Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Особенности структурной организации рибосом простейших с сегментированной 28S рРНК

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Особенности структурной организации рибосом простейших с сегментированной 28S рРНК"

ГОСКОВСКИЙ ОРДЕНА ЛЕНИНА, ОРДЕНА ОКТЯБРЬСКОЙ РЕВОЛЮЦИИ И ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ им. М.В. ЛОМОНОСОВА

Биологический факультет

На правах рукописи

ЧЕРНЯЕВА Наталья Сергеевна

УДК 547.963.3

ОСОБЕННОСТИ СТРУКТУРНОЙ ОРГАНИЗАЦИИ РИБОСОМ ПРОСТЕЙШИХ С СЕГМЕНТИРОВАНОЙ 28Б рРНК

03.00.03 - Молекулярная биология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 1995

-il

Работа выполнена на кафедре молекулярной биологии биологического факультс Московского Государственного Университета. , . ,,

Научный руководитель: кандидат биологических наук, доцент B.D. Асеев

Официальные оппоненты: доктор химических наук A.M. Копылов

кандидат биологических наук A.C. Степанов.

Ведущая организация: Институт биоорганической химии

им. М.М. Шемякина и Ю. А. Овчинникова РАН

С

Защита диссертации состоится "7? " . /¿.^¿.О/и 4 1995 г. в /¿^час * ^мин I заседании диссертационного ученого со] юта Д.053.05.70 при Москопскс государственном университете им. М.В. Ломоносова по адресу: 119899, Моею: Воробьёвы горы, МГУ, биологический факультет.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологического факультс МГУ.

Автореферат разослан "_"_ 1995 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета кандидат химических наук ii.H. Каграманои

f о bv .-

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ. 1. Актуальность проблемы. У большинства организмов структурный каркас / у^ большой и малой субъединиц ■ рибосомы образован ковалснтно-нспрсрывными S молекулами РНК. В рибосомах прокариотического типа это 5S, 23S и 16S рРНК, / а в рибосомах эукариотического типа — 5S, 5,8S, 19S и 28S рРНК. Но у некоторых организмов рРНК фрагментированы. Большая и малая субъсдиницы рибосом у таких организмов содержат ряд ковалентно-несвязанных фрагментов рРНК.

Такие рибосомы характерны для организмов, относящихся к различным систематическим группам. Наиболее часто рибосомы с фрагментированной рРНК ч'''

встречаются у простейших, в частности, жгутиковых. У представителей отряда

r/'j.i'i".'1 Vs " ' \

трипаносоматид Crithidia fasciculata и Trypanosoma brucellins рРНК расщеплена на

6 фрагментов (Spencer, 1987). Наиболее значительная фрагментация 28S рРНК наблюдается у Euglena gracilis, у которой 28S рРНК расщеплена на 13 различных рРНК размером от 64 до 744 нуклеотидов (Schnarc, 1990). Поскольку у этих организмов 28S рРНК не образует ковалентно-непрерывного каркаса, то, и условиях диссоциации и разворачивания большой субъединицы таких рибосом, возможно получить отдельные рибонуклеопротеидные комплексы. Это позволяет изучать различные функциональные активности рибосомы и связывание лигандов с отдельными рибонуклеопротеидными комплексами, полученными в результате диссоциации рибосом с сегментированной рРНК. Также можно локализовать белки, связанные с отдельными фрагментами рРНК.

Таким образом, эта модель является очень удачной для исследования структурно-функциональной организации рибосом. В настоящее время известно более 10 организмов с сегментированной 28S рРНК, однако, данных о структурных превращениях таких рибосом практически нет.

-22. Цель и задачи исследования. Цель настоящей работы состояла в изучении структурной организации большой субъединицы рибосом жгутиковых простейших " Astasia longa и Crithidia fasciculata с расщепленной 28S рРНК. В настоящей работе были .поставлены ..следующие экспериментальные задачи: 1) исследовать чу фрагментацию рРНК цитоплазматических рибосом простейшего Astasia longa-, 2) изучить диссоциацию большой субъсдиницы цитоплазматических рибосом Astasia longa и Crithidia fasciculata; -3) определить, является ли диссоциация большой субъсдиницы рибосом Astasia longa обратимой, возможна ли рсассоциация рибосом Astasia longa и будут ли рибосомы после рсассоциации активными в бссклеточной системе трансляции.

