Особенности антибактериального действия дельта-эндотоксинов Bacillus thuringiensis как перспективного агента защиты растений

Левина, Татьяна Александровна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Особенности антибактериального действия дельта-эндотоксинов Bacillus thuringiensis как перспективного агента защиты растений
ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Особенности антибактериального действия дельта-эндотоксинов Bacillus thuringiensis как перспективного агента защиты растений"

На правах рукописи

ЛЕВИНА ТАТЬЯНА АЛЕКСАНДРОВНА

ОСОБЕННОСТИ АНТИБАКТЕРИАЛЬНОГО ДЕЙСТВИЯ ДЕЛЬТА-ЭНДОТОКСИНОВ BACILLUS THURINGIENSISКАК ПЕРСПЕКТИВНОГО АГЕНТА ЗАЩИТЫ РАСТЕНИЙ

Специальность: 03.00.07 - микробиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук

Казань, 2005

Работа выполнена на кафедре общей и биологической химии Государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования Ульяновский государственный университет

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор

Л.К. Каменёк

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

О.Н. Ильинская

доктор биологических наук, профессор Д.А. Васильев

Ведущая организация: Государственное образовательное учреждение

высшего профессионального образования Новосибирский государственный аграрный университет

Защита состоится « 2 » июня 2005 года в 13.00 часов на заседании диссертационного совета Д 212.081.08 при ГОУ Казанский государственный университет им. В.И. Ульянова-Ленина, 420008, г. Казань, ул. Кремлёвская, 18, ауд. 209.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке имени Н.И.Лобачевского Казанского государственного университета.

Автореферат разослан 2005 года

Учёный секретарь диссертационного

совета кандидат биологических наук, А.Н. Аскарова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. В последние десятилетия особо остро стоит проблема экологической безопасности технологий, применяемых в агропромышленном комплексе для повышения урожайности и улучшения качества продукции. Одним из решений данной проблемы является ужесточение требований к химическим препаратам и частичная замена их биологическими средствами. В России, однако, при очевидном сокращении объёмов производства пестицидов (с 215 тыс. тонн в 1985 году до 9,7 тыс. тонн в 2000 году) внедрение в сельскохозяйственную практику альтернативных технологий крайне невелико (не более 0,5% от общего объёма использования пестицидов) (Захаренко, 2003; Монастырский, 2003). Применяемые на сегодняшний день биопрепараты производятся преимущественно на основе целых культур микроорганизмов и содержат помимо действующего начала примесь спор, вегетативных клеток, токсинов, что нежелательно с экологической точки зрения. В этой связи особенно перспективно создание средств на основе выделенных и очищенных биологически активных веществ.

Одним из таких агентов являются кристаллические дельта-эндотоксины, продуцируемые аэробной спорообразующей бактерией Bacillus thuringiensis. Дельта-эндотоксины представляют собой семейство гомологичных белков, оказывающих избирательное действие на насекомых и практически неактивных в отношении теплокровных организмов (Bravo, 1997). На сегодняшний день рынок биопрепаратов на 90-95% представлен спорово-кристаллическими комплексами B.thuringiensis (Вершинина, Алимова, 2000). Создание препаратов на основе чистого эндотоксина позволило бы обеспечить снижение токсической нагрузки на агроценозы.

Некоторые штаммы B.thuringiensis описаны как активные против фитопатоген-ных бактерий и грибов (Marrone et al., 1999; Кандыбин, Смирнов, 1999; Смирнов, 2000; Климентова, 2001). Антимикробная активность показана также для дельта-эндотоксинов B.thuringiensis (Егоров и соавт., 1990; Юдина, Егоров, 1996; Юдина, Бурцева, 1997; Климентова, 2001; Тюльпинева, 2003). Вышеизложенное позволяет рассматривать кристаллические белки в качестве перспективного агента защиты растений от бактериозов. Это, однако, требует детального изучения антибиотической активности дельта-эндотоксинов и их эффективности против бактериозов культурных растений.

Цель и задачи исследования.

Целью работы явилось установление и анализ антибиотического действия дельта-эндотоксина B.thuringiensis на фитопатогенные бактерии различных таксономических групп, а также оценка особенностей фитозащитной активности этого агента.

В соответствии с обозначенной целью нами были поставлены следующие задачи:

1. установить чувствительность некоторых грамположительных и грамотрица-тельных фитопатогенных бактерий к дельта-эндотоксинам B.thuringiensis;

2. исследовать действие эндотоксинов на респираторную активность тест-культур и окислительный синтез АТФ бактериальными клетками;

3. оценить влияние состава питательной среды на восприимчивость бактерий к действию дельта-эндотоксина B.thuringiensis;

4. изучить роль сукцинатдегидрогеназы как одного из ключевых ферментов дыхательной цепи в эндотоксин-резистентности бактерий (на примере рода Pseudomonas);

5. в лабораторно-вегетационных опытах показать антибиотическое действие дельта-эндотоксинов на возбудителей бактериозов огурца, овса и фасоли;

6. изучить влияние эндотоксинов на развитие растений и их устойчивость к заболеваниям (на примере проростков овса).

Научная новизна результатов исследований. Впервые установлено ингиби-рующее действие дельта-эндотоксина на рост пяти штаммов фитопатогенных бактерий в условиях олиготрофности. Показано, что грамположительные бактерии высокочувствительны к низким концентрациям дельта-эндотоксинов. Однако для этих культур характерен вторичный рост. Развитие грамотрицательных бактерий подавлялось только в присутствии высоких концентраций раствора кристаллов, вместе с тем вторичного роста культур в этом случае не происходило.

Показана зависимость активности окислительных систем фитопатогенных бактерий от качественного состава питательной среды. Впервые проведено изучение влияния дельта-эндотоксинов B.thuringiensis subsp.kurstaki, штамм Z-52 на респираторную активность бактериальных клеток в различных условиях инкубирования: в олиготрофной синтетической среде, евтрофной среде Сабуро, в олиготрофной среде, лимитированной по ионам Си (II).

Установлено угнетающее влияние эндотоксина на потребление неорганического фосфата бактериальными клетками, свидетельствующее о подавлении этим агентом окислительного синтеза АТФ.

Показано, что устойчивые к действию эндотоксинов диссоцианты R.syringae обладают повышенной активностью сукцинатдегидрогеназы по сравнению со средней активностью фермента, характерной для данных культур.

Установлена способность дельта-эндотоксинов подавлять бактериозы растений (овса, огурца, фасоли) и оказывать иммунизирующее действие (на овес).

Практическая значимость работы. Полученные результаты, демонстрирующие антибактериальное и фитопротективное действие дельта-эндотоксинов

B.thuringiensis, могут быть использованы при создании средств защиты растений и технологии их практического применения.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены на Всероссийской научно-практической конференции "Проблемы плодородия почв на современном этапе развития" (Пенза, 2002), VII и УТЛ Пущинской Международной школе-конференции молодых учёных "Биология - наука XXI века" (Пущино, 2003; 2004), V Международной конференции "Математическое моделирование физических, экономических, технических и социальных систем и процессов" (Ульяновск, 2003), Региональной научно-практической конференции молодых учёных "Актуальные проблемы современного здравоохранения и экологии" (Ульяновск, 2003), Всероссийской научно-практической конференции молодых учёных "Региональные проблемы народного хозяйства" (Ульяновск, 2004), XIII Международной конференции "Ферменты микроорганизмов: структура, функции и применение" (Казань, 2005).

Публикации. По материалам конференции опубликовано 14 работ.

Структура и объём диссертационной работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальных глав, выводов и приложения общим объёмом 172 страницы компьютерного набора. Работа иллюстрирована 12 таблицами и 28 рисунками. Список литературы включает 265 наименований, в том числе 134 наименования на иностранном языке.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ 1. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

В качестве продуцента дельта-эндотоксинов использовали штамм

B.thuringiensis subsp.kurstaki Z-52, полученный из ФГУП ГосНИИ Генетики и селекции промышленных микроорганизмов (г. Москва).

Тест-объектами служили фитопатогенные бактерии Agrobacterium tumefaciens, штамм 8628; Corynebacterium sepedonicum, штамм 1; C.michiganense, штамм 7;

C.insidiosum, штамм 14; Pseudomonas syringaepv.striafaciens, штамм 9; P.syringae pv.lachrymans, штамм 23; P.syringae pv.pisi, штамм 16, P. syringae pv.tomato, штамм 1. Культуры получены из коллекции кафедры фитопатологии МСХА им. Тимирязева и Всероссийского института сельскохозяйственной микробиологии (г. Пушкин).

В работе использовали рыбопептонный агар (РИА) для поддержания культуры B.thuringiensis и тест-бактерий, среду Сабуро для изучения респираторной активности микроорганизмов в евтрофных условиях; синтетическую среду Старра, модифицированную добавлением FeSC>4 (0,005%) (среда №1), среду №1 лимитированную по CuJ+ (среда №2) и среду ПДГ (пептон, дрожжевой экстракт, глюкоза по 0,1%.) для исследования восприимчивости бактерий к эндотоксину в олиготрофных усло-

виях; РПА с добавлением ЫагБ и среду № 1 с добавлением N32$ для исследования окислительной активности бактерий в присутствии восстановителей.

Споры ВЛЫппр-втЬ и кристаллы дельта-эндотоксинов разделяли с помощью хлороформа. Кристаллы растворяли в 0,05 М №ОН при 20°С, рН растворов снижали до 7,8 осторожным титрованием 0,1 н НС1.

Электрофоретическое разделение компонентов кристаллов проводили на аце-тоцеллюлозных пластинах в гиппуратном буфере (рН 8,6). Белковые фракции окрашивали раствором пунцового С. Денситометрирование осуществляли при 540 нм.

Количественную оценку антибактериальной активности эндотоксинов определяли методом диффузии в агар. За условную единицу антибактериальной активности (ЕА) принимали количество белка эндотоксинов (мг/диск), дающее зону подавления роста индикаторного штамма диаметром 6 мм. Величину, обратную соответствующей дозе представляли в единицах активности в 1 мг эндотоксинов (удельная антибиотическая активность, ЕА/мг).

Качественное определение развития терминальной оксидазы тест-бактерий проводили по скорости окраски колоний в присутствии тетраметил-р-фенилендиамина, используя бактериальные культуры, выращенные на различных типах питательных сред.

Влияние токсина на респираторную активность тест-культур оценивали манометрически (Манометрические методы..., 1951). Влияние эндотоксина на потребление неорганического фосфата из питательной среды тест-бактериями исследовали по методу Самнера (1989).

Активность сукцинатдегидрогеназы (СДГ) бактериальных клеток определяли фотометрически по реакции восстановления феррицианида калия сукцинатом (Биохимические исследования... , 1990).

Влияние дельта-эндотоксина на угловатый бактериоз огурца, бурый бактериоз овса и бактериальный ожог фасоли изучали в лабораторных условиях на искусственном инфекционном фоне. Опыт проводили по схеме: а)интактные растения; б)инфекционный фон; в)здоровые растения, обработанные токсином; г) нифицированные растения, обработанные токсином. Поражение растений бактериозом оценивали по универсальной пятибалльной шкале (Ефимов и соавт., 1979).

Влияние дельта-эндотоксина на развитие растений исследовали на проростках овса. Растения в течение различных промежутков времени инкубировали в присутствии дельта-эндотоксина (0,3%). Контролем служило проращивание в дистиллированной воде; в присутствии 2,4-ДНФ (0,3%); в присутствии растворов, используемых для выделения эндотоксинов: КАОН(рН=7,5-8,0), КаС1 (0,03%). Учет результатов проводили в течение трех дней с интервалами в 24 часа, оценивая следующие показатели: количество корней у проростков, длина корней, степень развития зоны

корневых волосков, длина колеоптиля. Оценивалась также доля растений с теми или иными признаками в каждом варианте и доля нормальных и ненормальных по всем показателям проростков (Методические указания..., 1968).

Иммунизирующее влияние дельта-эндотоксинов исследовали на примере овса. Опыт проводили по схеме: а)30-минутная обработка проростков дельта-эндотоксинами с последующим двухсуточным выдерживанием в чашках Петри; б)двухсуточное инкубирование в присутствии эндотоксинов; в)проращивание в воде. Затем проростки промывали стерильной дистиллированной водой, инфицировали Р.яупщагру^Ма/аавт и осуществляли доращивание. Контролем служили ин-тактные растения. Учёт проводили по пятибалльной шкале (Ефимов и соавт., 1979).

Все результаты обрабатывали статистически. В таблицах приведена оценка достоверности результатов по критерию Стьюдента и величина наименьшей существенной разности (НСР), рассчитанная по результатам однофакторного дисперсионного анализа с учетом соответствующего уровня значимости.

2. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

2.1. Дельта-эндотоксины как фактор антибиотической активности B.thuringiensis. Электрофоретическая картина разделения дельта-эндотоксинов B.thuringiensis оказалась сопоставима с результатами, полученными другими авторами (Честухина и соавт., 1977; Залунин и соавт., 1979). В исследуемом растворе преобладала фракция с Мг 130-140 кДа (49,3-51,7%). Вслед за ней располагалась целая группа полос различной интенсивности, молекулярный вес белков которой варьировал в пределах 65-80 кДа. По данным денситометрии общее содержание этих компонентов в растворе составляет около 45%. Наконец, около 3-10% приходится на долю белка с Мг 60-65 кДа. Следует отметить, что в некоторых случаях в следовых количествах в пробах обнаруживали компонент с Мг около 5-10 кДа.

Анализ литературных данных указывает на то, что белок, имеющий Мг 60-65 кДа, является, скорее всего, компонентом кубоидных кристаллов. Как известно, доля таких включений в спорово-кристаллических комплексах составляет обычно 810%. Высокомолекулярная фракция является, вероятно, компонентом ромбовидных кристаллов, преобладающих в культуре подвида киШаЫ.

