Органотипическая культура сетчатки глаза как модель для оценки эффективности трансплантации клеток

Сергеев, Сергей Александрович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Органотипическая культура сетчатки глаза как модель для оценки эффективности трансплантации клеток
ВАК РФ 03.03.05, Биология развития, эмбриология

Автореферат диссертации по теме "Органотипическая культура сетчатки глаза как модель для оценки эффективности трансплантации клеток"

На правах рукописи

СЕРГЕЕВ

Сергей Александрович

Органотипическая культура сетчатки глаза как модель для оценки эффективности трансплантации клеток

03.03.05 - биология развития, эмбриология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 7 НОЯ 2011

МОСКВА -2011-

005002325

Работа выполнена на кафедре эмбриологии Биологического факультета Московского Государственного Университета имени М.В.Ломоносова

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор Мария Львовна Семенова

Биологический факультет МГУ имени М.ВЛомоносова

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук,

заведующий Лабораторией проблем регенерации

Элеонора Норайровна Григорян

Институт Биологии Развития им. Н.К.Кольцова РАН, Москва

кандидат биологических наук, доцент Ксения Андреевна Рубина

факультет Фундаментальной медицины МГУ имени М.В.Ломоносова, Москва

Ведущая организация:

Научно-исследовательский институт Морфологии человека РАМН, Москва

Защита диссертации состоится 15 ноября 2011 года в 15 часов 30 минут

на заседании диссертационного Совета Д.501.001.52 в Московском государственном университете им. М.В. Ломоносова по адресу: 119899, Москва, МГУ, Биологический факультет, ауд. М-1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета МГУ им М.В. Ломоносова.

Автореферат разослан 15 октября 2011 года

Ученый секретарь

диссертационного совета, кандидат биологических наук

Е.Н. Калистратова

Общая характеристика работы Актуальность проблемы

Возможность направленной и контролируемой дифференцировки стволовых клеток является одной из наиболее актуальных задач современной биологии развития. Накопленные к настоящему времени данные по решающему значению микроокружения для дифференцировки трансплантированных стволовых клеток позволили существенно расширить возможности их терапевтического введения, а работы по трансдифференцировке одних клеточных типов в другие открывают широкие перспективы к репарации повреждений тканей с использованием клеточной терапии [Zwart et ai, 2008]. Но, несмотря на большое число примеров удачного использования трансплантированных клеток, все еще остаются нерешенными фундаментальные вопросы о взаимодействии введенных клеток с микроокружением реципиента. Так, например, почти не исследовано поведение инъецированных клеток при трансплантации в развивающиеся структуры, не закончившие свою дифференцировку. Продолжаются дискуссии о механизмах избирательной миграции трансплантата в области поражения и об эффективности восстановления ткани трансплантированными клетками. И, наконец, остается непонятным, что происходит с клетками и их потомками в ткани реципиента в первые часы после трансплантации, с какими структурами они устанавливают взаимосвязи и как регулируется их поведение.

В связи с этим необходимо создание адекватных модельных систем, максимально приближенных к условиям in vivo, которые позволят не только с легкостью детектировать процессы клеточной миграции, дифференцировки и гибели клеток на любых сроках после трансплантации, но и вносить коррективы в поведение трансплантируемых клеток. Одной из таких моделей является органотипическая эксплантационная культура сетчатки глаза [,Johansson et al., 2000, Ghosh et al., 2010]. Развитие сетчатки глаза не заканчивается в пренатальном периоде, а продолжается еще некоторое время после рождения. В течение этого периода онтогенеза происходит формирование четко организованной сложной пространственной структуры нейросетчатки, представляющей большой интерес для исследования поведения в ней трансплантированных клеток, изменения программы их дифференцировки в новом микроокружении и возможности их включения в образующиеся нейрональные сети сетчатки глаза.