3. Научная новизна работы. Обнаружено, что гены рРНК Astasia longa кодируются экстрахромосомными кольцевыми молекулами размером 11 т.п.н., содержащими гены 19S, 5,8S и 28S рРНК. Выявлено, что у жгутикового простейшего Astasia longa 28S рРНК разделена на тринадцать ковалентно-нссвязанных фрагментов. Были оптимизированы солевые условия разворачивания большой субъсдиницы рибосом и разделения отдельных рибонуклеопротеидных комплексов жгутиковых простейших А. longa и С. fasciculata. При разворачивании большой субъсдиницы рибосом А. longa происходила диссоциация фрагментов рРНК, образующих VI домен 28S рРНК эукариотичсских организмов, и фрагмента, относящегося к вариабельной области 28S рРНК. При разворачивании большой субъсдиницы цитоплазматических рибосом простейшего Crithidia fasciculata, у которого 28S рРНК расщеплена на 6 фрагментом, также от большой субъсдиницы диссоциировали рРНК, формирующие VI домен 28S рРНК. Однако у Crithidia fasciculata большая субъсдиница рибосомы оказалась менее стабильной. Были подобраны условия для рсассоциация рибосом Astasia lon»a, с восстановлением трансляционной активности рибосом после реаесодиции.

4. Научно-практическая ценность работы. Оптимизированы условия для бесклеточной системы трансляции, полученной из клеток жгутикового простейшего Astasia longa. Выделена и охарактеризована плазмида, кодирующая v гены рРНК из клеток Astasia longa. Этот автономно реплицирующийся генетический элемент может быть использован для построения новых биотехнологических векторов для низших эукариот. Впервые была показана диссоциация и реассоциация большой субъединицы рибосом, содержащих ^ сегментированную 28S рРНК, что важно для понимания структурной организации эукариотических рибосом.

5. Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на международной конференции "Young Scientist's View of Molecular Biotechnology" (Бельгия, 1995 г.). Работа обсуждалась на заседании кафедры молекулярной биологии биологического факультета МГУ. Экспериментальные данные представлялись на семинаре лаборатории "Исследования механизмов биосинтеза белка" института Белка РАН (г. Пущино). Было сделано стендовое сообщение на конференции для молодых ученых в Санкт-Петербурге (1995 г.).

6. Публикации. По материалам исследований опубликовано 6 печатных работ, в том числе 3 статьи и 3 тезисов. ' •-1. Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора

литературы, описания материалов и методов, изложения результатов (включая обсуждение результатов), выводов и списка цитируемой литературы ( / J¿uaименований) и содержит (¿ ß рисунков и ¿ таблиц. Объем работы - ///^страниц.

МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Объект исследования — представитель жгутиковых простейших семейства эвгленовых Astasia longa и трипаносоматид Crithidia fasciculata. Плазмидную рДНК

п

из клеток Astasia longa выделяли методом, разработанным в нашей лаборатории (Зайцева и др., 1991). Рибосомы получали из клеток Astasia longa и Crithidia fasciculata по ранее разработанной для Е. gracilis методике (Schnarc et at., 1990). рРНК из целых клеток получали экстракцией горячим фенолом (Parish & Kirby, 1966) или гуанидинизотиоцианатным методом (Chirgwin et al., 1987) методом. рРНК анализировали в полиакриламидном геле в денатурирующих условиях (7 М мочевины). Гснноинжснсрные манипуляции с гаазмидами и гибридизационные эксперименты проводили согласно Маниатис и др., 1984. Основой для разработки бесклеточной системы трансляции послужила работа Freyssinct and Schiff, 1977.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ. 1. Выделение экстрахромосомной рДНК Astasia longa, и локализация генов рРНК.

Был разработан метод выделения экстрахромосомной рДНК из клеток Astasia longa, которая оказалась кольцевыми молекулами с размером 11 т.п.н. Была построена рестрикционная карта экстрахромосомной рДНК и локализованы гены рРНК на ней. Данная плазмида содержала по одному гену 19S, 5,8S и 28S рРНК. Такая организация рибосомного оперона характерна для большинства

HIß1 PI В2 Н2 R1 „. „, В5Н1

I I х" р?! Г р?! м "

"[ si|'s2 ¡¿I I I I I J , I Bg1 I 1 I Bg* Sm1 S3ÖS5

BQ2 ^ *3 ¿m2

гей 5 BS рРНК

Масштаб:

а -- ген 19S рРНК.

500 п-н- I ген 28S рРНК.

Рис. 1. Рестрикционная карта экстрахромосомной рДНК Astasia longa. Штриховкой обозначена локализация генов рРНК. Сайты рестрикции обозначены: H-Hindlll, S-SalGI, P-Pstl, R-EcoRI, B-BamHI, X-Xholl, Sm-Smal, Bg-BglII. Цифра после буквенного обозначения рсстриктазы обозначает конкрепгый сайт рестрикции.

эукариотических организмов, однако, рибосомныс гены обычно локализуются в хромосоме. Экстрахромосомные копии рибосомных генов встречаются у некоторых организмов, наиболее часто — у простейших. Е. gracilis содержит экстрахромосомную кольцевую молекулу, кодирующую гены 19S, 5,8S и 28S рРНК (Curtis, 1981). Рестрикционные карты рДНК этих двух видов жгутиковых простейших сходны, различия локализуются в нетранскрибируемой области. На рис. 1 представлена рестрикционная карта экстрахромосомной рДНК Astasia longa и локализация генов рРНК на ней. 2. Характеристика рРНК Astasia longa-

Astasia longa относится к отряду эвгленовых, поэтому представляло интерес сравнить рРНК этого вида с рРНК Е. gracilis, для которой показана высокая степень фрагментации рРНК. Чтобы исключить возможность деградации рРНК, сравнивали результаты нескольких методов выделения рРНК из А. longa:

1 2 3 4

I!1!

Рис. 2. Электрофорез в 7% полиакриламидном геле препаратов рРНК. 1 — рРНК Е. gracilis; 2, 3, 4 — рРНК А., longa, выделенная экстракции горячим фенолом, гуанидинизотиоцианатного метода и дспротеиниза-цией рибосом.

экстракции горячим фенолом, гуанидинизотиоцианатного метода и депротсинизации рибосом.

Препараты, полученные разными методами, давали одинаковые элсктрофореграммы (рис. 2). Сравнение с рРНК Е. gracilis показало, что

Г11 13

12345 67 8 9 <10) 12 14

□□□□□□□□□ало

163 133 350 116 688 527 235 744 614 163 649558 86

Рис. 3. Схематическое представление гена 28S рРНК. Прямоугольниками обозначены фрагменты рРНК, а пробелами — спейссрные участки. Цифры сверху указывают номера фрагментов, а цифры под прямоугольниками — размер фрагментов. Фрагменты пронумерованы в направлении от 5'- к З'-концу 28S рРНК.

количество фрагментов и их размеры у этих двух организмов одинаковы. У А. longa. 28S рРНК сегментирована на 13 ковалснтно-нссвязанных фрагментов. На рис. 3 представлена схема гена 28S рРНК

1 Целостность структурной организации рибосом с фрагментированной 28S

{

\ рРНК после выделения была проанализирована с использованием теста на их } функциональную активность. Для этой цели были оптимизированы условия бссклсточной системы трансляции из А. longa и продемонстрирована активность рибосом А. longa с фрагментированной рРНК в этой системе. Это подтверждает, что фрагментация 28S рРНК не обуславливается деградацией в процессе выделения.

