени (таблица 6).

При обсуждении обнаруженного в ходе исследования ограничения глюкокортикоидным антагонистом постстрессорного усиления карбонилирования белков уместно отметить, что окислительная модификация белков является составляющей протеолитических процессов (Amm I., Sommer Т., Wolf D.H., Biochim. Biophys. Acta. 2013.-№10). He исключено, что глюкокортикоиды при данном варианте стрессорных воздействий усиливают протеолиз в органе, что отражается как на

содержании белка, так и на массе печени (таблица 6). В связи с этим уместно обратить внимание на одновременное снижение активности МАО-Б в печени после завершений повторных одночасовых иммобилизаций (таблица 6). Известно, что глюкокортикоиды обладают способностью снижать уровень активности МАО (P.Carlo, М. Del Rio, Е. Violani et al., Cell Biochem. Funct. -1996. - Vol. 14, № 1). О глюкортикоид-зависимом характере пострессорного снижения МАО активности в печени свидетельствует нормализация ферментативной активности на фоне предварительного введения глюкокортикоидного антагониста (таблица 6).

Выявленным особенностям свободнорадикального окисления в печени при ежедневных иммобилизациях сопутствовало увеличение активности изоформы цитохрома Р450 CYP3A с 0,432±0,035 нмоль/ мин/г белка в контрольной группе (п=6) до 1,18±0,33 нмоль/ мин/г белка в опытной (п=6, Р=0,044). При этом активность llß-ГСДГ не претерпела статистически значимых изменений.

Таблица 7 - Модификация гепатотропных эффектов триамцинолона ацетонида при иммобилизационном стрессе __

Дненовые конъюгаты (гептановая фаза) 0,86±0,01 * 0,88±0,01 ** 0,96±0,01 0,86±0,01

Кетодиены и сопряженные триены (гептановая фаза) 0,15±0,03 * 0,04±0,01 ** 0,14±0,03 ** 0,11±0,02

Кетодиены и сопряженные трнены (изопропанольная фаза) 0,56±0,16 * 0,2±0,01 ** 0,41±0,11 ** 0,31±0,06

Окислительная модификация белков мкмоль/г белка 3,44±0,69 * 2,62±0,42 3,14±0,56 3,3±0,36

Окислительная модификация белков (индукция Н202/Ре2*), мкмоль/г белка 14,62±1,82 * 8,37±1,35 11,08±1,74 11,24±1,75

ЭРНД — активность, нмоль/мин/г ткани 0,43±0,03 * 1,77±0,35 1,03±0,23 1,88±0,523

пр-гсдг, мкмоль/мин/г белка 0,73±0,25 * 2,09±0,79 2,48±1,23 1,35±0,38

* - статистически значимые отличия от контрольной группы, Р<0,05; ** - статистически значимые отличия от группы «Триамцинолона ацетонид»

Введение триамцинолона ацетонида оказывало супрессивное действие на процессы свободнорадикального окисления в печени (таблица 7).

Предварительные повторные иммобилизации существенно ограничивали выраженность этого эффекта экзогенного глкжокортикостероида. Экзогенный глюкокортикостероид значительно повышал активность ключевых ферментов биотрансформации ГКГ в печени (таблица 7): активность изоформы цитохрома Р450 СУРЗА увеличилась более чем в четыре раза, а 11Р-ГСДГ более чем в два. Предварительный иммобилизационный стресс не повлиял на уровень индукции указанных ферментов.

Введение экзогенного глюкокортикостероида сопровождалось развитием гипокортикоидного состояния: выявлено снижение содержания кортикостерона в сыворотке крови. Предварительные иммобилизации ограничивали выраженность дисфункции надпочечников, вызванной введением экзогенного глюкокортикостероида (рисунок 1).

нмоль/л (¡од 500 400

300

200 100

О г"-М-М-М-Ц

Контроль ТА РЧИМ+ТА ЕИМ+ТА

Рисунок 1 - Содержание кортикостерона в сыворотке крови при введении триамцинолона ацетонида интактным и стрессированным животным. Примечание: ТА - триамцинолона ацетонид; РЧИМ -редкочередующиеся иммобилизации; ЕИМ - ежедневные иммобилизации. * -статистически значимые отличия от контрольной группы; ** - статистически значимые отличия от группы «Триамцинолона ацетонид».

Содержание кортикостерона было снижено и в ткани надпочечников (с 32,55±6,88 мкмоль/г ткани в контрольной группе (п=10) до 6,05±0,77 мкмоль/г ткани в опытной (п=12), Р=0,038), также наблюдалось уменьшение массы надпочечников (индекс массы изменялся с 1,6±0,16 в контрольной группе (п=10) до 0,92±0,17 в опытной (п-12), Р=0,023). Введение триамцинолона предварительно стрессированным животным также приводило к уменьшению содержания кортикостерона в крови, однако выраженность этого снижения была значительно меньше.

Таким образом, два режима иммобилизационного стресса, отличающиеся кратностью и частотой воздействий, приводят к разнонаправленным изменениям свободнорадикального окисления и

биотрансформации глюкокортикостероидов в печени, ограничивая при этом выраженность эффектов экзогенного глюкокортикостероида.

Почки

Редкочередующиеся четырехкратные иммобилизации не оказали влияния на содержание продуктов свободнорадикального окисления липидов и белков в почках. При этом статистически значимо снижалась активность ксантиноксидазы (с 68,10±5,43 ЕД/г ткани в контрольной группе (п=9) до 24,74±3,89 ЕД/г ткани в опытной (п=9) группе, Р=0,01). Воспроизведение данного режима на фоне введения ГР - антагониста также не сопровождалось изменениями свободнорадикального окисления в органе.

После завершения ежедневных иммобилизаций в почках было выявлено одновременное усиление липопероксидации и окислительной модификации белка (таблица 8) при одновременном увеличении активности ксантиноксидазы с 57,28±4,56 ЕД/г ткани в контрольной группе до 160,34±13,11 ЕД/г ткани в опытной (Р=0,02) и неизменной активности каталазы и супероксиддисмутазы.

Таблица 8 - Влияние трехкратных ежедневных иммобилизаций и глюкокортикоидного антагониста на свободнорадикальное окисление в почках крыс (М±т)

Окислительная модификация белка, мкмоль / г белка 1,921±0,272 * 2,122±0,28 ** 2,47±0,393

Диеновые конъюгаты (изопропанольная фаза), е.о.и. 0,412±0,005 * 0,436±0,006 ** 0,397±0,006

* - статистически значимые отличия от контрольной группы, Р<0,05; ** - статистически значимые отличия от группы «ежедневные иммобилизации»; е.о.и,- единицы окислительного индекса

Предварительное введение ГР-антагониста привело к дополнительному постстрессорному усилению окислительной модификации белка и ограничению липопероксидации (таблица 8). Следовательно, при ежедневных иммобилизациях ГКГ оказывают супрессивное действие на свободнорадикальное окисление белков и стимулирующее — на липопероксидацию. При редкочередующихся иммобилизациях не обнаружено ГКГ-зависимых изменений свободнорадикального окисления в почках.

Глюкокортикоид - зависимые изменения свободнорадикального окисления в органах кроветворения и иммуногенеза при экспериментальных стрессорных воздействиях

В вилочковой железе после завершения редкочередующихся иммобилизаций наблюдалось усиление липопероксидации, выражавшееся в повышении уровня изопропанол-растворимых кетодиенов и сопряженных триенов (таблица 9). РЧИМ, воспроизводимые на фоне блокады ГР не сопровождались усилением липопероксидации в тимусе: содержание соответствующей категории продуктов ПОЛ статистически значимо отличалось от значений группы «РЧИМ». Следовательно, ГКГ при редкочередующихся иммобилизациях оказывают стимулирующий эффект на липопероксидацию в тимусе.

Таблица 9 - Глюкокортикоид-зависимые изменения свободнорадикального окисления в органах кроветворения и иммуногенеза при редкочередующихся иммобилизациях (М±т)__

Показатель Контроль (п=9) Четырехкратные иммобилизации (п=9) Четырехкратные иммобилизации + Ш38486 (п=9)

Тимус

Кетодиены и сопряжённые триены (изопропанольная фаза), е.о.и. 0,062±0,008 * 0,089±0,011 ** 0,051±0,003

Селезенка

Окислительная модификация белка, мкмоль / г ткани 45,972±2,996 * 25,939±1,399 ** 44,447±2,994

Костный мозг

Окислительная модификация белка, мкмоль / мл 4,747±0,023 * 2,475±0,194 ** 4,115±0,322

Диеновые конъюгаты (изопропанольная фаза), индукция Ре2+/ аскорбат, % 178,81±9,34 * 181,99±7,442 ** 196,67±9,481

* - статистически значимые отличия от контрольной группы, Р<0,05 ** - статистически значимые отличия от группы «РЧИМ» е.о.и,- единицы окислительного индекса

В селезенке после завершения РЧИМ не наблюдалось изменений перекисного окисления липидов, но статистически значимо уменьшалось содержание алифатических кетондинитрофелгидразонов нейтрального характера (таблица 9). При воспроизведении РЧИМ на фоне блокады ГР изменений окислительной модификации белка в селезенке не наблюдалось. Содержание продуктов ОМБ в группе «РЧИМ + ЯШ 8486» статистически значимо отличалось от соответствующего показателя в группе «РЧИМ».

Следовательно, ГКГ при редкочередующихся иммобилизациях не оказывают влияния на липопероксидацию, вызывая при этом ограничение ОМБ.

В костном мозге при РЧИМ также наблюдалось ограничение ОМБ. (таблица 9). Кроме того, наблюдалось статистически значимое увеличение содержания диеновых конъюгатов (индукция Ре2+/ аскорбат), что свидетельствует об усилении антиоксидантного резерва ткани. Введение антагониста ГР опытным животным не сопровождалось стресс индуцированным снижением ОМБ в костном мозге. Уровень продуктов ОМБ в костном мозге животных группы «РЧИМ+ 1ШЗ8486» статистически значимо отличался от соответствующего показателя группы «РЧИМ». При этом наблюдался дополнительный прирост липопероксидации в ответ на индукцию Ре2+/ аскорбат (таблица 9). Следовательно, ГКГ при редкочередующихся иммобилизациях ограничивают ОМБ и прирост антиоксидантного резерва в костном мозге.

Следствием ежедневных иммобилизаций, в отличие от редкочередующихся, стало ограничение липопероксидации и усиление окислительной модификации белков в тимусе (таблица 10).

Таблица 10 - Глюкокортикоид-зависимые изменения свободнорадикального окисления в органах кроветворения и иммуногенеза при ежедневных иммобилизациях (М±т) __

Показатель Контроль (п=10) Трехкратные ежедневные иммобилизации (п=10) Трехкратные ежедневные иммобилизации + 1Ш38486 (п=10)

Тимус

Окислительная модификация белка, мкмоль / г белка 0,353±0,062 * 0,932±0,028 ** 0,369±0,054

Кетодиены и сопряжённые трнены (гептановая фаза), е.о.и. 0,111±0,004 * 0,092±0,005 ** 0,117±0,004

Селезенка

Кетодиены и сопряжённые триены (гептановая фаза), е.о.и. 0,166±0,009 * 0,147±0,004 0,14±0,005

Кетодиены и сопряжённые триены (изопропанольная фаза) 0,347±0,024 * 0,364±0,086 0,362±0,081

Шиффовы основания (изопропанольная фаза), е.о.и. 0,028±0,008 * 0,053±0,008 0,051±0,003

Костный мозг

Окислительная модификация белка, мкмоль / мл 2,205±0,571 * 4,587±0,926 1,024±0,181

Диеновые конъюгаты (гептановая фаза), е.о.и. 0,657±0,016 * 0,58±0,01 0,601±0,053

Кетодиены и сопряжённые триены (гептановая фаза), е.о.и. 0,111±0,003 * 0,086±0,003 0,081±0,005

* - статистически значимые отличия от контрольной группы, Р<0,05; ** - статистически значимые отличия от группы «ЕИМ»; е.о.и,- единицы окислительного индекса

Введение антагониста ГР перед каждым эпизодом стресса отменяло постстрессорные изменения свободнорадикального окисления (таблица 10). Следовательно, ГКГ оказывают стимулирующее действие на окислительную модификацию белков и супрессивное на липопероксидацию в тимусе при ежедневных иммобилизациях.

Постстрессорные изменения свободнорадикального окисления в селезенке при ежедневных иммобилизациях распространились только на липиды: разнонаправлено изменялось содержание гептан- и изопропанол-растворимых вторичных продуктов ПОЛ при одновременном увеличении содержания Шиффовых оснований. Указанные изменения липопероксидации не отменялись предварительным введением ГР-антагониста, что дает основания предполагать их ГКГ - независимый характер (таблица 10).

Изменения свободнорадикального окисления в костном мозге после завершения ЕИМ, как и в тимусе, проявлялись ограничением перекисного окисления липидов и усилением окислительной модификации белков (таблица 10). Предварительное введение ГР-антагониста отменяло только прирост ОМБ. Следовательно, при ежедневных иммобилизациях было выявлено ГКГ- зависимое усиление окислительной модификации белка, и ГКГ - независимое ограничение липопероксидации в костном мозге.

Наблюдаемые изменения свободнорадикального окисления в органах кроветворения и иммуногенеза сопровождались изменениями интенсивности реакции гиперчувствительности замедленного типа, характеризующей клеточный иммунный ответ: при ежедневных иммобилизациях наблюдалось ее усиление, а при редкочередующихся - ослабление. Уровень антителобразующих клеток селезенки (гуморальный иммунный ответ) при этом не претерпел статистически значимых изменений (таблица 11).

Таблица 11 - Интенсивность клеточного и гуморального иммунного ответа после завершения повторных иммобилизаций (М±т)_

Показатель Контроль (п=10) Четырехкратные иммобилизации (п=10) Трехкратные ежедневные иммобилизации (п=10)

Реакция гиперчувствительности замедленного типа, см3 0,42±0,03 * 0,25±0,02 * 0,76±0,03

Абсолютное количество антителобразующих клеток селезенки, х104 82,71±5,51 25,39±4,56 40,75±5,72

* - статистически значимые отличия от показателей контрольной группы, Р<0,05

Через 96 часов после введения экзогенного глюкокортикостероида наблюдалось усиление свободнорадикального окислении в тимусе, что сопровождалось его инволюцией (таблица 12): увеличивалось как содержание гептан- и изопропанол-растворимых продуктов перекисного окисления липидов, так и продуктов окислительной модификации белка.

Выявлена корреляционная зависимость между уровнем окислительной модификации белка и массой тимуса (115=-0,714, Р= 0,028).

Таблица 12 - Изменения свободнорадикального окисления в тимусе и массовые параметры органа при введении экзогенного глюкокортикостероида интактным и стрессированным животным_

Диеновые конъюгаты, е.о.и. (гептановая фаза) 0,94±0,03 * 0,85±0,04 0,87±0,004 0,85±0,03

Кетодиены и сопряженные трнены, е.о.и. (гептановая фаза) 0,04±0,01 * 0,14±0,02 ** 0,03±0,003 ** 0,2±0,04

Шиффовы основания, е.о.и. (гептановая фаза) 0,01±0,001 * 0,04±0,01 0,004±0,001 0,01±0,001

Диеновые конъюгаты, е.о.и. (изопропанольная фаза) 0,52±0,03 * 0,58±0,01 0,57±0,004 0,59±0,01

Кетодиены и сопряженные триены, е.о.и. (изопропанольная фаза) 0,29±0,06 0,2±0,01 0,2±0,03 0,18±0,002

Шиффовы основания, е.о.и. (изопропанольная фаза) 0,05±0,02 * 0,1±0,001 ** 0,05±0,01 0,07±0,01

Окислительная модификация белка, мкмоль / г белка 0,75±0,11 * 0,93±0,04 ** 1,35±0,46 1,12±0,24

Масса тимуса, г 0,24±0,03 * 0,06±0,01 ** 0,11±0,02 0,08±0,01

Индекс массы тимуса 0,05±0,01 * 0,01±0,001 ** 0,03±0,002 0,02±0,002

* - статистически значимые отличия от контрольной группы, Р<0,05 ** - статистически значимые отличия от группы «Триамцинолона ацетонид» е.о.и.- единицы окислительного индекса

Предварительные редкочередующиеся иммобилизации ограничили усиление липопероксидации и снижение массы тимуса, но при этом вызвали дополнительный прирост уровня окислительной модификации белка (таблица 12). Введение триамцинолона ацетонида после завершения ежедневных иммобилизаций привело к дополнительному усилению липопероксидации (статистически значимо увеличилось содержание вторичных гепан - растворимых продуктов липопероксидации).