Изменения в сетчатой оболочке глаза, вызванные разнообразными внешними повреждающими факторами, часто ведут к частичной или полной утрате зрения. Процесс репарация этих дефектов сходен с процессами нормального онтогенеза сетчатки. Для предотвращения развития необратимых нейродегенеративных процессов в сетчатке глаза предлагается применять трансплантацию клеток с

широкими потенциями к дифференцировке - стволовых/прогеииторных элементов нервной ткани (НСПК) [Александрова и др., 2005, Blongrt al., 2010] или клеток стромы костного мозга (ММСК) [Phinney et al., 2004]. При введении в организм реципиента, данные клетки активно мигрируют к месту повреждения, дифференцируются и замещают утраченные элементы дефектной ткани, а так же секретируют целый спектр трофических и регуляторных факторов, поддерживающих функциональность поврежденной ткани и активирующих ее собственные системы репарации [Blong et al., 2010]. Так же инъекции клеток пигментного эпителия (ПЭ) при различных повреждениях сетчатки приводят к значительному улучшению клинической картины и быстрой репарации повреждений сетчатой оболочки глаза [Semkovaetal, 2002].

В ряде работ по трансплантации ММСК in vivo отмечается морфологическое и биохимическое преобразование этих клеток не только в нейроны [Sanchez-Ramos, 2002], но и в терминально дифференцированные фоторецепторные клетки [Tomita et al, 2006]. Костный мозг представляет собой сравнительно легкодоступный материал для выделения аллогенных мультипотентных клеток, использование которых позволяет избежать многих биомедицинских и этических проблем, ограничивающих применение НСПК [Kabos et al., 2002]. Однако вопрос о функциональном замещении нервных клеток трансдифференцированными ММСК и их потомками остается открытым.

Цель и задачи исследования

Целью работы являлось создание модели нейросетчатки in vitro на базе органотипической эксплантационной культуры, пригодной для исследования распределения и дифференцировки различных типов клеток после их трансплантации и для оценки возможности функционального восстановления сетчатки при ее патологических изменениях.

Для достижения указанной цели были поставлены следующие задачи:

1) Получить долгосрочно-переживающие культуры нейросетчатки глаза крыс и показать их эквивалентность сетчатке in vivo.

2) Продемонстрировать адекватность полученной модели на примере исследования реакций эксплантатов сетчатки на трофические факторы (BDNF, PEDF, эритропоэтин, ангиопоэтин) и препараты (Авастин™, Церебролизин).

3) Получить культуры EGFP+ клеток (ММСК, НСПК, ПЭ) мышей линии C57BL/6-Tg(ACTB-EGFP)/Osb/J и провести их трансплантацию in vitro в интактные эксплантаты сетчатки с последующей оценкой миграции, распределения, и дифференцировки трансплантированных клеток на различных сроках после инъекции.

4) Разработать систему контролируемого лазерного повреждения сетчатки in vitro и оценить его влияние на поведение трансплантированных НСПК и ММСК, на основе чего провести оптимизацию способов трансплантации клеточного материала в поврежденную сетчатку глаза с целью наиболее эффективной репарации дефектов.

5) Исследовать процессы восстановления поврежденной нейросетчатки на функциональном уровне с применением НСПК и ММСК, оценить возможность функциональной интеграции трансплантированных клеток в поврежденную сетчатку глаза.

Научная новизна работы

Оптимизирован протокол выделения и долгосрочного ведения эксплантационной культуры сетчатки. Показано продолжение морфологического разделения эксплантатов неонатальной сетчатки на слои и самоорганизация их клеток в примитивные нейрональные сети in vitro. Разработана адекватная модель для тестирования экзогенных трофических факторов и факторов роста на сетчатке глаза на примере эксплантационной культуры. Впервые проведена трансплантация НСПК и ММСК in vitro в различные слои нейросетчатки и подробно исследовано поведение инъецированных клеток непосредственно после введения. Получены уникальные данные по выявлению оптимального способа трансплантации различных типов клеток. Разработана оригинальная методика контролируемого повреждения сетчатки глаза при помощи инфракрасного лазерного излучения, проведено подробное исследование поведения и дифференцировки НСПК и ММСК, трансплантированных в поврежденные эксплантаты сетчатки глаза. Исследована возможность функциональной интеграции трансплантированных клеток в состав сетчатки глаза.

