Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Особенности диминуции хроматина у Cyclops kolensis и Cyclops strenuus strenuus (Crustacea, Copepoda)

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Особенности диминуции хроматина у Cyclops kolensis и Cyclops strenuus strenuus (Crustacea, Copepoda)"

vV о ^

' < "" На правах рукописи

ГРИШАНИН

АНДРЕЙ КОНСТАНТИНОВИЧ

ОСОБЕННОСТИ ДИМИНУЦИИ ХРОМАТИНА У CYCLOPS KOLENSIS И CYCLOPS STBENUUS STRENUUS (CBUSTACEA,COPEPODA)

Специальность O.'J.00.15. - генетика

Автореферат диссертации па соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва -1996

Работа выполнена в Институте химической физики им.Н.Н.Семенова РАН в Институте биологии внутренних вод ии.И.Д.Папанина РАН и в Институте биологии развития им.Н.К.Кольцова РАН

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор А.П.Акифьев Научный консультант:

доктор биологических наук, профессор В.Я.Бродский

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук В.Г.Митрофанов, доктор биологических наук .Н.А.Ляпунова

Ведущая организация:

Институт общей генетики им. Н.И.Вавилова РАН

Защита диссертации состоится "21" февраля 1996г.

в 11 часов на заседании специализированного совета Д-002.85Л по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора на) в Институте биологии развития им. Н.К.Кольцова РАН по адресу: г.Москва, ул.Вавилова,26.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биологии развития им.Н.К.Кольцова.

Автореферат разослан " С/ 1996 г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

кандидат биологических наук Е.В.Волина

ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования. Под диминуцией хроматина (ДХ) понимается круг генетических процессов,приводящих к неравноценности в количественной и качественном отношении геномов клеток зародышевой плазкы и соматических тканевых клеток.

Феномен ДХ был открыт Бовери в 1887г. (Boveri,1887). Особый интерес представляет ДХ у циклопов (Crustacea.Copepoda),где она заключается в элиминации на ранних стадиях развития большей или меньшей части хромосомного материала из зародышевых соматических клеток. Явление ДХ имеет множество интересных для фундаментально** и прикладной биологии аспектов,начиная от эмбриологии,кончая методологией генной инженерии. Согласно Шапиро (Shapiro,1992), диминуция хроматина относится к тем процессам,которые можно рассматривать в качестве примеров генной инженерии в природе. Наибольшее значение ДХ представляет для понимания организации хромосом высших эукариот. Сам процесс ДХ наглядно показывает, какая часть генома необходима и достаточна для нормального функционирования практически всех тканевых клеток по крайней мере тех организмов, у которых она встречается.

К настоящему времени ДХ известна у немногих видов эукариот (Райков,1992; Beermann,1977; Ammermann,1985; ТоЫer,1986;Pimpinel1 i,Goday, 1989; Tobler et al.,1992),поэтому особую актуальность приобретают исс-педования тех объектов,в частности представителей рода Cyclops,у которых ДХ затрагивает значительную,в идеале максимальную долю генома со-натических клеток .

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы было изучение 1роцесса ДХ у двух представителей рода Cyclops - Cyclops kolensis Lili л подвида Cyclops strenuus strenuus Fischer, отличного по картине ДХ зт вида С.strenuus,который описала Берман (Beermann,1977). Были поставлены следующие задачи:

1.Провести с помощью цитофотометрии фельгеновской реакции срав-1ение содержания ДНК в клетках обоих видов циклопов до и после ДХ.

2.Исследовать цитологически с помощью светового и электронного (икроскопа процесс ДХ у С.kolensis .обращая особое внимание на иэмене-же структуры хромосом.

3.Изучить с помощью электронной микроскопии структуру гранул элиминируемого хроматина у С.kolensis.

Научная новизна. Впервые обнаружен вид эукариот - С.kolensis, у которого после рекордной потери генетического материала - более 90% в соматических клетках полностью сохраняется число и типичная структура митотических хромосом. Этот факт указывает на то,что у С.kolensis более 90% хромосомной ДНК не связана как с кодирующими,так и с регуля-торными функциями, необходимыми для дифференцировки соматических клеток.

Обнаружен подвид C.strenuus strenuus диплоидное количество хромосом у которого,а также картина и график димииуционных процессов отличаются от описанных ранее для вида Cyclops strenuus Берман (Beermann, 1977).

Показано,что репликация ДНК у С.kolensis завершается до диминуции хроматина .

Установлено,что хромосомы С.kolensis в преддикинуиионнок митозе без какой-либо предобработки проявляют сегментацию,типичную для G-дис-ков млекопитающих.

Впервые описана мембрана,окружающая гранулы элиминируемого хроматина у многоклеточного эукариотического организма, которая в отличие от ядерной мембраны эукариотических клеток однослойная и в ней отсутствуют поры.

Впервые у представителей копепод в тканях взрослых циклопов С.kolensis и C.strenuus strenuus»обнаружены высокополиплоидные клетки, возникшие на основе постдиминуционного генома.

Впервые у многоклеточного эукариотического организма изучена структура хромосом и интерфазных ядер зародышевых клеток до и после ДХ при помощи электронной микроскопии.

На основе полученных данных высказано предположение: процесс, подобный ДХ у С.kolensis и C.strenuus strenuus, должен предшествовать смене типов интерсперсим последовательностей различной степени повторяемости в неходируюцей части генома,многократно происходившей в ходе эволюции эукариот.

Практическая значимость. 1.Специфика картины ДХ - количественная и качественная - может быть использована в качестве критерия при опре-

делении видов рода Cyclops. Известно,что идентификация видов этого рода по стандартным морфологическим признакам представляет большие трудности даже для зоологов-систематиков.

2.Можно полагать,что в результате ДХ у C.kolensis в генетических локусах хромосом соматических клеток сохраняется минимальное число функционально значимых последовательностей ДНК .В таком случае дальнейшие исследования молекулярной структуры таких минилокусов окажутся полезными для оптимизации методов конструирования фрагментов донорной ДНК, используемых в генной инженерии, и в частности, при генотерапии наследственных болезней человека.

Положения выносимые'на защиту:

Открытие у C.kolensis рекордной для многоклеточных организмов доли генома»элиминируемой при ДХ из ядер соматических клеток;

Обнаружение подвида С.strenuus с отличными от известных ранее для этого вида цитогенетическими характеристиками, такими как: диплоидное число хромосом,общая картина и график диминуционных процессов:

Описание процесса ДХ у C.kolensis;

Обнаружение спонтанной G-подобноЯ поперечной сегментации хромосом :.kolensis в преддиминуционном митозе;

Обнаружение специфической структуры мембран, окружающих гран*-элиминируемого хроматина;

Сравнение удьтраструхтуры митотических хромосом и интерфаэных 1Дер клеток зародыша C.kolensis до и после ДХ.

Публикации. Основные результаты исследований, представленные в (иссертациоиной работе,изложены в семи журнальных статьях,три из кото->ых находятся в печати.

Апробация работы. Основные материалы диссертационной работы были [оложены на научных семинарах и на заседании Ученого совета Института ¡иологии внутренних вод им.И.Д.Папанина РАН (1991-1995) , на научных :еминарах Института химической физики им.Н.Н.Семенова РАН (1991-1993), нститута.общей генетики им.Н.И.Вавилова РАН (1994), Института молеку-ярной генетики РАН (1995), Института цитологии РАН (1994), на заседа-ии Санкт-Петербургского отделения ВОГиС,посвященном 90-летию со дня ождения А.А.Прокофьевой-Бельговской (30 марта 1993 г.),на международ-ой конференции по "Эволюционной генетике и адаптации", посвященной

памяти Жака Moho (Оссуа, Франция, 25-29 сент. 1995).