Из данных, приведенных выше, можно сделать вывод о том, что выявленные глюкокортикоид — зависимые изменения свободнорадикального окисления имеют свои особенности в каждом из исследованных органов и во многом определяются режимом стрессорного воздействия, который, в свою очередь, определяет состояние и функцию ГГАС. Следовательно, особенности ГКГ - зависимых изменений свободнорадикального окисления определяются изменениями функции ГГАС, связанными с гипо- или гиперпродукцией ГКГ, нарушением регуляции по механизму отрицательной обратной связи, изменением чувствительности тканей к ГКГ, а также скоростью биотрансформации глюкокортикоидов. В зависимости от характера, интенсивности, длительности воздействующего стрессора (стрессоров) могут развиваться различные варианты дисфункции ГГАС, каждый из которых, помимо прочих особенностей, сопровождается либо недостаточностью системных эффектов ГКГ, либо их избытком. Поэтому мы посчитали целесообразной оценку особенностей проявлений оксидативного стресса при клинических состояниях, сопровождающихся дисфункцией ГГАС и нарушением адаптивных процессов.

Особенности свободнорадикального окисления при клинических состояниях, сопровождающиеся нарушением адаптивных процессов и лабораторными признаками гипо- и гиперкортикоидных состояний

Особенности оксидативного стресса и содержание кортизола в пуповинной крови при нарушениях адаптации новорожденных

В результате проведенного исследования были выявлены признаки изменений функции ГГАС при нарушениях адаптации новорожденных, что проявлялось увеличением или снижением уровня кортизола в сыворотке крови по сравнению с соответствующим показателем контрольной группы (таблицы 13 и 14). Исходя из принятых на сегодняшний день лабораторных норм по содержанию кортизола в пуповинной крови (Кишкун, A.A. Руководство по лабораторным методам диагностики,- М.: ГЭОТАР Медиа, 2007; Ипполитова, Л.И. - Педиатрия. - 2010. - Т. 89, № 1), можно говорить о том, что значительно превышает нормальный уровень содержание кортизола при болевом синдроме. При синдромах гипервозбудимости, токсической эритеме, кровоизлияниях в кожу наблюдаются колебания уровня кортизола в пределах общепринятых норм, а при синдромах срыгивания угнетения и кардио - респираторной депрессии выявлена патологическая гипокортизолемия. При этом во всех без исключения группах обследованных детей наблюдались различные проявления оксидативного стресса. В пуповинной крови новорожденных с болевым синдромом наблюдалось одновременное увеличение содержания продуктов перекисного окисления липидов и уровня окислительной модификации белка. Подобные изменения наблюдались и при синдроме гипервозбудимости (таблица 13).

Таблица 13 - Перекисное окисление липидов и окислительная модификация белков при нарушениях адаптации новорожденных, сопровождающихся высоким и нормальным уровнем кортизола в пуповинной крови

~--Группы Показатели ' ................. Контроль п-33 Болевой синдром п-20 Гипервозбудимость п=21 Токсическая эритема >1=13 Кровоизлияния в кожу п=17

Коргиюл, нмоль / л 373,834*26,15 955,672±75,1 474,19]±47,921 312,58±42,464 287,297±47,429

Диеновые конъюгаты (гептановая фаза), е.о.и. 2,252±0,015 3,112±0,15 3,464±0,252 1,755±0,14 * 2,353±0,078

Кетодиены и сопряжённые триены (гептановая фаза), е.о.и. 0,135±0,003 » 0,205±0,015 0,169±0,009 0,1б2±0,019 0,14±0,011

Шиффовы основания (гептановая фаза), е.о.и. 0,156±0,01 0,18±0,01б * 0,306±0,034 0,209±0,028 0,199±0,015

Диеновые конъюгаты (изопропанольная фаза), е о и. 0,559±0,004 0,764±0,038 0,787±0,042 0,949±0,055 0,551±0,032

Кетодиены и сопряжённые триены (изопропанольная фаза), е о и. 0,258±0,004 0,148±0,008 * 0,267±0,0И 0,081±0,005 0,226±0,006

Шиффовы основания (изопропанольная фаза), е.о и. 0,143±0,001 0,166±0,030 0,262±0,018 0,384±0,019 0,193±0,013

ТБК - активные продукты, мкмоль/л 32,434±1,036 0,724±2,7515 * 56,771±1,239 39,834±1,56 35,535±0,922

Окислительная модификация белка, мкмоль / г белка 0,384±0,017 0,640±0,039 0,370±0,043 * 0,482±0,034 0,328±0,031

* - статистически значимые отличия от показателей контрольной группы.

Таблица 14 - Перекисное окисление липидов и окислительная модификация белков при нарушениях адаптации новорожденных, сопровождающихся снижением уровня кортизола в пуповинной крови

---Группы Показатели ' ■—___ Контроль п=33 Срыгнванне п=26 Угнетение п=8 КРД п=14

Кортщол, нмоль / л 373,834±26,15 261,505±10,662 194,975±64,477 140,933±13,599

Диеновые конъюгаты (гегтгановая фаза), е. о. и 2,252±0,015 2,952±0,124 3,873±0,781 2,397±0,157

Кетодиены и сопряжённые трнены (гегтгановая фаза), е о и. 0,135±0,003 * 0,31±0,046 0,249±0,074 * 0,324±0,063

Шиффовы основания (гегтгановая фаза), е о и 0,156*0,01 0,19±0,017 0,184±0,01 0,439±0,035

Диеновые конъюгаты (изопропанольная фаза), е.о и. 0,559±0,004 0,91±0,045 * 0,795±0,065 * 0,736±0,046

Кетодиены и сопряжённые триены (изопропанольная фаза), е о и. 0,258±0,004 0,267±0,014 0,153±0,013 0,231±0,016

Шиффовы основания (изопропанольная фаза), е.о.и. 0,143±0,001 0,631±0,027 0,696±0,005 0,260±0,027

ТБК - активные продукты, мкмоль/л 32,434±1,036 58,629±2,525 52,428±5,091 57,82±3,804

Окислительная модификация белка, мкмоль / г белка 0,384±0,017 0,357±0,056 0,418±0,071 0,518±0,009

Окислительная модификация белка (индукция Бе2* / Н2О2), мкмоль / г белка 1,546±0,15 1,53±0,56 1,50±0,50 1,62±0,11

* - статистически значимые отличия от показателей контрольной группы. КРД- кардио - респираторная депрессия.

Нарушения адаптации, протекающие на фоне умеренного снижения содержания кортизола относительно контрольного уровня (токсическая эритема и кровоизлияния в кожу), также сопровождались усилением липопероксидации (таблица 13). Синдром токсической эритемы развивался на фоне повышения содержания первичных и конечных продуктов липопероксидации, ТБК - активных продуктов и уровня ОМБ. Подобные, но менее выраженные изменения (за исключением усиления ОМБ) наблюдались и при кровоизлияниях в кожу. Отличием данных синдромов дезадаптации был относительно низкий уровень ТБК-активных продуктов и окислительной модификации белка.