Научно-практическое значение работы

Функциональная реабилитация сетчатки при патологиях различного генеза в настоящее время остается актуальной задачей. В данной работе использована адекватная модель развивающейся сетчатки глаза in vitro — органотипическая эксплантационная культура, которая позволила исследовать действия различных трофических факторов и последствия трансплантации стволовых клеток. Разработана методика in vitro трансплантации различных типов клеток в определенные слои эксплантата сетчатки, что позволило детально охарактеризовать микроокружение трансплантата и проследить поведение отдельных инъецированных клеток на разных сроках после введения. Выявлены различия миграционной активности и потенции к дифференцировке инъецированных клеток в зависимости от способа введения в органотипическую культуру сетчатки. Исследование процессов миграции и дифференцировки трансплантированных клеток при инъекции в органотипические культуры сетчатки позволило обосновать эффекты клеточной терапии, проводимой in

vivo с целью репарации повреждений сетчатки. Полученные данные в дальнейшем позволят оптимизировать протоколы трансплантации клеток ПЭ, НСПК и ММСК, применимые в клинической практике. На основе анализа данных, полученных после трансплантации НСПК и ММСК в сетчатку, поврежденную лазерным излучением, показана возможность прогноза поведения этих клеток при их инъекции in vivo и дано обоснование некоторым неудачным попыткам восстановления зрительной функции после трансплантации.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Органотипическая культура сетчатки является адекватной моделью развивающейся нейросетчатки глаза, сохраняет свой клеточный состав и гистологическую организацию клеток, реагирует на экзогенные факторы роста и дифференцировки аналогично сетчатке in vivo.

2. Место и способ трансплантации обуславливают распределение трансплантированных НСПК, ММСК и клеток ПЭ в сетчатке, организацию их в ассоциаты и дальнейшую дифференцировку. В отсутствии повреждения эксплантата основные изменения миграционной активности инъецированных клеток происходят в первые часы после введения, а сама миграция завершается к 3-м суткам после инъекции.

3. Повреждение сетчатки лазером стимулирует миграционную активность трансплантированных клеток (до 14 суток после инъекции), обладая мощным атграгирующим эффектом, ускоряет их дифференцировку, приводит к морфологическому преобразованию ММСК в нейроноподобные клетки. Инъекция клеток в слои нейросетчатки или нанесение их на ее фоторецепторную поверхность (при моделировании протоколов, используемых в клинике) имеет принципиальное значение для реализации терапевтического действия трансплантированных клеток.

Апробация работы

Результаты работы были представлены на Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов» (2007,2008,2009,2010,2011), Москва; Международном междисциплинарном конгрессе «Нейронаука для медицины и психологии» (2007, 2008, 2009, 2010, 2011) Судак, Украина; Федоровских чтениях (2007, 2008), Москва; Школе-конференции для молодых ученых «Методы культивирования клеток» 2008, Санкт-Петербург; XV Школе «Актуальные проблемы биологии развития» 2008, Звенигород; Научно-практическом семинаре «Слушай музыку науки» Carl Zeiss 2008, Санкт-Петербург, Новосибирск; Научной школе-конференции «Аутологичные стволовые клетки: экспериментальные и клинические исследования» 2009, Москва; Всероссийской конференции с элементами научной школы для молодежи «Клеточные исследования и технологии в современной

биомедицине» 2009, Тула; III Международном симпозиуме "Актуальные вопросы клеточных технологий" 2010, Москва; VIII Всероссийской конференции по патологии клетки 2010, Москва; Всероссийской научной школе-конференции «Стволовые клетки и регенеративная медицина» 2010, Москва; 6th International Heinrich F.C. Behr Symposium «Stern Cells and Cancer» 2010, Heidelberg, Germany; XX международной конференция Российской ассоциации репродукции человека 2010, Нижний Новгород; III Международной Студенческой Научно - практической Конференции с участием молодых ученых «Клинические и теоретические аспекты современной медицины» 2011, Москва; 5 международной конференции «Современные достижения бионаноскопии» 2011; 27 международной конференции European Society of Human Reproduction and Embryology Stockholm, Sweden, 2011; 7th Congress on Stem Cell Biology & Technology, Tehran - Iran; 2 международной конференции Stem Cells and Cancer (ICSCC) 2011, Pune, India. Работе присвоен диплом I степени на Научной школе-конференции «Аутологичные стволовые клетки: экспериментальные и клинические исследования» 2009, Москва и диплом II степени на «Всероссийском конкурсе инновационных проектов и идей научной молодежи» 2011, Красновидово. Работа была поддержана индивидуальным грантом Carl Zeiss №2-15 и ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009 - 2013 годы№П113. Публикации