3. Диссоциация рибосом А. longa.

Известно, что при снижении концентрации ионов Mg2+ происходит сначала диссоциация рибосом на субъсдиницы, а затем разворачивание субъединиц с образованием рибонуклсопротсидного тяжа. При диссоциации и разворачивании

V0

12 18

0.3 шМ Mg2*

(в)

12 1в _ 0.3 шМ Mg2+ 5 mM ЭДТА

рибосом с сегментированной рРНК можно ожидать образование отдельных рибонуклеопротевдных комплексов, содержащих один или несколько фрагментов рРНК. Для изучения этого процесса мы разделяли рибосомы А. longa и их компоненты в сахарозном градиенте при различных концентрациях Mg2+ и ЭДТА.

На рис. 4 представлено распределение рибосом и рибонуклеопротеидных комплексов А. longa в сахарозных градиентах с различным содержанием Mg2+ и ЭДТА. При 8 мМ Mg2+ выражен пик мо-носом с коэффициентом седиментации 80S (рис. 4а). При снижении концентрации Mg2+ происходит диссоциация рибосом на большую и малую субъединицу (коэффициенты седиментации 55S, 40S) (рис. 46). При дальнейшем разворачива- рис 4 ультроцентрифушрование в

нии рибосом, от большой субъединицы градиенте сахарозы рибосом и рибонуклеопротеидных компплексов

диссоциируют некоторые рибонуклеопро-

А. longa при разных концентрациях теидные комплексы (рис.4). Диссоци- Mg2+ и ЭДТА. Стрелка показывает

ирующие от большой субъединицы увеличение концентрации сахарозы в

градиенте.

рибосомы рибонуклеопротеидные комплексы в сахарозном градиенте образуют пик с коэффициентом седиментации 7S. При разделении в пешиакриламидном геле РНК выделенной из 7S пика было обнаружено, что в нем присутствуют определенные фрагменты рРНК. При концентрации Mg2+ 0,3 мМ происходит диссоциация фрагмента 10 и 5S РНК

12 1В

Номер фракции

п

(рис. 46). При концентрации ЭДТА 5 мМ и выше диссоциируют 5S рРНК и фрагменты 4, 10, 11, 12, 13 и 14 (рис. 4в).

Для подтверждения этих данных рибонуклеопротеидные комплексы, J полученные при диссоциации рибосом А. longa разделяли в агарозном геле. Рибосомальные РНК диссоциирующие от большой субъединицы рибосомы препаративно выделяли из агарозного геля и анализировали в полиакриламидном геле. Было показано, что при разделении рибонуклеопротеидных комплексов в агарозном геле от большой субъсдиницы рибосомы диссоциируют те же короткие рибосомальныс РНК (крРНК), что и при разделении в сахарозном градиенте, кроме 5S РНК.

Фрагмент 10 содержит консервативную последовательность, расщепляемую рядом сайт-специфических РНКаз и называемую а-сарциновой петлей. а-Сарци-новая петля играет чрезвычайно важную роль в функционировании рибосом — это У участок взаимодействия факторов элонгации с рибосомой (Hausner, 1978). Фрагменты 4, 11, 12 соответствуют вариабельным участкам, присутствующим только в эукариотических рРНК (Michot, 1984). Фрагменты 13 и 14 гомологичны З'-концсвой области 23S рРНК, которая в хлоропластах высших растений представлена 4,5S рРНК. Все эти фрагменты, кроме фрагмента 4 и 5S рРНК, соответствуют области рРНК большой субъсдиницы, образующей VI домен. Таким образом, при разворачивании большой субъсдиницы рибосом А. longa под действием ЭДТА происходит диссоциация VI домена рибосом и фрагмента 4, соответствующего вариабельному району эукариотических рибосом у А. longa.