Структура и объем диссертации. Материал диссертации, состоящий из введения, обзора литературы, изложения материалов и методов, результатов, обсуждения и выводов, представлен на 101 машинописной странице, включая 4 таблицы и 21 рисунок. Список литературы включает 171 работу, из них 140 работ на иностранных языках. Общий объем диссертации составляет 119 страниц машинописного текста.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ

Работа была проведена на циклопах,отловленных в пруду на Воробьевых горах в Москве и в пруду д,Заломы Некоузского р-на. Ярославской обл.Во время работы было исследовано около 500 особей Cyclops koleneis и более 200 особей Cyclops strenuus strenuus. У обоих видов диминуция хроматина (ДХ) описана нами впервые. Для количественной и качественной характеристики феномена ДХ у исследованных видов циклопов необходимо было провести окраску большого числа циклопов по методу Фельгена строго в одних и тех же условиях. Для этого нами была разработана модифицированная методика подготовки препаратов для цитофотометрии,которая не требует их замораживания сухим льдом или жидким азотом.' Самки циклопов с яйцевыми мешками и семенники дрозофилы подвергали в одном объеме гидролизу в IN НС1 при t»60 С в течение 12,5 мин. Наличие в одном объеме большого числа препаратов гарантировало одинаковые условия гидролиза для всех объектов, что исключительно важно при цитофотометри-ческих исследованиях. По окончании гидролиза пробы промывали дистиллированной водой, окрашивали реактивом Шиффа, затем промывали сернистой водой, проводили через 35%,70%,96% этанол по 15 мин в каждом, раздавливали покровным стеклом на предметном, затем снова помещали в 96% этанол на 20 мин. Далее исследуемый материал проводили через бутанол, бутанол-ксилол, ксилол по 20 мин в каждом, и заключали в бальзам. Количество ДНК измеряли на сканирующем микроденситометре,используя объектив 100Х в области поглощения ДНК-фуксина(Фельген)-580нм.

Необходимым условием для исследования диминуционного процесса у C.kolensis в электронном микроскопе была методическая разработка, позволившая определять In .vivo стадию дробления зародыша циклопа в свето-

вой микроскопе. Ныло установлено,что количество бластомеров в дробящемся центролецитальном яйце вышеуказанных видов циклопов соответствует числу сферических образований,представляющих собой участки цитоплазмы с ядром и имеющих, по-видимому, оптическую плотность отличную от таковой окружающего их желтка. Подобным образом «о«но достаточно, надежно определять стадию деления зародыша вплоть до окончания 6-го деления дробления. Необходимо заметить,что дробление зародышей в парных яйцевых мешках C.kolensis и C.strenuus происходит с высокой степенью синхронности. Эта особенность развития зародышей C.kolensis также била использована при приготовлении препаратов для изучения их методами электронной микроскопии. Парные яЛцевып кешки циклопов использовали с целью получения контрольного препарата для световой микроскопии, Была измерена длительность промежутка времени между следующими друг за другом эмбриональными делениями C.kolensis и C.strenuus путем определения стадии дробления in vivo с последующей фиксацией зародышей ji окраской ацетоорсеином . >

.. Для исследования структуры хромосом и интерфазных ядер Cyclops kolensis до и после ДХ в трансмиссионном электронном микроскопе (ТЭМ) у C.kolensis отделяли парные яйцевые мешки , один из которых фиксировали для световой микроскопии в снеси этанол/уксусная кксло-та(3:1), второй для электронной в 2,5% глутаровом альдегиде на 0,07М фосфатном буфере при рН=6,9, в течение 1,5 часов- Часть препаратов, предназначенную для изучения в световом микроскопе, окрашивали по Фельгену или ацетоорсеином. Препараты, которые готовились для изучения в ТЭМ после изучения их в световом микроскопе, промывали в фосфатном буфере, обезвоживали в серии этиловых спиртов возрастающей концентрации, помещали в 70* этанол,насыщенный уранилацетатом и завершали обезвоживание в 100SS этаноле, бутаноле и ксилоле. После этого препараты помещали в аралдит и выдерживали в термостате при t=37 С 12 часов, а далее при 60 С двое суток. Полученные срезы контрастировали уранилацетатом и окрашивали по Рейнольдсу. Срезы многих десятков клеток зародышей C.kolensis были исследованы в ТЭМ Hitachi при ускоряющем напряжении 60 kv.

Для изучения гранул элиминируемого хроматина в клетках зародыша C.kolensis при помощи ТЭМ применялся также модифицированный метод Нил-

лера (Miller,Bakken, 1972), согласно которому проводили обработку дробящихся яиц C.kolensis на этапах 2-7 делениях дробления. Для этого яйцевые мешки циклопа замораживали сухим льдом или жидким азотом, раздавливали на предметном стекле, и ресуспендировали содержимое яйцевых мешков в этой смеси. Диспергированный материал наносили на сетки, окрашивали 1% уранилацетатом в течение 15 секунд»ополаскивали в 70% этаноле и в воде с рН«9 и высушивали сетки на воздухе.

Гранулы C.kolensis изучались также и при помощи сканирующей электронной микроскопии. Для этого яйцевые мешки самок С.ко1епа1в,фик-■ сированные смесью этанола и уксусной кислоты (3:1), окрашивали ацето-орсеином, изучали полученные препараты в световом микроскопе,затем замораживали их на сух^ч льду,и снимали пинцетом покровное стекло. Подготовленные таким образом препараты промывали в фосфатном буфере (рН»6,9), дегидратировали в растворах ацетона (20г100%) и .высушивали методом перехода критической точки. В дальнейшем препараты были изучены в СЭМ 3SM-25S, Зео1 под углом 45 .

Работа с циклопами представляет большие трудности во многих отношениях. Во-первых, определение видов циклопов крайне сложно даже для специалистов зоологов. Во-вторых, циклопы чрезвычайно трудно поддаются лабораторному культивированию, впервые это отметила Вермаи в 1977г. В-третьих,репродуктивный период у видов,с которыми мы работали чрезвычайно короток: 2-3 недели в году. В четвертых, из-за плохой проницаемости оболочки яйцевых мешков пока не разработана методика получения колхицинированных препаратов хромосом для циклопов в раннем эмбриогенезе. в пятых, в литературе отсутствуют данные о дифференциальной окраске хроносом у указанных видов циклопов. Тем не менее мы надеемся, что те результаты, которые будут изложены нами ниже окажут стимулирующее воздействие для преодоления указанных трудностей работы с циклопами. •

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

1. Особенности процесса диминуции хроматина у Cyclops kolensis и Cyclops strenuus strenuus

Диминуция хроматина у Cyclops kolensis проходит во врекя 4гГо де-

*ления дробления в 6 клетках зародыша из 8 и характеризуется тем, что в

конце значительно удлиненной интерфазы в ядрах этих шести клеток появляются мелкие Фельген-положительные гранулы. Интервал между 3- и 4-м делениями дробления зародыша С. kolensis в 6 раз _превышает интервалы между первыми .тремя делениями и п 9-10 раз интервалы между последующими тремя последиминуционньши делениями клеток соматической линии, за счет увеличения длительности преддиминуционной интерфаэы- (ТаС/л. 1) .

Таблица 1.Длительность интервалов времеии между делениями дробления зародыша Cyclops kolensis при 18-20 С

* | Интервал между ! Длительность i 1 I llpü.-.гчяттч-! i

| делениями | I i интервала (мин) i i

1 1 1 1-2 | 70-90 1 I 1 1

1 2-3 • | 70-90 1 1

1 3-4 | 480 - 540 1У зародышевых 1

! 4-5 1 50-60 1 соматических |

1 1 i !<Л«?ТОК 1

1 5-6 1 50-60 ! -//-// 1

| 6-7 | 50-60 1 --//--//-- 1

! 7-3 J 1 1 50-60 1 --//--//-- 1 1 1

В седьмой клетке ДХ проходит с некоторым опозданием, когда претерпевшие ДХ шесть клеток входят в 5-е деление. В восьмой клетке - клетке зародышевого пути диминуционныв процессы не происходят вовсе, в ней сохраняется исходное количество ДНК. Описанная »синхронность делений дробления у зародыаей С.kolensis после 3-го деления имеет закономерный характер и наблюдается у всех зародышей (более 200), изученных на этой стадии.

По мере прохождения диминуцнонного деления число гранул уменьшается с 500-600 в интерфаэе до 150 в метафазе, и до 15-40 в телофаэе, по-видимому за счет слияния гранул,поскольку их размеры увеличиваются с 0,5 до 3-4мкм. В метафазе и особенно в анафазе 4-го деления видно,

что большая часть гранул элиминируемого хроматина перемещается к поло- * сам клетки раньше чем хромосомы, при этом вытянутая форма гранул позволяет предположить участие в этом процессе нитей веретена деления. Материал гранул не подвергается декомпактизации во время телофаэы 4-го деления дробления. По окончании 4-го деления гранулы элиминируемого хроматина перемещаются в цитоплазму. Разрушение гранул и реутилизация их материала происходит в течение 2-3 последующих делений.

Дининуция хроматина у исследованной нами популяции С.в1гепиив в1гепииэ проходит в два этапа: на 5-м и 6-м делениях дробления зароды-, иа. До 4-го деления клетки зародыша С.е^.ви-епичэ делятся синхронно через каждые 45-50 мин. После 4-го деления дробления клетки зародыша начинают делиться асинхронно. Перед 5-м и 6-м делениями зародышевых соматических клеток С.а1:гепииа Б1гепииа продолжительность интерфазы возрастает, что приводит к увеличению интервалов между 4-м и 5-м делениями в 4 раза,а между 5-м и 6-м в 2 раза (Табл.2).

Таблица 2.Длительность интервалов времени между делениями дробления зародыша С.в1гепииз в^епиив при 18-20 С

1 1 1 Интервал между | Длительность Г 1 ■ .......... 1 1 Примечание |

|делениями | интервала (мин)

1 1-2 | 40-50

1 2-3 | 40-50

1 3-4 | 40-50

1 4-5 | 170 - 190 IУ зародышевых |

|сонатических I

1 5-6 | 80 - 90 | клеток I

1 6-7 | 35-40 1 -"//-//- 1

1 7-8 | 1. . ........ . 1 35-40 1 --//"-//— 1 1 1

В интерфазных ядрах зародышевых соматических клеток С.вЪгетшв в^етшв.как и у С.ко1епв1в перед диминуционными делениями появляются мелкие гранулы в количестве 60-80, которые хорошо окрашиваются как по

Фельгену.так и ацетоорсеином-.В анафазе 5-го и 6-го деления подобные гранулы сосредоточены на экваторе клетки, однако из-за ассоциации части гранул трудно достоверно определить их количество. В телофазных ядрах этих хе клеток гранулы легко подсчитать, их число колеблется от 15 до 20. В то время как 14 клеток соматической линии, вступающие в 5-е деление дробления находятся на стадии преддиминуционной интерфазы, две клетки Делятся путей обычного митоза, не сопровождающегося потерей хроматинового материала. Одна из них - клетка зародышевого пути, ДХ в которой не наблюдается. Вторая клетка после деления дает клетку эаро-««s.iwpo пути и клетку соматической линии; последняя в дальнейшем претерпевает ям последов*!ельm-ir ^кячиуииоинм*. ДСДС1Ш.Т

2.Содержание ДНК в клетках Cyclops kolensis и Cyclops strenuus strenuus.

Для измерения количества ДНК, составляющей додиминуционуый геном С.kolensis,использовали отдельно лежащие группы анафаэных и телофазных хромосон-2-3 деления зародышевых клеток (Табл.з). Величина гаплоидного генома эароды1зевих клеток С.kolensis до 4-го деления составляет 2,3 +

0,05пг. Количество ДНК после ДХ определяли у особей С.kolensis и у C.strenuuc strenuus в соматических ингерфазных клетках взрослого циклопа,так как только в этом случае можно было проводить измерения, исключив наложение клеток в толще препарата. Содержание ДНК в гаплоидном соматическом геноме С.kolensis оказалось равным 0,14+0,02 пг.что составляет примерно 5-7X от додикинуционного генома зародышевых клеток данного вида.

Количество ДНК в гранулах элиминируемого хроматина клеток соматической линии зародыша С.kolensis на стадии гелофазы 4-го деления варьирует от 0,05 до 0,5 пг, при этом в отдельных телофазных ядрах содержится в среднем 25 гранул,что позволяет сделать вывод о продолжающемся слиянии гранул¿которое начинается в интерфазе 4-го деления. Гранулы, находящиеся в каждом таком ядре, можно условно разделить на 3 группы: от 0,15 до 0,5 пг (3-5 шт), от 0,09 до 0,14 пг (4-7 шт) и от 0,05 до 0,08 пг (4-12 шт ). Содержание ДНК в гранулах десяти телофазных клеток,не накладывающихся на другие клетки, оказалось равным после деления на два (так как из клеток удаляется реплицированный материал)

2,0-2,2 пг, что хорошо соответствует разнице между количествами ДНК в клетках соматической линии С.ко1епз1в до и после ДХ.

Таблица 3. Содержание ДНК в эмбриональных и соматических клетках С.ко1епа1в и С.в^епиив вЪгепииг в условных единицах. М + м. I-1-1-Г-1

В эмбриональных |в соматических IЭлиминиру- I

клетках на стадии ! клетках Iеиая ДНК |

1 Вид ана- и телофаэы I взрослой особи 1 * 1

1 До ДХ 1 5-го 1 1 | 2С 1 4С

|деления • 1 1 ' |

|с.ко1епв!в 1 2С-5360+120| *--- Г 1 |321+45|б20+50 1 94 |

1 N 35 | | ! 42 1 36 1 <

lc.str.str. 1 2С-1630+140| 2С-980+80 1 1 1442+401876+95 1 75 |

! N 23 | 26 | | 30 | 38 1 ..........Л— .............. 1 ..........I

Содержание ДНК в сперматидах О.те1аподав1ег (Меллер-5) : ' 2С«420+50*0,36+0,04пг по(11аес11 а1.1971). N-количество исследованных клеток.

Среди клеток взрослых особей С.ко1епг1в, формирующих покровы циклопа, встречаются высокополиплоидные клетки в количестве около 50 с содержанием ДНК в каждой из них в среднем 102 С , что равно примерно 1700 последиминуционным гаплоидным геномам.

Количество ДНК в геноме клеток соматической линии C.вtгепииз в^епииэ уменьшается в результате ДХ с 0,72пг до 0,18пг. В 5-м делении из клеток сомы элиминируется 40% хроматина,а в 6-м делении еще 35% от первоначального зародышевого генома (Табл.З).

В теле взрослых особей С.вЬгепиив насчитывается около 50 высокополиплоидных клеток с содержанием ДНК в каждой из них около 85С, что соответствует 340 последиминуционным гаплоидным геномам.

. структура интерфаэных ядер,гранул элиминируемого хроматина и хро-осом в ходе ДХ у Cyclops kolensis и Cyclops strenuus strenuus

Изучение в ТЭМ интерфазных ядер клеток соматической линии эаро-ыша С.kolensis обнаружило необычную закономерность. Если до 4-го, ди-инуционного,деления дробления хроматин диспергирован по всему объему дра в виде тонких фибрилл толщиной Юнм, 25-30нм и SO-IOOhm, хромо-;ентры и периферический высококонденсированный хроматин, примыкающий к дерной мембране, отсутствуют, то после диминуции интерфаэные ядра 1Меют структуру> свойственную большинству эукарнотических клеток: дис-|вргированкиП го всем объеме хроматин перемежается с участками высохо-:онденсированного хроматина, часть хроиоивнтроа тесно примыкает к шерной мембране.

Анализ срезов десятков клеток соматической линии зародыша С. :olensla до и после ДХ показал,что после диминуционного деления значительно уменьшается диаметр клеток и -интерфаэных ядер, а также уменьшайся количество ядрышек, с 2 до 1,причем редуцируется'более крупное яд->ы'шко, но при этом отношение общего диаметра ядрышек к диаметру клет-(И,а также диаметра ядра к диаметру клетки остается практически посто-1ННЫК .