По теме диссертации опубликовано 26 печатных работ, включая 7 статей (из них 6 -из списка журналов, утвержденного ВАК) и одно методическое пособие. Структура и объем работы

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов, обсуждения и выводов изложена на 180 страницах машинописного текста, содержит 21 рисунок и 6 таблиц. Список литературы включает 260 работ. Материалы и методы исследования

Получение культур сетчатки. Для получения эксплантационной культуры сетчатки глаза по модифицированному протоколу [Kretc et al, 2007], использовали 4-х сут. самцов крыс Wistar. Эксплантаты помещали на поверхность чашки Петри, слоем фоторецепторов, обращенным наружу (Рис.1) и культивировали в течение 30 дней в стандартных условиях (+ЗС, 5% С02) в среде DMEM/F12 (НПП ПанЭко), с добавлением глутамина (Sigma, G-8540) и ИТС (НПП ПанЭко) 1:50, сыворотки FCS™ 7% (HyClone, SH30109.03), bFGF Юнг/мл и EGF по 10нг/мл (Sigma, Е9644, F0291), гепарина (НПП ПанЭко), гентамицина 5мкл/1мл, добавок N2 (Gibco, 17502-048) 1:100 и В27 (Gibco, 17504044) 1:50. Клеточный состав и область разрастания эксплантатов оценивали при помощи сканирующей электронной микроскопии на микроскопе САМ Scan. Разделение клеток на типы по морфологическим признакам проводили согласно

работам [Сотников, 2008', Gibbons et al., 2007; Narayanet al., 2007; Rorkeeial., 1975] на астроцитоподобные, микроглию [Hayes et al., 1988], протоплазматические и фиброзные астроциты [Estes et al., 1990], эндотелиальные клетки и фибробласты. Для оценки действия факторов роста (ФР) в среду добавляли нейроторфический фактор мозга (BDNF), фактор пигментного эпителия (PEDF), для блокирования действия фактора роста эндотелия (VEGF) - препарат Бевацизумаб - Авастин™ (Genentech Inc., США) а для оценки комплексного действия экзогенных ФР - экстракт мозга свиньи «Церебролизин» (EVER Neuro Pharma)e концентрациях 5, 10, 50 и 100нг/мл.

Нанесение повреждения проводили при помощи инфракрасного лазера (1480nm) Zilos-tk™ (Hamilton Thome) миллисекундного диапазона мощностью ЗООмВ, нагревающего поверхность в фокусе до 150°С. Повреждение сетчатки проводили 15-ю импульсами лазера длительностью 1000-3 ОООмс по квадрату со стороной ЮОмкм на 14 сутки культивирования эксплантатов.

Трансплантацию клеток проводили стеклянным микрокапилляром (0,1 мкл среды) под бинокуляром Olympus CZX16 при помощи микроинъекционной приставки и на инвертированном микроскопе Nikon TE2000S, с микроманипуляторами и инъекторами Narishige (MMO-202ND, IM-9B, IM-Hl, HD-21) и терморегулируемым столиком (Termo Plate) в зону разрастания клеток эксплантата на расстояниях ЮОмкм, ЮООмкм и ЗОООмкм от зоны повреждения. В эксплантаты инъецировали клетки EGFP+ мышей линии C57BL/6-Tg(ACTB-EGFP)/Osb/J: нейральные стволовые/прогениторные клетки субвентрикулярной зоны 12 дневных плодов -НСПК 2-го пассажа; клетки стромы костного мозга новорожденных мышей - ММСК 2-6-го пассажа, выделенные по стандартному протоколу [Schrepfer et al., 2007]; клетки стромы жировой ткани - СКЖТ 4-го пассажа, выделенные согласно протоколу [Zuket al., 2001]; клетки ПЭ 2-4-го пассажей, полученные после ферментативной обработки структур глаза.

