Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Особенности деградации органических компонентов сточных вод (мет)акрилатных производств микроорганизмами гранулированного анаэробного сообщества

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Особенности деградации органических компонентов сточных вод (мет)акрилатных производств микроорганизмами гранулированного анаэробного сообщества"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК

ИНСТИТУТ БИОХИМИИ И ФИЗИОЛОГИИ МИКРООРГАНИЗМОВ

РГЗ од

• ' ■ _ .. На правах рукописи

"..........УДК 579.695 : 62834

Штаркман Николай Борисович

ОСОБЕННОСТИ ДЕГРАДАЦИИ ОРГАНИЧЕСКИХ КОМПОНЕНТОВ СТОЧНЫХ ВОД (МЕТ)АКРИЛАТНЫХ ПРОИЗВОДСТВ МИКРООРГАНИЗМАМИ ГРАНУЛИРОВАННОГО АНАЭРОБНОГО СООБЩЕСТВА

(специальность 03.00.07 - микробиология)

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Пущино -1993

Работа выполнена в лаборатории анаэробных процессов Института биохимии и физиологии микроорганизмов РАН.

Научные руководители: доктор биологических наук, профессор В.К. Акименко кандидат биологических наук К.С. Лауринавичюс

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор ЕЛ. Головлев кандидат биологических наук А.Н. Ножевникова

Ведущее учреждение: Казанский Государственный Университет, кафедра микробиологии.

Защита диссертации состоится час.^^мин. на

заседании Специализированного совета Д002.69.01 при Институте биохимии и физиологии микроорганизмов РАН, г. Пущино, Московской области.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биохимии и физиологии микроорганизмов РАН

Автореферат разослан ЧУ " 1993 г.

Ученый секретарь Специализированного совета

доктор биологических наук В.М. Вагабов

Актуальность проблемы. В результате научно-технического прогресса и, в частности, развития химических отраслей промышленности, происходит интенсивное загрязнение окружающей среды синтетическими органическими соединениями. Значительная роль в деградации этих соединений принадлежит микроорганизмам. Обитая в различных экологических нишах, они обладают способностью включать в свой метаболизм неприродные органические соединения.

Состояние вопроса. Фундаментальные исследования в области анаэробной деградации органических соединений до метана микроорганизмами явились основой для создания современных технологий очистки бытовых и промышленных сточных вод. Одним из примеров высокоэффективных технологий очистки является реактор с восходящим потоком сточных вод (иА5В), в котором формируется гранулированная биомасса. В то время как анаэробная биологическая очистка сточных вод имеет длительную историю, процессы с гранулированной биомассой получили развитие только в последнее время. В настоящее время иАБВ реакторы широко применяются за рубежом для очистки сточных вод пищевых и целлюлозно-бумажных производств (ЬеИш§а е1 аЦ 1983). К настоящему моменту получен большой объем информации о механизме гранулообразования, микробном составе гранул, о тонких взаимоотношениях бактерий в сообществах в процессе метаболизма органических соединений (Ьеи^а е1 а1, 1988; Калюжный и др., 1991; Ьолуе е1 а1, 1993). Однако имеется ряд проблем, которые ограничивают применение данной технологии. Одной из них является проблема запуска процесса на новых сточных водах, с компонентами которых гранулированный ил ранее не контактировал. Это особенно актуально для очистки сточных вод химической промышленности, т.к. сток каждого производства содержит в большом количестве специфические компоненты. Для расширения сферы применения данной технологии необходимо решить ряд фундаментальных и прикладных задач, а именно, получение новых гранул на реальных сточных водах или изменение активности микрофлоры имеющихся гранул в желаемом направлении.

Удобной моделью в таких исследованиях явились сточные воды (мет)акрилатных производств, включающие в себя простые соединения, способные вовлекаться анаэробными бактериями в их метаболизм. Имеется ограниченное количество публикаций по анаэробной очистке сточных вод, содержащих (мет)акрилатные компоненты (Сухарев и др, 1987; БоЬапуоэ ег а1, 1988). Все они носят технологический характер и не содержат данных о микрофлоре участвующей в процессе очистки. Учитывая то, что сточные воды определенных производств всегда имеют специфический состав органических загрязнителей, изучение процесса их деградации позволяет выявлять как общие закономерности, так и индивидуальные особенности.

Цель и задачи работы. Цель настоящей работы состояла в изучении процессов анаэробного разложения органических веществ микроорганизмами гранулированного ила на примере компонентов сточных вод (мет)акрилатных производств. Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

изучить пути деградации органических компонентов сточных вод (мет)акрилатных производств сообществами анаэробных микроорганизмов;

выделить и охарактеризовать специфическую анаэробную микрофлору, инициирующую процесс деградации (мет)акриловых кислот;

инициировать процесс деградации (мет)акриловых кислот модификацией гранулированного ила специфической микрофлорой;

сравнить активность гранул, разрушающих метакриловую кислоту, выращенных на реальных сточных водах и модифицированных специфической микрофлорой;

изучить некоторые физиологические особенности культивирования гранулированного ила на индивидуальных субстратах: ацетате, пропионате, бутирате и изобутирате.