Особый интерес вызывает обнаруженные в растворе кристаллов фракции с Мг 65-80 кДа и 5-10 кДа. Появление таких белков связывают с ограниченным протеоли-зом компонента с Мг 130-140 кДа при участии ферментов бактериального происхождения (Залунин и соавт., 1979).

Нами была проведена оценка антибактериальной активности раствора кристаллов в отношении грамположительной и грамотрицательной микрофлоры (табл.1). Как показали результаты исследований, фитопатогенные бактерии проявляли чувст-

витальность к дельта-эндотоксинам в олиготрофных условиях (среды №1 и ПДГ). В условиях роста на евтрофном РПА и олиготрофной среде, дефицитной по Си2+ (среда №2) бактерии не были восприимчивы к эндотоксинам.

Грамположительные коринебактерии оказались более восприимчивы к действию эндотоксинов, на газоне этих тест-культур, как правило, формировались зоны ингибирования роста большего диаметра, чем на газоне грамотрицательных псевдомонад. Следует, однако, отметить, что после нейтрализации белка кристаллов (5-6 суток) происходил слабый вторичный рост бактериальных клеток вблизи дисков даже при использовании раствора эндотоксинов высокой концентрации.

Грамотрицательные псевдомонады проявляли чувствительность только к относительно высоким концентрациям эндотоксинов. Но при этом после нейтрализации белка кристаллов вторичный рост бактерий не наблюдался. Среди грамотрицательных бактерий наиболее чувствительным к эндотоксину оказался штамм P.syringae pv.striafaciens 9, а среди грамположительных - C.insidiosum 14 (табл.1).

Таблица 1

Антибактериальное действие различных концентраций дельта-эндотоксинов B.thuringiensissubsp.kurstaki Z-52

Концентрация экдотоксина (мг/мл) Диаметр зон подавления роста (мм) тесг-микроорганизмов

Р.рШ 16 Рмпа/ааепз 9 РЛасИгутаю 23 СтзкИюит 14 пегие!

0,03 0 0 0 9,13*0,87 7,38*0,26

0,04 0 6,00*0,89 5,50*0,77 10,25*0,49 8,00*0*

0,08 5,00±0* 8,50*0,43 7,00*0* 12,25*1,17 8,38*0,50

0,15 7,00*0* 9,13*030 7,38*0,43 14,90*1 ДО 9,00*0*

0,23 7,40*0,60 10,00*0,89 7,75*0,38 16,00*1,75 9,25*0,45

0,30 7,63*0,76 11,00*1,25 8,50±0,45 17,00*0,32 9,50*0,52

0,38 9,13*0,68 13,38*0,43 9,63*0,43 17,00*0* 9,63*0,50

0,75 13,25*1,39 14,00±0,63 11,00*0,89 17,25*0,32 9,75*0,45

1,50 13,88*137 16,13*1,04 12,88*0,83 18,20*0,96 10,00*0*

2,25 15,00±0,63 15,50*0,89 1538*0,43 19,00*0,75 10,56*0,43

3,00 15,00*0(45 16,ООН),75 15,25*0^8 19,50*036 10,94*0,49

НСР05 0,694 0,598 0,451 0,506 0,316

ЕА/мг 1,1*0 33*1,0 2,8*0,9 7,6*0,8 6,3*0,5

Вторичный рост + +

Примечание: * - величина стандартного отклонения (абсолютной ошибки средней) менее 0,01 мм.

2.2. Влияние дельта-эндотоксинов на окислительный синтез АТФ бактериальными клетками. Выявленное антибиотическое действие дельта-эндотоксинов

ВЛкипп$ет18, зависящее от условий культивирования микроорганизмов, ставит вопрос о природе данного явления. Анализ литературных данных указывает на то, что кристаллические белки являются цитостатиками, вызывающими деэнергизацию клеток-мишеней. Один из возможных механизмов деэнергизирующего действия эндотоксинов, как полагают, заключается в разобщении окислительного фосфорили-рования и дыхания (Каменёк, 1998). Вполне вероятно, что антибактериальное действие этих агентов будет во-многом определяться особенностями энергетического обмена тестируемых бактерий.

В лабораторных условиях нами была проведена оценка влияние качественного состава питательной среды на активность окислительных систем фитопатогенных бактерий.

Таблица 2

Активность окислительных систем тест-бактерий в различных условиях культивирования

Условия культивирования Длительность формирования окраски колоний в присутствии тет-раметил-р-фенилендиамина, с.

Р.1аскгутап5 23 Р.$!гш[ааеп$ 9 С.зереНотсит 1

РПА, к^-фаза 20-30 10-20 20-30

Среда №1,1<^-фаза 45-60 45-60 45-60

Среда №2,1(^-фаза - - -

РПА, стационарная фаза 60 и дольше 60 и дольше 60 и дольше

Среда №1 + №¡5,к^-фаза 10 5-10 10

РПА + ИагБ, ^-фаза - - -

Примечание: знак " - " указывает на отсутствие окрашивания колоний.

Результаты проведённых экспериментов показали, что состав питательной среды оказывает существенное влияние на развитие и свойства окислительных систем тест-микроорганизмов. Так, на сбалансированной евтрофной среде РПА в логарифмическую фазу развития для бактерий свойственны высокоактивные терминальные оксидазы (табл.2). На это указывает быстро развивающаяся окраска колоний в присутствии тетраметил-р-фенилендиамина.

Напротив, в случае роста микроорганизмов на среде №1 клетки характеризуются низкой оксидазной активностью. В этом случае отчётливая окраска колоний формировалась в течение 45-60 с. Затяжная тест-реакция свидетельствует о том, что окисление субстратов клетками происходит менее интенсивно, чем в условиях роста на РПА. Низкая активность окислительных систем была характерна также для стареющей культуры (стационарная фаза) в условиях роста на РПА.

Следует отметить, что в олиготрофных условиях бактерии оказались способны формировать устойчивые к ингибиторам дыхательные цепи. Как показали результа-

ты наших наблюдений, при росте на среде №1 с добавлением ИагБ отчётливая окраска колоний в присутствии тетраметил-р-фенилендиамина формировалась в течение 10 с, то есть значительно быстрее, чем это требуется для положительной реакции. Напротив, при добавлении N828 к среде РПА бактерии не индуцировали цитохро-моксидаз, о чём свидетельствует отсутствие характерного окрашивания колоний. Следует отметить, что бактерии так же не обладали цитохромоксидазной активностью при культивировании на олиготрофной среде, лимитированной по Си2+ (среда №2). Вероятно, это свидетельствует о неспособности микроорганизмов синтезировать гемовые оксидазы в условиях роста на несбалансированных средах.

Приведённые данные свидетельствуют о высокой лабильности окислительных систем бактерий, что вероятно в свою очередь отражает адаптацию микроорганизмов к возможным изменениям естественных условий. Таким образом, большой интерес представляет изучение восприимчивости окислительных систем к действию эндотоксинов при инкубировании бактерий в различных питательных средах.

Известно, что в первые минуты воздействия разобщающих агентов происходит компенсаторное стимулрование респираторной активности чувствительных клеток. Аналогичные симптомы должно иметь и действие на бактерии дельта-эндотоксинов B.thuringiensis. Как оказалось, раствор эндотоксинов концентрации 0,015% провоцирует резкое

увеличение скорости потребления кислорода бактериями при их инкубировании в олиготрофных условиях (среда №1) (рис.1). Напротив, в евтрофных условиях (среда Сабуро), а также при инкубировании в среде, дефицитной по Си2+ (среда №2) характерного стимулирующего действия эндотоксинов на дыхание тест-культур не наблюдали.

Рис.1. Влияние дельта-эндотоксинов (0,015%) на респираторную активность Csepedonicum в различных условиях инкубирования: 1-в среде Сабуро; 2-в среде №1; 3-в среде №2. Стрелками обозначено время добавления раствора эндотоксинов.

Полученные результаты согласуются с литературными данными о влиянии веществ-разобщителей на окислительную активность бактериальных клеток (Трутко и соавт., 1980; Меденцев и соавт., 1985; Акименко, 1989). Авторы полагают, что условия, оптимальные для роста, соответствуют log-фазе развития культуры, характеризующейся активностью дыхательных цепей (III состояние по Чансу), высокой скоростью синтеза и гидролиза АТФ и, как следствие, низким значением (или отсутствием) дыхательного контроля. В этом случае влияние разобщителей на бактериальные клетки не выражено.

Напротив, в условиях снижения активности окислительных систем при одновременном падении гидролиза АТФ бактериальные дыхательные цепи переходят в "контролируемое" состояние (IV состояние), что сопровождается проявлением чувствительности бактерий к деэнергизирующим агентам. Инкубирование бактерий в олиготрофных условиях, очевидно, соответствует этому. Следует отметить, что в условиях ингибирования цитохромното участка цепи переноса электронов (например, при лимитировании питательной среды по ) активизируется дыхание, обусловленное функционированием оксидаз негемовой природы. Такие оксидазы, являющиеся FeS-белками, шунтируют дыхательную цепь на уровне Со-ферментного цикла, подавляя функцию, по крайней мере, двух пунктов сопряжения и, следовательно, не участвуют в генерации энергии. Полагают, что несопряженное дыхание нечувствительно к разобщителям.

На основании объёмов кислорода, потреблённого в течение 2, 5 и 15 минут, была рассчитана степень влияния эндотоксинов на дыхательную активность микроорганизмов (табл 3).

Таблица 3

Степень влияния дельта-эндотоксинов B.thuringiensis на дыхание бактериальных клеток

Штаммы тест-бактерий Процент поглощения кислорода от нормы через... мин HCPos

2 мин 5 мин 15 мин

Csepedonicum 1 131,74±12,74 108,87*1935 93,75*13,02 6,53

Cinsidiosum 14 134,02±13,57 103,89*15,55 90,32*13,62 3,34

P.lachrymaits 23 139,30*10,54 122,54*9,26 107,08*6,93 5Д5

P.pisi 16 181,3 8±9,95 147,47*12,53 130,89*15,08 8,36

P.tomato 1 173,84±10,89 127,52*14,55 110,32*14,60 19,73

P.striafaciens 9 149,82^9^18 123,70*7,17 103,17±14,61 11,82

A.tumefaciens 8628 123,47*11,26 106,81±14,76 104,29*14,77 7,52

Приведённые данные свидетельствуют о том, что эффект начального стимулирования поглощения кислорода постепенно затухает. Через пятнадцать минут воздействия эндотоксинов у некоторых тест-микроорганизмов имело место незначительное угнетение дыхательной активности по сравнению с контролем. В наибольшей степени этот эффект был характерен для коринебактерий. Аналогичная тенденция наблюдалась у штаммов P.syringae pv. tomato 1, P.syringae pv.striafaciens 9, A.tumefaciens 8628, о чём свидетельствует величина абсолютной ошибки средней. В отношении штамма P.syringae pv.lachrymans 23 незначительное угнетение потребление кислорода было отмечено лишь в отдельных случаях, а дыхательная активность штамма P.syringae pv.pisi 16 была существенно выше нормы.

Анализ литературных данных указывает на то, что эффект угнетения потребления кислорода, наблюдающийся в некоторых случаях, может быть вызван нарастающей во времени деэнергизацией клеток. Полагают, что окислительные системы, являясь энергозависимыми, требуют для своей активности определённого клеточного фонда АТФ, который в свою очередь активно гидролизуется в ходе разобщения (Каменск, 1998). Кроме того, эффект ингибирования может быть следствием гибели некоторой доли тестируемых клеток. Глубина угнетения дыхания, таким образом, отражает степень чувствительности культуры к действию эндотоксинов. Действительно, как следует из сравнения данных таблиц 1 и 3, угнетение респираторной активности в большей степени было свойственно представителям рода Corynebacte-rium, восприимчивым к низким концентрациям дельта-эндотоксинов. Напротив, па-товары P.syringae, рост которых подавлялся лишь достаточно высокими концентрациями эндотоксинов, характеризовались затяжным усилением дыхания. Следует отметить, что ранее с помощью световой микроскопии была продемонстрирована устойчивость A.tumefaciens, штамм 8628 к действию эндотоксинов B.thuringiensis (Климентова, 2001). В наших исследованиях для этой культуры было характерно сравнительно низкое стимулирование дыхания в течение первых двух минут воздействия эндотоксинов. Затем дыхательная активность A.tumefaciens снижалась до значений, характерных для нормы.

Таким образом, начальное усиление респираторной активности бактерий может являться следствием разобщающего влияния дельта-эндотоксинов. В этом случае оно должно сопровождаться снижением окислительного синтеза АТФ и, соответственно, потребления неорганического фосфата бактериальными клетками.

Исследования показали (табл.4), что в присутствии эндотоксинов уже через 15 мин инкубирования отмечается существенное угнетение потребления бактериями из питательной среды неорганического фосфата. Следует отметить, что степень инги-бирующего влияния зависела от конечной концентрации эндотоксинов в инкубационной среде. Так, потребление фосфата штаммом P.syringae pv.lachrymans 23 в при-

сутствии эндотоксинов концентрации 0,03% и 0,06% составило соответственно в среднем 38,24 и 9,08 процентов от нормы.

Анализ динамики потребления бактериальными клетками неорганического фосфата показал, что ингибирующее действие эндотоксинов максимально в первые 15 мин исследования, а затем эффект влияния постепенно снижается. Вполне вероятно, что последующее увеличение потребления фосфата из питательной среды может отражать высокую потребность клеток в АТФ в результате деэнергизации и, возможно, усиление синтеза АТФ в ходе субстратного фосфорилирования.

Угнетение потребления неорганического фосфата бактериальными клетками на фоне усиления их респираторной активности, очевидно, свидетельствует о разобщающем влиянии дельта-эндотоксинов на эти тест-объекты.