Атомно-силовая микроскопия. АСМ-изображения были получены на атомно-силовом микроскопе Solver BIO Olympus (НТ-МДТ, Россия, Зеленоград), с полем сканирования 100x100x7 мкмЗ и системой емкостных датчиков. При скорости сканнирования 0,3 - 1,5Гц в полуконтактном и контактном режимах. Изображения были обработаны средствами программы Nova (НТ-МДТ, Россия, Зеленоград). Иммуногистохимический анализ (ИГХ) дифференцировки трансплантированных клеток проводили с использованием антител к ß-III-тубулину - anti-tubulin ß III isoform antibody (Chemicon, MAB1637), GP-45 (Abcam abl 10898), рековерину - anti-recoverin antibody (Abcam ab31928), глиальному кислому фибриллярному белку -GFAP - anti-glial fibrillary acidic protein (Sigma G9269), фактору фон-Виллебранда -Von Willebrand Factor antibody (Abcam ab 6994) и к GSL-IB4 - Griffonia simplicifolia IB4 isolectin (Sigma LI 509).

Вестерн-блот анализ экспрессии фактора фон-Виллебранда в эксплантатах сетчатки по методу Бредфорд с модификациями [Тахчиди и др., 2009] проводили на 14 сутки после добавления факторов роста.

Методы прижизненного наблюдения. Жизнеспособность трансплантата оценивали по включению мертвыми клетками йодида пропидия (PI) (Invitrogen, V13243, США). Контрастирование клеток эксплантата сетчатки для выявления возможности слияния с трансплантированными ММСК проводили флуоресцентным неспецифическим липофильным красителем Di-I (Invitrogen, С7001, США). Измерение реакции трансплантированных клеток на внешнее раздражение проводили с применением электростимулятора АСЛ-2 и потенциал-чувствительного красителя RH 795 (Invitrogen R-649, США), способного изменять спектр флуоресценции в зависимости от потенциала клеточной мембраны.

Получение изображений проводили с помощью инвертированного микроскопа NikonTE2000S, флуоресцентных изображений — с помощью инвертированного флуоресцентного микроскопа Olimpus КХ-100 с камерой Delta Pix 5000 и Axsi overt 25. Для получения пространственной картины распределения трансплантированных клеток в эксплантате применяли метод лазерной сканирующей конфокальной микроскопии на микроскопах Axsiovert 200LSM 510Meta(Carl Zeiss) и Leica TCS SPE с оригинальным программным обеспечением.

Статистический анализ осуществляли средствами программы STATISTICA 8.0. Наличие и достоверность различий между выборочными величинами независимых выборок оценивали при помощи непараметрического Н-критерия Крускала-Уоллиса. Достоверность отличий между группами инъецированных клеток (ММСК, НСК, ПЭ) определяли при помощи метода Стьюдента-Ньюмана-Келса. Достоверность различий в индексе площади (ИП) — с помощью t-критерия Стюдента.

Результаты и обсуждение

Морфологический анализ клеток выселяющихся из эксплантата сетчатки

При помощи гистологических и электрономикроскопических методов в зоне разрастания эксплантата показано присутствие клеток, морфологически подобных астроцитам, олигодендроцитам, микроглии, биполярным нейронам, фибробластам и эндотелиальным клеткам. Продемонстрирована сохранность основных типов клеток, характерных для сетчатки in vivo наряду с сохранностью цитоархитектоники эксплантата и дальнейшей дифференцировкой ткани сетчатки. Возможность самоорганизации нейросетчатки с последующим подразделением на слои была продемонстрирована в экспериментальных системах in vivo во многих исследованиях [Katusis et ai, 2008], a in vitro показана лишь в единичных работах на модели дезагрегированных культур клеток [Engelsberg, Ghosh, 2011; Eiraku et ai, 2011].

Рис.1. Схема проведения трансплантации клеток in vitro (А). Инъекция материала под контролем инвертированного микроскопа и микроманипуляторов (В) в среднюю область края разрастания эксплантата сетчатки (Б) стеклянным капилляром (Г) в объеме среды 0,3мкл.

И ш? #• vr - аг-

ЯЧ—риниты— Ш . . i'4 \ . 1 . - , ^^гж.< ШШш ¡яя

Рис.2. Миграция клеток, образование ими нейроноподобных отростков (стрелка) и

тм

ассоциатов (звездочка) под действием факторов роста. А-ЕШИЕ; Б-Авастин ; В-Церебролизин; Г-Эритропоэтин; Д,Е-РЕВР. Масштабный отрезок А-В,Д-50мкм, Г-Юмкм, £-100 мкм.