Наиболее выраженные проявления оксидативного стресса наблюдались на фоне синдромов дезадаптации, сопровождающихся снижением уровня кортизола в пуповинной крови (таблица 14). Синдром срыгивания развивался на фоне повышенного количества всех категорий продуктов ПОЛ и ТБК -активных продуктов. При синдроме угнетения дополнительно увеличивался базальный уровень окислительной модификации белка, а при кардио -респираторной депрессии было выявлено усиление как базальной, так и металл - катализируемой ОМБ.

Снижения уровня кортизола при синдромах срыгивания, угнетения и кардио - респираторной депрессии демонстрирует истощение стресс -регулирующих систем новорожденного, что на основании наблюдения за данными детьми указывает на снижение их адаптационных возможностей. Важной особенностью свободнорадикальных процессов у новорожденных с синдромами срыгивания, угнетения и кардио - респираторной депрессии было выраженное увеличение по сравнению с другими исследованными группами оснований Шиффа и малонового диальдегида.

Кластеризация данных, представленных выше, по уровню кортизола методом К - средних (К-теаш) позволила выявить среди новорожденных с нарушениями процессов адаптации в раннем постнатальном периоде 2 кластера. При этом в каждом из полученных кластеров были выявлены корреляционные взаимосвязи между уровнем кортизола и показателями свободнорадикального окисления (таблица 15).

Анализ корреляционных взаимосвязей, (таблица 15), позволяет сделать выводы о том, что повышенный уровень кортизола (кластер 1) связан с изменениями активности одного из ключевых антиоксидантных ферментов: глутатионпероксидазы. Снижение уровня кортизола (кластер 2) сопровождается появлением новых корреляционных взаимосвязей между уровнем кортизола и свободнорадикальным окислением, а корреляционная взаимосвязь с активностью глутатионпероксидазы уменьшается вплоть до ее исчезновения.

Таблица 15 - Корреляционные взаимосвязи между уровнем кортизола крови и показателями свободнорадикального окисления (кластерный и корреляционный анализ)

Показатель Кластер 1 Нарушения адаптации, протекающие на фоне гиперкортизолемии п=22 Кластер 2 Нарушения адаптации, протекающие на фоне относительного снижения уровня кортизола п=111 я,

Кортизол, нмоль/л 1030,609±47,2292 267,646±2,686

Диеновые конъюгаты (гептановая фаза) -0,353371 0,206718*

Шиффовы основания (гептановая фаза) 0,047116 0,436103* 05 я"

Диеновые конъюгаты (изопропанольная фаза) 0,395381 0,254317* а те к <и

Шиффовы основания (изопропанольная фаза) -0,093161 0,441074* о. о ¡й

Окислительная модификация белка 0,070088 -0,221259* и Я" К

Ксантиноксидаза -0,123208 0,288149* •е-•е-

Катал аза -0,302663 -0,276498* о

Глутатионпероксидаза 0,651059* 0,147918

Глутатион -0,049140 -0,328618*

*-Р<0,05

Особенности оксидативного стресса и содержание кортизола в крови пациентов с психическими и поведенческими расстройствами, вызванными употреблением алкоголя

Абстинентное состояние, осложненное развитием алкогольного делирия (Р10.4) сопровождается активацией ГГАС. У пациентов наркологического стационара с явлениями алкогольного делирия были выявлены лабораторные признаки гиперкортикоидного состояния (таблица 17), сопровождавшиеся изменениями свободнорадикального окисления. Установлено ограничение липопероксидации при увеличении содержания продуктов окислительной модификации белка. При использовании кластерного анализа, исследуемую группу пациентов удалось разделить на два кластера по уровню кортизола (таблица 17).

Кластер 1 содержит пациентов с относительно высоким уровнем кортизола, кластер 2-е относительно низким. Оба кластера имеют одинаковые особенности свободнорадикального окисления: ограничение липопероксидации при увеличении окислительной модификации белка. Сопоставляя изменения уровня кортизола в исследуемых группах с уровнем окислительной модификации белка, следует обратить внимание на то, что

наиболее высокому уровню кортизола соответствует наиболее выраженное усиление окислительной модификации белка, а наименее выраженному увеличению уровня кортизола соответствует наименее выраженная ОМБ.

Таблица 17 - Изменения свободнорадикального окисления в зависимости от уровня кортизолемии при алкогольном делирии (кластерный анализ)_

Показатель Контроль (п=20) Алкогольный делирий (п=43) Алкогольный делирий Кластер 1 (п=17) Алкогольный делирий Кластер 2 (п=26)

Кортизол, нмоль/л 201,958±26,649 * 378,981±23,907 * 552,074±25,760 * *♦ 269,997± 10,046

Шиффовы основания (гептановая фаза) 0,231±0,043 * 0,061±0,015 * 0,035±0,012 * #* 0,079±0,023

Шиффовы основания (изопропанольная фаза) 0,104±0,008 * 0,051±0,007 * 0,042±0,010 * ** 0,056±0,009

Окислительная модификация белка, ЕД/г 38,233±3,727 # 206,844±17,154 * 234,188±26,959 * 188,965±21,934

Окислительная модификация белка (индукция), ЕД/г 99,606±12,123 * 377,315±33,415 * 450,533±51,971 * 329,441±41,715

* - статистически значимые отличия от показателей контрольной группы; * * - статистически значимые различия между показателями кластеров.

Соотношение между уровнем кортизола и уровнем свободнорадикального окисления при посттравматическом стрессовом расстройстве (ПТСР)

При исследовании лиц с ПТСР наблюдалось увеличение содержания АКТГ и снижение содержания кортизола по сравнению с контролем (таблица 18). Одновременный прирост содержания кортикотропина свидетельствует о снижении чувствительности коры надпочечников к стимулирующим сигналам со стороны АКТГ.

При этом наблюдались отчетливые проявления активации свободнорадикального окисления: увеличилось содержание гептан-растворимых кетодиенов и сопряженных триенов, а также уровень продуктов окислительной модификации белка (таблица 18). Отмеченные изменения соответствуют состоянию так называемого карбонильного стресса, возникающим в результате увеличения концентрации активных соединений, содержащих альдегидные и карбонильные группы. Была выявлена положительная корреляционная зависимость между уровнями кортизола и окислительной модификации белка (1^=0,49, Р=0,006).

Таблица 18 - Содержание адренокортикотропного гормона, кортизола и евободнорадикальное окисление у лиц с ПТСР

Показатель Контроль (п=45) ПТСР (п=45)

АКТГ, 20,10±1,12 *

пг/мл 36,20±1,24

Кортизол, нмоль/л 402,8±43,7 * 222,40±26,95

Кетодиены и сопряженные триены (гептановая фаза), е.о.и. 0,188 ±0,011 * 0,472±0,021

Окислительная модификация белка, мкмоль/г белка 0,317±0,0175 * 0,471±0,026

* - статистически значимые отличия от показателей контрольной группы, Р<0,05.

Отмеченные изменения соответствуют состоянию так называемого карбонильного стресса, возникающим в результате увеличения концентрации активных соединений, содержащих альдегидные и карбонильные группы. Была выявлена положительная корреляционная зависимость между уровнями кортизола и окислительной модификации белка (^=0,49, Р=0,006).