о

Исследование, проведенное при помощи светового микроскопа, лозво-)нло установить, что количество хромосом в диплоидном набор с. :olensis 2п=22. оно не изменяется 0 ходе онтогенеза, хотя поело 4-го деления дробления длина хромосом в 7 клетках зародыша из В уменьшается г 11-20 до 2,6 -7 мкм,а диаметр с 1 до 0,5 мкм. Хромосомный набор ча-зодышевых клеток С.kolensis до 4-го деления дробления состоит в основ юл иэ метацентрических хромосом. Лишь одна пара хромосом может быть этнесена к субметацентрическим с соотношение!! дяии плеч 2,2 . Диплоид-■Шй хромосомный набор клеток соматической линии С.kolensis после дх ;одержит б пар метацентрических, 4 пары субметацентрических, н 1 пару 1кроцентрических хромосом. Таким образом в кариотипе клеток соматической линии с.kolensis вследствиг ДХ вместо двух пар метацентрических <рО!ЮСОМ появились: 1 пара акроцектрических хроносом и две пары субме-гацентрических хромосом.

Диплоидное количество хромосом у С.strenuus strenuus равно 2i, после ДХ оно не изменяется. Длина хроносом при этом уменьшается при-

керно в 2 раза с 4,5-12,5 нк до 2,8-5,4 нк. К сожалении, как не уда лось получить метафаэные пластинки с хорошим разбросом додиминуционны хромосом, поэтому в данной работе не представлен диплоидный набор хро мосом С.э^епииэ вЪгепиив до ДХ> Однако отчетливо показано, что коли чество бивалентов в профазе 1-го мейотичесхого деления равно 12. диплоидном наборе последиминуциониых хромосом С.вЪгепиив вггепиие кож но выделить б пар метацентрических хромосом, 3 пары субметацентричес ких и 3 пары акроцентрических хромосом.

Так как диплоидное число хромосом у данных видов циклопов в ре зультате ДХ не изменяется, то число сайтов зксцизии, по которым иде' вырезание элиминируемого хроматина, по-видимому, должно быть равно ил> кратко числу гранул, появляющихся в конце преддиминуционной интерфазы 500-600 у С.ко1епэ1в и 160 у С.в1гепииа.

Интересным и крайне необычным фенотипическим признаком обладаю: митотические хромосомы С.ко1епе1з на стадии 3-го деления дробления: без какой-либо предфиксационной обработки при окраске ацетоорсеином ) них четко выявляется чередование темных и светлых полос, весьма сходное с в или Е (ко не С) окраской в'хромосомах млекопитающих. Количество таких полос на отдельных хромосомах колеблется от 20 до 40. Необходимо заметить, что в митотических хромосомах клеток зародыш* С.ко1епэ1в на стадии 1-го и 2-го деления дробления, а также в последи-кинуционных хромосом клеток соматической линии такой четкой исчерчен-ности не обнаружено. Это наблюдение особенно интересно сопоставить с концепцией Холмквиста (Но1тяи1вЪ, 1989) о том, что банды в митотических хромосомах млекопитающих представляют- собой молекулярные экологические ниши со специфическим представительством определенных генов и некодирующих последовательностей.

Структура метафазных хромосом клеток зародышевого пути не имеет видимых отличий от структуры метафазных хромосом клеток соматической линии. На поперечном срезе тех и других в электронной микроскопе видны плотные тела,лишенные субструктуризации.

Таким образом исследование в электронном микроскопе хромцом клеток соматической линии, преобразованных в ходе ДХ, и хромосом клеток зародышевого пути с неизменным геномом не обнаружило каких-либо принципиальных отличий в их структуре.

При изучении гранул элиминируемого хроматина,выделенных из дро-!ихся яиц C.kolensis после 4-го деления дробления в ТЭМ, окаэа-:ь, что каждая из гранул с диаметром 0,5-3,5мкм окружена плотной гбраноЯ толщиной 50 нм . Эти мембраны не имеет двухслойного строения 1в содержат пор. Подобные гранулы обнаруживаются на препаратах под-говленных по методу Миллера,когда происходит механическое разрушение ; C.kolcnsin на стадии 4-5 деления. Наблюдаемые на этих препаратах анули также имеют плотную лишенную пор мембрану толщиной 50 ни

зуглые элехтронноплотные образования размерами 0,5-2,5 мхм наблюда-мя iieanaparir •»яродышей C.kolensls на стадии анафазы 5-го деления золения при изучении их в СЗИ.

Сходство структур, наблюдаемых в ТЭМ и в СЭМ, а тпхже наличие г эных яйцевых мешках C.kolensls фельген-положительных гранул, поэво-эт сделать заключение об идентичности этих структур, и с большой до-1 вероятности утверждать, что электронноплотние образования, окружные мембраной и 'появляющиеся в конце интерфаэы 4-го деления дробле-а, представляют собой гранулы элиминируемого хроматина.

:у»дение

Главным результатом настоящей работы является обнаружение у colensis рекордной среди многоклеточных доли генома, элиминируемой в эцессе ДХ. Трудно согласиться с мнением Берман (Beermann,197? ) , сог-2но которому во время ДХ у циклопов удаляется только лишь гетерохро-гин, В тако.ч случае доля гетерохроматина в геноме c.kolensis должна гь 34У,, что по сравнению с таковой у других видов ( Прокофьева-Бель-зская,198б) крайне маловероятно.

Один иэ общабиологнческих аспектов диминуции хроматина связан с нтёльмой дискуссией (Дулиттл,1986) о так называемой С-парадоксе. Поденные нами данные по диминуции хромат ia у C.kolensis и C.strenuus renuus свидетельствуют против гипотезы Бриттена и Дэвидсона ritten, Davidson, 1971), согласно которой избыточная ДНК представля-собой регуляторные последовательности, так как весь морфогенез, для уществления которого необходима целостность и полнота структур--фунхциоиальных областей генома,начинается уже после того,как эавер-

шилась диминуция хроматина. Поэтому элиминация около 94% генома клет< соматической линии С.ко1епа1в и 1Ъ% генома клеток сомы С.вЪгепш вЪгепиив ставит под сомнение гипотезы приписывающие "избыточной" Д1 какие-либо известные функции и позволяет сделать вывод о том» что эл1 минируемая ДНК не несет никаких значительных кодирующих и регулятор«] функций. Вполне возможно,что некоторые элиминируемые последовательно« ти необходимы для нормального хода нейоза (Р-повторы) и созревания ш ловых клеток.

Больший интерес явление ДХ представляет для оценки гипоте: "эгоистичной" ДНК (0ооИгЪ1е,8ар1епга,1980; 0где1,Сг1ск,1980), авто] которой рассматривают накопление избыточной ДНК в геноме эукариот к. самоумножение селективно нейтральных последовательностей. Семейст! таких последовательностей должны 'быть распределены в виде определе: 1>«1х кластеров довольно равномерно по хромосомам С.ко1епз1з и могут х, рактеризоваться рядом особенностей, касающихся графика репликации ил: обогащенности определенными нуклеотидами. Не исключено,что именно т. кие кластеры проявляются на определенных этапах онтогенеза в фор! дисков, придающих хромосомам С.ко1епз1е в-подобиную окраску. Мож! предположить,что у С.ко1епз1г и у С.вЬгепииг вЬгепииг в-процессе ДХ ] генома клеток соматической линии удаляются в первую очередь как раз • последовательности, которые и составляют так называемую "избыточную или "эгоистичную" ДНК, а сохраняется та часть генома, котор; А.П.Акифьевым предложено называть "базигеномом"(Акифьев, 1993).Так1 образом, ДХ представляет собой яркий пример контролирования генотип« самой структуры генетического аппарата клетки.

Морфологические отличия между некоторыми видами циклопов, имеющ! в онтогенезе ДХ разного масштаба и со своеобразной феноменологие: настолько малы, что установить их может лишь опытный специалист п систематике копепод. Это означает, что развитие циклопов происход: практически одинаково как на основе постоянного,так и реорганиз.ованн го во время дикинуции генома. Мы инеем дело с тек же эффектом,что преобразования генома в ходе эволюции. Диминуция хроматина у многая точных, в особенности того типа, что описана Берман (Веегиапп, 1977 и нами у С.ко1епв1е и С.зЪгепиив вЪг., позволяет понять,как может пр изойти первое событие, с которого начинается смена типов интерспе;

ии. Новый последовательностям должно быть освобождено место в гено-е,в противном случае размеры геномов будут безгранично расти. Если же роцесс,подобный ДХ,хотя бы изредка может произойти в половых клетках, результаты недавней работы лаборатории Годзй (Esteban et al.1993) видетельствуют о том, что это возможно, то потерявший более или ке-ее значительную долю некодирующих последовательностей геном может ыть заселен другими последовательностями. На основании полученных в анкой работе результатов представляется возможный сделать следующее редположение: процесс,подобный ДХ у C.kolensis, должен предшествовать мене типов интерсперсии последовательностей различной степени повто-яемости в «сканирующей части генома, многократко происходившей в ходе волюции эукариот.

Тот факт, что интервалы между додиминуционными и последиминуцион-ыми делениями у C.kolensis отличаются ненамного может быть объяснен яедующим образом. Известно,что скорость движения репликационной вилки самых различных клетках эукариот достаточно постоянна и составляет ,'5-1 мкм в минуту, поэтому для того чтобы реплицировать додиминуци-яный геном, размер которого на порядок превышает размер генома клеток зеле ДХ,необходимо чтобы в додиминуционных хромосомах работало на по-чдок больше участков инициации репликации, чем после ДХ. В сбою оче-здь это означает,что элиминируемая ДНК насыщена потенциальными орид-1нами репликаци.,. Кроме того сложность и неординарность процесса экс-1зии элиминируемой фракции генома из хромосом пресоматических клеток •kolensis, по-видимому, также является причиной резкого увелич чия ■ттельности преддиминуционной интерфазы.

Асинхронность делений дробления,наблюдаемая при развитии всех »ученных памп зародышей C.kolensis и состоящая в феномене четко фик-фованного во времени сдвига начала диминуциониого деления одной из зесоматических клеток и задержки деления клетки зародышевого пути,а »кже двухэтапность диминуциониого процесса у C.strenuus strenuus ;стко запрограммирована в онтогенезе указанных видов и, вероятно, зязана со спецификой механизма регуляции прохождения ДХ у определен->й части клеток разсивающихся зародышей. . Можно предположить, что ме-1низм ДХ запускается детерминантами, находящимися еще в ь^оплодотво-шном яйце циклопа, но также опосредован структурой участков генома,

граничащих с элиминируемыми последовательностями.

Отсутствие гранул элиминируемого хроматина в интерфазных ядрах клеток C.kolensis перед 4-м делением в то время,когда количество ДНК в них было примерно равно 4С, свидетельствует в пользу того, что процесс формирования гранул элиминируемого хроматина в зародышевых клетках соматической линии C.kolensis происходит после репликации ДНК.

Гранулы элиминируемого хроматина, появляющиеся вследствие процесса дх у циклопов, по крайне мере у изученных нами видов C.kolensis и C.strenuus strenuus, являются совершенно особенными внутриклеточными структурами, существующими относительно непродолжительный отрезок времени. Функциональная потребность в создании подобных структур, очевидно, состоит в изоляции элиминируемой ДНК от той, которая должна быть сохранена для реализации фенотипа организма. Ибо, если элиминируемая ДНК не будет заключена в гранулу с плотной лишенной пор мембраной и по этой причине, по-видимому, непроницаемой,то на конденсированный элиминируемый хроматин должны действовать факторы декомпахтиаации наверняка присутствующие в клетке во время телофаэы 4-го. деления дробления, и тогда компартментализованная элиминируемая ДНК превратилась бы, предположительно, в микроядра. Так как ДНК находящаяся в микроядрах способна к репликации (Gregoire et al., 1983 ), то следствием такого варианта был бы хаос в клетке. Характерная особенность гранул элиминируемого хроматина - плотная однослойная лишенная пор мембрана - резко отличает ее и от микроядер,которые частично окружены ядерной мембраной обладающей порами (Gregoire et al., 1983), и от таких клеточных органе лл как ядро или митохондрии, имеющие двухслойную мембрану с порами (Бродский,1965; Бил,Ноулэ,1981), что позволяет им активно осуществлять обменные процессы, в то время как гранулы при ДХ, благодаря особенностям своей плотной мембраны, вероятно, лишены такой возможности. Поэтому мембрану гранул элиминируемого хроматина следует рассматривать как плотную оболочку, функция которой, по-видимому,состоит только лишь в изоляции заключенного в ней элиминируемого хроматина от окружающей ее внутриклеточной среды.

Причиной изменения структурированности интерфазных ядер клеток соматической линии C.kolensis после ДХ может быть переход с цитоплаз-матической регуляции экспрессии генов во время первых делений дроблет

ния, определяемую факторами находящимися еще в цитоплазме неоплодотво-ренного яйца, на ядерную,когда генная экспрессия регулируется посредством конденсации и деконденеации хроматина. Подобное предположение основывается на известных представлениях относительно механизмов дифференциальной активности генов эукариот во время эмбриогенеза (Ней-фах,Тинофеева, 1978; Raff.Kaufman, 1983). Таким "образомо, диминуцион-ныа процессы у зародышей C.kolensis, по-видимому, определяют этап, после которого ядра клеток соматической линии приобретают структуру, свойственную дифференцированным клеткам взрослого организма.

Редукция яярмж» вследствие диминуционных процессов в пресома-тических клетках C.fcoleneie позволяет предположить,что вследствие ДХ происходит удаление из хромосом зародышевых соматических клеток части рибосомных цистронов,функциональная потребность в которых теряется вместе с элиминируемым хроматином. В то же время остается постоянной относительная функциональная активность рибосомных генов,о чем можно судить по величинам отношения общего диаметра ядрышек к диаметру ядра' и к диаметру клетки; которые не изменились после ДХ. Известно, что высококонденсированный хроматин интерфаэного ядра содержит инактивиро-ванные гены (Ченцов,Поляков, 1974; Восток,Самнер, 1981). Следовательно, сохранение после ДХ ядерно-цитоплазматического отношения у зародыша C.kolensis таким же, каким оно было до ДХ, при наличии значитетьн^ числа участков i юококонденсированного.а значит инактивированного матина, позволяет предположить,что величина ядерно-цитоплазматического отношения скорее определяется функциями ядерной мембраны, чем величиной генома или числом функционирующих генов, учитывая тот факт, что у особой C.kolensis в результате ДХ элиминируется более 90% генома.

Изучение ДХ у C.kolensis и C.strenuus позволяет высказать предположение о довольно разномерном распределении генов в хромосоме. Действительно, полученные доказательства того, что число сайтов эксци-зии элиминируемого хроматина у C.kolensis не менее 500-600, а у c.strenuus на менее 180, а также тот факт,что в результате ДХ происходит равномерное уменьшение размеров всех хромосон диплоидного набора, а не удаляются отделышз хромосомы или участки немногих хромосом позволяют поддержать гипотезу о распределении генов по принци / "островов в океане" негенной ДНК (термин Русава, Zuckerkandl,1992) .

В нашем исследовании установлено, что ДХ у C.kolensis происходи! во время 4-го деления дробления, а у C.strenuus в 5 и 6-м деления» дробления. Согласно данным Верман ДХ у c.strenuus происходит в 4-м делении дробления (Beerntann,1977). Начиная свою работу по изучению ДХ, мы определили вид, с которым работали, как C.strenuus, и уже поток после консультации с проф.В.Р.Алексеевым исправили результаты определения на C.kolensis. Хотя картина диминуционного деления у C.strenuus по Берман (Beermann,1977) на первый взгляд схожа с таковой у C.kolensis в нашем исследовании, но тем не менее она имеет и существенные отличия: отсутствие спонтанной дифференциальной сегментации хромосом во время 3-го деления дробления, 56V элиминируемой при ДХ ДНК, а не 94%, наличие полового диморфизма по величине хромосом, что отсутствует у C.kolensis в нашем исследовании. Отлична от данных Бер->.-.н картина ДХ у C.strenuus strenuus в нашем исследовании:. ДХ проходит не на 4-н, а на 5-к и 6-и делениях, во время ДХ элиминируется 75% ДНК, а не 56%,гранулы элиминируемого хроматика сосредоточены на"экваторе" клетки, а не на полюсах. Кроме этого диплоидное число хромосом у C.strenuus strenuus в нашем исследовании равно 24. Согласно данным Берман (Beermann, 1977) у C.strenuus 2п»22. В то же время по данным Айнсле (Einsle,1993) ДХ у C.kolensis наблюдается во время 5-го деления дробления, а гранулы элиминируемого хроматина в анафазе диминуционного деления аккумулируются в области экватора.

Следовательно, представляется вероятным, что мы работали с другими видами циклопов группы Cyclops, чем Берман и Айнсле, а различия в ряде характеристик процесса ДХ у исследованных видов циклопов могут быть связаны с высокой поликорфностыо видов этого рода. В таком случае каждый из таких видов может обладать своей,присущей только этому виду, картиной ДХ.

ВЫВОДЫ

1.В настоящей работе с помощью цитофотометрии фельгеновской реакции впервые установлено,что в результате диминуции хроматина клетки статической линии C.kolensis и C.strenuus strenuus теряют около 94% и 75% ДНК соответственно; при этом величина гаплоидного генома изменяется у C.kolensis с 2,3 до 0,14 пг,а у C.strenuus strenuus с 0,72 до 0,18 nr.

2.Показано,что процесс формирования гранул элиминируемого хроматина в ародышевых клетках соматической линии С.kolensis начинается после епликации ДНК в конце интерфаэы 4-го деления дробления.

3. У взрослых особей С.kolensis и C.strenuus strenuus обнаружены вы-окополиплоидные клетки с содержанием ДНК в каждой из них равным при-ерно 1700 и 180 последиминуционным геномам соответственно.

4.Установлено, что диплоидное число хроиосом (2п) у Cyclops kolensis авно 22, а у C.strenuus strenuus 24 .

5. У обоих видов циклопов имеет место резкое удлинение продолжитель-оети преддиминуционной интерфаэы (у С.kolensis в 6 раз; у C.strenuus trenuus в 4 раза перед 5-м делением и в 2 раза перед б-н делением робления).

б.Обнаружена спонтанная дифференциальная исчерченность (G-подобные элосы) хромосом С.kolensis,четко выраженная во время Э-ro преддимину-ионного деления дробления.

7.обнаружено закономерное снижение числа гранул элиминируемого хрома-ина в клетках зародыш« С.kolensis на стадии интерфазы-твлофаэы 4-го еления дробления,при одновременной увеличении размеров этих гранул.

8.Исследование гранул элиминируемого хроматина у С.kolensis в элехт-онном микроскопе обнаружило наличие у них плотной»лишенной пор мемб-аны толщиной 50 нм,окружающей элиминируемый хроматин.

9.При исследовании клеток соматической линии С.kolensis до и после -го деления дробления в ТЭМ показано,что в результате ДХ происходит вменение структуры интерфазных ядер,связанное с появлением конденси-ованного хроматина, но не обнаружено принципиальных различий в струк-уре хромосом клеток соматической и зародышевой линии.

Ю.На основании полученных результатов высказано следующее предполо-ение:, процесс, подобный ДХ у С.kolensis, должен предоествовать сиене ипов интерсперсии последовательностей различной степени ловторяености некодируюцей части генома, многократно юисходившей в хода эволюции укариот.

Полученные цитогенетические характеристики видов С.kolensis и .strenuus strenuus предлагается использовать для таксономгч циклопов.

Основные положения диссертации опубликованы в работах:

1.Акифьев А.ПГришанин Л.К. Некоторые биологические аспекты динннуцш хроматина // Журн.общ.биол.1993.Т.54,N.1.С.5-16.

2.Гришанин А.К..Акифьев A.n. Диминуция хроматина и организация хромое

у Cyclops etrenuus strenuus // Генетика.1993.Т.29,N.7.С.1099-1107.

3.Гришанин А.К.,Бродский В.Я.,Акифьев A.n. Соматические клетки Cyclops strenuus (copepoda,Crustacea) теряют при диминуции хроматина более 90Х генома // Докл.РАН.1994.Т.338,N.5.С.708-710.

4.Гришанин А.К. Сравнительное изучение хромосом и интерфазных ядер в клетках эародыпа Cyclops kolensis (Copepoda,Crustacea) до и после диминуции хроматина при помощи электронной микроскопии // Онтогенез.1995. T.26,N.3.C.188-195.

i Гришанин А.К., худолий Г.А., Шайхаев 3.Г.О.,Бродский В.Я.,.В,Б,Мака ров,Акифьев A.n. Диминуция хроматина у Cyclops kolensls и Cyclops etrenuus etrenuus (Copepoda,Crustacea) - уникальный пример генной инженерии в природе // Генетика.1996.N.5.{ в печати).

6.Гришанин А.К. Изучение элиминируемого хроматина в клетках зародыш; Cyclops kolensis с помощью сканирующей электронной микроскопии // Ци гология.1996.(в печати).

7.Гришанин А.К. К вопросу о цитотаксономии видов Cyclops strenuus i Cyclops kolensls (Copepoda,Cyclopidae) // Зоологический журнал.(В ne чати).

5.Grichanln A.K. Is chromatlne diminution a tool or result o: eukaryote evolution? Abstracts, Conference Oacques Honod "Evolutionär; Genetics and Adaptation", September 25-29th,1995, Aussois(France).

3.28.T. 100.Типография Ярославского государственного технического университета.

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Гришанин, Андрей Константинович, Москва; Борок

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ИНСТИТУТ ХИМИЧЕСКОЙ ШИЗИКИ ИМ. Н.Н.СЕМЕНОВА ИНСТИТУТ БИОЛОГИИ ВНУТРЕННИХ ВОД Ш.И.Д.ПАПАНИНА ИНСТИТУТ БИОЛОГИИ РАЗВИТИЯ ИМ. Н.К.КОЛЬЦОВА

ГРИШАНИН

АНДРЕЙ КОНСТАНТИНОВИЧ

ОСОБЕННОСТИ ДИШНУДИИ ХРОУАТИНА У CYCLOPS ROLENS IS И CYCLOPS STRENUUS STRENUUS (CRUSTACEA , COPEPODA)

Специальность U3.00.15, - генетика

диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель: проф.5д.б.н. А.П.Акифъев Научный консультант; проф. 5д. б,н. В.Я.Бродский

Москва -

Борок -

1996

СОДЕРЖАНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.Диминуция хроматина у простейших (Protozoa).............. 8

2.Диминуция хроматина у нематод (Nematodes)...............14

3.Диминуция хроматина у копепод (Copepoda)21

4. Диминуция хроматина у двукрылых насекомых (Diptera),.. „.24

5. Диминуция хроматина у позвоночных (Vertebrata)..........27

6. Диминуция хроматина у растений (Plantae),..;.............28

7.Биологическая роль диминуции хроматина ................. 31

МАТЕРИАЛЫ I МЕТОДЫ,.................................... .ЗА

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

1,Феноменологические особенности процесса диминуции хроматина у Cyclops kolensis и Cyclops strenuus strenuus.40

2,Содержание ДНК в клетках Cyclops kolensis

и Cyclops strenuus strenuus ............................49

3,Структура интерфазных ядер,гранул элиминируемого хроматина и хромосом в процессе диминуции хроматина у Cyclops kolensis

и Cyclops strenuus strenuus ,.,,...,,.,..,,.=....,,,,.,,,52

ПРРУЖТТСЩТР v'P

q д kr 7|intipuT/fjr q q

RUpnTTU 1ПП

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ.....................................102

Под диминуцией хроматина (ДХ) понимается в широком смысле круг генетических процессов,приводящих к неравноценности в количественном и качественном отношениии геномов клеток зародышевой плазмы и соматических тканевых клеток,

Феномен ДХ был открыт Бовери в 1887г. за год до того, как было введено понятие хромосома (Boveri,188?). Результаты, полученные Бовери при изучении ДХ, способствовали в дальнейшем созданию хромосомной теории наследственности (Boveri,1910). Особый интерес представляет ДХ у циклопов (Crustacea,Copepoda),где она заключается в элиминации большей или меньшей части хромосомного материала на ранних стадиях развития из зародышевых соматических клеток. Явление ДХ имеет множество интересных для фундаментальной и прикладной биологии аспектов,начиная от эмбриологии,кончая методологией генной инженерии. Согласно Шапиро (Shapiro,1992),диминуция хроматина относится к тем процессам,которые можно рассматривать в качестве примеров генной инженерии в природе. Наибольшее значение ДХ представляет для понимания организации хромосом высших зукариот, Сам процесс ДХ наглядно показывает, какая часть генома необходима и достаточна для нормального функционирования практически всех тканевых клеток по крайней мере тех организмов,у которых она встречается,

К настоящему времени ДХ известна у немногих видов зу-кариот (Райков,1992; Веепшпп, 1977; Airoermann,1985; Tobier,1986; PimpineIIi,Soday,1989; Tobler et al-,1992)поэтому особую актуальность приобретают исследования тех ооъек-

toe,в частности представителей рода Cyclops,-/ которых ДХ затрагивает значительную,в • идеале максимальную долю генома, соматических клеток. Цель и задачи исследования

Целью настоящей работы было изучение процесса ДХ у двух представителей рода Cyclops - Cyclops kolensis Lili и подвида Cyclops strenuus strenuus Fischer, отличного по картине ДХ от того,который описала Верман (Beermann,1977). Были поставлены следующие задачи:

1.Провести с помощью цитофотометрии фелыеновокой реакции сравнение содержания ДНК в клетках обоих видов циклопов до и после ДХ,

2.Исследовать цитологически с помощью светового и электронного микроскопа процесс ДХ у С,kolensis,обращая особое внимание на изменение структуры хромосом,

3.Изучить с помощью электронной микроскопии структуру гранул элиминируемого хроматина у С.kolensis,

Научная новизна.

Впервые обнаружен вид эукариот - С,kolensis,у которого после рекордной потери генетического материала - более 90% -в соматических клетках полностью сохраняется число и типичная структура митотических хромосом, Этот факт указывает на то,что у С,kolensis более 90% хромосомной ДНК не связана как с кодирующими,так и с регуляторными функциями необходимыми для дифференцировки соматических клеток.

Обнаружен подвид С,strenuus strenuus диплоидное количество хромосом у которого,а также картина и график димину-

ционных процессов отличаются от описанных ранее для вида Cyclops strenuus Верман (Beemann, 1977),

Показано,что репликация ДНК у С.kolensis завершается до диминуции хроматина.

Установлено,что хромосомы С,kolensis в преддиминуцион-ном митозе без какой-либо предобработки проявляют сегментацию ?типичную для G-дисков млекопитающих.

Впервые описана мембрана,окружающая гранулы элиминируемого хроматина у многоклеточного эукариотического организма, которая в отличие от ядерной мембраны зукариотических клеток однослойная и в ней отсутствуют поры,

Впервые у представителей копепод в тканях взрослых циклопов С, kolensis и С. strenuus strenuus,обнаружены высокополиплоидные клетки,возникшие на основе поотдиминуционного генома,

Впервые у многоклеточного эукариотического организма изучена структура хромосом и интерфазных ядер зародышевых клеток до и после ДХ при помощи электронной микроскопии,

На основе полученных данных высказано предположение: процесс, подобный ДХ у С,kolensis и С,strenuus strenuus должен предшествовать смене типов интерсперсик последовательностей различной степени повторяемости в некодирующей части генома,многократно происходившей в ходе эволюции эукариот. Практическая значимость, 1,Специфика картины ДХ - количественная и качественная - может быть использована в качестве критерия при определении видов рода Cyclops. Известно,что идентификация видов .этого рода по стандартным морфологичес-

ким признакам представляет большие трудности даже для зоологов- систематиков.

2.Можно полагать5что в результате ДХ у С,ко1епз1з в генетических локусах хромосом соматических клеток сохраняется минимальное число функционально значимых последовательностей ДНК ,В таком случае дальнейшие исследования молекулярной структуры таких минилокусов окажутся полезными для оптимизации методов конструирования фрагментов донорной ДНК,используемых в генной инженерии,и, в частности,при генотерапии наследственных болезней человека, Положения выносимые на защиту:

1)Открытие у С.ко1епз1з рекордной для многоклеточных организмов доли генома,элиминируемой при ДХ из ядер соматических клеток;

2) Обнаружение подвида С.^гепшш о отличными от известных ранее для этого вида онтогенетическими характеристиками,такими как: диплоидное число хромосом,общая картина и график диминуционных процессов;

3)Описание процесса ДХ у С,ко1епз1з;

4)Обнаружение спонтанной О-подобной поперечной сегментации хромосом С,ко1епз1з в преддиминуционном митозе;

5)Обнаружение специфической структуры мембран, окружающих гранулы элиминируемого хроматина;

6)Сравнение ультраструктуры митотичеоких хромосом и интерфазных ядер клеток зародыша и,ко1епз1з до и после ДХ. Публикации, Основные результаты исследований,представленные в диссертационной работе,изложены в семи журнальных статьях.

Апробация работы. Основные материалы диссертационной работы были доложены на научных семинарах и на заседании Ученого совета Института биологии внутренних вод им,И,Д.Папанина РАН (1991-1995) , на научных семинарах Института химической физики им.Н.Н.Семенова РАН (1991-1993) .Института общей генетики им.Н.И.Вавилова РАН (1994)., Института молекулярной генетики РАН (1995) 5 Института цитологии РАН (1994).. на заседании Санкт-Петербургского отделения ВОРиС,посвященном 90-ле-тню со дня рождения А.А.Прокофьевой-Вельговокой (30 марта 1993 г.),на международной конференции по "Эволюционной генетике и адаптации", посвященной памяти Жака Моно (Оооуа, Франция, 25-29 сент, 1995).

Считаю своим приятным долгом выразить искреннюю признательность моему научному руководителю проф.А.П.Акифьеву, без помощи и участия которого эта работа не была бы выполнена, также проф.В,Я,Бродскому., при помощи которого были получены основные результаты этой работы. Я очень благодарен д.б.н. В,Ф.Семешину и проф, В,Ю,Полякову за помощь в работе и обсуждение результатов, а также проф, В.Р.Алексееву, к.б.н.

B.И.Лазаревой и к.б.н. Н.В,Карташевой за определение видов

C.kolensis и C.strenuus strenuus.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1, Диминуция хроматина у простейших (Рго1о2оа)

Процесс диминуции хроматина среди простейших организмов наблюдается у ряда видов ,относящихся к отрядам Hirrseri03t.emat.ida и НуроЬг1сЫс1а, во время ядерной дифференциров-ки. Ядерная дифференцировка ведет к появлению двух (или более) разных ядер в одной клетке: мелкого, метаболически менее активного генеративного ядра (микронуклеуса),и соматического ядра (макронуклеуса),более крупного,обеспечивающего вегетативные функции организма простейшего, Микронукдеуо (Ми) в отличие от макронуклеуса (Ма) проходит мейоз во время спаривания клеток, копулирующие клетки при этом обмениваются гаплоидными Ми,последние сливаются со стационарными Ми,образуя новый диплоидный Ми в каждой клетке, Клетки разделяются и новый Ми делится митотически без деления клетки, Один дочерний Ми становится ядром зародышевой линии,а другой развивается в новый соматический Ма (0г1аз,Н1£азЬ1- пакац;ша,1990}, Таким образом Ми сохраняет генетическую непрерывность в клеточном цикле и формирует после каждой конъюгации новое соматическое ядро, Обычно Ми рассматривался как транскрипционно инертное ядро,но полученные данные о роли генеративного ядра в развитии ротового аппарата у Рагагпесхигп (М^, 1988),свидетельствует,что некоторые гены Ми в ходе морфогенеза становятся активными. Геном Ми значительно отличается от генома Ма, Мнкронуклеарная ДНК хромосом

имеет очень высокий молекулярный вес (более 1000 т.п.о.)*типичный для зукариотичеоких хромосом (PrescottД992). Гены встречаются группами вдоль молекулы,с короткими последовательностями между генами внутри группы,и перемежаются с намного более длинными повторяющимися и уникальными некодирующими последовательностями, которые находятся между групп генов (Boswell ei al,,1983; Klobutcher et al,,1986),Одна ив характерных отличительных особенностей микронукдеарного генома состоит в том,что все "нефункциональные " последовательности (интроны) ,которые прерывают гены в геноме Ми,вырезаются из него в процессе развития Ма из Ми (Klobutcher,Prescott,1986). Гены в ДНК Ми не зкопреооируются в растущих вегетативных клетках; например синтез ДНК не обнаружен при помощи авторадйографии (Prescott,1992), Поэтому обычно Уи рассматривался как транс-крипционно инертное ядро, Но полученные данные о роли генеративного ядра в развитии ротового аппарата у Paramecium (Mg,1988),свидетельствует,что некоторые гены Ми в ходе морфогенеза становятся активными.