Научная новизна. Изучен путь деградации метакриловой кислоты до метана в анаэробных условиях. Показана роль специфической анаэробной микрофлоры в осуществлении начальной стадии процесса деградации (мет)акриловых кислот. Выделена и изучена чистая культура анаэробной бактерии, осуществляющая реакцию трансформации метакриловой кислоты до изомасляной за счет окисления ацетата. Данная реакция является новой для анаэробных бактерий, и в ряде случаев может представлять собой терминальную стадию деградации органических веществ, наряду с нитрат-, сульфат-, серо- и железоредукцией, а также метаногенезом.

Впервые продемонстрированы различные подходы к изменению активности микроорганизмов, входящих в гранулированный консорциум. Показано, что наиболее эффективным оказалось сочетание специфической микрофлоры, инициирующей процесс деградации (мет)акриловых кислот, с гранулированным илом, адаптированным к низшим жирным кислотам (изобутирату или пропионату).

В лабораторной модели UASB реактора получены значения pH оптимумов для гранулированного ила при культивировании на ацетате, пропионате, бутирате и изобутирате.

Практическая значимость исследования. Изучены пути деградации основных компонентов сточных вод (мет)акрилатных производств. Подробно исследована трансформация метакриловой кислоты до изомасляной чистой культурой АМ-1. Выделенный штамм АМ-1 может быть предложен как деструктор метакриловой кислоты и ацетата для анаэробной очистки сточных вод (мет)акрилатных производств. Изученные подходы по изменению микробиологической активности гранул на примере акриловой и метакриловой кислот могут служить методическими рекомендациями при выборе способа запуска UASB реактора на новых сточных водах. Изоляты метаногенных бактерий -DGAC и PRF, которые способны образовывать агрегаты, могут быть использованы в качестве исходных культур для внесения в UASB реактор при получении новых гранул.

Апробация работы. Материалы диссертации были сообщены на Всесоюзных конференциях (г. Пущино, 1988; г. Рига, 1988; г. Алма-Ата, 1991), на Всесоюзном симпозиуме " Микробиология охраны биосферы в регионах Урала и Северного Прикаспия" (г. Оренбург, 1991).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 5 работ, две работы находятся в печати.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, выводов и списка литературы. Материалы изложены на машинописного текста и включают таблиц, рисунков,

литературы содержит наименований работ.

глав» страницах Список

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Объектами исследования служили - активный ил из реактора контактного типа, который длительное время (более 3-х лет) очищал сточные воды (мет)акрилатных производств и гранулированный ил из UASB реактора, любезно предоставленный проф. Г. Летгингой (Голландия). Все эксперименты с илами проводились в анаэробных условиях.

Культивирование активного ила. Анаэробный активный ил культивировали при 37° С в стеклянной колбе объемом - 5 л, (объем жидкой фазы составлял 4 л). Колба была закрыта резиновой пробкой, снабжена стационарным пробоотборником, системой отвода и сбора газа. Перемешивание ила производилось магнитной мешалкой. Реактор работал в периодическом режиме. Среду готовили на водопроводной дехлорированной воде с добавлением NaHCO-j -2Д г/л и основных компонентов стоков (мет)акрилатных производств, суммарная концентрация которых равнялась 10 г/л в пересчете на жидкую фазу реактора. Конечное значение рН составляло 7,2 - 7,6.

Эксперименты во флаконах. Для культивирования как активного, так и гранулированного ила во флаконах (объем-50 мл) применялась минеральная среда (Lettinga et al., 1980). В качестве источников углерода использовали метиловый и бутиловый эфиры акриловой кислоты, метиловый эфир метакриловой кислоты, метакриловую и акриловую кислоты, метанол, изопропанол, бутанол, ацетон, масляную и изомасляную кислоты в концентрациях 1*2 г/л. Органические кислоты добавляли в среду в виде натриевых солей. Флаконы инкубировали в течение 10 -12 дней при 37°С.