Таблица 4

Влияние дельта-эндотоксинов В. 1кипщ1гт188иЬ8р. киЫаЫ, штамм Z-52 на потребление неорганического фосфата патоварами Рлупщав

Конц. эндотоксина (%) Тест-бактерии Потребление Рнеорг из питательной среды бактериальными клетками в присутствие эндотоксинов через ...мин, % от нормы HCPos

15 30 45 60

0,03 P.lachrymans 23 38,24*7,71 85,4446,26 84,78±3,93 94,99±1,Э5 5,03

P.pisi 16 45,70=fc9,37 86,09±9,37 86,88±4,97 95,72±4,18 7,03

P.slriafaciens 9 41,18±17,60 82,38±5,34 87,04±6,72 99,56±0,42 9,57

0,06 P.lachrymans 23 9,08±3,40 64,69±8,05 77,90±0,89 94,18±2,88 6Д0

P.pisi 16 15,1&Ь8,92 42,53±1U4 75,94±1,61 93,25*5,34 10,29

P.striafaciens 9 8,09±2,40 61,32±12,44 69,79±7,28 91,16±3,69 7,70

HCPos 11,85 8,48 9,65 3,46*

Примечание: * - показатель существенности частных различий рассчитан для уровня значимости 0,10 (НСР10).

2.3. Специфика функционирования окислительных систем эндотоксино-устойчивых вариантов Pseudomonas syringe. В ходе исследования антибактериального действия эндотоксина диффузионным методом было показано, что низкие концентрации раствора кристаллов оказывают стимулирующее влияние на рост клеток. Это приводит к формированию областей усиленного роста, расположенных вслед за зонами лизиса. Известно, что зоны усиленного роста образуют бактериальные клетки, менее восприимчивые к токсину (R-варианты) (Юдина и соавт.,1996). Для исследования возможных причин индивидуальной устойчивости фитопатоген-ных бактерий к действию дельта-эндотоксина мы проанализировали активность сукцинатдегидрогеназы (СДГ) R-диссоциантов трех патоваров P.syringae.

Как показали результаты эксперимента, активность СДГ бактериальных клеток, полученных из зон усиленного роста значительно выше активности фермента, характерной для исходных штаммов (табл.5). Так, у P.syringaepv.striafaciens 9 активность СДГ К-диссоциантов составила 37,8±3,9 нМоль сукцината/мин/мг белка клеток, в то время как в контроле эта величина оказалась существенно ниже. Сходные результаты были получены и для других патоваров P.syringae.

Таблица 5

Активность СДГ эндотоксиноустойчивых вариантов патоваров P.syringae

в сравнении с активностью фермента, характерной для культуры в среднем

Варианты Активность СДГ тест-бактерий (нМ/минмг)

Р.зта/аает 9 Р.ксЬгутапз 23 Р.рЫ 16

Область усил. роста 37,8±3,9*** 33,3±7,8»" 52,3±7,8*

Исходный штамм (контроль) 21,3±6,7 14Д±5,8 35,7±13,8

Примечание: * -различия по сравнению с контролем существенны при р<0,05; *** -р<0,001.

В последнее время активно изучается диссоциация микробных популяций под влиянием факторов среды. Результаты таких исследований указывают на различия в устойчивости диссоциантов одного вида к действию физических и химических факторов. Вместе с тем, реакция одинаковых типов клеток к внешним воздействиям, как правило, сходна даже у разных видов микроорганизмов (Милько, Егоров, 1986; Милько, Никитенко, 1998; Максимов и соавт., 1999). Так, например, показано, что Я-варианты приобретают селективное преимущество в оптимальных для роста условиях. В свою очередь М-диссоцианты преобладают в культуре при снижении аэрации, при превышающих оптимум и заниженных температурах, при недостатке азотного, углеродного и фосфорного питания.

Приведённые данные могут отчасти объяснить повышенную восприимчивость бактериальных культур к эндотоксинам B.thuringiensis в олиготрофных условиях и устойчивость в условиях роста на богатых органических средах. Вполне вероятно также, что любые факторы, контролирующие рост культур и обеспечивающие адаптивное преимущество М-диссоциантов, могут способствовать усилению антибактериальной активности дельта-эндотоксинов.

2.4. Влияние эндотоксинов на бактериозы растений. Характер антимикробной активности дельта-эндотоксина налагает некоторые ограничения на его возможное практическое использование для защиты растений от бактериозов. Нами были проведены лабораторно-вегетационные исследования фитозащитного действия этого агента.

Результаты проведённых экспериментов показали способность токсина подавлять бактериозы растений в фазу вегетации. Наиболее эффективным оказалось использование раствора кристаллов против угловатой пятнистости огурца (табл.6). В этом случае биологическая эффективность использования дельта-эндотоксинов составила 95,43±4,14%. В результате обработки растений наблюдали достоверное снижение (р<0,05) распространения заболевания с 90,00+5,16% до 20,00+10,33%, развития - с 44,87+4,84% до 2,28+2,06%.

Таблица 6

Влияние дельта-эндотоксина В. thuringiensissubsp. кы^аШ 2-52 на угловатый бактериоз огурца

Вариант опыта Распространение, % Развитие, % Степень выравненности, % Биол. эффективность, %

0 0,1 1 2 3

1 11,67±9,55 0,39±0,32 88,33±12,38 11,67*8,95 0 0 0 -

2 5,00±4,47 0,17±0,15 95,00±4,46 5,00±4,46 0 0 0 36,29± 35,00

3 90,00±5,16 44,87±4,84 Ю,00±6,71 6,67±5,48 48,33±4,34 20,00±0 15,00±5,82 -

4 20,00± 10,33 2,28±2,0б 80,00±13,42 16,67± 14,51 4,33*3,30 0 0 95,43± 4,14

НСР05 11,18 3,58 8,94 10,72 3,41 2,50 3,35 44,07

Варианты опыта: 1 - интактные растения (контроль), 2 - условно здоровые растения, обработанные раствором эндотоксинов, 3 - инфицированные растения (инфекционный фон), 4 - инфицированные растения, обработанные эндотоксином.

Показателем, наглядно иллюстрирующим фитозащитный эффект обработки растений раствором эндотоксинов, является выравненность образцов по степени бактериоза. Исследования показали, что после обработки проростков огурца токсином происходит резкое снижение в опытной группе доли больных растений: большая часть пораженных проростков относилась к категории устойчивых (0,1 балл); растений второго и третьего баллов поражения в этом варианте обнаружено не было.

Необходимо отметить, что раствор дельта-эндотоксинов снижал основные показатели заболевания и на естественном инфекционном фоне. Однако ввиду сравнительно низкого естественного поражения растений в большинстве случаев фитоза-щитный эффект оказался недостоверным, а величина биологической эффективности составила в среднем 36,29%, что существенно ниже аналогичного показателя, определённого на искусственном инфекционном фоне (табл.6).

В отношении бурого бактериоза овса биологическая эффективность дельта-эндотоксинов составила на искусственном инфекционном фоне 64,86±2,09% (табл.7). При этом раствор кристаллов снижал распространение заболевания на 44%, а развитие - на 56%. После обработки раствором эндотоксинов в выборке достоверно уменьшалась доля растений третьего балла поражения и увеличивалась доля здоровых и устойчивых проростков. На фоне естественного поражения овса бактериозом биологическая эффективность дельта-эндотоксинов оказалась еще выше.

Таблица 7

Влияние дельта-эндотоксина B.thuringiensis8ыЪ8р. киЫакZ-52 на поражение овса бурым бактериозом

Вариант 1 опыта [ Распространение, % Развитие, % Степень выравкенносги, % Биол. эффек-

0 0,1 1 2 3 тивность, %

1 21,50*9,48 2 Л ±0,97 78,50*3,00 16,50*1,76 5,00*2,09 0 0 -

2 10,00*4,20 0,33*0,08 90,00*4,37 10,00*2,71 0 0 0 84,62* 15,39

3 98,00*1,88 86,77*2,51 2,00±1,45 3,00*1,19 11,50*1,76 2,00*1,45 81,50*1,76 -

4 54,00*1,53 30,42*1,39 46,00*1,53 18,00*1,88 8,00*1,88 2,50*2,11 25,50*1,15 64,86* 2,09

НСР05 3,90 4,59 3,69 3,48 2,61 2,18 1,46 2,27

Активность эндотоксинов в отношении бактериального ожога фасоли на искусственном инфекционном фоне была сравнительно невысокой. В ходе обработки проростков отмечали снижение распространения бактериоза всего на 9% (табл.8). В большей степени фитозащитное влияние дельта-эндотоксинов проявлялось в снижении развития болезни (в среднем на 28%). Как показывает анализ степени вырав-ненности образцов, раствор кристаллов снижает долю проростков третьего балла поражения, однако наряду с этим в выборке достоверно увеличивается процент растений 1-2 баллов.

Таким образом, на искусственном инфекционном фоне эндотоксины лишь сдерживают бактериальный ожог фасоли, но не оказывают существенного оздорав-ливающего эффекта. Напротив, в случае естественного поражения растений раствор кристаллов резко увеличивал долю здоровых образцов, растений 2-3 баллов поражения в выборке обнаружено не было (табл.8).

Таблица 8

Влияние дельта-эндотоксина B.thuringiensissubsp. киг^ак 2-52 на поражение фасоли полосатым бактериозом

н Распространение, % Степень выравненное™, % Биол. эффективность %

Вариан опыта Развитие, % 0 0,1 1 2 3

1 45,63*14,60 16,15*6,49 54,37±14,60 21,87±6,78 8,13*5,97 8,75*1,96 6,88*4,50 -

2 30,00±7,95 3,62*1,76 70,00*7,52 21,25*4,39 8,75*5,44 0 0 75,87* 12,94

3 97,50*3,21 85,96±4,73 2,50*2,03 3,75*3,01 5,62*3,67 12,50*7,86 75,63*9,74 -

4 88,12*6,39 57,3115,75 11,87*6,39 14,37*4,20 11,25*1,96 28,13*8,47 34,38*9,47 33,31* 5,46

НСР05 7,06 4,63 7,06 6,70 4,85 6,72 7,78 11,96

В ходе оценки влияния дельта-эндотоксинов В.Шипщ1гт18 на бактериозы в некоторых случаях отмечалось незначительное угнетение роста растений, обработанных эндотоксинами. Так как действие на растение является одной из важнейших характеристик биопрепатаров, нами было проведено исследование влияния дельта-эндотоксинов на основные морфометрические характеристики проростков овса. Учитывая возможный разобщающий механизм цитопатического действия раствора кристаллов, мы сравнили полученные результаты с эффектом воздействия 2,4-ДНФ на проростки.

Было обнаружено, что в присутствии ДНФ развитие проростков прекращается, все оцениваемые показатели не изменялись в ходе всего исследования (табл.9). Столь выраженный эффект не оказывало даже длительное воздействие дельта-эндотоксинов. Однако по сравнению с контролем (растения, проращиваемые в воде) в результате длительного воздействия эндотоксинов (45 минут и дольше) происходило незначительное угнетение развития проростков. Угнетающее действие проявлялось, прежде всего, в слабом развитии зоны корневых волосков. Кроме того, под влиянием раствора кристаллов наблюдали ингибирование формирования и роста корней, а также подавление роста колеоптилей.

Анализ динамики активности дельта-эндотоксинов показал, что угнетение развития проростков происходит в первые сутки инкубирования, затем эффект влияния значительно снижается.

Таблица 9

Подобные симптомы характерны для действия фитопатогенов, неспецифических для данного растения, и сопровождаются, как правило, выраженной фитоалек-синной активностью некротизированных тканей (индуцированная устойчивость, серхчувствительность растений) (Матышевская, 1979; Озерецковская, Чалова, 1989). Известно, что в случае кратковременного воздействия микробных метаболитов, либо под влиянием низких концентраций индукторов у растений не образуются некрозы. Но растительная ткань при этом приобретает способность к активным защитным реакциям. Такое явление называют системной устойчивостью растения (Озерецков-ская, Чалова, 1989).

Действительно, результаты наших исследований показали, что токсичным является только длительное инкубирование проростков в растворе кристаллов (60 мин, а также проращивание в эндотоксине). Снижение времени воздействия до 3045 минут нивелирует токсичное действие, а при 15-минутном инкубировании наблюдали ростостимулирующее влияние эндотоксинов (табл.9).

Приведённые нами данные согласуются с результатами А.Тюльпинёвой (2003). В ходе анализа антифунгальной активности дельта-эндотоксинов B.thuringiensis автором было обнаружено недостоверное ингибирование этим агентом роста овса, сочетающееся с увеличением всхожести. В отношении роста яровой пшеницы и озимой ржи, напротив, было отмечено стимулирующее действие дельта-эндотоксинов. Вполне вероятно, что растения существенно различаются между собой по реакции на индукцию устойчивости. Поэтому одна и та же длительность воздействия дельта-эндотоксинов у одних культур вызывает усиление роста, сопровождающееся формированием системной устойчивости, а у других растений провоцирует реакцию сверхчувствительности. В последнем случае у растений могут образовываться некрозы и другие симптомы повреждения. Необходимо отметить, что растворы, применяемые для выделения кристаллов, не оказывали токсического действия на растения (табл.9).

Нами было проведено исследование влияния эндотоксинов на устойчивость овса к возбудителю бурого бактериоза. Как оказалось, 30-минутная обработка эндотоксинами достаточна для формирования у растений системной устойчивости к Р^упщае ру^Ма/аЫет. В этом случае биологическая эффективность дельта-эндотоксинов составила 12,32±3,75% (табл.10). Обработка растений раствором эндотоксинов приводит к достоверному снижению распространения и развития бурого бактериоза, существенному увеличению в выборке доли здоровых и устойчивых проростков, а также снижению доли растений третьего балла поражения.

Длительное воздействие (48 ч) раствора кристаллов на проростки производило гораздо меньший защитный эффект. В этом случае биологическая эффективность обработки растений составила лишь 5,19±1,73%. Под влиянием эндотоксинов дос-

товерно уменьшалось развитие бактериоза, вместе с тем снижение распространения оказалось несущественным. Анализ степени выравненности образцов показал, что в выборке снижается доля проростков третьего балла поражения, однако наряду с этим незначительно увеличивается процент растений второго балла (табл.10).

Таблица 10

Иммунизирующий эффект обработки проростков овса дельта-эндотоксинамиВ. thuringiensissubsp.kurstakiZ-52

Вариант опыта Распространение, % Степень выравненности, % Бнол. эффективность, %

Развитие, % 0 0,1 1 2 3

] 21,95*6,33 2,40*0,65 78,05*3,16 16,35*2,00 5,60*1,50 . 0 0 -

2 96,88±2,14 86,82*3,60 3,12*1,20 4,12*2,15 13,45*2,50 4,35*2,00 74,96*3,40 -

3 93,03*4,40 75,40*4,31 7,00*3,62 7,50*2,81 13,50kt2,53 4,00*3,12 68,00*2,73 12,32* 3,75

4 95,03*1,32 81,35*3,12 5,25*2,38 8,00*3,12 10,20*3,11 6,35*2,36 70,20*3,61 5,19* 1,73

НСР05 3,16 5,03 2,45 2,12 3,35 2,06 1,93 3,98

Варианты опыта: 1 - интактные растения (контроль), 2 - инфицированные растения (инфек-

ционный фон), 3 - инкубирование в растворе эндотоксинов (30 мин) и последующее инкубирование в воде (48 часов), 4 - инкубирование в растворе эндотоксинов (48 часов).

Таким образом, полученные результаты указывают на иммунизирующий характер влияния дельта-эндотоксинов на проростки овса. Кратковременное воздействие эндотоксинов не угнетает растение, вместе с тем при последующем заражении фи-топатогенами выявляется усиление и ускорение реакции устойчивости.

Результаты проведённых экспериментов в целом дают основание рассматривать дельта-эндотоксины B.thuringiensis в качестве перспективного агента контроля бактериозов растений.

ВЫВОДЫ

1. Установлено ингибирующее действие дельта-эндотоксинов B.thuringiensis subsp.kurstaki Z-52 на рост фитопатогенных бактерий - представителей родов Согу-nebacterium и Pseudomonas. Степень антибиотической активности раствора эндотоксинов зависит от его концентрации, а также вида микроорганизмов и условий их культивирования.

го стимулирования и последующего угнетения респираторной активности зависит от вида тестируемых микроорганизмов. Усиление дыхательной активности сопровождается подавлением синтеза АТФ бактериальными клетками.

3. Показано, что антибиотическая активность эндотоксинов выражена при росте бактерий на олиготрофных средах, сбалансированных по составу, и отсутствует на несбалансированных олиготрофных (лимитированных по ) средах. Фитопато-генные бактерии так же устойчивы к эндотоксинам в условиях роста на евтрофных питательных средах.

4. Для токсин-резистентных диссоциантов патоваров Pseudomonas syringae характерен более высокий уровень активности сукцинатдегидрогеназы по сравнению с активностью фермента, характерной для исходных штаммов, что свидетельствует о формировании высокоактивных дыхательных цепей у клеток, устойчивых к действию дельта-эндотоксинов.

5. Дельта-эндотоксины B.thuringiensis subsp.kurstaki Z-52 подавляют основные симптомы бактериозов огурца, овса и фасоли. Биологическая эффективность эндотоксинов составила на искусственном инфекционном фоне в среднем соответственно 95,43,64,86 и 33,31 процентов.

6. Дельта-эндотоксины B.thuringiensis subsp.kurstaki Z-52 стимулируют рост и развитие проростков овса при кратковременном воздействии. Предварительная обработка проростков раствором эндотоксинов повышает устойчивость растений к возбудителю бурой пятнистости.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕДИССЕРТАЦИИ

1. Каменёк Л.К. Действие дельта-эндотоксина Bacillus thuringiensis на фитопато-генные микроорганизмы /Л.К.Каменёк, АА.Тюльпинёва, Е.П.Морозова, Т.АЛевина, Е.Н.Тихонова, Т.АЛуковенко //Всероссийская научно-практическая конференция, посвященная 50-летию кафедры почвоведения и агрохимии ПГСХА, Пенза 19-20 ноября 2002 г.: Сборник материалов. - Пенза, 2002. - С.130-132.

2. Каменёк Л.К. Фитозащитный эффект обработки семян овса дельта-эндотоксином Bacillus thuringiensis /Л.К.Каменёк, Т.АЛевина, Е.П.Морозова, ТАЛуковенко //Приоритет России XXI века: от биосферы и техносферы к ноосфере: Сборник материалов /Международная научно-практическая конференция, Пенза 21-22 января 2003 г. - Пенза, 2003. - С. 76-77.

3. Каменёк Л.К. Влияние дельта-эндотоксина Bacillus thuringiensis на дыхание микроорганизмов /Л.К.Каменёк, ААТюльпинёва, Т.А.Левина, Е.П.Морозова, Е.Н.Тихонова, ТА.Луковенко //Биология - наука XXI века: Сборник тезисов /7-ая Путинская Международная школа-конференция молодых учёных, Пущино 14-18 апреля 2003 г. - Пущино, 2003. - С.277.

4. Тюльпинёва А.А. Возможности использования дельта-эндотоксина Bacillus thuringiensis для подавления грибных фитопатогенов /А.А.Тюльпинёва, Т.А.Левина, Е.Н.Тихонова, Л.К.Каменёк //Биосфера и человек: проблемы взаимодействия: Сборник материалов /VII Международная научно-практическая конференция, Пенза 23 мая 2003 г. - Пенза, 2003. - С. 173-175.

5. Каменёк Л.К. Действие дельта-эндотоксина Bacillus thuringiensis на некоторые аэробные бактерии в зависимости от развития окислительных систем микроорганизмов /Л.К.Каменёк, ТАЛевина //Математическое моделирование физических, экономических, технических и социальных систем и процессов: Сборник материалов /V Международная конференция, Ульяновск 16-18 июня 2003 г. - Ульяновск, 2003.-С.85-87.

6. Левина Т.А. Активность сукцинатдегидрогеназы диссоциантов Pseudomonas syringae, устойчивых к действию дельта-эндотоксина Bacillus thuringiensis /Т.АЛевина, Л.К.Каменёк //Актуальные проблемы современного здравоохранения и экологии: Сборник материалов /Региональная конференция молодых учёных, Ульяновск 27 ноября 2003 г. - Ульяновск, 2003. - С.60-62.

7. Левина Т.А. Возможности использования дельта-эндотоксинов Bacillus thuringiensis для защиты растений от бактериозов /Т.А.Левина, Л.Д.Миначёва, ДА.Терёхин, Л.К.Каменёк //Региональные проблемы народного хозяйства: Сборник материалов /Всероссийская научно-практическая конференция молодых учёных, Ульяновск 8-9 апреля 2004 г. - Ульяновск, 2004. - С.103-107.

8. Левина Т.А. Возможности использования дельта-эндотоксина Bacillus thuringiensis для сенсибилизации растений /Т.АЛевина, Д.А.Терёхин, Л.Д.Миначёва, Л.К.Каменёк //Биотехнология - охране окружающей среды. Сохранение биоразнообразия и рациональное использование биологических ресурсов: Сборник тезисов /II Международная научная конференция и Ш школа-конференция молодых учёных и студентов, Москва 25-27 мая 2004 г. - Москва, 2004. - С.48.

9. Левина Т.А. Возможности использования дельта-эндотоксинов Bacillus thuringiensis для защиты растений от бактериозов /ТАЛевина, Л.Д.Миначёва, Д.А.Терёхин, Л.К.Каменёк //Биология - наука XXI века: Сборник тезисов /8-ая Пу-щинская Международная школа-конференция молодых учёных, Пущино 17-21 мая 2004 г. - Пущино, 2004. - С.267.

10. Левина ТА. Активность дельта-эндотоксинов Bacillus thuringiensis в отношении некоторых бактерий /ТАЛевина, С.В.Пантелеев, Л.К.Каменёк //От фундаментальной науки - к новым технологиям. Химия и биотехнология биологически активных веществ, пищевых продуктов и добавок. Экологически безопасные технологии: Сборник материалов /Международная конференция молодых ученых, Тверь 1 октября 2004 г. - Тверь, 2004. - С.13-16.

Н.Левина Т.А. Влияние дельта-эндотоксинов Bacillus thuringiensis на окислительный синтез АТФ клетками Pseudomonas syringae /Т.АЛевина, Л.К.Каменёк //Наука и образование 2004: Сборник материалов /Международная научно-техническая конференция, Мурманск 7-15 апреля 2004 г.- Мурманск, 2004. - С.52-55.

12. Левина Т.А. Дельта-эндотоксины как фактор антагонистической активности Bacillus thuringiensis /ТАЛевина, С.В.Пантелеев, Л.К.Каменёк //Проблемы экологии и охраны природы. Пути их решения: Сборник материалов /II Всероссийская научно-практическая конференция, Ульяновск, ноябрь 2004. - Ульяновск, 2004. - С.116-121.

13. Левина Т.А. Особенности функционирования окислительных систем диссоци-антов Pseudomonas syringae, устойчивых к дельта-эндотоксинам Bacillus thuringiensis /Т.А.Левина, Л.К.Каменёк //Ферменты микроорганизмов: структура, функции и применение: Сборник докладов /XIII Международная конференция, Казань 4-8 апреля 2005 г. - Казань, 2005. - С.53-55.

14. Каменёк Л.К. Антибактериальное действие дельта-эндотоксина Bacillus thuringiensis как потенциального агента защиты растений /Л.К.Каменёк, ТАЛевина, ДА.Терёхин, Л.Д.Миначёва //Биотехнология. - 2005. - №1. - С.59-70.

Подписано в печать 20.04.05 Формат 60x84/16. Гарнитура Times New Roman Cyr. Усл. печ. л. 1,0. Тираж 100 экз. Заказ №146/ Отпечатано с оригинал-макета в Лаборатории оперативной полиграфии Ульяновского государственного университета 432970, г. Ульяновск, ул. Л. Толстого, 42

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Левина, Татьяна Александровна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ ВВЕДЕНИЕ

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Микробиометод в системе экологизированной защиты растений

1.2. Bacillus thuringiensis как агент микробиологической защиты растений

1.2.1. Экологическая ниша Bacillus thuringiensis

1.2.2. Факторы токсичности Bacillus thuringiensis

1.3. Кристаллические дельта-эндотоксины Bacillus thuringiensis

1.3.1. Формирование включений

1.3.2. Морфология и ультраструктура кристаллов

1.3.3. Белки кристаллов

1.3.4. Структурно-функциональная организация молекул эндотоксинов

1.3.5. Генетический контроль токсинообразования

1.3.6. Действие дельта-эндотоксинов на целевые объекты

2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

3.1. Дельта-эндотоксины как фактор антибиотической активности Bacillus thuringiensis

3.2. Влияние дельта-эндотоксинов на окислительный синтез АТФ бактериальными клетками

3.3. Специфика функционирования окислительных систем эндоток-синоустойчивых вариантов Pseudomonas syringae

3.4. Фитозащитная активность дельта-эндотоксинов Bacillus thuringiensis

ВЫВОДЫ

Введение Диссертация по биологии, на тему "Особенности антибактериального действия дельта-эндотоксинов Bacillus thuringiensis как перспективного агента защиты растений"

Одним из таких агентов являются кристаллические дельта-эндотоксины, продуцируемые аэробной спорообразующей бактерией Bacillus thuringiensis. Дельта-эндотоксины представляют собой семейство гомологичных белков, оказывающих избирательное действие на насекомых и практически неактивных в отношении теплокровных организмов (Bravo, 1997). На сегодняшний день рынок биопрепаратов на 90-95% представлен спорово-кристаллическими комплексами В.thuringiensis (Вершинина, Алимова, 2000). Создание препаратов на основе чистого эндотоксина позволило бы обеспечить снижение токсической нагрузки на агроценозы.

Некоторые штаммы В. thuringiensis описаны как активные против фитопа-тогенных бактерий и грибов (Marrone et al., 1999; Кандыбин, Смирнов, 1999; Смирнов, 2000; Климентова, 2001). Антимикробная активность показана также для дельта-эндотоксинов В.thuringiensis (Егоров и соавт., 1990; Юдина, Егоров, 1996; Юдина, Бурцева, 1997; Климентова, 2001; Тюльпинева, 2003). Вышеизложенное позволяет рассматривать кристаллические белки в качестве перспективного агента защиты растений от бактериозов. Это, однако, требует детального изучения антибиотической активности дельта-эндотоксинов и их эффективности против бактериозов культурных растений.

Цель и задачи исследования.

Целью работы явилось установление и анализ антибиотического действия дельта-эндотоксина B.thnrmgiensis на фитопатогенные бактерии различных таксономических групп, а также оценка особенностей фитозащитной активности этого агента.

В соответствии с обозначенной целью нами были поставлены следующие задачи:

1. установить чувствительность некоторых грамположительных и грамотри-цательных фитопатогенных бактерий к дельта-эндотоксинам B.thuringiensis\

3. оценить влияние состава питательной среды на восприимчивость бактерий к действию дельта-эндотоксина B.thuringiensis\

Научная новизна результатов исследований. Впервые установлено ин-гибирующее действие дельта-эндотоксина на рост пяти штаммов фитопатогенных бактерий в условиях олиготрофности. Показано, что грамположительные бактерии высокочувствительны к низким концентрациям дельта-эндотоксинов. Однако для этих культур характерен вторичный рост. Развитие грамотрица-тельных бактерий подавлялось только в присутствии высоких концентраций раствора кристаллов, вместе с тем вторичного роста культур в этом случае не происходило.

Показана зависимость активности окислительных систем фитопатоген-ных бактерий от качественного состава питательной среды. Впервые проведено изучение влияния дельта-эндотоксинов B.thuringiensis subsp.kurstaki, штамм Z-52 на респираторную активность бактериальных клеток в различных условиях инкубирования: в олиготрофной синтетической среде, евтрофной среде Сабуро, в олиготрофной среде, лимитированной по ионам Си (II).

Показано, что устойчивые к действию эндотоксинов диссоцианты P.syringae обладают повышенной активностью сукцинатдегидрогеназы по сравнению со средней активностью фермента, характерной для данных культур.

