Особенности хромосомной организации протеин-кодирующих генов у Allium cepa L. и Allium fistulosum L.

Романов, Дмитрий Викторович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Особенности хромосомной организации протеин-кодирующих генов у Allium cepa L. и Allium fistulosum L.
ВАК РФ 03.02.07, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Особенности хромосомной организации протеин-кодирующих генов у Allium cepa L. и Allium fistulosum L."

На правах рукописи

РОМАНОВ Дмитрий Викторович

ОСОБЕННОСТИ ХРОМОСОМНОЙ ОРГАНИЗАЦИИ ПРОТЕИН-КОДИРУЮЩИХ ГЕНОВ У ALLIUM СЕРА L. И ALLIUM FISTULOSUM L.

Специальность: 03.02.07 - генетика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук

Москва 2012

005048646

Работа выполнена в научно-образовательном Центре молекулярной биотехнологии Российского государственного аграрного университета - МСХА имени К. А. Тимирязева

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор Хрусталева Людмила Ивановна

Официальные оппоненты:

Поляков Владимир Юрьевич доктор биологических наук, профессор, МГУ имени М.В. Ломоносова, НИИ физико-химической биологии имени А.Н. Белозерского, отдел электронной микроскопии, заведующий отделом

Кан Людмила Юрьевна кандидат сельскохозяйственных наук, ВНИИ селекции и семеноводства овощных культур, лаборатория генетики и цитологии, заведующая лабораторией

Ведущая организация: Всероссийский научно-исследовательский институт сельскохозяйственной биотехнологии Россельхозакадемии

Защита состоится «28» ноября 2012 г. в 14:30 на заседании диссертационного совета Д 220.043.10 при Российском государственном аграрном университете -МСХА имени К.А. Тимирязева по адресу: 127550, Москва, ул. Тимирязевская, д. 49, тел./факс (499) 976-24-92, e-mail: genetics@timacad.ru

С диссертацией можно ознакомиться в Центральной научной библиотеке им. Н.И. Железнова РГАУ-МСХА имени К.А. Тимирязева.

Автореферат разослан «26» октября 2012 г.

Учёный секретарь диссертационного совета Л.С. Большакова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Лук репчатый {Allium сера L.) является второй самой важной овощной культурой, уступая лишь томату (FAO, 2010). Лук входит в ежедневное меню питания человека. В нашей стране его выращивают на 12% площадей открытого грунта, занятых под всеми овощными культурами (Кокорева, Титова, 2007). Химический состав луковиц и зеленых листьев включает в себя множество полезных веществ. Обилие витаминов и их удачная комбинация в луке способствуют профилактике многих заболеваний. Исследования последних лет показали, что содержащиеся в луке сульфорганические соединения обладают выраженным противораковым эффектом и снижают агрегацию тромбоцитов, т.е. предупреждают образование тромбов (Imai et al., 2002; Голубев и др., 2003).

На сегодня в мире в селекции лука репчатого существует большая проблема обедненного генофонда этой культуры, как результат более 5000-летнего периода целенаправленной селекции и утери при этом ряда ценных признаков. В современной селекции лука репчатого близкородственный вид лук-батун (Allium fistulosum L.) является уникальным источником многих ценных признаков (высокое содержание сухого вещества, холодостойкость, устойчивость к ржавчине, шейковой гнили, луковой мухе, корневой гнили), которые могли бы быть использованы для создания новых сортов лука репчатого.

Необычайно огромный геном лука (1С = 16415 млн. п.н.) является главной причиной, по которой задерживается создание генетических ресурсов для этого экономически и филогенетически важного растения. Геном лука в 103 раза больше генома арабидопсиса, в 34 и 6 раз больше генома риса и кукурузы, соответственно (King et al., 1998).

Исследования последних лет по организации и эволюции генома растений с крупным геномом показали, что плотность генов увеличивается по направлению к дистальному концу хромосомы и коррелирует с частотой рекомбинаций (Akunov et al., 2003; Khrustaleva et al., 2005). В связи с этим возникает вопрос об организации генов у таких видов, как А. сера и А. fistulosum, которые диаметрально отличаются по распределению частот рекомбинаций вдоль физической хромосомы (Albini et al., 1988). У А. сера точки рекомбинации локализованы в дистальном и интерстициальном регионах, а у A. fistulosum - вблизи центромерного района.

Недавно было установлено, что положение гена на хромосоме играет важную роль в изменении признаков и эволюции организмов (Rockman et al., 2010). Возможность увидеть ген/гены на физической хромосоме и сравнительный анализ положения гена на хромосоме у разных видов,

объединенных в определенную таксономическую группу, значительно обогатят наши знания в области функциональной и сравнительной геномики и эволюции видов.

Учитывая масштабы выращивания лука, его ценность как продукта питания и как сырья для фармацевтической индустрии, являются актуальными расширенные исследования по изучению его генома, клонированию, секвенированию и физическому картированию генов.

Цели и задачи работы. Цель работы - изучить особенности хромосомной организации протеин-кодирующих генов у А. сера и A. fistulosum.

В соответствии с целью были поставлены следующие задачи:

1. Провести биоинформатический анализ ДНК сиквенсов лука, размещённых в международном банке данных (NCBI) и нуклеотидных последовательностей EST клонов лука в двух имеющихся у нас EST библиотеках;

2. Провести клонирование 700 EST клонов в Е. coli, выделение плазмидной ДНК и приготовление меченных ДНК проб для гибридизации in sittr,

3. Усовершенствовать метод приготовления цитологических препаратов метафазных хромосом А. сера и A. fistulosum для молекулярно-цитогенетических исследований;

4. Провести Tyramide-FISH локализацию 631 EST клона на хромосомах А. сера и A. fistulosum и сделать сравнительный анализ локализации генов на хромосомах этих двух близкородственных видов;

5. Провести картирование индивидуальных EST клонов на хромосомах А. сера с помощью Tyramide-FISH;

6. Подобрать праймеры на известные нуклеотидные последовательности генов аллиназы, фактора элонгации 1В-а и а-комплекса зарождающегося полипептида. Получить ПЦР-продукты с подобранными праймерами и геномной ДНК А. сера и А. fistulosum;

7. Провести клонирование и секвенирование экзон-интронных фрагментов генов аллиназы, фактора элонгации 1В-а и а-комплекса зарождающегося полипептида;

8. Провести Tyramide-FISH-картирование экзон-интронных последовательностей фрагментов генов аллиназы, фактора элонгащш 1В-а и а-комплекса зарождающегося полипептида;

9. Провести интегрирование сконструированных физических карт и ранее полученных генетических карт А. сера.

Научная новизна. Впервые проведены широкомасштабные исследования по хромосомной организации протеин-кодирующих генов на луковых: проведен сравнительный анализ распределения 631 EST клона на физических хромосомах у А. сера и A. fistulosum. Впервые физически картирован ген (EST клон API66), кодирующий транспортазу сахарозы А. сера и установлено положение генов семейства транспортаз сахарозы на физических хромосомах А. сера. Впервые с помощью Tyramide-FISH физически картированы на хромосомах А. сера ген аллиназы (экзон-интронный фрагмент) и ген (EST клон API20), кодирующий светопоглощающий белок 3. Впервые клонированы, секвенированы и физически картированы на хромосомах А. сера и A. fistulosum экзон-интронные фрагменты генов фактора элонгации 1В-а и а-комнлекса зарождающегося полипептида. Впервые проведено интегрирование созданных ранее генетических карт А. сера и физических карт, полученных нами с помощью молекулярно-цитогенетического картирования генов на хромосомах А. сера, что позволило установить положение маркеров относительно теломеры и центромеры на физической хромосоме и определить физическое расстояние между ними.

Практическая значимость. Физическое картирование генов позволяет определить точное местонахождение конкретного гена на хромосоме, связать физическую и генетическую карты, что дает возможность определить распределение частот рекомбинаций вдоль физической хромосомы и тем самым установить положение гена относительно частоты рекомбинации.

Результаты работы могут быть использованы в селекции лука. Полученные знания о физическом положении генов на хромосомах позволяют прогнозировать возможности их переноса от одного генотипа к другому, определять размеры селекционной популяции, время и экономические затраты на получение нужных форм.

Полученные интегрированные карты могут быть использованы при секвенировании генома лука. Наличие интегрированных карт намного облегчает процесс секвенирования, что было наглядно показано при секвенировании генома человека (Yu et al., 2001), риса (Chen et al., 2002) и томата (Szinay et al., 2008).

современных генетических знаниях и технологиях» (Москва, 2011), 35-й Международной конференции студентов сельскохозяйственной и ветеринарной медицины (Сербия, Нови-Сад, 2011), Международной научной конференции молодых ученых и специалистов, посвященной 146-летию Академии имени К.А.Тимирязева (Москва, 2011), 6-ом Международном симпозиуме по съедобным Alliaceae (Фукуока, Япония, 2012), Международной конференции: Молекулярное картирование и селекция с помощью маркеров (Вена, Австрия, 2012).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 10 печатных работ.

Объем и структура диссертации. Материалы диссертации изложены на 120 страницах машинописного текста и включают 35 рисунков, 5 таблиц, 1 приложение. Диссертация состоит из разделов «Введение», «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты исследований и их обсуждение», «Выводы», «Заключение», «Список литературы», «Список иллюстративного материала» и «Приложения». Список литературы включает 162 источника, из них 146 иностранных.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объекты исследования. В работе был использован следующий растительный материал: лук репчатый А. сера сорт «Халцедон» и лук-батун А. fistulosum сорт «Русский зимний». Семена данных растений были произведены агрофирмой «Гавриш».

Выделение ДНК. Выделение ДНК из проростков проводили СТАВ-методом согласно Rogers & Bendich (1988) с некоторыми модификациями.

Клонирование кДНК. EST-клоны, используемые в данной работе, были получены из двух кДНК-библиотек. Первая была синтезирована из неизвестных тканей и клонирована в pUC-13 векторе в Native Plants, Inc. (NPI), Salt Lake City, Utah (обозначаются префиксом API). Вторая кДНК-библиотека была синтезирована из тканей луковицы А. сера и клонирована в векторе pPCR-ScriptTM Amp SK(+) в Plant Research International, Wageningen, The Netherlands (обозначаются префиксом PRI).

Трансформацию клеток E. coli проводили векторами pUC-13 и pPCR-ScriptTM Amp SK(+), несущими вставки кДНК, на электропораторе MicroPulser. Отбор колоний, несущих вектор со вставкой кДНК, проводили на селективной питательной среде с добавлением ампициллина и X-Gal.

Дизайн праймеров. Для подбора праймеров использовалась программа РптегЗ. Праймеры A111.8(L), A111.8(R) подбирались на нуклеотидную последовательность L48614.1 (ген аллиназы А. сера) (GenBank).