Результаты проведенного исследования убедительно демонстрируют нелинейный характер глюкокортикоид - зависимых изменений свободнорадикального окисления при стрессе. Опираясь на полученные данные, можно сделать выводы о том, что особенности свободнорадикального окисления, как и других метаболических процессов, при стрессе во многом определяются не только динамикой секреции глюкокортикоидов, но также чувствительностью к ним тканей-мишеней и скоростью их биотрансформации. Эти три фактора, в конечном счете, и определяют конкретные эффекты глюкокортикоидов в конкретный момент времени. Поэтому глюкокортикоид -зависимые изменения свободнорадикального окисления при различных вариантах стрессорных воздействий могут быть абсолютно противоположными. В зависимости от характера, интенсивности, длительности воздействующего стрессора (стрессоров) могут развиваться различные варианты дисфункции ГГАС, каждый из которых, помимо прочих особенностей, сопровождается либо недостаточностью системных эффектов ГКГ (гипокортикоидные состояния), либо их избытком (гиперкортикоидные состояния). Суммируя результаты экспериментального и клинического разделов работы, можно сделать заключение о том, что гиперкортикоидные состояния характеризуются разнонаправленными органоспецифичными глюкокортикоид - зависимыми изменениями свободнорадикального окисления, а гипокортикоидные состояния сопровождаются развитием карбонильного стресса. Именно карбонильный стресс, сопровождающийся избытком карбонильных производных биомолекул, согласно современным

представлениям, является основным и наиболее тяжелым проявлением окислительного стресса. С точки зрения кондиционализма, именно нелинейный характер глюкокортикоид - зависимой регуляции окислительного стресса определяет многие индивидуальные аспекты реактивности организма. В свою очередь, влияние глюкокортикоидов на реактивность организма, в конечном итоге, позволяет им выполнять свою препаративную функцию, связанную с подготовкой организма к воздействию стрессоров.

Выводы:

1. При редкочередующихся иммобилизациях глюкокортикоидные гормоны оказывают стимулирующее действие на процессы свободнорадикального окисления в головном мозге, а при ежедневных иммобилизациях - супрессивное, что связано с различным характером изменений чувствительности тканей ЦНС к действию глюкокортикоидов. Последствием этих изменений являются поведенческие расстройства, имеющие свои особенности для каждого из режимов иммобилизаций.

2. Введение экзогенного глюкокортикостероида приводит к развитию гипокортикоидного состояния, сопровождающегося развитием оксидативного стресса: в головном мозге и органах кроветворения и иммуногенеза выявлена активация свободнорадикального окисления, в печени - супрессия.

3. Предварительные иммобилизации модифицируют эффекты экзогенного глюкокортикостероида в головном мозге. Редкочередующиеся иммобилизации отменяют эффекты препарата, ограничивая прирост содержания продуктов липопероксидации, а ежедневные - усиливают, что приводит к дополнительному приросту содержания продуктов перекисного окисления липидов.

4. Два режима иммобилизационного стресса, отличающиеся кратностью и частотой воздействий, приводят к разнонаправленным изменениям свободнорадикального окисления и биотрансформации глюкокортикостероидов в печени, в одинаковой степени ограничивая супрессию свободнорадикального окисления при введении экзогенного глюкокортикостероида.

5. Глюкокортикоиды при редкочередующихся иммобилизациях оказывают стимулирующий эффект на липопероксидацию в тимусе, не оказывают влияния на липопероксидацию, вызывая при этом ограничение окислительной модификации белков в селезенке, ограничивают окислительную модификацию белков и прирост антиоксидантного резерва в костном мозге. Указанные изменения сопровождаются ослаблением клеточного иммунного ответа.

6. Глюкокортикоиды при ежедневных иммобилизациях оказывают стимулирующее действие на окислительную модификацию белков и супрессивное на липопероксидацию в тимусе; в костном мозге выявлено глюкокортикоид -зависимое усиление окислительной модификации белка, и глюкокортикоид -независимое ограничение липопероксидации. Изменения свободнорадикального окисления в селезенке при ежедневных иммобилизациях имеют глюкокортикоид -независимый характер. Указанные изменения сопровождаются усилением клеточного иммунного ответа.

7. При гиперкортикоидных состояниях (абстинентное состояние, осложненное развитием алкогольного делирия, болевой синдром и гипервозбудимость новорожденных) наблюдается преобладание процессов окислительной модификации белка, напрямую зависящее от выраженности подъема уровня кортизола в крови.

8. При гипокортикоидных состояниях (синдром посттравматического стрессового расстройства, синдромы угнетения, срыгивания новорожденных) наблюдаются проявления карбонильного стресса (накопление кетодиенов и сопряженных триенов и карбонилированных белков).

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Цейликман, В.Э. Влияние повторных стрессорных воздействий на иммунную реактивность и монооксигеназную активность печени нормотензивных и гипертензивных крыс / В.Э. Цейликман, Д.А.Козочкин, А.Л.Маркель, О.Б.Цейликман, С.В.Сибиряк, А.И.Синицкий, Д.А.Сысаков, А.С.Снмбирцев // Российский Физиологический Журнал им. И.М.Сеченова.-2008.-Т.94, №5.- С.574-580.

2. Цейликман, В.Э. Глюкокортикоид-зависимые изменения поведенческого статуса и липопероксидации при стрессорных воздействиях со сниженной устойчивостью к гипоксии / В.Э. Цейликман, А.И. Синицкий, A.B. Борисенков // Материалы Пятой Российской конференции «Гипоксия: механизмы, адаптация, коррекция». Патогенез.-2008.-№3.-С.93.

3. Цейликман, В.Э. Влияние повторных стрессорных воздействий с повышенной чувствительностью к гипоксии на окисление белков и липопероксидацию у крыс / В.Э. Цейликман, А.И.Синицкий, А.Б. Горностаева, Л.И. Крупицкая // Российский физиологический журнал им.И.М.Сеченова.-2008.-№12.-С. 1407-1413.

4. Цейликман, В.Э. Сенситизация вилочковой железы к гипоплазирующему действию глюкокортикоидов после длительного гипокинетического стресса /В.Э.Цейликман, Т.А.Филимонова, Н.В.Бояринова, С.В.Сибиряк, А.И.Синицкий, Д.А.Козочкин / Бюллетень экспериментальной биологии и медицины.- 2008.Т146, №7.-С.40-41.

5. Крупицкая, Л.И. Ксантиоксидаза как показатель адаптации новороэвденных / Л.И. Крупицкая, В.Э. Цейликман, А.С.Попова, А.И.Синицкий, Т.Н.Голощапова, В.П.Дубровская, И.М.Гузема // Клиническая лабораторная диагностика.- 2008.-№12.-С.16-17.

6. Цейликман, В.Э. Биохимические стратегии адаптации в условиях хронического стресса / В.Э. Цейликман, О.Б.Цейликман, А.И.Синицкий, Е.А.Лавин, Д.А.Романов, И.А.Лаптева, А.Б.Горностаева, А.В.Борисенков, М.И. Нусратов // Вестник Южно-Уральского гос. ун-та. Серия «Образование, здоровье и физическая культура».- 2008.-№14.- С.56-57.

7. Цейликман, В.Э. Соотношение между окислением белков и липопероксидацией у крыс с приобретенной интолерантностью к гипоксии / В.Э.Цейликман, Е.А.Лавин, Д.А.Козочкин, О.Б.Цейликман, А.И. Синицкий // Материалы IV съезда биохимиков и молекулярных биологов,- Новосибирск, 2008.- С. 476.

8. Цейликман, В.Э. Сенситизация к глюкокортикоидам в условиях гипокинезии / В.Э.Цейликман, Т.А.Филимонова, Н.В.Бояринова, С.В.Сибиряк, А.И.Синицкий, Д.А.Козочкин, Е.С.Каташинский // Материалы 6 Международной научно-практической конференции «Достижения фундаментальных наук в решении актуальных проблем медицины».- Астрахань, 2008. -С.281.

9. Синицкий, А.И. Чувствительность к глюкокортикоидам и свободнорадикальное окисление в условиях анксиогенного стресса / А.И. Синицкий, Н.В.Бубнов, К.А. Поярков, Е.В.Вождаев // Актуальные проблемы теоретической и прикладной биохимии: Рос. конф., посвящ. 80-летию со дня рождения Р.И. Лифшица. -Челябинск, 2009.-С.12-15.

10. Цейликман, В.Э. Активность моноамиооксидазы-Б тромбоцитов и показатели перекисного окисления липидов у новорожденных с различными синдромами / В.Э. Цейликман, А.С. Попова, Л.И. Крупицкая, А.И. Синицкий // Актуальные проблемы теоретической и прикладной биохимии: Рос. конф., посвящ. 80-летию со дня рождения Р.И. Лифшица. - Челябинск, 2009.-С.188-189.