Практическая значимость работы. Полученные результаты, демонстрирующие антибактериальное и фитопротективное действие дельта-эндотоксинов B.thuringiensis, могут быть использованы при создании средств защиты растений и технологии их практического применения.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены на Всероссийской научно-практической конференции «Проблемы плодородия почв на современном этапе развития» (Пенза, 2002), VII и VIII Пущинской Международной школе-конференции молодых учёных «Биология - наука XXI века» (Пущи но, 2003; 2004), V Международной конференции «Математическое моделирование физических, экономических, технических и социальных систем и процессов» (Ульяновск, 2003), Региональной научно-практической конференции молодых учёных «Актуальные проблемы современного здравоохранения и экологии» (Ульяновск, 2003), Всероссийской научно-практической конференции молодых учёных «Региональные проблемы народного хозяйства» (Ульяновск, 2004), XIII Международной конференции «Ферменты микроорганизмов: структура, функции и применение» (Казань, 2005).

Публикации. По материалам конференций опубликовано 14 работ.

Структура и объём диссертационной работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальных глав, выводов и приложений общим объёмом 172 страницы компьютерного набора. Работа иллюстрирована 12 таблицами, 28 рисунками. Список литературы включает 265 наименований, в том числе 134 наименования на иностранном языке.

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Левина, Татьяна Александровна

выводы

1. Установлено ингибирующее действие дельта-эндотоксинов Bacillus thuringiensis subsp.kurstaki 2-52 на рост фитопатогенных бактерий - представителей родов Corynebacterium и Pseudomonas. Степень антибиотической активности раствора эндотоксинов зависит от его концентрации, а также вида микроорганизмов и условий их культивирования.

2. Выявлено стимулирующее действие дельта-эндотоксинов на респираторную активность тест-бактерий. Эффект усиления дыхания (1-5 мин инкубирования) сменяется угнетением потребления кислорода (15 мин) бактериями. Степень начального стимулирования и последующего угнетения респираторной активности зависит от вида тестируемых микроорганизмов. Усиление дыхательной активности сопровождается подавлением синтеза АТФ бактериальными клетками.

3. Показано, что антибиотическая активность эндотоксинов выражена при росте бактерий на олиготрофных средах, сбалансированных по составу, и отл i сутствует на несбалансированных олиготрофных (лимитированных по Си ) средах. Фитопатогенные бактерии так же устойчивы к эндотоксинам в условиях роста на евтрофных питательных средах.

4. Для токсин-резистентных диссоциантов патоваров Pseudomonas syringae характерен более высокий уровень активности сукцинатдегидрогеназы по сравнению активностью фермента, характерной для исходных штаммов, что свидетельствует о формировании высокоактивных дыхательных цепей у клеток, устойчивых к действию дельта-эндотоксинов.

5. Дельта-эндотоксины Bacillus thuringiensis subsp.kurstaki Z-52 подавляют основные симптомы бактериозов огурца, овса и фасоли. Биологическая эффективность эндотоксинов на искусственном инфекционном фоне составила в среднем соответственно 95,43, 64,86 и 33,31 процентов.

6. Дельта-эндотоксины Bacillus thuringiensis subsp.kurstaki Z-52 стимулируют рост и развитие проростков овса при кратковременном воздействии. Предварительная обработка проростков раствором эндотоксинов повышает устойчивость растений к возбудителю бурой пятнистости.

134

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Левина, Татьяна Александровна, Казань

1. Азизбекян P.P. Споро- и кристаллообразование у B.thuringiensis /Р.Р.Азизбекян, Т.А.Смирнова //Успехи микробиологии. - 1988. - Вып.22. -С.83-107.

2. Акименко В.К. Альтернативные оксидазы микроорганизмов. М.: Наука, 1989.-263с.

3. Ануфриев Э.Ф. Электронно-микроскопическое изучение кристаллов эндотоксина Bacillus thuringiensis var.dendrolimus //Энтомопатогенные бактерии и грибы в защите растений. 1985. - С.135-145.

4. Ашмарин И.П. Статистические методы в микробиологических исследованиях /И.П.Ашмарин, А.А.Воробьев, JL: Медгиз, 1962. - 180с.

5. Бакеева JI.E. Изменение структуры митохондрий в ответ на функциональные воздействия /Л.Е.Бакеева, А.А.Ясайтис //Митохондрии. Молекулярные механизмы ферментативных реакций. М.: Наука. - 1972. - С.56-64.

6. Бельтюкова К.И. Бактериальные болезни зернобобовых культур /К.И.Бельтюкова, И.Б.Королёва, В.А.Мурас, Киев: Наукова думка, 1974. -340с.

7. Биохимические исследования в. токсикологическом эксперименте /Науч. Ред. Н.Ф.Савченков. Иркутск: Изд-во Иркутского ун-та, 1990. - 213с.

8. Блохина Т.П. Изменчивость B.thuringiensis при разных условиях выращивания /Т.П.Блохина, З.В.Сахарова, Ю.Н.Игнатенко, И.Л.Работнова, Я.И.Раутенштейн //Микробиология. 1984. - Т.53. - Вып.З. - С.427-431.

9. Бриан Л.Е. Бактериальная резистентность и чувствительность к химиоп-репаратам: Пер. с англ. М.: Медицина, 1984. - 272с.

10. Бурцева Л.И. Бактериальные болезни насекомых /Л.И.Бурцева, М.В.Штерншис, Г.В.Калмыкова //Патогены насекомых: структурные и функциональные аспекты. М.: Круглый год, 2001. - С.167-245.

11. Вершинина В.И. Продукты на основе микробной биомассы /В.И.Вершинина, Ф.К.Алимова //Микробная биотехнология. Казань: Уни-пресс: ДАС, 2000 - С. 125-200.

12. Габдуллин В.Р. Наращиваем объёмы производства //Защита и карантин растений. 2003. - №6. - С. 19-20.

13. Галушка Ф.П. Изучение плазмид линий различных разновидностей Bacillus thuringiensis Berliner /Ф.П.Галушка, Р.Р.Азизбекян //Докл. Акад. наук СССР. 1977. - Т.236. - №5. - С. 1233-1235.

14. Гейл Э. Молекулярные основы действия антибиотиков /Э.Гейл, Э.Кандлифф, П.Рейнолдс, М.Ричмонд, М.Уоринг, М.: Мир, 1975. - 500с.

15. Глез В.М. Перспективы применения агата-25К на картофеле /В.М.Глез, М.К.Деревягина, В.И.Седова, С.В.Васильева //Защита и карантин растений. -2003.- №5. -С.27-29.

16. Глик Б. Молекулярная биотехнология.!Принципы и применение /Б.Глик, Дж.Пастернак /Пер. с англ. М.: Мир, 2002. - 5.89с.

17. Головко А.Э. Роль B.thuringiensis в природных биоценозах /А.Э.Головко, П.Н.Голышин, Н.Ф.Рябченко //Микробиологический журнал. 1993. - Т.55. -№3. - С. 104-109.

18. Голышин Н.М. Новые средства защиты растений от болезней //Защита растений. 1992 а. - №8. - С.50-54. .

19. Голышин Н.М. Резистентность возбудителей болезней растений к фунгицидам //Агрохимия. 1992 б. - №12. - С.130-150.

20. Горленко М.В. Бактериозы овощных культур //Защита растений. 1993. -№8. - С.50-51.

21. Гулий В.В. Микробиологическая борьба с вредными организмами /В.В.Гулий, Г.М.Иванов, М.В.Штерншис, М.: Колос, 1982. - 272с.

22. Далин М.В. Белковые токсины микробов /М.В.Далин, Н.Г.Фиш, М.: Медицина, 1980.-224с.

23. Дебабов В.Г. Выделение и предварительная характеристика хромосомных элементов ДНК Bacillus thuringiensis /В.Г.Дебабов, Р.Р.Азизбекян, О.И.Хлебалина, В.В.Дьяченко, Ф.П.Галушка, Р.А.Белиш //Генетика. 1977. -Т. 13. -№3. - С.496-501.

24. Дегтярева И.А. Микробиологический мониторинг почв агроценозов /И.А.Дегтярева, М.М.Ильясов, И.Т.Храмов //Агрохимический вестник. 2003. -№4. - С.30-32.

25. Доспехов Б.А. Методика полевого опыта. М.: Колос, 1979. - 416с.

26. Дятлова К.Д. Микробные препараты в растениеводстве //Соровский образовательный журнал. 2001. - Т.7. - №5. - С. 17-22.

27. Егоров Н.С. Основы учения об антибиотиках. М.: Высш. школа, 1979. -455с.

28. Егоров Н.С. О корреляции между инсектицидной и антибиотической активностями • параспоральных кристаллов В. thuringiensis /Н.С.Егоров, Т.Г.Юдина, А.Ю.Баранов //Микробиология. 1990. - Т.59. - №3. - С.448-452.

29. Ермолаева Н.И. Биопрепараты ; на основе ризосферных псевдомонад /Н.И.Ермолаева, Н.И.Иванова, Н.П.Скворцова, Е.А.Мордухова, Н.А.Вертохина, В.В.Кочетков, А.М.Боронин //Защита растений. 1992. - №8. - С.24-25.

30. Ефимов М.С. Об особенностях, оценки селекционного материала овощных культур на устойчивость к болезням;/М.С.Ефимов, В.В.Скляревская, М.Д.Дрокин, Н.Я.Ольховская //Труды по прикладной ботанике, генетике и селекции. 1979. - Т.64. - Вып.1. - С.110-115.

31. Залунин И.А. Белковый состав кристаллов дельта-эндотоксина различных серотипов Bacillus thuringiensis /И.А.Залунин, Г.Г.Честухина, В.М.Степанов //Биохимия. 1979. - Т. 44. - С.693-698.

32. Залунин И.А. О различии первичных структур дельта-эндотоксинов, образуемых разными серотипами В.thuringiensis /И.А.Залунин, Е.Д.Левин, Е.А.Тимохина, Г.Г.Честухина, В.М.Степанов //Биохимия. 1982. - Т.47. -Вып.9. - С.1570-1576.

33. Залунин И.А. Сравнительное изучение белков, образующих энтомоцид-ные кристаллы Bacillus thuringiensis подвида israelensis /И.А.Залунин, Л.И.Костина, Г.Г.Честухина, М.Е.Борматова, Ф.С.Клепикова, О.М.Ходова,

34. B.М.Степанов //Биохимия. 1986. - Т.51. -№3. - С.449-456.

35. Захаренко В.А. Развитие защиты растений и её научного обеспечения //Сельскохозяйственная биология. 2003. — №1. — С.93-107.

36. Зурабова Э.Р. Новые штаммы Bacillus thuringiensis subsp.kurstaki, выделенные из мельничной огнёвки /Э.Р.Зурабова, Т.П.Круглякова, М.К.Дергалюк //Сельскохозяйственная биология. 1988. — №5. — С.60-64.

37. Ивинскене В.Л. Фосфолипаза и термолабильный экзотоксин Bacillus thuringiensis //Энтомопатогенные бактерии и их роль в защите растений. 1987.1. C.57-75. .

38. Кагава Я. Биомембраны. — М.: Высшая школа, 1985. 303с.

39. Каменек Л.К. Влияние дельта-эндотоксина Bacillus thuringiensis на активный транспорт ионов у насекомых /Л.К.Каменек, М.В.Штерншис //Изв. СО АН СССР, сер. биология. 1984. - Вып.З. - С. 113-117.

40. Каменек Л.К. Действие эндотоксина Bacills thuringiensis на культуру клеток непарного шелкопряда /Л.К.Каменек,, Н.И.Харина //Актуальные проблемы земледелия химизации и защиты растений в Сибири. Новосибирск, 1981. -С.40.

41. Каменёк JI.K. Дельта-эндотоксин Bacillus thuringiensis: строение, свойства и использование для защиты растений. Дисс. докт. биол. наук. М., 1998. -345с.

42. Каменек JI.K. Разобщающее действие дельта-эндотоксина Bacillus thuringiensis /Л.К.Каменек, М.В.Штерншис //Интегрированная защита растений от болезней и вредителей в Сибири. Новосибирск, 1986. - С.80-85.

43. Кандыба Е.В. Бактериальные удобрения и урожай //Агрохимический вестник. 2003. - №3. - С.23-24.

44. Кандыбин Н.В. Бактериальные средства борьбы с грызунами и вредными насекомыми. — М.: Агропромиздат, 1989. 172с.

45. Кандыбин Н.В. Биопестициды. Теория и практика //Защита растений. -1991.-№1.-10-12.

46. Кандыбин Н.В. Для активации микробиометода //Защита и карантин растений. 2003. - №7. - С. 13-14.

47. Кандыбин Н.В. О создании микробных препаратов с полифункциональными свойствами /Н.В.Кандыбин, О.В.Смирнов //Агро XXI. 1999. - №9. — С.11.

48. Кандыбин Н.В. Проблемы микробиометода //Защита растений. 1995. -№6. - С.10-11.

49. Кашкин П.Н. Антибиотики и их практическое использование. Л.: Мед-гиз, 1952.-251с.

50. Киль В.И. Генетически модифицированный картофель, устойчивый к колорадскому жуку /В.И.Киль, В.Д.Надыкта //Агро XXI. 2002. - №1. - С.12-15.

51. Климентова Е.Г. Антимикробное действие дельта-эндотоксина B.thuringiensis в отношении ряда фитопатогенных бактерий. Автореф. дисс. К.6.Н.-М., 2001. -21с.

52. Коваленков В.Г. Проблема смены форм вредителей и тактика защиты /В.Г.Коваленков, М.С.Соколов //Агро XXI. 1999. - №7. - С.6-7.

53. Кольчевский А.Г. Изменчивость физиолого-биохимических свойств B.thuringiensis subsp.thuringiensis после пребывания в почве /А.Г.Кольчевский, А.Я.Лескова //Микробиология. Т.54. - 1985. - Вып.6. - С.1019-1020.