Ма определяет фенотип организма,и содержит активно транскрибируемые гены, Развитие Ма проходит по двум основным схемам: первая объединяет в основном представителей отряда Нуpotгichida, вторая инфузорий из отряда Hymenostomatida (Райков, 1989; Kraut et al,,1986; Brunk,1986; Karrer,1986; Preer, 1989;Ammermann,1990; Steinbruck,1990), В самом начале развития Ма у некоторых гипотрихид из рода Stylonyohia проходит первый

этап диминуции хроматина, во время которого элиминируется около 60% хромосом (Агшеггпаш, 1985). У представителей рода Oxytricha подобной редукции числа хромосом не наблюдали (Spear,Lauth,1976), Оставшиеся хромосомы политенизируютоя,В ' это время содержание ДНК в Ма увеличивается по сравнению о количеством ДНК в диплоидном Ми в 15 раз у Stylonychia mytilus (Аштешапп, 1971), в 30 раз у Oxytricha f ai lax (Fresoott,Murti, 1973),и почти в 53 раза у Euplotes aediculatus (Ашпетапп, 1971), По мере развития политении, в хромосомах ги-потрихид появляются поперечные полосы (Агшегаапп, 1964, 1965,1971,1974; . Alonso, Perez-SiIva,1965; Murti,1976; Rao,Ажпегаапп, 1970;Ruthman,1972;Spear, Lauth,1976). Степень репликации различных локусов хромосом неодинакова,так например отмечается "оверхрепликация*' отдельных гетерохроматиновых полос во время политенизации хромосом зачатка Ма Euplotes aediculatus (Aimermann,1971),и Chilodonella cuoullulus(Radzi-kowski,1979), Сформированные политенные хромосомы фрагментиру-ются на отдельные сегменты,окруженные мембраной толщиной 100 А (Kloetzel,1970; Murti,1973), образуя в зачатке Ма большое количество пузырьков, У Stylonichia число пузырьков равно числу полос (Ашегшаш, 1971; Ашеппапп et al,, 1974), у Oxytricha часть полос сливается перед фрагментацией,в результате чего количество полос в политенных хромосомах уменьшается в 4 pasaba в одном пузырьке заключается по несколько полос (Spear,Lauth, 1976'), Затем происходит второй этап ДХ,во время которого из фрагментов ДНК,заключенных в пузырьках,по-видимо-

му, вырезаются опейоерные участки ДНК и интроны,называемые иначе внутренние элиминируемые последовательности (internal eliminated sequences, IES):,при этом оставшиеся участки генов (зкзоны) иногда меняют взаимное расположение., что необходимо для активизации генов, Завершается процессинг минихромосом путем наращивания на их концах теломерных повторов 0чкц/ длина которых видоопецифична (Roth,Presentt, 1985; Klobutcher,1987; Greslin et al-,1989). Все двадцать генов,охарактеризованных до сих пор в микронуклеарном геноме у Oxytricha nova и Euplotes crassus, содержат IES,некоторые часто в большом количестве,Геном Ми может содержать около 50000 IES,при этом все они удаляются и разрушаются во время развития макронуклеуса (Ribas-Aparacio,et. al,, 1987), IES представляют собой отдельные копии AT-богатых последовательностей,размером от 14 до 548 п.о.,более или менее рассеяных по генам (Prescott.,1992). Все IES- элементы имеют 2-19 п.о. прямых повторов, возможно определяющих сайты ,по которым происходит разрезание ДНК и сплайсинг участков генов (Presoott,1992). Часть IES,по крайней мере длинные единицы,удаляются в кольцевой форме на стадии политевных хромосом (Prescott.,1992). Кроме них на стадии полнтенных хромосом из ДНК Ми Е,crassus вырезаются два родственных семейства транопозонподобных элементов,называемых ТЕС-1 (Baird et al-,1989;Jahn et al,,1989) и TEC-2 (Jahn et al,, 1988),каждый около 5,3 т.п.о, длиной и представленных тридцатью тысячами копий, Oxytricha f al lax содержит около 1900 копий транопозонподобных элементов длиной около 4000 п,о,,на-

■1

JL£. -

зываемък TBE-1 (Herrick_et al,,1985), Внутренние элиминируемые последовательности разделяют в микронуклеарном геноме сегменты генов , называемые MDS-элементами (macronuoIear destIned sequences или сохраняемые сегменты макронуклеуса),которые после экоцизии IES-злементов соединяются и образуют функционально активный ген Ма, Последовательность чередования сегментов MDS в макронуклеарном геноме может отличаться от таковой в геноме Ми, Характер распределения элементов MDS и IES может быть неодинаковым в разных генах. Так к примеру ген актина-1 имеет инвертированные MDS-элементы,а у гена -ТВР элементы MDS распределены кластерами: группа нечетных элементов и группа четных элементов MDS,которые после экоцизии IES сшиваются в порядке нумерации (Prescott, 1992),

После ДХ видоизмененные гены многократно реплицируются (1000 и более копий), но не обязательно в одинаковой степени (Steinbruck Л983,1990).Таким образом ДНК Ма у инфузорий отряда Hypotrichida и некоторых других таксонов представлена фрагментами содержащими один ген без интронов,экипированный регуля-торными пооледовательнноотями ,что соответствует 0,4-20,0 т,п,о,или 0,1-0,8 мкм (Kraut et al,, 1989; Aiwnemann, 1990; Steinbruck., 1990), Каждая такая молекула, минихромосома или ген в кусочке ДНК (genes in pieces), относительно автономна,способна к репликации (равна одному решшкону), и к транскрипции, имеет типичные теломеоные повторы,но не имеет центромер. Поэтому при делении Ма минихромосомы перераспределяются в дочерние макронуклеусы случайным образом, Однако поскольку таких

последовательностей много,то высока вероятность того,что даже при амитозе оба дочерних Ма получат хотя бы несколько копий каждого гена. Кодирующему району гена предшествует лидерная последовательность размером от 50 до 500 п.о.,а за геном следуют трайлер-последовательность из пяти сотен пар оснований (Prescott,1992). Лидерная и трайлерная последовательности,вероятно. необходимы для инициации и термннации транскрипции.

Другая модель макронуклеуса встречается у инфузорий из отряда Hymenostomatida, родов Tetrahymena и Paramecium (Brimk, 1986;Каггег, 1986;Ргеег,1989;Steinbruck,1990). В самом начале развития Ма у Tetrahymena элиминируется 15% последовательностей хромосомной ДНК Ми,но в отличие от Hypotrichidae ДХ у представителей этого рода цитологическими методами не определяется (Gorovsky,1980;Yokoyama,Yao, 1982). Длина молекул ДНК макронуклеусов Tetrahymena, Paramecium и других инфузорий этой группы лежит в пределах от 24 до 2000 т.п.о. (Altschuler,Yao, 1985; Conover,Brunk,1986; Phan et al.,1989). ¥ Tetrahymena в Ма находится 200-300 типов подобных молекул ДНК (Райков,1992), Пять хромосом Ми Tetrahymena фрагментируетоя на 40-60 субхромосом в Ма.Каждая субхромосома Ма представителей отряда Hymenostomatida в отличие от минихромосом Ма инфузорий отряда Hypotrichida содержит по несколько генов. У субхромосом также имеются на концах теломерные повторы O^A^/G^T^,которые присоединяются в ходе фрагментации de novo, отсутствуют центромеры (Blackburn, 1986). Каждый тип оубхроыооом присутствует в Ма в нескольких десятках или сотнях копий.

Итак, во время диминуции хроматина у некоторых представителей простейших (Hypot.riohiohidae) удаляется из генома