Праймеры API15_1(L), API15_1(R), API15_2(L), API15_3(R) подбирали на нуклеотвдную последовательность ВЕ205550.1 (кДНК клон API 15 с гомологией к фактору элонгации 1В-а) (GenBank).

Праймеры API59_1(L), API59_1(R), API59_2(L), API59_2(R) подбирали на нуклеотидную последовательность ВЕ205590.1 (кДНК клон API59 с гомологией к a-комплексу зарождающегося полипептида) (GenBank).

Клонирование ПЦР-продуктов. Клонирование полученных ПЦР-продуктов было проведено с помощью коммерческого набора pGEM®-T Easy Vector System (Promega, USA) согласно прилагаемому протоколу. Трансформацию клеток Е. coli проводили вектором pGEM®-T Easy с различными вставками ПЦР продуктов на электропораторе MicroPulser. Отбор колоний, несущих вектор со вставкой кДНК, проводили на селективной питательной среде с добавлением ампициллина и X-Gal.

Приготовление препаратов митотических хромосом. Приготовление цитологических препаратов метафазных хромосом А. сера и A. fistulosiim проводилось согласно Pijnacker et al. (1984) и Бочков и др. (1989) с некоторыми модификациями, а именно, использование гидроксимочевины для синхронизации клеточного цикла, использование в качестве цитостатика закиси азота под давлением 10 атмосфер, применение низких температур для улучшения ферментной мацерации тканей и разброса хромосом на цитологических препаратах.

Приготовление ДНК-пробы. Выделение плазмидной ДНК проводилось с использованием коммерческого набора реактивов «The GeneJET™ Plasmid Miniprep Kit» (Fermentas, USA), согласно прилагаемому протоколу.

Мечение плазмидной ДНК проводилось методом Nick-трансляции с использованием DIG-Nick Translation Mix (Roche, Germany) согласно прилагаемой инструкции.

Флуоресцентная in situ гибрндизаиия (Tvramide-FISH). Предгибридизационную обработку слайдов и гибридизацию проводили по Kuipers et al. (1997) с некоторыми модификациями. Tyramide-FISH (флуоресцентная in situ гибридизация) процедура была проведена согласно Khrustaleva & Kik (2001) с некоторыми модификациями.

Микроскопия и анализ изображения. Препараты хромосом были просмотрены с помощью микроскопа Zeiss Axiolmager Ml, снабженного фильтрами для детекции FITC и DAPI, ультрафиолетовой лампой НВО мощностью 100 Вт., а также соединенной с компьютером цифровой камеры AxioCam. Морфометрия и кариотипирование метафазных пластинок были проведены с помощью программ AxioVision v.4.6, Isis v.5.ru и MicroMeasure v.6.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 1. Анализ ДНК сиквенсов луков, размещённых в международном банке данных (NCBI). BLASTX анализ библиотек EST клонов, полученных из луковичной ткани А. сера

Проведенный нами анализ базы данных на сервере NCBI показал, что накоплено всего лишь около 54000 различных последовательностей ДНК для А. сера, включая 20180 EST. Геном A. fistulosum представлен в NCBI ещё меньшим числом - 728 последовательностей (данные на 22.10.2012).

Проведенный BLASTX анализ показал, что транслируемые аминокислотные последовательности с некоторых EST клонов гомологичны к белкам, принадлежащим следующим семействам: рибосомальных белков, пероксидаз, белков ионных каналов, трансфераз и киназ (рисунок 1). Так как в клетке практически всегда присутствует очень большое количество рибосом, то не удивительно, что значительную часть среди EST, составляют EST, аминокислотная последовательность которых имеет гомологию к рибосомальным белкам. Если рассматривать функции найденных белков, то следует отметить, что большая часть белков относится к белкам общего метаболизма клетки. Парокеидазы

Г 9%

I Белки роимых каналов

Рисунок 1. Процентное соотношение белков, соответствующих EST клонам в имеющейся библиотеке

Используя программу CENSOR (Jurka et al., 2005), было проверено 43 EST клона, случайно отобранных из всех имеющихся EST клонов. Оказалось, что из 43 анализируемых сиквенсов 9 (21%) имели внутри своей последовательности фрагменты ДНК (50-60 п.н.) гомологичные (на 70-80%) к каким-либо повторам, известным как у растений, так и у животных (таблица 1).

Таблица 1. Результаты поиска гомологии сиквенсов EST к сиквенсам повторяющихся элементов

EST клон Тип повтора Организм с гомолог ичным повтором

ALED9 Gypsy-подобные элементы Oiyza sativa

ALRD7 LTR Ретротранспозон Schmidtea mediterránea

ALVC7 Ретровнрус-подобный повтор класса 1 Monodelphis domestica

ALVE3 Gypsy повтор Zea mays

ALWA7 Ретровнрус-подобный повтор класса 1 Monodelphis domestica

ALWE7 HERVI9 Ретровнрус-подобный повтор класса 1 Homo sapiens

ALXG5 Повтор из семейства Polinton ДНК транспозонов Strongv locentrotus

ALBD10 Non-LTR Ретротранспозон Crithidia fasciculata

Таким образом, проведенный на первом этапе работы биоинформатический анализ нуклеотидных последовательностей EST клонов в двух имеющихся у нас библиотеках позволил найти в базах данных аминокислотные последовательности белков, гомологичные

последовательностям, транслируемым in silico с сиквенсов EST клонов. Так же была получена информация о наличии в ряде EST клонов последовательностей ДНК с частичной гомологией к повторам, которая позволила исключить эти клоны из исследований и избежать сложностей с их картированием in situ.

2. Сравнительный анализ Tvramide-FISH локализации 631 EST клона на хромосомах А. сера и A. fistulosum

Была проведена in situ гибридизация 631 EST клона с ДНК метафазных хромосом А. сера и A. fistulosum (рисунок 2). EST-библиотеки были разделены на 26 гибридизационных смесей, в каждой по 11 -25 случайных EST-клонов. Был проведен анализ распределения сайтов гибридизации на хромосомах этих двух близкородственных видов (таблица 2). У А. сера большая часть сайтов гибридизации ESTs была выявлена в дистальных и интерстициальных регионах. У A. fistulosum большая часть сайтов гибридизации ESTs была выявлена в проксимальных и интерстициальных регионах.

Рисунок 2. Tyramide-FISH-картирование 11 EST-клонов из кДНК-библиотеки лука репчатого на хромосомах А. сера (а) и A. fistulosum (б)

Таблица 2. Обобщенные данные Tyramide-FISH картирования 631 EST клона: количество и распределение сайтов гибридизации EST вдоль физических хромосом А. сера к A. fistulosum _

Регион хромосомы

Проксимальный Интерстициальный Дистальный Всего

А. сера 121* 201 286 608

19.9%** 33.1% 47.0% 100%

А. fistulosum 261 241 119 621

42.0% 38.8% 19.2% 100%

*количество сайтов гибридизации, **% от общего числа выявленных сайтов гибридизации

Ранее проведенный английскими исследователями анализ распределения событий кроссинговера показал, что 92,6 % хиазм у A. fistulosum расположены в проксимальных регионах, и, наоборот, у А. сера 97,9% хиазм расположены в дистальных и интерстициальных регионах (Albini & Jones, 1988). Таким образом, предположение, что виды с проксимальным положением рекомбинаций могут иметь противоположный градиент распределения генов вдоль хромосомы (Akhunov et al., 2003), подтверждается результатами нашей работы.

Полученные данные физического картирования генов показывают, что хромосомная организация луковых отличается от хромосомной организации других однодольных с крупным геномом. Однако, на основе числа проанализированных EST клонов мы можем сделать выводы только об организации небольшой части экспрессирующихся генов. Кроме того, выявляемые нами флуоресцирующие сигналы могут исходить не только из мест

локализации экспрессирующихся генов, но и быть результатом гибридизации ДНК пробы с последовательностями с высокой гомологией, например, псевдогенами или другими молчащими копиями экспрессирующихся генов. Было показано, что высоко экспрессирующиеся гены, могут иметь несколько псевдогенов до 5% от общего числа EST-соответствующих генов (Harrison et al., 2001).

3. Картирование индивидуальных EST клонов на хромосомах А. сера

3.1. Картирование EST клона с гомологией к транспортазе сахарозы

Сахароза - основной углевод, транспортируемый по флоэме большинства растений, включая луковые (Hayashi et al., 1990). Количество сахара в листьях луковых колеблется от 1,3 до 5,1 %, а в луковицах — от 4,5 до 21,4 % (Казакова, 1970). Транспортазы сахарозы важны как для поступления сахарозы во флоэму из питающих тканей, так и для подачи сахарозы в нуждающиеся клетки.

В результате Tyramide-FISH анализа митотических метафазных хромосом А. сера было выявлено 25 сайтов гибридизации EST-клона API66, несущего вставку гена транспортазы сахарозы (рисунок 3). Сигналы встречались на всех хромосомах.

Рисунок 3. Tyramide-FISH с EST-клоном API66 с гомологией к транспортазе сахарозы на хромосомах А. сера (а); Идиограмма кариотипа А. сера с положениями сигналов гибридизации EST-клона API66 (б)

Ген транспортазы сахарозы принадлежит к большому суперсемейству генов у растений с высокой гомологией ДНК внутри подсемейств и между отдельными подсемействами (Shiratake, 2007). Этим объясняются полученные множественные сайты гибридизации in situ в наших экспериментах с учетом параметров жесткости гибридизации и отмывки (80%). Подобная организация

генов, кодирующих транспортазу сахарозы, показана на арабидопсисе, где установлено 24 локуса генов этого семейства на всех хромосомах, и на рисе, у которого найдено 20 локусов на всех хромосомах (N0131, 2012).

3.2 Физическое картирование EST с гомологией к светопоглощающему белку 3

В анализируемой EST-библиотеке только один клон API20 был генетически картирован ранее в группе сцепления, соответствующей хромосоме 1 (Martin et al., 2005). В результате Tyramide-FISH анализа митотических метафазных хромосом А. сера был выявлен также один сайт гибридизации EST клона API20, гомологичного светопоглощающему белку 3. Эти данные согласуются с данными генетической карты Martin et al. (2005). Результаты интегрирования физической и генетической карт представлены на рисунке 4.