54. Корганова Н.Н. К методике оценки устойчивости тыквенных культур к аскохитозу /Н.Н.Корганова, О.В.Юрина, Т.Г.Успенская //Труды по прикл. бот., ген. и селекции. 1979.-Т.64.-Вып.1.-С.116-118.

55. Коробко А.П. Новые возможности микробиометода //Защита и карантин растений. 1997. - №5. - С.8-9.

56. Король А.Л. Пентафаг против угловатой пятнистости /А.Л.Король, А.Ф.Былинский //Защита растений. 1994. - №4. - С. 16-17.

57. Кузин А.И. Влияние условий культивирования на продукцию дельта-эндотоксина у B.thuringiensis subsp.morrisoni ■/А.И.Кузин, Т.Н.Шамшина, И.Б.Миненкова, Е.М.Шагов, P.P.Азизбекян //Биотехнология. 1994. - С.23-25.

58. Кузнецов Л.Е. Оптимизация синтетической питательной среды для культивирования B.thuringiensis /Л.Е.Кузнецов, М.П.Ховрычев //Микробиология. -1984. Т.53. - Вып.1. - С.54-57.

59. Кукси К.Э. Кристаллический белковый токсин B.thuringiensis: биохимия и механизм действия //Микроорганизмы в борьбе с вредными насекомыми и клещами. М.: Колос, 1976. - С.198-218.

60. Куренина Н.Е. Микроцины: природа и генетическое детерминирование /Н.Е.Куренина, И.А.Хмель //Молекулярная генетика, микробиол. и вирусол. -1986.-№4.-С.З.

61. Лапина В.В. Планриз протравитель и фунгицид /В.В.Лапина, Л.В.Гордеева, А.Г.Тостаева //Защита и карантин растений. - 2003. - №3. - С.19.

62. Логинов О.Н. Биопрепараты для томатов в защищенном грунте /О.Н.Логинов, Е.В.Свешникова, Е.Г.Пугачева, А.М.Шарафутдинова, Н.Н.Сили-щев //Аграрная наука. 2004. - №5. - С.7-8.

63. Лукьяненко А.Н. Селекция томатов на устойчивость к мозаике /А.Н.Лукьяненко, М.Е.Егиян, В.А.Беседина //Труды по прикл. бот., ген. и селекции. 1979. - Т.64. - В.1. - С.36-40.

64. Майгалит Й. Биологические методы контроля численности двукрылых насекомых с помощью Bacilllus thuringiensis subsp.israelensis /Й.Майгалит, Э.Бен-Дов //Патогены насекомых: структурные и функциональные аспекты. -М.: Круглый год, 2001. С.246-270.

65. Максимов В.Н. Влияние углеродного, азотного и фосфорного питания на рост R-, S- и М-диссоциантов Pseudomonas aeruginosa /В.Н.Максимов, Е.С.Милько, И.А.Ильиных //Микробиология. 1999 а. - Т.68. - №2. - С.206-210.

66. Максимов В.Н. Влияние углеродного, азотного и фосфорного питания на рост R-, S- и М-диссоциантов Pseudomonas aeruginosa в смешанных культурах /В.Н.Максимов, Е.С.Милько, И.А.Ильиных //Микробиология. 1999 б. - Т.68. -№4. - С.485-490.

67. Малинин О.А. Экологический контроль безопасности сельскохозяйственной продукции /О.А.Малинин, В.Д.Шуляк, Г.Н.Шевцова, Л.И.Бабий, В.В.Волощенко, Е.Е.Семернина, Н.П.Трофименко, О.М.Ялаш //Защита растений.- 1995.-№7.-С.13-15.

68. Матышевская М.С. Сверхчувствительная реакция у растений, инфицированных фитопатогенными бактериями //Труды по прикладной ботанике, генетике и селекции. 1979. - Т.64. - Вып.1. - С. 19-22.

69. Методические указания по качественной характеристике проростков при оценке прорастающих семян JI, 1968. - 54с.

70. Методы практической биохимии /Пер. с англ. М.: Мир, 1978. - 308с.

71. Милько Е.С. Влияние пониженных концентраций углерода, азота и фосфора в среде на динамику роста трёх диссоциантов Pseudomonas aeruginosa /Е.С.Милько, И.А.Ильиных //Микробиология. 2001. - Т.70. - №5. - С.607-610.

72. Милько Е.С. Влияние физических и химических факторов среды на рост диссоциантов Pseudomonas aeruginosa /Е.С.Милько, Л.А.Никитенко //Прикладная биохимия и микробиология. 1998. -Т.34. -№2. - С.171-174.

73. Милько Е.С. Гетерогенность популяции бактерий и процесс диссоциации (корине- и нокардиоподобные бактерии) /Е.С.Милько, Н.С.Егоров, М.: Изд-во МГУ, 1991.- 144с.

74. Милько Е.С. Экологическая роль процесса расщепления популяции бактерий на варианты /Е.С.Милько, Н.С.Егоров //Экологическая роль микробных метаболитов. М.: Изд-во МГУ, 1.986. - С.201-212.

75. Монастырский О.А. Биозащита зерновых культур от токсикогенных микроорганизмов //Защита и карантин растений. 2003. - №2. - С.5-8.

76. Надыкта В.Д. Биологическая защита растений и экологическая безопасность /В.Д.Надыкта, В.Я.Исмаилов //Arpo.XXI. 1999. - №10. - С. 10-11.

77. Наумова Н.А. Анализ семян на грибную и бактериальную инфекцию. -Л.: Колос, 1970.-208с.

78. Новожилов К.В. Некоторые направления экологизации защиты растений //Защита и карантин растений. — 2003. №8. - С. 14-17.

79. Новожилов К.В. Проблема химической коммуникации в биологических системах в связи с охраной окружающей среды /К.В.Новожилов, В.Н.Буров //Сельскохозяйственная биология. 1988. - №3. - С.106-111.

80. Озерецковская О.Л. Индуцирование устойчивости растений к болезням /О.Л.Озерецковская, Л.И.Чалова //Молекулярные и генетические механизмы взаимодействия микроорганизмов с растениями: Сб.науч.трудов. Пущино: НЦБИ АНСССР, 1989.-С.178-184.

81. Орлова М.В. Антибактериальная активность Bacillus laterosporus /М.В.Орлова, Т.А.Смирнова, Т.Н.Шамшина, Н.А.Коваленко, Р.Р.Азизбекян //Биотехнология. 1995. -№1-2. - С.22-26.

82. Паников Н.С. Кинетика роста микроорганизмов. М.: Наука, 1992. - 311 с.

83. Пилинская М.А. Мутагенное действие пестицидов //Итоги науки и техники. -М.: ВИНИТИ, общая генетика, 1986. -Т.9. С.97-151.

84. Плохинский Н.А. Математические методы в биологии. М.: Изд-во МГУ, 1978.-265с.

85. Практикум по биохимии. М.: Изд-во МГУ, 1989. - 508с.

86. Практикум по микробиологии. М.: Изд-во МГУ, 1976. - 307с.

87. Сахарова З.В. Кинетика роста и развития В .thuringiensis при периодическом культивировании /З.В.Сахарова, Ю.Н.Игнатенко, Ф.Шульц, М.П.Ховрычев, И.Л.Работнова //Микробиология. 1985. - Т.54. - Вып.4. -С.604-608.

88. Сахарова З.В. Рост и спорообразование, В.thuringiensis при высоких концентрациях субстратов /З.В.Сахарова; .И.Л.Работнова, М.П.Ховрычев //Микробиология. 1988. - Т.57. - Вып.6. - С.992-995.

89. Сахарова З.В. Споруляция и кристаллообразование у В. thuringiens is при лимитации роста источниками питания /З.В.Сахарова, Ю.Н.Игнатенко, М.П.Ховрычев, В.П.Лыков, И.Л.Работнова, В.В.Шевцов //Микробиология. -1984. Т.53. - Вып.2. - С.279-284.

90. Скулачёв В.П. Трансформация энергии в биомембранах. — М.: Наука, 1972.-203с.

91. Слободянюк Г.А. Биологическая защита овощных культур в закрытом грунте курортной зоны г.Сочи /Г.А.Слободянюк, Т.Н.Игнатьева, В.Н.Пилипюк //Защита растений. 1995. - №6. - С. 12-13.

92. Смирнов О.В. Патотипы B.thuringiensis и экологические основы их использования в защите растений Автореф.дисс.д.б.н. Санкт-Петербург - Пушкин, 2000.-42с.

93. Смирнова Т.А. Ультраструктура спор и кристаллов бактерий различных серотипов B.thuringiensis /Т.А.Смирнова, А.М.Михайлова, В.С.Тюрин, Р.Р.Азизбекян //Микробиология. 1984. - Т.53. - Вып.З. - С.455-462.

94. Соколов М.С. Биологическая защита растений в США /М.С.Соколов, Е.В.Литвишко //Защита растений. 1993. - №11. - С.18-20.

95. Соколов М.С. Генофонд микроорганизмов ресурс для биотехнологии /М.С.Соколов, А.И.Марченко, А.А.Денисов //Агро XXI. - 2002. - №1. - С.5-8.

96. Солонцов И.Л. Сканирующая туннельная и электронная микроскопия па-расп оральных кристаллов B.thuringiensis /И. Л. Солонцов, Т.Г.Юдина //Микробиология. 1996. - Т.65. - Вып.2. - С.235-240.

97. Список пестицидов и агрохимикатов, разрешенных к применению на территории Российской Федерации. Справочное издание /Приложение к журналу «Защита и карантин растений». 2002. - №6 - 393с.

98. Степанова Т.В. Штаммы B.thuringiensis, проявляющие множественную активность против широкого круга ■ насекомых /Т.В.Степанова, З.Ф.Барышникова, М.В.Чирков, В.Н.Жимерикин, Н.Ф.Рябченко //Биотехнология. 1996. -№12. - С. 17-22.

99. Сурмава М.Е. Лабораторный метод оценки на устойчивость капусты к киле//Труды по прикл. бот., ген., и селекции.-1979. Т.64.-В. 1. - С. 144-146

100. Третьяков А.П. В поддержку биометода //Защита растений. 1995. - №5. - С.14.

101. Трофименков В.Н. Биологические и иммунохимические свойства белка кристаллов B.thuringiensis var.galleriae и var.insectus /В.Н.Трофименков,

102. Р.И.Тумаркин, М.М.Файбич //Известия АН СССР, сер.биологическая. 1979. -№2. - С.296-300.

103. Ю.Тюльпинева А.А. Антифунгальное действие дельта-эндотоксина B.thuringiensis как экологически безопасного агента защиты растений. Дисс. к.б.н. Ульяновск, 2003. — 123с.

104. Умбрейт В.В. Манометрические методы изучения тканевого обмена /В.В.Умбрейт, Р.Х.Буррис, Дж.Ф.Штауффер, -М.: Изд-во И.Л., 1951. 359 с.

105. Федоров Л.А. Пестициды токсический удар по биосфере и человеку /Л.А.Федоров, А.В.Яблоков, - М.: Наука, 1999. - 460с.

106. ПЗ.Хакимов А.Х. Триходермин против фузариоза томатов /А.Х.Хакимов, Б.Я.Абдуллаев //Защита растений. 1992. - №8. - С.25.

107. Харькова А.П. Селекция сладкого перца, баклажанов, огурцов на устойчивость к болезням /А.П.Харькова, Н.М.Руденко //Труды по прикладной ботанике, генетике и селекции. 1979. -Т.64. -Вып.1. - С.93-96.

108. Хеймпел A.M. Безопасность энтомопатогенных микроорганизмов для человека и позвоночных животных //Микроорганизмы в борьбе с вредными насекомыми и клещами. М.: Колос, 1976. - С.373-390.

109. Хужамшукуров Н.А. Энтомоцидная активность бактериальных клеток

110. B.thuringiensis /Н.А.Хужамшукуров, Т.Ю.Юсупов, И.М.Халалов, А.Г.Гузалова, М.М.Мурадов, К.Д.Давранов //Прикладная биохимия и микробиология. 2001. -Т.37.-№6. — С.698-701.

111. Честухина Г.Г. Аминокислотные последовательности пептидов N-концевого домена дельта-эндотоксина Bacillus thuringiensis подвида alesti. Гипервариабельные участки эндотоксинов.; B.thuringiensis /Г.Г.Честухина,

112. C.А.Тюрин, А.Л.Остерман, О.П.Ходова, В.М.Степанов //Биохимия. 1986. -Т.51.-С. 1048-1050.

113. Честухина Г.Г. Белки кристаллов дельта-эндотоксина B.thuringiensis /Г.Г.Честухина, Л.И.Костина, И.А.Залунин, Т.С.Котова, С.П.Катруха, Ю.С.Кузнецов, В.М.Степанов //Биохимия. 197?. - Т.42. - Вып.9. - С. 1660-1667.

114. Честухина Г.Г. Изучение структуры и функции дельта-эндотоксинов и протеиназ Bacillus thuringiensis. Автореф. дисс. д.б.н. — М., 1990. 53с.

115. Честухина Г.Г. Протеиназы в процессе роста и спорообразования B.thuringiensis /Г.Г.Честухина, Т.С.Котова, И.А.Залунин, В.М.Степанов //Биохимия. 1979. - Т.44. - Вып.5. - С.769-802.

116. Честухина Г.Г. Сравнительная биохимия 5-эндотоксинов и ферментов Bacillus thuringiensis /Г.Г.Честухина, В.М.Степанов //Тезисы V Всесою-зного биохимического съезда. -М., 1985. — Т.1. С.236-237.

117. Честухина Г.Г. Структурное многообразие дельта-эндотоксинов Bacillus thuringiensis /Г.Г.Честухина, Л.И.Костина, И.А.Залунин, О.М.Ходова, В.М.Степанов //Тезисы VII Всесоюзн. симпозиума по химии белков и пептидов. -Таллин, 1987. -С.132-133.