Рис.3. Спонтанная организация выселившихся из эксплантата сетчатки клеток в примитивные нейрональные сети типа диффузного плексуса и микроганглиев (указаны звездочкой) под действием 50нг/мл (А) и 100нг/мл (Б) Церебролизина. Масштабный отрезок 50мкм. ..

-»-№72

5 120

? юо 1 80 1 60 • <0

120 а О

-»-ММСК

Рис.4. Индекс площади при культивировании эксплантатов сетчатки в присутствии 100нг/мл ВООТ и различных концентраций Церебролизина. Достоверные отличия (р<0,05) с контрольной группой указаны звездочками.

Динамика выживаемости МИСК

Динамика выживаемости НСПК

2 3

суткиси

Динамика выживаемости клеток ЛЭ

12 3 4 5 0

Сутки с мом«нга «гмшам

Процентом динамика числемност* трансплантированных клеток

1 2 3 4 5 6 Сутки с мошип иммнпам

Рис.5. Динамика выживаемости ММСК, НМПК и клеток ПЭ, инъецированных в эксплантат сетчатки. Подсчет численности живых клеток проводился с периодичностью в сутки в течение 6 дней эксперимента по отсутствию включения Р1.

Рис.б. Экспрессия маркеров дифференцировки клетками эксплантатов сетчатки при культивировании с факторами роста: A-B-BDNP (ß-Ш-тубулнн; GFAP); Г-PEDF; (ß-Ш-тубулин; GFAP); Д-Церебролизин (GSL-JB4; GFAP; Hoechst. 33342); Е-Авастин™ (р-Ш-тубулин; GFAP). Масштабный отрезок А-В-Юмкм, Г-ЮОмкм, Д,Е-30мкм.

Рис.7. Изменение соотношения экспрессии GFAP и GP45 в сетчатке in vitro при концентрации Церебролнзина Юнг/мл (А); 50нг/мл (Б); 100нг/мл (В), достоверно (р<0,05) оплечные от контроля (Г). Масштабный отрезок 50мкм.

Рис.8. Миграция ЕОРР+ НСПК от зоны инъекции к области травмы (указана овалом). А,Б - направленный рост отростков к зоне повреждения (указан стрелкой); В- заселение зоны повреждения; Г-контроль.

А Ч? * * 9 # Б в

( Г • ;оо ч'п

Л 40 е

О 0

100%

■ п

ЧИР—ЕР—I

27%

600 мкм

1000 мкм 3000 мкм

Рис.9. Поведение трансплантированных НСПК при наличии нескольких зон повреждения на одном эксплантате, удаленных на различное расстояние от области инъекции клеток (А-бООмкм; Б-1000мкм; В-ЗОООмкм). Направленный рост отростков к мету травмы указан стрелкой. Звездочка - достоверные отличия в количестве клеток в зоне повреждения и в штатном эксплантате - р<0,05.

Рис.10. Изменение морфологии трансплантированных ЕС КР+ ММСК в эксплантате сетчатки, поврежденном лазерным излучением.

А-Г-приобретение нейрональной морфологии инъецированными ММСК. Д-Е-дифференцировка инъецированных ММСК по глиальному фенотипу.

А ^

/ У

' -

* . ' Ш Щ 0 4 К . Щь . v> ~ f s » \

9 » * . , ff 0 Ш. Й gp » » \

<1 £ • 1 а

Рис. 11. Сокультивирование EGFP+ ММСК с сетчаткой глаза.

А-эксплантадионное сокультивирование - моделирование супрахориоидальной трансплантации, сетчатка окрашена маркером Di-I. Пунктиром показана граница эксплантата и агрегата ММСК, стрелками - ММСК, проникшие в сетчатку; Б-HD сокультивирование ММСК в течение 14-ти суток с дисперсной культурой сетчатки -миграция единичных клеток в сетчатку; выявление мертвых клеток по включению PI, ядра контрастированы бисбензимидом (Hoechst. 33342) .