1 l.Tseilikman, V.E. Stress-induced hepatitis and sensitivity to pro-inflammatory cytokines and glucocortikoids/ V.E.Tseilikman, O.B.Tseilikman, A.I. Sinitskii, M.I. Nusratov, S.V. Popov, E.S. Katashinsky, D.A. Kozochkin // European journal of Immunology Supplement 1/09 Immunity for lifelmmunology for health Abstracts 2nd European congress of Immunology September 13-16, 2009, Berlin, Germany.- P.675

12.Tseylikman, V.E. Endocrine-immune interaction under stress conditions on hypertensive and normotensive rats / V.E. Tseylikman, O.B.Tseylikman, A.I. Sinitskii, D.A. Kozochkin, S.V.Popov, E.S.Katashinsky // The journal of Physiological Sciences Proceedings of the XXXVI International Congress of Physiological Sciences (IUPS2009) Function of Life: Elements and Integration. 2009, Kyoto, Japan.- P.227.

13. Цейликман, В.Э. Влияние депренила на свободнорадикальное окисление в головном мозге крыс при иммобилизационном стрессе / В.Э.Цейликман, А.И.Синицкий, К.А.Поярков, Е.В.Вождаев // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины.-2009.-Т148, №12.- С.615-617.

14.Бояринова, Н.В. Особенности иммуноэндокринного статуса и состояние свободнорадикального окисления при синдроме посттравматического стрессового расстройства / Н.В.Бояринова, М.Г.Давыдович, В.Э.Цейликман, А.И.Синицкий, А.Р.Габбасов, Д.А.Козочкин, С.Г.Богданов // Медицинский вестник Башкортостана,- 2010.- №4.-С.

15.Boyarinova, N. Hypothalamic-pituitary-adrenal system status and free radical oxidation in patients with posttraumatic syndrome / N. Boyarinova, M. Davidovich, V.Tseylikman, O.Tseylikman, A. Sinitskii, // 7th World congress on Stress, Gorlaeus Laboratoria, University of Leiden, Nhe Netherlands, 2010.- P.28-29.

16. Цейликман В.Э. Активность моноамиоксидазы тромбоцитов, Mg - АТФ-азы эритроцитов и содержание магния в сыворотке крови у новорожденных в острый период адаптации / В.Э.Цейликман, А.С.Попова, Л.И.Крупицкая, А.И. Синицкий // Клиническая лабораторная диагностика.- №5.- 2010.- С.14-16.

17.Цейликман, О.Б. Влияние рецепториого антагониста IL-ip на перекисное окисление липидов в печени при стрессе / О.Б.Цейликман, В.Э.Цейликман, А.И.Синицкий, Д.А.Козочкин, А.М.Миронов, Е.С.Каташинский //

Бюллетень экспериментальной биологии и медицины,- 2010.- Т.150, №8.- С. 158-159.

18.Цейлнкман, В.Э. Перекнсное окисление липидов во внутренних органах крыс при тревожно - депрессивных расстройствах / В.Э.Цейликман, А.И.Синицкнй, Д.А.Козочкин // Вестник Южно-Уральского гос. ун-та. Серия «Образование, здоровье и физическая культура»,- 2010.- выпуск 23, №19.- С.47 - 49.

19.Цейликман, В.Э. Иммуносупрессивное действие гипокинетического стресса и сенситизация вилочковой железы к глюкокортикоидам / В.Э.Цейликман, Т.А.Филимонова, С.В.Сибиряк, А.И.Синицкнй, Д.А.Козочкин, JI.A. Стрельникова // Российский физиологический журнал им. И.М.Сеченова .-

2011.-Т.97, №5.-С.532-537.

20. Тимофеева, Т.Г. Свободнорадикальное окисление в тимусе, селезенке и костном мозге при гипокинетическом стрессе / Т.Г. Тимофеева, Т.А.Филимонова, А.И.Синицкнй, Д.А.Романов, Л.А.Стрельникова // Вестник Уральской медицинской академической науки - тематический выпуск по аллергологии и иммунологии. - 2011.- №2 /1.-С.67-68.

21.Козочкин, Д.А. Соотношение между липопероксидацией и окислением белков в крови и головном мозге в динамике тридцатисуточной гипокинезии / Д.А. Козочкин, Т.Г.Тимофеева, А.И.Синицкнй, Д.А.Романов, Л.А.Стрельникова, И.В.Стрельников, Т.А.Филимонова, В.Э.Цейликман // Омский научный вестник Серия Ресурсы земли. Человек,- 2011.- №1(104).-С. 102 -104.

22. Филимонова, Т. А. Соотношение между липопероксидацией и окислительной модификацией белка в печени в динамике тридцатисуточной гипокинезии/ Т.А. Филимонова, Н.Е. Панков, А.И.Синицкнй, Д.А. Козочкин, Р.В.Деев, Т.Г.Тимофеева // Фундаментальные исследования. - 2012. - №2,- С.143-146.

23. Паиачев, И.В. Особенности свободнорадикального окисления в эритроцитах и плазме крови при алкогольном делирии с преобладанием психотического компонента / И.В. Паначев, Д.Б. Виноградов, К.А.Бабин, А.И.Синицкнй // Фундаментальные исследования. - 2012. - №4.- С.352-355.

24.TseiIikman, V. Does stress-induced release of interleukin -1 cause liver injury ? / V.Tseilikman, D.Kozochkin, S.Sibiriak, O.Tseilikman, A. Sinitskii, E. Katashinsky, A. Nikitina, D.Vinogradov, A.Simbirtsev // Cell. Mol. Neurobiol.-

2012.- 32:1069-1078.

25. Стрельникова, Л. А. Влияние однодневной гипокинезии на показатели дексаметазонового теста, уровень апоптоза, окислительного стресса и чувствительность вилочковой железы к гипоплазирующему действию глюкокортикоидов / Л. А. Стрельникова, И. В. Стрельников, Н. Н.Курчатова, М. В. Осиков, Д. А. Козочкин, В. Э. Цейликман, О. Б. Цейликман, А.И.Синицкнй // Российский иммунологический журнал.-2012.-т.6(14). - №3(1).-С.143-145.

26.Деев, Р.В. Взаимосвязи между активностью моноаминоксидаз и свободнорадикальным окислением в митохондриях головного мозга при стрессе / Р.В. Деев, А.И.Синицкнй, Д.А.Козочкин, М.А.Тюменцев, И.Г.Галиуллина,

А.К.Юнусова, З.З.Зарипова, А.А.Никитина, Д.И.Гимазутдинова // Медицинский академический журнал.-2012.-т.12, №3.-С.70-72.

27. Цейликман, В.Э. Изменение уровня Fe+2 /аскорбат -индуцированнового ПОЛ при синдромах асфиксии, гипервозбудимости, срыгивания, болевом синдроме и их сочетаниях у новорожденных/ В.Э. Цейликман, В.В. Хасанова, A.C. Попова, Л.И.Крупицкая, Т.П.Шевлюкова, А.И. Синицкий // Современные проблемы науки и образования.-2012.-№6.

28. Попова, A.C. Состояние энергетического обмена у новорожденных в норме и при развитии нарушений адаптации в раннем постнатальном периоде / A.C. Попова, Л.И. Крупицкая, В.Э.Цейликман, В.Е. Рябинин, А.И. Синицкий, Р.В.Деев // Клиническая лабораторная диагностика,- 2013.-№1.-С.22-24.

29. Виноградов, Д.Б. Соотношение между уровнем биогенных аминов, активностью тромбоцитарной МАО-Б и свободнорадикальным окислением в условиях алкогольного делирия / Д.Б. Виноградов, К.А. Бабии, Б.В. Изаровский, В.Э. Цейликман, А.И. Синицкий, Ю.М. Шатрова // Наркология.-2013.-№3.-С.49-52.

30. Цейликман, В.Э. Влияние глюкокортикоидного препарата триамцинолона ацетонида на поведенческую активность и устойчивость к гипоксии у крыс различным уровнем микросомального окисления / Д.А. Козочкин, М.Е. Мишарина, М.В. Комелькова, А.И.Синицкий, Р.В.Деев // «Фундаментальные и прикладные проблемы стресса»: III Международная научно-практическая конференция. - Витебск, 2013.- С.110-112.

