Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Особенности апоптоза лимфоцитов при атопической бронхиальной астме

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Особенности апоптоза лимфоцитов при атопической бронхиальной астме"

На правах рукописи

Водунон Сирил Алоде Джуниор

ОСОБЕННОСТИ АПОПТОЗА ЛИМФОЦИТОВ ПРИ АТОПИЧЕСКОЙ БРОНХИАЛЬНОЙ АСТМЕ

03.00.04 - биохимия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Казань-2008

003456612

Работа выполнена в лаборатории биохимии нуклеиновых кислот Казанского государственного университета им. В.И. Ульянова-Ленина».

Научный руководитель: доктор биологических наук,

Абрамова Зинаида Ивановна

Официальные оппоненты: доктор биологических наук,

Семенов Валерий Васильевич (заведующий кафедрой медицинской биологии и генетики Казанского медицинского университета, г.Казань)

доктор биологических наук,

Сергей Юрьевич Егоров

(профессор кафедры микробиологии Казанского

государственного университета, г. Казань)

Ведущая организация: ГОУВПО «Казанская государственная

медицинская академия»

Защита диссертации состоится «11» «декабря» 2008 года в 13 часов на заседании специализированного Диссертационного совета Д212.081.08 при Казанском государственном университете им. В. И. Ульянова-Ленина» по адресу: 420008, г. Казань, ул. Кремлевская, д. 18, главное здание, ауд. 211.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке имени Н.И. Лобачевского Казанского государственного университета.

Автореферат разослан » «_ НОЗдрЛ » 2008 г.

Ученый секретарь, д.б.н. У/07 Абрамова З.И

Актуальность работы. Апоптоз представляет собой высоко регулируемую форму программированной клеточной гибели с характерными морфологическими, биохимическими и генетическими признаками, в результате которой достигается конечная цель - смерть клетки. Механизмы регуляции апоптоза очень сложны и практически не изменились в процессе эволюции, что дает основание судить о фундаментальной биологической роли этого процесса (Варга, 2007; Манских, 2007; Григорьев, 2003; Владимирская, 2002). Апоптоз играет важную роль как в морфогенетических процессах, так и в регуляции численности клеток на протяжении всего онтогенетического развития многоклеточного организма (Варга, 2007; ЬепаЫо, 1995). Кроме того, он защищает организм от персистенции поврежденных и цитотоксических клеток, которые могут оказаться потенциально опасными для организма (Варга, 2007).

Исследование молекулярных механизмов апоптоза клеток стало в последние годы одной из самых трудных и актуальных проблем медико-биологических наук. До сих пор, не до конца выяснены пути регуляции апоптоза отдельных клеток в целостном многоклеточном организме. Актуальность проблемы заключается и в том, что возникновение самой патологии связывают с нарушением процесса программированной клеточной гибели (Москалева, Северин, 2006; Белушкина, Белецкий, 2004; Бгаззатто, 1998; Рыжов, Ьеуте, 1994). Что особо важно, возникновение тяжелых заболеваний связывают с такими нарушениями, при которых клетки либо перестают погибать (Ргаззапипо, 1998; Рыжов, Ьеуте, 1994), и тогда возможно возникновение опухолей, либо гибель захватывает избыточное число клеток, что является патогенным фактором в развитии другого ряда заболеваний, среди которых аутоиммунные и иммунодефицитные состояния.

Активно изучается роль апоптотического механизма иммуносупрессии в патогенезе аллергических заболеваний. Повышенный интерес обусловлен концептуальной версией, согласно которой в основе иммунных заболеваний лежит чрезмерная активация иммунокомпетентных клеток, которая приводит к накоплению аутореактивных клонов (позитивная активация и отсутствие апоптоза) (Каладзе, 2004, Чернушенко, 2003; Сепиашвили, 2000). Специфический воспалительный процесс в бронхиальной стенке при астме, характеризуется увеличением в слизистой оболочке и просвете бронхиального дерева активизированных эозинофилов, тучных клеток, макрофагов и Т-лимфоцитов (Гавалов, 2001). Воспаление респираторных путей характеризуется потерей клеток эпителия бронхов (Тгаийпапп ег а1., 2002), которое сопровождается ДНК-фрагментацией и характерными изменениями, присущими апоптозу, и этот процесс активируется Т-клетками и эозинофилами. Предполагают, что апоптотическая гибель большинства Т-лимфоцитов связана с их миграцией в результате антигенного воздействия, то есть апоптоз Т-клеток представляется авторами как механизм антигенуправляемой селекции лимфоцитов (Барышников, Шишкин, 1996; Шэошепе е1 а1., 2005; Яойет й а1., 2002). А пролонгацию аллергического воспаления при бронхиальной астме

связывают с усилением выживаемости Т-лимфоцитов и утратой ими способности к апоптозу (Шапорова, 2003), что проявляется в замедлении процессов фрагментации ДНК этих клеток (Vignola, 2000; Melis et al., 1997; Thomas, 1992).

Одним из значительных в этом направлении исследований стала работа Vignola А.М. с соавторами (Vignola et al, 2000), в которой в экспериментальной системе с применением иммуногистохимического и TUNEL методов показали наличие апоптотических эозинофилов, макрофагов и лимфоцитов в тканях дыхательных путей здоровых людей и больных хроническим бронхитом. Сравнивая здоровых людей с двумя группами больных бронхиальной астмой (получавших и не получавших стероиды) Druilhe А. и соавторы (Druilhe et al, 1998) исследовали процесс апоптоза и экспрессию апоптоз-регулирующих молекул в эозинофилах и лимфоцитах тканей дыхательных путей. Авторы сообщили о наличии TUNEL-положительных эозинофилов и лимфоцитов в трех исследуемых группах, но не обнаружили достоверной разницы между группами. Не была представлена информация относительно апоптотических изменений в клетках, полученных с помощью световой и электронной микроскопии.

Противоположным процессу апоптоза является процесс пролиферации. Соотношение апоптоза и пролиферации при этом служит важным параметром реакции на антигены, так как оно определяет ее результативность с точки зрения развития иммунного ответа (Никонова и др., 1999).

Апоптоз сопровождается изменением целого ряда морфологических, биохимических и других показателей, касающихся практически всех клеточных структур. При анализе ДНК хроматина и ультраструктуры органелл поврежденных клеток выявляют разрывы цепи ДНК методом TUNEL (TdT-mediated dUTR-biotin nick end-labeling) и методом электрофореза в геле агарозы. На начальных этапах программируемой гибели в клетках, еще до начала формирования апоптотических телец, наблюдается нарушение мембранной ассиметрии, вследствие чего наружу экспрессируется фосфатидилсерин, что распознается при специфическом связывании методом проточной цитофлюориметрии (Григорьева и др., 2002).

Таким образом, проблема апоптоза лимфоидных клеток, идентификация его морфологических и биохимических маркеров в перспективе может способствовать более глубокому пониманию механизмов патогенеза астмы, улучшению и созданию принципиально нового направления дифференциальной диагностики.

Цель работы: Характеристика биохимических и морфологических признаков процесса апоптоза лимфоцитов периферической крови при атопической бронхиальной астме.

Задачи исследования:

1. Провести цитогенетической анализ форменных элементов крови у больных астмой с различной степенью тяжести.

2. Изучить динамику роста форменных элементов клеток in vivo и in vitro, на примере сравнительного анализа роста лимфоцитов периферической крови у больных астмой различной степени тяжести.

3. Провести сравнительный анализ морфологии выделенных лимфоцитов условно здоровых доноров и больных астмой методом трансмиссионной электронной и световой микроскопии.

4. Изучить биохимические особенности апоптоза:

а. Оценить степень деградации ДНК лимфоцитов выделенных из периферической крови электрофоретическим методом (фрагментация ДНК).

б. Определить уровень спонтанного и дексаметазон-индуцированного апоптоза лимфоцитов на ранней и поздней стадии, используя нарушение мембранной ассиметрии (вследствие чего наружу экспрессируется фосфатидилсерин), фрагментацию ядер, что распознается при специфическом связывании методом проточной цитофлюориметрии.

Научная новизна работы. Впервые установлено, что у больных различными формами атопической бронхиальной астмой (легкая, средняя и тяжелая персистирующая астма) процесс апоптоза лимфоцитов имеет структурные и биохимические особенности. У больных легкой и средней персистирующей астмой на фоне торможения апоптоза повышается количество пролиферирующих лимфоцитов (отмечается лимфопролиферативный эффект ). Для лимфоцитов больных тяжелой персистирующей астмой характерно нарушение клеточного деления лимфоцитов (митотической активности).

Начальные этапы апоптоза, выраженные через взаимосвязь между числом клеток со сниженным митохондриальным потенциалом и экспрессией фосфатидилсерина на поверхности Т-лимфоцитов не претерпевают серьезных отличий в норме и при патологии. Нарушения апоптоза затрагивают заключительный этап на стадии деградации ДНК. У больных с тяжелой персистирующей астмой апоптоз идет по пути программированного некроза.

Практическая ценность работы. Полученные результаты расширяют представления о механизмах нарушения апоптоза лимфоцитов и прогноза тяжести заболевания астмой. Работа носит экспериментальный характер и может послужить фундаментом для дальнейшего поиска новых- методов для диагностики и контроля тяжести астмы.

Положения, выносимые на защиту.

1.Степень тяжести бронхиальной астмы отражена в морфологических проявлениях апоптоза лимфоцитов, связанного с заключительным этапом процесса в ядре.

2.При легкой и средней персистирующей астме увеличение продолжительности жизни лимфоцитов коррелирует с повышением пролиферативной активности на фоне торможения апоптоза.

3.Повышение уровня антител к ДНК при тяжелой персистирующей астме связано с гибелью лимфоцитов по типу программируемого некроза, сопровождающегося развитием альтерации окружающих клеток и воспаления,

а фагоцитоз остатков погибших клеток- развитием иммунного ответа, если в них имеются антигены хроматин-содержащие элементы клеток.

Апробация работы: Основные результаты исследований докладывались на конференции II Международного молодежного медицинского конгресса в Санкт Петербурге (2007), IV съезде Российского общества биохимиков и молекулярных биологов в Новосибирке (2008) и II Международной научно-практической конференции «Постгеномная эра в биологии и проблемы биотехнологии».- Казань, 2008.

Публикации: По материалам диссертации опубликовано 8 работ.

Объем и структура диссертации. Основной текст диссертации изложен на 157 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, главы собственных наблюдений, обсуждения и выводов. Диссертация иллюстрирована 13 таблицами и 32 рисунками. Список литературы содержит 215 источник: 87 в Российских изданиях и 128 зарубежных авторов.

Материалы и методы исследования

Объектом изучения послужили лимфоциты, выделенные из периферической крови условно здоровых доноров (ЗД) и больных атопической бронхиальной астмой (АБА) (109)- (мужчины/женщины: 69/40; возраст ± SD: 31±15). Группу больных АБА составили лица с различной степенью тяжести заболевания: 15 больных с интермиттирующим течением (32±6); 38 больных с легким персистирующим течением (29±14); 26 больных со средним персистирующим течением (32±14); 30 больных с тяжелым персистирующим течением (42±18), на момент забора крови не получавшие кортикостероиды, находящиеся на стационарном лечении в пульмонологическом отделении РКБ МЗ РТ г. Казани. Диагноз атопической формы БА ставился на основании данных аллергического анамнеза, результатов кожных проб с бытовыми, эпидермальными, пыльцевыми аллергенами, провокационных назальных и ингаляционных тестов. Стандартное исследование периферической крови (общий анализ с лейкоцитарной формулой) проводилось в лаборатории пульмонологического отделения РКБ МЗ РТ г. Казани.

Подготовка мазков крови периферической крови. Мазки крови фиксировали неразбавленным раствором фиксатора-красителя (эозин метиленовый синий по Май-Грюнвольду фирмы «Абрис +», Россия). Материал окрашивался методом, рекомендованным фирмой-производителем стандартных гематологических красителей Май-Грюнвальда и Романовского-Гимза (Абрис +), в растворе азур-эозинового красителя Романовского-Гимза (1:10) на дистиллированной воде. Препараты высушивали на воздухе и просматривали под бинокулярным микроскопом «Micros МС 50» (окуляр-7, объектив-ЮОх) с использованием масляной иммерсии.

Подсчет эритроцитов с микроядрами в периферической крови. Приготовленные мазки фиксировались в растворе метиловый спирт - ледяная

уксусная кислота (3:1) в течение 3 мин, затем высушивались. Окрашивались в растворе азур-эозинового красителя Романовского-Гимза (1:5) в течение 20 мин. Число эритроцитов с микроядрами пересчитывали в процентах.

Лимфоциты из периферической крови выделяли методом равновесного центрифугирования (Patel D et al., 1995) в растворе фиколл-верографина (р= 1,077 г/см). Суспензию клеток собирали и промывали в растворе Хенкса. Рабочая концентрация лимфоцитов составляла 2х106 клеток в 1 мл.

Культивирование лимфоцитов. Клетки (2x106) суспензировались в среде RPMI 1640 из расчета 1 мл клеточной суспензии на 1 лунку, в 24-луночных пластиковых плоскодонных планшетах (Nung), далее добавлялась 10% эмбриональная телячья сыворотка и 200 мкг/мл L-глутамина (Flow). Культивировали с дексаметазоном (конечная концентрация 1ОЛМ) в СО2-инкубаторе (5 %-ным СО2) в течение 1-6 суток (Бойчук,2003).

Ультраструктурное исследование проводилось на осажденных центрифугированием лимфоцитах, которые последовательно фиксировали в 2,5%-ом глутаровом альдегиде на 0,1М Na-фосфатном буфере (рН 7,2) и 1%-ом растворе 0s04 в течение 1 ч. Полученные образцы заключали в Эпон-812. Срезы получали на ультрамикротоме LKB-III (Швеция), просматривали на электронном микроскопе Hitachi HU-125E (Япония).

Выделение ДНК из лимфоцитов. Осадок лимфоцитов суспензировали в 1 мл денатурирующего раствора охлажденного сахарозного буфера (Джербашьян, 2002), выдерживали 10 мин при комнатной температуре (Иващенко, 1999). Образец центрифугировали при 3000 об/мин, при 4°С в течение 15 мин. Осадок ядер суспензировали в 400 мкл буфера для протеиназы К, и добавляли: 20 мкл 10% SDS-Na до конечной концентрации 0,5%, 5 мкл маточного раствора протеиназы К до конечной концентрации - 250 мкг/мл. ДНК экстрагировали с помощью смеси фенол-хлороформа (1:1) (Джербашьян, 2002) и осаждали изопропиловым спиртом. Концентрацию и степень чистоты образцов ДНК определяли спектрофотометричкски, измеряя поглощение образца при 260 и 280 нм.

Электрофорез в 1% агарозном геле. В лунки вносили образцы, содержащие одинаковое количество ДНК, добавляли по 2 мкл бромфенолового синего. Электрофорез вели в горизонтальном направлении на пластинах размером 10x11x3 мм при напряжении 5 В/см, в течение 3,5 ч при 20 С в электродном буфере, содержащем бромистый этидий (2 мкг/мл) и фотографировали в УФ-свете (видеосистема для регистрации гелей "DNA Analyzer").

Определение доли клеток со сниженной величиной митохондриального потенциала (МП) измеряли с помощью флюорохрома CMX-ROS. 5 мкл вносили в 1 мл клеточной суспензии, содержащей 1х106 клеток/мл среды (конечная концентрация CMX-Ros 5 мкг/мл). Суспензию инкубировали в темноте 30 мин при 37°С в полистирольных пробирках для цитофлуориметрии 12x75 мм (Falcon 2052). Регистрацию результатов проводили на третьем детекторе флюоресценции FL3 (красная область спектра). На каждый вариант опыта

просчитывали не менее 10000 клеток. Мёртвые клетки исключали из исследования на основании параметров их прямого (FSC) и бокового (SSC) светорассеяния.

Определение доли клеток с экспрессией фосфатидилсерина (ФС). Маточный раствор МС540 (1 мг/мл) в объёме 5 мкл вносили в 1 мл клеточной суспензии, содержащей 106 клеток/мл (конечная концентрация МС540 5 мкг/мл) (Mower D, 1994). Клеточную суспензию инкубировали в течение 5 мин в темноте при комнатной температуре в полистирольных пробирках 12x75 мм (Falcon 2052). Регистрацию результатов осуществляли на втором детекторе флюоресценции FL2 цитометра. На каждый вариант опыта просчитывали не менее 10000 клеток.

Определение доли клеток с гиподиплоидным содержанием фрагментированной ДНК. Количество клеток на стадии апоптоза оценивали по доле клеток формирующих гиподиплоидную область при окрашивании образцов PI ("Sigma"). Клетки, предварительно фиксированные в течение 1 ч 70 этиловым спиртом и отмытые ФСБ, окрашивали на ДНК при комнатной температуре в течение 15 мин в темноте гипотоническим раствором PI, содержащим 0,1% тритона Х-100 и 0,1% цитрата натрия, в полистирольных пробирках 12x75 мм (Falcon 2052) (Бойчук,2003). Определяли процент клеток в гиподиплоидной зоне гистограммы (2), располагающегося левее основного пика (1), соответствующего диплоидным клеткам. Регистрацию результатов проводили на втором детекторе флуоресценции - FL2 (Nicoletti,1991).

Статистическая обработка. Математический анализ полученных результатов проводился на персональном компьютере с использованием пакета программ "Excel (Microsoft office 2003)" и Statistica 5,0". Сравнение вариационных рядов осуществлялось с помощью непараметрического критерия Крускала-Уоллиса и Т-критерия Манна - Уитни. Достоверность различия частоты встречаемости признака определяли, используя метод Фишера и t-тест для долей с поправкой Бонферрони. Корреляционный анализ проводился методом ранговой корреляции Спирмена-г5

Результаты исследования и их обсуждение

Цитогенетический анализ и количественная характеристика форменных

элементов периферической крови при развитии тяжести астмы in vivo

На клеточном уровне поддержание биологической целостности организма реализуется за счет регуляторного влияния эфферентных сигналов, которые поддерживают состояние равновесия между интегративными физиологическими процессами: пролиферацией, дифференцированием и программированной клеточной гибелью. Функция апоптоза заключается в отслеживании нарушений в клетке, которые могут привести к изменению цитогенетического аппарата. Одним из анализов нестабильности хромосом человека является микроядерный тест. Учет микроядер, по мнению исследователей (Ковалева, 2008), стал возможен в большинстве популяций

делящихся клеток одного организма, в том числе и лимфоцитах. Однако оценка микроядер в одноядерных лимфоцитах с их относительно большей продолжительностью жизни может вносить ошибку в анализ, так как учитываются и индуцируемые микроядра и предсуществующие (Романова и др., 2000). Динамика двухъядерных клеток или двухъядерных клеток с микроядрами в популяции остается недостаточно исследованной (РеПша ег а1., 1965), поэтому легче всего их выявлять в клетках без основного ядра у большинства видов млекопитающих - в эритроцитах.

Лимфоциты и эритроциты относятся к форменным элементам крови, которые отражают состояние защитных сил организма (Глобальная стратегия лечения и профилактики астмы, 2002), поэтому мы изучали показатели общего анализа крови у больных АБА, в том числе динамику клеток лейкоцитарных рядов и цитогенетические аномалии.

Проведя микроядерный анализ эритроцитов периферической крови, мы обнаружили достоверное увеличение числа эритроцитов, содержащих микроядра (табл.1).

Таблица 1. Уровень эритроцитов с микроядрами в периферической крови больных атопической бронхиальной астмой

Группы доноров Число Изучено Эритроциты с микроядрами: Р

обследованных клеток абс. число М ± m (%)

Здоровые 17 34000 7 0,021±0,002 -

а

с легкая 14 28000 10 0,036+0,002 Н.З.

т средняя 15 30000 16 0,053±0,003 <0,001

м а тяжелая 10 20000 18 0,090±0,004 £0,001

Увеличение количества эритроцитов с микроядрами периферической крови наблюдалось у всех больных и коррелировало с тяжестью атопической бронхиальной астмы. По данным литературы (Okada, Мак, 2004), образование одного или нескольких микроядер в клетках, в которых отсутствуют явления маргинации и конденсации хроматина, понимают как процесс гибели клетки отличный от апоптоза и получивший название митотическая катастрофа. Морфологический и биохимический механизм гибели клетки, претерпевшей митотическую катастрофу, обычно описывают как некроз (Roninson et al., 2001).

Если экстраполировать результаты на лимфоциты, интерпретация данных, полученных этим методом, в значительной мере определяется решением вопроса о дальнейшей судьбе клетки, содержащей микроядра.

Мы изучили поведение некоторых форменных элементов крови ш vivo. В клинике имеет значение не только общее количество лейкоцитов, но и процентное соотношение всех видов лейкоцитов. С помощью световой микроскопии мы дифференцировали клетки лейкоцитарных рядов.

Изменения лейкоцитарной формулы сопутствуют многим заболеваниям и нередко являются неспецифическими. Тем не менее, оно дает представление о тяжести состояния пациента, эффективности проводимого лечения. По полученным нами данным, световая микроскопия не показала значительных отличий в морфологии форменных элементов крови в зависимости от тяжести заболевания, поэтому мы изучили динамику количества этих клеток in vivo.

Как известно, у здорового человека в норме число лейкоцитов в 1 л крови составляет 6,0-9,0x109 (Kogg, Doerschux, 1995). При атопической астме суммарное количество лейкоцитов (6,18x109) в крови практически не отличается от количества лейкоцитов здоровых доноров, однако при изучении отдельных групп клеток выяснилось, что на фоне достоверного повышения числа нейтрофилов (р=0,04) и эозинофилов (р=0,26), но не отражающего взаимосвязи с тяжестью патологии, обращает на себя внимание пониженное содержание числа лимфоцитов. Особенно динамика к снижению числа лимфоцитов была отмечена при развитии тяжести патологии. Использование непараметрического Т-критерия Манна-Уитни и соответствующих структурных единиц (медиана и перцентили) показало, что различия в числе лимфоцитов в периферической крови между легким и тяжелым персистирующим течениями астмы достоверны на уровне значимости 95% (р=0,05). Методом корреляционного анализа установлено, что существует обратная корреляционная зависимость между количеством лимфоцитов и степенью тяжести заболевания (г = - 0,3,р =0,04, /^=0,0734, «=49).

Снижение, может быть связано как с нарушением пролиферативной активности лимфоцитов, так и миграцией последних из периферической крови к легким после воздействия аллергена. С другой стороны пролонгацию аллергического воспаления при бронхиальной астме связывают с утратой ими способности к апоптозу и, как следствие, увеличению продолжительности их жизни.

Для объяснения фактов полученных in vivo, мы изучили ряд биохимических параметров клеток при развитии in vitro (в культуре лимфоцитов больных астмой различной степенью тяжести).

Особенности роста лимфоцитов при культивировании in vitro

Учитывая, что на клеточном уровне изменения проявляются значительно раньше, чем на организменном, представляется весьма актуальным сравнительный анализ морфологических особенностей структур лимфоцита в норме и при различной степени тяжести астмы. Нами установлено, что структура лимфоцитов периферической крови больных по большинству параметров значительно отличается от нормы (рис.1). Если при окраске эозином апоптоз определяется в единичных клетках - апоптотические клетки выглядят как округлые или овальные скопления интенсивно эозинофильной цитоплазмы с плотными фрагментами ядерного хроматина, то при электронной микроскопии выявляются четкие отличительные морфологические признаки.

Шш

АБА (6,18х109/л)

Таблица 2. Изменения структуры лейкоцитарной формулы периферической крови пациентов с атопической астмой

в зависимости от тяжести заболевания.

моноциты

эозинофилы

1-эритроциты

2-лимфоцнты

3-моноциты

4-невтрофилы

5-эозинофнлы

лимфоциты

нейтрофилы

Степень тяжести астмы-»

Интермит-тиругощая

Клетки | :

Количество клеток в %:

N. 6,3x10%

Персисгирующая:

легкая

тяжелая

Уплотнение цитоплазмы, более компактное расположение органелл, лимфоциты больных астмой отличаются от контрольных клеток крупными ядрами и сегрегацией ядрышек. Выявляются и апототические лимфоциты с выпячиваниями поверхности клетки и блеббингами на мембране. Ядра

Рис.1. Морфология лимфоцитов здоровых доноров (норма) и больных легкой, средней и тяжелой персистирующей астмы in vivo.

течение атонической бронхиальной астмы

приобретают лопастной вид, отмечается маргинация хроматина, сущность которой в концентрации последнего по периферии ядра в виде глыбок. Более выраженные отличия выявляются в клетках больных тяжелой формой астмы: часто отмечается фрагментация ядер и их отшнуровывание мембраной внутри клетки.

В связи с этим возникает вопрос, как ведут себя лимфоциты с такой структурой в процессе роста. Исследование апоптоза в эксперименте in vitro с использованием клеточных культур дает сегодня возможность для более глубокого понимания молекулярных нарушений и кинетики этого процесса при развитии атопических заболеваний (Мамонтова, 2005). В большинстве культуральных систем лимфоциты гибнут путем апоптоза на протяжении нескольких дней, поэтому срок появления лимфоидных клеток при атопическай бронхиальнай астме разных степеней тяжести, которые перешли в состояние апоптоза, представляет практический интерес.

Мы изучили изменение числа клеток в культуре лимфоцитов in vitro.