118. Чулкина В.А. Экологическая концепция в защите растений от болезней //Защита растений. 1990.-№11. -С.7-12., t :

119. Швецова О.И. Пигментобразующие, варианты B.thuringiensis Berliner из тутового шелкопряда /О.И.Швецова, Э.Р.Зурабова //Микробиология. 1966. — Т.35. -Вып.З. — С.725-731.

120. Юдина Т.Г. Антимикробная активность белковых включений различных бактерий /Т.Г.Юдина, Н.С.Егоров //Доклады Академии Наук. 1996. - Т.349. — №2. - С.283-286.

121. Юдина Т.Г. Биологическая активность параспоральных кристаллов B.thuringiensis /Т.Г.Юдина, Н.С.Егоров, Ж.К.Лория, С.Н.Выборных //Изв. АНСССР. 1988. - сер.биологическая. - №3. - С.427-436.

122. Юдина Т.Г. Влияние источников углерода на биологическую активность и морфологию параспоральных кристаллов B.thuringiensis /Т.Г.Юдина, О.В.Саламаха, Е.В.Олехнович, Н.П.Рогатых, Н.С.Егоров //Микробиология. -1992. Т.61. - Вып.4. - С.577-584.

123. Юдина Т.Г. Действие дельта-эндотоксинов четырёх подвидов B.thuringiensis на различных прокариот /Т.Г.Юдина, Л.И.Бурцева //Микробиология. 1997. - Т.66. - № 1. - С.25-31.

124. Юдина Т.Г. Чувствительность диссоциантов Micrococcus luteus к действию дельта-эндотоксинов В.thuringiensis /Т.Г.Юдина, Е.С.Милько, Н.С.Егоров //Микробиология. 1996. -Т.65. -№3. - С.365-369.

125. Яблоков А.В. Об отрицательных последствиях применения пестицидов //Сельскохозяйственная биология. 1988. - №3. - С.99-105.

126. Akimenko V.K. The absence of energy conservation with electron transfer via the alternative pathway in cyanide-resistant yeast mitochondria /V.K.Akimenko, N.P.Golovchenko, A.G.Medentsev //Biohim. Et Biophys. Acta. 1979. - V.585. -P.398-403.

127. Aronson A. Structure and morphogenesis of the bacterial spore coat /A.Aronson, P.C.Fitz-James //Bacteriol.Revs. 1976. - V.40. - P.360-402.

128. Aronson A.I. Bacillus thuringiensis and related insect pathogens /A.I.Aronson, W.Beckman, P.Dunn //Microbiol. Rev. 1986. - V.50. - P. 1-24.

129. Aronson A.I. Mutagenesis of specificity and toxicity regions of a Bacillus thuringiensis protpxin gene /A.I.Aronson, D.Wu, C.Zhang //J. Bacteriol. 1995. - V.177 -P.4059-4065. >

130. Bechtel D.B. Electron microscope study of sporulation and parasporal crystal formation in Bacillus thuringiensis /D.B.Bechtel, L.A.Bulla //J. Bacteriol. 1976. -V.127. -P.1472-1481.

131. Berliner E. Uber die Schlaffsucht der Mehlmottenraupe (Ephestia Kiihniella Zell.) und ihren Erreger Bacillus thuringiensis n.sp. //Zeitschr.angew.Ent. 1915. -B.2. - S.29-56.

132. Bosch D. Recombinant Bacillus thuringiensis crystal proteins with new properties: possibilities for resistance management /D.Bosch, B.Schipper, H.van der Kleij, R.A.de Maagd, J.Stiekema//Bio/Technology. 1994. -№12. -P.915-918.

133. Bravo A. N-terminal Activation Is an Essential Early Step in the Mechanism of Action of the Bacillus thuringiensis CrylAc Insecticidal Toxin /A.Bravo, J.Sanchez, T.Kouskoura, N.Crickmore //J. Biol. Chem. 2002. - V.277. - P.23985-23987.

134. Bravo A. Phylogenetic relationships of Bacillus thuringiensis d-endotoxin family proteins and their functional domains //Jour. of. Bacteriol. 1997. - V.179. -№9. -P.2793-2801.

135. Bulla L.A. Characterization of the entomocidal parasporal crystal of Bacillus thuringiensis /L.A.Bulla, J.J.Kramer, L.I.Davidson //J. Bacteriol. 1977. - V.130. -P.375-383.

136. Bulla L.A. Entomocidal proteinaceous crystal of Bacillus thuringiensis /L.A.Bulla, K.J.Kramer, D.B.Bechtel, L.I.Davidson //In: Microbiology. Washington: D.C., 1976.- P.534-539.

137. Butko P. Cytolytic Toxin CytlA and Its Mechanism of Membrane Damage: Data and Hypotheses //Appl. and Env. Microbiology. 2003. - V.69. - №5. -P.2415-2422.

138. Butko P. Membrane permeabilization induced by cytolytic delta-endotoxin CytA from Bacillus thuringiensis var.israelensis /P.Butko, F.Huang, M.Pusztai-Carey, W.K.Surewicz//Biochemistry. 1996.-V.35.-P.11355-11360.

139. Carrol J. Analysis of Bacillus thuringiensis d-endotoxin action on insect-membrane permeability using a light-scattering assay /J.Carrol, D.J.Ellar //Eur. J. Biochem. 1993. - V.214. - P.771-778.

140. Charles J.F. Action de la 5-endotoxine de Bacillus thuringiensis var. israelen-sis sur cultures de cellules de Aedes aegypti L. //Ann. Microbiol. 1983. - V.134. -P. 365-381. , <

141. Cooksey K.E. Purification of a protein from Bacillus thuringiensis toxic to a larvae of Lepidoptera //Biochem.J. 1968. - V.106. - P.445-454.

142. Debro L. Two different parasporal inclusions are produced by Bacillus thuringiensis subsp.finitimus /L.Debro, P.C.Fitz-James, A.Aronson //J. Bacteriol. 1986.- V.165.-P.258-268.

143. Dulmage H.T. Insecticidal activity of isolates of Bacillus thuringiensis and their potential for pest control //In: Microbial, control of pests and plant diseases (Burges H.D) Acad. Press: London, 1981. - P.l93-222.

144. Fast P.G. The 5-endotoxin of Bacillus thuringiensis. 4. The effect of 8-endotoxin on ion regulation by midgut tissue of Bombyx mori larvae /P.G.Fast,

145. R.Milne//J.Invert. Pathol.-1979.-V.34.-P.319.

146. Faust R. Degradation of the parasporal crystal produced by Bacillus thuringiensis var.kurstaki /R.Faust, G.Hallam, R.Travers //J. Invertebr. Pathol. 1974 a.- V.24.-P.365-373.

147. Faust R. Preliminary investigations on the molecular mode of action of the 5-endotoxin produced by Bacillus thuringiensis var.alesti /R.Faust, R.Travers, G.Hallam//J. Invertebr. Pathol. 1974 b. - V.23. - P.259-261.

148. Faust R.M. Comparative morphology and size distribution of the parasporal• crystals from various strains of Bacillus thuringiensis /R.M.Faust, J.R.Adams, K.Abe, T.Iizzuka, L.A.Bulla//J. Sericult. Sci. Jap. 1982. - V.51. - P.316-324.

149. Faust R.M. Nature of pathogenig process of Bacillus thuringiensis //Compar. Pathol. 1984. - V.7. - P.91-141.

150. Favret M.E. Thuricin: the bacteriocin produced by Bacillus thuringiensis /M.E.Favret, A.A.Yousten //J. Invertebr. Pathol. 1989. - V.53. -№2. - P.206-216.

151. Fedhila S. The InhA2 Metalloprotease of Bacillus thuringiensis Strain 407 Is Required for Pathogenicity in Insects Infected via the Oral Route /S.Fedhila, P.Nel, D.Lereclus //J. Bacteriol. 2002. - V. 184. - P.3296-3304.

152. Ge A.Z. Functional domains of Bacillus thuringiensis insecticidal crystal proteins /A.Z.Ge, D.Rivers, R.Milne, D.H.Dean //J. Biol. Chem. 1991. - V.266. -P.17954-17958.

153. Gill S.S. Identification, isolation and cloning of a Bacillus thuringiensis Cry-IAc toxin-binding protein from midgut of the lepidopteran insect Heliothis virescens

154. Щ /S.S.Gill, E.A.Cowlest, V.Francis //J. Biol. Chem. 1995. - V.270. - P.27277-27282.

155. Gonzales J. Transfer of Bacillus thuringiensis plasmids coding for S-endotoxin among strains of B.thuringiensis and B.cereus /J.Gonzales, B.Brown, B.Carlton //Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1982. - V.79. - P.6951-6955.

156. Gonzales J.M. Correlation between specific plasmids and 5-endotoxin production in Bacillus thuringiensis /J.M.Gonzales, H.T.Dulmage, B.C.Carlton //Plasmid. -1981. V.5. - P.351-365.

157. Grigorova R.E. On the shape and structure of the crystal in two strains of Ba-• cillus thuringiensis /R.E.Grigorova, E.Kantardgieva, N.Pashov //J. Invert. Pathol.1967. V.9. - P.503-509.

158. Grochulski P. Bacillus thuringiensis CrylA(a) insecticidal toxin: crystal structure and channel formation /Р.Grochulski, L.Masson, S.Borisova, M.Pusztai-Carey, J.L.Schwartz, R.Brousseau, M.Cygler //J. Mol. Biol. 1995. - V.254. - P.447-464.

159. Guerchicoff A. The Bacillus thuringiensis cyt Genes for Hemolytic Endotoxins Constitute a Gene Family /A.Guerchicoff, A.Deldcluse, C.P.Rubinstein //Appl. Environ. Microbiol. 2001. - V. 67P. 1090-1096.

160. Haider M.Z. Mechanism of action of Bacillus thuringiensis insecticidal delta-endotoxin: interaction with phospholipid vesicles /M.Z.Haider, D.J.Ellar //Biochim. Biophys. Acta. 1989. - V.978 - P.216-222.

161. Hannay C.L. Crystalline inclusions in aerobic sporeforming bacteria //Nature. -1953.-V.172.-P.1004.

162. Hannay C.L. Inclusions in bacteria //In: Bacterial Anatomy. Spooner E. and Stocker B. (eds.), 1956. - P.318-340.

163. Hannay C.L. The protein crystals of Bacillus thuringiensis Berliner /C.L.Hannay, P.Fitz-James //Can. J. Microbiol. 1955. - V.l. - P.694-710.

164. Heimpel A.M. A critical review of Bacillus thuringiensis var. thuringiensis Berliner and other crystalliferous bacteria //Ann. Rev. Entomol. 1967. - V.l2. -P.287-322.

165. Heimpel A.M. Bacterial insecticides /A.M.Heimpel, T.A.Angus //Bacteriol. Rev. 1960. - V.24. - P. 266-288.

166. Herbert B.N. Biosynthesis of the crystal protein of B.thuringiensis var.tohvorthi: 1.Kinetics of formation of the polypeptide components of the crystal protein in vivo /B.N.Herbert, H.J.Gould //Eur. Biochem. 1973. - V.37. - P.441-448.

167. Hodgman T.C. Models for the structure and function of the Bacillus thuringiensis 8-endotoxins determined by compilational analysis /T.C.Hodgman, D.J.Ellar //DNA Seq. 1990. - V. 1. - P.97-106.

168. Hofte H. Insecticidal Crystal Proteins of Bacilllus thuringiensis /H.Hofte, H.R. Whiteley //Microbiol.Rev. 1989. - V.53.-№2. - P.242-255.

169. Israil A.M. Recent data on the molecular biology of bacteriocins //Arch.roum.pathol.exptlet microbiol. 1984. - №1. -P.5.

170. Ito A. A Bacillus thuringiensis Crystal Protein with Selective Cytocidal Action to Human Cell /A.Ito, Y.Sasaguri, S.Kitada, Y.Kusaka, K.Kuwano, K.Masutomi, E.Mizuki, T.Akao, M.Ohba //J. Biol. Chem. 2004. - V.279. - №20. - P.21282-21286.

171. Klier A. Cloning and expression of the crystal protein genes from Bacillus thuringiensis strain Berliner 1715 /A.Klier, F.Fargette, F.Ribier, J.Ribier, G.Rapoport //EMBO Journ. 1982. - V.l. - P.791-799.

172. Knowles B.H. Colloid-osmotic lysis is a general feature of the mechanism of action of Bacillus thuringiensis 5-endotoxins with different insect specificity /B.H.Knowles, D.J.Ellar //Biochim. Biophys.Acta. 1987. - V.924. - P.509-518.

173. Knowles B.H. Mechanism of action of Bacillus thuringiensis insecticidal delta-endotoxins //Adv. Insect. Phys. 1994. - V.24. - P.275-303.

174. Koni P.A. Cloning and characterization of a novel Bacillus thuringiensis cytolytic delta-endotoxin /P.A.Koni, D.J.Ellar //J. Mol. Biol. 1993. - V.229. - P.319-327.

175. Krieg A. A new serotype of Bacillus thuringiensis isolated in Germany: Bacillus thuringiensis var.darmstadiensis /A.Krieg, H.de Barjac, A.Bonnefoi //J. Invert. Pathol. 1968. - V. 10. - P.428-430.

176. Krieg A. Bacillus thuringiensis var.tenebrionis: a new pathotype effective against larvae of Coleoptera /A.Krieg, A.M.Huger, G.A.Langenbruch, W.Shnetter //Z. Angew. Entomol. 1983. - B.96. - №.5. - S.500-508.

177. Krieg A. Bioinsecticides: A Bacillus thuringiensis /A.Krieg, H.G.Miltenburger //Advances in biotechnological processes. 1984. - V.3. - P.273-290.

178. Labaw L.W. The structure of Bacillus thuringiensis Berliner crystals //J. Ultra-struct. Res. 1964. - V.10. - P.66-75.

179. Le Binh T. Differential Effects of pH on the Pore-Forming Properties of Bacillus thuringiensis Insecticidal Crystal Toxins /T.Le Binh, V.Vachon, J.-L.Schwartz, R.Laprade //Appl.and Environment. Microb. 2001. - V.67. - №10. - P.4488-4494.

180. Lecadet M.M. Action comparee de l'uree et du thioglycolate sur la toxine fig-uree de Bacillus thuringiensis //Compt. Rend. Acad. Sci. 1967. - V.264. - P. 28472850.

181. Lecadet M.M. Enzymatic hydrolysis of the crystals of Bacillus thuringiensis by the proteases of Pieris brassicae. 1. Preparation and fractionation of the lysates /М.М.Lecadet, R.Dedonder //J. Invertebrate Path. 1967. - №9. - P.310-321.

182. Lecadet M.M. La toxine figuree de Bacillus thuringiensis. Fechnique de separation et composition en acides amines //Compt. Rend. Acad. Sci. 1965. - V.261. -P.5693-5696.

183. Lecadet M.M. The formed toxin of Bacillus thuringiensis. Dissolution by the action of thioglycolate or cysteine //C. R. Acad. Sci. Hebd. Seances Acad. Sci. D. — 1966. V.262. — №1. - P.195-198.

184. Lee M.K. Domain III exchanges of Bacillus thuringiensis CrylA toxins affect binding to different gypsy moth midgut receptors /M.K.Lee, B.A.Young, D.H.Dean //Biochem. Biophys. Res. Commun. 1995. - V.216. - P.306-312.

185. Lereclus D. Diversity of B.thuringiensis toxins and genes /D.Lereclus,

186. A.Delecluse, M.M.Lecadet //Bacillus thuringiensis, an Environmental Biopesticide: Theory end Practice /P.F.Entwistle, J.S.Cory, M.J.Bailey, S.Higgs. Chichester, United Kingdom: John Willey & Sons, 1993. - P.37-69.

187. Lereclus D. Isolation of a DNA sequence related to several plasmids from Bacillus thuringiensis after a mating involving the Streptococcus faecalis plasmid pAMJ31 /D.Lereclus, G.Mennou, M.M.Lecadet //Mol and Gen. Genet. 1983. -V.191. - P307-313.

188. Lereclus D. Molecular relationships among plasmids of Bacillus thuringiensis: conserved sequences through 11 crystalliferous strains /D.Lereclus, M.M.Lecadet, J.Ribier, R.Dedonder //Mol. and Gen. Genet. 1982. - V. 186. - №3.- P391-398.

189. Li J. Crystal structure of insecticidal d-endotoxin from Bacillus thuringiensis at 2.5 A resolution/J.Li, J.Carroll, D.J.Ellar//Nature. 1991. - V.353. - P.815-821.

190. Li J. Structural implications for the transformation of the Bacillus thuringiensis d-endotoxins from water-soluble to membrane-inserted forms /J.Li, D.J.Derbyshire,

191. B.Promdonkoy, D.J.Ellar//Biochem. Soc. Trans. 2001. - V.29. - P.571-577.

192. Li J. Structure of the mosquitocidal delta-endotoxin CytB from Bacillus thuringiensis ssp.kyushuensis and implications for membrane pore formation /J.Li, P.A.Koni, D.J.Ellar//J. Mol. Biol. 1996. - V.257. -№1. - P.129-152.

193. Liang Y. Irreversible binding kinetics of Bacillus thuringiensis CrylA 5-endotoxins to gypsy moth brush border membrane vesicles is directly correlated to toxicity /Y.Liang, S.S.Patel, D.H.Dean //J. Biol. Chem. 1995. - V.270. - P.24719-24724.

194. Lightwood D.J. Role of proteolysis in determining potency of Bacillus thuringiensis Cryl Ac 5-endotoxin /D.J.Lightwood, D.J.Ellar, P.Jarrett //Applied and Environmental Microbiology. 2000. - V.66. - № 12. - P.5174-5181.

195. Lilley M. Purification of the insecticidal toxin in crystals of Bacillus thuringiensis /M.Lilley, R.N.Ruffel, H.J.Somerville //J. Gen. Microbiol. 1980. - V.l 18. -P.l-11.

196. Lorence A. 8-Endotoxins induce cation channels in Spodoptera frugiperda brush border membranes in suspension and in planar lipid bilayers /A.Lorence,

197. A.Darszon, C.Diaz, A.Lievano, R.Quintero, A.Bravo //FEBS Lett. 1995. - V.360. -P.217-222.

198. Lu H.L. Identification of amino acid residues of Bacillus thuringiensis d-endotoxin CrylAa associated with membrane binding and toxicity to Bombyx mori /H.L.Lu, F.Rajamohan, D.H.Dean//J. Bacteriol.- 1994. V. 176. - P.5554-5559.

199. Luthy P. Insecticidal toxins of Bacillus thuringiensis //FEMS Microbiology Letters. 1980.-V.8.-P. 1-7.

200. Marrone P.G. Strain of Bacillus for controlling plant disease /P.G.Marrone, S.D.Heins, D.C.Manker, D.R.Jimenez, C.N.Chilcott, P.Wigley, A.Broadwell /Пат.5919447. CIIIA, 1999. МПК6 AO IN 63/00, C12N 1/20.

201. Masson L. The CrylA(c) receptor purified from Manduca sexta displays multiple specificities /L.Masson, Y.-J.Lu, A.Mazza, R.Brousseau, M.J.Adang //J. Biol. Chem. 1995. - V.270. - P.20309-20315.

202. Monro R. Protein turnover and the formation of protein inclusions during sporulation of Bacillus thuringiensis //Biochem. J. 1961. - V.81. - P.225-232.

203. Norris J.R. Electron Microscope study of sporulation and protein crystal formation in Bacillus cereus var.alesti /J.R.Norris, D.H.Watson //G. Gen. Microbiol. -I960.- V.22. P.744-749.

204. Ohba M. Crystals of Bacillus thuringiensis subsp.yunnanensis are produced only in asporogenous cells /M.Ohba, K.Aizawa //J. Invert. Pathol. 1986. - V.48. -P.254-256.

205. Pendleton I.R. Characterization of crystal protoxin and an activated toxin from Bacillus thuringiensis var.entomocidus //I. Invertebr. Pathol. 1973. - V.21. — P.46-49.

206. Pendleton I.R. Toxic subunits of the crystal of Bacillus thuringiensis //J. Appl. Bacteriol. 1968. - V.31. - P.208-214.

207. Peyronnet O. Ion channel activity from the midgut brush-border membrane of Gypsy moth (Lymantria dispar) larvae /О.Peyronnet, V.Vachon, J.-L.Schwarz, R.Laprade // Jour, of Exp. Biol. 2000. - V.203. - P. 1835-1844.

208. Poncet S. Evaluation of synergistic interactions between the CrylVA, CrylVB and CrylVD toxic components of B. thuringiens is subsp.israelensis crystals /S.Poncet, A.Delecluse, A.Klier, G.Rapoport //J. Invert. Pathol. 1995. - V.66. - P.131-135.

209. Prasad S.S. Biochemistry and biological activities of the proteinaceous crystal of Bacillus thuringiensis /S.S.Prasad, Y.I.Shethna //J. Sci. Ind. Res. 1976. - V.35. -P.626-632.

210. Prasad S.S. Mode of action of a purified antitumor protein from the proteinaceous crystal of B.thuringiensis on Yoshida ascites Sarcoma cells /S.S.Prasad, Y.I.Shethna //Antimicrob. Agents and Chemother. 1976. - V.l0. - №2. - P.293.

211. Ravoahangimalala O. In vitro binding of Bacillus thuringiensis var.israelensis individual toxins to midgut sells of Anopheles gambiae larvae (Diptera: Culicidae) /O.Ravoahangimalala, J.-F.Charles //FEBS Letters. 1995. - V.362. - P.l 11-115.

212. Rosenberg M. Respiratory control in Micrococcus lysodeikticus /M.Rosenberg, I.Friedberg //J. Bioenerg.and Biomembr. 1984. - V.16. - P.61-68.

213. Sayles V.B. Small polypeptide components of the Bacillus thuringiensis. Parasporal crystalline inclusion /V.B.Sayles, J.N.Aronson, A.Rosenthal //Biochem. Biophys. Res. Commun. 1970. - V.41. - P.l 126-1133.

214. Schnepf E. Bacillus thuringiensis and Its Pesticidal Crystal Proteins /E.Schnepf, N.Criclcmore, J.Van Rie, D.Lereclus, J.Baum, J.Feitelson, D.R.Zeigler, D.H.Dean //Microbiology and Molecular Biology Reviews. 1998. - V.62. - №3. -P.775-806.

215. Schnepf H.E. Delineation of a toxin-encoding segment of a Bacillus thuringiensis crystal protein gene /Н.E.Schnepf, H.R.Whiteley //J. Biol. Chem. 1985. -V.260. - P.6273-6280.

216. Schnepf H.E. Specificity-determining regions of a lepidopteran-specific insecticidal protein produced by Bacillus thuringiensis /Н.Е.Schnepf, K.Tomczak, J.P.Ortega, H.R.Whiteley //J. Biol. Chem. 1990. - V.265. - P.20923-20930.

217. Schnepf H.E. The amino acid sequence of a crystal protein from Bacillus thuringiensis deduced from the DNA base sequence /H.E.Schnepf, H.C.Wong, H.R.Whiteley //Jour. Biologic.Chem. 1985. - V.260. - №10. - P.6264-6272.

218. Sharpe E.S. Ultrastructure of the Unusual crystal of the HD-1 isolate of Bacillus thuringiensis var.kurstaki /E.S.Sharpe, F.L.Baker //J. Invert. Pathol. 1979. -V.34.-P. 320-322.

219. Slatin S.L. Delta-endotoxins form cation-selective channels in planar lipid bilayers /S.L.Slatin, C.K.Abrams, L.English //Biochem. Biophys. Res. Commun. -1990.-V.169.-P.765-772.

220. Somerville H.J. Association of the crystalline inclusion of Bacillus thuringiensis with the exosporium /H.J.Somerville, C.R.James //J.Bacterid. 1970. - V.102. -P.580-583.

221. Somerville H.J. The insecticidal endotoxin of Bacillus thuringiensis //Citta del Vaticano. 1977. - V.41. - P.253-268.

222. Stahly D.P. Multiple extrachromosomal deoxyribonucleic acid molecules in Bacillus thuringiensis /D.P.Stahly, D.W.Dingman, R.L.Irgens, C.C.Field, M.G.Feiss, G.L.Smith //FEMS Microbiol. Lett. 1978. - V.3. - P.139-141.

223. Steinhaus E.A. Possible use of Bacillus thuringiensis Berliner as an aid in the biological control of the alfalfa caterpillar. Hilgardia. - 1951. - V.20.-P. 359-381.

224. Thomas W.E. Bacillus thuringiensis var.israelensis crystal delta-endotoxin: effects on insect and mammalian cells in vitro and in vivo /W.E.Thomas, D.J.Ellar //J. Cell Sci.- 1983. V.60. - P.181-197.

225. Travers R. Effects of Bacillus thuringiensis var.kurstaki 5-endotoxin on isolated lepidopteran mitochondria /R.Travers, R.Faust, C.F.Reichelderfer //J. Invertebr. Pathol. 1976 b.-V.28.-P. 351-356.

226. Vankova I. An electron microscope study of protein crystals in different strains of the Bacillus thuringiensis group /I. Vankova, O.Kralik //Ztbl. f. Bact. 1966. - V. 199. - P.380-386.

227. Vankova I. Bacillus thuringiensis in praktischer Anwendung Intern. Colloq. Insect Pathol //Entomophaga. 1962. - V.2. - P.271-291.

228. Vidaver А.К. Bacteriocins: the future and reality //Plant Disease. 1983. -V.6 7.-№5.-P.471.

229. Wu D. Localized mutagenesis defines regions of the Bacillus thuringiensis d-endotoxin involved in toxicity and specificity /D.Wu, A.I. Aronson /J. Biol. Chem. -1992.-V.267.-P.2311-2317.

230. Wu D. Synergism in mosquitocidal activity of 26 and 65 kDa proteins from Bacillus thuringiensis subsp.israelensis crystal /D.Wu, F.N.Chang //FEBS Lett. -1985.- V.190.-P.232-236.

231. Wu D. Synergism of mosquitocidal toxicity between CytA and CrylVD proteins using inclusions produced from cloned genes of Bacillus thuringiensis /D.Wu, J.J.Johnson, B.A.Federici //Mol. Microbiol. 1994. - V.13. - P.965-972.

232. Wu S.J. Functional significance of loops in the receptor binding domain of Bacillus thuringiensis CryHIA d-endotoxin /S.J.Wu, D.H.Dean //J. Mol. Biol. 1996. -V.255. - P.628-640.

233. Yamamoto T. Identification of entomocidal toxins of Bacillus thuringiensis by high performance liquid chromatography //J. Gen. Microbiol. 1983. - V.129. -P.2595-2603.

234. Yamamoto T. Two type of entomocidal toxins in the parasporal crystals of Bacillus thuringiensis subsp.kurstaki /Т.Yamamoto, T.Iizuka //Arch. Biochem. Biophys. 1983.-V.227.-P.233-241.

235. Young J.E. Chemical and morphological studies of bacterial spore formation. II. Spore and parasporal protein formation in Bacillus cereus var.alesti /J.E.Young, P.C.Fitz-Jomes //J. Biophys. Biochem. Cytol. 1959. - V.6. - P.483-498.

236. Yousten A.A. Metabolism of Bacillus thuringiensis in relation to spore and crystal formation /A.A.Yousten, M.H.Rogoff //J. Bacteriol. 1969. - V. - 100. — P.1229-1236.

Информация о работе

Левина, Татьяна Александровна
кандидата биологических наук
Казань, 2005
ВАК 03.00.07

Диссертация

Особенности антибактериального действия дельта-эндотоксинов Bacillus thuringiensis как перспективного агента защиты растений - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Особенности антибактериального действия дельта-эндотоксинов Bacillus thuringiensis как перспективного агента защиты растений - тема автореферата по биологии, скачайте бесплатно автореферат диссертации

Похожие работы