Особенности лечения повреждений кожи у животных

Григорьев, Георгий Евгеньевич

Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему
Особенности лечения повреждений кожи у животных
ВАК РФ 06.02.02, Кормление сельскохозяйственных животных и технология кормов

Автореферат диссертации по теме "Особенности лечения повреждений кожи у животных"

На правах рукописи

ГРИГОРЬЕВ Георгий Евгеньевич

особенности лечения повреждений кожи у животных

(клинико-экспериментальное исследование)

06.02.02 - ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология 06.02.01 - диагностика болезней и терапия животных, патология, онкология и морфология животных

АВТОРЕФЕРАТ

на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук

1 5 мдр 2012

Барнаул-2012

005014254

Работа выполнена в ФГОУ ВПО «Иркутская государственная сельскохозяйственная академия» (Иркутск) на кафедре анатомии, физиологии, патофизиологии, акушерства, гинекологии и биотехнике размножения животных; Учреждении Российской академии медицинских наук Научном центре реконструктивной и восстановительной хирургии Сибирского отделения РАМН в научном отделе экспериментальной хирургии с виварием (Иркутск).

Научный руководитель: доктор ветеринарных наук,

профессор Ильина Ольга Петровна

Научный консультант:

доктор биологических наук Лепехова Светлана Александровна

Официальные оппоненты:

доктор ветеринарных наук,

доцент Медведева Лариса Вячеславовна

(Алтайский государственный аграрный университет) кандидат ветеринарных наук Бокова Татьяна Владимировна

(Алтайская краевая ветеринарная лаборатория)

Ведущее учреждение:

Государственное научное учреждение Научно-исследовательский институт ветеринарии Восточной Сибири Российской академии сельскохозяйственных наук

Защита состоится «29» марта 2012 г. в «10» часов на заседании диссертационного совета Д 220.002.02 при Алтайском государственном аграрном университет на факультете ветеринарной медицины по адресу: 656922, Алтайский край, г. Барнаул, ул. Попова, 276, тел./факс 8-3852-31-39-70.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке факультета ветеринарной медицины Алтайского государственного аграрного университета

Автореферат разослан «_»_2012 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

Барышников П.И.

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Тактика лечения инфицированных повреждений кожи относится к числу важных разделов ветеринарии, так как эта патология наносит значительный экономический ущерб крупным специализированным и фермерским хозяйствам. Расходы на лечение, потери молока, мяса, особенно преждевременная выбраковка животных, влияют на формирование стада и его воспроизводс тво (Елисеев А.Н. с соавт., 2000; Потапова А.Н., 2008; Новиков П.В., 2010; Архипов A.A., 2011).

В условиях специализированных животноводческих комплексов, фермерских хозяйств и личных подворий с определенным уровнем механизации и конструктивными недостатками помещений, а также при неподготовленности скота к групповому содержанию наиболее частой причиной повреждений кожи является травматизм, осложненный полиинфекцией. Раневая инфекция является, как правило, постоянным спутником каждого механического повреждения тканей животного. При развитии раневой инфекции возможно не только нарушение регенерации и эпителизации повреждений кожи, но и осложнение сепсисом (Елисеев А.Н. с соавт., 2000; Веремей Э.И. с соавт., 2004; Гимранов В.В. с соавт., 2006).

Клинический опыт, накопленный в области теории и практики лечения повреждений кожи, свидетельствует о том, что даже применение самых эффективных средств не снижает риск возникновения различных осложнений (Даценко Б.М., 1995; Алексеева И.В., 2006).

Широкое применение антибиотиков, эффективность которых в начале была высокой, в дальнейшем, привело к возникновению ряда сложных проблем, мутагенное действие антибиотиков на патогенную микрофлору обусловили изменение как этиологической структуры гнойной инфекции, так и биологических свойств микробной клетки с появлением ангибио-тикорезистентных штаммов (Киричек Л.Т., 2003; Фадеева Т.В., 2007; Потапова А.Н., 2008).

Эта проблема указывает на необходимость пересмотра мнения о монопольном положении антибиотиков и переходе на более обоснованную стратегию и тактику лечения пюйносептических инфекций, включая интерес к забытой группе антибактериальных препаратов - антисептиков (Страчунский JI.C. с соавт., 2000; Григорьев Е.Г., 2005; Фадеева Т.В., 2007).

Исходя из этого, были определены цель и задачи исследования.

Цель работы: изучить антибактериальную активность антисептика «Ана-видин» in vitro и обосновать его применение для профилактики и лечения повреждений кожи у сельскохозяйственных животных.

Задачи исследования

1. Разработать модель инфицированного повреждения кожи у крыс, которая позволит изучать антибактериальные и биологические свойства новых препаратов. Установить количественные изменения микробного состава на модели, инфицированного повреждения кожи при обработке «Анавидином» в динамике исследования.

2. Изучить антибактериальные свойства антисептика «Анавидин» in vitro.

3. Оценить влияние антисептика «Анавидин» на изменения в иммунологическом ответе показателей 1-го порядка при заживлении инфицированных повреждений кожи.

4. Дать морфологическую оценку заживления инфицированных повреждений кожи под влиянием антисептика «Анавидин».

5. На основании проведённых экспериментальных исследований разработать рекомендации для патогенетически обоснованного метода профилактики и лечения инфицированных повреждений кожи у сельскохозяйственных животных.

Научная новизна

Разработан способ моделирования инфицированного повреждения кожи с контролируемыми параметрами, включающими бактериальную обсеменен-ность раны, глубину и площадь повреждения, которая может быть использована в хроническом эксперименте для изучения антибактериальных и биологических свойств новых препаратов.

Выявлено, что «Анавидин» обладает стимулирующим регенерацию и заживление инфицированного повреждения кожи, вследствие антибактериального и противовоспалительного действия. Показано, что преобладание фибробла-стов в грануляционной ткани у животных опытной группы обеспечивает более быстрый темп созревания соединительной ткани, чем в контроле, на 3^4 дня.

Получены данные об антибактериальных свойствах антисептического препарата «Анавидин» в исследованиях in vitro и in vivo.

Установлено, что 0,02% водный раствор «Анавидина» обладает выраженным ранозаживляющим действием при инфицированных повреждениях кожи, способствуя заживлению их в более ранние сроки.

Показано, что при использовании водного раствора «Анавидина» на молочной ферме КРС после обработки помещений фермы и оборудования контактирующего с выменем коровы, позволило снизить обсемененность обследованных предметов микроорганизмами с 60 % до нулевых величин.

Исследование инфицированных повреждений кожи у КРС выявило следующий видовой состав бактерий, чувствительных к антисептику «Анавидин»: (104) КОЕ - Ps. aeruginosa, Klebsiella spp., Fusobacterium necrophorum; Enterobacter agglomerans; Proteus mirabilis; Acinetobacter baumanii; Acinetobacter Iwoffi;

Bacillus spp.; (103) КОЕ - Enterobacter aerogenes, St. epidermidis, St. aureus, Cl. perfringens, E. coli.

Теоретическая и практическая значимость работы

Антисептик «Анавидии» стимулирует регенерацию и заживление инфицированной кожной раны путем активации пролиферации фибробластов и обеспечивает быстрый темп созревания грануляционной ткани в оформленную соединительную ткань и эпителизацию повреждения.

В исследовании in vitro определена минимальная концентрация раствора «Анавидина», которая обладает бактерицидным действием в отношении (109) КОЕ Е. coli и микста Ps. aeruginosa и Е. coli.

Экспериментально обоснована возможность применения 0,02% водного раствора антисептика «Анавидин» для профилактики и лечения гнойных ран сельскохозяйственных животных в ветеринарной клинике.

Внедрение результатов научных исследований

Разработанная модель инфицированной кожной раны у животных, позволяющая изучать новые методы лечения инфицированных ран, внедрена в научном отделе экспериментальной хирургии с виварием НЦРВХ СО РАМН.

Материалы диссертационного исследования используются в учебном процессе кафедры госпитальной хирургии ГБОУ ВПО «Иркутский государственный медицинский университет», Научного центра реконструктивной и восстановительной хирургии СО РАМН и кафедры анатомии, физиологии, патофизиологии, акушерства и биотехники размножения животных ИрГСХА.

Положения, выносимые на защиту

1. Водный раствор «Анавидина» в концентрации 0,02 % эффективен в лечении инфицированных повреждений кожи путем активации репаративных процессов в соединительной ткани и эпителии, оказывает антибактериальное, противовоспалительное действие.

2. Инфицированное повреждение кожи с контролируемыми параме трами бактериального обсеменения раны, глубиной и площадью повреждения позволяет оценивать антибактериальную активность антисептика «Анавидин».

3. Концентрация 0,0015% раствора «Анавидина» обладает антибактериальной активностью в отношении антибиотикорезистентных штаммов микроорганизмов in vitro. Применение раствора «Анавидина» позволило снизить контаминацию помещений и оборудования фермы до нулевых значений.

Апробация основных положений работы

Основные результаты проведенного исследования доложены и обсуждены на: I съезде хирургов Сибири и Дальнего Востока (Улан-Удэ, 22- 24 июня 2005 г.); Международной научно-практической конференции «Актуальные во-

просы электрофизиологии и незаразной патологии животных» (Улан-Удэ, 26-28 июня 2009 г.); II Сибирском ветеринарном конгрессе «Актуальные вопросы ветеринарной медицины» (Новосибирск, 25-26 февраля 2010 г.); II научно-практической конференции молодых ученых Сибирского и Дальневосточного федеральных округов (Иркутск, 7-8 октября 2010 г.); XI Международной Байкальской научно-практической конференции по проблемам ветеринарной медицины (Иркутск, 15-16 марта 2011 г.).

Основные положения диссертационной работы доложены и обсуждены на заседаниях ученого совета НЦРВХ СО РАМН (сентябрь 2010 г.). По материалам диссертационного исследования опубликовано 10 работ, в т.ч. 6 статей в журналах рекомендованных ВАК Минобразования и науки, получен патент на изобретение Российской Федерации, разработаны методические рекомендации. В опубликованных работах изложены основные положения диссертации.

Структура и объем диссертации

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, главы о материалах и методах исследования, трех глав собственных наблюдений, заключения, выводов, практических рекомендаций, указателя литературы.

Текст изложен на 128 страницах, иллюстрирован 22 таблицами и 14 рисунками. Библиография включает 135 источников, из них 126 отечественных и 9 иностранных авторов.

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Работа является итогом научных исследований, выполненных автором в соответствии с планом научно-исследовательской работы, проводимой сотрудниками НЦРВХ СО РАМН (номер государственной регистрации 01200951068).

Работа выполнена на основании стендовых экспериментов in vitro-, двух серий хронических экспериментов in vivo на белых крысах-самцах линии Ви-стар 6-месячного возраста с массой тела 200-250 г. В клинический фрагмент исследования вошли результаты лечения гнойных повреждений кожи у КРС (коровы).

Общая характеристика экспериментального материала in vitro

Экспериментальные микробиологические исследования выполнены в лаборатории бактериологии (лицензия № 99-01-001275 от 10.03.05 г. выдана Федеральной службой по надзору в сфере здравоохранения и социального развития) НЦРВХ СО РАМН (зав. лабораторией - д.б.н. Т.В. Фадеева).

Исследования in vitro в количестве 192 стендовых опытов выполнены для подбора наименьшей концентрации антисептиков с высокой антимикробной активностью, в отношении штамма Е. coli и микста Е. coli + Ps. Aeruginosa, выделенных из инфицированных повреждений кожи больных коров. В первой

серии экспериментов проведено сравнительное исследование антибактериальной активности «Анавидина» и хлоргексидина биглгоконата в отношении

Е. coli 109 КОЕ/мл.

Использовали следующие концентрации водного раствора «Анавидина» и водного раствора хлоргексидина бипноконата: 0,1 %, 0,05 %, 0,02 %, 0,01 %, 0,005 %, 0,003 %, 0,0015 % и 0,001%.

В третьей серии исследований in vitro проведено бактериологическое исследование объектов внешней среды в помещениях фермы и доильной аппаратуры на все виды микроорганизмов до и после обработки антисептиком «Анавидин» для выявления уровня микробной контаминации и определения видового состава бактерий.

Приготовление суточной культуры микроорганизмов

Культуры Е. coli и Ps. aeruginosa сохраняли на твердых питательных средах с периодическим пассированием на средах обогащения в термостате при температуре 37 °С в течение 18-24 часов. Полученную кулмуру смывали теплым стерильным раствором натрия хлорида и стандартизировали до Ю'КОЕ в миллилитре (КОЕ/мл) по стандарту мутности (методика Института стандартизации и контроля биологических препаратов им. JI.A. Тарасевича, Москва).

Общая характеристика экспериментального материала in vivo

Исследование проводили в научном отделе экспериментальной хирургии с виварием НЦРВХ СО РАМН (заведующая - д.б.н. С.А. Лепехова) под руководством д.б.н. С.А. Лепеховой fia белых крысах-самцах линии «Вистар» 6-месячного возраста с массой тела 200-250 г.

Животных содержали в условиях вивария при свободном доступе к воде и пище, что соответствует нормативам ГОСТа «Содержание экспериментальных животных в питомниках НИИ» (виварий I категории, вет. удостоверение 238 № 0015220 от 25 марта 2009 г, служба ветеринарии Иркутской области). Опыты на животных выполняли в соответствии с правилами гуманного обращения с животными, регламентированными «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных», утвержденными Приказом МЗ СССР № 742 от 13.11.84 г. «Об утверждении правил проведения работ с использованием экспериментальных животных» и № 48 от 23.01.85 г. «О контроле за проведением работ с использованием экспериментальных животных». Все оперативные вмешательства проводили в стерильных условиях иод общим обезболиванием.

Способ моделирования инфицированного повреждения коз/си

Предложена модель инфицированного повреждения кожи (патент на изобретение РФ№ 2431890 «Способ моделирования инфицированной кожной раны»),

В асептических условиях и под общей анестезией животное фиксировали на столике А.И. Сеченова в положении на животе. После подготовки операционного

поля, в области спины выполняли иссечение кожи и подкожно-жировой клетчатки площадью 4 см2 (рис. 2.1). Края дефекта подшивали к подлежащим тканям атравматичной иглой с рассасывающейся лигатурой 4/0 с шагом 5 мм (рис. 1).

мп^тиЙЦИПуИЦИи

г з ■

Рис. 1. Нанесение кожного дефекта размером 4 см2 (А), подшивание краев дефекта (Б).

Дополнительно каждый угол дефекта был прошит отдельным диагональным швом (рис. 2). Через 3 суток после нанесения повреждения иссекали образовавшийся струп, некротизированные ткани. Затем рану обрабатывали раствором антисептика и промывали физиологическим раствором. На обработанную поверхность повреждения кожи с размещением под угловые диагональные швы устанавливали полупроницаемую мембрану. Под установленную полупроницаемую мембрану вводили бактериальную суспензию, содержащую 0,5 мл Е. coli 109 и 0,5 мл Ps. aeruginosa 109 КОЕ (выделенных из раневого отделяемого коров).

с'

т / .

\ ■■;/,. Л.

Лс ..

- уда

Vv •

Рис 2. Дополнительные диагональные швы (А), установка полупроницаемой мембраны и введение инфекта (Б).

Через сутки после инфицирования повреждения кожи животных относили к экспериментальным группам методом случайного распределения, таким образом, в исследование вводили животных с инфицированным повреждением кожи. Отправной точкой эксперимента была обработка инфицированного повреждения кожи препаратом, определяющим в дальнейшем их групповую принадлежность. Работа выполнена на основании 2 серий

хронических экспериментов.

В первой серии опытов (30 крыс) у животных изучали влияние на микрофлору инфицированных повреждений кожи и площадь раневой поверхности в динамике эксперимента на 1-е, 3-й, 7-е, 9-е, 11-е, 19-е сутки обработок физиологическим раствором (КГ-1), 0,02% раствором хлоргексидина би-глюконата (КГ-2), 0,02% водным раствором антисептика «Анавидин» (ОГ). Санацию инфицированного повреждения кожи выполняли каждый день, на протяжении 19 суток. Планиметрию раны проводили по методу K.M. Фен-чина (1979).

Во второй серии экспериментов (124 животных) проводили исследование по разработке модели и изучению показателей гомеостаза (иммунологические тесты, OAK) и морфологии участка кожного дефекта с прилегающими неповрежденными тканями под воздействием физиологического раствора (КГ-1), 0,02% раствора хлоргексидина биглюконата (КГ-2), 0,02% водного раствора антисептика «Анавидин» (ОГ).

Методика забора материала

Животных во всех группах выводили из эксперимента на 1-е, 3-й, 5-е, 7-е, 9-е, 11-е, 19-е сутки (по 6 животных в каждой группе). Проводили забор крови для оценки выбранных показателей, аутопсию и забирали участок поврежденной кожи с окружающими тканями для последующего гистологического исследования.

Забор материала проводили у всех крыс в утренние часы.

Общая характеристика клинического материала

Клинический раздел исследования выполнен в учебном хозяйстве «Молодежный» (гл. зоотехник - Р.И. Бидогаева) ИрГСХА (ректор - к.э.н., Ю.Н. Ва-шукевич) под руководством д.в.н., профессора О.П. Ильиной на основании анализа результатов лечения 18 коров. Критерием включения в данное исследование явились: наличие гнойного кожно-мышечного повреждения не более 10 см2 с локализацией на латеральной поверхности бедра. Распределение КРС на группы в зависимости от выбранного лечебного воздействия представлено в таблице 1.

Выполняли бактериологические исследования на 1-е, 3-й, 7-е, 14-е сутки от начала санации повреждений кожи выбранным препаратом.

Распределение КРС на группы Таблица /

№ группы Характер воздействия Количество животных

КГ-1 Кожно-мышечное повреждение на бедре КРС с ежедневной обработкой ран физиологическим раствором 6

КГ-2 Кожно-мышечное повреждение на бедре КРС с ежедневной обработкой ран 0,02% раствором хлоргексидина биглкжоната 6

ОГ Кожно-мышечное повреждение на бедре КРС с ежедневной обработкой ран 0,02% водного раствора «Анавидина» 6

ИТОГО 18

Характеристика методов исследования

Бактериологические методы исследований

Комплекс бактериологических методов исследования предусматривал в первую очередь посевы материала на твердые и жидкие питательные среды в соответствии с инструкцией.

В качестве объектов микробиологических исследований при инфицированных повреждениях кожи исследовали гнойное отделяемое для выявления уровня микробной контаминации и определения видового состава бактерий. Материал отбирали при строгом соблюдении правил асептики. Образцы помещали в пробирки с виноградно-сахарным бульоном и сразу доставляли в лабораторию. Пересев на твердые питательные среды (5% кровяной агар, молочно-желточно-солевой агар, среда Эндо, Сабуро) осуществляли стандартной петлей методом секторальных посевов (метод Gould в модификации Рябинского - Родомана). Чашки инкубировали при температуре 37 °С в течение 18-24 часов, после чего подсчитывали число колоний, выросших в разных секторах.

Вид, биохимический профиль выделенных микроорганизмов, определение резистентности микроорганизмов к различным антибактериальным препаратам (метод серийных разведений) осуществляли с помощью автоматизированных бактериологических анализаторов «Autosceptor» (Becton Dickinson, США) и «АТВ Expression» фирмы «Biomerieux» (Франция), согласно прилагаемым к анализаторам инструкциям по их эксплуатации. Бака-нализаторы определяют более 800 видов микроорганизмов и более 9000 их биохимических профилей (большинство из них недоступны для определения классическими методами).

В качестве объектов микробиологических исследований в клинике исследовали отделяемое из ран коров. В помещениях фермы проведено бактериологическое исследование объектов внешней среды, доильной аппаратуры на все виды микроорганизмов до и после обработки новым сибирским антисептиком «Анавидин» для выявления уровня микробной контаминации и определения видового состава бактерий.

Иммунологические и общеклипические методы исследований Иммунологические исследования проводили в лабораторном отделе Центральной научно-исследовательской лаборатории (заведующий - к.м.н., доцент A.B. Стародубцев) Иркутского государственного института усовершенствования врачей (ректор - Д.М.Н., профессор В.В. Шпрах). Для определения параметров фагоцитарной реакции нейтрофилов крови использовали убитые при температуре 80-90 °С клетки дрожжей Saccharomyces cerevisiae. Оценивали фагоцитарный показатель (фагоцитарная активность или фагоцитарный индекс)

- процент фагоцитов из числа сосчитанных нейтрофилов и фагоцитарное число

- среднее число дрожжей, поглощенных одним активным нейтрофилом. Для оценки степени антигенной раздраженности неактивных in vitro гранулоцитов крови исследовали спонтанный тест восстановления нитросинего тстразолия (НСТ-тест), выражая результаты в процентах. Активированный НСТ-тест (%) проводили для оценки функционального кислородозависимого механизма бак-терицидности фагоцитов. Определение циркулирующих иммунных комплексов (ЦИК) проводили по стандартной методике Гриневича.

Общий анализ крови выполняли стандартными методами с подсчетом количества эритроцитов, лейкоцитов и лейкоцитарной формулы.

Планиметрическое исследование

Планиметрию дефектов кожи проводили по методу K.M. Фенчина. На дефект накладывали прозрачную пленку, и на ней чернилами обрисовывали контуры. Зная массу 1 см пленки, рассчитывали площадь повреждения но формуле:

S = (Si х М) / Mi,

где: S - площадь повреждения; Si - площадь 1 см2; Mi - масса 1 см2 пленки; М - масса очерченной пленки.

Повторное исследование площади повреждения позволяет определить динамику регенеративных процессов и установить процент уменьшения площади повреждения за сутки по следующей формуле:

V = (S-Sn)x ЮО/St, где: V - % уменьшения повреждения за сутки; S - площадь повреждения при предыдущем измерении; Sn - площадь повреждения при данном измерении; t - число дней между измерениями Методы морфологического исследования

Исследование проведено на базе лаборатории патоморфологии НЦРВХ СО РАМН (заведующий - к.м.н. O.A. Гольдберг). Заготовленный материал фиксировали в 10% нейтральном формалине. Проводка материала проводилась в автомате для вакуумной проводки VIP-E150F фирмы «Sacura» (Япония). Заливка в системе для автоматической заливки материала в парафин «TEC-IV» фирмы «Sacura» (Япония).

Резка стандартных серийных срезов толщиной 3 мкм проводилась на полуавтоматических роторных микротомах СМ-502 фирмы «Microm» (Германия) с использованием одноразовых ножей на трех уровнях (перпендикулярно оси кожного дефекта).

Покраска срезов гистологическими методиками осуществлялась в автомате для покраски срезов DRS-601А фирмы «Sacura» (Япония).

Покрытие срезов на предметных стеклах покровными стеклами в автомате Cover Tech фирмы «Microm» (Германия).

Микроскопическое исследование препаратов проводилось с помощью компьютерной микроскопической видеосистемы «Quantimet 550IW» фирмы «Leica» (Англия) для цифрового анализа патоморфологического и цитологического материала и углубленной диагностики с камерой высокого разрешения, позволяющей проводить количественный анализ изображения по реальным цветам или оптическим плотностям с форматом изображения 6000 * 4000 пикселей.

Срезы окрашивали гематоксилином и эозином, азуром и эозином, гематоксилином и пикрофуксином [81].

Методы статистической обработки результатов

Данные представляли в виде медианы с нижним и верхним квартилями (25-й и 75-й процентили). При нормальном распределении в выборке данные представлены в средних величинах со средней квадратической ошибкой.

Величины, выраженные в процентах, приведены в тексте с ошибкой процента. Определение значимости различий полученных данных (р) в сравниваемых выборках проведено по критериям Манна - Уитни (U), Вилкоксона (W).

Корреляционный анализ данных в выборках с ненормальным распределением проводили с применением непараметрического коэффициента корреляции Спирмена (R).

Критический уровень значимости при проверке статистических гипотез в данном исследовании принимался равным 0,05.

Статистическая обработка результатов произведена с помощью статистического пакета программ.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Целью нашего исследования стало изучение антибактериальной активности антисептика «Анавидин» in vitro и обоснование его применения для профилактики и лечения повреждений кожи у сельскохозяйственных животных.

На первом этапе данного исследования в эксперименте in vitro мы изучали антибактериальную активность антисептика «Анавидин» для подбора минимальной концентрации антисептика, которая бы подавляла рост антибиотикоре-зистентных штаммов микроорганизмов полученных из отделяемого ран коров.

Для сравнения антимикробного действия применяли весьма близкий аналог «Анавидину» - хлоргексидина биглюконат. Он также является производным гуанидина, но вместо фосфатных ионов (как у анавидина) содержит

хлорфенильные радикалы.

Эксперимент выполнен на основании проведения трех серий опытов т vitro. В первой серии экспериментов проведено сравнительное исследование антибактериальной активности «Анавидина» и хлоргексидина биглюконат в

отношении Е. coli 109 КОЕ/мл.

Согласно литературным данным, в инфицированных повреждениях кожи животных наиболее часто встречаются грамотрицателъные возбудители - 90 %, среди которых эшерихии составляют 32,5 %, синегнойная палочка - 30,2 %.

Концентрации 0,1,0,05,0,02,0,01,0,005,0,003,0,0015 % водного раствора «Анавидина» и водного раствора хлоргексидина биглюконата, снижали количество микроорганизмов с 109 до нулевых значений КОЕ/мл, пробы становились стерильными (рис. 3).

Анавидин 0,1; 0,05; 0,02; 0,01; 0,005; 0,003; 0,0015% 10э КОЕ/мп----------и

109 КОЕ/мл Отсутствие роста микроорганизмов

Хлоргексидин 0,1; 0,05; 0,02; 0,01; 0,005; 0,003; 0,0015%

— л

Анавидин 0,001 % Хлоргексидин 0,001 % 109 КОЕ/мл 103 КОЕ/мл ри = 0,02 10* КОЕ/мл

Рис. 3. Результаты антибактериальной активности антисептика «Анавидин-. в отношении штамма Е. coti.

Однако концентрация антисептиков 0,001 % не подавляла рост микроорганизмов при добавлении водного раствора анавидина - количество li.coli достоверно снижалось с 109 до 103 КОЕ/мл {ра< 0,05); водного раствора хлоргексидина биглюконата до 104 КОЕ/мл. Следует отметить, что водный раствор 0,001% «Анавидина» подавлял рост микроорганизмов более эффективно, чем водный раствор 0,001% хлоргексидина биглюконата (рц = 0,003).

Во второй серии стендовых экспериментов проведено сравнительное исследование антибактериальной активности «Анавидина» и хлоргексидина биглюконат в отношении микста Е. coli + Ps. aeruginosa 109 КОЕ/мл, так как, согласно литературным данным наиболее часто во всех пораженных тканях крупного рогатого скота регистрируют полиинфекцию.

Выявлено, что при концентрации антисептиков 0,0015 % и 0,001 % отмечается рост микроорганизмов. Использование водного раствора 0,0015% «Анавидина» позволяет достоверно снизить количество Е. coli с 109до 0 КОЕ/мл, a Ps. aeruginosa - с 109 до 103 КОЕ/мл (р,,< 0,05). Водный раствор хлоргексидина биглюконата в концентрации 0,0015 % снижает количество Е. colic 109до 103 КОЕ/мл, a Ps. aeruginosa- с 109 до 104 КОЕ/мл О(/<0,05). Следует отметить, что «Анавидин» подавлял рост микроорганизмов более эффективно, чем хлоргексидин биглюконат (ри< 0,05). Дальнейшее снижение концентрации приводит к увеличению бактериальной контаминации (рис. 4).

Анавидин 0,1; 0,05; 0,02; 0,01; 0,005; 0,003% 109 КОЕ/мл

Отсутствие роста микроорганизмов

Хлоргексидин 0,1, 0,05; 0,02; 0,01; 0,005; 0,003 % 109 КОЕ/мл

Анавидин 0,0015; 0,001 % Хлоргексидин 0,00150,001 % ^О^КОЕЛ^ 109 КОЕ/мл 10'КОЕ/мл Ри = 0,02 10s КОЕ/мл

Рис. 4. Результаты антибактериальной активности антисептика «Анавидин» в отношении микста £ coli + Ps. Aeruginosa.

В доступных литературных источниках мы не встретили данных о бактериологических исследованиях объектов внешней среды ферм, доильной аппаратуры на все виды микроорганизмов с использованием автоматизированных бактериологических анализаторов. Баканализаторы определяют более 800 видов микроорганизмов и более 9000 их биохимических профилей (большинство из них недоступны для определения классическими методами).

о 20 40 60 80 100 120 ^положительные результаты р/о) Шсанитарно-локаэательные виды (/<,)

Рис. 5. Микробная обсемененность молочной фермы. 14

В третьей серии исследований in vitro проведено бактериологическое исследование объектов внешней среды в помещениях фермы, доильной аппаргпуры (рис. 5) на все виды микроорганизмов до и после обработки ан тисептиком «Анавидин» с использованием автоматизированных бактериологических анализаторов «Autosceptor» (Becton Dickinson, США) и «АТВ Expression» фирмы «Biomerieux» (Франция).

После обработки 1% водным раствором «Анавидина» объектов внешней среды фермы как зоны наиболее высокого риска передачи инфекции, показали, что в целом по обследуемым помещениям процент высеваемости микроорганизмов достоверно снизился в 4 раза (ри = 0,001). Выявлено полное исчезновение санитарно-показательных микроорганизмов с 32,6 % до 0 (табл. 2).

Таблица 2

Результаты исследования антимикробной активности «Анавидина» в помещениях фермы

До и после обработки Кол-во положительных Кол-во

Виды Кол-во результатов (% ± Sp) видов

исследовании всего из них санитарно-показательных микроорганизмов

ДО 48 33 (68,7 ±2,9) 16 (32,6 ±2,0) 20

Ферма после 46 8 (17,3 ±3,0) 0 3

р - р = 0,001 р = 0,002 -

до 20 7 (35 ± 2,7) 1 (12,5 ± 1,4) 7

Бидоны после 20 1 (5± 1,4) 0 2

р - р = 0,003 р = 0,62 -

Доильные стаканы ДО 10 6 (60 ± 7,9) 2 (25 ± 5,5) 14

после 10 0 0

р - р = 0,0001 р = 0,002 -

Применение 1% водного раствора «Анавидин» для влажной уборки помещений фермы и оборудования, контактирующего с выменем коровы, позволяет снизить обсемененность обследованных предметов, что является эффективным методом деконтаминации для профилактики заболеваемости маститами.

При бактериологическом исследовании обсемененности доильных стаканов после обработки 1% водным раствором «Анавидина» удалось снизить контаминацию микроорганизмов с 60 % до нулевых значений.

Дальнейшим этапом экспериментального раздела работы было изучение антибактериальных свойств антисептика «Анавидин» в условиях инфицированного повреждения кожи у экспериментальных животных в отношении микста Ps. aeruginosa + Е. coli в концентрации 1 х 109 КОЕ/мл. При постановке опытов на крысах был использован предложенный нами способ моделирования инфицированного повреждения кожи.

Обсуждая результаты исследования на животных, прежде остановимся на формировании экспериментальных групп. Животные были распределены на группы так, что в КГ-2 инфицированные повреждения кожи обрабатывали

0,02% водным раствором хлоргексидина биглюконата, в ОГ инфицированные повреждения кожи обрабатывали 0,02% водным раствором «Анавидина». Контролем служили крысы, которым инфицированные повреждения кожи обрабатывали физиологическим раствором (КГ-1). Санацию дефектов выполняли каждый день, на протяжении 19 суток.

Так, при бактериологическом исследовании (рис. 6) на 1-е сутки исследования микробное обсеменение инфицированного повреждения кожи в группе КГ-1 составляло 107, а в группе ОГ этот показатель был значимо ниже и составлял 105 (ри= 0,007; 0,02). При обработке инфицированного повреждения кожи хлоргексидина бишюконатом в КГ-2 показатель не имел существенных отличий от КГ-1 (рц= 0,138).

ШЮГ 0КГ-1 ОКГ-2

5 7 9

Сутки исследования

Рис. 6. Влияние антисептика «Анавидин» на микробную контаминацию инфицированного повреждения кожи в эксперименте in vivo.

На 3-й сутки в КГ-1 количество микроорганизмов составило 105, что значимо ниже по сравнению с предыдущими сутками исследования (Pw= 0,01). В ОГ отмечали монотонное снижение микробной обсемененности инфицированного повреждения кожи до 104. В КГ-2 также отмечали снижение микробной обсемененности инфицированного повреждения кожи до 104, что значимо ниже по сравнению с предыдущими сутками (pw = 0,001). При межгрупповом сравнении ОГ, КГ-1, КГ-2 достоверных различий на 3-й сутки не выявлено (рц > 0,05).

На 5-е сутки эксперимента в группе КГ-1 количество микроорганизмов составило 105, что существенно выше, чем в ОГ (рц = 0,001). В ОГ с обработкой инфицированного повреждения кожи антисептиком «Анавидин», микробная обсемененность была прежней по сравнению с предыдущими сутками и составляла 104, что значимо ниже по сравнению с группой КГ-2 (ри = 0,0026).

На 9-е сутки эксперимента в группе КГ-1 количество микроорганизмов составило 105, достоверных различий с этим показателем в предыдущие сутки исследования не выявлено (ри> 0,05), но значимо выше, чем в группе ОГ

(Р;/= 0,0013). В ОГ с обработкой антисептиком «Анавидин» показатель был равен 0, что существенно ниже при сравнении с группой КГ-2 (Ри: ~ 0,01). IB группе КГ-2 микробная обсемененносгь составляла 103. В динамике 11-19 суток выявленная закономерность сохранялась.

Таким образом, выявлено, что микробная обсемененность инфицированного повреждения кожи достоверно снижается уже к 3-м суткам исследования, при обработке 0,02% водным раствором антисептика «Анавидин» и 0,02% раствором хлоргексидина биглюконата, достигая нулевых значений в ipynne ОГ к 9-м суткам исследования, что существенно ниже показателя в КГ-1 и КГ-2 (Ру< 0,05), в КГ-2 санация хлоргексидина биглюконатом приводит к нулевым значениям только к 19-м суткам исследования, при промывании дефектов физиологическим раствором количество микробных тел сохраняется высоким до 19-х суток эксперимента, а преобладающим микроорганизмом в развитии раневого процесса выявлена синегнойная палочка

Полученные данные свидетельствуют о выраженном антибактериальном действии антисептика «Анавидин» в концентрации 0,02% в отношении микста Е. coli 109 КОЕ/мл + Ps. aeruginosa 109 КОЕ/мл внесенного в повреждение кожи.

При клиническом исследовании микробной контаминации кожно-мышсч-ных повреждений у коров (табл. 3) был выявлен следующий видовой состав бактерий: (Ю4) КОЕ была выявлена Ps. aeruginosa, Klebsiella spp., Fusobac-terium necrophorum, Enterobacter agglomérons, Proteus mirabilis, Acinetobacter baumanii, Acinetobacter Iwoffi, Bacillus; (103) КОЕ была выявлена Enterobacter aerogenes, St.epidermid.is, St. aureus, Cl. perfringens, E. coli.

Таблица 3

Микробная контаминация повреждений кожи у коров

Видовой состав бактерий Концентрация

Ps. aeruginosa 104

Klebsiella spp. 104

Fusobacterium necrophorum 104

Enterobacter aggiomerans 104

Proteus mirabilis 10'

Acinetobacter baumanii 104

Acinetobacter Iwoffi 104

Bacillus spp. 104

St.epidermidis 10J

St. aureus 103

CI. perfringens 103

E. coli 10"

В 100 % случаев микробная контаминация повреждений кожи у КРС была выявлена в ассоциациях: Ps. aeruginosa (15,2 %), St. epidermidis (30,0 %), Klebsiella spp (10 %), E. coli (43,5 %), Fusobacterium necrophorum (1,3 %).

Показана высокая устойчивость к широко применяемому сегодня гента-мицину (43—75 %). Существенной оказалась резистентность к оксациллину

(31-38 %), наибольшая антибиотикорезистентность была выявлена к пенициллину (89-90 %).

Множественно-резистентными оказались Ps. aeruginosa и Enterobacter agglomerans. Препаратами выбора для них являются имипенем, сульперазон, амикацин. К широко используемым антибиотикам цефтриаксону, пефлокса-цину, ципрофлоксацину выявлена высокая резистентность.

Таким образом, выявлена высокая антибиотикорезистентность к наиболее используемым антибиотикам, таким, как пенициллин, ампициллин, цефазолин, эритромицин.

Анализ микробиологической структуры раневых инфекций, верифицированных у коров, показал, что основными возбудителями, которые встречаются во всех пробах, являются штаммы St. epidermidis, Ps. aeruginosa, Enterobacter agglomerans и E. coli. Обработки инфицированного повреждения кожи 0,02% водным раствором антисептика «Анавидин» позволили снизить микробную контаминацию всех видов микробных тел в ране до нулевых значений на 1-е сутки после обработки, что говорит о высокой чувствительности раневых штаммов микроорганизмов к антисептику «Анавидин» и пролонгированному действию антисептика.

Прежде чем рассмотреть результаты биологических свойств антисептика «Анавидин», остановимся подробнее на результатах по разработке способа моделирования инфицированного повреждения кожи с заданным микробным пейзажем, а также с контролируемой глубиной и площадью повреждения. Эти условия необходимы для стандартизации раны и возможности объективной оценки влияния новых препаратов на рану. В литературе описано большое количество способов моделирования инфицированных повреждений кожи. Наиболее близкой является модель И.Ю. Сахарова (1993), отличительными приемами предлагаемого нами способа являются:

• подшивание краев дефекта к подлежащим тканям после иссечения кожного покрова;

• каждый угол дефекта дополнительно прошивают отдельным диагональным швом;

• иссечение струпа и некротизированных тканей в пределах здоровых тканей;

• обработка инфицированного повреждения кожи антисептиком с последующим промыванием её физиологическим раствором;

• закрытие обработанной поверхности раны полупроницаемой мембраной, концы которой вставляют под угловые диагональные швы;

• введение под полупроницаемую мембрану бактериальной взвеси, содержащей 0,5 мл Е. coli 109и 0,5 мл Ps. aeruginosa 109.

Таким образом, разработана модель инфицированного повреждения кожи с контролируемыми параметрами, включающими как бактериальную обсе-

мененность раны, так глубину и площадь повреждения, которая может быть использована в хроническом эксперименте для изучения антибактериальных и биологических свойств новых препаратов.

Для оценки системной воспалительной реакции на индукцию инфицированного повреждения кожи под влиянием антисептика «Анавидин» был проведен сравнительный анализ уровня лейкоцитов и формулы периферической крови.

При исследовании лейкоцитоза венозной крови (рис. 7) оказалось, что максимальным проявлением системной воспалительной реакции на 1-е сутки исследования в КГ-1, КГ-2 и ОГ закономерно являлся лейкоцитоз, при этом уровень лейкоцитов в КГ-1 был максимальным по сравнению с КГ-2 (ри 0,02), ОГ(р(/= 0,004), а в ОГ'был наименьшим, но достоверно выше нормы (р00,03). От нормальных величин также не отличалось количество лейкоцитов у КГ-2, но было статистически меньше по сравнению с КГ-1 (ри= 0,02) и больше, чем в ОГ (р(/= 0,04). Высокие показатели лейкоцитоза сохранялись во всех группах до 9-х суток, однако наименьший показатель среди групп был выявлен в ОГ с санацией инфицированного повреждения кожи антисептиком «Анавидин».

ЙОГ 0КГ-1 ЕЗКГ-2

3 7 9

Сутки исследования

Рис. 7. Динамика уровня лейкоцитов в группах.

Таким образом, выявлено, что показатель лейкоцитоза у животных с обработкой инфицированного повреждения кожи антисептиком «Анавидин» был наименьшим по сравнению с группами контроля на протяжении всех 19 суток исследования, но был существенно выше нормальных значений до 11-х суток с нормализацией на 19-е сутки. Однако отметим, что выбранный для контроля антисептик хлоргексидина биглюконат также ограничивал лейкоцитоз, показатели в этой группе были существенно ниже, чем в контрольной фуппе, где инфицированные повреждения кожи просто промывали физиологическим раствором, но были существенно выше, чем В ОПЫТНОЙ 1руппе.

Обработка инфицированного повреждения кожи антисептиком «Анавидин» приводит к уменьшению воспалительного ответа, что подтверждае тся норма-

лизацией к 19-м суткам уровня лейкоцитов, сегментоядерных нейтрофилов, моноцитов и лимфоцитов (рис. 8-11).

1 3 7 9 11 19

Сутки исследования

Рис. 9. Количество сегментоядерных лейкоцитов в динамике исследования.

ШОГ 0КГ-1 ЕЭКГ-2

Р 80 |

-|б0 5

0 ¥

1 20 §

1 3 7 9 11 19

Сутки исследования

Рис. 8. Количество палочкоядерных лейкоцитов в динамике исследования.

| 50

1 40

й 30 га

| 20 10

1 3 7 9 11 19

Сутки исследования

Рис. 10. Количество моноцитов в динамике исследования.

Сутки исследования

Рис. 11. Количество лимфоцитов в динамике исследования.

Динамика уровня лейкоцитов периферической крови согласуется с данными микробиологического исследования, где максимальное снижение КОЕ прослеживалось в ОГ, и в меньшей степени - в КГ-2 и КГ-1, особенно на 1-е и 9-е сутки эксперимента.

При исследовании показателей фагоцитарной активности нейтрофильных лейкоцитов, обнаружено, что во всех группах экспериментальных животных на 1 -е сутки имело место повышение фагоцитарного индекса. На 7-е сутки имелось несущественное снижение ФИ у ОГ и КГ-2, но показатель сохранялся выше нормы во всех группах (ро<0,05). Максимальным показатель был в группе КГ-1, что по срокам совпадает с максимальным лейкоцитозом в этой

группе. При сравнении показателя в группах ОГ и КГ-1 выявлено, что в ОГ показатель существенно ниже (рц= 0,03). Эти данные указывают на активацию фагоцитарного звена иммунного ответа на инфекцию.

На 9-е сутки эксперимента ФИ был минимальным в КГ-1 по сравнению с нормой (ра= 0,002) и КГ-2 (ри= 0,009), а также по сравнению с 7-ми сутками (Рц,= 0,0001). В ОГ отмечался также повышенный фагоцитарный индекс по сравнению с КГ-1 (ри= 0,005). Однако отметим, что показатель ФИ в группах КГ-2 и ОГ сохранялся существенно более высоким по сравнению с нормой (рв< 0,05).

Существенное снижение ФИ к 9-м суткам у животных КГ-! совпадает с литературными данными об угнетении фагоцитоза при гнойно-некротических поражениях тканей.

К девятнадцатым суткам ФИ нормализовался в КГ-2 и ОГ, тогда как в КГ-1 показатель оставался существенно ниже нормы (рп= 0,0001) КГ-2 и ОГ (ри* 0,05).

Нами подтверждено, что санация инфицированных повреждений кожи «Анавидином» не оказывает подавляющего влияния на фагоцитоз. Выявленная динамика ФИ совпадает с изменениями ФЧ (рис. 12, 13).

Таким образом, установлено ограничение системной воспалительной реакции, сохранность неспецифической резистентности и отсутствие сенсибилизации при инфицированном повреждении кожи под воздействием антисептика «Анавидин», тогда как в КГ-1 отмечали прогрессирующие расстройства неспецифической резистентности реакции организма, характерные для течения гнойных ран без лечебных воздействий.

В результате проведенных планиметрических исследований (рис. 14) установлено, что применение антисептика «Анавидин» способствует ускоре-

1 3 7 9 11 19 Сутки исследования

Рис. 12. Показатели фагоцитарного индекса в динамике исследования

1 3 7 9 11 19 Сутки исследования

Рис. 13. Показатели фагоцитарної о числа в динамике исследования.

нию заживления дефекта, о чем свидетельствует существенное уменьшение площади инфицированного повреждения кожи уже на 3-й сутки, уменьшение площади дефекта в 2 раза на 9-е сутки и нулевое значение показателя к 19-м суткам. Использование антисептика хлоргексидин биглюконата (КГ-2) способствовало уменьшению площади инфицированного повреждения кожи в 2 раза на 11-е сутки, а в КГ-1 - с обработкой ран физиологическим раствором позволило уменьшить площадь инфицированного повреждения кожи в 2 раза к 15-м суткам исследования.

Сутки исследования

Рис. 14. Влияние антисептика «Анавидин» на заживление инфицированного повреждения кожи.

Клиническая картина инфицированного повреждения кожи во всех группах животных до начала лечения была одинаковой.

Раны характеризовались подрытыми, рубцово-фибринозными краями, вялыми и тусклыми грануляциями с очагами некротических изменений, при гистологической оценке препаратов животных всех групп в области раны на I -е сутки (4-е сутки с момента нанесения кожного дефекта) выявлено (рис. 15): поверхностно колонии микробов, некротизированная ткань, лейкоциты, детрит, фибрин. В подлежащих тканях выявляли: отек, плазматическое пропитывание, диффузно распределенные лейкоциты в подлежащей соединительной ткани.

При гистологическом исследовании на 3-й сутки у животных опытной группы с обработкой антисептиком «Анавидин» выявляли на поверхности дефекта фибрин и лейкоциты, в глубине раны - грануляционная ткань с новообразованными капиллярами, фибробластами и лейкоцитами.

Таким образом, под поврежденным слоем идет процесс созревания грануляционной ткани. В ней фибробласты, с разнонаправленной ориентировкой. В КГ-1 с обработкой ран физиологическим раствором грануляционная ткань находится на разных стадиях резорбции клетками воспалительного инфильтрата с формирующимися микроабсцессами. В тканях, прилежащих к ране,

наблюдается нарушение кровообращения, сопровождающееся полнокровием сосудов.

Рис. 15. Крыса. 1-е сутки после инфицирования дефекта (4-е сугки 07 момента нанесения дефекта): А - ОГ; Б - КГ-1; В - КГ-2; 1 - некротизированная ткань, лейкоциты, детрит, фибрин; 2 - отек, плазматическое пропитывание, диффузно распределенные лейкоциты в подлежащей соединительной ткани. Окраска гематоксилином и эозином. Об. 4х; Ок. 10х.

Таким образом, преобладание в грануляционной ткани фибробластов у животных опытной группы обеспечивает более быстрый темп созревания соединительной ткани, чем в контроле, на 3-4 дня, с закрытием раневого дефекта эпителием к 19-м суткам (рис. 16), тогда как у животных контрольных групп раны находились под струпом до 19-х суток исследования. У животных КГ-1 ни в одном случае эпителий полностью не закрывал поверхность инфицированного повреждения кожи.

Результаты нашего исследования показали, что использование водного раствора «Анавидина» в условиях микробноконтаминированой инфицированного повреждения кожи приводит к элиминации возбудителей гнойной инфекции и ускоряет темп созревания соединительной ткани по сравнению с кон тролем на 3-4 дня с закрытием раневого дефекта эпителием к 19-м суткам.

Рис. 16. Крыса. 19-е сутки после инфицирования дефекта: А - ОГ; Б КГ-1; В КГ-2; 1 - некротизированная ткань (струп) на поверхности раны; 2 созревающая соединительная ткань; 3 - сформированная соединительная ткань; 4 эпителий, закрытие раны; Окраска гематоксилином и эозином. Об. 4х; Ок. 10х.

выводы

1. Созданная модель инфицированной кожной раны, заключающаяся в иссечении кожного покрова, удалении струпа и введении инфекта в рану, является легко воспроизводимой с контролируемыми параметрами, заданными бактериальным обсеменением раны (0,5 мл Е. coli 109 и 0,5 мл Ps. aeruginosa 109), глубиной и площадью повреждения, позволила изучить антибактериальные и биологические свойства антисептика «Анавидин». В опытах in vivo при обработке инфицированных кожных повреждений 0,02% водным раствором антисептика «Анавидин» микробная обсемененность достоверно снижается уже к 3-м суткам, достигая нулевых значений к 9-м суткам в динамике до 19-х суток исследования.

2. В опытах in vitro выявлено, что 0,0015% раствор «Анавидина» обладает бактерицидным действием в отношении Е. coli и микста Ps. aeruginosa и Е. coli, его использование позволяет достоверно снизить количество Е. coli с 109 до нулевых значений, а Ps. aeruginosa - с 109 до 103 КОЕ/мл (р(/ < 0,05).

3. Обработка инфицированных повреждений кожи антисептиком «Анавидин» приводит к ограничению системной воспалительной реакции, сохранности неспецифической резистентности и отсутствию сенсибилизации.

4. Применение антисептика «Анавидин» способствует ускорению заживления инфицированных повреждений кожи, о чем свидетельствует существенное уменьшение площади дефекта уже на 3-й сутки, уменьшение площади ран в 2 раза на 9-е сутки и нулевое значение показателя к 19-м суткам. «Анавидин» обладает стимулирующим регенерацию и заживление инфицированного кожного повреждения, вследствие антибактериального и противовоспалительного действия. Показано, что преобладание фибробластов в грануляционной ткани у животных опытной группы обеспечивает более быстрый темп созревания соединительной ткани, чем в контроле, на 3 -4 дня, с закрытием кожного дефекта эпителием к 19-м суткам.

5. Использование водного раствора «Анавидина» на молочной ферме КРС для обработки помещений фермы и оборудования, контактирующего с выменем коровы, позволило снизить обсемененность обследованных предметов микроорганизмами с 60 % до нулевых значений. При микробиологическом исследовании инфицированных повреждений кожи у КРС был выявлен следующий видовой состав бактерий чувствительных к антисептику «Анавидин»: (104) КОЕ -Ps. aeuruginosa, Klebsiellaspp., Fusobacterium necrophorum, Enterobacter agglomerans, Proteus mirabilis, Acinetobacter baumanii, Acinetobacter Iwoffi, Bacillus spp.; (103) КОЕ - Enterobacter aerogenes, St.epidermidis, St. aureus, Cl. perfringens, E. coli.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Модель инфицированного повреждения кожи можно использовать для экспериментальной оценки новых методов лечения инфицированных повреждений кожи.

2. Для улучшения репаративных процессов в зоне раневого дефекта в условиях инфицированного повреждения кожи рекомендовано использование 0,02% водного раствора антисептика «Анавидин».

3. Для подавления роста Е. coli и микста Ps. aeruginosa и Е. coli рекомендуется использовать раствор «Анавидина» в минимальной концентрации 0,0015%.

4. С целью снижения обсемененности на молочной ферме КРС для обработки помещений фермы и оборудования контактирующего с выменем коровы, целесообразно применение 1% водного раствора «Анавидина».

5. Наибольшее количество видов микроорганизмов выделенных из отделяемого у КРС, имело высокую чувствительность к нитрофурантоину, ри-фампицину, амикацину (в среднем 80-90 %), умеренную активность показали пефлоксацин и ципрофлоксацин (57-64 %).

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. »Григорьев Г.Е., Ильина О.П., Лепехова С.А., Коваль Е.В., Рой Т.А., Ба-тёха В.И Динамика бактериологической обсеменённости хронической раны иод влиянием «Анавидина» // Бюл. ВСНЦ СО РАМН. - 2005. ~№ 3. - С. 216-217.

2. "Тригорьев Г.Е., ИльинаО.П., Лепехова С.А., Фадеева Т.В., КовальЕ.В., Рой Т.А. Антисептик «Анавидин» для профилактики маститов у коров // Молочная промышленность - 2009. -№ 4. - С. 79-80.

3. Григорьев Г.Е., Ильина О.П., Лепехова С.А., Коваль Е.В., Фадеева Т.В. Сравнительная характеристика чувствительности микрофлоры инфицированной раны к антисептику «Анавидин» // Актуальные вопросы электрофизиологии и незаразной патологии животных: материалы международной практической конференции. - Улан-Удэ, 2009. - С. 113-115.

4. Тригорьев Г.Е., Ильина О.П., Лепехова С.А. Новые возможности в лечении гнойно-некротических ран у животных // Вестник КрасГАУ. - 2009. — № 11.-С. 146-151.

5. Григорьев Г.Е., Ильина О.П., Коваль Е.В., Лепехова С.А. Влияние антисептика «Анавидин» на динамику бактериологической обсемененности гнойной раны // Актуальные вопросы ветеринарной медицины: матер. II Сибирского ветеринарного конгр. - Новосибирск, 2010. - С. 314-315.

6. Тригорьев Г.Е., Гольдберг О.А., Лепехова С.А., Ильина О.П., Коваль Е.В., Суворикова В.А. Влияние нового сибирского антисептика «Анави-

дин» на заживление кожной инфицированной раны // Бюл. ВСНЦ СО РАМН. -2010. —№ 6(76), Ч. 1.-С. 160-163.

7. Патент на изобретение Рос. Федерации № 2431890 «Способ моделирования инфицированной кожной раны», от 20.10.2011 г. / авт.: Григорьев Г.Е., Лепехова С.А., Гольдберг O.A., Коваль Е.В.

8. "Григорьев Г.Е., Гольдберг O.A., Лепехова С.А., Ильина О.П., Коваль Е.В. Морфологическая оценка заживления инфицированных повреждений кожи под влиянием антисептика «Анавидин» // Вестник КрасГАУ. — 2011. — № 12-С. 191-195.

9. * Григорьев Г.Е., Лепехова С. А., Зарицкая Л.В., Ильина О.П., Коваль Е.В., Гольдберг O.A., Постовая О.Н., Батунова Е.В.Влияние антисептика «Анавидин» на показатели неспецифической резистентности при заживлении инфицированных повреждений кожи // Вестник КрасГАУ. - 2012. - № 1. - С. 139-142

10. Григорьев Г.Е., Ильина О.П., Лепехова С.А., Фадеева Т.В., Шелупа-ев A.B., Савинова A.C. Применение антисептика «Анавидин» для профилактики и лечения инфицированных повреждений кожи в животноводстве: метод, рек. - Иркутск: НЦРВХ СО РАМН, 2011. - 28 с.

Примечание: * - издания, рекомендованные ВАК для публикации результатов исследований

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

КГ-2 - контрольная группа 2

КГ-3 - контрольная группа 3

КОЕ/г (мл) - колониеобразующие единицы в грамме (миллилитре)

КРС - крупный рогатый скот

ОАК - общий анализ крови

ОГ - опытная группа

ФИ (%) - фагоцитарный индекс

ФЧ - фагоцитарное число

ЦИК - циркулирующие иммунные комплексы

НСТ-тест - спонтанный тест восстановления нитросинего тетразолия

Подписано в печать 13.02.2012. Бумага офсетная. Формат 60х841/16. Гарнитура Тайме. Усл. печ. л. 1,5 Тираж 100 экз. Заказ №022-12._

РИО НЦРВХ СО РАМН (Иркутск, ул. Борцов Революции, 1. Тел 29-03-37. E-mail: arleon58@gmail.com)

Текст научной работыДиссертация по сельскому хозяйству, кандидата ветеринарных наук, Григорьев, Георгий Евгеньевич, Иркутск

61 12-16/101

МИНИСТЕРСТВО СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА РФ ФГОУ ВПО ИРКУТСКАЯ ГОСУДАРСТВЕННАЯ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННАЯ АКАДЕМИЯ УЧРЕЖДЕНИЕ РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ МЕДИЦИНСКИХ НАУК

НАУЧНЫЙ ЦЕНТР РЕКОНСТРУКТИВНОЙ И ВОССТАНОВИТЕЛЬНОЙ ХИРУРГИИ СИБИРСКОГО ОТДЕЛЕНИЯ

РАМН

На правах рукописи

ГРИГОРЬЕВ ГЕОРГИЙ ЕВГЕНЬЕВИЧ

ОСОБЕННОСТИ ЛЕЧЕНИЯ ПОВРЕЖДЕНИЙ КОЖИ

У ЖИВОТНЫХ

(клинико-экспериментальное исследование)

ДИССЕРТАЦИЯ

на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук

Научный руководитель:

доктор ветеринарных наук, профессор Ильина О.П. Научный консультант: доктор биологических наук Лепехова С.А.

Иркутск - 2012

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ .......................................................................4

ВВЕДЕНИЕ ......................................................5

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ..........................................11

1.1. Этиология и патогенез раневого процесса....... .....................11

1.2. Способы лечения гнойно-некротических процессов....................12

1.3. Моделирование гнойно-некротического процесса......................16

1.3.1. Влияние раневого процесса на иммунологическую

реакцию организма................................................................17

1.4. Роль микробного фактора в развитии инфекционного процесса ^ ^ в поврежденной коже.................................

1.5. Антисептики в профилактике и лечении 25 гнойно-некротических процессов.........................

1.6. Заключение по обзору литературы 30

ГЛАВА 2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ................................31

2.1. Материалы и методы......................................................................31

2.1.1. Общая характеристика экспериментального материала

in vitro...........................................31

2.1.2. Общая характеристика экспериментального материала

in vivo...........................................33

2.1.3. Общая характеристика клинического материала............37

2.1.4. Характеристика методов исследования..............................38

2.1.5. Методы статистической обработки результатов................41

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ..........................43

3.1. Антибактериальная активность антисептика «Анавидин»

в отношении штамма микроорганизмов Escherichia coli...... 44

3.2. Антибактериальная активность антисептика «Анавидин»

в отношении микста Escherichia coli и Pseudomonas aeruginosa 45

3.3. Антибактериальная активность антисептика «Анавидин»

в отношении микробной обсемененности объектов внешней

среды в помещениях фермы ..............................46

3.4. Влияние антисептика «Анавидин» на микробную контаминацию повреждений кожи в эксперименте in vivo

на крысах............................................ 51

3.5. Влияние антисептика «Анавидина» на микробную контаминацию повреждений кожи у крупного рогатого скота 58

3.6. Разработка способа моделирования инфицированного повреждения кожи у крыс.............................. . 65

3.7. Влияние антисептика «Анавидин» на изменение неспецифической реакции организма в условиях инфицированного повреждения кожи...................... 73

3.8. Влияние антисептика «Анавидин» на заживление инфицированного повреждения кожи..................... 85

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ................................................................95

ВЫВОДЫ..................................................... 106

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ........................................................108

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ..................................109

ПРИЛОЖЕНИЕ..............................................................................................124

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

КГ-2 - контрольная группа 2

КГ-3 - контрольная группа 3

КОЕ/г (мл) - колоннеобразующие единицы в грамме (миллилитре)

КРС - крупный рогатый скот

OAK - общий анализ крови

ОГ - опытная группа

ФИ (%) - фагоцитарный индекс

ФЧ - фагоцитарное число

ЦИК - циркулирующие иммунные комплексы

НСТ-тест - спонтанный тест восстановления нитросинего тетразолия

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность

Тактика лечения инфицированных повреждений кожи относится к числу важных разделов ветеринарии, так как эта патология наносит значительный экономический ущерб крупным специализированным и фермерским хозяйствам. Расходы на лечение, потери молока, мяса, особенно преждевременная выбраковка животных, влияют на формирование стада и его воспроизводство [Елисеев А.Н. с соавт., 2000; Потапова А.Н., 2008; Новиков П.В., 2010; Архипов А.А, 2011].

В условиях специализированных животноводческих комплексов, фермерских хозяйств и личных подворий с определенным уровнем механизации и конструктивными недостатками помещений, а также при неподготовленности скота к групповому содержанию наиболее частой причиной повреждений кожи является травматизм, осложненный полиинфекцией. Раневая инфекция является, как правило, постоянным спутником каждого механического повреждения тканей животного. При развитии раневой инфекции возможно не только нарушение регенерации и эпителизации повреждений кожи, но и осложнение сепсисом [Елисеев А.Н. с соавт., 2000; Веремей Э.И. с соавт., 2004; Гимранов В.В. с соавт., 2006].

Клинический опыт, накопленный в области теории и практики лечения повреждений кожи, свидетельствует о том, что даже применение самых эффективных средств не снижает риск возникновения различных осложнений [Даценко Б.М., 1995; Алексеева И.В., 2006].

логических свойств микробной клетки с появлением антибиотикорезистент-ных штаммов [Киричек Л.Т., 2003; Фадеева Т.В., 2007; Потапова А.Н., 2008].

Эта проблема указывает на необходимость пересмотра мнения о монопольном положении антибиотиков и переходе на более обоснованную стратегию и тактику лечения гнойносептических инфекций, включая интерес к забытой группе антибактериальных препаратов - антисептиков [Страчун-ский Л.С. с соавт., 2000; Григорьев Е.Г., 2005; Фадеева Т.В., 2007].

Исходя из этого, были определены цель и задачи исследования.

Цель работы: изучить антибактериальную активность антисептика «Анавидин» in vitro и обосновать его применение для профилактики и лечения повреждений кожи у сельскохозяйственных животных.

Задачи исследования:

2. Изучить антибактериальные свойства антисептика «Анавидин» in vitro.

3. Оценить влияние антисептика «Анавидин» на изменения в иммунологическом ответе показателей первого порядка, при заживлении инфицированных повреждений кожи.

Научная новизна

Разработан способ моделирования инфицированной кожной раны с контролируемыми параметрами, включающими бактериальную обсемененность раны, глубину и площадь повреждения, которая может быть использована в хроническом эксперименте для изучения антибактериальных и биологических свойств новых препаратов.

Выявлено, что «Анавидин» обладает стимулирующим регенерацию и заживление инфицированного повреждения кожи, вследствие антибактериального и противовоспалительного действия. Показано, что преобладание фиб-робластов в грануляционной ткани у животных опытной группы обеспечивает более быстрый темп созревания соединительной ткани, чем в контроле, на 3-4 дня.

Показано, что при использовании водного раствора «Анавидина» на молочной ферме крупно-рогатого скота (КРС) после обработки помещений фермы и оборудования контактирующего с выменем коровы, позволило снизить обсемененность обследованных предметов микроорганизмами с 60 % до нулевых величин.

Исследование инфицированных повреждений кожи у КРС выявило следующий видовой состав бактерий чувствительных к антисептику «Анавидин»: (104) КОЕ была выявлена Ps. aeruginosa, Klebsiella spp., Fusobacterium nec-rophorum; Enterobacter agglomerans; Proteus mirabilis; Acinetobacter baumanii; Acinetobacter Iwoffi; Bacillus spp\ (103) КОЕ была выявлена Enterobacter aero-genes, St. epidermidis, St. aureus, Cl. perfringens, E. coli.

Теоретическая и практическая значимость работы

Антисептик «Анавидин» стимулирует регенерацию и заживление инфицированного кожного повреждения, путем активации пролиферации фиб-робластов и обеспечивает быстрый темп созревания грануляционной ткани в оформленную соединительную ткань и эпителизацию повреждения.

Экспериментально обоснована возможность применения 0,02% водного раствора антисептика «Анавидин» для профилактики и лечения инфицированных повреждений кожи у сельскохозяйственных животных.

Внедрение результатов научных исследований

Материалы диссертационного исследования используются в учебном процессе кафедры госпитальной хирургии Иркутского государственного медицинского университета, Научного центра реконструктивной и восстановительной хирургии СО РАМН и кафедры анатомии, физиологии, патофизиологии, акушерства и биотехники размножения животных ИрГСХА.

Положения, выносимые на защиту

1. Водный раствор «Анавидина» в концентрации 0,02% эффективен в лечении инфицированных повреждений кожи, путем активации репаративных процессов в соединительной ткани и эпителии, оказывает антибактериальное, противовоспалительное действие.

2. Инфицированное повреждение кожи с контролируемыми параметрами бактериального обсеменения раны, глубиной и площадью повреждения, позволяет оценивать антибактериальную активность антисептика «Анави-дин».

Апробация основных положений работы

Основные результаты проведенного исследования доложены и обсуждены:

• I съезде хирургов Сибири и Дальнего Востока (Улан-Удэ, 2005);

• Международной научно-практической конференции «Актуальные вопросы электрофизиологии и незаразной патологии животных» (Улан-Удэ, 2009);

• II сибирском ветеринарном конгрессе «Актуальные вопросы ветеринарной медицины» (Новосибирск, 2010);

• II научно-практической конференции молодых ученых Сибирского и Дальневосточного федеральных округов (Иркутск, 2010);

• XI Международной Байкальской научно-практической конференции по проблемам ветеринарной медицины (Иркутск, 2011).

Основные положения диссертационной работы доложены и обсуждены на заседаниях ученого совета НЦРВХ СО РАМН (сентябрь, 2010). По материалам диссертационного исследования опубликовано 8 работ, в том числе 6 статей в журналах рекомендованных ВАК Минобразования и науки РФ, получен патент на изобретение Российской Федерации, разработаны методические рекомендации. В опубликованных работах изложены основные положения диссертации.

Структура и объем диссертации

Текст изложен на 128 страницах, иллюстрирован 22 таблицами и 14 рисунками. Библиография включает 136 источников, из них 127 отечественных и 9 иностранных авторов.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Этиология и патогенез раневого процесса

Клинический опыт, накопленный в области теории и практики лечения инфицированных повреждений кожи, свидетельствует о том, что даже применение самых эффективных средств не снижает риск возникновения различных осложнений [47].

Лечение длительно не заживающих гнойно-некротических повреждений кожий относится к числу важных разделов ветеринарии, так как эта патология наносит значительный экономический ущерб крупным специализированным и фермерским хозяйствам. Расходы на лечение, потери молока, мяса, преждевременная выбраковка животных, влияют на формирование стада и его воспроизводство. При развитии инфекции происходит нарушение регенерации и эпителизации повреждений кожи, что приводит к патологическому течению заживления, так же возможно осложнение сепсисом [28, 35, 89].

В условиях специализированных животноводческих комплексов, фермерских хозяйств и личных подворий с определенным уровнем механизации и конструктивными недостатками помещений, а также при неподготовленности скота к групповому содержанию наиболее частой причиной гнойно-некротических поражений является травматизм. Нарушение ветеринарно-санитарных норм содержания животных, отсутствие надлежащего ухода и должной лечебной помощи, также является предрасполагающей причиной учащения заболеваемости животных гнойно-некротическими процессами [9, 51,52, 98, 100].

По классификации, предложенной М.И. Кузиным [73], выделяют 3 фазы течения раневого процесса: фазу воспаления, которая включает периоды сосудистых реакций и очищения раны от омертвевших тканей; фазу регенера-

ции, в течение которой происходит образование и созревание соединительной ткани, и фазу реорганизации рубца и эпителизации.

Длительность и особенности заживления повреждений кожи определяются не только степенью и объемом повреждения тканей и характером их инфицирования, но и реактивными возможностями вовлекаемых в процесс тканей организма человека или животного в целом [25, 62, 64, 86, 89].

В связи с этим подход к лечению повреждений кожи в настоящее время строится в зависимости от фазы раневого процесса, сопутствуя ее естественному ходу, а, не тормозя его. В первую фазу раневого процесса лекарственные препараты должны подавлять инфекцию в ране, обеспечивать нормализацию местного гомеостаза, активировать отторжение некротических тканей, адсорбировать отделяемое из ран; [127] во 2 и 3 фазах - предотвращать вторичную контаминацию микробов с одновременным подавлением роста в ней остаточной микрофлоры, оказывать протекторное действие на регенирируе-мые ткани, защищая от механических повреждений, высушивания, обеспечивать активацию обменных процессов в тканях и улучшать региональный кровоток, обеспечивать направленную стимуляцию репаративных процессов в ранах [6, 47, 66, 68, 78. 80, 90].

Для эффективной коррекции инфицированных повреждений кожи очень важно учитывать закономерности раневого процесса; последнее должно соответствовать фазовым изменениям, стимулировать клеточные факторы, дополнять их защитный потенциал на фоне усиления естественной резистентности организма животного [17, 22, 27, 32. 68. 74, 115].

1.2. Способы лечения гнойно-некротических процессов

Способы лечения гнойно-некротических процессов предложенные в ветеринарии, очень разнообразны, это свидетельствует о том, что даже применение самых эффективных средств не снижает риск возникновения различных осложнений [47].

Широкое применение антибиотиков, эффективность которых вначале была отличной, привело к возникновению ряда сложных проблем [60, 65].

Мутагенное действие антибиотиков на патогенную микрофлору обусловило изменение как этиологической структуры гнойной инфекции, так и биологических свойств микробной клетки с появлением антибиотикорезистентных штаммов [14, 20]. Эта проблема указывает на необходимость пересмотра мнения о монопольном положении антибиотиков и переходе на более обоснованную стратегию и тактику лечения гнойно-септических инфекций, включая интерес к группе антибактериальных препаратов - антисептиков [41,110,117. 124].

Не менее важной причиной, осложняющей ситуацию в лечении гнойно-некротических поражений у сельскохозяйственных животных, следует считать отмечаемые в последние годы неблагоприятные изменения иммунологической реактивности организма под действием повреждающих факторов технического прогресса (загрязнение окружающей среды, химизация образа жизни, ионизирующее облучение) [61]. Указанные причины определяют повсеме�

Информация о работе

Григорьев, Георгий Евгеньевич
кандидата ветеринарных наук
Иркутск, 2012
ВАК 06.02.02

Диссертация

Особенности лечения повреждений кожи у животных - тема диссертации по сельскому хозяйству, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы