Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Особенности биологической активности водорастворимых производных фуллеренов в системе вирус - клетка-хозяин

ВАК РФ 03.00.06, Вирусология

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Максимова, Наталья Сергеевна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Биологические и генетические механизмы жизненного цикла вирусов как основа для выбора перспективных направлений антивирусной химиотерапии.

1.1.1. Молекулярно-генетическая организация вирусов и реализация вирусной генетической информации. Ингибиторы вирусных ферментов.

1.1.2. Механизмы взаимодействия вируса и клетки-хозяина и ингибиторы ключевых этапов вирусной инфекции.

1.2. Характеристические особенности фуллеренов и перспективность их применения в биологии и медицине.

1.2.1. Строение фуллеренов.

1.2.2. Химические свойства фуллеренов.

1.2.3. Воздействие фуллеренов на биологические объекты.

1.2.3.1. Биохимическая активность фуллеренов.

1.2.3.2. Антивирусная активность фуллеренов.

1.2.3.3. Действие фуллеренов на клетки и их цитотоксические свойства.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

2.1. Синтез водорастворимых производных фуллеренов.

2.2. Клеточные культуры и вирусы.

2.3. Определение влияния производных фуллеренов на культуры соматических клеток.

2.3.1. Цитотоксический эф ф ект.

2.3.2. Исключение трипанового синего.

2.3.2.1. Приготовление раствора трипанового синего.

2.3.3. Гемолитический тест.

2.3.4. Анализ роста бактерий в периодической культуре.

2.4. Исследование вирулицидного действия производных фуллеренов

2.4.1. Действие на внеклеточный вирус гриппа.

2.4.2. Действие на внеклеточный вирус полиомиелита.

2.4.3. Фагоцидное действие.

2.5. Изучение влияния производных фуллеренов на процесс репродукции вирусов.

2.5.1. Исследование репродукции вируса гриппа.

2.5.1.1. Метод ИФА.

2.5.1.1.1. Приготовление желатины.

2.5.2. Изучение адсорбции вирусов полиомиелита на клетках НЕр

2.5.3. Изучение влияния производных фуллеренов на адсорбированный вирус полиомиелита.

2.6. Изучение адсорбции бактериофага /52 на чувствительной культуре 74 2.6.1. Подготовка бактериальной культуры.

2.7. Изучение длительности латентного периода бактериофага /52 в культуре Escherichia coli С.

2.8. Электронная микроскопия.

2.8.1. Подготовка материала для электронной микроскопии

2.8.1.1. Приготовление смолы.

2.9. ИК спектроскопия.

2.10. Статистическая обработка результатов.

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ.

3.1. Характеристика производных фуллеренов.

3.2. Исследование токсичности производных фуллеренов в отношении клеточных линий MDCK, НЕр2 и эритроцитов крови человека

3.2.1. Гемотоксичность производных фуллеренов.

3.2.2. Цитотоксичность производных фуллеренов в отношении клеток MDCK.

3.2.3. Действие производных фуллеренов на культуру клеток НЕр

3.2.4. Биологическая активность производных фуллеренов в отношении культуры бактериальных клеток Escherichia coli С

3.3. Исследование биологического действия водорастворимых производных фуллеренов на вирусы человека на модели вирус гриппа А/Виктория/3 5/72 (НЗЫ2)-клетки MDCK.

3.3.1. Влияние водорастворимых производных фуллеренов на внеклеточный вирус гриппа А/Виктория/3 5/72 (H3N2).

3.3.2. Воздействие производных фуллеренов на процесс репродукции вируса гриппа А/Викгория/35/72 (H3N2) в культуре клеток MDCK.

3.4. Исследование влияния производных фуллеренов на вирусы человека на модели вирус полиомиелита-клетки НЕр2.

3.4.1. Эффект производных фуллеренов на внеклеточный вирус полиомиелита Р712, ch2ab (II).

3.4.2. Влияние производных фуллеренов на инфекционный процесс в системе полиовирус -клетки НЕр2.

3.5. Влияние производных фуллеренов на биологическую систему бактериофаг (52 - Escherichia coli С.

3.5.1. Действие производных фуллеренов на внеклеточный бактериофаг f52.

3.5.2. Влияние производных фуллеренов на процесс адсорбции бактериофага f52 на клетках Escherichia coli С.

3.5.3. Изменение длительности латентного периода и урожая бактериофага (52 в клетках Escherichia coli С в присутствии производных фуллеренов.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Особенности биологической активности водорастворимых производных фуллеренов в системе вирус - клетка-хозяин"

Актуальность проблемы. Последнее десятилетие отмечено большим интересом к одной из аллотропных модификаций углерода - фуллеренам. Начиная с 1990 года, когда был предложен способ получения этого класса веществ в лабораторных условиях, т.е. когда фуллерены стали доступны широкому кругу исследователей, началось детальное изучение их уникальных физических и химических свойств (Мастеров В.Д., 1997). В настоящее время наука о фуллеренах приобрела междисциплинарный характер. Физика, химия, биология, математика, астрономия, геология, медицина - вот далеко не полный перечень научных дисциплин, в рамках которых проводятся исследования свойств фуллеренов (Елецкий А.В., Смирнов Б.М., 1995).

Эти вещества привлекают внимание уникальной химической структурой и, как следствие, своеобразием свойств. Согласно многочисленным публикациям, посвященным фуллеренам, сфера их перспективного применения также чрезвычайно широка: создание сверхпроводников (Елецкий А.В., Смирнов Б.М., 1995; Мастеров В.Д., 1997), синтез алмазов, разработка новых катализаторов и адсорбентов (Давыдов В.Я., Хохлова Т.Д., 2000), синтез экологически чистых источников тока и принципиально новых медицинских препаратов (Елецкий А.В., Смирнов Б.М., 1993; Andrievsky G.V. et al., 1997).

Перспектива использования фуллеренов в биологической и фармакологической практике заслуживает особого внимания. Результаты биологических исследований фуллеренов (Andrievsky G.V. et al., 1997; Jensen A.W., Wilson S.R., Schuster D.I., 1996; Kotelnikova R.A. et al., 1996) выявили наличие липофильных и мембранотропных свойств у этих веществ. Мембранотропность является чрезвычайно важным свойством. Учитывая, что множество жизненно важных для клеток биофизических и биохимических процессов связано с клеточной мембраной, можно предположить возможность использования фуллеренов для воздействия на эти процессы (Зайдес В.М., Жданов В.М., 1981; Штрауб Р.У.,

Болис Л., 1983; Букринская А.Г., Жданов В.М., 1991; Кукайн Р.А., 1991). Это также может иметь отношение и к взаимодействиям клеток с вирусами - возбудителями различных инфекционных заболеваний, что представляет огромный практический и теоретический интерес как для медицины, так и для экспериментальной биологии.

Следует отметить, что перспектива успешного внедрения фуллеренов в биологическую и медицинскую практику, в частности, в качестве антивирусных препаратов, тесно связана как с неослабевающей потребностью в новых антивирусных химиопрепаратах, так и с проблемой синтеза водорастворимых производных фуллеренов (Lamparth I., Hirsch А., 1994; Scrivens W.A., Tour J.M., Creek K.E, 1994; Andrievsky G.V. et al., 1995; Tsuchiya Т., Yamakoshi Y.N., Mi-yata N.A., 1995). Наиболее вероятно, что только при этом условии возможно эффективное взаимодействие указанных соединений с биофизическими и биохимическими факторами жизнеобеспечения клеток (Scrivens W.A., Tour J.M., Creek K.E, 1994; Andrievsky G.V. et al., 1995). Важным обстоятельством для проведения работ в этом направлении является то, что технологии получения водорастворимых производных фуллеренов в настоящее время достаточно немногочисленны.

Одним из наиболее приемлемых в биологическом смысле путей создания водорастворимых соединений фуллеренов является получение их производных на основе матриц - носителей, в частности, поливинилпирролидона (Yamakoshi Y.N. et al., 1994; Andrievsky G.V. et al., 1995). Вместе с тем, существует перспектива возможного использования в качестве таких матриц различных биомолекул - пептидов (Toniolo С. et al., 1994; Kotelnikova R.A. et al., 1996) и аминокислот (Vol'pin M.E. et al., 1995; Kotelnikova R.A. et al., 1996). В частности, это относится и к молекулам фосфолипидов (Бородин Е.А., Арчаков А.И., Лопухин Ю.М., 1985; Гордиенко А.Д., 1990; Тенанова Г.В., Кушнарева М.В., Светлов С.И., 1992). Есть основания полагать, что использование биомолекул позволит регулировать цитотоксичность синтезируемых соединений и, следовательно, расширить спектр их биологической эффективности (Луйк А.И. и со-авт., 1999). Вероятно, осуществляя модификацию фуллеренов путем использования в качестве матриц биомолекул клеточной природы, можно повысить также и мембранотропность соответствующих производных.

Исходя из этого, важной задачей представляется сравнительное исследование эффективности действия производных фуллеренов, полученных с использованием разных матриц, в биологической системе вирус-клетка. Принимая во внимание вышесказанное, а также то, что проблема резистентности вирусов к химиопрепаратам до сих пор остается одной из чрезвычайно важных (Emini Е.А., 1995; Киселев О.И. и соавт., 2000), изучение биологической, в частности, антивирусной активности производных перспективного нового класса веществ - фуллеренов представляется интересной и актуальной задачей.

Цель работы. Целью настоящего исследования явилось изучение биологической активности водорастворимых производных фуллеренов на моделях РНК-содержащих оболочечных и безоболочечных вирусов и клеточных культур, чувствительных к этим вирусам.

Задачи исследования. Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:

- синтез водорастворимых производных фуллеренов;

- исследование параметров цитотоксичности синтезированных производных фуллеренов;

- исследование действия этих соединений на внеклеточные вирусы;

- исследование антивирусного эффекта производных фуллеренов в системе вирус - клетка-хозяин;

- сравнительная характеристика полученных производных по эффективности биологического действия.

Научная новизна и практическая ценность работы. Разработан метод синтеза, с помощью которого впервые получено качественно новое водорастворимое производное фуллеренов. В качестве амфифильной матрицы для этого были использованы фосфолипиды клеточного происхождения — кефалины. Определены оптимальные весовые соотношения компонентов «фуллерен» : «матрица», при которых фуллерены наиболее полно переходят в водный раствор.

Обнаружен ингибирующий эффект производных фуллеренов, синтезированных на основе разных по химической природе молекулярных матриц (PVP, кефалинов и твина 20), на процесс репродукции РНК-содержащих вирусов человека и бактерий. Впервые проведены исследования биологической активности фуллеренов на моделях РНК-содержащих безоболочечных вирусов полиомиелита и бактериофага Escherichia coli f52.

На основании результатов проведенных вирусологических и электронно-микроскопических исследований выявлено, что фуллерены обладают способностью блокировать вирусную репродукцию на уровне мембранозависимых процессов - адсорбции и проникновения вируса в клетку.

В результате выполненной работы получены данные, доказывающие антивирусную эффективность фуллеренов в отношении различных вирусных инфекций. Работа на данном этапе имеет фундаментальное значение и позволяет расширить объем информации, касающейся медико-биологического аспекта науки о фуллеренах, в частности, их антивирусной активности. По результатам работы получен патент Российской Федерации № 2162819 «Способ получения водорастворимых производных фуллеренов», что свидетельствует о практической перспективности настоящей работы.

Положения, выносимые на защиту.

• Возможность создания эффективных водорастворимых производных фуллеренов с использованием бифильных матриц различной химиче

10 ской природы;

• Параметры цитотоксического действия водорастворимых производных фуллеренов имеют дозозависимый и матрично-специфический характер. Фуллерены снижают токсичность веществ, использованных в качестве матриц;

• Характеристики действия синтезированных производных фуллеренов на внеклеточные оболочечные и безоболочечные РНК-содержащие вирусы;

• Протективное действие производных фуллеренов в системе вирус-клетка-хозяин в значительной степени реализуется на этапе мембрано-зависимых стадий вирусной репродукции.

Заключение Диссертация по теме "Вирусология", Максимова, Наталья Сергеевна

выводы

1. Разработан способ получения стабильных водорастворимых производных фуллеренов и синтезированы дериваты на основе молекулярных матриц поливинилпирролидона, кефалинов и твина 20.

2. В результате исследований цитотоксической активности синтезированных производных фуллеренов в отношении культур бактериальных и соматических клеток установлено, что фуллерены снижают цитотоксичность использованных матриц.

3. Показано, что производные CPVP и CCph способствуют увеличению скорости деления бактериальных клеток, a CTw - замедляет процесс деления в сравнении с контрольными показателями. Бактерицидного эффекта производных фуллеренов в отношении культуры Е. coli С не выявлено.

4. Производные CPVP, CCph, CTw и соответствующие матрицы не проявляют вирулицидного действия в отношении РНК-содержащих безоболочеч-ных вирусов - полиомиелита Р 712, ch 2ab (II) и бактериофага Е. coli {52. Методом электронной микроскопии показано деформирующее действие высоких концентраций CCph, CTw и соответствующих матриц на структуру вирионов гриппа А/Виктория/35/72 (H3N2). Деструктивного действия производного CPVP на вирионы гриппа А/Виктория/3 5/72 (H3N2) не выявлено.

5. Действие производных фуллеренов, как антивирусных агентов, в значительной мере направлено на поверхностные структуры клетки-хозяина.

6. В системе вирус - клетка-хозяин производное соединение CPVP в высоких концентрациях эффективно блокирует репродукцию вируса гриппа А/Виктория/3 5/72 (H3N2).

7. Определено, что обработка монослоя клеток НЕр 2 растворами CPVP до инокуляции полиовируса, и воздействие на монослой с адсорбированным вирусом растворами CCph и CTw приводят к достоверному снижению эффективности репродукции вируса полиомиелита на 100 - 50%.

154

8. На модели системы бактериофаг f 52 - клетки Е. coli С выявлено, что производные фуллеренов оказывают влияние последовательно на несколько параметров вирусной инфекции - адсорбцию вируса, длительность латентного периода и урожай вирусных частиц.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Начиная с 1990 года началось детальное изучение уникальных физических и химических свойств одной из аллотропных форм углерода - фуллеренов (Елецкий А.В., Смирнов Б.М., 1993). Эти вещества привлекают внимание исследователей специфической химической структурой и, как следствие, своеобразием свойств. Чрезвычайно широка сфера их перспективного применения: от электроники до фармацевтической отрасли. При этом последнее заслуживает особого внимания, если учесть обнаруженные в ходе биологических исследований липофильные и мембранотропные свойства фуллеренов (Jensen A.W., Wilson S.R., Schuster D.I., 1996; Kotelnikova R.A. et al., 1996). Принимая во внимание, что множество жизненно важных для клеток биофизических и биохимических процессов связано с клеточной мембраной, можно предположить возможность использования фуллеренов для воздействия на эти процессы (Зайдес В.М., Жданов В.М., 1981; Штрауб Р.У., Болис Л., 1983; Букринская А.Г., Жданов В.М., 1991; Кукайн Р.А., 1991). Это предположение можно перенести и на процессы взаимодействия клеток и вирусов. Однако применение фуллеренов в биологической и медицинской практике ограничено гидрофобностью этих веществ. Решением этой задачи является синтез их водорастворимых производных, т.к. только при этом условии возможно эффективное взаимодействие с биофизическими и биохимическими факторами жизнеобеспечения клеток (Scrivens W.A., Tour J.M., Creek К.Е., 1994; Andrievsky G.V. et al., 1997). Однако технологии получения вышеупомянутых производных достаточно немногочисленны.

Перспективным в этом направлении может явиться создание новых соединений или комплексов на основе биомолекул клеточного происхождения, например, аминокислот (Vol'pin М.Е. et al., 1995; Kotelnikova R.A. et al., 1996), пептидов (Toniolo C. et al., 1994; Vol'pin M.E. et al., 1995), фосфолипидов (Гордиенко А.Д., 1990). Это позволит расширить спектр биологической эффективности, повысить сродство к компонентам клеточных мембран, а также уменьшить цитотоксичность (Луйк А.И. и соавт., 1999) производных фуллеренов.

Исходя из вышесказанного, для изучения биологической активности фуллеренов в системе вирус - клетка-хозяин были приготовлены их водорастворимые производные. При этом в качестве матриц нами были выбраны амфифильные соединения различной химической природы: PVP, кефалины и твин 20. В качестве водорастворимой молекулярной матрицы нами впервые были использованы мембранные кефалины, которые отличаются от других фосфолипидов способностью растворяться в полярных и неполярных растворителях. Кефалины являются естественными компонентами клеток животных и человека. Прототипом разработанного нами способа получения водорастворимых производных явился метод, описанный в работе (Yamakoshi Y.N. et al., 1994). Весь процесс проводился в изолированном боксе в атмосфере азота. Для создания азотной атмосферы герметично закрытый бокс продували газом в течение 30-50 минут. Навеску фуллеренов растворяли в бензоле (плотность 0,879 г/см3) при комнатной температуре. К полученному раствору фуллеренов приливали раствор молекулярной матрицы в хлороформе. Затем проводили выпаривание смеси под вакуумом в течение нескольких часов. Выбор бензола в качестве растворителя для фуллеренов позволял проводить эту стадию при температуре 45°С, которая не вызывала деструкции компонентов реакции. Повышение температуры приводило к разрушению комплекса. Снижение температуры значительно увеличивало продолжительность процесса высушивания, причем не достигалось полного удаления растворителей, что оказывало негативное влияние на качества продукта.