31. Цейликман, В.Э. Влияние предварительного гипокинетического стресса на чувствительность костного мозга к гипоплазирующему действию экзогенного глюкокортикоида / В.Э. Цейликман, М.В. Осиков, Л.А. Стрельникова, Т.А. Филимонова, И.В. Стрельников, О.Б.Цейликман, А.И.Синицкий, Д.А. Козочкин, Н.Е. Панков, П.А.Панкова // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины, 2013.-№5, Т.155.- С. 547-550.

32. Цейликман В.Э. Влияние глюкокортикоидного антагониста на карбонилирование белков в печени крыс при ежедневных одночасовых иммобилизациях / Цейликман В.Э., Рябинин В.Е., Цейликман О.Б., Синицкий А.И., Деев Р.В./ Бюллетень экспериментальной биологии и медицины, 2013.-№7, Т.156.-С.38-41.

33. Цейликман В.Э. Соотношение между уровнем циркулирующего кортикостерона и уровнем карбонилирования белков в печени при непродолжительной гипокинезии / В.Э.Цейликман, Н.Е.Панков, Н.А.Панкова, Т.А.Филимонова, А.И.Синицкий, Д.А.Козочкин, О.Б.Цейликмаи//Бюллетень экспериментальной биологии и медицины, 2013.-№8, Т.156.-С. 153-156.

34. Tseilikman, V. Low Cortisol levels are associated with increased free radical oxidation in patients with combat-related PTSD / V.Tseilikman, E.Manuhina, F.Downey, A. Sinitskii, A.Nikitina, O.Tseilikman, D.Altman //«Stress, Rhythm & Blues»: 43rd Annual Meeting of the International Society of Psychoneuroendocrinology (ISPNE).- The Netherlands, Leiden.-P.126.

На правах рукописи

Синицкий Антон Иванович

ОСОБЕННОСТИ СВОБОДНОРАДИКАЛЬНОГО ОКИСЛЕНИЯ ПРИ ГИПО- И ГИПЕРКОРТИКОИДНЫХ СОСТОЯНИЯХ

03.01.04. - биохимия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

Челябинск-2013

Подписано в печать 16.11.2013г. Тираж 40 экз. Заказ №852. Отпечатано в типографии «Проспект» 454080, г. Челябинск, пр-т Ленина, 64д Тел.: 2004-204

Текст научной работыДиссертация по биологии, доктора медицинских наук, Синицкий, Антон Иванович, Челябинск

Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Южно-Уральский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской

Федерации

На правах рукописи

05201450427

Синицкий Антон Иванович

ОСОБЕННОСТИ СВОБОДНОРАДИКАЛЬНОГО ОКИСЛЕНИЯ ПРИ ГИПО - И ГИПЕРКОРТИКОИДНЫХ состояниях

03.01.04. - биохимия

Диссертация на соискание ученой степени доктора медицинских наук

Научный консультант: Цейликман Вадим Эдуардович, доктор биологических наук, профессор

Челябинск - 2013

Оглавление

Введение......................................................................................................... 4

Глава 1. Глюкокортикоидные гормоны как регуляторы свободнорадикального окисления при стрессе (обзор литературы)......... 19

1.1 Изменения свободнорадикального окисления при стрессе............. 22

1.2 Адаптивные и дезадаптивные последствия изменения функции гипоталамо - гипофизарно - адренокортикальной системы и эффектов глюкокортикоидов в условиях стресса................................... 27

1.3 Глюкокортикоидная регуляция процессов

свободнорадикального окисления в условиях стресса........................... 49

Глава 2. Материалы и методы исследования............................................. 66

2.1 Моделирование изучаемых состояний в эксперименте................... 67

2.2 Характеристика обследованных пациентов...................................... 68

2.3 Методы анализа изучаемых явлений в эксперименте...................... 72

2.4 Биохимические методы исследования.............................................. 78

2.5. Статистическая обработка результатов............................................. 95

Глава 3. Глюкокортикоид - зависимые изменения

свободнорадикального окисления во внутренних органах при стрессе.. 96 3.1 Глюкокортикоид - зависимые изменения свободнорадикального окисления в головном мозге при экспериментальных стрессорных

воздействиях............................................................................................... 97

3.2. Глюкокортикоид - зависимые изменения свободнорадикального окисления в печени и почках при экспериментальных стрессорных

воздействиях............................................................................................... 120

3.3 Глюкокортикоид - зависимые изменения свободнорадикального окисления в органах кроветворения и иммуногенеза при

экспериментальных стрессорных воздействиях...................................... 127

Глава 4. Нарушение функции ГГАС, изменения чувствительности тканей к действию экзогенного глюкокортикостероида и сопутствующие изменения свободнорадикального окисления при экспериментальных стрессорных воздействиях........................................ 138

4.1 Изменения функции ГГАС и активности биотрансформации глюкокортикоидов при экспериментальных стрессорных воздействиях и введении экзогенного глюкокортикостероида............. 140

4.2 Свободнорадикальное окисление в головном мозге и изменения поведенческой активности при введении экзогенного глюкокортикостероида после завершения экспериментальных стрессорных воздействий.......................................................................... 149

4.3 Свободнорадикальное окисление в печени при введении экзогенного глюкокортикостероида после завершения экспериментальных стрессорных воздействий...................................... 157

4.4 Свободнорадикальное окисление в почках при введении экзогенного глюкокортикостероида после завершения экспериментальных стрессорных воздействий....................................... 162

4.5 Свободнорадикальное окисление в органах иммуногенеза и кроветворения при введении экзогенного глюкокортикостероида

после завершения экспериментальных стрессорных воздействий........ 165

Глава 5. Особенности свободнорадикального окисления при состояниях, сопровождающиеся нарушением адаптивных процессов и

лабораторными признаками гипо - и гиперкортикоидных состояний..... 178

5.1. Особенности оксидативного стресса и содержание кортизола в пуповинной крови при нарушениях адаптации новорожденных......... 178

5.2 Особенности оксидативного стресса и содержание кортизола в крови пациентов с психическими и поведенческими расстройствами, вызванными употреблением алкоголя.................................................... 191

5.3 Соотношение между уровнем кортизола и уровнем свободнорадикального окисления при посттравматическом стрессовом расстройстве (ПТСР).............................................................. 208

6. Заключение.............................................................................................. 212

Выводы.......................................................................................................... 251

Список сокращений и условных обозначений....................................... 253

Список литературы..................................................................................... 255

Введение

Актуальность темы исследования и степень ее разработанности

Подавляющее большинство метаболических процессов в организме позвоночных животных регулируется глюкокортикоидными (ГКГ) гормонами [70;377]. Уникальное разнообразие и распространенность эффектов ГКГ, очевидно, связаны с их основной функцией: эндокринной регуляцией стресса и адаптационных процессов. Метаболические эффекты ГКГ при стрессе на сегодняшний день детально изучены. Наиболее заметным из них является влияние на углеводный обмен, мобилизация липидов и аминокислот, ограничение синтеза белка и стимуляция протеолиза в различных типах мышц и др. [196].

Одним из наиболее важных метаболических процессов, наряду с биоэнергетикой, обменом углеводов и липидов, является свободнорадикальное окисление. Активные формы кислорода (АФК) в физиологических условиях участвуют во многих регуляторных и метаболических процессах. В тканях происходит непрерывная генерация АФК, которая обеспечивает сохранение нормального метаболического фона, необходимого для функциональной активности клеток [35]. Поэтому любая стрессовая реакция организма, как и любой адаптивный процесс, закономерно сопровождается изменениями свободнорадикального окисления, а окислительный стресс является одним из важнейших звеньев адаптации организма на клеточном уровне [267].