Цитоплазматичсскис рибосомы Crithidia fasciculata также имеют расщепленную 28S рРНК. 28S рРНК С. fasciculata, разделена на шесть фрагментов. На рис. 6 представлены размеры и количество фрагментов рРНК, образующих большую субъсдишщу С. fasciculata. Рибосомы С. fasciculata

с

V .^-.„-»--г .-i__

-9- 1 "

диссоциировали в буферных растворах с различным содержанием Mg2+ и ЭДТА, а затем полученные рибонуклеопротеидные комплексы разделяли в сахарозном градиенте (рис. 5).

При концентрации Mg2+ 4 мМ и выше заметен один пик, соответствующий моносомам, его коэффициент седиментации равен 80S (рис. 5а). При отсутствии ионов Mg2+ и отсутствии Г^2+-связывающих агентов происходила диссоциация рибосом не только на большую и малую субъсдииицы, но и значительный "развал" большой субшишпкм на отдельные рибонуклеопротеидные комплексы. На (рис. 56) представлено распределение рибонуклеопротеилных комплексов в сахарозном градиенте при этих условиях. Заметны

12 16". Номера фракции

0,2

(В)

39-29S

12 16 Номера фракции

Рис. 5. Ультроцентрифугирование в градиенте два дополнительных пика, лока-сахарозы рибосом и рибонуклеопротеилных лнзующисся недалеко от верши-

комплексов С./аяс-киШа при различных кон-

г^гг-т-» ,-.^,2+ , I. ны сахарозного градиента, с ко-

иенграциях Ме и ЭДТА: (а) Мц - 4 мМ, к к

(б) Мё2+ - 0,3 мМ, Ми2+ — 0,3 мМ ЭДТА — эффицнентами седиме1гтации 7Б

15 мМ. Стрелка показывает увеличение кон- „ 8 При анализс фракцнй

центрации енхарозы п градиенте.

рРНК из этих пиков было обна-

ружено, что они не отличаются по составу и содержат фрагменты с, £ g и 5Б рРНК. По-видимому, в 8,38 пике локализуются рРНК, диссоциирующие от большой субъединицы рибосомы и образующие рибонуклсопротсидный комплекс, а в 75 пике представлены продукты их дальнейшей диссоциации, каркасом которых являются отдельные крРНК, диссоциирующие от большой субъединицы. Большая субъединица лишенная этих крРНК, распадается на два компонента примерно равного размера, не разделяющихся с малой субъединицей в сахарозном градиенте и имеющих коэффициент седиментации 39-298. В этом пике локализуются 19Б рРНК и фрагменты с, ё, ¡, В пике с коэффициентом седиментации 205, локализуются фрагменты с, <1, 1, Поскольку в них входят те же РНК, что и в области 39-295, они должны отличаться от компонентов первого пика либо менее плотной укладкой, либо отсутствием части белков.

Для достижения большего разворачивания рибосом С. /аьскиШа, анализ проводили в присутствии 15 мМ ЭДТА (рис. 5в), 8,35 пик в данных условиях отсутствовал. По-видимому, рибонуклеопротеидные комплексы с коэффициентом 8,35 под действием ЭДТА распадаются до отдельных крРНК, и весь материал, диссоциирующий от большой субъединицы, локализуется в 7Б пике. При анализе рРНК из фракций этого градиента было обнаружено, что в 7Б пике кроме крРНК диссоциирующих в отсутствии ЭДТА, локализован еще и фрагмент .ь а в двух других он отсутствует. В остальном распределение рРНК С. /ажшиЫа в составе рибонуклеопротеидных комплексов в сахарозном градиенте не изменилось.

Для подтверждения этих результатов проводили разделение рибонуклеопротеидных комплексов, полученных при диссоциации рибосом С. /ахкиЫа, в агарозном геле. Было показано, что даже при концентрации ионов

1 шМ и отсутствии ЭДТА происходит диссоциация крРНК с, Г и $ от большой субъединицы рибосомы С. /атсиШа, а при удалении ионов Мв2*

диссоциирует еще и 5S рРНК. Таким образом, как центрифугированием, так и электрофоретически, была показана диссоциация в отсутствии ионов Mg2+ крРНК е, f, g и 5S от большой субъединицы рибосом С. fasciculata. При сравнении рРНК, диссоциирующих от рибосом С. fasciculata в сахарозном градиенте и при электрофорезе, можно сделать заключение, что два разных метода дали сходные результаты.