S . § в Ч

1 9 8

= я]

1 ? Я

! ? о

f о!

40 4S 50 55 60

О 10 20 30 40 SO 60

Boxptoi by Group VartaOfe Var2

&oxf*ot by Group Versatile Van

1600 1400 1200 1000 600 600 <00 200

_L ф

Тип вводимых клеток

Рис. 12. АСМ анализ поверхности инъецированных ММСК, проводимый в контактном и полуконтактном режимах. А - Реконструкция поверхности ММСК, изменившей свою морфологию. Б -образование синаптических контактов (указаны стрелкой) между трансплантированными ММСК и клетками сетчатки. В - начало выселения клеток из эксплантата, образование ламеллоподий. Г - количественный анализ распределения высот отростков - 1 группа глиальиые клетки эксплантата сетчатки, 2 группа - отростки трансплантированных ММСК (р<0,()1). Д - количественный анализ распределения высот отростков - 1 группа клеток нейроналъные клетки эксплантата сетчатки, 2 группа - отростки трансплантированных ММСК(р>0,01).

В данной работе эта способность клеток нейросетчатки впервые показана на модели эксплантационной культуры.

При помощи методов АСМ было показано, что выселению клеток из эксплантата сетчатки предшествовало образование ламеллоподиальных выростов цитоплазмы краевых клеток эксплантата на 3-й день культивирования, средняя длина которых составила 10,09±2мкм, а средний диаметр - 3,68±0,5мкм. К 7-м суткам наблюдалось увеличение протяженности отростков, средняя длина которых составила 21,65±5мкм, а средний диаметр - 0,78±0,23мкм. По поверхности глиальных (ОРАР+) и эндотелиальных (05Ь-1В4+) клеток происходило распространение нейритов, длина которых достигала нескольких миллиметров и диаметр до 0,47мкм. При сравнении высот отростков было показано достоверное отличие (р<0,01) в величине отростков, формируемых глиальными и эндотелиальными компонентами сетчатки в начале выселения из кусочка сетчатки и высотами отростков нейронов, распространяющихся по выселившимся клеткам.

Влияние трофических факторов на эксплантационную культуру сетчатки

В 3-х сериях экспериментов, включавших по 30 образцов каждая, были подобраны оптимальные концентрации добавляемых ФР, составившие 100нг/мл для ВО№, РЕОИ, и препаратов Церебролизина и 2,5нг/мл для Авастина™. В среде с добавлением Авастина™ изменения клеточной миграции и дифференцировки нейронов происходили значительно быстрее, чем в контрольных группах (Рис. 2Б). Через 3-е суток после введения в среду ВО№ и РЕОР в концентрации 100нг/мл наблюдалась стимуляция миграционной активности нейроноподобных клеток и радиальное распространение их асинаптических дендритов (Рис. 2А, Д, Е).

Под действием Церебролизина (10, 50 и 100нг/мл) нейральные клетки формировали ассоциаты, в виде диффузного плексуса, а затем, при концентрации препарата 50 и 100нг/мл, переходившие в плексусно-ганглионарные нервные сплетения (Рис.3). При добавлении 100нг/мл Церебролизина наблюдалось формирование микроганглиев из 2-5 клеток (Рис. 2В). Под влиянием Церебролизина на ранних сроках культивирования нейроны образовывали широкие ламеллы с шипиковидными выпячиваниями, которые позже в результате изометрического сокращения переходили в ампулярные сплетения. Большинство клеток имело биполярное расположение отростков, однако единичные нейроны выпускали разветвленные дендриты, местами соединенные коллатералями, и приобретали мультиполярность. Глиальные и эндотелиальные клетки сильно распластывались и пролиферировали, что приводило к образованию эпителиоподобного слоя на дне чашки для культивирования. При подсчете ИП разрастания эксплантатов под действием Церебролизина было обнаружено достоверное отличие (р<0,05) ИП на первый день добавления препарата и на 28-е сутки культивирования с Церебролизином, а также достоверные отличия ИП эксплантатов в опытных группах

(Р<0,05) на всех сроках культивирования для всех концентраций препарата по сравнению с контрольной группой (Рис.4). Аналогичные результаты изменения ИП показаны и при культивировании сетчатки с BDNF в концентрации 100 нг/мл.