Непрерывное культивирование гранул проводили в лабораторных моделях UASB реактора при 30°С. Реакторы имели высоту 40 см, внутренний диаметр 6 см и объем 1,2 литра. Реакторы инокулировались зрелыми гранулами. Слой гранул в реакторах в среднем составлял 25 см. Гидравлические нагрузки составляли 2,7-3,0 л/сут. Каждый реактор подпитывался синтетической средой, которая содержала следующие компоненты (г/л): NH^Cl • 1,04; КН2РО4 -0,17; (NH4)2S04 - 0,17; MgCl^f^O - 0,15; KCI - 0,27; дрожжевой экстракт • 0,02; микроэлементы - ОД мл.(ЬеИода et al., 1980); рН среды 7,0 • 7,2. В качестве единственного источника углерода в среду добавляли ацетат, или пропионат, или бутират, или изобутират (ЛЖК). Гранулы культивировали при различных значениях рН в интервале от 5,5 до 9,0. Пробы отбирали последовательно сверху вниз по высоте реактора с шагом 5 см. рН среды в пробах измеряли с использованием комбинированного электрода фирмы Ingold. Количество образованного биогаза определяли при помощи сосуда Мариотта по объему вытесненной воды. Беззолыюе вещество биомассы (БВБ) определяли по стандартной методике (Dolfing, 1985).

Приготовление сред, выделение и культивирование накопительных и чистых культур бактерий осуществляли согласно принципам работы с анаэробными микроорганизмами (Hungate, 1969; Balch et al., 1979) и рекомендациям (Widdel, 1980). Чистую культуру микроорганизмов, трансформирующих метакрилат, получали путем многократных пересевов колоний, которые вырастали в толще агаризованных питательных сред на соответствующие жидкие. Минеральной основой для сред служил солевой раствор (Widdel, Pfennig, 1984). Предварительную очистку культур от неметаногенной микрофлоры проводили с

использованием антибиотиков. При выделении и культивировании метаногенных бактерий использовали среды N1 и N3 (Balch et al., 1979), а также минералыгую среду (Zeikus et al., 1975) с необходимыми добавками. Чистоту культур контролировали с помощью микроскопирования, а также высевом на среды для аэробных и анаэробных гетеротрофных бактерий.

Физиологическая характеристика чистых культур включала определение оптимальных значений температуры, pH, субстратную специфичность.

Морфологию бактерий изучали, применяя световые микроскопы ЛЮМАМ-И2 и NU-2E (Carl Zeiss Jena) с фазовоконтрастным устройством, а также электронные микроскопы JEM-10Q, Hitachi-H600. Препараты для электронной микроскопии ( негативное контрастирование, ультратонкие срезы, сканирующая микроскопия) готовили по общепринятым методам (Методы общей бактериологии, 1983).

Определение суммарного белка. Содержание белка определяли п.о методу Бредфорда (Bradford, 1976).

Гагохроматографкчсскне анализы субстратов и метаболитов были выполнены на газовом хроматографе Pye Unicam GCD (Англия) с пламенно-ионизационным детектором. Газ -носитель - азот. Разделение ацетона, метанола, нзопропаиола и эфиров (мст)акриловых кислот проводили на стеклянной колонке (длина 1,5 м, внутренний диаметр 2 мм), заполненной глицерином (30 вес.%), на хромосорбе W/AW (100-120 меш.). Температура иньектора 120°С, колонки 90вС, детектора 120°С. Разделение акриловой, метакр иловой, уксусной, проп попово it, нзомасляиоП и масляной кислот проводили на стеклянной колонке (длина 2 м, внутренний диаметр 2 мм ), заполненной неопентилгликольсукцинатом (20 вес%) на хромосорбе W/AW-DMCS, 100-120 меш (Fluka, ФРГ). Температуру колонки повышали со скоростью 16°С/мин от 100° до 190°С. Температура ииьектора и детектора - 150°С.

Метан определяли на стеклянной колонке (длина 1 м, внутренний диаметр 2 мм), заполненной порапаком Q (Fluka, ФРГ). Температура иньектора 150°С, колонки • 120°С, детектора - 150°С.

Углекислоту и водород определяли на газовом хроматографе CHROM-S (Чехословакия) с детектором по теплопроводности. Газ-носитель»азот, скорость потока - 30 мл/мин. Температура колонки - 40°С, температура иньектора и детектора - 50°С. Для обнаружения водорода использовали металлическую колонку (длина 2 м, внутренний диаметр 3 мм, сорбент -молекулярные сита 13Х). Определение углекислоты проводили на стеклянной колонке ( длина 1 м, внутренний диаметр 2 мм), заполненной порапаком О.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

1. Пути деградации органических компонентов сточных вод (мет)акрнлатных производств до метана сообществами микроорганизмов адаптированного и неадаптированного ила.

С целью изучения путей деградации органических компонентов сточных вод до метана и СС>2 использовали адаптированный активный ил и неадаптированный гранулированный ил. Источниками углерода в обоих случаях служили метиловый и бутиловый эфиры акриловой кислоты, метиловый эфир метакриловой кислоты, метакриловая и акриловая кислоты, метанол, изопропанол, бутанол, ацетон, масляная и изомасляная кислоты. Адаптированный и неадаптированный ил разлагали эфиры до соответствующих спиртов и кислот, спирты - до ЛЖК,

сн3-сн-сн3 он

сн3-с-сн3 «=^-сн3-сн2-с-он

СН2=СН-С%-СН2-СН2-СН2-СН3^СН2-СН-С?ОН^СН3-СН2-С°ОН

I

СНд-С^-С^-С^-ОН

->■ сн3-сн2-сн2-с-он

сн2«с-с-о-сн3-

СНч

-> СНл^-С^ОН^к'СНгСН-С^ОН-

сн3

I

?н3

СН3-СН2-СН2-С-ОН

н2

со2 сн,

сн,-с°-он —► + со2

СНз-ОН

Рис.1. Пути деградации органических компонентов сточных вод (мет)акрилатных производств адаптированным и неадаптированным активным илом. ц ^только адаптированный ил.

а затем ЛЖК - до ацетата с образованием метана и СО2.

Разложение акриловой и метакриловой кислот до пропионовой и изомасляной, соответственно, а так же ацетона до пропионовой кислоты осуществлялось только адаптированным илом. Кроме того, было установлено, что для обоих типов илов характерно обратимое превращение ацетона и изопропанола, а также бутирата и изобутирата. В общем виде пути деградации основных компонентов сточных вод (мет)акрилатных производств представлены на рис. 1.

Результаты исследований позволили заключить, что как адаптированный ил, так и неадаптированный ил содержали физиологические группы бактерий, осуществляющие ацидогенез из спиртов, ацетогенез из ЛЖК и метаногенез. Способность деградировать (мет)акриловые кислоты и ацетон, присущая только адаптированному илу, указывает на то, что адаптация приводит к накоплению специфических милрооргакизмог, способных инициировать разложение данных соединений.

2. Инициирование процесса деградации (мет)акриловых кислот специфической анаэробной микрофлорой с образованием метана гранулированным илом.

Следующий этап наших исследований состоял в выяснении закономерностей инициирования процесса разложения акриловой и метакриловой кислот до метана. Для этого из адаптированного ила путем ряда последовательных пересевов в разведениях на средах как с акриловой, так и с метакриловой кислотами удалось получить две стабильные ассоциации анаэробных бактерий, осуществлявшие процессы трансформации этих соединений до пропионовой и изомасляной кислот, соответственно.

Дальнейшее протекание процесса зависело от активности синтрофной микрофлоры, осуществляющей ацетогенез из изобутирата или пропионата. Такая синтрофная микрофлора содержалась в исходных гранулах, но она обнаружила весьма низкую активность. В связи с этим следующий этап работы состоял в адаптации гранул к пропионату и изобутирату.

Таблица 1. Числеиость анаэробных микроорганизмов различных физиологических групп в гранулах, адаптированных к пропионату или изобутирату.

Гранулы Микроорганизмы (кл/мл), использующие:

СО2/Н2 ацетат пропионат бутират

неадаптированные ю10 ю8 10б ю7

адаптированные к пропионату ш10 10® 108 ю7

адаптированные к изобутирату ю9 ю7 ю9 ю10

СУТКИ

Рис.2. Деградация метахриловой кислоты до метана гранулами и инициирующей культурой. А — неадаптированные гранулы; Б — гранулы адаптированные к изобутирату.

--гранулы; _ гранулы + инициирующая

культура; о - метакриловая кислота; * - изобутират; о - метан.

Из данных, приведенных в табл. 1, следует, что адаптация гранул к пропионату или изобутирату приводила к увеличению на 2-3 порядка численности бактерий, утилизирующих пропионат или изобутират, соответственно. В то же время, численность бактерий, использующих бутират в "пропионатных" гранулах, осталась на уровне исходных, а использующих пропионат в "изобутиратных" гранулах, была на три порядка выше, по сравнению с исходным неадаптированным илом.

7

СУТКИ

Рис.3. Деградация акриловой кислоты до метана гранулами и инициирующей культурой. А — неадаптированные гранулы; Б — гранулы адаптированные к пропионату.

--гранулы; - гранулы + инициирующая

культура; а - акриловая кислота; ф -пропионат; о - метан.

Полученные результаты свидетельствовали о развитии в изученном сообществе синтрофкых микроорганизмов, специфических для определенного типа гранул. Подтверждением этого факта явилось и увеличение скорости потребления данных субстратов. Так, скорость потребления изобутирата была в 53 раза выше по сравнению с неадаптированными гранулами, а пропионата - в 21 раз.

Заключительный этап исследований состоял в получении полного процесса разложения (мет)акриловых кислот до метана с помощью инициирующих культур, осуществлявших начальную стадию превращения (мет)акриловых кислот в ЛЖК и гранул, адаптированных к последним. В качестве контроля использовались неадаптированные гранулы. На рис. 2 и 3 представлены результаты этих экспериментов.

Неадаптированные гранулы утилизировали метакриловую кислоту в течение всего периода инкубации со скоростью - 0,04 мМ/сут. Гранулы адаптированные к изобутирату трансформировали метакриловую кислоту в течение 24 суток со скоростью 0,1 мМ/сут. Добавление ассоциации инициирующих бактерий, как к неадаптированным, так и к адаптированным гранулам, приводило к трансформации метакриловой кислоты до изобутирата за 6 суток, против 24 суток без инициирующих бактерий , при этом скорость составляла 7,45-7,48 мМ/сут (рис. 2). Дальнейшая утилизация изобутирата, продукта трансформации метакриловой кислоты, проводилась микрофлорой гранул. Далее, как видно из динамики утилизации метакриловой кислоты и накопления продуктов, образованная изомасляная кислота потреблялась адаптированными и неадаптированными гранулами с разной скоростью, при этом накапливался ацетат (данные не представлены).

Образование метана наблюдалось в обоих случаях, при этом, адаптированные гранулы имели ярко выраженное преимущество перед неадаптированными. К концу эксперимента количество выделившегося метана у адаптированных гранул было примерно в 4 раза больше, чем у неадаптированных.

Результаты экспериментов по деградации акриловой кислоты до метана с помощью инициирующих культур и гранул представлены на рис. 3. В целом, динамика разложения акриловой кислоты до пропионовой с дальнейшим образованием метана аналогична описанной для метакриловой кислоты. Однако, как следует из рис. ЗА, гранулы адаптированные к пропионату, обладали сами по себе высокой способностью к утилизации акрилата со скоростью 3,5 мМ/сут, против 1 мМ/сут у неадаптированных гранул. Добавление ассоциации анаэробных бактерий, трансформирующих акриловую кислоту, к гранулам сокращало время утилизации последней до 3-4 суток. Скорость трансформации при этом составила 57 мМ/ сут. Образованная при этом пропионовая кислота потреблялась микрофлорой гранул, адаптированных к пропионату. В то время как неадаптированные гранулы не утилизировали пропионат (рис. ЗА), а количество образованного метана было в 4,5 раза меньше, чем в варианте с адаптированными гранулами.

Проведенные расчеты показали, что углерод (мет)акриловых кислот практически полностью переходил в метан, если в процессе деградации участвовали инициирующие культуры и гранулы, адаптированные к низшим жирным кислотам (пропионату или изобутирату). В противном случае, при использовании неадаптированных гранул, в течение периода инкубации в метан переходило всего лишь 12,5 или 20 % углерода при деградации метакриловой или акриловой кислоты, соответственно.

3. Характеристика анаэробной бактерии, трансформирующей метакриловую кислоту.

Из устойчивой ассоциации бактерий, трансформирующей метакрилат в изобутират, была выделена чистая культура, обозначенная как штамм АМ-1. Она росла на синтетической среде содержащей ацетат и метакрилат. Штамм АМ-1 был представлен палочковидными, хах правило, одиночными клетками с закругленными концами, размером 1,8-2,4 • 0,4-0,6 мкм. Клетки были подвижны за счет перитрихиально расположенных жгутиков. Бактерии не образовывали спор и окрашивались по Граму отрицательно. Бактерии не росли в аэробных условиях и требовали наличия в среде восстановителя ( сульфида или сульфид-цистеина - 0,5 г/л), являясь, таким образом, строгими анаэробами. Оптимальный рост изолята наблюдали при температуре 37°С и значениях рН - 7,2-7,4. Пенициллин, стрептомицин, ампицилин и некоторые другие антибиотики в концентрации 100 мг/мл подавляли рост и реакцию трансформации метакриловой кислоты. Этот факт, а также строение клеточной стенки, указывает на принадлежность штамма АМ-1 ¡с эубактериям (Вещ, 1989). Бактерия хорошо росла на синтетической среде, не Содержащей витаминов и других органических факторов роста. При высеве в агаризованную среду бактерии образовывали в течение 10 - 15 дней розовые колонии диаметром 1-2 мм. На рис. 4 представлена динамика метаболизма субстратов (ацетата, метакрилата) и образования изобутирата и СО2.

МЕТАКРИЛАТ, ИЗОБУТИРАТ, АЦЕТАТ, С02 [мМ]

Рис.4. Динамика трансформации метакриловой кислоты (МАК) и окисления ацетата штаммом АМ-1. Стрелка показывает

дополнительное введение МАК в среду. — МАК;----- изобутират;

----ацетат;.....СО2.

Как видно из этих данных , микроорганизм окислял ацетат с одновременным восстановлением метакрилата до изобутирата. Скорость окисления ацетата составляла 4,4 мМ/сут, а скорости трансформации метакрилата и образования изобутирата достигали 14,6 мМ/сут. и 163 мМ/сут, соответственно. Метаболизм субстратов культурой АМ-1 сопровождался ростом бактерий со скоростью 96 мг белка/л • сут. В отсутствие ацетата метакриловая кислота не использовалась в качестве единственного источника углерода и энергии.

Субстратами, поддерживающими рост культуры, в процессе трансформации метакрилата, кроме ацетата, служили также формиат и водород. Микроорганизм не использовал в качестве донора электронов для восстановления метакрилата следующие субстраты: метанол, этанол, лактат, пропионат, бутират и глюкозу. Сульфат, тиосульфат и Б0 не служили акцепторами электронов. Кроме того, не наблюдали образования метана или ацетата при инокулировании штаммом АМ-1 среды с СО2/Н2 (20:80) в качестве единственного источника углерода и энергии.

По результатам изучения стехиометрии следует, что разложение ацетата и восстановление метакрилата происходило согласно следующему уравнению:

Н3с-С00' + ЗН2ОС-СОО' + 4Н20 --> ЗН3С-^Н-СОО" + 2НСО3"

сн3 сн3

Выделенный нами штамм АМ-1 осуществляет реакцию, которая представляет интерес, если рассматривать ее как терминальную стадию при деградации органического вещества. В таких искусственных экосистемах как метантенки, очищающие сточные воды химических производств, которые содержат до 10 г/л метакрилата или другие ненасыщенные кислоты, данная реакция и бактерия, осуществляющая ее, может играть существенную роль в регуляции потока электронов.

Таким образом, приведенные результаты свидетельствуют, что выделенный микроорганизм является строго анаэробной ацетат окисляющей бактерией. В настоящее время известно ограниченное число строго анаэробных бактерий, способных использовать ацетат в качестве единственного источника углерода и энергии. До сих пор также не был известен микроорганизм, сочетающий способность окисления ацетата с одновременным восстановлением метакрилата.

4. Микробиологическая характеристика гранулированного ила, сформированного на сточной воде (мет)акрилатного производства.

4.1. Формирование гранулированного ила на сточной воде (мет)акрилатного производства. В результате лабораторных экспериментов нами было показано, что процесс формирования гранул на реальных сточных водах (мет)акрилатных производств занимал от 120 до 240 суток. Исходный анаэробный активный ил содержал агрегаты клеток, подобные МеШапо5агста ьр. и палочковидные клетки разной длины. Через 45 суток суспендированный ил приобрел ярко выраженную флокулированную структуру. Появление отдельных гранул, количество которых возрастало со временем, мы наблюдали спустя 120 дней, а к 240 дню практически весь ил приобрел гранулярную структуру. Размеры выращенных гранул варьировали от 0,5 мм до 10 мм. При этом крупные гранулы встречались реже (до

10%). В сформированных гранулах доминировали палочковидные клетки. Полученные гранулы обладали высокой активностью к трансформации метакриловой кислоты. Они были в 42 и 84 раза активнее чем голландские гранулы, адаптированные к метакрилату или изобутирату, соответственно.

4.2. Свойства некоторых метанобразующих бактерий, выделенных из сформированных гранул. Анализ метаногенного сообщества выращенных гранул показал, что в них присутствуют различные метаболические группы метаногенов, способные расти на среде с ацетатом, метанолом или СО2/Н2, в качестве источника углерода и энергии. Их численность достигала порядка 1(г - 1(Лсл/мл. При микроскопировании препаратов из последних разведений клеточных суспензий, где шел процесс активного метанобразования (до 70 % метана в газовой фазе), мы наблюдали, в основном, палочковидные формы, реже встречались кокки или сарциноподобные клетки.

Под люминесцентным микроскопом клетки, вырасшие на среде с СО2/Н2 или метанолом, обнаруживали характерное для метаногенов зеленоватое свечение. В то время, как на среде с ацетатом светящиеся клетки встречались гораздо реже. В дальнейшем, более подробно были исследованы культуры, использующие для роста и метаногенеза Н2/СО2 или ацетат. Как правило, такие организмы являются основными компонентами метаногенного сообщества в гранулах (ОоШ^ е| аЦ 1985). Свойства изолятов суммированы в таблице 2.

Таблица 2. Основные свойства метаногенов выращенных из сформированных гранул.

Свойства | Штаммы метаногеиных бактерий

| БСАС РР.Г М,

Форма клеток палочки палочки палочки

Размеры, мкм 0,7' 2-3 0,5' 5-6 0,4' 8-12

Образование агрегатов + + -

Оптимум, Т"С 37-40 37 37

Оптимум, рН 7,2-7,4 6,6-7,0 нд.

Метан на субстратах (%)'.

н2/со2 0,7-2 43

формиат, 25 мМ - 50 18

ацетат, 5 мМ 30 - -

Время удвоения, час 6,2 3,1 1,2

Ацетатпотребляющий метаногеи. Из активной накопительной культуры, использующей ацетат (5 мМ), как источник роста и метаногенеза, была получена

монокультура, обозначенная как штамм DGAC. Клетки этого штамма были представлены прямыми палочками с прямоугольными обрубленными концами, диаметром 0,7-0,8 мкм и длиной 2,5-5,0 мкм. При микроскопировании препаратов живых клеток наблюдали цепочки из 2 -3 клеток или длинные нити, достигавшие 120-140 мкм. Такие нити характерны для бактерий рода Methanothrix (Huser et al, 1982; Kamagata et al, 1990). Ацетат являлся единственным источником роста и энергии. Его оптимальная концентрация для роста составляла около 5 мМ, что характерно для организмов этого рода (Ohtsubo et al, 1992). Дрожжевой экстракт (0,5 г/л), коэнзим М (50 мг/л) и NaHCOj (1г/л) стимулировали рост изолята. Активный рост штамма наблюдался при добавлении в среду FeS в концентрации 0,05 г/л. При этом культура хорошо развивалась в осадке и нити концентрировались вокруг микрочастиц FeS. Это свойство культуры, возможно, вносит свой вклад в формирование гранул в реакторе типа UASB.

Таким образом, морфология и способность использовать ацетат в качестве единственного источника углерода и энергии свидетельствует о принадлежности штамма DGAC к роду Methanotrix. Как было показано (MacLeod et al, 1990), Mtx. soehngenii играет центральную роль в реакторе типа UASB и является одной из основных культур, осуществляющих процесс метаногенеза из ацетата.

Водородпотребляющие штаммы. Два штамма PRF и RL использовали для роста и метаногенеза СО2/Н2 или формиат. Для штамма PRF рост на формиате был более предпочтителен (табл. 2). Выделенные организмы не требовали органических добавок для роста.

Одной из характерных морфологических особенностей штамма PRF являлся его рост в агрегатах. Отдельные клетки были изогнуты, неподвижны и достигали в длину до 5-6 мкм . Организмы с такой морфологической особенностью также могут вносить свой вклад в формирование гранул, наряду с Methanothrix spp.

Следует также подчеркнуть, что образование метана из ЛЖК происходит посредством межвидового переноса водорода. В последнее время появились данные и об участии формиата в данном процессе (Thiele, Zeikus, 1988; Shink, 1992). Таким образом, физиологическая роль выделенных из гранул водородпотребляющих метаногенов становится очевидной.

5. Некоторые физиологические особенности культивирования гранулированного ила на индивидуальных субстратах: ацетате, пропионате, бутирате и изобутирате.

5.1. Влияние начальных значений рН среды, подаваемой в колонку, на жизнедеятельность гранулированного ила. На рис. 5 представлены выборочные данные значений рН среды в слое гранул, полученные нами в лабораторных экспериментах по культивированию гранул на индивидуальных ЛЖК при различных начальных рН подаваемой среды. В каждом из приведенных случаев, рН среды в слое гранул быстро сдвигался по высоте колонки в довольно узкую область значений рН. Так, для ацетата они находились в интервале рН 8,0-8,5; для пропионата - 7,1-7,7; для бутирата - 7,5-8,0; для изобутирата - 7,3-7,7. Данные области рН, в основном, совпадали с интервалами рН для наибольших удельных скоростей

рН рН

рн рн

Рис.5 Изменения рН среды внутри слоя гранулированного ила, при ее подаче о: А. - ацетатом; Б - пропионатом; В - бутиратом; Г - изобутиратом.

потребления ацетата, пропионата, бутирата и изобутирата, которые составляли 7,58,5; 6,75-7,75; 7,0-8,0; 7,0-8,0, соответственно. Удельные скорости при оптимумах рН составляли [мМ/(г БВБ сутки)]: для ацетата (рН-8,0) - 26, для пропионата (рН-7,5) -2,5, для бутирата (рН-7,6) - 12 и для изобутирата (рН-7,6) - 3,0. Приведенные выше данные показывают, что гранулированный ил не просто поддерживал рН среды в интервале 6,0-8,0, а сдвигал его в область оптимальных значений для потребления индивидуальных субстратов.

14

потребление ацетата (мМ/сутки) 1400

О 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 Ацетат (мМ)

потребление пропионата (мМ/сутки) 500

0 40 80 120 160 200 240 Пропионат (мМ)

потребление бутирата (мМ/сутки) 2000

Ьутират (ыМ)

потребление изобутирата (мМ/сутки) 2500

100 200 300 400 500 Изобутират (мМ)

Рис.6. Зависимость скорости потребления гранулированным илом индивидуального субстрата от его концентрации.

5.2. Влияние концентрации ЛЖК на жизнедеятельность гранулированного ила. Далее мы исследовали влияние концентраций ЛЖК на скорости их потребления. Как видно из данных, представленных на рис. 6 практически во всех случаях скорости потребления ЛЖК линейно зависели от концентрации субстрата. ( Данные приведенные на рисунках получены при оптимальных значениях рН). Полученные линейные зависимости указывают на то, что скорости потребления субстратов ограничиваются диффузией их молекул внутрь гранул,

а увеличение нагрузки (по его концентрации) повышает эффективность утилизации субстрата. Полученные результаты свидетельствуют, что реакторы типа ЧАБВ выгоднее эксплуатировать при высоких нагрузках по ЛЖК.

ВЫВОДЫ

1. Изучены пути деградации основных компонентов сточных вод (мет)акрилатных производств анаэробным сообществом микроорганизмов неадаптированного гранулированного ила из реактора типа иА5В и адаптированного активного ила из реактора контактного типа. Показано, что разложение метакриловой и акриловой кислот, а также ацетона протекает только в адаптированном иле, что свидетельствует о развитии специфических метаболических групп микроорганизмов. Особенностью процесса является обратимое превращение ацетона и изопропанола.

2. На сточной воде (мет)акрилатных производств получены гранулы осуществляющие процесс разложения метакриловой кислоты с высокой скоростью: 84 мМ/сутки,

3. Предложены подходы к изменению микробной активности гранулированного ила, которые заключаются :

а) в естественной адаптации к (мет)акрилатам,

б) адаптации гранулированного ила к интермедиату разрушения (мет)акрилатов,

в) сочетании специфической микрофлоры, осуществляющей начальную стадию разложения (мет)акрилатов, с гранулами, адаптированными к низшим жирным кислотам.

На примере разложения акриловой и метакриловой кислот до метана показано, что наибольший эффект в изменении микробной активности достигался при сочетании специфической микрофлоры с гранулированным илом, адаптированным к пропионату или изобутирату.

4. Из адаптированного активного ила выделена чистая культура анаэробной бактерии, осуществляющая трансформацию метакриловой кислоты в изомасляную за счет окисления ацетата. Микроорганизм с таким типом метаболизма описан впервые.

5. Впервые получены значения оптимумов рН при культивировании гранулированного ила на ацетате, пропионате, бутирате и изобутирате. Эти значения составили 8.0,15,7.6 и 7.6, соответственно.

Показано, что гранулированный консорциум анаэробных микроорганизмов сдвигает рН среды в область оптимальных значений для потребления индивидуальных низших жирных кислот.

Скорость разрушения ацетата, пропионата, бутирата и изобутирата линейно зависит от их концентраций, что подтверждает лимитирование процессов в гранулах диффузионным переносом субстратов из среды к микроорганизмам.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

Штаркман Н.Б, Лауринавичюс К.С, Акименко В.К. Пути деградации отходов (мет)акрилатных производств активным илом. Сборник тезисов Всесоюзной конференции "Микробиологические методы защиты окружающей среды". Пущино, 1988, с. 126-127.

Штаркман Н.Б, Литвинов Н.Р, Лауринавичюс К.С, Акименко В.К. Пути деградации отходов (мет)акрилатных производств в метантенке. Сборник тезисов 1 конференции "Биоконверсия-88". Рига, 1988, с. 116

Штаркман Н.Б, Лауринавичюс К.С, Акименко BJC Разрушение низших жирных кислот до метана ассоциацией анаэробных микроорганизмов в UASB реакторе. Сборник тезисов Всесоюзной конференции "Биотехнология и биофизика микробных популяций". Алма-Ата, 19-22 августа, 1991, с. 87

Образцова АЛ, Котельникова С. В., Штаркман Н.Б, Галушко А.С, Лауринавичюс К.С., Акименко В.К. Биологическая очистка сточных вод (мет)акрилатных производств. Анализ микроорганизмов метаногенного сообщества. Сборник тезисов Всесоюзного симпозиума "Микробиология охраны биосферы в регионах Урала и Северного Прикаспия". Оренбург, 1991, с. 94-95.

Штаркман Н.Б, Лауринавичюс К.С, Акименко В.К. Пути деградации органических компонентов сточных вод (мет)акрилатных производств до метана сообществом микроорганизмов адаптированного и неадаптированного ила. Микробиология, 1992, Т. 61, Вып. 4, с. 709-716.

10.11.93 г. Зак.5845Р. Тир.ХЗО экз. Уч.-изд.т. 1.0 Отпечатано на ротапринте в ОНТИ ПНЦ РАН