Рис.2 . Динамика изменения роста клеток in vitro

Уровень клеток (рис.2), обнаруживаемых в гиподиплоидной зоне гистограмм на 3 сутки, мы сравнивали с числом клеток перед культивированием, а на 6 сутки - с количеством клеток на 3 сутки культивирования. Как следует из табл. 3, количество лимфоцитов на 3 сутки

увеличивается (при спонтанном апоптозе) на 45 % в культуре здоровых клеток и на 58 - 70% при легкой и средней персистирующей астме, соответственно.

Таблица 3. Изменение количества лимфоцитов в норме и при астме in vitro после 3 дней культивирования без и с дексаметазоном (Дн).

Исходное количество клеток-2 млн/мл

норма

2,1±0,2

Степень тяжести астмы:

2,9±0,22

>70

2,3±0,1

>15

легкая

средняя

тяжелая

При использовании дексаметазона в норме число клеток на 3 сутки увеличилось только на 5%, что может свидетельствовать о подавлении клеточного роста.

Таблица 4. Изменение количества лимфоцитов в норме и при астме in vitro после 6 дней культивирования без и с дексаметазоном (Дн).

Исходное количество клеток - 2 млн/мл

Степень тяжести астмы:

тяжелая

В культуре лимфоцитов легкой и средней степени тяжести клетки продолжали расти, но пролиферативная активность лимфоцитов несколько снижалась (число клеток увеличилось на 33-20 %, соответственно), что можно объяснить гибелью клеток в результате индуцированного апоптоза.

На 6 сутки (табл. 4) отмечалось снижение числа клеток в культуре лимфоцитов в норме и больных астмой.

Обращает на себя внимание поведение клеток в культуре лимфоцитов больных тяжелой персистирующей астмой: если без дексаметазона число клеток на 3 сут увеличивается в среднем на 15%, то добавление индуктора апоптоза приводило к снижению числа лимфоцитов на 10% по сравнению с числом клеток до культивирования.

Таким образом, in vitro число лимфоцитов изменяется в зависимости от времени роста как в культуре клеток от условно здоровых доноров, так и культуре клеток от больных атопической бронхиальной астмой и говорит о разной степени выживаемости клеток в зависимости от тяжести заболевания.

Однако, с одной стороны, по данным нашего исследования выявлена обратная корреляционная связь между числом лимфоцитов в периферической крови и тяжестью астмы in vivo, с другой стороны, на фоне торможения роста клеток в культуре лимфоцитов больных тяжелой персистирующей астмой, лимфоциты от больных легкой и средней тяжести заболевания in vitro проявляют пролиферативную активность. По данным Минеева с соавторами (Минеев и др, 2003) апоптоз и пролиферация - процессы полярные.

В какой форме и на каком этапе развития апоптоза лимфоцитов может проходить нарушение этого процесса у больных атопической бронхиальной астмой? Для ответа на данный вопрос мы изучили основные проявления апоптоза на биохимическом уровне, которые протекают в митохондриях и в ядре:

- степень деградации ДНК лимфоцитов, выделенных из периферической крови электрофоретическим методом.

- определение уровня спонтанного и дексаметазон-индуцированного апоптоза лимфоцитов на ранней и поздней стадии, используя нарушение мембранной ассиметрии (вследствие чего наружу Т-лимфоцитов экспрессируется фосфатидилсерин) к фрагментацию ядер, что распознается при специфическом связывании йодида пропидия методом проточной цитофлуориметрии.

Идентификация биохимических маркеров апоптоза лимфоцитов in vitro

При апоптозе ДНК деградирует с образованием упорядоченных фрагментов, которые обнаруживаются по увеличению гиподиплоидной зоны ДНК на гистограммах в процессе цитофлуориметрии. Уровень апоптотических клеток, обнаруживаемых в гиподиплоидной зоне гистограмм, сравнивали с количеством клеток в культуре лимфоцитов условно здоровых и легкой и тяжелой формами астмы на 3 и 6 сутки культивирования (рис. 3).

При изучении механизмов апоптоза большое внимание уделяется митохондриям, так как в процессе ПКГ из них выделяется большое количество биологически активных веществ, необходимых для перехода апоптоза в конечную и необратимую стадию (Бойчук, 2003). Хорошо известно свойство митохондрий - четко выраженная взаимосвязь ультраструктуры и функционального состояния этих структур. Исчезают протяженные митохондриальные филаменты, мелкие округлые митохондрии концентрируются в зоне ядра, кристы меняют конфигурацию.

IV ш UC

3 JL M1 1 3 с У т к и

л "jfcr M1 I WW Ak

т ж u: 1 ' 25% -xl i——

Рис. 3. Изменение величины митохондриального потенциала (МП) и фосфатидилсерина (ФС) в лимфоцитах доноров (3) и больных с легкой (JI) и тяжелой (Т) персистирующей атопической астмой, отражающих ранние признаки апоптоза. (В % выражено число клеток со сниженным МП потенциалом и экспрессией ФС).

Мамонтова Т.В. и Кайдашев И.П. (2005) показали явление проникновения митохондрий в ядро (обнаруженное в отдельных случаях и в данной работе). По мнению авторов «ядерные митохондрии», как признак апоптоза, нашли подтверждение при апоптозе растительных клеток. Биохимические изменения в митохондриях являются одним из наиболее ранних событий, происходящих в клетках во время апоптоза (Metivier, 1998).

При исследовании клеточного роста нами установлено (рис. 3), что различий в спонтанном изменении показателей МП между исследуемыми группами на 3 сутки (табл. 5) не было выявлено. Клетки здорового организма проявляли устойчивость к Дн-индуцированному апоптозу через 72 ч (табл. 6).

Таблица 5. Изменения числа клеток (в %) in vitro на стадии ранних

Форма астмы Число клеток в % на 3 сутки культивирования

- (действие Дн в %):

здоровые 21% 20% (нет)

легкая 20% 30% (больше на 30%)

тяжелая 27% 39% (больше на 44%)

На 6 сутки (табл. 6) при спонтанном апоптозе в норме увеличивается ответ в виде повышения числа клеток со сниженным МП, что может быть связано с нарушениями, которые происходят в культуре клеток {in vitro). Активно пролиферирующие клетки в культуре лимфоцитов больных легкой формой астмы отвечают повышением числа клеток со сниженным МП (на 110%). Не делящиеся клетки больных тяжелой формой астмы отвечают практически отсутствием апоптотических изменений (табл.6).

Таблица 6. Сравнение спонтанного и индуцированного апоптоза в норме и при астме (по числу лимфоцитов (в%) со сниженным МП)

Спонтанный апоптоз Индуцированный апоптоз (на б сут. по сравнению с 3 сут.)

3 сутки 6 сутки Изменение: 3 сутки 6 сутки Изменение:

Условно здоровые 21% 36% > на 70% 20% 54% > на 170%

Степень тяжести легкая 20% 42% > на 110% 30% 18% < на 50%

тяжелая 27% 30% > на 10% 39% 43% > на 11%

Инкубация с Дн индуцировала снижение величины МП и появление ФС на поверхности лимфоцитов (табл. 6 и 7), однако динамика существенно различалась между лимфоцитами различных групп. Через 72 ч инкубации лимфоцитов с Дн число клеток со сниженным МП среди лимфоцитов больных атопической астмой был выше по сравнению с лимфоцитами доноров. Продолжение культивирования в питательной среде в течение 6 суток показали резистентность к развитию апоптоза с различиями в зависимости от тяжести патологии, в то время как лимфоциты здоровых лиц проявляли постепенное увеличение уровня апоптоза в этих условиях.

На начальных этапах апоптоза из-за нарушения мембранной ассиметрии, наружу экспрессируется фосфатидилсерин (табл.7). Инкубация лимфоцитов с Дн приводила к повышению уровня экспрессии ФС на их поверхности через 3 суток инкубации. Продолжение культивирования в течение 6 суток также показало резистентность к развитию апоптоза как в случае с изменением величины МП.

Таблица 7. Сравнение спонтанного и индуцированного апоптоза в норме и при атопической бронхиальной астме (по числу лимфоцитов с повышенной экспрессией ФС, в %)

Спонтанный апоптоз Индуцированный апоптоз (на 6 сут. по сравнению с 3 сут.)

3 сутки 6 сутки Изменение 3 сутки 6 сутки Изменение:

Условно здоровый 18% 32% >на 78% 24% 47% > на 96%

Форма астмы легкая 21% 41% >на 95% 36% 17% < на 53%

тяжелая 26% 28% >на 7% 39% 42% > на 8%

Известно, что атопическая астма сопровождается инфильтрацией бронхиального дерева клетками, мигрировавшими из кровяного русла. По истечению определенного срока они должны подвергнуться элиминации посредством запуска апоптоза. Нарушение элиминации клеток из органов-мишеней может быть связано с ослаблением экспрессии на их поверхности молекул (в частности, фосфатидилсерина), сигнализирующих об апоптозе и обеспечивающих их распознавание и последующее переваривание. Существует предположение, что причиной длительности воспаления в легких при атопической астме является не нарушение процессов регуляции апоптоза лимфоцитов, а нарушение их распознавания (Susin et al., 1999).

Слабое проявление ранних признаков апоптотического процесса в культуре лимфоцитов больных, особенно, тяжелой формой астмы как при спонтанном, так и индуцированном апоптозе на 6 сутки in vitro может свидетельствовать о нарушении апоптоза этих клеток и на заключительном этапе, т.е. в ядре.

Таблица 8. Изменения числа клеток (в %) на стадии позднего апоптоза in vitro в норме и при патологии.

Исследования in vitro (табл.8) показали не только отсутствие различий в спонтанном изменении величины МП и экспрессии ФС на поверхности лимфоцитов периферической крови исследуемых групп через 3 суток,

существенных различий не было выявлено и во фрагментации ДНК лимфоцитов. Даже при 144 часовой (в течение 6 суток) инкубации фрагментация лимфоцитов при атопии была выражена в меньшей степени или отсутствовала по сравнению с контролем.

Таким образом, нами выявлена обратная связь между количеством апоптотических клеток и тяжестью астмы.

Гибель клеток оценивали по характеру деградации ДНК, для чего из клеток выделяли ДНК фенольным методом по Кирби-Георгиеву, и проводили электрофоретическое разделение ДНК.

При анализе продуктов распада ДНК до культивирования выявлено (рис. 4), что ДНК ядер лимфоцитов больных тяжелой персистирующей астмой более деградирована, ДНК ядер лимфоцитов легкой персистирующей астмы содержит высокомолекулярные продукты (30000-50000 п.н) по сравнению с ДНК, выделенной из контрольных препаратов (примерно, 20000-25000 п.о.)

В норме, при анализе продуктов распада ДНК in vitro показано, что инкубация лимфоцитов без добавок в течение 3 суток вызывает слабый апоптоз. Появление низкомолекулярных продуктов деградации ДНК до 2000 п.н. отмечается на 6 сутки инкубации (рис. 4).

1 2 3 4 5

0 сутки

1 2 3 4 5

3 сутки

1 2 3 4 5

6 сутки

Рис. 4. Анализ степени деградации ДНК лимфоцитов in vivo и in vitro здоровых лиц (3) и больных легкой (JI) и тяжелой (Т) персистирующей астмы после 3 и 6 дней культивирования (электрофорез в 1% агарозном геле; дорожки 1,2-маркеры).

Анализ продуктов распада ДНК лимфоцитов больных астмой обнаружил слабую межнуклеосомную деградацию ДНК хроматина. Наибольшую устойчивость проявляла ДНК лимфоцитов больных легкой персистирующей астмой.

Мы показали, что добавление дексаметазона вызывает не только подавление митотической активности in vitro, но индуцирует комплекс реакций, приводящих к гибели клеток в норме по типу апоптоза. Лимфоциты

1В

больных легкой персистирующей астмой резистентны к развитию апоптоза на протяжении 72 ч культивирования в питательной среде в присутствии дексаметазона (рис.5) .

Инкубация с дексаметазопом в течение 6 суток

soft

400

зоо 200 leo

Рис. 5. Структура ДНК из лимфоцитов здоровых (3) лиц и больных астмой легкой (JI) и тяжелой (Т) формы после 3 и 6 дней культивирования с дексаметазоном.

Итак, фрагментация ДНК это одно из проявлений апоптоза на биохимическом уровне, которое реализуется в ядре клетки. По данным Brown с сотрудниками (Brown et al., 1993) высокомолекулярные фрагменты образуют два пика в районе 50 и 300 т.п.н. при разделении ДНК апоптотических клеток в пульсирующем электрическом поле. По другим данным, в норме сначала происходит образование крупных фрагментов ДНК, содержащих 700, 200-250, 50-70- т.п.н., позже 30-50 т.п.н. Полагают, что именно этот начальный этап фрагментации хроматина является ключевым событием апоптоза (Погорелов, Козинец, 1995). Следующий этап фрагментации - межнуклеосомная деградация, т.е. расщепление в результате двунитевых разрывов между нуклеосомами с формированием фрагментов, содержащих 180-200 п.о.

Исследования процесса апоптоза лимфоцитов больных АБА свидетельствует об устойчивости данных клеток к апоптозу. Однако, следует отметить тот факт, что при инкубации с Дн лимфоцитов доноров и больных астмой снижение величины МП и экспрессия ФС происходила у определенной части клеток, в то время как у остальной части лимфоцитов эти параметры не изменялись. Не все клетки перешли в апоптоз по данным оценки при окрашивании образцов йодидом пропидия. Следовательно, наряду с клетками здоровых доноров, только часть лимфоцитов больных астмой in vitro подвергается спонтанному и индуцированному апоптозу и способна гибнуть путем апоптоза in vivo. У больных тяжелой формой астмы апоптотических клеток на поздней фазе развития не более 14-21% (табл.8).

Рис. 6. Ультраструктура лимфоцитов периферической крови здоровых доноров (А), пациентов с легкой (В) и тяжелой (Г) персистирующей АБА. Б- апоптотические тельца.

Признаки апоптоза клеток наиболее выражены в лимфоцитах больных легкой персистирующей астмой (рис. 6). В составе препаратов ДНК лимфоцитов обнаружены фрагменты размером 30-50 т.п.н., присутствие которых морфологически проявляется в виде конденсации хроматина и выпячивания мембраны, характерных для апоптоза (рис. 6).

Как следует из рис. 6 при тяжелой персистирующей астме обнаружены клетки, морфология которых претерпела существенные изменения: структура выражено отличается как от здоровых клеток, так и клеток больных легкой формой АБА. Обнаруживаются глубокие вдавливания ядерных мембран, ядра приобретают лопастной вид, обычно далее происходит его коллапс вплоть до фрагментации последних. На клеточной мембране появляются выпячивания и пузыри - «блеббинги». Развитие блеббинга мембраны представляет собой результат нарушения мембран-цитоскелетных взаимодействий вследствие активации специфических ферментативных реакций, окислительного повреждения белков цитоскелета, развития примембранного энергетического и ионного дисбаланса, целостность мембран часто не нарушена. В периферической крови больных легкой персистирующей астмой можно обнаружить везикулы, так называемые апоптотические тельца.

Наиболее принципиальным достижением последних лет (Манских, 2007) в изучении программируемой клеточной гибели явилось установление программируемого характера биохимических изменений, приводящих к некрозу (Okada,Mak, 2004; Проскуряков и др., 2002). В связи с этим в современной классификации ПКГ апоптоз получи название «ПКГ I типа», а некроз-«ПКГ III типа»; «ПКГ II типа» представлен аутофагией. В настоящее время на первый план выходят различия в последствиях апоптоза и некроза для окружающих живых клеток и организма. Апоптоз заканчивается «аккуратным» фагоцитозом без последствий в виде альтерации, воспаления и иммунного ответа (Degenhardt et al., 2006). Гибель клетки по типу некроза всегда сопровождается развитием альтерации окружающих клеток и воспалением, а фагоцитоз погибших клеток - развитием полноценного иммунного ответа, если в них есть антигены (Проскуряков, и др., 2002). Эти различия весьма важны для патологии. Морфологическими признаками некроза является набухание клеток и . мембранных органелл, неспецифическая компактизация хроматина, вакуолизация цитоплазмы, нарушение целостности мембран. Понятие «программируемый некроз» сформировалось на основании данных, что существует сигнальный путь инициации некроза в ответ на связывание рецепторами молекул TNF, на фоне подавления апоптоза (Fiers et al., 1999). По данньм (Edinger, Thompson, 2004) механизм апоптоза направлен, в том числе, и на подавление ферментов, активность которых может приводить к запуску некроза. Отрицательная связь между апоптозом и программированным некрозом прослеживается и при повреждении ДНК. В неопухолевых клетках в этих случаях включаются пункты проверки, действующие в интерфазе клеточного цикла и предотвращающие вступление в митоз клеток с нарушенным геномом (Rieder, Khodjakov,1997). В случае нарушения механизма

репарации клетки погибают путем апоптоза. Однако, если в таких клетках с поврежденной ДНК нарушены механизмы апоптоза, клетки погибают путем программируемого некроза. Физиологическое значение некроза в такой ситуации имеет двоякий смысл. С одной стороны программируемая гибель клеток путем некроза в отсутствии апоптоза все же снижает риск передачи дочерним клеткам мутаций (Edinger, Thompson, 2004). С другой стороны, распад клеток при некрозе может способствовать активации иммунного ответа многоклеточного организма. Это может выражаться при выработке аутоантител к ДНК, что показано нами ранее (Курбапов и др., 2007).

Следует отметить, что при определенных условиях процесс реализации одной программы гибели на каких-то этапах может смениться, например, начавшаяся аутофагия может смениться апоптозом, а апоптоз завершиться постапоптотическим некрозом.

Таким образом, выявленные биохимические и морфологические нарушения на уровне лимфоцитов и цитогенетические на уровне эритроцитов могут быть новыми интегративными критерями при установлении тяжести течения заболевания, в частности, атопической бронхиальной астмой.

Выводы:

1 .Установлена обратная корреляционная зависимость между количеством лимфоцитов периферической крови и степенью тяжести заболевания in vivo.

2.Степень нарушения ультраструктуры лимфоцитов коррелирует с тяжестью астмы.

3.Степень нарушения апоптоза лимфоцитов отражает степень тяжести заболевания;

а. у больных легкой и средней персистирующей астмой на фоне торможения апоптоза повышается количество пролиферирующих лимфоцитов (отмечается лимфопролиферативный эффект).

б. для лимфоцитов больных тяжелой персистирующей астмой характерно нарушение клеточного деления лимфоцитов (митотической активности).

4. Начальные этапы апоптоза, выраженные через взаимосвязь между числом клеток со сниженньм митохондриальным потенциалом и экспрессией фосфатидилсерина на поверхности Т-лимфоцитов не претерпевают серьезных

- - отличий в норме и npir атопической' бронхиальной астме.

5. Нарушения апоптоза связаны с заключительным этапом, происходящем в ядре. У больных с тяжелой персистирующей астмой апоптоз идет по пути программированного некроза.

6. Высокое число эритроцитов с микроядрами, коррелирующее с тяжестью астмы, свидетельствует о сильном прессинге эндомутагенов на геном форменных элементов крови (в частности эритроцитов).

Список основных работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Нсангу, М.М.Д. Особенности морфологических показателей и количественной оценки лимфоцитов периферической крови больных

атопической бронхиальной астмой / М.М.Д. Нсангу, A.C. Водунон. З.И. Абрамова, A.B. Лунцов, В.Н. Цибулькина // Казанский медицинский журнал.-

2007.-Т.88, № 2.-С.182-185.

2. Водунон, A.C. Влияние дексаметазона на степень деградации ДНК лимфоцитов больных Атопической Бронхиальной Астмой./ A.C. Водунон. З.И. Абрамова // Сб. тез./И-й международный молодежный медицинский конгресс.-Санкт-Петербург, 2007.-С.18.

3. Пинчук, Ю.В. Биохимические и морфологические изменения лимфоцитов при апоптозе у больных атопической бронхиальной астмой/ Ю.В. Пунчук. А.С Водунон. З.И. Абрамова // Сб. тез./Н-й международный молодежный медицинский конгресс. -Санкт-Петербург, 2007.-С.17.

4. Водунон, A.C. Интенсивность анеугенеза у больных атопической бронхиальной астмой / A.C. Водунон, З.И. Абрамова //Сб. тез. /IV съезд Российского общества биохимиков и молекулярных биологов. -Новосибирск,

2008. -С.447.

5 Пинчук, Ю.В. Особенности биохимических и морфологических показателей лимфоцитов при апоптозе у больных атопической бронхиальной астмой/ Ю.В Пунчук, A.C. Водунон. З.И Абрамова // Сб. тез./IV съезд Российского общества биохимиков и молекулярных биологов. Новосибирск,2008. С.439.

6. Водунон, A.C. Цитогенетические изменения в эритроцитах больных атопической бронхиальной астмой / A.C. Водунон, Н.А Пономарева, З.И Абрамова // Ученые записки Казанского государственного университета. Серия «Естественные науки»,- 2008.-Т.150, Кн. 3.-С.101-105.

7. Пинчук, Ю.В. Биохимические и морфологичесие изменения лимфоцитов при апоптозе у больных атопической бронхиальной астмой/ Ю.В.Пинчук, A.C. Водунон. З.И. Абрамова, М.М.Д. Нсангу, И.Г. Мустафин, А.А.Пономарева // Вестник Оренбургского государственного университета,- № 11.- С.156-161.

8. Пинчук, Ю.В. Морфологические нарушения апоптоза лимфоцитов больных атопической бронхиальной астмой / Ю.В.Пинчук, A.C. Водунон. З.И. Абрамова // Сб. тез. Л1-я Международная научно-практическая конференция «Постгеномная эра в биологии и проблемы биотехнологии».- Казань, 2008. -С. 104.

Факс биолого-почвенного факультета КГУ : 843 2387121.

Подписано в печать 8.11.08. Формат 60x84 1/16. Усл. печ. л. 1,5. Договор № 5 от 8.11.08. Тираж 100.

Лаборатория оперативной печати Казанского педагогического колледжа 420036, г. Казань, ул. Побежимова, 47а, тел. 571-14-29.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Водунон Сирил Джуниор Алоде

СОКРАЩЕНИЯ

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Варианты программированной гибели клеток

1.1.1. Апоптоз

1.1.2. Аутофагическая гибель

1.1.3. Программированный некроз

1.2. Морфологические проявления апоптоза

1.2.1. Морфологические изменения ядра при апоптозе

1.2.2. Проявления апоптоза в цитоплазме

1.3. Биохимические процессы при апоптозе

1.4. Сигнальные пути при апоптозе

1.5. Факторы регулирующие апоптоза

1.6. Методы выявления апоптоза

1.7. Морфологические и биохимические признаки апоптоза лимфоцитов при патологии

1.8. Цитогенетические аномалий в развитии апоптоза

1.9. Биохимические механизмы развития атопической бронхиальной астмы

1.10. Апоптоз в развитии воспаления при бронхиальной астме

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

3.1 Морфология и дифференциация клеточных элементов периферической крови больных АБА на окрашенных препаратах

3.2. Цитогенетический анализ у больных АБА на примере изучения эритроцитов

3.3. Количественная оценка некоторых форменных элементов периферической крови больных АБА in vivo

3.4. Особенности роста лимфоцитов при культивировании in vitro

3.5. Определение уровня спонтанного и дексаметазон-индуцированного апоптоза 94 3.5.1 Измерение величины митохондриального потенциала 95 3.5.2.Экспрессия фосфатидилсерина на поверхности клеточной мембраны 98 3.5.3 Определение доли клеток с гиподиплоидным содержанием ДНК

3.10. Электрофоретическое изучение ДНК лимфоцитов in vivo и in vitro

3.11. Изучение морфологии лимфоцитов методом электронной микроскопии

3.11.1. Сравнение ультраструктуры лимфоцитов здоровых доноров и больных астмой in vivo

3.11.2. Сравнение ультраструктуры лимфоцитов здоровых доноров и больных астмой in vitro 114 3.11.2.1. Морфологические показатели апоптоза лимфоцитов здоровых доноров при культивировании

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

ВЫВОДЫ

Введение Диссертация по биологии, на тему "Особенности апоптоза лимфоцитов при атопической бронхиальной астме"

Апоптоз представляется собой высокорегулируемую форму программированной клеточной гибели с характерными морфологическими, биохимическими и генетическими признаками, в результате которой достигается конечная цель - гибель клетки (Варга, 2007; Григорьев, 2003; Владимирская, 2002; Uno, Shah, 1989 ). Механизмы регуляции апоптоза очень сложны и, как показали исследования, практически не изменились в процессе эволюции, что дает основание судить о фундаментальной биологической роли этого процесса.

Исследование молекулярных механизмов апоптоза клеток стало в последние годы одной из самых трудных и актуальных проблем медико-биологических наук. До сих пор, не до конца выяснены пути регуляции апоптоза отдельных клеток в целостном многоклеточном организме. Актуальность проблемы заключается и в том, что возникновение самой патологии связывают с нарушением процесса программируемой клеточной гибели (Белушкина, 2001; Frassantino, 1998).

Апоптоз играет важную роль в морфогенетических процессах и в регуляции численности клеток на протяжении всего онтогенетического развития многоклеточного организма (Варга, 2007; Lenardo, 1995). Во-вторых, он защищает организма от персистенции поврежденных клеток, цитотоксических клеток, которые могут оказаться потенциально опасными для организма (Urazova, 2008; Варга, 2007; Krammer, 2000). Что особо актуально, возникновение многих тяжелых заболеваний связано с такими нарушениями, при которых клетки либо перестают погибать (Frassantino, 1998), и тогда возможно возникновение опухолей или активно пролифилировать, что приводит к возникновению СПИДа и др. патологий. Активно изучается роль апоптотического механизма иммуносупрессии в патогенезе аллергических заболеваний, в том числе атопической бронхиальной астмы (АБА).

Повышенный интерес обусловлен концептуальной версией, согласно которой в основе иммунодефицитных и аутоиммунных заболеваний лежит чрезмерная активация иммунокомпетентных клеток. Принципиальным различием является то, что при иммунодефицитах их активация заканчивается гибелью (негативная активация, апоптоз), тогда как при аутоиммунных заболеваниях активация приводит к накоплению аутореактивных клонов (позитивная активация, отсутствие апоптоза) (Каладзе, 2004, Чернушенко, 2003; Сепиашвили, 2000). Исследование маркеров апоптоза у больных БА показало, что этот биологический процесс изменен как при обострении, так и в фазе ремиссии заболевания. В частности, при обострении БА увеличивается количество СБ95-позитивных клеток. Уменьшение их числа происходит в процессе терапии глюкокортикоидам. Отмечено, что клетки (лимфоциты, эозинофилы) больных атопической формой БА устойчивы к процессам спонтанного апоптоза.

Недавние клинические исследования позволили значительно продвинуться в понимании патогенеза аллергических заболеваний. Эти исследования продемонстрировали критическую роль СБ4+ Т-лимфоцитов, эозинофилов и в регуляции аллергического воспаления и дисфункции дыхательных путей. Предпологают, что апоптотическая гибель большинства Т-лимфоцитов связана с их миграцией из участков, активно продуцирующих данные факторы, в результате антигенного воздействия, то есть апоптоз Т-клеток представляется авторами как механизм антигенуправляемой селекции лимфоцитов (Барышников, Шишкин, 1996).

Изучение механизмов развития атопической бронхиальной астмы (АБА) привело к пониманию ее как хронического воспалительного заболевания генеза. До недавнего времени считали, что механизмы, которые управляют аутоиммунитетами и аллергическими заболеваниями, совершенно различные.

Однако новые данные предполагают возможным наличие общих патогенетических эфферентных путей (ЛоИет, 81юе^е1с1, 2003). Эти данные основаны на представлении о том, что общие механизмы связаны с ключевыми элементами, которые регулируют иммунный ответ: антитела, тучные клетки, Т5 клетки, цитокины и генетические детерминанты. Наличие аутоантител при астме предполагает аутоиммуную основу этого заболевания. Специфический воспалительный процесс в бронхиальной стенке, характеризуется увеличением в слизистой оболочке и просвете бронхиального дерева количества активизированных эозинофилов, тучных клеток, макрофагов и Т-лимфоцитов (Гавалов, 2001). Процесс апоптоза в патогенезе АБА рассматривают как один из необходимых компонентов, который позволит организму поддерживать гомеостаз и нормальную жизнедеятельность на клеточном, тканевом и органном уровнях.

Установлено, что в формировании аллергической реакции ведущая роль принадлежит лимфоцитам (МеНэ et а1., 1998). Пролонгацию аллергического воспаления при БА связывают с усилением выживаемости Т-лимфоцитов и утратой ими способности к апоптозу (Шапорова, 2003), что проявляется в замедлении процессов фрагментации ДНК этих клеток (\^по1а, 2000; МеНв е! а1., 1998).

В терапии АБА широкое распространение получило применение ингаляционных глюкокортикоидов (ГК), в том числе дексаметазона. Убедительно доказана способность ГК индуцировать апоптоз (МеаЬег, 1996). Следовательно, способность ГК индуцировать апоптоз клеток, инфильтрующих бронхиальное дерево при АБА, может являться одним из факторов, обусловливающим их клиническую эффективность. Поскольку целенаправленная индукция или ингибиция апоптоза — идеальный путь лечения некоторых патологических состояний, развитие исследований в данном направлении необходимо считать высокоприоритетным.

По мнению Мамонтова (Мамонтова, 2005) проблема апоптоза лимфоидных клеток при атопической аллергии актуальна для дальнейшего исследования и применения, так как в настоящее время нет общепринятого мнения по поводу механизма нарушения регуляции апоптоза лимфоцитов.

Таким образом, целью данной работы явилась характеристика биохимических и морфологических признаков процесса апоптоза лимфоцитов 6 при атопической бронхиальной астме. В связи с этими нами были поставлены следующие задачи;

1- Провести цитогенетической анализ форменных элементов крови у больных астмой с различной степенью тяжести.

2- Изучить динамику роста форменных элементов клеток in vivo и in vitro, на примере сравнительного анализа роста лимфоцитов периферической крови у больных астмой с различной степенью тяжести.

3-Провести сравнительный анализ морфологии выделенных лимфоцитов условно здоровых доноров и больных астмой методом трансмиссионной электронной и световой микроскопии.

4- Изучить биохимические особенности апоптоза: а. оценить степень деградации ДНК лимфоцитов выделенных из периферической крови электрофоретическим методом (фрагментация ДНК).

Б. определить уровень спонтанного и дексаметазон-индуцированного апоптоза лимфоцитов на ранней и поздней стадии, методом проточной цитофлюорометрии, используя в качестве маркеров уровень митохондриального потенциала, экспрессию фосфатидилсерина и включение пропидиум иодида.

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Водунон Сирил Джуниор Алоде

выводы

1-Установлена обратная корреляционная зависимость между количеством лимфоцитов периферической крови и степенью тяжести заболевания in vivo.

2-Степень нарушения ультраструктуры лимфоцитов коррелирует с тяжестью астмы.

3-Степень нарушения апоптоза лимфоцитов отражает степень тяжести заболевания: а/ у больных легкой и средней персистирующей астмой на фоне торможения апоптоза повышается количество пролиферирующих лимфоцитов (отмечается лимфопролиферативный эффект ). б/ для лимфоцитов больных тяжелой персистирующей астмой характерно нарушение клеточного деления лимфоцитов (митотической активвности).

4- Начальные этапы апоптоза, выраженные через взаимосвязь между числом клеток со сниженным митохондриальным потенциалом и экспрессией фосфатидилсерина на поверхности Т-лимфоцитов не претерпевают серьезных отличий как при спонтанном, так и индуцированном апоптозе в норме и при атопической бронхиальной астме.

5-Нарушения апоптоза связаны с заключительным этапом, пройсходящем в ядре. У больных с тяжелой персистирующей астмой апоптоза идет по пути программированного некроза.

6- Высокое число эритроцитов с микроядрами, коррелирующее с тяжестью астмы, свидетельвует о сильном прессинге эндомутагенов на геном форменных элементов крови (в частности эритроцитов).

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Водунон Сирил Джуниор Алоде, Казань

1. Барышников, А.Ю. Программированная клеточная смерть (апоптоз) / А.Ю. Барышников, Ю.В. Шишкин. // Российский онкологический журнал. — 1996. -№1. -С.58-60.

2. Белушкина, И.И. Молекулярные основы патологии апоптоза / И.И. Белушкина, С.Е. Северин. // Архивы патологии. — 2001 — Т.63 С.51-60.

3. Бережков, Н.В. Апоптоз — управляемая смерть клетки. / Н.В. Бережков. // Архивы анатомии, гистологии и эмбриологии. -1990. -Т.99. — С.68-75.

4. Бигалиев, А.Б. Цитогенетический мониторинг населения из экологически неблагополучных районов / А.Б. Бигалиев, Э.В. Краус. // Цитология-генетика. -1992. -Т.26. -№ 1. -С.64-66.

5. Бойчук, C.B. Механизмы дексаметазон-индуцированного апоптоза лимфоцитов при Атопической Бронхиальной Астме / С.В.Бойчук, И.Г.Мустафин, P.C. Фассахов. //Пульмонология.-2003. №1. -С.10-16.

6. Бойчук, C.B. Спонтанный и глюкокортико-идиндуцированный апоптоз лимфоцитов больных атопической бронхиальной астмой: роль ми тохондрий и CD 95(АРО-1) / C.B. Бойчук, И.Г. Мустафин, P.C. Фассахов, Д.В. Терещенко. // Аллергология. -2002. -№ 1. -С. 13-20.

7. Бойчук, СВ. Fas-рецептор и его роль при атопических заболеваниях /C.B. Бойчук, И.Г. Мустафин. // Иммунология. 2001. -№3. - С. 24-28.

8. Бориляк, I.P. Бюлопчна шдукщя та дозимотр1я за частотою нестабшьних аберацш хромосом у л1мфоцитов людини / 1.Р.Бориляк, Е.А. Дьомша. // Цитология и генетика. -2004. -Т-38. -№ 1. -С.72-85.

9. Варга, О.Ю. Влияние метилпреднизолона и циклофосфана in vitro на активность апоптоза лимфоцитов периферической крови при системной красной волчанке / О.Ю. Варга. // Ревматология. 2007. -Т.8. -С.518-525.

10. Владимирская, Е.Б. Апоптоз и его роль в развитии опухолевого роста / Е.Б. Владимирская, A.A. Масчан, А.Г. Румянцев. // Гематология и трансфузиология. 1997. -Т.42. - С.4-9.

11. Владимирская, Е.Б. Механизмы апоптотической смерти клеток / Е.Б. Владимирская. //Гематол. и трансфузиол. 2002. -№2. -С.35-40.

12. Гавалов, С.М. Морфоцитометрические характеристики ядер лимфоцитов и степень тяжести бронхиальной астмы (сравнительное исследование) / С.М. Гавалов, Ж.К. Мамоян, Н.Т. Ясакова, И.В. Белан. // Аллергология. -2001. -№4. -С.60-65.

13. Герасимов, С. В. Пероксидна оксидащя лщцв та антиоксидантний захист при бронх1альнш астм1 / С. В. Герасимов. // Укр. медичн. часопис. -2000.- Т. 2, -№ 1. — С. 86-94.

14. Глазко, Т.Т. Микроядерный тест у великих та др1бных ссавщх / Т.Т. Глазко, O.A. Ковальова, Л.П. Якименко. // Bich.DAY. -2003. -№ 2. -С-77-85.

15. Глобальная стратегия лечения и профилактики бронхиальной астмы. Пересмотр 2002 г.- Пер.с анг. под ред. А.Г.Чучалина. М.: Атмосфера, 2002.-160 с.

16. Григорьев М.Ю. Апоптоз в норме и патологии / М.Ю. Григорьев, E.H. Имянитов, К.П. Хансон. // Медицинский академический журнал. -2003. -№3. -С.3-11.

17. Джербашьян, А.Р. Апоптоз и деградация ДНК: теория отражения физиологического состояния организма в деградированности ДНК / А.Р Джербашьян, P.A. Захарян, П.А. Казарян, С.Н. Симонян, К.Г. Карагезян. // ДНАН Армении. -2002. -Т. 100. -Nl. -С.60-63.

18. Дудич, Е.И. Изучение апоптоза раковых клеток, индуцированного фетопротеином / Е.И. Дудич, Л.Н. Семенкова, И.В. Дудич. // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. —2000. -Т. 130. -С.604-612.

19. Егорова, А.Б. Повреждение цитоскелета и клеточных мембран при апоптозе / А.Б. Егорова, Ю.А. Успенски. // Успехи современной биологии. -2001.-Т.121. -№5. -С.502-510.

20. Залесский, В.Н. Методы ранней диагностики апоптоза in vitro и in vivo для оценки хронических эффектов токсикантов. / В.Н. Залесский, Н.В. Великая. // Современные проблемы токсикологии: Науч.- практ. журн. 2006. - №1. -С.78-82.

21. Зарецкая, А.И. электронно-микроскопический анализ апоптоза рака прямой кишки до и после облучения. / А.И. Зарецкая. / Арх. Пат. -1988. -Т.50. -№1. -С.46-52.

22. Захаров, В.М. Здоровье среды: методика оценки. / В.М. Захаров, A.C. Баранов, А,С. Борисов и др. // Эко л .экспертиза. -2001. -№5. -С.103-116.

23. Иващенко, Т.Э. Методы молекулярной диагностики генных болезней / Т.Э Иващенко, М.В Асеев, В.С Баранов. // Медицинские лабораторные технологии и диагностика. Интериедика. Ст-Петербург. -1999. -№2. -С.603-617.

24. Ильинский, H.H. Микроядерный анализ и цитогенетическая нестабильность / Н.Н Ильинский, В.В Новицкий, Н.Н Ванчугова, И.Н Ильинских. // Томск. ТГУ. 1992. - 272 с.

25. Илющенко, В.Г. Классификация спонтанной генотипической клеточной адаптации / В.Г. Илющенко // Цитология и генетика. -2002. -Т-36, -№5. -С.34-42.

26. Казначеев, К.С. Апоптоз клеток-мигрантов кожи у детей с атопическим дерматитом на фоне применениия крема «Скин-Кап»./ -К.С. Казначеев, Л.Ф. Казначеева, A.B. Молокова. // «Аллергология». 2006 .- № 3. -С.7-11.

27. Каладзе, Н. Н. Показатели апоптоза и их динамика в процессе санаторного лечения у детей, болеющих бронхиальной астмой / Н. Н. Каладзе, С. В. Тришина, 3. 3. Аметшаева. // Украйнский пульмонологический журнал. -2004. -№3. -С.23-29.

28. Ковалева, O.A. Цитогенетические аномалии в соматических клетках млекопитающих/ О.А Ковалева. // Цитология и Генетика. -2008. -№1.- С-58-72.

29. Ковальчук, Л.В. CD4/CD25 иммунорегуляторные Т-лимфоциты человека ex vivo и in vitro в норме и при патологи / Л.В. Ковальчук, С.А. Павлюж. // Микробиология, эпидемиологии и иммунологии. -2002. -№5. -С.40-45.

30. Коган, Е.А. Некроз. Лекции по общей патологической анатомии / Под. Ред. В .В. Серова, М.А. Пальцева//М: Медицина. -1996. С.78-90.

31. Колесникова, Н. В. Ранние и отдаленные эффекты влияния экзогенного гидрокортизона на систему нейтрофильных гранулоцитов лабораторных мышей / Н.В. Колесникова, И. В. Нестерова, Г.Ф. Чудилова. // Гематология и трансфузиология. -1999. -№ 5. С.36-40.

32. Колотова, Т.Ю. Влияние процесса транскрипции на образование двойных разрывов при высокомолекулярной фрагментации ДНК/ Т.Ю. Колотова // Анали мечниковського Институту. 2005. -№1. -С.75-83.

33. Коновалова, E.H. Апоптоз и межклеточные взаимодействия при бронхиальной астме и хроническом обструктивном бронхите / Е.Н Коновалова. //Автореф. дис. . канд. мед. наук. —Владивосток- 2001.

34. Кузнецова, Л. В. Содержание цитокинов в сыворотке крови больных бронхиальной астмой при различной степени тяжести / Л. В. Кузнецова, А. М. Пилецкий, Л. С Осипова и др. // Матер. I зЧзду алерголопв Украши. -К. -2002. -С. 85-86.

35. Кунгуров, Н.В. Атопический дерматит. Типы течения, принципы терапии / Н.В. Кунгуров, Н.М. Герасимова, М.М. Кохан // Екатеринбург, 2000.-272 с.

36. Курбанов, P.A. Аутоантитела к нативной ДНК при атопической бронхиальной астме у детей. / Р.А.Курбанов, З.И.Абрамова, В.Н Цибулькина, Г.М Зайнетдинова. // Казанский медицинский журнал. 2007. - Т. 88. - № 3. — С. 224-228.

37. Латышева, Т. В. Иммунотропные препараты в комплексной терапии больных с тяжелой формой бронхиальной астмы. / Т. В. Латышева. О. В. Романова. //Иммунология. -2008.

38. Ленская, Л.Г. Анализ прямых медицинских затрат на лечение бронхиальной астмы в Томсткой области / Л.Г. Ленская, Л.М. Огородова, М.В. Малаховская. //Пульмонология. -2004. -№4.-Р.37-43.

39. Мамонтова, Т.В. Новые аспекты апоптоза мононуклеарных клеток в патогенезе атопической бронхиальной астмы/ Т.В. Мамонтова, И.П. Кайдашев. // Аллергология. -2005. -№4. -С. 15-23.

40. Манских, В.Н. Морфологические методы верификации и количественной оценки апоптоза / В.Н. Манских. // Бюллетень сибирской медецины. -2004.-№ 1. -С.1-2.

41. Манских, В.Н. Пути гибели клетки и их биологическое значение/ В.Н. Манских//Цитолигия. -2007. -Т.49. -№11. -С.909-915.

42. Митин, Ю.А. Морфологические изменения ядер лимфоцитов и деградация нуклеотидов при ВИЧ- инфекции./ Ю.А. Митин, Е.И. Змушко. // 5-ая Международная конференция. -1997.

43. Михайлов, В.М. Ультраструктурный и морфологический анализ стадий апоптоза кардиомиоцитов мышей MDX / В.М.Михайлов. / Цитология. -2001. -Т.43. -№8. -С.729-735.

44. Монахов, A.C. Раннее выявление опухолевых заболеваний по цитогенетическим критериям, определяемым в лимфоцитах периферической крови (напримере рака желудочно-кишечного тракта у человека) // Вопр. онкологии. -2001. -Т-47. -№ 4. -С.401-407.

45. Москалева, Е.Ю. Возможные механизмы адаптации клетки к повреждениям, индуцирующим программированную гибель, связь с патологией / Е.Ю. Москалева, С.Е. Северин. // Патологическая физиология и экспериментальная терапия. 2006. -№2. -С.2-16.

46. Невзорова, В. А. Апоптоз и воспаление при бронхиальной астме. / В. А. Невзорова, Т. Н.Суворенко, Е. Н. Коновалова. // Терапевт, архив. -2001. -№ 12.-С.92-96.

47. Никонова М.Ф. Апоптоз и пролиферация клеток как альтернативные формы ответа Т лимфоцитов на стимуляцию / М.Ф. Никонова, М.М.Литвина, М.И.Варфоломеева и др. // Иммунология. -1999. -№11. -С.20-23

48. Новиков, B.C. Программированная клеточная гибель. / B.C. Новиков, О.П. Уханова, С.З. Чуков, и др. // Наука.- СПб. -1996. №3. - С.161-164.

49. Овсянников, Н.В. Оценка уровня контроля бронхиальной астмы в практике участкового терапевта/ Н.В. Овсянников, И.В. Багишева, Л.В.Сердюк, С.Г.Суворова, Т.М. //Пульмонология. -2007. -№1. -С.100-105

50. Онищенко, Г.Е. Варианты программированной гибели клеток / Г.Е. Онищенко, Е. Александрова. // Доклады РАН. 2004. -С.399:507-509.

51. Павлов, А. В. Плоидность микронуклеированных тимоцитов, индуцированных введением метилнитрозомочевины / А. В.Павлов, А. Н.Гансбургский, М. А. Гансбургский // Бюл. эксперим. биол. мед. -2005. -Т. 140. -№12. -С.695-697.

52. Пинегин, Б. В. Полиоксидоний — новое поколение иммуномодуляторов с известной структурой и механизмом действия / Б. В. Пинегин // Аллергия, астма и клиническая иммунология. -2000. -№1. -С.27-28.

53. Погорелов, В.М. Морфология апоптоза при нормальном и патологическом гемопоэзе / В.М. Погорелов, Г.И. Козинец // Гематология и трансфузиология. 1995. -Т. 40. - № 5. - С. 21-25.

54. Проскуряков, С. Я. Некроз-активная, управляемая форма программируемой клеточной гибели / С. Я. Проскуряков, В. Л. Габай, А. Г. Конопляников. // Биохимия. -2002. -Т.67. -№4. -С.467-491.

55. Проскуряков, С .Я. Иммунология некроза и апоптоза / С .Я Проскуряков, В.П Гавай, А.Г Коноплянников. // Биохимия. -2005. -Т.70. -№42. -С.1593-1605.

56. Райкис, Б.Н. Современные взгляды на иммунологические механизмы формирования и течения Бронхиальной астмы у взрослых. / Б.Н.Райкис, М.Н.Гогуева. // Аллергология. -2006. -№3. -С.47-50.

57. Райхлин, Н.Т. Регуляция и проявления апоптоза в физиологических условиях и в опухолях / Н.Т. Райхлин, А.Н. Райхлин. // Вопросы онкологии.-2002. -Т.48. -С.159-171.

58. Рапопорт, Е. М. Участие сиалосвязывающих макрофагальных лектинов в фагоцитозе апоптотических телец / Е. М. Рапопорт, Ю. Б. Сапотько, Г. В. Пазынина, и др. //Биохимия. -2005. -Т.70. №3. -С.406-415.

59. Ревякина, В.А. Аллергические болезни у детей в Российской Федерации/ В.А Ревякина. // В сб. тезисов II Всеросс. конгресса по детской аллергологии. -М. -2003. 170с.

60. Романова, Е.П. Первичный скрининг людей, подвергающихся хроническому облучению в малых дозах / Е.П Романов, Л.К Бездробная, И.П

61. Дрозд. // Проблемы радиационной генетики на рубеже веков:Тез. докл. Международ. конф.-Ереван.-2000.-315с.

62. Сепиашвили, Р.И. Апоптоз в иммунологических процессах. / Р.И. Сепиашвили, М.Г. Шубич. // Аллергология и иммунология. -2000. -№1. -С. 1523.

63. Скорова, C.B. Влияние иммунологических реакций организма на частоту структурных мутаций хромосом /C.B. Скорова// Автореф.дис. .канд.биол.наук.-Новосибирск, 1982.-24с

64. Скороход, H. I. Корекщя метабол1чних процес1в у хворих на бронх1альну астму: вшьнорадикальш аспекта / H. I Скороход // Практична медицина.- 1998. № 5-6. - С.76-79.

65. Сорока, Н.Ф. Влияние иммуносупрессивных лекарсвенных препаратов на апоптоз лимфоцитов больных системной красной волчанкой in vitro / Н.Ф. Сорока, А.И. Свирновский, A.JI. Рекун // научно-пратичнеская ревматология. -2007. -№1. -С-15-21.

66. Треумова, С И. Антиоксидантная обеспеченность и перекисное окисление липидов у больных бронхиальной астмой/ С И Треумова // Лпсарська справа. -1997. -№ 6. -С.76-77.

67. Фридлянская, И.И. Индукция апоптоза в клетках мышиной миеломы NSO/1, трансформированной геном основного белка теплового шока / И.И. Фридлянская, О.Н. Демидов, М.М. Булатов. // Цитология.-2000. -Т.42. -С. 10531509.

68. Хейфиц, Л.Б. Разделение форменных элементов крови человека в градиенте плотности верографин-фиколл / Л.Б. Хейфиц, В.А. Абалкин // Лабораторное дело. -1973. -№10. -С.579-581.

69. Худолей, В. В. Канцерогены: характеристики, закономерности, механизмы действия. / В.В. Худолей. // СПб.: НИИ химии СПбГУ. -1999. 419с.

70. Цой, А.Н.Эффективность Симбикорта в реальной клинической практике: результаты Российского национального исследования/ А.Н. Цой, В.В. Архипов, Е.В.Гавришина. //Пульмонология. -2006. -№2. -С.60-66

71. Чернушенко, Е.Ф. Актуальные проблемы иммунология / Е.Ф. Чернушенко // Украйнский пульмонологический журнал. -2003. -№2 -С.94-96.

72. Чернушенко, К.Ф. 1мунопатогенез брошаально1 астми / К.Ф. Чернушенко. / Нова медицина. -2003. -Т.6. -№ 1. С. 18-21.

73. Чернюк, Н. В. Тнтерлейкши та асощацш акроцентричних хромосом як ¡муноцитогенетичш параметри важкосп переб1гу броюаально1 астми / Н. В. Чернюк // Укр. мед. альманах. -2001. № 1. -С. 179-182.

74. Шапорова, Н.Л. Бронхиальная астма тяжелого течение / Н.Л. Шапорова, М.А, Петрова, В.И. Трофимов. //Пульмонология. -2003. -№6. С.108-113.

75. Шигина, Ю. Качество жизни. / Ю. Шигина. //Профилактика. -2004. -№ 6 (www.profilaktika.ru).

76. Широкова, А.В. Апоптоз.сигнальные пути и изменение ионного водного баланса клетки/ А.В Широкова. // Цитология. -2007. -Т.49. -№ 5. -С.385-394.

77. Ярилин, А. А. Система цитокинов и принципы ее функционирования в норме и при патологии / А. А Ярилин. // Иммунология. -1997. -№ 5. -С.7-13.

78. Ярилин, А.А. Апоптоз: природа феномена и его роль в норме и при патологии /А. А Ярилин // Актуальные проблемы патофизиологии. Под ред. Б.Б.Мороза. М.: Медицина. -2001. -С. 13-56.

79. Яшина, Л. О. Важлив1 питания д1агностики терапи бронх1ально1 астми / Л. О. Яшина. // Нова медицина.-2003. -Т.6. -№ 1. С.10-17.

80. Ali, F.M. A two-step procedure for obtaining normal peripheral blood T-lymphocytes using continuous equilibrium density gradient centrifugation on percoll / F.M.Ali. A.May. G.D.McLaren et al. // J Immunol Methods. -1982.-V.12. -P. 185191.

81. Antoneeva, I.I. Differentiation and activation-associated markers of peripheral blood lymphocytes in the patients with ovarian in the course of tumor progression / I.I. Antoneeva. / Медицинская иммунология. -2007. -T.9. -№ 6.-C.649-652.

82. Aoki, H. Direct activation of mitochondrial apoptosis machinery by c-Jun N-terminal kinase in adult cardiac myocytes / H. Aoki, P.M. Kang, J. Hampe., et al., // J. Biol. Chem. -2002. -T.277. -C. 10244-10250.

83. Arends, MJ. Apoptosis. The role of the endonuclease. / MJ Arends, RG Morris, AH Wyllie // Am J Pathol.-1990. -T. 136. -C.593-608.

84. Bar, P.R. Apoptosis-the cell's silent exit / P.R. Bar. // Life Sci. -1996.-V.59. -C.369-378.

85. Barke, RA. The role of programmed cell death (apoptosis) in thymic involution following sepsis. / R.A. Barke, S Roy, R.B Chapin, R Charboneau. // Arch Surg. -1994 Dec; 129(12):1256-61; discussion 1261-2.

86. Basnakian, A.G. DNA & Cell. Biol. / A.G. Basnakian., S. James // J Res. -1996. -T.15.-C. 255-262.

87. Bauer, G. Reactive oxygen and nitrogen species: Efficient, selective, and interactive signals during intercellular induction of apoptosis/ G. Bauer // Anticancer Res . -2000. -T. 20. -C.4115-4139.

88. Beere, H.M. <The stress of dying>: the role of heat shoke proteins in the regulation of apoptosis/ H.M. Beere. // J. Cell Sci. -2004. -T.l 17. -C.2641-2651.

89. Bernardi, P. A. Mitochondrial perspective on cell death. / P. Bemardi, V. Petronilli, Di Lisa F, M. Forte. // Trends Biochem. -2001. -T.26. -C-112-117.

90. Bessis, M. Blood Smears Reinterpreted/ M. Bessis // Springer Inter. -1977. -P.146-147.

91. Brown, D. Dexametasone-induced apoptosis involves cleavage of DNA to large fragments prior to internucleosomal fragmentation / D. Brown, S.G. Cohen. // J. Biol.Chem. -1993. -V.268. -P.3037-3039.

92. Busse, W.W. Asthma / W.W. Busse, R.F. lemanske. // NEJM.-2001. -V.344.-№.5. -P.350-362.

93. Cameron, L. Curr. Allergy Asthma. / L. Cameron., Q.Hamid. // Rep.-2001. -Vol.1.-P. 153-163.

94. Carmen, M.M. Membrane microparticles from circulating and vascular cell in regulating vascular function. / M.M. Carmen, A.Tesse, .F. Zobairi. // J. Heart and circulatory physiology. -2005. -№-4. -P.288-292.

95. Castedo, M. The cell cycle checkpoint kinase Chk2 is a negative regulator of mitotic catastrophe / J.Z. Perfettini, T. Roumier, K. Andreau, et al. // Oncogene. -2004. -T. 23. -P.2825-2837.

96. Chan, M. Diffi cult-to-control asthma: clinical characteristics of steroid-insensitive asthma / M. Chan, D. Leung, S. Szefler, J. Spahn. // Allergy Clin. Immunol. -1998. -V. 101. -P.594-601.

97. Chertin, B. The role of nitric oxide in reflux nephropathy. / B. Chertin, U. Rolle Tarkas, P. Puri. // Pediatr Surg Int.- 2002. -T.18. -C. 630-634.

98. Christensen, M.D. Enhanced gene expression of CGRP and GAP-43 in dorsal root ganglia by spinal hemisection. / S.C Supowit, D.J DiPetter, C.E. Halsebosch. // J. Neurotrauma. -1996. -№13. -602c.

99. Chung, C.S. Inhibition of Fas signaling prevents hepatic injury and improves organ blood flow during sepsis. / C.S. Chung, S. Yang, G.Y. Song, et al. // Surgery. -2001. T.130. -№2. -C.339-345.

100. Degenhardt, K. Autophagy promotes tumor cell survival and restricts necrosis, inflammation, and tumorigenesis. / K. Degenhardt, R. Mathew, B. Beaudoin, K. Bray,et al. //Elsevier,cancer.Cell. -2006. -V.10-. №1. -P.51-64.

101. Di Leonardo, A. DNA damage triggers a prolonged p53-dependent G1 arrest and long-term induction of Cipl in normal human fibroblasts. / A. Di Leonardo, S.K. Linke, et al. // Genes Dev. -1994. -Vol.8. -C.2540-2551.

102. Druilhe, A. Apoptosis, proliferation, and expression of Bcl-2, Fas, and Fas ligand in bronchial biopsies from asthmatics // A Druilhe, B Wallaert, A Tsicopoulos. //Am. J. Respir. Cell. Mol. Biol. -1998. -Vol.19. -№5. -P.747-757.

103. Edinger, A.Z. Death by design: apoptosis, necrosis, and autophagy Curr. Opin / A.Z Edinger, C. Thompson. // Cell Biol. -2004. -T.16. -C.663-669.

104. Elias, L. Induction of differentiation by tumour necrosis factor in HL-60 cells is associated with the formation of large DNA fragments / L. Elias, C. Berry. // Leukemia. -1991. -V.5. -P.879-885.

105. Fadok, V.A. Exposure of phosphatidilserine on the surface of apoptotic lymphocytes triggered specific recognition and removal by macrophages / V.A. Fadok, D.R. Voelker, P.A.Champbel et al. // J.Immunol. -1992. -T.48. -№15. -P.2207-2216.

106. Feucht, HE. Efficient separation of human T lymphocytes from venous blood using PVP-coated colloidal silica particles (percoll) / H.E Feucht, M.R Hadam, F. Frank, G Riethmuller. // J Immunol Methods. -1980. -V.38. -P.43-51.

107. Flames, P. Mechanisms of action of glucocrticoids in asthma/P. Flames. // Am. J. Respir. Crit. Care Med. -1996. -Vol.154. -№ 2, Suppl.-P.S21-S27.

108. Gall, E.A. A previously undescribed granule within the lymphocyte / E.A. Gall //Amer.J.Med. Sci. -1936. -V.191. -P.380.

109. Gozuacik, D. Autophagy as a cell death and tumor suppressor mechanism / D Gozuacik, A. Kimchi // Oncogene. -2004. -T.23. -C.2891-2906.

110. Green, D.R. Mitochondrial and apoptosis // D.R Green, J.C Reed. // Science. -1998. -T.281. -C.1309-1312.

111. Greenberg, A.H. Activation of apoptosis pathways by granzyme B / A.H. Greenberg // Cell Death Differ. -1996. -V.3. -P.269-274.

112. Hait, W. N. A matter of life or death (or both): understanding autophagy in cancer / W.N. Hait, S. Jin, J. Yang. // Clin. Cancer Res. -2006. -T.12 .-C.1961-1965.

113. Hannun, Y.A. Ceramide in the eukaryotic stress response / Y.A Hannun, C. LubertoTrends // Cell Biol. -2000. -V.10. -P.73-80.

114. Haupt, S. Apoptosis -the p-53 network / S Haupt, M Berger, Z Goldberg //.J. Cell Sci. -2003. -T.116. -C. 4077-4085.

115. Heddle, J. A. A rapid in vivo test for chromosomal damage / J. A. Heddle // Mutat. Res. -1973. -T. 18. -P. 187.

116. Heddle, J. A. Chromosomal aberrations and bone marrow toxicity. / J.A. Heddle, M.F. Salamone. // Journal of Applied Toxicology. -2006. -V.8. -№ 2,- C.141 144.

117. Ho, P. K. Mammalian initiator apoptotic caspases. / P. K. Ho, C. J Hawkins. // FEBS J-.2005. -V.272. -C.5436-5453.

118. Hortelano, S. Nitric oxide induces tyro-sine nitration and release of cytochrome C preceding an increase of mitochondrial transmembrane potential in macrophages. / S. Hortelano, A.M. Alvarez, L. Bosca // FASEB J- 1999. -T.13. -C.2311-2317.

119. Imyanitov, E.N. Mechanisms of lung cancer / E.N Imyanitov, E.Sh Kuligina, E.V. Belogubova et al. // Drug Discov. Today: Dis. Mech. 2005a. -№ 2.- PP.213223.

120. Jaattela, M. Multiple cell death pathways as regulators of tumour initiation and progression/ M. Jaattela. // Oncogene. -2004. -V.23. -P.2746-2756.

121. James, S.J. Mechanisms of cancer / S.J. L. James, B.J. Miller A.G Basnakian et al. //Carcinogenesis. -1997. -T.18. -C.287-293.

122. Jeschke, M.G. Cell proliferation, apoptosis, NF-kappaB expression, enzyme, protein, and weight changes in livers of burned rats. / M.G. Jeschke, J.F.Low, M. Spies, et al. // Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. -2001.-V.280. -№6. -P. 13141320.

123. Johnson, M. Interactions between corticosteroids and agonists in asthma and Chronic Obstructive Pulmonary Disease/ M. Johnson // Am. J. Respir. Crit Care Med. -1998. -P.146-153.

124. Kando, Y. The role of autophagy in cancer development and response to therapy / Y. Kando, T. Kanzawa, R Sawaya, S Kondo // Nat. Rev. Cancer. -2005. -№5. -C.726—734.

125. Kastan, M.B. Cell-cycle checkpoints and cancer./ M.B Kastan., J Bartek // Nature. -2004. -V.432. -C.316-323.

126. Kaufmann, S. H. Induction of apoptosis by cancer chemoterapiy / S. H. Kaufmann, W.C. Earnshaw. // Exp. cell Res. -2000. -V. 256. -C.42-49.

127. Kobayashi, S. An alternative inhibitor overcomes resistance caused by a mutation of the epidermal growth factor receptor / S Kobayashi. H, Ji., Y Yuza et al. // Cancer Res. 2005. -T. 65. -C.7096-7101.

128. Krammer, P. CD95 s deadly mission in the immune system / P. Krammer. // Nature. -2000. -V.407. -P.789-795.

129. Krieser, R. J. Engulfment mechanism of apoptotic cells / R. J Krieser, K White. // Curr. Opin. Cell Biol. -2002. -T.14. -C.734-738.

130. Kroemer, G. Mithochondrial control of apoptosis / G. Kroemer, N. Zamzani, S. Susin//Immunol. Today. 1997. -T.18. -N.l. -P.44-51.

131. Leung, D. Pathogenesis of atopic dermatitis // J. Allergy Clin. Immunol.- 1999. -Vol.104. -P. 99-108.

132. Levine, B. Autophagy in cell death: an innocent convict? / B. Levine, J. Yuan. // J. Clin. Investig. -2005. -V.115. -C.2679-2688.

133. Levine, B. Development by self-digestion: molecular machanisms and biological functions of autophagy / B. Levine, D.J. Klionsky. // Develop. Cell. -2004. -№ 6. —C.463-477.

134. Levine, B. Eating oneself and uninvited guests: autophagy related pathways in cellular defense. / B. Levine // Cell. -2005. -T.120. -C. 159-162.

135. Li J. The role of nitric oxide in apoptosis. / J. Li., T.R. Bittiar. // Semin Perinatol. 2000. -T.24. -C.46-50.

136. Li, G.L., Apoptosis and expression of Bcl-2 after compression trauma to rat spinal cord. / G.L. Li, M Farooque, A. Holtz, Y. Olsson. // Acta Neuropathol. (Berl). -1999. -T. 98. -C.473-480.

137. Li, J. A phenotyping approach to predict systemic exposure to EGFR tyrosine kinase inhibitors СУРЗ/ J. Li, M.O. Karlsson, J. Brahmer et al. // J. Natl. Cancer Inst. 2006. -T.98. —C.1714-1723.

138. Liaudet, L. Biology of nitric oxide signaling. / L. Liaude, F.G. Soriano, C. Szabo // Crit Care Med. -2000. -№28. -C.37-52.

139. Liu, X.Z. Neuronal and Glial Apoptosis after Traumatic Spinal Cord Injury. / X.Z. Liu, X.M. Xu, R. Hu, et al. // J. Neurosci. -1997. -V.17. -P.5395-5406.

140. Lockshin, R.A. Apoptosis, autophagy, and more. / R.A. Lockshin, Z. Zakeri // IJBCB. -2004. -T.36. -C.2405-2419.

141. Maeno, E. Normotonic cell shrinkage because of disordered volume regulations an early prerequisite to apoptosis /Е. Maeno, Y. Ishizak, A Hazama, Y Okada // Prod. Nat. Acad. Sci.USA. -2000. -Vol.97. -C.9487-9492.

142. Majino, G. Apoptosis, oncosis and necrosis. An overview of cell death // G . Majino, I. Joris. // J. Pathol. -1995. -Vol.146. -№.1. -P3-15.