Нами были исследованы показатели растворимости фуллеренов в воде в зависимости от соотношения масс компонентов производного соединения «фуллерен» : «матрица». Показано, что эти показатели, как и следовало ожидать, различались в зависимости от типа матрицы. Так, по максимальному процентному содержанию фуллеренов полученные водорастворимые производные можно было расположить в следующем порядке: CCph(0,85%)>CPVP(0,63%)>CTw(0,23%). Полученные нами данные согласовались с опубликованными материалами, касающимися растворения фуллеренов в воде с использованием поливинилпирролидона (Yamakoshi Y.N. et al., 1994), однако указанное авторами максимальное процентное содержание фуллеренов в составе производного достигало 0,80%. Было установлено, что увеличение концентрации фуллеренов в реакционной смеси не приводило к увеличению их процентного содержания в составе водорастворимых производных. Кривые растворимости плавно поднимались до определенного значения, после чего переходили в область плато (рис. 21 - 23).

Объяснение этому факту было получено с помощью метода ИК - фурье -спектроскопии, который позволил оценить характер взаимодействия фуллеренов с соответствующими матрицами. Поскольку фуллерены в химических реакциях чаще исполняют роль акцепторов электронов (Новоженов В.А., 1999), то эффективность межмолекулярного взаимодействия, вероятно, зависела от наличия и количества электронодонорных групп в матричной молекуле. Таким образом, при достижении кривой растворимости определенной точки, характеризующей максимальное содержание фуллеренов, вероятно, происходило насыщение всех возможных реакционных центров матрицы. Анализ ИК спектров поглощения исследуемых соединений выявил возникновение донорно - акцепторных взаимодействий между фуллеренами и матричными молекулами.

Первым шагом в биологическом исследовании любого химического соединения является, как известно, определение его токсичности в отношении объекта исследования. В качестве наиболее простого и информативного способа для оценки токсичности нами был выбран гемолитический тест (Yamakoshi Y.N. et al., 1994 - 1997). Исследование проводили путем непосредственной обработки клеток крови человека 0 группы исследуемыми соединениями. По уровню гемолитической активности исследуемые производные фуллеренов расположились следующим образом: CPVP«CTw=CCph. Имеющиеся литературные данные также свидетельствовали о низкой гемо-токсичности производного соединения CPVP (Yamakoshi Y.N. et al., 1994 -1997). В результате сравнительного изучения производных фуллеренов и соответствующих матриц нами было установлено, что фуллерены снижали цитотоксичность исходных матричных соединений (р<0,05). Обнаруженная закономерность оказалась справедливой и в отношении клеточных линий MDCK и НЕр 2, что было подтверждено с помощью гистологических и электронно-микроскопических методов исследования монослоев клеток после инкубирования их в присутствии исследуемых соединений. Линия клеток MDCK оказалась чувствительной к обработке производными фуллеренов и соответствующими матрицами. Данные электронной микроскопии показали, что обработка клеток MDCK растворами кефалинов и твина 20, приводила не только к разрушению межклеточных связей, но и вызывала сильные повреждения клеток. В подтверждение результатов гемолитического теста, фуллерены снижали исходную токсичность соответствующих молекулярных матриц, используемых в синтезе производных. Очевидно, что производные обладали различной цитотоксичностью в зависимости от химической природы молекулярной матрицы. Поскольку токсическое действие CCph и CTw на клетки MDCK проявлялось даже в низких концентрациях (10 мкг/мл), а также, учитывая невысокое содержание фуллеренов в составе производных, мы сочли нецелесообразным проводить дальнейшие исследования их биологической активности на моделях, в которых использована линия клеток MDCK. Исходя из этого, для изучения антивирусной активности с использованием культуры MDCK наибольший интерес для нас представлял CPVP, обладающий наименьшей токсичностью для этой линии клеток, и PVP, используемый для сравнительного анализа.

Поскольку мы предположили, что чувствительность клеток различных культур к химиопрепаратам может быть не одинаковой, то целесообразно было проверить ЦТД производных фуллеренов и соответствующих матриц на каждой культуре и определить их МПК для линии клеток НЕр 2. Культура клеток НЕр 2 оказалась более устойчивой к воздействию исследуемых соединений в сравнении с клеточной линией MDCK. МПК производных CCph и CTw для этой модели составляла 200 мкг/мл, а МПК матриц - 100 мкг/мл.

Очевидно, что цитотоксичность производных фуллеренов была напрямую связана с химической природой соответствующих матриц, являющихся ПАВ, способными модифицировать (или даже повреждать) клеточные мембраны (Геннис Р., 1997). При этом, как и в вышеописанных исследованиях, растворы дериватов фуллеренов были менее цитотоксичны для клеток НЕр 2, чем исходные матрицы в тех же концентрациях. По-видимому, происхождение соматических клеток также могло оказывать влияние на фенотипическую экспрессию их чувствительности к дериватам фуллеренов и соответствующим матрицам.

Одним из объектов исследования также являлась бактериальная культура Е. coli С. Для изучения влияния производных CPVP, CCph и CTw на бактериальные клетки мы сочли целесообразным изучить физиологию процесса роста периодической бактериальной культуры в присутствии исследуемых соединений. Сравнительный анализ показал, что влияние производных фуллеренов и соответствующих матриц проявлялось не одинаково. Было выявлено, что фуллерены в составе исследуемых водорастворимых производных изменяли эффект влияния, оказываемого на процесс роста периодической бактериальной культуры Е. coli С в сторону увеличения средней скорости деления, в случае CPVP, CCph и CTw. В высоких концентрациях CCph снижал скорость деления бактериальной культуры относительно аналогичного показателя в присутствии кефалинов. Эффект, вызываемый более высокими концентрациями изучаемых производных фуллеренов и соответствующих матриц на поверхностные структуры бактериальных клеток, был исследован с помощью методов электронной микроскопии. По степени снижения цитотоксич-ности исследуемые вещества распределились в следующем порядке: твин 20>CTw>кeфaлины>PVP>CCph>CPVP:=кoнтpoль. Было установлено, что твин 20 и кефалины, являясь ПАВ, воздействовали именно на наружные слои клеток, что, вероятно, приводило к нарушению избирательной проницаемости плазматической мембраны и понижению внутриклеточного осмотического давления - наблюдалось сморщивание клеток. Следует отметить, что в изученном интервале концентраций исследуемые производные фуллеренов не оказывали бактерицидного действия на культуру Е. coll С. Увеличение же концентрации до 5000 мкг/мл выявило сильный цитотоксический эффект твина 20 и CTw.

Таким образом, при исследовании токсических свойств синтезированных производных фуллеренов выявлено, что фуллерены в составе производных обладают защитным эффектом на клетки, т.к. было показано значительное снижение исходной токсичности молекулярных матриц, использованных в синтезе. Эта тенденция была выявлена и подтверждена в результате цитотоксиче-ских исследований, проведенных на моделях соматических и бактериальных клеток. Во всех случаях наименее токсичным оказалось CPVP. Исследуемые соединения фуллеренов по уровню токсичности распределились в следующем порядке: CPVP«CCph<CTw. В результате проведенных экспериментов были определены рабочие интервалы концентраций исследуемых соединений, которые мы использовали для дальнейшего изучения биологической активности в системе вирус - клетка.

Определение вирулицидного действия производных фуллеренов проводили путем непосредственной обработки вирусной суспензии действующими веществами. Оценку воздействия производных на РНК-содержащие оболочечные вирусы гриппа осуществляли с помощью метода электронной микроскопии. Данные электронной микроскопии выявили, что наибольшие деформационные изменения поверхности вирионов гриппа А были вызваны присутствием твина 20, кефалинов и PYP. Действие CTw на вирусные частицы было сравнимо с эффектом соответствующей матрицы. В свою очередь, CCph и CPVP практически не проявляли деформирующего действия на вирионы.

С учетом вышеописанных данных была изучена способность вирусов гриппа А репродуцироваться в культуре клеток ХАО после предварительного инкубирования вирусной суспензии в присутствии производного CPVP и соответствующей матрицы. В результате нами выявлена антивирусная активность исследуемого CPVP. В качестве препарата сравнения использовали ремантадина гидрохлорид в концентрации 25 мкг/мл. Репродукция вируса гриппа А/Виктория/35/72 (H3N2) в клетках ХАО в присутствии CPVP (2600 мкг/мл) снижалась на 42% в сравнении с аналогичным показателем в контроле. Снижение концентрации исследуемого соединения соответственно уменьшало эффективность его антивирусного действия. В то же время присутствие в среде PVP (1500 мкг/мл) не оказывало влияния на вирусную репродукцию. Ремантадин (25 мкг/мл) в тех же условиях снижал репродукцию вируса гриппа на 69,2 %. Таким образом, установлено наличие антивирусной активности у производного CPVP и отсутствие таковой у PVP. Аналогичные данные приведены в работах (Kiselev O.I. et al., 1998; Пиотровский JI.Б. и соавт., 2001), касающихся антивирусной эффективности производного соединения фуллеренов CPVP в отношении вирусов гриппа А. При этом указывалось, что уровень антивирусной активности CPVP соответствовал активности ремантадина, однако достигался при значительно больших концентрациях.

Исходя из этого, можно сделать вывод, что именно фуллерены придают деривату CPVP свойства антивирусного препарата. Этим же можно объяснить и нивелирование антивирусной активности производного CPVP при их разбавлении стандартной средой. В составе CPVP," как уже указывалось выше, содержалось 0,63% фуллеренов, поэтому при сравнительно высокой концентрации

CPVP, равной 160 мкг/мл, ингибирования репродукции вируса не происходило, т.к. концентрация фуллеренов составляла только -1,0 мкг/мл. Растворы CPVP с концентрацией 2600 мкг/мл содержали -16,5 мкг/мл фуллеренов. Учитывая все вышесказанное, можно предположить, что эффективность действия фуллеренов действительно была соизмерима с эффективностью противовирусного препарата - ремантадина. Принимая во внимание факт, что электронная микроскопия показала отсутствие деформирующего действия CPVP на вирионы гриппа А, и в то же время было обнаружено ингибирование процесса репродукции обработанных CPVP вирусных частиц в клетках ХАО, можно заключить, что действие производных фуллеренов направлено, в первую очередь, на клеточную поверхность.

К такому же выводу мы пришли, изучая вирулицидный эффект производных фуллеренов в отношении РНК - содержащих безоболочечных вирусов полиомиелита и бактериофага Е. coli f 52. Непосредственное воздействие производных на вирусную суспензию не оказывало ингибирующего действия на инфекционную способность этих вирусов.

С целью оценки эффективности исследуемых производных в системе вирус-клетка был изучен процесс репродукции РНК-содержащего оболочечного вируса гриппа А/Виктория/3 5/72 (H3N2) в монослойной культуре клеток MDCK. Ингибирующее действие оценивали с помощью РГА. Установлено, что CPVP в высоких концентрациях (в пересчете на фуллерены -16,5 мкг/мл) способен снижать репродукцию вируса гриппа А на 87,5 % (р<0,05) при заражении дозой вируса 100 ид50, что было сравнимо с действием антивирусного препарата ремантадина (25 мкг/мл) в тех же условиях. Уменьшение концентрации действующего вещества приводило к уменьшению эффективности ингибирования процесса вирусной репродукции. Дополнительное подтверждение наличия антивирусной активности CPVP в отношении вируса гриппа А было получено с помощью методов ИФА. В присутствии CPVP (2600 мкг/мл, в пересчете на фуллерены -16,5 мкг/мл) синтез вирусного нуклеопротеидного антигена снижался на 52% (р<0,05) при инокуляции 100 ИД5о вируса гриппа. Ремантадин в аналогичных условиях угнетал синтез нуклеопротеидного антигена на 59,4% (р<0,05) относительно аналогичного контрольного показателя.

Таким образом, присутствие производного CPVP в культуральной среде достаточно эффективно ингибировало процесс вирусной репродукции. Это положение подтверждалось опубликованными данными, свидетельствующими о тотальном блокировании процесса вирусного размножения. При этом важной для химиотерапии особенностью фуллеренов являлось то, что антивирусное действие их производных носило клеточно-зависимый специализированный характер и относилось к определенным мембранозависи-мым стадиям инфекционного цикла. Предполагалось, что амфифильный характер водорастворимых производных фуллеренов позволяет им встраиваться в мембрану клетки-хозяина (Kotelnikova R.A. et al., 1996) и, тем самым, вмешиваться в связанные с мембраной этапы репродукции вируса.

Поскольку, как было указано выше, производные CPVP, CCph и CTw не влияли на инфекционность безоболочечных вирусов при непосредственной обработке внеклеточных вирионов, мы оценивали их влияние на протекание начальных этапов инфекционного процесса на модели системы вирус полиомиелита Р 712, ch2ab (II) - клетки НЕр 2. Исследуемые соединения были введены в систему вирус-клетка на определенных этапах взаимодействия компонентов: а) до инфицирования монослоя; б) после адсорбции вируса на клетках. Монослой заражали дозой 100 ТЦД50 полиовируса. Показано, что предварительная обработка клеточного монослоя снижала адсорбционную способность мембран НЕр 2. Присутствие CPVP в культуральной среде в высоких концентрациях (в пересчете на фуллерены -33,1 - 8,3 мкг/мл) эффективно защищало монослой от проникновения вируса (не наблюдалось ЦПД, характерного для полиомиелита). Уменьшение его концентрации (в пересчете на фуллерены до ~ 2,0 - 1,0 мкг/мл) приводило к снижению эффективности на

50%, а дальнейшее уменьшение - к нивелированию защищающего эффекта CPVP. Более эффективным в сравнении с CPVP оказалось производное соединение CCph. Антивирусный эффект этого соединения проявлялся в концентрациях 200 - 100 мкг/мл (в пересчете на фуллерены 1,7 - 0,8 мкг/мл). Интересные результаты показала предварительная обработка монослоя НЕр 2 растворами CTw. В концентрации 200 мкг/мл (в пересчете на фуллерены 0,5 мкг/мл) CTw полностью блокировал адсорбцию полиовируса на поверхности клеток НЕр 2. Очевидно, не только концентрация фуллеренов, но и форма их модификации (в данном случае природа бифильных матричных молекул) играли роль в определении антивирусной эффективности производных фуллеренов. Здесь же следует указать, что предварительная обработка монослоев НЕр 2 растворами исходных матриц во всем диапазоне исследованных концентраций не приводила к блокированию вирусной репродукции.

Экспериментально была обнаружена антивирусная эффективность изучаемых производных фуллеренов в отношении адсорбированного клеточными рецепторами вируса полиомиелита. Показано, что в присутствии CPVP (в пересчете на фуллерены 33,1 мкг/мл) адсорбированный полиовирус полностью терял инфекционную способность. Понижение концентрации действующего вещества в 2-4 раза снижало эффективность обработки до 50%.

Установлено, что производное соединение CCph ингибировало репродукцию адсорбированного на мембранах полиовируса только в концентрации 100 мкг/мл (в пересчете на фуллерены ~0,8 мкг/мл), a CTw - в диапазоне концентраций 200 - 50 мкг/мл (в пересчете на фуллерены ~0,5 - 0,1 мкг/мл). Очевидно, что по эффективности антивирусного действия исследуемые производные фуллеренов различаются между собой. При этом CCph было более эффективно в качестве своеобразного «профилактического» препарата, т.е. максимальный ингибирующий эффект проявлялся при обработке монослоя НЕр 2 до инокуляции полиовируса, a CTw оказался более эффективным при ингибировании репродукции уже адсорбированных на клеточной поверхности вирусных частиц.

Более подробно исследовать воздействие изучаемых производных фуллеренов на репликативный цикл РНК-содержащих безоболочечных вирусов представилось возможным на модели системы фаг - бактерия, которая является для этих целей наиболее простой и удобной. Нами исследованы три показателя, имеющие значение для описания инфекционного процесса - адсорбция, длительность латентного периода и урожай вирусных частиц. Независимо от присутствия производных фуллеренов и соответствующих матриц количество адсорбированного на клетках Е. coli С бактериофага превышало 99,0%. При этом фуллерены уменьшали эффективность адсорбции фага, наблюдаемую в присутствии PVP и твина 20. Показано, что по эффекту ускорения темпов адсорбции производные фуллеренов распределялись следующим образом: CPVP>CTw (p=0,01)>CCph (р=0,01).

Общим положением для всех производных фуллеренов и соответствующих матриц являлось то, что в их присутствии в концентрации 1 ООО мкг/мл наблюдалось уменьшение интервала времени, в течение которого происходила максимальная адсорбция фага на клетках Е. coli С, т.е. происходило увеличение скорости адсорбции. В то же время, дальнейшее увеличение концентрации этих производных фуллеренов в системе фаг - бактерии сопровождалось уменьшением скорости адсорбции бактериофага на клетках в 1,6 раз (р=0,02) в присутствии CPVP, в 1,3 раза (р=0,02) в присутствии CCph и в 1,2 раза (р=0,03) в присутствии CTw. Аналогичная зависимость в системе фаг-бактерии имела место и при увеличении концентрации матриц твина 20 и PVP.

Факт замедления процесса адсорбции, вероятно, может быть объяснен двумя причинами. Во-первых, увеличение концентрации действующих веществ приводило к увеличению плотности среды, что затрудняло броуновское движение фаговых частиц. Во-вторых, за счет адсорбции на поверхности клеток исследуемых производных фуллеренов могло происходить изменение заряда клеточной поверхности и (или) экранирование вирусных и клеточных рецепторов, что также могло препятствовать адсорбции бактериофага. Существенно, что в присутствии кефалинов наблюдалась обратная тенденция. Увеличение концентрации этого компонента в системе фаг - бактерия приводило к достоверному увеличению скорости адсорбции в 5 раз. Здесь следовало учитывать химическую природу кефалинов, а также высокое содержание фосфолипидов в наружной мембране Е. coll С. Прикрепляясь к поверхностным структурам клеток, кефалины могли модифицировать рецеп-торный аппарат клеточной поверхности, что, вероятно, и являлось основной причиной ускорения процесса адсорбции.