Chromosome 1

AOBlGfrfl-e.WS.7

АСА GS 35"

АСМ10Г

АОВ! 87-Е1-7.6Я .О

AOB105-E5-3.0/S.0

AJK26S-ES-9.S

AJK26SE5-5.0

A06168-ES-24.0

A JB6-E1-9.5/22.0

АОВ214-НЗ-8 0/7.0

АОВ117-Е5-Ю.ОМ2.0

ACAAI30

Хромосома 1

u.U. -- ■ISM",, ± 1JÜ

22.99%

а ® ±2.69

в)

A P120Î 5-1.3/3.0 АОВ237-Е1-20.0/9.0 AJ8«-C1-9.0/9.5

A JKB5-E5-22.0/20.0 API31-EM.015.0

Рисунок 4. Tyramide-FISH с EST-клоном API20 с гомологией к светопоглощающему белку 3 на хромосомах А. сера (а); Интегрирование положения маркера API20-E5-4.3/3.0 на генетической карте (Martin et al., 2005) (б) и положения соответствующего ему EST клона API20 на хромосоме 1 (в)

4. Картирование экзон-интронных последовательностей генов -продуктов ПЦР с геномной ДНК

Нами был применен новый подход в создании меченной ДНК пробы для гибридизации in situ, который заключается в использовании существующей базы данных (GenBank NCBI) для дизайна праймеров с целью получения

фрагментов ДНК, включающих не только экзоны, как в EST, но и интроны. Этот подход позволил на порядок увеличить специфичность гибридизации, благодаря присутствию в пробе более вариабельной последовательности интронов. Одновременно возросла чувствительность метода за счет увеличения размеров ДНК-мишени.

4.1 Клонирование фрагмента гена аллиназы и его физическое картирование

Фрагмент гена аллиназы был получен с помощью ПЦР, в которой использовали геномную ДНК А. сера и праймеры AI11.8 (рисунок 5) на экзон-интронную последовательность гена аллиназы (номер в GenBank L48614.1).

экэон 2 83 ил. интрон 2 Ни 99 п.н. ШЩ лсюн 3 282 ii.li. х^Н интрон 92 п л. тЩ экзон 4 ЗОО IIJL интрон 4« 78 пл. || 'лсюн 5 158 п.н.

---- —-

Рисунок 5. Схематическое изображение фрагмента гена аллиназы, ограниченного праймерами АН 1.8

Был получен ПЦР продукт размером приблизительно 1100 п.н. Длина ПЦР продукта совпадала с теоретически ожидаемым размером (рисунок 5).

Для определения нуклеотидной последовательности

амплифицированного ПЦР продукта было проведено клонирование в плазмидном векторе pGEM-T с последующим отбором клонов и их секвенированием. Нуклеотидные последовательности были проанализированы, используя программу BLASTN, с помощью которой был проведен поиск в базе данных GenBank (NCBI). В результате была установлена идентичность полученной нами нуклеотидной последовательности (размером 1092 п.н.) к нуклеотидной последовательности фрагмента гена аллиназы А. сера.

Анализ положения сигналов, исходящих от сайтов гибридизации фрагмента гена аллиназы, показал наличие сигнала на хромосоме 4 в дистальном регионе длинного плеча в положении 74,4% ± 1 (рисунок 6). На менее конденсированных хромосомах было выявлено два сайта гибридизации пробы, что может указывать на наличие двух локусов гена аллиназы.

Наши данные согласуются с работами по генетическому картированию данного гена, где также было показано наличие двух копий, относящихся к одной группе сцепления на хромосоме 4 (Martin et al., 2005). Результаты интегрирования физической и генетической карт представлены на рисунке 6.

б)

10.7 9.5 6.5 7.8 11.4

Chromosome 4

Al;imaSí-£S-3.5

АОВ162-£1-15.0Л ЛИкмИММП ACAHQ24

A08302-E1 -10.0/9. АСМ124

АСМ271

AJK242Í5-9.00.6 AP;53íM.002

Рисунок 6. Tyramide-FISH с фрагментом гена аллиназы на хромосомах А. сера (а); интегрирование положения маркеров Alliinase-E5-3.5 и Alliinase-Bl-14.5/13.0 на генетической карте (Martin et al., 2005) (б) и положения соответствующего им гена аллиназы на хромосоме 4 (в)

Нами было рассчитано соотношение числа пар нуклеотидов к частоте рекомбинации в данном регионе, которое составило 1,76 МЬ/сМ. Согласно данным Khrustaleva et al. (2005), полученным при интегрировании физической и генетической карт, этот показатель в регионах с высокой частотой рекомбинации для Allium составляет 1,4 МЪ/сМ, а в регионах с низкой частотой рекомбинации - 74,3 МЬ/сМ. Таким образом, согласно приведённым расчётам, ген аллиназы расположен в регионе с высокой частотой рекомбинации.

4.2. Клонирование фрагментов генов фактора элонгации 1В-а и а-комплекса зарождающегося полипептида и их физическое картирование

Хромосома 5 является объектом пристального внимания селекционеров лука, так как в ней находятся QTL, контролирующие содержание сухого вещества, устойчивость к абиотическим факторам, лежкость луковиц и другие ценные гены (McCallum et al., 2007; Masamura et al., 2012). В анализируемой EST-библиотеке два клона API15-E1-3.0 и API59-H3-15.0/9.5 были картированы ранее в группе сцепления, соответствующей хромосоме 5 (Martin et al., 2005). BLASTX анализ показал, что EST клон API 15 имеет гомологию к гену фактора элонгации 1В-а и EST клон API59 имеет гомологию к гену а-комплекса зарождающегося полипептида. Последовательности этих EST клонов были использованы для подбора праймеров с целью получения экзон-интронных фрагментов этих генов.

После проведения ПЦР с праймерами, подобранными на EST клон API 15, и геномной ДНК А. сера и A. fistulosum, были получены ПЦР продукты

размером 2100 п.н. и 1800 п.н., а после проведения ПЦР с праймерами, подобранными на EST клон API59, и геномной ДНК А. сера и A. fistulosum, были получены ПЦР продукты одинакового размера 1000 п.н..

ПЦР продукты были клонированы в плазмидный pGEM-T вектор, с последующим отбором клонов и их секвенированием. Полученные сиквенсы были проанализированы, используя программу BLASTN. В результате была выявлена высокая степень гомологии полученных нами сиквенсов к сиквенсам соответствующих EST клонов, после чего было проведено их выравнивание с помощью программы GeneDoc (рисунок 7).

НЕСЕКВЕНИРОВДННЫЙ УЧАСТОК

Рисунок 7. Результаты выравнивания фрагментов генов фактора элонгации 1В-а А. сера и A. fistulosum с EST клоном API15 (а) и фрагментов генов а-комплекса зарождающегося полипептида А. сера и A. fistulosum с EST клоном API59 (б).Черным цветом показаны участки генов, гомологичные EST клонам (экзоны), серым - негомологичные EST клонам (интроны)

В результате выравнивания было выяснено, что фрагменты генов фактора элонгации 1В-а А. сера и A. fistulosum содержат минимум три экзона и два интрона (в секвенированных участках), причем экзоны, как наиболее консервативные элементы генов, содержат только 8 нуклеотидных замен, а интроны - 8 делеций, общей протяженностью 34 нуклеотида, и 76 замен. Фрагменты генов а-комплекса зарождающегося полипептида А. сера и А. fistulosum содержат три экзона и два интрона; экзоны содержат в себе 19 однонуклеотидных замен, а интроны - 4 делеции, общей протяженностью 9 нуклеотидов, и 30 замен (рисунок 7).

Кроме того, BLASTN-анализ фрагментов генов фактора элонгации 1В-а А. сера и A. fistulosum выявил высокую степень гомологии к EST API92, a BLASTN-анализ фрагментов генов а-комплекса зарождающегося полипептида А. сера и A. fistulosum выявил высокую степень гомологии к EST API23. Выравнивание EST API 15 и EST API92 (оба имеют гомологию к гену фактора элонгации 1В-а) показало 99% соответствия. Выравнивание EST API59 и EST

API23 (оба имеют гомологию к гену а-комплекса зарождающегося полипептида) показало 99% соответствия. Клоны API92-E1-11.0/12.0 и API23-НЗ-12.0/6.5 были картированы ранее в группе сцепления, соответствующей хромосоме 5 (Martin et al., 2005). Таким образом, мы имеем дело с двумя копиями гена фактора элонгации 1В-а и двумя копиями гена а-комплекса зарождающегося полипептида, EST клоны которых находятся в одной группе сцепления, соответствующей хромосоме 5.

Tyramide-FISH анализ фрагмента гена фактора элонгации 1В-а у А. сера показал наличие сигналов на хромосоме 5 в проксимальном регионе длинного плеча в положении 22,24% ± 2,83 и в интерстициальном регионе длинного плеча в положении 54,45% ± 3,21 (рисунок 8).

Tyramide-FISH анализ фрагмента гена а-комплекса зарождающегося полипептида у А. сера показал наличие сигналов на хромосоме 5 в проксимальном регионе длинного плеча в положении 30,95% ± 3,72 и в интерстициальном регионе длинного плеча в положении 53,51% ± 2,57 (рисунок 8).

Хромосома 5 I Хромосома 5

ц.и. - 48,00% ± 1,15 I п.и. - 48,18% ± 0,72

а)

22,24% 3o,9S%

' ±2,83 • • ±з,72

54.45% * ' 53,51%

i3,21 ±2,5 7

6) В) I)

Рисунок 8 Тугапп(1е-Р18Н с фрагментом гена фактора элонгации 1В-а на хромосомах А. сера (а) и с фрагментом гена а-комплекса зарождающегося полипептида на хромосомах А. сера (б); положение генов фактора элонгации 1В-а (в) и а-комплекса зарождающегося полипептида (г) на хромосоме 5

Наши данные согласуются с работами по генетическому картированию данных генов, где так же было показано наличие двух копий гена фактора элонгации 1В-а и двух копий гена а-комплекса зарождающегося полипептида, относящихся к одной группе сцепления на хромосоме 5 (Martin et al., 2005). В результате интегрирования физической и генетической карт было установлено, что проксимальные локусы генов а-комплекса зарождающегося полипептида и фактора элонгации 1В-а расположены в регионах с относительно низкой частотой рекомбинации (21,83 Mb/cM), а более дистальные локусы этих генов расположены в регионе с высокой частотой рекомбинации (0,3 МЬ/сМ) (рисунок 9).

Chromosome 5

• АОВ260-Е5-9.6 .А0850-Е 5-0.7

/АСМ13Э' £АРИ5-£1-3.0 Г-АР123-Н3.12.0Г6 5

^АГО&НЭДСмЗ

АСМ099 ^АСАЕТ81 . ЛОВ46-£5-20.0.'9.Б . APW6-E5-6.7 . API92-E1-11 0/12.0 .АОВ236-Е1-12.0/18.0 5API6€-E«.7/9.5 АСМ171"

• ACAFM96

. АОВ120-С1-10.0 ■ А Р147-Е1-15.0/20.0

3.8: 5.5.

28.5

АСААХ07* АСМ288

A JB45-H3-8.0/10 0 АОВ74-Е5-6.7/15 0

AJB19-€1-4.0/4.3

Хромосома.

а)

-22,24% + 2,83^2, 83 Mb/cM •30,95% '

'53,51% .+ 2,57'%. „ , il ~54,45% ± 3,21 ~ МЬ/сМ

Рисунок 9. Интегрирование положения маркеров API15-E1-3.0 и API92-E1-11.0/12.0 и маркеров API59-H3-15.0/9.5 и API23-H3-12.0/6.5 на генетической карте (Martin et al., 2005) (а) и положения соответствующих им генов фактора элонгации 1В-а и а-комплекса зарождающегося полипептида на физической хромосоме 5 А. сера (схема) (б)

Тугапмёе-РШН анализ фрагмента гена фактора элонгации 1В-а у А. А.шйояит показал наличие сигналов на хромосоме 5 в проксимальном регионе длинного плеча в положении 33,31% ± 2,44 (рисунок 10).

Тугатк1е-Р18Н анализ фрагмента гена а-комплекса зарождающегося полипептида у А. /¡зЫояит показал наличие сигналов на хромосоме 5 в интерстициальном регионе длинного плеча в положении 40,07% ± 3,49 (рисунок 10).

Хромосома 5 I Хромосома 5

ц.и. = 49,07% * 1,04 I „.„. - 48.46% ± 0,91

а)

о 33,31% I

"±2.44 С , 40,07%

±3,49

G) в) г)

Рисунок 10. Tyramide-FISH с фрагментом гена фактора элонгации 1В-а на хромосомах A. fistulosum (а) и с фрагментом гена а-комплекса зарождающегося полипептида на хромосомах A. fistulosum (б); положение сигналов гибридизации фрагмента гена фактора элонгации 1В-а (в) и фрагмента гена а-комплекса зарождающегося полипептида (г) на хромосоме 5

Итак, Tyramide-FISH выявил по две копии генов фактора элонгации 1В-а и а-комплекса зарождающегося полипептида у А. сера и по одной копии этих генов у A. fistulosum. Результаты физического картирования генов совпадают с результатами ранее проведенных исследований King et al. (1998) по созданию генетической карты морфологических признаков и Kühl et al. (2004) по генетическому картированию EST клонов, в которых было показано, что для А. сера характерен высокий уровень дупликации генов.

выводы

1. Показано, что с помощью чувствительного метода Tyramide-FISH можно визуализировать на высоко компактизированной растительной хромосоме короткие последовательности генов (1-3,5 тыс. п.н.), что позволяет создавать молекулярно-цитогенетические маркеры для определения индивидуальных хромосом и интегрирования генетических и физических карт.

2. Предложен новый подход к созданию ДНК проб для in situ картирования генов, основанный на клонировании экзонных-интронных фрагментов генов, что позволяет увеличить чувствительность метода и специфичность картирования.

3. Успешная Tyramide-FISH визуализация генов на хромосомах А.сера и A.fistulosum луков позволила сконструировать физические карты хромосом, провести их интегрирование с генетическими картами и установить положение гена относительно частоты рекомбинации.

4. Установлена корреляция плотности генов с частотой рекомбинации: Tyramide-FISH 631 EST клона на хромосомах двух видов луков с диаметрально противоположным распределением частот рекомбинаций вдоль физической хромосомы выявила 80,1% сайтов гибридизации на хромосомах А. сера в дистальном и интерстициальном регионах, у А. fistulosum 80,8% EST клонов были локализованы в проксимальном и интерстициальном регионах.

5. BLASTX анализ картируемых in situ библиотек EST клонов, полученных из луковичной ткани А. сера, выявил следующий состав экспрессирующихся генов в одной отдельно взятой ткани: гены рибосомальных белков - 14%; другие гены домашнего хозяйства - 26% (пероксидазы - 9%, белки ионных каналов - 5%, киназы - 5%, трансферазы - 7%); видоспецифичные гены - аллиназы (2,4%) и другие низко- и однокопийные гены (57,6%).

6. Скрининг EST клонов с помощью программы CENSOR показал наличие повторов в экзонных областях некоторых генов, что позволило исключить эти гены из Tyramide-FISH экспериментов, так как наличие повторов маскирует сигнал, исходящий от генов.

7. Установлено, что EST клоны, принадлежащие к большим семействам сходных генов (> 80% гомологии), не могут быть использованы как ориентиры для интегрирования физических и генетических карт. Картирование EST клона API66 с гомологией к гену, кодирующему транспортазу сахарозы, выявило 25 сайтов гибридизации, распределенных по всем хромосомам А. сера.

8. EST клон API20 с гомологией к гену, кодирующему светопоглощающий белок 3, был картирован в проксимальной части длинного плеча (22,99% ± 2,69 от центромеры относительно длины плеча) хромосомы 1 А. сера. Проведено интегрирование положения гена на физической и генетической карте.

9. Клонирован и секвенирован экзон-интронный 1092 п.н. фрагмент гена аллиназы А. сера. С помощью Tyramide-FISH установлена локализация этого гена в дистальной части длинного плеча (74,4% ±1) хромосомы 4 А. сера. Установлено наличие двух сайтов гибридизации гена в данном регионе на менее конденсированных хромосомах. Установлено, что ген аллиназы расположен в регионе с высокой частотой рекомбинации: соотношение числа пар нуклеотидов к частоте рекомбинации в данном регионе 1,76МЪ/сМ.

10.Клонирован и секвенирован экзон-интронный фрагмент гена фактора элонгации 1В-а размером 2100 п.н. у А. сера и 1800 п.н. у A.fistulosum. С помощью Tyramide-FISH установлена локализация этого гена в двух локусах длинного плеча хромосомы 5 А. сера (22,24% ± 2,83 и 54,45% ± 3,21) и в одном локусе длинного плеча хромосомы 5 A.fistulosum (33,31% ±2,44).

11.Клонирован и секвенирован 1000 п.н экзон-интронный фрагмент гена а-комплекса зарождающегося полипептида, одинакового размера у А. сера и A. fistulosum. С помощью Tyramide-FISH установлена локализация этого гена в двух локусах длинного плеча хромосомы 5 А. сера (30,95% ± 3,72 и 53,51% ± 2,57) и в одном локусе длинного плеча хромосомы 5 А. fistulosum (40,07% ± 3,49).

12.Интегрирование физической и генетической карт хромосомы 5 показало, что проксимальные локусы генов а-комплекса зарождающегося полипептида и фактора элонгации 1В-а расположены в регионах с относительно низкой частотой рекомбинации (21,83 МЬ/сМ), а более дистапьные локусы этих генов расположены в регионе с высокой частотой рекомбинации (0,3 МЬ/сМ).

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Проведенные исследования по клонированию, секвенированию, физическому картированию протеин-кодирующих генов на хромосомах А. сера и А. АятЫит и интегрированию сконструированных нами физических карт с имеющимися генетическими картами позволяют нам сделать заключение о том, что у однодольных с крупным геномом плотность генов на хромосоме коррелирует с частотой рекомбинаций, что согласуется с данными полученными на других однодольных, таких как пшеница, ячмень и кукуруза. Плотность генов и частота рекомбинаций у этих зерновых культур наиболее высокая в дистальных регионах хромосом. Однако, известно, что у А. /ишЬхит градиент частоты рекомбинаций вдоль хромосомы диаметрально противоположен градиенту у большинства существующих видов растений, в т.ч. у А. сера и зерновых. А. /ШиЬяит в этом отношении является одним из редких видов, у которых события кроссинговера чаще всего происходят в проксимальном регионе хромосом. Благодаря возможности визуализировать гены на хромосоме с помощью Тугагшёе-РКН, было доказано, что плотность генов у А. АзШ^ит высокая в проксимальном регионе и очень низкая в дистапьном регионе хромосом. Обнаружены различия в распределении плотности генов вдоль физической хромосомы у А. АвшЬйит и других однодольных (А. сера, зерновые).

Сравнительный анализ картирования индивидуальных генов на хромосомах А. сера и А. /¡яП/Ьяши показал наличие дупликации генов у А. сера. Для А. сера характерен высокий уровень дупликации генов, в этом видится одна из причин укрупнения генома в ходе длительной, более 5000 лет, селекции этого вида. Близкородственный дикорастущий вид А. /мЫвяит имеет на 27% меньше размер генома и меньший уровень дупликации генов.

Конструирование физических карт с помощью прямого Тугагш<1е-Р15Н картирования генов/маркеров на хромосоме и их интегрирование с генетическими картами позволяет оценить положение интересующего гена относительно частоты рекомбинации, что является важным критерием в практической селекции для прогнозирования переноса гена и определения размеров популяции. Гены, находящиеся в регионе с высокой частотой рекомбинации, проще перенести от одного растения к другому, и для этого нужен меньший размер популяции, чем для переноса генов из регионов с низкой частотой рекомбинации.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ

1. Романов Д.В., Киров И.В., Фесенко И.А., Хрусталёва Л.И. Клонирование и секвенирование генов, кодирующих аллиназу и слезоточения фактор синтетазу // Сборник тезисов участников XI молодежной научной конференции секции «Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии», Москва, 2011. - С. 40-41.

2. Романов Д.В., Киров И.В., Фесенко И.А., Хрусталёва Л.И. Особенности хромосомной организации генов аллиназы и слезоточения фактора синтазы у луковых // Сборник статей участников Международной научной конференции молодых ученых и специалистов, посвященной 146-летию Академии имени К.А.Тимирязева, Москва, 2012. - Т. 1. - С. 7981.

3. Романов Д.В., Киров И.В., Фесенко И.А., Хрусталёва Л.И. Клонирование, секвенирование и физическое картирование генов аллиназы и слезоточения фактора синтазы у луковых // Сборник статей XII международной научно-практической конференции «Фундаментальные и прикладные исследования, разработка и применение высоких технологий в промышленности», Санкт-Петербург, 2011. - Т. 1. - С. 237-238.

4. Романов Д.В., Хрусталёва Л.И. Tyramide-FISH с EST-клоном, кодирующим транспортазу сахарозы, на хромосомах Allium сера // Сборник статей XII международной научно-практической конференции «Фундаментальные и прикладные исследования, разработка и применение высоких технологий в промышленности», Санкт-Петербург, 2011.-Т. 2.-С. 288-291.

5. Киров И.В., Романов Д.В., Фесенко И.А., Хрусталёва Л.И. Клонирование и секвенирование генов, кодирующих аллиназу и синтазу фактора слезотечения // Известия ТСХА, выпуск 3,2011. - С. 58-65.

6. Киров И.В., Романов Д.В., Фесенко И.А., Хрусталёва Л.И. Физическое картирование генов аллиназы и слезоточения фактора синтазы на хромосомах Allium сера L. с помощью tyr-FISH // Сборник тезисов участников XI молодежной научной конференции секции «Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии», Москва, 2011.-С. 23.

7. Kirov I., Romanov D, Physical mapping of the onion genes using Tyramide-FISH (Физическое картирование генов лука с использованием Tyramide-FISH) // Proceeding of the 35th conference of agricultural students and veterinary medicine with international participation, Serbia, 2011. - P. 225-230.

8. Киров И.В., Романов Д.В. Tyramide-FISH - ценный инструмент для сравнительной геномики растений // Сборник статей 2-й Международной школы-конференции молодых учёных «Генетика и селекция растений, основанная на современных генетических знаниях и технологиях», Цифровичок, Москва-Звенигород, 5-10 декабря 2011. - С. 48.

9. Khrustaleva L., Kirov I., Romanov D,, Fesenko I. Single-gene detection using ultra-sensitive Tyramide-FISH for assembling physical and recombination maps in the onion (Allium сера) (Детектирование однокопийных генов с помощью ультрачувствительной Tyramide-FISH для совмещения физической и рекомбинационной карт лука Allium сера) II International conference: Molecular mapping and marker assisted selection, Vienna, Austria, February 8-11 2012.-P. 19.

10.Khrustaleva L., Romanov D., Budylin M., Kirov I., Fesenko I., Kiseleva A. Chromosomal Organization of Genes and Some Types of Extragenic DNA in Allium (Хромосомная организация генов некоторых типов негенной ДНК у Allium) II Материалы 6-го Международного симпозиума по съедобным Alliaceae, Фукуока, Япония, 21-24 мая 2012. - Р. 34.

БЛАГОДАРНОСТИ

Автор выражает глубокую признательность и благодарность своему научному руководителю - доктору биологических наук, профессору Хрусталевой Людмиле Ивановне за всестороннюю поддержку и бесценную помощь при выполнении научной работы.

Автор благодарит профессора Mike Havey, университет Висконсин, США и доктора Arnaud Bovy, университет Вагенинген и научный центр, Нидерланды за предоставленную плазмидную ДНК EST библиотек.

Автор выражает свою благодарность всем сотрудникам Центра молекулярной биотехнологии за помощь на всех этапах подготовки и проведения научной работы.

Отдельную благодарность автор выражает к.б.н. Дивашуку Михаилу Георгиевичу и к.б.н. Фесенко Игорю Александровичу за помощь в проведении секвенирования.

Искреннюю и сердечную благодарность автор выражает своей семье, в первую очередь Романову Виктору Степановичу и Романовой Ирине Сергеевне за понимание и неоценимую поддержку.

Отпечатано с готового оригинал-макета

60х84'/16. Усл. печ. л 1,4. Тираж 100 экз. Заказ 468.

Издательство РГАУ - МСХА 127550, Москва, ул. Тимирязевская, 44 Тел.: (499) 977-00-12, 977-26-90, 977-40-64

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Романов, Дмитрий Викторович

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Физическая организация генов в растительной хромосоме.

1.2. Рекомбинация и организация генов в структуре хромосом.

1.3. Физическое картирование экспрессирующихся протеин-кодирующих генов.

1.4. Tyramide-FISH.

1.5. Особенности генома луковых.

1.6. Общая характеристика изучаемых видов А. сера и A. fistulosum.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1. Растительный материал.

2.2 Выделение ДНК.

2.3. Клонирование кДНК.

2.4. Дизайн праймеров для ПЦР амплификации фрагментов генов и их клонирование.

2.5. Приготовление препаратов митотических хромосом.

2.6. Флуоресцентная in situ гибридизация (Tyramide-FISH).

2.7. Микроскопия и анализ изображения.

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

3.1.Анализ ДНК сиквенсов луков, размещённых в международном банке данных (NCBI). BLASTX анализ библиотек EST клонов, полученных из луковичной ткани А. сера.

3.2. Сравнительный анализ Tyramide-FISH локализации 631 EST клона на хромосомах А. сера и A. fistulosum.

3.3. Картирование индивидуальных EST клонов на хромосомах А. сера.

3.4. Картирование экзон-интронных последовательностей генов -продуктов ПЦР с геномной ДНК.

ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Особенности хромосомной организации протеин-кодирующих генов у Allium cepa L. и Allium fistulosum L."

Лук репчатый {Allium сера L.) является второй самой важной овощной культурой, уступая лишь томату (FAO, 2010). Лук входит в ежедневное меню питания человека. В нашей стране его выращивают на 12% площадей открытого грунта, занятых под всеми овощными культурами [1]. Химический состав луковиц и зеленых листьев включает в себя множество полезных веществ. Обилие витаминов и их удачная комбинация в луке способствуют профилактике многих заболеваний. Исследования последних лет показали, что содержащиеся в луке сульфорганические соединения обладают выраженным противораковым эффектом и снижают агрегацию тромбоцитов, т.е. предупреждают образование тромбов [2; 3].

На сегодня в мире в селекции лука репчатого существует большая проблема обедненного генофонда этой культуры, как результат более 5000-летнего периода целенаправленной селекции и утери при этом ряда ценных признаков. В современной селекции лука репчатого близкородственный вид лук-батун (.Allium, fistulosum L.) является уникальным источником многих ценных признаков (высокое содержание сухого вещества, холодостойкость, устойчивость к ржавчине, шейковой гнили, луковой мухе, корневой гнили), которые могли бы быть использованы для создания новых сортов лука репчатого.

Необычайно огромный геном лука (1С = 16 415 млн. п.н.) является главной причиной, по которой задерживается создание генетических ресурсов для этого экономически и филогенетически важного растения. Геном лука в 103 раза больше генома арабидопсиса, в 34 и 6 раз больше генома риса и кукурузы, соответственно [4].

Исследования последних лет по организации и эволюции генома растений с крупным геномом показали, что плотность генов увеличивается по направлению к дистальному концу хромосомы и коррелирует с частотой рекомбинаций [5; 6]. В связи с этим возникает вопрос об организации генов у таких видов, как А. сера и A. fistulosum, которые диаметрально отличаются по распределению частот рекомбинаций вдоль физической хромосомы [7]. У А. сера точки рекомбинации локализованы в дистальном и интерстициальном регионах, а у A. fistulosum - вблизи центромерного района.

Недавно было установлено, что положение гена на хромосоме играет важную роль в изменении признаков и эволюции организмов [8]. Возможность увидеть ген/гены на физической хромосоме и сравнительный анализ положения гена на хромосоме у разных видов, объединенных в определенную таксономическую группу, значительно обогатят наши знания в области функциональной и сравнительной геномики и эволюции видов.

Цели и задачи работы. Цель работы - изучить особенности хромосомной организации протеин-кодирующих генов у А. сера и А. fistulosum.

В соответствии с целью были поставлены следующие задачи

2. Провести клонирование 700 EST клонов в Е. coli, выделение плазмидной ДНК и приготовление меченных ДНК проб для гибридизации in situ;

5. Провести картирование индивидуальных EST клонов на хромосомах А. сера с помощью Tyramide-FISH;

8. Провести Tyramide-FISH-картирование экзон-интронных последовательностей фрагментов генов аллиназы, фактора элонгации 1В-а и а-комплекса зарождающегося полипептида;

9. Провести интегрирование сконструированных физических карт и ранее полученных генетических карт А, сера.

Научная новизна. Впервые проведены широкомасштабные исследования по хромосомной организации протеин-кодирующих генов на луковых: проведен сравнительный анализ распределения 631 EST клона на физических хромосомах у А. сера и A. fistulosum. Впервые физически картирован ген (EST клон API66), кодирующий транспортазу сахарозы А. сера и установлено положение генов семейства транспортаз сахарозы на физических хромосомах А. сера. Впервые с помощью Tyramide-FISH физически картированы на хромосомах А. сера ген аллиназы (экзон-интронный фрагмент) и ген (EST клон API20), кодирующий светопоглощающий белок 3. Впервые клонированы, секвенированы и физически картированы на хромосомах А. сера и A. fistulosum экзон-интронные фрагменты генов фактора элонгации 1В-а и а-комплекса зарождающегося полипептида. Впервые проведено интегрирование созданных ранее генетических карт А. сера и физических карт, полученных нами с помощью молекулярно-цитогенетического картирования генов на хромосомах А. сера, что позволило установить положение маркеров относительно теломеры и центромеры на физической хромосоме и определить физическое расстояние между ними.

Апробация работы. Результаты диссертационной работы были представлены на XI молодежной научной конференции, секция «Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии» (Москва, 2011), XII Международной научно-практической конференции «Фундаментальные и прикладные исследования, разработка и применение высоких технологий в промышленности» (Санкт-Петербург, 2011), II Международной школе-конференции молодых учёных «Генетика и селекция растений, основанная на современных генетических знаниях и технологиях» (Москва, 2011), 35-й Международной конференции студентов сельскохозяйственной и ветеринарной медицины (Сербия, Нови-Сад, 2011), Международной научной конференции молодых ученых и специалистов, посвященной 146-летию Академии имени К.А.Тимирязева (Москва, 2011), 6-ом Международном симпозиуме по съедобным АШасеае (Фукуока, Япония, 2012), Международной конференции: Молекулярное картирование и селекция с помощью маркеров (Вена, Австрия, 2012).

Заключение Диссертация по теме "Генетика", Романов, Дмитрий Викторович

ВЫВОДЫ

3. Успешная Tyramide-FISH визуализация генов на хромосомах А. сера и A.fistulosum луков позволила сконструировать физические карты хромосом, провести их интегрирование с' генетическими картами и установить положение гена относительно частоты рекомбинации.

4. Установлена корреляция плотности генов с частотой рекомбинации: Tyramide-FISH 631 EST клона на хромосомах двух видов луков с диаметрально противоположным распределением частот рекомбинаций вдоль физической хромосомы выявила 80,1% сайтов гибридизации на хромосомах А. сера в дистальном и интерстициальном регионах, у A. fistulosum 80,8% EST клонов были локализованы в проксимальном и интерстициальном регионах.

7%); видоспецифичные гены - аллиназы (2,4%) и другие низко- и однокопийные гены (57,6%>).

9. Клонирован и секвенирован экзон-интронный 1092 п.н. фрагмент гена аллиназы А. сера. С помощью Tyramide-FISH установлена локализация этого гена в дистальной части длинного плеча (74,4%) ± 1) хромосомы 4 А. сера. Установлено наличие двух сайтов гибридизации гена в данном регионе на менее конденсированных хромосомах. Установлено, что ген аллиназы расположен в регионе с высокой частотой рекомбинации: соотношение числа пар нуклеотидов к частоте рекомбинации в данном регионе 1,76 МЬ/сМ.

10. Клонирован и секвенирован экзон-интронный фрагмент гена фактора элонгации 1В-а размером 2100 п.н. у А. сера и 1800 п.н. у А. fistulosum. С помощью Tyramide-FISH установлена локализация этого гена в двух локусах длинного плеча хромосомы 5 А. сера (22,24%) ± 2,83 и 54,45% ±

3,21) и в одном локусе длинного плеча хромосомы 5 А. АзШШит (33,31% ± 2,44).

11. Клонирован и секвенирован 1000 п.н экзон-интронный фрагмент гена а-комплекса зарождающегося полипептида, одинакового размера у А. сера и А. АзШоБит. С помощью Тугагшёе-РШН установлена локализация этого гена в двух локусах длинного плеча хромосомы 5 А. сера (30,95%) ± 3,72 и 53,51% ± 2,57) и в одном локусе длинного плеча хромосомы 5 А. /мШЬяит (40,07% ± 3,49).

12. Интегрирование физической и генетической карт хромосомы 5 показало, что проксимальные локусы генов а-комплекса зарождающегося полипептида и фактора элонгации 1В-а расположены в регионах с относительно низкой частотой рекомбинации (21,83 МЬ/сМ), а более дистальные локусы этих генов расположены в регионе с высокой частотой рекомбинации (0,3 МЬ/сМ).

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Проведенные исследования по клонированию, секвенированию, физическому картированию протеин-кодирующих генов на хромосомах А. сера и А. /Ъы1о8ит и интегрированию сконструированных нами физических карт с имеющимися генетическими картами позволяют нам сделать заключение о том, что у однодольных с крупным геномом плотность генов на хромосоме коррелирует с частотой рекомбинаций, что согласуется с данными полученными на других однодольных, таких как пшеница, ячмень и кукуруза. Плотность генов и частота рекомбинаций у этих зерновых культур наиболее высокая в дистальных регионах хромосом. Однако, известно, что у А. ^Ыозит градиент частоты рекомбинаций вдоль хромосомы диаметрально противоположен градиенту у большинства существующих видов растений, в т.ч. у А. сера и зерновых. А. /гяШЬзит в этом отношении является одним из редких видов, у которых события кроссинговера чаще всего происходят в проксимальном регионе хромосом. Благодаря возможности визуализировать гены на хромосоме с помощью Тугагтёе-Р18Н, было доказано, что плотность генов у А. /гзШЬяит высокая в проксимальном регионе и очень низкая в дистальном регионе хромосом. Обнаружены различия в распределении плотности генов вдоль физической хромосомы у А. /гзШЬзит и других однодольных (А. сера, зерновые).

Сравнительный анализ картирования индивидуальных генов на хромосомах А. сера и А. /¡яшЬзит показал наличие дупликации генов у А. сера. Для А. сера характерен высокий уровень дупликации генов, в этом видится одна из причин укрупнения генома в ходе длительной, более 5000 лет, селекции этого вида. Близкородственный дикорастущий вид А. ^з1и1озит имеет на 27% меньше размер генома и меньший уровень дупликации генов.

Конструирование физических карт с помощью прямого Тугагшс1е-Р18Н картирования генов/маркеров на хромосоме и их интегрирование с генетическими картами позволяет оценить положение интересующего гена относительно частоты рекомбинации, что является важным критерием в практической селекции для прогнозирования переноса гена и определения размеров популяции. Гены, находящиеся в регионе с высокой частотой рекомбинации, проще перенести от одного растения к другому, и для этого нужен меньший размер популяции, чем для переноса генов из регионов с низкой частотой рекомбинации.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Романов, Дмитрий Викторович, Москва

1. Кокорева, В. А., Титова, И. В. Лук, чеснок и декоративные луки. М. : ЮНИОН-паблик, 2007. - 208 с.

2. Imai, S., Tsuge, N., Tomotake, M., Nagatome, Y., Sawada, H., Nagata Т., Kumagai, H. An onion enzyme that makes the eyes water // Nature. 2002. -№ 419. - C. 685.

3. Голубев, В. Ф., Голубкина, Н. А., Горбунов, Ю. Н. Минеральный состав диких луков и их пищевая ценность // Прикладная биохимия и микробиология. 2003. - Т. 39; № 5. - С. 602-606.

4. King, J. J., Bradeen, J. M., Bark, O., McCallum, J. A., Havey, M. J. A low-density genetic map of onion reveals a role for tandem duplication in the evolution of an extremely large diploid genome // Theor Appl Genet. 1998. - № 96.-C. 52-62.

5. Khrustaleva, L. I., de Melo, P. E., van Heusden, A. W., Kik, C. The Integration of Recombination and Physical Maps in a Large-Genome Monocot Using Haploid Genome Analysis in a Trihybrid Allium Population // Genetics. -2005. -№ 169,-C. 1673-1685.

6. Albini, S. M., Jones, G. H. Synaptonemal complex spreading in Allium сера and Allium fistulosum. II. Pachytene observations: the SC karyotype and the correspondence of late recombination nodules and chiasmata // Genome. -1988. № 30. - C. 399-410.

7. Matthew, V., Rockman, Sonja, S., Skrovanek, Kruglyak, L. Selection at Linked Sites Shapes Heritable Phenotypic Variation in C. elegans // Science. -2010. T. 330; № 6002. - C.372-376.

8. Chen, X., Cho, Y. G., McCouch, S. R. Sequence divergence of rice microsatellites in Oryza and other plant species // Mol Gen Genomics. 2002. - № 268.-C. 331-343.

9. The Arabidopsis Information Resource Электронный^ ресурс. -Режим доступа: http://www.arabidopsis.org

10. Gill, К. S., Gill, В. S., Endo, Т. R., Boyko, E. V. Identification and high density mapping of gene-rich regions in chromosome group 5 of wheat // Genetics. 1996. - № 143. - C. 1001-1012.

11. Gill, K. S., Gill, B. S., Endo, T. R., Taylor, T. Identification and high density mapping of gene-rich regions in chromosome group 1 of wheat // Genetics. 1996. -№ 144.-C. 1883-1891.

12. Barakat, A., Matassi, G., Bernardi, G. Distribution of genes in the genome of Arabidopsis thaliana and its implication for the genome organization of plants // Proc. Natl. Acad. Sci. 1998. - № 95. - c. 10044-10049.

13. Schmidt, Т., Heslop-Harrison, J. S. Genomes, genes and junk: the large-scale organization of plant chromosomes // Trends Plant Sci. 1998. - № 3. -C. 195-199.

14. Flavell, R. B., Bennett, M. D., Smith, J. B. Genome size and the proportion of repeated nucleotide sequence DNA in plants // Biochem Genet. -1974.-№ 12.-C. 257-269.

15. Dooner, H. K. Genetic fine structure of the bronze locus in maize // Genetics. 1986. - № 113. - C. 1021-1036.

16. Barakat, A., Matassi, G., Bernardi, G. Distribution of genes in the genome of Arabidopsis thaliana and its implication for the genome organization of plants // Proc. Natl. Acad. Sci. 1998. - № 95. - C. 10044-10049.

17. Sandhu, D., Champoux, J. A., Bondareva, N., Gill, K. S. Identification and physiacal location of useful genes and markers to a major gene-rich region on wheat group IS chromosomes // Genetics. 2001. -№ 157.-C. 1735-1747.

18. Kiinzel, G., Korzun, L., Meister, A. Cytogenetically integrated physical restriction fragment length polimorphism maps for the barley genome base don translocation breakpoints // Genetics. 2000. - № 154. - C. 397-412.

19. Stephens, J. L., Brown, S. E., Lapitan, N. L. P., Knudson, D. L. Physical mapping of barley genes using an ultrasensitive fluorescence in situ hybridization technique // Genome. 2004. - № 47. - C. 179-189.

20. Martin, W. J., McCallum, J., Shigyo, M., Jakse, J., Kuhl, J. C., Yamane, N., Havey, M. J. Genetic mapping of expressed sequences in onion and in silico comparisons show scant colinearity with rice // Mol Gen Genomics. -2005,- № 274. C. 197-204.

21. Stack, S.M., Comings, D.E. The chromosomes and DNA of Allium cepa//Chromosoma. 1979. - № 70. - C. 161-181.

22. Chen, J.M., Gustafson, J.P. Physical mapping of restriction fragment length polymorphisms (RFLPs) in homoeologous group 7 chromosomes of wheat by in situ hybridization // J. Hered. 1995. - № 75. - C. 225-233.

23. Dvorak, J., Chen, К. C. Distribution of nonstructural variation between wheat cultivars along chromosome arm 6Bp: Evidence from the linkage map and physical map of the arm // Genetics. 1984. - № 106. - C. 325-333.

24. Ma, X. F., Ross, K., Gustafson, J. P. Physical mapping of restriction fragment length polymorphism (RFLP) markers in homoeologous groups 1 and 3 chromosomes of wheat by in situ hybridization // Genome. 2001. - № 44. - C. 401-412.

25. Koul, A. K. Cytology of the Tetraploid Allium ampeloprasum with Chiasma Localization // Chromosoma. 1970. - № 29. - C. 12-19.

26. Levan, A. Cytological studies in Allium IV. Allium fistulosum // Sven. Bot. Tidskr. 1933. - № 27. - C. 211-232.

27. Арефьев, В.А., Лисовенко, Л.А. Англо-русский толковый словарь генетических терминов. М. : BFMPO, 1995.

28. Leitch, I. J., Leitch, A. R., Heslop-Harrison, J. S. Physical mapping of plant DNA sequences by simultaneous in situ hybridization of two differently fluorescent probes // Genome. 1991. - № 34. - C. 928-932.

29. Albini, S.M., Schwarzacher, T. In situ localization of two repetitive DNA sequences to surfa-spread pachytene chromosome of rye // Genome. 1992. - № 35. -C. 551-559.

30. Friebe, B., Jiang, J., Gill, B. S., Dyck, P. L. Radiation-induced nonhomoeologous wheat-Agropyron intermedium chromosomal translocations conferring resistance to leaf rust // Theor Appl Genet. 1993. - № 81. - C. 146149.

31. Jackson, S.A., Dong, F., Jiang, J. Digital mapping of bacterial artificial chromosomes by fluorescence in situ hybridization // Plant J. 1999. -№ 17.-C. 581-572.

32. Jiang, J., Gill, B. S., Wang, G. L., Ronald, P. C., Ward, D. C. Metaphase and interphase fluorescence in situ hybridizationmapping of the rice genome with bacterial artificial chromosomes // Prpc Natl Acad Sci. 1995. - № 92.-C. 4487-4491.

33. Jiang, J., Hulbert, S. H., Gill, B. S., Ward, D. C. Interphase fluorescence in situ hybridization: a physical mapping strategy for plant species with large complex genomes // Mol. Gen.Genet. 1996. - № 252. - C. 497-502.

34. Khrustaleva, L. I., Kik, C. Localization of single-copy T-DNA insertion in transgenic shallots (Allium cepa) by using ultra-sensitive FISH with tyramide signal amplification // Plant J. 2001. - № 25. - C. 699-707.

35. Peterson, D. G., Lapitan, N. L. V., Stack, S. M. Localization of single-and low-copy sequences on tomato synaptonemal complex spreads using fluorescence in situ hybridization (FISH) // Genetics. 1999. - № 152. - C. 427439.

36. Xu, J., Earle, E. D. High resolution physical mapping of 45S (5.8S, 18S and 25S) rDNA geneloci in the tomato genome using a combination of karyotyping and FISH of pachytene chromosomes // Chromosoma. 1996. - № 104.-C. 545-550.

37. Zhong, X. B., de Jong, J. H., Zabel, P. Preparation of tomato meiotic pachytene and mitotic metaphase chromosomes suitable for fluorescence in situ hybridization (FISH) // Chromosome Res. 1996. - № 4. - C. 24-28.

38. Kamstra, S. A., Kuipers, A. G., de Jeu, M. J. Physical localization of repetitive DNA sequences in Alstroemeria: karyotyping of two species with species-specific and ribosomal DNA // Genome. 1997. - № 40. - C. 652-658.

39. Hanson, R. E., Zwick, M. S., Choi, S. Fluorescence in situ hybridization of a bacterial artificial chromosome // Genome. 1995. - № 38. -C. 646-651.

40. Lapitan, N. L. V., Brown, S. E., Kennard, W. FISH physical mapping with barley BAC clones // Plant J. 1997. - № 11. - C. 149-156.

41. Gomez, M. I., M. Islam-Faridi, N., Woo, S. S. FISH of maize sh2-selected sorghum BAC to chromosomes of Sorhum bicolor // Genome. 1997. -№40. -C. 475-478.

42. Fuchs, J., Kloos, D. U., Ganal, M. V., Schubert, I. In situ localization of yeast artificial chromosome sequences on tomato and potato metaphase chromosomes // Chromosome Res. 1996. - № 4. - C. 277-281.

43. Adams, M., Kelley, J., Gocayne, J., Dubnick, M., Polymeropoulos, H., Xiao, H., Merril, C., Wu, Olde, R., Moreno, R., Complementary DNA sequencing:

44. Expressed sequence tags and human genome project // Science. 1991. - № 252. -C. 1651-1656.

45. Okubo, K., Hori, N., Matoba, R., Niiyama, Т., Fukushima, A., Kojima, Y., Matsubara Large scale cDNA sequencing for analysis of quantitative and qualitative aspects of gene expression // Nature Genet. 1992. - № 2. - C. 173-179.

46. Sikela, J. M., Aufray, C. Finding new genes faster than ever // Nature Genet. 1993.- № 3. - C. 189-191.

47. Gautheret, D., Poirot, O., Lopez, F., Audic, S., Claverie, J. M. Alternate polyadenylation in human mRNAs: a large-scale analysis by EST clustering // Genome Res. 1998. - № 8. - C. 524-530.

48. Rawlings, J. R., Searls, D. B. Computational gene discovery and human disease // Curr. Opin. Genet. Dev. 1997. - № 7. - C. 416-423.

49. Zweiger, G., Scott, R. W. From expressed sequence tags to 'epigenomics': an understanding of disease processes // Curr. Opin. Biotechnol. -1997,- № 8. C. 684-687.

50. Schmitt, A. O., Specht, Т., Beckmann, G., Dahl, E. Exhaustive mining of EST libraries for genes differentially expressed in normal and tumour tissues // Nucl. Acids Res. 1999. - № 21. - C. 4251-4260.

51. Vingron, M., Hoheisel, J. Computational Aspects of Expression Data // J. Mol. Med. 1999. - № 77. - C. 3-7.

52. Свободная энциклопедия Электронный ресурс. Режим доступа: http://ru.wikipedia.org

53. The National Center for Biotechnology Information Электронный ресурс. Режим доступа: http://www.ncbi.nlm.nih.gov

54. Yu, J. К., Dake, Т. M., Singh S., Benscher D., Li W., Gill, В., Sorrells, М. Е. Development and mapping of EST-derived simple sequence repeat markers for hexaploid wheat // Genome. 2004. - № 47. - C. 805-818.

55. Kim, D. W., Jung, T. S., Nam, S. H. GarlicESTdb: an online database and mining tool for garlic EST sequences // Plant Biology. 2009. - № 9. - C. 61.

56. Brown, T.A. Gene cloning and DNA analysis: an introduction. MA: Blackwell Pub., 2010.

57. Nathans, D., Smith, H.O. Restriction endonucleases in the analysis and restructuring of DNA molecules // Annu. Rev.Biochem. 1975. - № 44. - C. 273-293.

58. Cohen, S. N., Chang, A. C., Boyer, H. W., Helling, R. B. Construction of biologically functional bacterial plasmids in vitro // Proc. Natl. Acad. Sei. -1973,- № 11.-С. 3240-3244.

59. Watson, J. D. Recombinant DNA: genes and genomes: a short course. San Francisco: W.H. Freeman, 2007.

60. Patten, C. L., Glick, B. R., Pasternak, J. Molecular Biotechnology: Principles and Applications of Recombinant DNA. Washington, D.C: ASM Press., 2009.

61. Brown, T. Gene cloning and DNA analysis: an introduction. Cambridge, MA: Blackwell Pub., 2006.

62. Shizuya, H., Birren, В., Kim, U. J. Cloning and stable maintenance of 300-kilobase-pair fragments of human DNA in Escherichia coli using an F-factor-based vector // Proc. Natl. Acad. Sei. 1992. - № 18. - С. 8794-8797.

63. Shortle, D., Nathans, D. Local mutagenesis: a method for generating viral mutants with base substitutions in preselected regions of the viral genome // Proceedings of the National Academy of Sciences USA.- 1978. № 75. - C. 2170-2174.

64. Flavell, R. A., Sabo, D. L., Bandle, E. F., Weissmann, C. Site-directed mutagenesis: effect of an extracistronic mutation on the in vitro propagation of bacteriophage Qbeta RNA // Proc Natl Acad Sci USA.- 1975. № 72. - C. 367371.

65. Buttner-Mainik, A., Parsons, J., Jérôme, H., Hartmann, A., Lamer, S., Decker, E.L. Production of biologically active recombinant human factor H in Physcomitrella // Plant Biotechnology Journal. 2011. - № 9. - C. 373-383.

66. The, M.J. Human insulin: DNA technology's first drug // Am J Hosp Pharm. 1989,- №9.-C. 9-11.

67. Lewandowski, C., Barsan, W. Treatment of acute ischemic stroke // Ann Emerg Med. 2001. - № 37. - C. 202-216.

68. Chang, M.H., Chen, C.J., Lai, M.S. Universal hepatitis B vaccination in Taiwan and the incidence of hepatocellular carcinoma in children. Taiwan Childhood Hepatoma Study Group // N. Engl. J. Med. 1997. - № 336. - C. 1855-1859.

69. Crusio, W. E., Goldowitz, D., Holmes, A., Wolfer, D. Standards for the publication of mouse mutant studies // Genes, Brain and Behavior. 2009. -№ 8. -C. 1-4.

70. Bourdi, M., Davies, J. S., Pohl, L. R. Mispairing C57BL/6 Substrains of Genetically Engineered Mice and Wild-Type Controls Can Lead to

71. Confounding Results as It Did in Studies of JNK2 in Acetaminophen and Concanavalin A Liver Injury // Chemical Research in Toxicology. 2011. - № 24.-C. 794-796.

72. Gasdaska, J.R., Spencer, D., Dickey, L. Advantages of Therapeutic Protein Production in the Aquatic Plant Lemna // BioProcessing Journal. 2003. -C. 49-56.

73. Baur, A., Reski, R., Gorr, G. Enhanced recovery of a secreted recombinant human growth factor using stabilizing additives and by co-expression of human serum albumin in the moss Physcomitrella patens // Plant Biotech. J. -2005,- № 3. C. 331-340.

74. Monsanto Company History Электронный ресурс. Режим доступа: http://www.Monsanto.com

75. Monsanto Will Let Bio-Crop Patents Expire Электронный ресурс.- Режим доступа: http://www.Monsanto.com

76. Monsanto Genuity Roundup Ready canola trait Электронный ресурс. Режим доступа: http://www.Genuity.com

77. Monsanto Genuity Roundup Ready sugarbeets trait Электронный ресурс. Режим доступа: http://www.Genuity.com

78. Agbios GM database entry for wheat event MON71800 Электронный ресурс. Режим доступа: http://www.Monsanto.com

79. Agbios GM database entry for alfalfa events events J101 and J163 Электронный ресурс. Режим доступа: http://www.Monsanto.com

80. Benbrook, C. Evidence of the Magnitude and Consequences of the Roundup Ready Soybean Yield Drag from University-Based Varietal Trials // Ag BioTech InfoNet. Technical Paper Number 11998.

81. Mazyoer, F., Frankenfish and the future. 2004.

82. Robischon, M., Leuchtfische aus dem Genlabor // Natürlich. 2006. -№ 8.-C. 6-13., by, August 2006 8: 6- 13

83. Pfeifer, A., Verma, I.M. Gene therapy: promises and problems // Annu Rev Genomics Hum Genet.-2001.- №2.-C. 177-211.

84. Gustafson, J. P., Butler, E., Mclntyre, C. L. Physical mapping of a low copy DNA sequence in rye (Secale cereale L) // Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. -1990,- №87.-C. 1899-1902.

85. Chen, J.M., Gustafson, J.P. Physical mapping of restriction fragment length polymorphisms (RFLPs) in homoeologous group 7 chromosomes of wheat by in situ hybridization // J. Hered. 1995. - № 75. - C. 225-233.

86. Leitch, I.J., Heslop-Harrison, J.S. Physical mapping of four sites of 5S rDNA sequences and one site of the a-amylase-2 gene in barley (Hordeum vulgare) // Genome. 1993. - № 36. - C. 517-523.

87. Bi, X. Z., Song, Y. C., Ren, N., Liu, L. H., Yan, H. M. Physical localization of phyA and rbcS genes in rice (Oryza sativa L.) // Acta Phytophysiol. Sin. 1990,- № 25. - C. 73-79.

88. Ma, X. F., Ross, K., Gustafson, J. P. Physical mapping of restriction fragment length polymorphism (RFLP) markers in homoeologous groups 1 and 3 chromosomes of wheat by in situ hybridization // Genome. 2001. - № 44. - C. 401-412.

89. Chung-Ju, R. W., Harper, L., Cande, W. Z. High-Resolution Single-Copy Gene Fluorescence in Situ Hybridization and Its Use in the Construction of a Cytogenetic Map of Maize Chromosome 9 // The Plant Cell. 2006. - № 18. - C. 529-544.

90. Stephens, J. L., Brown, S. E., Lapitan N. L. V., Knudson, D. L. Physical mapping of barley genes using an ultrasensitive fluorescence in situ hybridization technique // Genome. 2004. - № 47. - C. 179-189.

91. Bobrow, M. N., Harris, T. D., Shaughnessy, K. J., Litt, G. J. Catalyzed reporter deposition, a novel method of signal amplification. Application to immunoassays // J. Immunol. Meth. 1989. - № 125. - C. 279-285.

92. Raap, A., Van De Corput, M., Vervenne, R., Van Gijlswijk, R., Tanke, H., Wiegant, J. Ultra-sensitive FISH using peroxidase-mediated deposition of biotin- or fluorochrome-tyramides // Hum. Mol. Genet. 1995. - № 4. - C. 529-534.

93. Raap, A.K. Advances in fluorescence in situ hybridization // Mutat. Res. 1998. - № 400. - C. 287-298.

94. Speel, E., Ramaekers, F., Hopman, A. Sensitive multicolor fluorescence in situ hybridization using catalyzed reporter deposition (CARD) amplification // J. Histochem. Cytochem. 1997. - № 45. - C. 1439-1446.

95. Stack, S. M., Comings, D. E. The chromosomes and DNA of Allium cepa//Chromosoma. 1979.- № 70. - C. 161-181.

96. Kirk, J. T. O., Rees, H., Evans, G. Base composition of nuclear DNA with the genus Allium // Heredity. 1970. - № 25. - C. 507-512.

97. Fajkus, J., Sykorova, E., Leitch, A. R. Telomeres in evolution and evolution of telomeres // Chrom Res. 2005. - № 13. - C. 469-479.

98. Zakian, V. A. Telomeres: beginning to understand the end // Science.- 1995,- №270.-C. 1601.

99. Richards, E. J., Ausubel, F. M. Isolation of a higher eucariotic telomere from Arabidopsis thaliana // Cell. 1998. - № 53. - C. 127.

100. Sykorova, E., Lim, K. Y., Kunicka, Z., Chase, M. W., Bennett, M. D., Fajkus, J., Leitch, A. R. Telomere variability in the monocotyledonous plant order Asparagales // Proc. R. Soc. Lond. B. 2003. - № 270. - C. 79-84.

101. Fuchs, J., Brandes, A., Schubert, I. Telomere sequences localization and karyotype evolution in higher plants // Plant Syst. Evol. 1995. - № 196. - C. 227.

102. Irifune, K., Hirai, K., Zheng, J., Tanaka, R., Morikawa, H. Nucleotide sequences of a highly repeated DNA sequences and its chromosomal localization in Allium fistulosum // Theor. Appl. Genet. 1995. - № 90. - C. 312.

103. Pich, U., Fuchs, J., Schubert, I. How do Alliaceae stabilize their chromosome ends in the absence of TTTAGGG sequnces // Chromosome Res. -1996,- №4.-C. 207.

104. Stack, S. M., Comings, D. E. The chromosomes and DNA of Allium cepa // Chromosoma. 1979. - № 70. - C. 161 -181.

105. Durante, M., Tagliasacchi, S., Avanzi Fast reannealing sequences of DNA in Allium cepa: characterization and chromosomal localization // Cytobios. -1985,- № 44. C. 263-271.

106. Havey Restriction enzyme analysis of the nuclear 45s ribosomal DNA of six cultivated Alliums (Alliaceae) // Plant System Evolution. 1992. - № 181. -C. 45-55.

107. Maggini, F., Carmona, M. J. Sequence heterogeneity of the ribosomal DNA in Allium cepa (Liliaceae)// Protoplasma. 1981. - № 108. - C. 163-171.

108. Ricroch, A., Peffley, E. B., Baker, R. J. Chromosomal location of rDNA in Allium in situ hybridization using biotin- and fluorescein-labelled probe //Theor Appl Genet. 1992,- № 83. - C. 413-418.

109. Hizume, M. Allodiploid nature of Allium wakegi Araki revealed by genomic in situ hybridization and localization of 5S and 18S rDNAs // Jpn J Genet. 1994,- №69. -C. 407-415.

110. Lee, S. H., Do, G. S., Seo, В. B. Chromosomal localization of 5S rRNA gene loci and the implications for relationships within the Allium complex // Chromosome Res. 1999. - № 7. - C. 89-93.

111. Kamstra, S. A., Kuipers, A. G., de Jeu, M. J. Physical localization of repetitive DNA sequences in Alstroemeria: karyotyping of two species with species-specific and ribosomal DNA // Genome. 1997. - № 40. - C. 652-658.

112. Martin, W. J., McCallum, J., Shigyo, M., Jakse, J., Kuhl, J. C., Havey, M. J. Genetic mapping of expressed sequences in onion and in silico comparisons with rice show scant colinearity // Mol Gen Genomics. 2005. - № 274. - C. 197204.

113. Казакова А. А. Многолетние луки. JI.: Колос, 1966. - 61с.

114. Скоблина В. И. Лук репчатый. М.: Аркада-пресс, 2001. - 32 с.

115. Агафонов А. Ф., Дубова М. В. Использование видового разнообразия рода Allium L. в селекции // Селекция и семеноводство овощных культур в 21 веке. Доклады международной научнопрактической конференции. -М.: 2000. Т.1. С. 85-87.

116. Авцын А. П. Микроэлементозы человека. М.: Медицина, 1993. -496 с.

117. Currah L., Ockendon D. J., Maude R. B. Breeding for Botrytis resistance in onion // In: Proc. 3th Allium Symp. 1984. - № 6.

118. Netzer, D., Rabinowitch, H. D., Weintal, C. Greenhouse technique to evaluate pink root disease caused by Pyrenochaeta terrestris // Euphytica. 1985. -№ 34.-C. 385-391.

119. Galvan, G. A., Wietsma, W. A., Putrasemedja, S., Permadi, A. H., Kik, C. Screening for resistance to anthracnose (Colletotrichum gloeosporioides Penz.) in Allium сера and wild relatives // Euphytica. 1997. - № 95. - C. 173178.

120. Ponti, О. M. В., Inggamer, H. Resistance to the onion fly in Allium сера and Allium fistulosum // Eucarpia . 1984. - № 3. - C. 21-23.

121. Meer, Q. P., Bennekom, J. L. Improving the onion crop (Allium сера L.) by transfer of characters from Allium fistulosum L. // Biul Warzywniczy. -1978,- № 22. C. 87-91.

122. Компания "Гавриш" Электронный ресурс. Режим доступа: http://www.gavrish.ru

123. Rogers, S. О, Bendich, A. J. Exctraction of DNA from plant tisues // Plant. Мої. Biol. 1988. - № 6. - C. 1-10.

124. King, J. J., Bradeen, J. M., Havey, M. J. Variability for restriction fragment-length polymorphisms (RFLP) and relationships among elite commercial inbred and virtual hybrid onion populations // J Am Soc Hort Sci. 1998. - № 123.-C. 1034-1037.

125. Pijnacker, L. P., Ferwerda, M. A. Giemsa C-banding of potato chromosomes // Can J Genet Cytol. 1984. - № 26. - C. 415-419.

126. Бочков Н.П. Культура лимфоцитов как тест-объект для изучения генетических последствий у лиц, контактирующих с мутагенами. М.: Медицина, ЦИУВ. 1989. - 113 с.

127. Innovative Solutions For Automated Imaging Электронный ресурс. -Режим доступа: http://www.metasystems.su/

128. MicroMeasure Электронный ресурс. Режим доступа: http:/www.colostate.edu/Depts/Biology/MicroMeasure

129. Basic Local Alignment Search Tool Электронный ресурс. Режим доступа: http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/

130. Genetic Information Research Institute Электронный ресурс. -Режим доступа: http://www.girinst.org/

131. Jurka, J., Kapitonov, V. V., Pavlicek, A., Klonowski, P., Kohany, O., Walichiewicz, J. Repbase Update, a database of eukaryotic repetitive elements // Cytogentic and Genome Research. 2005. - № 110. - C. 462-467.

132. Kohany, O., Gentles, A. J., Hankus, L., Jurka, J. Annotation, submission and screening of repetitive elements- in Repbase: RepbaseSubmitter and Censor // BMC Bioinformatics. 2006. - № 25. - C. 474.

133. Khrustaleva, L. I., de Melo, P. E., van Heusden, A. W., Kik, C. The Integration of recombination and physical maps in a large-genome monocot using haploid genome analysis in a trihybrid Allium population // Genetics. 2005. -169.-C. 1673-1685.

134. Burr, В., Burr, F. A., Thompson, M. C., Albertson, M. C., Stuber, C. W. Gene maping with recombinant inbreds in maize // Genetics. 1988. - № 118. -C. 519-526.

135. Michalek, W., Ktinzel, G., Graner Sequence analysis and gene identification in a set of mapped RFLP markers in barley (Hordeum vulgare) // Genome. 1999. - № 42. - C. 849-853.

136. Gill, K. S„ Gill, B. S., Endo, T. R. Boyko, E.V. Identification and high density mapping of gene-rich regions in chromosome group 5 of wheat // Genetics. 1996. - № 143. - C. 1001-1012.

137. Kiinzel, G., Korzun, L., Meister, A. Cytogenetically integrated physical restriction fragment length polimorphism maps for the barley genome base don translocation breakpoints // Genetics. 2000. - № 154. - C. 397-412.

138. Anderson, L. K., Salmen, N., Bass, H. W., Harper, L. C., Cande, W. Z. Integrating genetic linkage maps with pachytene chromosome structure in maize // Genetics. 2004. - № 166. - C. 1923-1933.

139. Anderson, L. K., Lai, A., Stack S. M., Rizzon, C., Gaut, B. S. Uneven distribution of expressed sequence tag loci on maize pachytene chromosomes // Genome Res. 2006. - № 16. - C. 115-122.

140. Harrison, P. M., Echols, N., Gerstein, M. B. Digging for dead genes: an analysis of the pseudogene population in the Caenorhabditis elegans genome // Nucleic Acids Res. 2001. - № 29. - C. 818-830.

141. Shiratake, K. Genetics of Sucrose Transporter in Plants // Global Science Books. 2007. - C. 73-78.

142. СПИСОК ИЛЛЮСТРАТИВНОГО МАТЕРИАЛА

143. Рисунок 1. Кросс-биваленты A. ampeloprasum.12

144. Рисунок 2. Принцип метода FISH (Флуоресцентной in situ гибридизации).15

145. Рисунок 3. Принцип метода Tyramide-FISH.27

146. Рисунок 4. Лук репчатый Allium сера.32

147. Рисунок 5. Лук батун Allium fistulosum L.33

148. Рисунок 6. Схематическое изображение вектора pUC-13.38

149. Рисунок 7. Схематическое изображение вектора pPCR-ScriptTM Amp SK(+).39

150. Рисунок 8. Схематическое изображение вектора pGEM®-T Easy.41

151. Рисунок 9. Процентное соотношение белков, соответствующих EST клонам в имеющейся библиотеке.47

Информация о работе