143. Mannick, J.B. Fas-induced caspase denitrosylation / J.B Mannick, A Hausladen, L Liu. et al. // Science . -1999. -T.284. -C.651-654.

144. Marcel, Leist. Альтернативные пути запрограммированной гибели. / L.Marcel, J.Marja. // Nature Reviews Molecular Cell Biology. -2001. -V.2. -C.589-598.

145. Marsik, C. Regulation of Fas (APO-1, CD95) and Fas ligand expression in leukocytes during systemic inflammation in humans / C. Marsik, T. Halama, F. Cardona, et al. // Shock. -2003. -T.20. -№6. -C.493-496.

146. McCarthy, J.V. Cell shrinkage and apoptosis: a role for potassium and sodium ion efflux / J.V. McCarthy, T.G. Cotter// Cell Death Differ. -1997. -V.7. -C.756-770.

147. Meacher, L.Opposing effects of glucocorticoids on the rate of apoptosis in neutrophilic and eosinofilic granulocytes / L. Meacher, J. Cousin, J. Seckl // J. Immunol. -1996. -P.4422-4428.

148. Medema, J.P. Cleavage of FLICE ( caspase-8) by granzyme В during cytotoxic T lymphocyte-induced apoptosis / J.P Medema, R.E Toes, С Scaffidi et al // Eur.J. Immunol. -V.27. -P.3492-3498.

149. Meijer, A. J. Regulation and role of autophagy in mammalian cells. / A. J. Meijer, P. Codogno //. IJBCB.-2004. -T.36. -C.2445-2462.

150. Melis M. Effects of zafirlukast on peripheral-blud-limphocyte (PBL) apoptosis in asthma / M.Melis, A.Siena, A. Vignola (eds.) //In: of Europ. Respir Sciety. Annual Congress, Berlin.- 1997.

151. Melis M. Fluticasone propionate induces apoptosis in on peripheral- blud-limphocyte (PBL) isolated from normal and asthmatic pacients/ M. Melis, A.Siena, A. Vignola (eds.) //In: of Europ. Respir Sciety. Annual Congress, Berlin.- 1998.

152. Metivier, D.Cytofluorometric detection of mitochondrial alteractions in early CD 95 / Fas/ Apol-triggered apoptosis. / D .Metivier., B Dalaporta. N Zanzami // Immunol. Lett. -1998. -V-61. -№ 9. -P-157-163.

153. Mirkovitch, J. Organization of the higher order chromatin loops: specific DNA attachment site on nuclear scaffold / J Mirkovitch, M.E Mirault, U.K Laemmli. // Cell. -1984. -Vol.39. -P.223-232.

154. Murphy, FJ. Targeting inflammatory diseases via apoptotic mechanisms / FJ. Murphy, I. Hayes, T.G. Cotter. // Curr Opin Pharmacol. -2003.Aug;-T.3. -№4. -C.412-419.

155. Morgan, W. DNA double-srand breaks, xpomosomal rearrangements, and genomic instability / W.F. Morgan, J. Corcoran, A. Hartmann, et al // Mutat. Res. -1998.-V.31. -C.316-326.

156. Nagata, S. degradation of chromosomal DNA during apoptosis. / Nagata S, H. Nagase, K. Kawane et al. // Cell death Differ. -2003. -T.10. -C.108-116.

157. Nicoletti, I. Rapid and simple method of measurement of nuclear apoptosis. Nicoletti I, Migliorati G. //Immunol. Meth.-1991.-№4.-P. 271-279.

158. Nigg, E. A. Centrosome aberrations: cause or consequence of cancer progression? // Nat Rev Cancer. 2002. - V. 2. - № 11. -P. 815-25.

159. Nishino, I. Autophagic vacuolar myopathies/ I. Nishino. // Curr. Neu-rol. and Neurosci. Reprod. -T.2003. -T.3. -C.64-69.

160. O'Sullivan, S. Fluticasone induces T cell apoptosis in the bronchial wall of mild to moderate asthmatics / S. O'Sullivan, L. Cormican, C.M. Burke // Asthma. -2004. -V.59. -№8. -C.657-661.

161. Ogier, D.E. Authophagy: a barrier or an adaptive response to cancer. / D. E .Ogier, P. Codogno // Biochem. Biophys Acta. -2003. -T.1603. -C.l 13-128.

162. Okada, H. Pathways of apoptotic and non-apoptotic death in tumor cells. / H. Okada, T. Mak// WNat. Rev. Cancer. -2004. -№ 4. -C.592—603.

163. Patel, D. Separation of T and B lymphocytes from human peripheral blood mononuclear cells using density perturbation methods / D.Patel, C.P. Rubbi, D. Rickwood // Clin Chim Acta. -1995. -V.240. -P. 187-193.

164. Reed, J. C. Mechanisms of apoptosis/ Reed, J. C // Amer. J. Pathol. -2000. -T.157. -C.1415-1430.

165. Richard, A. Effects of severe hypertensive on endothelial and platelet microparticles // A. Richard, Jy Wencher, J. Joaguin // Hypertension. -2003. -Vol 41. -P.211.

166. Rieder, C.D. Progr. Cell Cycle / C.D. Rieder, A. Khodjakov. // J.Res. 1997. -№3. - P.301-312.

167. Roninson, I. B. If not apoptosis, then what? Treatment-induced senescence and mitotic catastrophe in tumor cells /1. B. Roninson, E. V Broude, B.D Chang. // Drug Resist. Updates. -2001. -№4. -C.303-313.

168. Rottem M. Asthma as paradigm for autoimmune desease. / M.Rottem, Y. Shoenfeld //Int. Arch. Allergy. Immunol. -2003. -132. -P.210-214.

169. Roy, S. Cross-talk in cell death signaling / S. Roy, D. Nicholson // J. Exp. Med. -2000. -T.192. -C.21-25.

170. Rusnak, J. Genesis of discrete higher order DNA fragments in apoptotic human prostatic carcinoma cells. / J. Rusnak, T.Calmels, D. Hoyt. // Mol. Pharmacol. -1996. -Vol.13.-P.191-198.

171. Russell, P., Cds25 functions as an inducer in the mitotic control of fission yeast/P. Russell, //Nurse P. Cell. -1986. -T.45. -C. 145-153.

172. Sanders, E.J. Ultrastructural identification of apoptotic nuclei using the TUNEL technique / E.J Sanders, M.A. Wride // Histochem J. -1996. -T.28. -№4. -P.275-281.

173. Savill, J. Phagocyte recognition of cells undergoing apoptosis // J Savill, V Fadok, P. Henson, C. Haslett// Immunol Today. 1993. -Vol.14. -PP.131-136.

174. Schmid, W. The micronucleus test. Mutat. /W. Schmid, // Res. -1975. -V.31.-P.9-15.

175. Sherr, С J. Cancer cell cycles / Sherr, C.J. // Science. -1996. -Vol. 274. -PP.l 672-1677.

176. Singh, V.K. Modulation of autoimmune diseases by nitric oxide / V.K Singh, S , Mehrotra, P Narayan et al.// Immunol Res. -2000. -T.22 .-C.l-19.

177. Solodilova, M.A. The impact of Pro 198 Leu polymorphism in the glutathione peroxidase-1 gene on risk of atopic asthma in males / M.A. Solodilova, V.P. Ivanov.- // Пульмонология. -2007. -№1. -C.50-54.

178. Solovyan, V. Odered nuclear DNA disintegration as a specific genome reaction accompanying apoptosis, stress responses and differentiation / V Solovyan., L. Andreev, T. Kolotova, et al. // Биополимеры и клетки .-1996.-T.12. -С.67-70.

179. Steller, H. Mechanisms and genes of cellular suicide/ H. Steller // Science. -1995. -Vol. 267. -C.1445-1449.

180. Stennicke, H.R. Caspases-controlling intracellular signals by protease zymogenactivation / H.R. Stennicke, G.S. Salven // Biochem. Biophys. Acta. -2000. -V. 1477.-P. 299-306.

181. Susin, S.A. Two distinct pathways leading to nuclear apoptosis. / S.A Susin., E Daugas., L Ravagnanet al. // J. Exp. Med . -2000. -T.192. -C.571-580.

182. Tandler, B. Improved uranyl acetate staining for electron microscopy / B. Tandler// J. Electron. Microsc. Techn. -1990. -Vol.16. -P. 1505 -1517.

183. Tisdale, M J. Biochemical mechanisms of cellular catabolism/ M.J. Tisdale // Curr Opin Clin Nutr Metab Care. -2002. -T.5.- №4. -C.401-405.

184. Torre, D. Circulating levels of FAS/APO-1 in patients with systemic inflammatory response syndrome / D. Torre, R. Tambini, M. Manfredi, et al. // Diagn Microbiol Infect Dis. -2003. -V.45. №4. -C.233-236.

185. Trautmann, A. Role of dysregulated apoptosis in atopic dermatitis. A Trautmann, M Akdis, К Blaser. // Apptosis. -2000. -V.5. -№5. -P.425-429.

186. Urboniene, D. Autoimmunity in pathogenesis of chronic obstructive pulmonary disease / D. Urboniene, R. Sakalauskas, B. Sitkauskiene // Medicina(Kaunas). 2005. - V. 41. -№3. - P.190-195.

187. Uno, H. Apoptosis / H.Uno, S. Shah // J. Lab.Clin. -1989. -V.24. Nl.-P.169-177.

188. Urazova, O.I. Apoptosis of blood lymphocytes in the patients with autoimmune thyroid disorders / O.I. Urazova, E.B. Kravets, V.V. Novitsky. // Медицинская иммунология. -2008. —T. 10. -№2-3. -С. 187-192.

189. Venable, J.H. A simplified lead citrate stain for use in electron microscopy / J.H. Venable, R.A. Coggeshall. // J. Cell Biol. -1965. -Vol.25. P.407-408.

190. Vermeulen K. Apoptosis: mechanisms and relevance in cancer./ К Vermeulen, D. R. Van Bockstaele, Z.N. Berneman // Ann. Hematol.- 2005. -T.84. -C.627-639.

191. Vignola A.M. Airway inflammation in mild intermittent and in persistent asthma / A.M. vignola, P. chanez, A.M Campbell, et al. // am J.respire crit care med. 1998. -V.157. - P.403-409.

192. Vignola, A.M. Apoptosis and airway inflammation in asthma / A.M Vignola, G. Chiappara, R. Gagliardo // Apoptosis. -2000. -V.5. -№5. -P.473-485.

193. Von Knethen A, Superoxide attenuates macrophage apoptosis by NF-kappa-B and AP-1 activation that promotes cyclooxygenase-2 expression / A Von Knethen, D Callsen, В Brune // J Immunol. -1999. -V.163. -.№5. -C.2858-2866.

194. Walker, P.R.,Caspase-dependent and independent cell death in rat hepatoma 5123tc cell. / P.R. Walker, J. Leblanc, B. Smith, et al.// Methods. -1999. -№17. -P.329-338.

195. Wan Cheng Tan (ред.).Карманное руководство по профилактике и лечению бронхиальной астмы .-М., 2006)

196. Wang, J. Inchibition of Fas-mediated apoptosis by theB-cell antigen receptor through cFLIFP/ J. Wang, A. A. Lobito, F.Shen. // Eur J Immunol.-2000.-V.30. -P.155-163.

197. Weedon, D. Apoptosis. Its nature and implications for dermatopathology / D. Weedon, J. Searl, J.F. Kerr// Am. J. Dermatopathol. -1979. V.1.-P.133-144.

198. Wijsman, J.H. A new method to detect apoptosis in paraffin sections:in situ end-labeling of fragmented DNA. / J.H. Wijsman, R.R. Jonker, R Keijzer, et al. // J.Histochem.-Cytochem. -1993. №41. -C.7-12.

199. Williams, G. T. Molecular regulation of apoptosis: genetic controls on cell death / G. T.Williams, C.A. Smith. / Cell. 1993. - V.74.- N.5. - P.777-779.

200. Woolcock, A. Steroid resistant asthma: what is the clinical definition? / A. Woolcock. // Eur. J. Respir. Dis. -1993. -V.6. -P.743-747.

201. Wyllie, A.H. Cell death: The significance of apoptosis./ A.H. Wyllie, J.F. Kerr, A.R. Currie. // Cytol. -1980. -V.68. -C. 251-306.

202. Zamora, R. Inducible nitric oxide synthase and inflammatory diseases. / R. Zamora, Y. Vodovotz, T.R. Billiar// Mol Med. -2000. -№ 6. -C.347-373.

203. Zhivotovsky, B. Involment of Ca2+ in the information of high molecular weight DNA fragments in thymocyte apoptosis/ B. Zhivotovsky, B.Cedervall, S. Jiang, P.Nicotera // Biochem. Biophys. Res Communs. 1994. - V.202. - P.120-127.