На рис. 6 представлена схема расположения фрагментов рРНК и разделяющих их спейсерных участков в генах рибосомных РНК двух жгутиковых простейших A. tonga (Schnare, 1990) и С. fasciculata, кроме того, штриховкой отмечены диссоциирующие и недиссоциирующие крРНК.

У С. fasciculata фрагменты g, f, j соответствуют З'-концевой области гена 28S i с е d f j д

1

163

1782

212

1523

12 3 4

183 73 133

11 13 9 10 12 14

163 133 350 116 698 527 235 744 614 163649558В6

Рис. 6. Схематическое представление генов 28S рРНК: 1 — С. fasciculata, 2 — А. longa. Прямоугольниками обозначены фрагменты рРНК, штриховкой отмечены фрагменты рРНК, диссоциирующие от большой субъединицы рибосомы. Цифры под прямоугольниками обозначают размеры фрагментов.

рРНК, образующей VI домен рибосомы (Spencer, 1987). Фрагмент f содержит сайт узнавания а-сарцином, он образует так называемую а-сарциновую петлю. У А. longa фрагменту f гомологичен фрагмент 10 крРНК, также диссоциирующий от большой субъедишщм рибосомы при снижении концентрации ионов Mg2+ (Schnarc, 1990). Фрагмент j соответствует эукариотическому вариабельному

5

6

7

8

району, ему гомологичны фрагменты И и 12 рРНК А. longa Sehnare, 1990). Из представленных данных следует, что фрагмент j не диссоциирует без добавления Mg-связывающих агентов, хотя согласно модели вторичной структуры рРНК, он не образует водородных связей с другими фрагментами. Фрагмент g соответствует 4,5S рРНК хлоропластов высших растений и фрагментам 13, 14 крРНК А. longa (Sehnare, 1983), которые диссоциируют от большой субъединицы рибосомы при концентрации ЭДТА 10 мМ. У С. fasciculata от большой субъединицы рибосомы кроме VI домена диссоциирует фрагмент с, локализующийся между Ш И IV доменами 28S рРНК.

Таким образом, у двух этих видов жгутиковых простейших происходит диссоциация фрагментов, образующих VI домен рибосомы, и некоторых фрагментов, относящихся к вариабельной области. VI домен рибосомы отвечает за взаимодействие с трансляционными факторами и поэтому играет важную роль в биосинтезе белка. Однако было показано, что трансляционные. факторы не являются строго необходимыми для синтеза белка. Рибосомы синтезируют белок и без факторов трансляции, однако неэффективно. Можно предположить, что VI домен рибосомы образовался позднее в процессе эволюции, поэтому у некоторых организмов он ковалентно не связан с остальной частью большой субъединицы рибосомы. Это предположение объясняет диссоциацию VI домена рибосомы от большой субъединицы у организмов с сегментированной 28S рРНК. 4. Реассоциация рибосом А. longa.

Следующая часть работы посвящена реассоциации рибосом после диссоциации большой субъединицы рибосомы А. longa. Возникает вопрос: является диссоциация большой субъединицы рибосомы обратимой, возможно ли реассоциировать рибосомы после диссоциации большой субъедйницы?

Номера фракций

Номера фракций

Ночера фракций

Рис. 7. Ультроцентрифугирование в сахарозном градиенте рибосом и РНП А. 1оща. а) Моносомы, б) рибосомы после реассоциации, в) диссоциированные рибосомы.

// J i:

С— v,

Была проведена работа по оптимизации ионных условий и концентрации MgJ+ для реассо-циации рибосом А. longa, после диссоциации большой субъединицы, которые составили: 100 мМ NH4C1 и 4 мМ MgCI2. Однако, моносомы после реассоциации образовывались в незначительном количестве. Поэтому для увеличения количества реассоциирован-ных рибосом были подобраны условия термоактивации. Термоактивацию проводили 7 мин при 32°С.

После реассоциации рибосом А. longa образовывался гетерогенный материал, содержащий моносомы, субъсдиницы рибосом, U также неспецифические агрегаты. Наилучшее разделение продуктов реассоциации было получено в экспоненциальном (4 - ^

о

20%) сахарозном градиенте (рис. 7).

Необходимо было проверить активность рибосом после рсассоциации. Для этого рсассоциированныс рибосомы помещали в poly-U зависимую бесклеточную систему трансляции А. longa из которой предварительно были удалены нативные I рибосомы. В качестве отрицательного контроля использовали диссоциированные / рибосомы, которые также помещали в poly-U зависимую бесклеточную систему ( трансляции А. longa. И было показано, что после рсассоциации рибосомы А. longa проявляют трансляционную активность, в то время как диссоциированные рибосомы не активны.

ВЫВОДЫ

1. Показано, что у простейшего А. longa гены 5,8S, 19S и 28S рРНК кодируются ( экстрахромосомной ДНК имеющей размер 11 т.п.н.

2. Обнаружено, что 28S рРНК простейшего А. longa разделена на 13 ковалентно несвязанных фрагментов, как и рРНК Е. gracilis.

3. При снижении концентрации Mg2+ от большой субъединицы рибосомы А. longa диссоциируют фрагменты 10, И, 12, 13 и 14 крРНК, образующие VI домен рибосомы, и 4 фрагмента относящегося к вариабельной области второго домена большой субъединицы рибосомы.

/ 4. У С. fasciculata при снижении концентрации Mg2+ также диссоциируют крРНК, / образующие VI домен рибосомы, и фрагмент относящийся к вариабельной ( области, который локализуется между III и IV доменами большой субъединицы рибосомы. Остальная часть большой субъединицы распадается на два рибонуклеопротеидных комплекса приблизительно одинакового размера. 5. Диссоциация большой субъединицы рибосомы А. longa является обратимой. Рибосомы после реассоциации частично восстанавливают трансляционную активность.

По материалам диссертации опубликованы следующие работы:

1. Г.Н. Зайцева, Н.С. Черняева, Е.Н. Георгиева, В.В. Асеев. Выделение и характеристика плазмидной (рибосомной) ДНК из клеток фитофлагслята Astasia longa. // Биологические науки,- 1992.- №1.- С. 19-25.

2. Г.Н. Зайцева, Н.С. Черняева, В.В. Асеев. Экстрахромосомная рибосомная ДНК фитофлагелята Astasia longa. // Цитология,- 1995,- Т. 34,- №4,- С. 61-64.

3. Н.С. Черняева, Ф.Е. Хайтович, В.В. Асеев. Особенности диссоциации рибосом жгутикового простейшего Astasia longa, имеющих фрагментированную рРНК. // Биохимия.- 1995.- Т. 60,- №5,- С. 769-775.

4. Н.С. Черняева, Ф.Е. Хайтович, В.В. Ассеп. Диссоциации рибосом жгутикового простейшего Crithidia fasciculata, имеющих фрагментированную 28S рРНК. // Молекулярная биология.- 1995.- Т. 6.- (в печати).

5. Chcrnyaeva, N. Dissociation of Astasia longa cytoplasmic ribosomcs. // Yourtg Scientist's View of Molecular Biotechnology, Liege, August 27-Scptember 2, 1995,-V. 1,- P. 3.

6. Н.С. Черняева, В.В. Асеев. Особенности структурной организации рибосом простейших с фрагментированной 2SS рРНК. // Конференция молодых физиологов и биохимиков: Тез. докл.- Санкт-Петербург, .19-21 сент. 1995.-

1няогр.«£!»у ;>рлг.";! '"him; Почета'' издательства МГУ

' ' .' *' L.Y.IOÛ ,OJÎbî ГЩЛ I.

Гирал; !Oîi tin