По этой причине, изменения свободнорадикального окисления и функция антиоксидантной системы, сопровождающие воздействие самых разных стрессоров, патологических и адаптивных процессов - одно из

наиболее активно развиваемых научных направлений последних десятилетий [347]. Из работ этих и многих других авторов сегодня очень много известно об особенностях свободнорадикального окисления в условиях стресса. Но, к сожалению, имеется очень мало данных о том, какие из этих изменений связаны с действием ГКГ при стрессе, а какие реализуются по механизмам, не зависящим от функции ГГАС.

Между тем, известно, что ГКГ принимают участие и в регуляции процессов свободнорадикального окисления. Сегодня известно о глюкокортикоидной регуляции ЫО-синтазы [301], глутатионпероксидазы [350], ксантиноксидазы, СОД, каталазы, [432], скорости продукции АФК [183], НАДФН - оксидазы [386], моноаминоксидазы [168]. Следовательно, от функционального состояние ГГАС, которое в свою очередь, определяется, прежде всего, частотой, длительностью, кратностью, и характером действующих стрессоров, могут зависеть и многие особенности свободнорадикального окисления.

патологии до ВИЧ - инфекции [333]), наблюдается длительное снижение уровня кортизола. Некоторые исследователи полагают, что именно сниженный уровень глюкокортикоидов определяет степень тяжести стрессорных расстройств [405].

Таким образом, дестабилизация ГГАС с последующим развитием гипо - или гиперкортикоидного состояния зачастую является основой для развития большого количества различных заболеваний. При этом весьма вероятным последствием такой дестабилизации является развитие окислительного стресса.

Цель исследования

Дать комплексную оценку состояния свободнорадикального окисления при гипо - и гиперкортикоидных состояниях, сопряженных с дисфункцией ГГАС и нарушением адаптивных процессов.

Задачи исследования

1. Изучить особенности свободнорадикального окисления и функцию ГГАС при экспериментальных стрессорных воздействиях.

2. Исследовать особенности свободнорадикального окисления и функцию ГГАС при введении экзогенного глюкокортикостероида.

6. Изучить особенности свободнорадикального окисления при клинических состояниях, сопровождающиеся нарушением адаптивных процессов и лабораторными проявлениями гипо - и гиперкортикоидных состояний.

Методология и методы исследования

Экспериментальный раздел работы выполнен на 643 беспородных лабораторных крысах обоего пола массой 190 - 280 г. Эксперименты проведены в соответствии с этическими нормами и рекомендациями по гуманизации работы с лабораторными животными, отражёнными в "Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и других научных целей" [219].

Для моделирования изучаемых состояний применялись модели иммобилизационного и гипокинетического стресса. Моделирование иммобилизационного стресса осуществлялось путём фиксации животного за конечности на спине с применением для этих целей прямоугольных планшет из фанеры. Были использованы два режима повторных иммобилизаций.

Первый режим воспроизводился путём трехкратных одночасовых иммобилизаций с интервалом между воздействиями в 24 часа. Согласно данным, полученным ранее [114], при таком способе моделирования хронического стресса развивается и доминирует толерантная стратегия адаптации. Авторы концепции адаптационных стратегий В.И. Кулинский и И.А. Ольховский [56] аргументировано декларируют гомологичность толерантного гипобиоза и «стадии истощения» стресс-синдрома.

Толерантный гипобиоз развивается у гомойотермных животных и человека вслед за стресс-реакцией, если она не обеспечивает адаптивный эффект [19].

Второй режим иммобилизационного стресса воспроизводился четырехкратными одночасовыми иммобилизациями с интервалом в 72 часа между отдельными стрессорными эпизодами. Для данного режима характерно доминирование резистентной стратегии адаптации [18], наличие поведенческих расстройств тревожно - депрессивного характера и снижение чувствительности к глюкокортикоидам [22].

Для изучения регуляции функциональной активности ГГАС использовали дексаметазоновый тест, который проводился после завершения гипокинезии по схеме, учитывающей особенности циркадной ритмики ГГАС у лабораторных крыс [89]. В качестве оценочного показателя функционирования механизмов обратной связи использовали изменения уровня кортикостерона в плазме крови до (исходный уровень) и через 6 часов после введения дексаметазона (KRKA, Словения; внутрибрюшинно в дозе 5 мкг / кг).

RU38486 (Mifepristone, Sigma). Животные получали антагонист в дозе 10 мг/кг интрагастрально перед каждым эпизодом иммобилизационного стресса [448]. Режим введения выбран исходя из особенностей фармакокинетики RU38486 [430].

Для изучения МАО - зависимых изменений свободнорадикального окисления использован селективный ингибитор МАО-Б депренил (ЮМЕКС, Sanofi / Chinoin, Венгрия) в дозе 10 мг/кг за 1 час до начала каждого сеанса иммобилизационного стресса.

Выделение отделов головного мозга крыс производилось в соответствии с рекомендациями, изложенными в работе [236].

Клинический раздел работы выполнен совместно с к.м.н. Поповой A.C. и к.м.н. Крупицкой Л.И. Обследовано 152 доношенных новорожденных. Из них: контрольная группа (дети, выписанные с диагнозом «здоров») - 33; дети с различными нарушениями адаптации, развивавшимися в раннем постнатальном периоде: синдром срыгивания - 26; болевой синдром - 20; синдром гипервозбудимости - 21; синдром угнетения - 8; синдром кардиореспираторной депрессии (КРД) - 14; кровоизлияние в кожу - 17; синдром токсической эритемы - 13. Для биохимического исследования проводили взятие пуповинной крови в пробирку в объеме 10 мл со стабилизатором (гепарин) сразу после рождения плода и пересечения пуповины, до отделения плаценты. В цельной крови и плазме, полученной из нее, определяли маркёры окислительного стресса, активность антиоксидантных ферментов, содержание кортизола. Наблюдали за состоянием новорожденных до седьмых суток и фиксировали развитие синдромов дезадаптации.

Содержание продуктов перекисного окисления липидов (ПОЛ) оценивали спектрофотометрически в липидном экстракте исследуемых тканей методом [16]. Определение содержания конечных продуктов

перекисного окисления липидов производилось спектрофотометрическим методом [62], малонового диальдегида в крови (ТБК - реактивные продукты) по реакции с тиобарбитуровой кислотой [46]. Интенсивность аскорбат-индуцированного ПОЛ изучали по методу [63]. Уровень спонтанной и металл - катализируемой окислительной модификации белков в исследуемых тканях оценивали по образованию динитрофенилгидразонов [2]. Активность моноаминоксидазы - Б определялась альдегидометрическим методом с использованием в качестве субстрата солянокислого бензиламина [17]. Активность супероксиддисмутазы оценивали по методу [126], активность ксантиноксидазы - по методу [253]. Определение активности глутатионпероксидазы в гемолизатах эритроцитов проводили по методу[14]. Содержание церулоплазмина в сыворотке крови изучали модифицированным методом Равина [46]. Активность каталазы оценивали по методу [53].

Поведенческие реакции животных изучались с использованием теста «приподнятый крестообразный лабиринт» [150] и актографа «открытое поле», эти тесты считаются одной из наиболее адекватных и чувствительных моделей для изучения тревожности [366].

Оценка гуморального и клеточного иммунитета производилась в соответствии с рекомендациями, изложенными в монографии [19].

Результаты обрабатывались общепринятыми методами дескриптивной статистики и выражались в виде среднеарифметической (М) и её стандартной ошибки (т). Статистически значимые различия определяли с использованием критериев непараметрической статистики: Манна-Уитни (U), Вальда-Вольфовица (WW), а также параметрического критерия Стьюдента (t - тест) (после проверки изучаемой выборки на нормальность распределения (критерий Шапиро-Уилкса) и равенство дисперсий (критерий Левина)). Для обработки результатов исследования использован пакет прикладных программ Statistica 6.0 for Windows.

Степень достоверности, апробация результатов, личное участие автора.

Информация о работе

Синицкий, Антон Иванович
доктора медицинских наук
Челябинск, 2013
ВАК 03.01.04

Диссертация

Особенности свободнорадикального окисления при гипо- и гиперкортикоидных состояниях - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы