Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Особенности сперматогенеза у мышей после действия химического мутагена дипина

ВАК РФ 03.00.11, Эмбриология, гистология и цитология

Автореферат диссертации по теме "Особенности сперматогенеза у мышей после действия химического мутагена дипина"

ЛЮСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ ИМ. М. В. ЛОМОНОСОВА

БИОЛОГИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ

На правах рукописи УДК 576:591

ХОДА АБДЕЛЬ ХАФФИЗ МАХРАН

ОСОБЕННОСТИ СПЕРМАТОГЕНЕЗА У МЫШЕЙ ПОСЛЕ ДЕЙСТВИЯ ХИМИЧЕСКОГО МУТАГЕНА ДИПИНА

(03.00.11 — эмбриология, гистология и цитология)

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

МОСКВА — 1994 год

Работа выполнена на кафедре эмбриологии Биологического факультета (Декан — профессор М. В. Гусев) Московского государственного университета им. М. В. Ломоносова-

Научный руководитель — доктор биологических паук

С. Т. Захидов

Официальные оппоненты: доктор биологических наук

Н. Д. Озернюк

кандидат биологических наук М. А. Лаиге

Ведущее учреждение — Российский государственный медицинский университет

.............30

Защита диссертации состоится « * -у______

па заседании специализированного совета Д.053.05.68 по защите диссертаций на соискание ученой степени кандидата биологических наук при Московском государственном университете им. М. В. Ломоносова по адресу: Москва, 119899, Ленинские горы, МГУ, Биологический факультет.

С материалами диссертации можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета МГУ им. М. В. Ломоносова

Автореферат разослан « ^ »__0- - 1994 г.

Ученый секретарь Специализированного совета кандидат биологических наук 1,л-

\ Е. Н. Калистратова

ОЭДЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Сперматогенез- процесс образования мужских половых клеток -предмет многочисленных исследований, ведущихся в областях сравнительной и экспериментальной эмбриологии, биологии развития и размножения, цитогенетики. Эти исследования, удачно сочетающие в себе общэбиалогич. кух и практическую значимость, способствовали установлению ряда закономерностей нормального и атипичного развития спермагогенных клеток. Детальному изучению подверглись морфологические и биохимические особенности хромосом, хроматина, клеточных структур на различных стадиях диф-ференцировки, кинетика клеточных популяций, полиморфизм гамет; выявлены принципиальные различия в структурной организации ДНП-комплекса спермагогенных и соматических клеток. Сделан огромный шаг к пониманию причин муж; ко го бесплодия ( Богданов, 197В» Данилова, 1878, Рувен-Ранге, 1980, Mann, Lutvak-Vfenn, 1988, Рай-цина, 1982, 1885, Россia et al., 1985, Захидов Д993).

И в настоящее время интерес к проблемам сперматогенеза не ослабевает. Наоборот, в связи с непрекрщапцимся загрязнением окружающей среды вредными веществами, практическими задачами медицины, демографии интенсифицировались исследования по изучению последствий действия ионизирующих ивлучений, химических и фармо-ко логических агентов Hä развивающиеся сперматогенные клетки, источников регенерационных процессов, роли вспомагательных соматических клеток, а частности клеток Сертоли в регуляции сперматогенеза. ,

Цели и вадачи работы. Основная цель ваключалась в изучении особенностей раввития мужских подовых клеток, а также высокодифференцированных клеток Сертоли у мышэй при действии химического мутагена дипкна.

Были поставлены слэдухщие конкретные задачи:

1) изучить динамику количественных и морфологических изменений различных типов половых клеток в процессе деструкция и восстановления сперматогеиного эшгтелия у половозрелых животных.

2) Установить степень чувствительности разных стадий сперматогенеза, последствия в длительность сохранения яндуцярованных гвветвчеснп изменений в стволовых я первичных подовых клетках.

3) изучить динамику количественных я морфологических кашне-

- г -

ний клеток Сертоли,

4) изучить Цитохимические особенности хроматина развивавшихся сперыатогенных клеток и клеток Сертоли в норме и после действия дипина.

Научная новизна работы. Впервые с помощьо гистологических, цитологических и цитогенетических методов изучены деструктивные Я восстановительные процессы в семенниках мышей, подвергшихся действии химического мутагена дипина. Установлено, что наиболее уязвимой стадией сперматогенеза является митотически размножающиеся спермагогонии. ,

Впервые показано, что индуцированные дшшнои в первичных половых клетках нарушила не влияпг на последующих постнаталышх стадиях развития животных на пул сперматогониалышх клеток, но вызывает сильное уменьшение числа мейотических и постмейотическнх клеток.

Впервые с помощью метода учета иикроядер и теста на аномалии форм головок спермиев неучена цитогенетическая чувствительность премейотических (первичные половые клетки, стволовые и дифференцирующиеся сперматогонии) в мейотнческнх (прелептотена-лептотена и поздняя пахите на -даакине») клеток.

Впервые показано, что в свйэнниках половозрелых шаэй высоко дифференцированные, потерявшие способность к пролиферации клетки Сертоли способны переходить к иитотическим делениям в ответ йа действие химического мутагена дипина.

Впервые обнаружены существенные различия в структуре хроматина некоторых типов сперматогенных клеток и клеток Сертоли в семенниках контрольных и подопытных животных.

Практическая значимость работы. Результаты настоящей работы детализирует ряд сторон гистс- в цитопатологии сперматогенеза у млекопитающих.

Полученные сведения включены в курс лекций, читаемый для студентов кафедры эмбриологии ИГУ.

Разработанные методы учета микроядер могут Сыть использованы для скрининга мутагенов, поражающа как половые» так и соматические клетки, в практике онтогенетического, мониторинга окружви-цэй среды.

Работа показала, что применение цитохимических методов в сочетании с нуклеазами открывает возможность для выявления нарушений и прогнозирования оплодотворяхтей способности мужских гамет

на уровне ДНП-комплекса.

Апробация работа Материалы диссертации докладывались на семинарах кафедры эмбриологии Биологического факультета МГУ (1993, 1994) и годичном собрания ИМ (Москва, 1993).

Ш материалам диссертация опубликована 1 статья,3 статьи находятся в печати.

Объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания штериадов и методов, изложения результатов и обсуждения, выводов. Работа представлена на 123 стр. и состоит кз б таблиц и 24 рис. Список литературы включает названий —172 кэ них 139 иностанных.

ШТЕШ1 Я 1ВГОДЫ КОСЗДОВЛШ«

Постановка экспериментов. В работе использованы половозрелые самцы и самки мышей гибридов I поколения (СВА х В157/С6). В одном и отлов каждого самца ссаживали с 1-3 виргинными самками. Подопытным самкам на 13 ( в это время идет активная пролиферация первичных половых клеток ) или 17(гоноциты вне клеточной репродукция) дни беременности инъецировали однократно, внутрибршинно ди-шш в дозах 6, или 30 иг/кг. Контрольным животным вводили по 0. ? мл физиологического рг~твора. Чэрев два месяца после рождения Самцов забивали путем дкслокации вейных позвонков.

В другом опыте половозрелым самцам мышей вводили.дипин в до->в 30 мг/кг. Отрицательным контролем слуяяли животные, получавшие по 0.2 мл 21-ного даго. »клией забивали путем дислокация шейных позвонков через 3 ч, 1, 3, 7, 14, 21, 35, Бв и 100 дней после начала эксперимента.

Приготовление и фиксация препаратов. После взвешивания семеи-кяхов, один из них целиком фиксировали в уксусно-глицериновой с меся, другой разрезали на небольшие кусочки и готовили отпечатки сперматогенных клеток; та хвостового отдела зпидидимиса готовили доки зрелых сперматозоидов. Препараты фиксировали в 10Х- ном нейтральней формалине в течение 15 кия.

. Дхя дсэличественвого анализа сперматогенеза и клеток Сэртага семенники, фиксировании» в уксусио-глицврилогой сы&сп а тв«кяяэ 2-8 вел, мвхаетгчески рввруил*, содеряимо* диссоциировали я полу-чигаут) таким образом суспекаяв анализ яровая* в га*»ра Горяева Да гистологических исследований сгнеянихи фихгяровага в

растворе Буэна. После фиксации и обезвоживания в спиртах восходящей концентрации семенники валивали в парафин и готовили среэы толщиной 5 мкм.

Окрашивание препаратов. Для цитологического анализа сперматогенеза препараты окрашивали по Федьгеку в стандартных условиях: 12-минутный гидролиз в Б н HCl п{ж t- 37* С с последующий окрашиванием в реактиве Шиффа в течение 1 ч. при комнатной температуре.

Для изучения цитохимических особенностей структуры хроматина в сперматогенных клетках и клетках Сертоли в норма и после действия дипина часть препаратов до их окрашивания по ®ельгену обрабатывали ДНКазой I (Kooh Light, Швейцария) - 100 ед/мл, 1С uU трис-HCI и 10 мЫ IfeCl ( pH 7. i) при 37е С в течение 5, 20 или 45 мин.

Препараты для гистологических исследований окрашивали гема-токсшшн-эоеиноы.

Цитофотоиетрия ДНК. Количественное определение содержания . ДНК в ядрах сперматогенных клеток и клеток Сертоли проводили с помощью штода прямой сканирующей денситометрии ("Виккерс- ISÖ", Англия). <-

ЬЬ?тоды учата иейогичэских и сперматогониадьных микроядер, В настоящей работе для определения частоты встречаемости округлых сперыатид к спердатогоякев с шкро ядрами в семенниках контрольных и подопытных мышей просматривали на окравдшшх по Сельгену препаратах не менее, "соответственно, 1000 иен 300 клеток от каждого тавотного. Число аномальных клеток выражали в прошила.

Метод учета вномалйй Дорц головок спермизв. В каоэй работо для определения частоты ватрочаеюсти апидвдкмалъных старшюв с морфологически аномальными головками просматривала Ев швее 500 клеток от каждого игвотного, в число мор^ологически атипичных га-шт выражали в процентах.

Статистическая обработка данных. Варкацтанно-статкстичвсклЯ анализ цифрового материала проводили по алгоритмам, представленным в книге a EL Урбаха ( 1QB4) в I» вомпылерным программам А. П. Кулаячэва (МГУ).

- 5 -

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

1. Количественная и цитологическая оценка сперматогенеза у половозрелых мышей, подвергшихся действию дипина на эмбриональных стадиях развития -Результаты количественного анализа сперматогенеза у мышей показаны на рис. 1а,б. Видно, что в гонадах подопытных животных, полупивших дипин в доае Б мг/кг на 17 день эмбрионального развития или в дозе 30 мг/кг на 13 день эмбрионального развития, общее число сперматогонйев на снижается и даже сущэственно выше контрольного уровня. Однако процентное, содержание пахитенных сперма-гоцитов уменьшается, причем при действии дипина в дозе 30 мг/кг на 13 и 17 дни эмбрионального развития, соответственно, в 1.85 и ,1.72 раза. . Число округлых сперматид также существенно снижалось при действий высокой дозы дипина; максимальные клеточные потери (733 от контроля) наблюдались после действия мутагена на животных, находившихся на 17.дне эмбрионального развития, а 40 X клеточных потерь на стадий округлых сперматид отмечено у животных, находившихся в момент воздействия дипина на 13 дне эмбрионального развития. При малой дозе дипина цитотонсические эффекты практически не наблюдались в обоих случаях. Аналогичная картина характерйа и для пула тестикулярных спёрмиев: при действии дипина в дозе 30 мг/кг на животных, находившихся на 13 и 17 днях эмбрионального,; развития, последующие потери на терминальных стадиях созревания гамет обставляли соответственно 42 и 701. -.Нэ и в этом случае дипия при дозе Б мг/кг фактически не влиял на число спер-миев.

При всех изучеяных дозах и вариантах опыта число клеток Сер-толи не отличалось от такового в семенниках контрольных животных.

; У мышей. подвергшася воздействию различных доз дипина в эмбриональном периоде, выход постмейотических клеток со следами Хрокюсошшх поаомок не превышал уровяя спонтанного мутагенеза, и даж в ряде случаев был ни» наблюдаемого в контроле (табх1). Я хотя воздействуя ва гоноциты, находившиеся как на стадия высокой »логической активности, так я после их выхода из цикла клеточной репродукции, дшот в дове 6 мг/кг вмвыв&а некоторое поешвяие адстоты встречаемости аномальных форм среди эпидядимальяых гамет, ово все■ ■'».. оставалось в пределах георэттпюски ожидаемого зваче-

еоо

1ВО-

100-

60-

ио 1ИЗ-100 -во-

1 2;. . ; ., .•:'Л"Ряс.1. Чйсло рвздичнй ТШ10В тсерштогеншп'кдэток (в X от контроля) в сешнниках иш?й; - подвергшиеся- действии дкпина в до-вах Б иУкг (в) и 30 ыг/кг (С) «а 13 ( ЕЕ ) к 17 ( [23 ) ДЯи вкбркоиального развития. 1 -сперьагогонии, 2 - спэрматоциты I порядка, 3 - окрутлыз спергатиды, 4 - сперыии.

юта. Однако значительный выход морфологически атипичных сперииев наблвдался посла действия дипина в дозе 30 мг/кг.

Таблица 1. Частота аберрантных половых клеток в репродуктивных органах контрольных и подопытных мышей.

Варианты х +

опыга ---------------------------------------------------

округлые спериатиды спермин с аномальными с миедоядрами, в X« головками, в X

1.4 + 0.4 (10) •

3.7 + 1.1 (7)

2.4 (2)

12.2 + 3.9 (В) *

20.3 + 4.1 (8) *

Примечание: в скобках - число изученных животных, * - различия статистически высоко достоверны при р< 0. Об

' 2. Количественная' оценка сперматогенеза £ мышей, подвергшихся , действии дидина на постнатальных стадиях развития

Как видно из рис. 2а в семенниках мышей, подвергшихся однократному воздействию дипина 1 дозе 30 мг/кг, общее число ранних половых клеток, (стволовые + дифференцирующиеся сперматогонии) оставалось в пределах норыы в первы» 14 дней эксперимента. Однако на 21 день фиксации пул сперттогониалышх клеток сильно увеличивался и составлял 17вХ от.контроля. На 35 день фиксации число сперматогоннев вновь достигало контрольных значений и в дальнейшем ааметно не варьировало. Семенники подот/тных мышей практически ^или свободам от спермвгоцитов I порядка (стадия пахптвкы) череа 14 и 21 дев» последействия. Затем число п&хотенкых сперма-тоцитов постепенно нарастало в к 56 дно эксперимента соотввтство-

Контроль 1.8 + 0.6(9)

Дипин 13 д 0.4 + 0.3 (в) Б мг/кг

17 д □ (2)

13 д 1.0 +0.5 (4)

30 мг/кг

17 д 2.0 + О.в (4)

гоо

160

100

БО

о

о

100

Рис. 2а. Динамика количественных изменений спериатогокиэв (•) и сперматоцитов I порндкамв семенниках мышей после действия дипина в дозе 30 иг/кг. 1Ь горизонтали - дни фиксации, по вертикали - число клеток в X от контроля.

вало нормальному уровни. Пэлное отсутсгвиэ округлых оперматид Отмечено в сперматогенном эпителии на 21 и 35 дни фиксации; на Бб день фиксации данная клеточная популяция составляла примерно 7БХ от исходного уровня.' Через 100 дней после начала эксперимента,

как и на 35 и Бб дни фиксации, пул тестнкулярных спермиев ещв выл далек от нормы и составлял всего 12Х от контроля. (рис. 2 б ».

3. Гистологический анализ семенников мьшей. подвергшихся действии дипина на постнатальных сгадя.х развития.

Как показали светооптические наблюдения срезов семенников контрольных мышей, семенные канальцы я иятарстйЦпОйаЛтая ткаяь 7

этих животных имели нормальную структуру.

UQ---------------------

IZO 100-BO

eo «

го

- т O

O 3 7 U 81 35 59 100

t • ' '' ■ ' :

Рис. 26. Динамика количественных изменений округлых cnepua-тид («) н спермиев (+) в семенниках мышей после действия дипина в доев 30 мг/кг. Ib горивонтали - дни фиксации, по вертикали -чжда клеток в X от контроля.

^ Щ З щяь после' действия дипива во многих канальцах наблюдалось Солыао» число сперцатоцитов 1 порядка с пикнотичесюши я драки, двуядёрных спериатид, клеток на стадии мейотических метафаз, что, вероятно, связано с задержкой процессов деления. Интерстици-

- ыьная ткань содержала шфштраты дни^цитов. -

Чер°э 7 дней после действия дипнна наблвдалось отслоение сперматогенного эпителия от оболочки канальцев, усиление дегенеративных процессов в них (пнкноэ, вакуолизация, образование гигантских ядер, двуядерных сперматоцитов I порядка и спериатид ). В ютерстициальяой ткани согранялись восполительные инфильтраты и появлялись клетки с необычной ыорфэлогиэй ядер.

Ва 14 день послвначалавксперкментасеменные канальцы содержали i основном сперкатиды н спермин, я также рёамнояшдося

сперматогонии и клетки Сертоли; сперматоциты I порядка встречались редко. Выявлялись двуядерные сперматидьг, сперматиды с гигантскими пикнотическими ядрами.

На 21 день после действия дипина значительная часть семенных канальцев сохраняла деструктивный характер, практически под-ностьб отсутствовали все типы сперматогенных клеток, ва исклсчэ-нием сперматогониев и клэток Сертоли.

На 35 день фиксации в семенных канальцах уже легко идентифицировались сперматоциты I порядка на разных стадиях развития (от лептотены до метафаз), округлые сперматиды. Несмотря на начавшийся процесс восстановления сперматогенного эпителия, в некоторых местах канальцев сохранялись пустые пространства, а в ин-терстициальной тканн - инфильтраты. Среди клеток Сертоли встречались митозы.

& 56 день фиксации в семенниках подопытных тавотных продолжали встречаться канальцы с нарушенным строением. Это отслоенш части сперматогенного ашпелия, слущиванкэ половых клеток в просвет канальцев, наличие мех- к внутриклеточных вакуолей, дегв-нерирущих клеток на стадиях мэйотнческих делений и сперматид, беспорядочное расположение спермиев. Среди клеток Сертоли продолжали встречаться митотические фигура В целом же большинство семенных канальцев содержали практически все типы раввивапцихся сперматогенных клеток.

Через 100 дней после действия дипина в семенниках мыпей по-давллщэе число канальцев имело морфологически нормальное -строение. Внутри канальцев сйерматогенныэ клетки располагались, как п в контроле, правильными концентрическими слоями в определенных ассоциациях. Шесте с тем в некоторых канальцах быхи обнаружены пустые пространства, дегенерирующие и гигантские клетки. Нередким событием были деляциеся клетки Сертоли. В ннтерстицкахьной ткани были ею видны инфильтраты к следы кровоизлияния.

4. 1Ърфо логические особенности »дер сперматогенных клеток подопытных мьшей

На окрашенных по Сель гену препаратах семенников было обнаружено больше число клеток с микроядрама и другими ядерными аномалиями Ыикроядра, поквля шлеек в округлых сперматид ах оказались

морфологически весьма разнообразными : от слабоокрашенных, диф-фувных структур, наломинапцих интерфаэяый хроматин до плотно конденсированных, почти пинчотических форм. Размеры выявляемых в клетках микроядер такта различны. На постмэйотичэских стадиях часто обнаруживались двух - и ыногоядэрнш сперматиды, сперматиды с гигантскими ядрами, следами хромосомных мостов.

Оормироваяию аберрантных спериатид предшествовали неправильности иэйотичэских делений в виде отставания или выброса за пределы веретена в цитоплазму одной или нескольких хромосом, их фрагментов, образование мостов.

В семенниках подопытных итвотных явные отклонения от нормы с Сольпой частотой встречались среди сперизтоцитов I порядка и спергатогониалышх клэток. R пкы следует отнести микроядра, ядра с уродливой форшй, двуядерньэ клетки.

В репродуктивных органах подопытных шзэй выявлено больше . чясго спермиео р разнообразная структур иьзл! поруганиями головой

0. Цитологический адалпэ генетических аффектов действия дипина на сперьдтогенкьз клетки половозрелых кывэА

Щ>я действия дзота в дозах 30 нг/кг статистически достоверно увеличивалось чпсхз окрутлыэс спэрьатид с ыикроядршя!, пропзо-сэдпгап от спэрштоцигоз, которьэ в tstaHT воздействия мутагена находились либо са стадиях поздней шшпегт-диакияэпа (3 день Сяксации), пйо пз стадиях прэлэптотэгш-лэптотвгги (14 дэпь фиксации). Цря отдаленной сроке фгксадяа (100 дэпь после катала згеспо-рэгэпта) число гогэткчэаа пэполпоцэшшх -клэток впачгелэ по прэвы- ' пш уровень спонтанного «утвгоиеза (рпс. За).

О степени а продоллятельгостп даЛстппл дЬгогаа пз xpoirocotcnit ттергал стволовых клгток судили по частоте пстрэчзэюстп аберрантных спериатогогшэв. Пзк видео ю рш. 33, число сперютогонп-алькшс клэтоя со следами индуцированных xpotocoisna полоиок в пзсколысо р2э прэеосгодп? ЧГ.СГО тп-'стг пз клэток а союншткпх контрольных йяеотььс.

Щтгологкчэсгей спалго твклэ показал, что процзпт ыорфологи-чзски ако1еимшзс Сори, п популяции оаклядюгальных сперев па 35 Дэнь фпксают ткзстзтъался по сравнения с гаонтролэы s 4,5 раза.

ю-/

«■-контроль БСЭ-дипин

' S4 М 100 .

Рис. 3. Число округлых сперыатвд (а) а спвр?<атогоинев(б)

о микг>ояцраын в семенниках кентролъдаа « подвергшихся

деЯств;ш ДЕпнна шее*. По горизонтали - zns ta «caían, по вертв-IM - чйбло «беррвотннх клеток > .<,'

6. Цитохимическиэ особенности хроматина в сперматогенных клетках мышей в норме и после действия дипина.

Как показал цитофотометрический анализ (табл. 2), в норма соотношения средних значений количества ДНК-фуксина в пахитенных сперматоцитах, округлых и удлиняющихся спермагидах близки к теоретически ожидаемым 4:1:1. В отличие от сперматид содержание ДНК-фуксина в гесгнкудярншс н, особенна, эпидидимальных спермиях заметно отклоняется от 1С уровня плоидности, что обусловлено возрастающей конденсацией хроматина в спермиогенных клетках.

ПЬсле обработки препаратов ДНКазой I содержание ДНК-фуксина • в пахитенных сперматоцитах, округлых и удлинивелхся сперматидах, тестикудяркых спермиях уменьшалось, соответственно, на 37, 41, 67 н 17Х. Плотно конденсированные ядра эпидидимальных спермиев не реагировали на действие ДНКазы I.

В препаратах семенников, приготовленных на 14 день после введения животным дипина в дозе 30 мг/кг, содержание ДНК-фуксина определяли только в постмейотических клетках. Обнаружено увеличение содержания ДНК-фуксина в округлых и удлинявшихся спепматидах, а также в эпидидимальных спермиях, соответственно, на 21, 12, ИХ по'сравнению с нормой. Нуклеазный гидролиз приводил к снижению содержания ДНК-фуксина в удлинявшихся сперматидах, тестккуляркых и эпидидимальных спермиях, соответственно, на 49, 8, 10%. Оценка содержания ДНК-фуксина а округлых сперматидах не проводилась, поскольку концентрация красителя в них лежала ва пределами чувствительности штода. У подопытных мышей варьирование количества ДНК-фукслна в морфологически нормальных эпидидимальных спермйях выго, чем в контроле (1^ против 7Х). После обработки га-ют ДНКааой I вариабельность снижалась до 8%.

Нз 35 день посл9 действия дипина содержание ДНК-фуксина в пахитенных спэрмзтоцятах уменыаалось на 185, а после нуюеазяого гидролиза потери составляли 18* против 37* в иейоцитах контрольных животных. Интересно отметить, что в гестикулярньос я эпидидимальных спермиях количество ДНК-фуюияа снижалось по сравнении с контролем на 85 и 18*, а после действия ДНКазы I увеличивалось в среднем на 13*.

Та&гаця 2. Сол'ржып» ДНК-буксяяа в раавявапцвхся сперматогенныг клетках *®в?рэлимг ж похопитжих мыввй.

"Т-лгаи юаотннх, ля фппсавкж , Обработка препаратов ---- 1С Типы к л е ОС УС ТОК тс ЭС

• Еоктро¿ь î п-61 п-48 П-63 П-85 П-178

253+4(9) 58+1(11) 64+1(11) 46+0.6(11) 38+0.2\7)

ДНКаза I ГУ-43 П-48 П—51 п-ВО п-150

161+5(20) 34+1(24) 22+1(38) 38+0.6(16) Эв+0. 2(0)

Дкггоп, SO кг/кг -> •

1Í £»К£ - - п-40 п-47 п-59 п-40

70+1(9) 72+2(16) 48+1.5(18) 42+1(14)

ДНКава I п-40 ñ-31 №46

- - - 37+1(20) 44+1(15) 38+0.5(8)

»*' m - п-40 - П-38 1X31

216+4(10) - 30 +1.5(29) 31+1(15)

ДНКав» I п-40 - • г>-45 п-31

17815(24) - - 34+1(19) 25+1(9)

Примечает»: n-число наученных клеток, » скобках- ковОДициент вариации, IE-пагитен-скэ сперматоцгтн, ОС- округам сперматиды, УС-удлиняющиеся сперматиды, ТС- тести-кугяряш стршя, ЭС- впядидимшт» сперма*.

7. Цитологические эффекты дипина на клетки Сертоли..

Количественный анализ клеток Сертоли (рис. 4), проведенный на 3 н 7 дни после действия дипина не выявил достоверных . отличий от контроля. № 14 и 21 дни фиксации число клеток Сертоли по сравнении с контролем сильно, увеличивалось и. составляло,соответственно, 180 и 230 X. На 35 день фиксации число клеток Сертоли практически воввращзлось к исходному уровню (80S от контроля) и на последующ« этапах эксперимента (60 и 100 дни фиксации) пул этих клеток оставался в пределах нормы.

Рис. 4 Дина-лека гешгчествекных вЗшнешй клеток Сертоли в сешннкках шдвэй после действия дипина в дозе 30 ц/кг. [ь горизонтали -дня фиксации, по вертикзди-число клеток а X от контроля.

В сеиетгкках подопытных ишзей среди клеток Сертоли очень часто встречались клетка с микроядрами, гигантскими ядрами, двуя-дэрныэ клетки, аномалию кгтози.

Сравнения средних значений содержания ДНК-фуксина в клетка! Сертоли между контролем и опытом , а именно, на 3 и 14 дни пос4» действия дипина выявили статистически значимые различия; характер варьирования был примерно одинаков (рис. Б}. На 35 день фиксашЙ по обоим статистическим показателям различий > сравнении с контролем не установлено.

еоо -f

Рис. Б. Содержание ДНК-фуксина а клетках Сертоли швей: ■ контроль, ЕЗ , И , ЕЙ - соответственно на 3, 14 и 35 дни после действия дипкяа в доев 30 и/кг. По горя-вонталя- время обработки в ДНКазе I в мин. Высоте столбцов -средние значения, цифровые обозначения над ними - коэффициенты . вариации.

totoe б-минутной обработки препаратов ДНКаэой I количество АЛХ-фуксина в клетках Сертоли контрольных животных снижется прв-, мрно ва 51. В то » яреш на 3, 14 я 36 дня п«**» действия днпя-ш» птяспаостъ окрацоаняа ядер свртоляевых клеток, , обработая-' па ДНКавой I, снижалась, соответственно, ва 15, £0 я lltj во . всех случаях угтаяоыени ствтшстятоскя достоверны» различия.

20-иинутный нуклеазный гидролиз приводил к значительным потерям содержания ДНК-фукскна (251) в клетках Сертоли контрольных мышей. У подопытных мнией через 3 дня после введения им дипина содержание ДНК-фуксина в клетках Сертоли не определяли, поскольку интенсивность окрашивания лежала еа пределами чувствительности цптофотоштрического метода. На 14 и 35 дни фиксации средние значения, характер варьирования содержания ДНК-фуксина, а также уровни потерь ДНК-фуксина (соответственно, 30 и 29Х) в ответ на действие ДНКази I были практически таким т как н контроле.

ОБСУЩШШВ

Если опираться на данные по кинетике сперматогенеза у мыта ft (Ibistrich, 1986), то тогда сильное снижение или полное отсутствие пахитенных сперыагоцитов и округлых сперматид , соот-вэтственно, на. 14 п 21 дай фиксации, следует рассматривать как результат губительного действия дкпкна на активно пролиферирущда спэрьатогонки тгаов А1 - А4 и спэриагогонии типов А-спаренныэ п А-групповыэ. Сильное снижение или полное отсутствие пахитенных сперизтоцптов па 21 день после введения 1ШШ дипина свидетельствует об частичной унввгажкти стволовых клеток. Тот факт, что об-CJ39 чксяо спэрштогониев фактически яе отличается от нормы в пер-еш 3-14 дней, а спустя 21 день- после начала эксперимента увели-шпгсэтся в 1.8 раза, южно объяснить ва счет усиления пролифера-

тиекой истинности увдлэвшнх стволовых кл9ток.

. Ез 35 день после воздействия дипина в дозе 30 «г/кг число епзршюоцитов па стадии пахитекы есэ не достигало походного копт-рольного уровня. Вэзиэжно , это связано с гпбельп кяэток-прэд-GJCTB9HHTIK0B са стадии преяептотвна-лептотзкы или во время дёлз-Ешл спэрттогонпэв. Ранее бшо показано (OsJcbere, 1959; Lu et al., IPSO), что, по крайней гарэ, посла iaitoTsra иолпзируг^пс га-лучэняЯ зтп клэткя H5 развивается п погибшог.

lii ввдм текгз, что чэрзв 100 дпзй посгэ воздействия дгокпа чгода тестикулярннж спермпэа, а отличие от сперматоцитов и округлых спэрштпд, ровгео снижается. Однако па работы С. Т. Вахпдовв (1993), готор\А гаучал 'л гае отдахэяки последствия следует, что в конечном сч»те чксяо твсггскулярных слчршэв иояэт достигать

нормы.

Судя по тому, что число тестикулярных спермиев в течение первых трех недель эксперимента не уменьшалось, дипин не оказывал цитотокснческого действия на округл» сперматиды и сперматоциты, преимущественно находящиеся на стадии средней пахитены. Эти наш наблюдения хорошо коррелируют с данными, говорящими о том,что поздние сперматоциты, сперматиды и спермии малочувствительны к цитотоксическим эффектам радиации, апкилирующих агентов, лекарств (Oakberg, 1955; Msistrich it al., 198Z;Visil, Bustos-Obrejon, 1987).

Атрофия семенников, a также морфологические аномалии ядер и клеток сперматогенного эпителия, его размывание, лимфоидяая инфильтрация, выявленные в семенниках мышей, подвергшихся однократному, воздействии дипина, во многом сходны с теми, что были обнаружены при действии циклофосфомида, прокарбазина (противоопухолевые: препараты), акршюнитрила (мономер, используемый в производстве полимеров), некоторых пестицидов, электромагнитных и влектрических полей (Gould et al., 1983; Tandon et al., 1088; Eroschenko et al., 1977, fcfcCall, Eroschenko, 1988; van Beek, Ualstnch, 1992; Шахматова, 1994).

Пэявленке больгого числа округлых сперматвд с мнкроядрамн на 3 и 14 дни после введения мышам дипина свидетельствует о генетической чувствительности мэйоцитов, которыэ в юмент воздействия находились, соответственно, на стадиях поздней пахитены-диакина-еа. Что касается спэрмвтогониальных клеток, то в данной клеточной популяции микроядра продолжали встречаться с частотой достоверно превышающей таковую в семенниках контрольных кьией. Итак, видно, что генетически аберрантные стволовые клетки, давая начало дифференцирующимся сперыатогониям, все жэ не обеспечивает дальнейшее развотно последних и их Оевболезнэнное прохождение черев мейотн-чоскне гчления.

Как показали цетофотометряческкв измерения, зпядидкмалыше спермин подопытных шавй на 14 двкь фиксация отлячалжсь от гамвг коятрояьшс животных боль вей гетерогенностью .»о содержания ДВК-фунсня», в га 36 дмп посж» действия дкпияа - ■ снижением со-йардаяяя ДЩ-фукси®. Снкееня» содержания ДКЕ-фуксина может прксходить как s сдую* вару®енаа кшгаэствгнвого состава сперад-еег»1«№>ч&с8й2 asss {см. Вахгзаз, Î9SS3Î. s пра так иазкзэд-

.мои явлении сверхстабилизации хроматина, когда в результате интенсивного окисления свободных тиолов, например, при длительном хранении эйякулятов m vitro (Salisbury, Hart, 1970) или при некоторых других условиях (см. Hicolle et al., 1985), образуются дополнительные дисульфидные связи в хроматине гамет. Поэтому снижение количества ДНК -фуксина в пакитенных сперматоцитах и эпиди-дималышх спермиях мышей через 35 дней после действия дипина может быть связано с модификациями структуры хроматина. Возможно, это справедливо в отношении спермиев, которые несут свое происхождение от клеток, представлявших собой на 14 день фиксации округлые сперматиды, ядра которых в сравнении с коьгролем более интенсивно окрашивались и проявили чрезвычайную чувствительное.i к действию ДНКазы I. Что яв касается пахитенных спермагоцитов, то •нехватка ДНК-фуксина в них может отражать нарушения преиейоти-чесгого синтеза ДНК. Такие клетки, если вступают в деления, могут давать начало спериатидаы и спермияи с нарушенным, сильно вариабельным содержанием ДНК. Наш цитохимические данные также показывают, что дипин вызывает сильные изменения в харак ере хроматина клеток Сертоли. Сднако выявленная на 35 день после действия этого мутагена нормализация содержания ДНК-фуксина, ее сходная с нормой реакция на действие ДКазы .1 позво^ет нам говорить либо о начале восстановления исходной структуры хроматина в поврежденных клетка* Сертоли, либо о формировании.новой клеточной популяции.

ВЫВОДЫ

1. Гистологические и цитологические- наблвдения обнаружили в семз книгах мышей, подвергшихся действию химического мутагена дипина, широкий спектр клеточных, ядерных и хромосомных аномалий на всех изученных стадиях сперматогенеза

2. Наибольшую чувствительность к цитотоксическиы эСфектаы дипина обнаружили шгготичвеки делящиеся спериатогонии; мейоти-чэекке н поспе Логические клетки сохраняли способность нормально-раввиааться.

3. Высокая частота встречаемости спермвтогоние^ с микроядра-ии я зпидидишльных спермиев с аномальной формой "оловок ^на отдаленных сроках Фиксации свидетельствует о необратимости индугчро-

ванных дипином генетических изменений в стволовых половых клетках.

4. Повреждающие эффект« дипина на первичные ^половые клетки имеюгг отдаленные последствия, выраженные - в зависимости от дозы -ревкии уменьшением пула спермагоцитов I порядка, сперматид и слермиев.

Б. Шявление среди клеток Сертоли ыитотических фигур, аберрантных форм (микроядра, мосты, даундерность) в ответ на действие дипина указывает на возможность перехода этих высокодифферотированных клеток к митотическим делениям, что, вероятно, и приводит К обновление данной клеточной популяции.

б. цитохимический анализ показал сильные нарушения структуры хроматина в развивающихся сперматогенных клетках и клетках Сертоли мышей после действия дипина. Эти нарушения выражаются в неадекватной чувствительности ДНК к действию ДННазы I.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ Ю ТШ ДОСЕРГАЦИИ

1. С. Т.Захидов, Л П. Дэраяткюш, Хода. А. X ЬЕахран, Эль-Саед Касем Абдель-хади, а А. Голиченков. 1994. Влияние химических мутагенов на сперматогенез млекопитающих. Онтогенетический ввалив// Иввестия РАН, сер. бйол., N 3, с. 1 -16.

2. С.Т.Захидов, В.А.Голиченков, Яэда X А. 1Ьхраи, Л.П. Пара-нппкнна. 1994. Некоторые аспекты атипичного сперматогенеза в связи с проблемой мужской стерильности// Вест. Моск. Унив., Биология,

N 4 ( в печати).

а С. Т.Захидов, ДЕШраншкияа, Яэда А.Х Шхран, Эль-Саед Абдель-хади, В. А. Голиченков. 1894. Влияние химических мутагенов на сперматогенев млекопитающих. Количественная оценка// Известия РАН, сер. Сиол., N Б ( в печати).

4. С. Т.Захидов, Т. Д Мартах, Яэда А.XШхран, Е А.Голхченхов. 1994. Цитохимическое исследование влияния химических мутагенов на. хроматин раввнводцихся сперматогенных к»тс;, лвй// Известия РАН, сер. Смол, (в печати). ,