Для выяснения влияния производных и соответствующих матриц на процессы внутриклеточного развития вируса, исследуемые соединения вводились в систему фаг - бактерия после адсорбции фаговых частиц на клетках. Было обнаружено увеличение длительности латентного периода в присутствии производных CPVP (1000 и 5000 мкг/мл) и CCph (5000 мкг/мл), а также PVP (5000 мкг/мл). В присутствии остальных действующих веществ наблюдалось уменьшение длительности периода внутриклеточного развития бактериофага. Наиболее эффективное ингибирование репродукции фаговых частиц наблюдалось в присутствии производного CCph (5000 мкг/мл, в пересчете на фуллерены 42,5 мкг/мл). При этом количество вновь синтезированных вирионов было на порядок меньше, чем в контроле. При анализе полученных результатов было выявлено, что уменьшение длительности латентного периода, вызванное действием исследуемых соединений, достоверно коррелировало с увеличением количества вновь синтезированных фаговых частиц. Это могло означать, что в данных условиях происходило усиление вирусспецифи-ческих биосинтетических процессов в зараженных фагом клетках Е. coli С. И, наоборот, увеличение продолжительности латентного периода достоверно коррелировало с относительно невысоким урожаем вирионов бактериофага. Важно отметить, что в исследованиях, проведенных на модели бактериофаг - бактерии

152 также, как и в исследованиях с использованием модели полиовирус - клетки НЕр 2 наиболее эффективным антивирусным препаратом в отношении РНК-содержащих безоболочечных вирусов оказалось производное фуллеренов CCph. Так, в его присутствии наблюдался не только максимальный латентный период фага f 52, но и минимальный выход вновь синтезированных вирионов.

Таким образом, нами показано, что производные фуллеренов способны проявлять антивирусную активность преимущественно в системе вирус - клетка-хозяин как в отношении РНК-содержащих оболочечных вирусов, так и в отношении РНК-содержащих вирусов, не имеющих оболочки.

Особого внимания, по нашему мнению, заслуживала в целом безопасная для жизнедеятельности клеток модификация клеточной поверхности исследованными дериватами фуллеренов, которая вызывала блокирование процессов проникновения вирусов в клетки. Учитывая тот факт, что биологическая эффективность исследованных производных зависела не только от процентного содержания самих фуллеренов, но и от формы их химической модификации, расширение ассортимента дериватов этого класса веществ, а также проведение дальнейших исследований их свойств могут явиться одним из перспективных направлений фундаментальной и прикладной науки в разработке новых и совершенствовании имеющихся препаратов антивирусной направленности, а также в преодолении феномена химиорезистентности возбудителей вирусных заболеваний.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Максимова, Наталья Сергеевна, Санкт-Петербург

1. Авцын А.П., Шахламов В.А. Ультраструктурные основы цитологии клетки М.: Медицина, 1994. - 320 с.

2. Агол В.И. Биосинтез вирусных нуклеиновых кислот //Молекулярная биология. Структура и биосинтез нуклеиновых кислот /Под ред. А.С Спирина. М.: Высш. шк., 1990. - С. 260 - 333.

3. Агол В.И. Генетические детерминанты нейровирулентности и аттенуации вируса полиомиелита //Молек. генетика, микробиология и вирусология. -1988. № 1.-С.З-9.

4. Агол В.И. "Помехоустойчивость" вирусов //СОЖ. 1999. - №2. - С. 5257.

5. Агол В.И. Разнообразие вирусов //СОЖ. 2000. - № 12 - С. 34 - 46.

6. Адаме М. Бактериофаги: Пер. с англ. М.: Изд. иностранной литературы, 1964.-527с.

7. Альберте Б., Брей Д., Льюис Дж. Молекулярная биология клетки. В 3 т. Т.1.: Пер. с англ. М.: Мир, 1994. - 2-е изд.-517 с.

8. Анджапаридзе О.Г., Гаврилов В.И., Семенов Б.Ф., Степанова Л.Г. Культура ткани в вирусологических исследованиях. М.: Гос. изд. мед. литературы, 1962. -235 с.

9. Анисимова Э., Воркунова Н.К., Вонка В., Букринская А.Г. Проникновение вируса гриппа в клетки перевиваемой линии клеток почек собаки //Цитология. 1984. - Т.24. - С. 316 - 318.

10. Ансова М.Г., Бонев М.Н., Данилов В.И. Роль чувствительных бактерий в определении числа бляшкообразующих единиц методом агаровых слоев. -Дубна: ОИЯИ, 1985. 6 с.

11. Атлас вирусной цитопатологии /Под ред. Жданова В.М. М.: Медицина, 1975.- 260 с.

12. Баранов А.А., Есипова Н.Г. Исследование возможности биосовместимости фуллерена С60 с олигопептидами с помощью сравнительного анализа их пространственной формы //Биофизика. 2000. - т.45, №5. - С. 801 - 808.

13. Бахов В.И., Майчук Ю.Ф., Корнев А.В. Механизмы защиты организма от вирусной инфекции: вирусные инфекции и иммунитет //Успехи современной биологии. 1999. - т.119, №5. - С. 428 - 439.

14. Бореко Е.И., Павлова Н.И., Вотяков В.И. Изменение чувствительности вируса гриппа, размножившегося в присутствии ремантадина, к противовирусным препаратам //Вопросы вирусологии. 1999. - т.44, №3.- С. 115 -119.

15. Бородин Е.А., Арчаков А.И., Лопухин Ю.М. Теоретическое обоснование использования ненасыщенных фосфолипидов для восстановления структуры и функций поврежденных биологических мембран //Вестник АМН СССР. 1985. - №3. - С. 84 - 90.

16. Боценовский В.А., Барышников А.Ю. Молекулы клеточной адгезии человека // Успехи совр. биологии. 1994.- т.114, вып.6.- С. 741 - 753.

17. Бубович В.И., Рязанцева Г.М., Индулен М.К. Стадии проникновения и раздевания вируса гриппа как объект воздействия ингибиторов //Изв. Латв. ССР,- 1986.- №11.- С. 52-59.

18. Букринская А.Г. Вирусология. М.: Медицина, 1986 - 336 с.

19. Букринская А.Г., Жданов В.М. Молекулярные основы патогенности вирусов. М.: Медицина, 1991.-256 с.

20. Букринская А.Г., Корнилаева Г.В., Слепушкин В.А. Ганглиозиды специфические рецепторы для вируса гриппа //Вопросы вирусологии.-1982. -т.27, №6. - С. 21-26.

21. Букринская А.Г., Шарова Н.К. Проникновение вируса гриппа в клетку //Вопросы вирусологии. 1984. - т.29, №3. - С. 260 - 264.

22. Быков В.Л. Цитология и общая гистология. С-Пб.: "Сотис", 1999. - 520 с.

23. Варганов С.А. Неэмпирические расчеты эндоэкзоэдральных комплексов фуллерена С60 с ионом Li+ и эндоэдрального комплекса С60 с димером Li2

24. ФТТ. 2000. - т.42, вып.2.- С. 378 - 382.

25. Вирусология. Методы: Пер с англ. /Под ред. Б. Мейхи. М.: Мир, 1988. -344 с.

26. Вирусология: В Зт. Т.2. : Пер. с англ. /Под ред. Б. Филдса, Д. Найпа. М.: Мир, 1989. -496 с.

27. Вирусы гриппа и грипп /Под ред. И.Г. Харитоненкова, Э.Д. Климова, Н.В. Каверина. М.: Медицина, 1978. - 585 с.

28. Владимиров Ю.А. Роль нарушений свойств липидного слоя мембран в развитии патологических процессов //Патол. физиология и эксперим. терапия. 1989.-№4. - С. 7 - 19.

29. Гаврилов В.И. Перевиваемые клетки в вирусологии. М.: Медицина, 1964.-267 с.

30. Геннис Р. Биомембраны. Молекулярная структура и функции. М.: Мир., 1997.- 624 с.

31. Голубев Д.Б., Соминина А.А., Медведева М.Н. Руководство по применению клеточных культур в вирусологии. Л.: Медицина, 1976. - 224с.

32. Гольдфарб Д.М. Бактериофагия. /Под ред. В.Д. Тимакова- М.: Медгиз, 1961.-297с.

33. Гордиенко А.Д. Фармакологические и биохимические эффекты ненасыщенных фосфолипидов //Фармакология и токсикология. 1990. - т.53, №5. -С. 78-81.

34. Давыдов В.Я., Хохлова Т.Д. Адсорбция белков и красителей на кремнеземе с иммобилизованным фуллереном С60 //Журнал физической химии. -2000. т.74, №7. - С. 1292 - 1297.

35. Деева Э.Г. Сравнительный анализ противогриппозной активности соединений ряда азоло-азинов, флуоренов и акридонов: Дис. канд. мед. наук: 03.06.00 /НИИ гриппа РАМН, С-Пб., 2000. 150 с.

36. Досон Р., Элиот Д., Элиот У., Джонс К. Справочник биохимика: Пер. с англ. /Под ред. В.Л. Друцы, О.Н. Королевой. М.: Мир, 1991. - 554 с.

37. Елецкий А.В., Смирнов Б.М. Фуллерены и структуры углерода //Успехи физических наук. 1995. - т. 165, № 9. - С. 976 - 1009.

38. Елецкий А.В., Смирнов Б.М. Фуллерены //УФН.- 1993.- т. 163, № 2.- С. 33 -59.

39. Ершов Ф.И. Антивирусные препараты: Справочник. М.: Медицина, 1998.- 192 с.

40. Жавненко В.М., Науменков В.И., Алешкевич В.Н. Практикум по вирусологии. Минск: Изд. «Дизайн ПРО», 1998. - 160 с.

41. Жирнов О.П., Конакова Т.Е., Garten W., Klenk H.D. Характеристика про-теолитического нарезания нуклеокапсидного белка NP вирусов гриппа в зараженных клетках //Вопр. вирусологии. 1999. - №5. - С. 275 - 279.

42. Зайдес В.М., Жданов В.М. Взаимодействие вирусных частиц и продуктов их репликации с плазматическими мембранами зараженных клеток. Новые подходы к химиотерапии вирусных инфекций //Вопросы вирусологии. -1981. №4. - С. 388-393.

43. Калпыня В.А., Фельдблюм P.JL, Индулен М.К. Устойчивость вирусов к химиопрепаратам. Рига: Зинатне, 1984. - 160 с.

44. Каплун А.П., Ле Банг Шон, Краснопольский Ю.М., Швец В.И. Липосомы и другие наночастицы как средство доставки лекарственных веществ //Вопр. мед. химии. 1999. - № 1. - С. 3 - 11.

45. Киселев О.И., Пиотровский Л.Б., Меленевская Е.Ю., Козелецкая К.Н. Действие фуллерена С60 на различные вирусы //Тез. докл. VI Рос. нац. конгресса "Человек и лекарство". 1999. - С. 300.

46. Киселев О.И., Деева Э.Г., Слита А.В., Платонов В.Г. Антивирусные препараты для лечения гриппа и ОРЗ. Дизайн препаратов на основе полимерных носителей. С-Пб.: ИАЦ "Время", 2000. - 132 с.

47. Киселев О.И., Козелецкая К.Н., Меленевская Е.Ю., Виноградова Л.В., Пиотровский Л.Б. Антивирусная активность комплексов фуллеренов С60 с поли(Ы-винилпирролидоном) //ДАН. 1998. - 361. - С. 547 - 549.

48. Киселев О.И., Блинов В.М. Структура рецептор связывающего сайта ге-магглютинина и фибронектиноподобные участки присоединения вируса гриппа к клеткам //Генетическая инженерия иммуномодуляторов и вакцинных препаратов. - Л., 1989.- С. 10- 17.

49. Кнорре Д.Г., Мызина С.Д. Биологическая химия. М.: Высшая школа, 1998.-480 с.

50. Корнилаева Г.В., Слепушкин В.А., Букринская А.Г. Разная природа клеточных рецепторов для вирусов гриппа и парагриппа //Вопросы вирусологии. 1986. -т.31,№1,-С. 35 - 39.

51. Коротяев А.И., Бабичев С.А. Медицинская микробиология, иммунология и вирусология. С-Пб.: "Специальная литература", 1998. - 542 с.

52. Кулинский В.И. Активные формы кислорода и оксидативная модификация макромолекул: польза, вред и защита //СОЖ. 1999. - №1. - С. 2 -7.

53. Лимфоциты: Методы: Пер. с англ. /Под ред. Д. Клауса. М.: Мир, 1990. -395с.

54. Липиды, углеводы, макромолекулы, биосинтез. /Под ред. Хаслама Е. //Общая химия: В 12-ти т. T.l 1. /Под ред. Д. Бартона и У.Д. Уоллиса: Пер. с англ. /Под ред. Н.К. Кочеткова. М.: Химия, 1986. - 736с.

55. Луйк А.И., Прокопенко В.В., Танчук В.Ю., Холодович В.В., Семенюта И.В. Общие свойства фармакологических агонистов и антагонистов внеш-немембранных рецепторов //Вопросы мед. химии. 1 999. - т.45, №6. - С.514.524.

56. Лурия С., Дарнелл Дж., Балтимор Д., Кэмпбелл Э. Общая вирусология: Пер с англ. /Под ред. Ю.З. Гендона. М.: Мир, 1981. - 680 с.

57. Мальцев В.Н., Стрельников В.А., Федоровский Л.П. Влияние поливинилпирролидона на микробные клетки //Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 1987. - №4. - С. 9 - 11.

58. Маркушин С.Г., Гинзбург В.П., Хайдер A.M., Ярош В.В., Ивасько Е.А., Климов А.И. Факторы, вызывающие изменения антигенной структуры ге-магглютинина вируса гриппа. //Вопр. вирусологии. 1992. - 37. - № 4. - С. 196- 199.

59. Масалова О.В. Иммуностимулирующее действие водорастворимых производных фуллеренов перспективных адъювантов вакцин нового поколения //Доклады РАН.- 1999.- т.369, №3.- С. 411 - 413.

60. Мастеров В.Д. Физические свойства фуллеренов //СОЖ. 1997. - №1. -С. 92 - 97.

61. Машковский М.Д. Лекарственные средства: В 2-х т. Т.2. Харьков: Тор-синг, 1998.-592 с.

62. Медведева М.Н., Петров Н.А. Характеристика гемагглютинина перси-стентных вариантов вируса гриппа А/Виктория/3 5/72/H3N2 //Вопросы вирусологии. 1990. - т.35, №5. - С. 374 - 376.

63. Мейнел Дж., Мейнел Э. Экспериментальная микробиология: Пер. с англ. М.: Мир, 1967.-347 с.

64. Методы общей бактериологии: Пер. с англ. /Под ред. Ф. Герхардта. М.: Мир, 1983. - 536 с.

65. Наканиси К. Инфракрасные спектры и стороение органических соединений: Пер. с англ. / Под ред. А.А. Мальцева. М.: Мир, 1965.- 210 с.

66. Никитина Л.Е., Носков Ф.С. Методические аспекты изучения химиопре-паратов на модели экспериментальной гриппозной инфекции //Вопр. вирусологии. 1987. - т.32, №5. - С. 579 - 582.

67. Новоженов В.А. Введение в неорганическую химию. Ч. 2 Барнаул: Изд. АТУ. - 1999. -300с.

68. Новые подходы к химиотерапии вирусных инфекций /Под ред. Р.А. Ку-кайн. Рига: Зинатне, 1991. - 190с.

69. Оборотова Н.А., Шпрах З.С., Багирова B.JI. Разработка инъекционных лекарственных форм цитостатиков с использованием поливинилпирролидона //Хим. фарм. журнал. - 2000. - т.35, №5. - с. 39 - 43.

70. Пехов А.П. Электромикроскопическое исследование бактерий и фагов (субмикроскопическая анатомия). М.: Гос. Изд. Мед. Лит., 1962. - 222 с.

71. Пиотровский Л.Б., Козелецкая К.Н., Киселев О.И. и др. Влияние комплексов фуллерена С60 с поливинилпирролидоном на репродукцию вирусов гриппа//Вопр. вирусологии. 2001. - №2. - С. 38 -41.

72. Покровский В.И., Онищенко Г.Г., Черкасский Б.Л. Современные представления об инфекционной патологии и основные направления совершенствования стратегии ее профилактики //Вестник РАМН. 2000. - № 1. - С. 3-7.

73. Пономарев А.Н. О некоторых особенностях анализа растворов фуллеренов С60 и С70 по их спектрам поглощения //Оптика и спектроскопия. -2000. т.88, № 2. - С. 230 - 232.

74. Пухова Я.И, Чурилов Г.Н., Исакова В.Г., Корец А.Я., Титаренко Я.Н. Исследование биологической активности водорастворимых комплексов фуллеренов //ДАН. 1997. - 355(2). - С. 269 - 272.

75. Рецепторы клеточных мембран для лекарств и гормонов: Междисциплинарный подход: Пер. с англ. /Под ред. Р.У. Штрауба, Л. Болис. М.: Медицина, 1983.-368 с.

76. Самуилов В.Д. Иммуноферментный анализ //СОЖ. 1999. - №12. - С. 9 -15.

77. Соколов В.И. Проблема фуллеренов: химический аспект //Известия АН, серия химическая. 1993. - т. 1. - С. 10-11.

78. Соколов Н.И., Синицкий А.А., Ремезов П.И. Вирусологические и серологические исследования при вирусных инфекциях. Л.: Медицина, 1972. -215 с.

79. Спицына Н.Г. Синтез, структура и спектральные исследования молекулярного комплекса 60. фуллерена с хлоротрифенилфосфин золотом С60 ' 2[Ph3AuCl] //Известия РАН, серия химическая. 2000. - № 2. - С. 365 -368.

80. Тананова Г.В., Кушнарева М.В., Светлов С.И. Влияние фосфолипидов на адгезивные свойства бактерий //Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 1992. - №5/6. - С. 4 - 7.

81. Федоров А.Н., Карадаги С. Эль, Русяев В.А. Исследование молекулярного механизма противовирусного действия 2-(Г-аминоэтил)бицикло(2,2,1) геп-тангидрохлорида //Вопросы вирусологии. 1988. - т.ЗЗ, №4. - С. 403 - 407.

82. Хэм А., Кормак Д. Гистология: Пер. с англ. М.: Мир, 1982. - Т.1.- 272 с.

83. Чекнев С.Б. Активные метаболиты кислорода в обеспечении и контроле естественных цитотоксических реакций //Вестник РАМН. 1999. - № 2. -С. 11-15.

84. Четверикова Л.К., Иноземцева Л.И. Роль липопероксидации в патогенезе гриппозной инфекции и поиск средств противовирусной защиты //Вестник РАМН. 1996. - №3. - С. 37-40.

85. Чижов Н.П., Ершов Ф.И., Индулен М.К. Основы экспериментальной химиотерапии вирусных инфекций. Рига: Зинатне, 1988. - 171 с.

86. Чизмаджев Ю.А. Мембранная биология: от липидных бислоев до молекулярных машин //СОЖ. 2000. - т.6. - №8. - С. 12 - 17.

87. Шепелев А.П., Корниенко И.В., Шестопалов А.В., Антипов А.Ю. Роль процессов свободно-радикального окисления в патогенезе инфекционных болезней //Вопр. мед. химии. 2000. - т.46, № 2. - С. 110 - 116.

88. Шлегель Г. Общая микробиология /Под ред. Е.К. Кондратьевой М.: Мир, 1987.-556 с.

89. Юркевич A.M., Швец В.И. Пути создания нового поколения лекарственных и биохимических препаратов с использованием лиганд рецепторных взаимодействий для активного мембранного транспорта //Вестник РАМН.1999.-№3.-С. 3-7.

90. Agol V.I., Pilipenko Е.У., Slobodskaya O.R. Modification of translational control elements as a new approach to design of attenuated picornavirus strain. //J. Biotech. 1996. - Vol. 44. - P. 119 - 128.

91. Andrievsky G.V., Klochkov V.K. Roslyakov A.D., Platov A.Yu. Aqueous solutions of fullerenes as prototypes of new class of medical products //Abstracts of IWFAC. 1997. - P. 262.

92. Andrievsky G.V., Kosevich M.V., Vovk O.M., Shelkovsky V.S., Vashchenko L.A. On the Production of an Aqueous Colloidal Solution of Fullerenes //J. Chem. Soc., Chem. Commun. 1995. - Vol. 12. - P. 1281.

93. Andrievsky G.V., Kosevich M.V., Vovk O.M., Shelkovsky V.S., Vashchenko L.A. On the production of an aqueous colloidal solution of fullerenes //J. Chem. Soc., Chem. Commun. 1995. - Vol.12. - P. 1281.

94. Andrievsky G.V., Malaya L.T., Klochkov V.K., Kuligina V. P. About the Nature of Fullerene Solutions in Water and in Aqueous Solutions of Aprotonic

95. Polymers //Abstract of IWFAC. 1995. - P. 152.

96. Andrievsky G.V., Roslyakov A.D., Gorbach T.V., Klochkov V.K. New date on biological actions of aqueous solutions of fullerenes as prototypes of new class of drugs //Abstracts of IWFAC. 1997. - P. 263.

97. Andrievsky G.V., Samokhina L.M., Zhmuro A.V., Roslyakov A.D., Sukach A.N. Investigation of Biological Effects of Action of Fullerene Aqueous Solutions on Microsomes and Cells of Rat Liver //Abstract of IWFAC. 1995. - P. 172.

98. Apostol M. On the energy spectrum of the C60 fullerene anion //J. Theor. Phis. 1995.-№8.-p. 1-6.

99. Arsardi D.C., Porter D.C., Morrow C.D. Coinfection with recombinant vaccine viruses expressing poliovirus PI and P3 proteins results in polyprotein processing and formation empty capsid structures //J. Virol. 1991. - 65(4). - P. 2088 -2092.

100. Azad R.F., Brown-Driver V. Antiviral activity of a phosphorothioate oligonucleotide complementary to human cytomegalovirus RNA when used in combination with antiviral nucleoside analogs //Antiviral. Res.- 1995. 28(2).- P. 101 -111.

101. Bonnafous P., Stegmann T. Membrane perturbation and fusion pore formation in influenza hemmaglutinin-mediated membrane fusion. A new model for fusion //J. Biol. Chem. 2000. - 275(9). - P. 6160 - 6166.

102. Cagle D.W., Alford M., Tien J., Wilson L.J. Gadolinium-containing fullerenes for MRI contrast agent applications //Electrochem. Sol. Proc. 1997. Vol. 97(14).-P. 361 -368.

103. Chen B.X., Wilson S.R., Das M., Coughlin D.J., Erlanger B.F. Antigenicity of fullerenes: antibodies specific for fullerenes and they characteristics //Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1998. -95(18). - P. 10809 - 10813.

104. Chiang L.Y., Lu F. J., Lin J. - T. Free - Radical Scavenging Activity of Water - Soluble Fullerenols //J. Chem. Soc., Chem. Commun. - 1995. - P. 1283

105. Crute J.J. Inhibition of herpes simplex virus type I helicase primase by (di-chloroanilino) purines and pyrimidines //J. Med. Chem. - 1995. - 38(10). - P. 1820- 1825.

106. Electron Microscopy of Proteins. Vol.5. Viral Structure /Edited by Harris J.R., Home R.W.- London etc.: Acad. Press, 1986. 452 p.

107. Emini E.A. Resistance to anti-human immunodeficiency virus therapeutic agents //Adv. Exp. Med. Biology.-l995.-390.- P. 187-195.

108. Friedman S.H., Ganapathi P. S., Rubin Y., Kenyon G.L. Optimizing the binding of fullerene inhibitors of the HIV-1 protease thought predicted increases in hydrophobic desolvation //J. Med. Chem. 1998. - 41(13). - P. 2424 - 2429.

109. Friedman S .M., D eCamp D .1., Sijbesma R.P., Srdanov GWudl F., Kenyon G.L. Inhibition of the HIV-1 Protease by Fullerene Derivatives: Model Building Studies and Experimental Verification //J. Am. Chem. Soc. 1993. - 115. - P. 6506 - 6509.

110. Helenius H. Unpacking the incoming influenza virus //Cell. 1992. - 69. - №4. -P. 577-578.

111. Hwang К .С., M auzerall P. P hotoinduced e lectron transport across a lipid bi-layer mediated by C70 //Nature. 1993. - 361(6408). - P. 138 - 140.

112. Irie K., Nakamura Y., Ohigashi H., Tokuyama H., Yamago S., Nakamura E. Photocytotoxicity of water soluble Fullerene Derivatives //Biosci. - Biotechnol. - Biochem. - 1996. - 60 (8). - P. 1359 - 1361.

113. Iyoda M., Sultana F., Sasaki Sh., Yoshida H. Synthesis and Properties of a Novel Redox System Containing Fullerene and p Benzoquinone. //J. Chem. Soc., Chem. Commun. - 1994. - P. 1929 - 1930.

114. Jenekhe S.A., Chen X.L. Self Assembled Aggregates of Rod-Coil Block Copolymers and Their Solubilization and Encapsulation of Fullerenes //Science. -1998.-Vol. 279.-P. 1903- 1907.

115. Jensen A.W., Wilson S.R., Schuster D.I. Biological Application of Fullerenes //Bioorg. Medical Chem. - 1996. - 4(6) - P. 767 - 779.

116. Kasermann F., Kempf C. Photodynamic inactivation of enveloped viruses by buckminsterfullerene //Antiviral. Res. 1997. - 34(1). - P. 65 - 70.

117. Kiselev O.I., Kozeletskaya K.N., Melenevskaya E. Yu., Vinogradova L.V., Zgonnik V.N., Piotrovsky L.B., Dumpis M.A. Antiviral Activity of Fullerene C60 with Poly(N-vinilpirrolidone)complex //Mol. Mat. 1998 - Vol. 11. - P. 121 - 124.

118. Kotelnikova R.A., Kotelnikov A.I., Bogdanov G.N., Romanova V.S. Mem-branotropic Properties of the Water Soluble Aminoacid and Peptide Derivatives of Fullerene C60 //FEBS Letters. 1996. - 389. - P. 111 - 114.

119. Kozeletskaya K.N., Zgonnik V.N., Vinogradova L.V., Melenevskaya E.Yu., Kever E.E., Klenin S.I., Dumpis M.A., Piotrovsky L.V., Kiselev O.I. The Antiviral Activity of Fullerene C60 //Abstract of IWFAC. 1997. - P. 270.

120. Lamparth I., Hirsch A. Water-soluble Malonic Acid Derivatives of C60 with a Defined Three dimensional Structure //J. Chem. Soc., Chem. Commun. - 1994. -P. 1727.

121. Lowe D.M. Mode of action of (R)-9-4-hydroxy-2(hydroxymetyl) butyljguanine against herpesviruses //Antimicrob. Agents Chemother. 1995. -39(8).-P. 1802- 1808.

122. Marcorin G.L., Da Ros Т., Castellano S., Stefancich G., Bonin I., Miertus S., Prato M. Design and Synthesis of Novel 60.Fullerene Derivatives as Potential HIV Aspartic Protease Inhibitors //Org. Lett. 2000. - 2(25). - P. 3955 - 3958.

123. Medveczky M. Haloanilinoderivatives of pyrimidines, purines and purine nucleoside analogs: synthesis and activity against human cytomegalovirus //J. Med. Chem. 1995.- 38(10).-P. 1811-1819.

124. Mukovsky L.A., Iakovtseni P. P., C14Lybirnov Yu.A., Stroykova G.S., Salova L.S. The Toxicological Characteristics of Fullerenes //Abstract of IWFAC. -1995.-P. 173.

125. Nelson M.A., Damman F.E., Bowden G.T., Hooser S.B., Fernando Q., Caster D.E. Effects of acute and subchronic exposure of topically applied fullerene extracts on the mouse skin //Toxicol. Ind. Health. 1993. - 9(4). - P. 623 - 630.

126. Pat. JP № 07247273 19950926, C07D-245/00, CO 1B-31/02. Fullerene derivative and its production /Matsubara Y., Yoshida Z.

127. Pat. JP № 07048302 19950221, C07C-35/22, C07B-61/00, B01J-31/02, C01B-31/02, C07C-29/50. Method for Synthesizing Fullerenol /Kitazawa K., Araki T.

128. Pat. JP № 07206760 19950808, С 07C-59/60, C01B-31/02, C07B-63/02, C07C-51/50. Production of fullerene clathrate compound /Kitazawa K., Saigo K.

129. Rajagopalan P., Wudl F., Schinazi R.F., Boudinot F.D. Pharmakokinetics of a Water-soluble Fullerenes in Rats //Antimicrob Agents - Chemopher. - 1996. -40(10).-P. 2262-2265.

130. Ruoff R.S., KadishK.M. Solubility of С 60 in Variety of Solvents//J. Phys. Chem.- 1993. 97. - P. 3397-3383.

131. Sakai A., Yamakoshi Y.N., Miyata N.A. The Effects of Fullerenes on the Initiation and Promotion stages of BALB/3T3 Cell Transformation //J. Fullerene Science & Technol. 1995. - 3(4). - P. 377 - 388.

132. Sakai A., Yamakoshi Y.N., Miyata N.A. Visible light irradiation of 60.f\illerene causes killing and initiation of transformation in BALB/3T3 cells //Fullerene Science and Technology. 1999. - 7(5). - P. 743 - 756.

133. Satoh M., Matsuo K., Kiriya H., Mashino Т., Hirobe M., Takayanagi I. Inhibitory effect of a flillerene derivative, monomalonic acid C60, on nitric oxide-dependent relaxation of aortic smooth muscle //Gen. Pharmacol. 1997. - 29(3). -P. 345 - 351.

134. Satoh M., Matsuo K., Kiriya H., Maschino Т., Nagano Т., Hirobe M., Takayanagi I. Inhibitory effects of a fullerene derivative, dimalonic acid C60, on nitric oxide-induced relaxation of rabbit aorta //Eur. J. Pharmacol. 1997. - 327 (2 -3).-P. 175-181.

135. Schinazi R.F., Sijbesma R., Srdanov G., Hill C.L., Wudl F. Synthesis and virucidal activity of a water-soluble, configurationally stable, derivatized C60 fullerene //Antimicrob Agents - Chemother. - 1993. - 37(8). - P. 1707 - 1710.

136. Schinazi R.F., Chiang L.Y., Wilson L.J., Cagle D.W., Hill G.L. Anti Human Immunodeficiency Virus Activity of Polyhy droxy fullerenes in vitro //Electro-chem. Sol. Proc. - 1997. - Vol. 97(14). - P. 357 - 360.

137. Scrivens W.A., Tour J.M., Creek K.E. Synthesis of 14C-Labeled C60, Its Suspension in Water, and Its Uptake by Human Keratinocytes //J. Am. Chem. Soc. -1994.- 116.-P. 4517-4518.

138. Sera N., Tokiwa H., Miyata N. Mutagenicity of the Fullerene C60-generated singlet oxygen dependent formation of lipid peroxides //Carcinogenesis. -1996.- 17(10).-P. 2163-2169.

139. Sijbesma R., Srdanov G., Wudl F., Castoro S.A., Wilkins Ch., Friedman S.H., Decapt D.L., Kenyon G.L. Synthesis of Fullerene Derivative for the Inhibition of HIV Enzymes. //J. Am. Chem. Soc. 1993. - 115. - P. 6510 - 6512.

140. Spence R.A., Kati W.M., Anderson K.S., Jonson K.A. Mechanism of inhibition of HIV-1 reverse transcriptase by nonnucleoside inhibitors //Science. 1995. -267(5200). - P. 988-993.

141. Staschke K.A. Molecular basis for the resistance of influenza viruses to 4-guanidino-Neu5Ac2en //Virology. 1995. - 214(2). - P. 642 - 646.

142. Steinhauer D.A., Wharton S .A. S tudies of t he m embrane fusion peptide mutants of influenza vims hemmaglutinin //J. Virology. 1995. - 69(11). - P. 6343 -6351.

143. Taylor R., Jonathan P., Harold W., Walton M. Degradation of C60 by light //Nature. 1991.-Vol. 351.-P. 277.

144. Thrash T. P., Cagle D.W., Alford M., Ehrhardt G.J., Lattimer J.C., Wilson L.J. 166Ho Mettallofullerenes: Nuclear Medicine Precursors //Electrochem. Sol. Proc. 1997. Vol. 97(14). - P. 349 - 356.

145. Tisdale M., Ellis M., KlumP K., Court S., Ford M. Inhibition of influenza virustranscription by 2'-deoxy-2'-fluoroguanosme //Antimicrob. Agents. Chemother. -1995. 39(11). - P. 2454 - 2458.

146. Tokuyama H., Yamago S., Nakamura E., Shiraki Т., Sugiura Y. Photoinduced Biochemical Activity of Fullerene Carboxylic Acid //J. Chem. Soc. 1993. -115. - P. 7918-7919.

147. Toniolo C., Bianco A., Maggini M., Scorrano G., Prato M., Marastroni M., Tomatis R., Spisani S., Palu G., Blair E.D. A Bioactive Fullerene Peptide//J. Med. Chem. 1994. - 37(26). - P. 4458 - 4462.

148. Tsai M.C, Chen Y.N., Chiang L.Y. Polyhydroxylated C60, fullerenol, a novel free radical trapper, prevented hydrogen peroxide - and cumene hydroperoxide- elicited changes in rat hippocampus in vitro //J. Pharm. Pharmacol. - 1997. -49(4).-P. 438-445.

149. Tsuchiya Т., Oguri Т., Yamakoshi Y.N., Miyata N.A. Effect of 60.Fullerene on the Chondogenesis in Mouse Embrionic Limb Bud Cell Culture System //J. Fullerene Science & Technol. 1996. - 4(5). - P. 989 - 999.

150. Tsuchiya Т., Oguri I., Yamakoshi Y.N., Miyata N. Novel harmful effect of 60.Fullerene on Mouse Embryos in vitro and in vivo //FEBS Letters. 1996. -393.-P. 139.

151. Tsuchiya Т., Yamakoshi Y.N., Miyata N.A. Novel Promoting Action of Fullerene C60 on the Chondrogenesis in Rat Embryonic Limb BUD Cell Culture System //Biochem. and Biophys. Research Commun. 1995. - Vol. 206. - №3. -P. 885-894.

152. Ueng Т.Н., Kang J. J., Wang H.W., Chiang L.Y. Suppression of microsomal cytochrome P 450 dependent monooxygenases and mitochondrial oxidative phosphorilation by fullerenol, a polyhydroxylated fullerene C60 //Toxicol. - Lett.- 1997.-93 (1).-P. 29-37.

153. Ungurenasu C., Airinei A. Highly stable C(60)/poly(vinylpyrrolidone) charge -transfer complexes afford new predictions for biological applications of underi-vatized fullerenes //J. Med. Chem. 2000. - 43(16). - P. 3186 - 3188.

154. Wang J., Badige S.G., Watson W.H., Gutsche C.D. Complexation of fullerenes with 5,5' Вiscalix5.arene (1)//J. Org. Chem. -2000. - 65(24). - P. 8 260 -8263.

155. Yamakoshi Y.N., Yagami Т., Fukuhara K., Sueyoshi S., Miyata N. Solubilization of Fullerenes into Water with Polyvinylpirrolidone Applicable to Biological Tests //J. Chem. Soc., Chem. Commun. 1994. - P. 517 - 518.

156. Yamakoshi Y.N., Yagami Т., Miyata N.A. Acridine Adduct of 60.Fullerene with Enhanced DNA-Cleaving Activity //J. Org. Chem. 1996. - 61. - P. 7236 -7237.