В ходе ИГХ исследования в зоне расселения эксплантата было показано наличие большого числа нейрональных клеток, имеющий -III-тубулин и GP45 позитивные нейриты (Рис.6). В процессе миграции клеток из эксплантата распространение нейрональных клеток происходило по поверхности GFAP+ глиальных и GSL-IB4+ эндотелиальных клеток. При анализе соотношения GP45+ и GFAP+ отростков клеток в культуре с добавлением Церебролизина было обнаружено дозозависимое увеличение количества нейрональных отростков в общем пуле асинаптических дендритов зоны расселения (Рис.7).

Стимуляция выселения нейрональных клеток из эксплантата происходила и при добавлении в среду ангиогенных ФР: ангиопоэтина и эритропоэтина (Рис. 2Г), способствующих сохранению одного их основных нише-образующих компонентов сетчатки глаза - клеток эндотелия микрокапилляров (GSL-IB4+ клеток).

Данные по влиянию указанных ФР, полученные в экспериментах \п vitro прекрасно согласуются с аналогичными ранее проведенными исследованиями по введению этих же ФР в нативную и поврежденную сетчатку крыс, мышей и кроликов. in vivo[Po6ycmoea и др., 2003].

Трансплантация клеток в сетчатку in vivo

На основании электроретинограммы (ЭРГ) крыс линии Campbell установлено, что клетки ПЭ как при интравитриальной (60 000-100 000 клеток в 2мкл), так и при ретробульбарной (300 000 в Юмкл) трансплантации через 4 и 6 суток оказывают слабоположительное влияние на функциональное состояние сетчатки крыс Campbell возраста 25 суток. Трансплантация 100 000 клеток ПЭ позволяет сохранить функциональную активность сетчатки у крыс до 36 суток. Статистически достоверно увеличивается толщина ONL у опытных животных 27-х и 43-х суток. При супрахориоидальной трансплантации клеток ПЭ (300 000 клеток в 2мкл или 150 000 клеток в 1мкл) отмечено замедление процессов дегенерации, развивающихся в ONL и сохранение высокого уровня функциональной активности сетчатки. При супрахориоидальной трансплантации НСПК (300 000 клеток в 2мкл или 150 000 клеток в 1мкл) функциональная активность сетчатки животных была в 3 раза ниже, чем при аналогичной трансплантации клеток ПЭ, несмотря на статистически неразличимые морфологические данные толщины ONL.

Трансплантация клеток в сетчатку in vitro, поврежденную инфракрасным лазерным излучением

При воздействии лазерного излучения наблюдалось изменение структуры ткани в области фокуса луча, сопровождающееся потемнением цитоплазмы клеток,

их интенсивной вакуолизацией и коагуляцией межклеточного матрикса. Повреждение лазером приводило к утрате клеточных взаимосвязей и изменению морфологии клеток, завершающихся их гибелью, и носило необратимый характер.

При нанесении на поверхность поврежденного эксплантата сетчатки НСПК (моделирование супрахориоидальной трансплантации in vivo) практически отсутствовали их миграционная активность и процессы нейрональной дифференцировки. В результате в популяции трансплантированных клеток присутствовали лишь единичное -Ш-тубулин+ клетки. Данное наблюдение позволяет объяснить факт незначительного терапевтического эффекта трансплантированных НСПК в клинической практике при супрахориоидальной или ретробульбарной инъекции. При инъекции НСПК вглубь слоев нейросетчатки трансплантированные клетки активно мигрировали в первые 24 часа. Сравнительный анализ зависимости количества активно мигрирующих клеток на различных сроках после введения показал, что при трансплантации непосредственно после нанесения травмы или через сутки наблюдается наибольшая миграционная активность клеток, а при трансплантации через 7 суток после воздействия лазера интенсивность миграции инъецированных клеток практически не отличалась от контрольных образцов (трансплантация клеток без нанесения травмы). Распространение НСПК в эксплантате, поврежденном лазером, происходило на расстояния, превышающие 5мм, от места трансплантации вдоль вектора, направленного к области травмы, и составляло всего около 1мм в противоположном направлении. На 3-е сутки после трансплантации НСПК было проведено сравнение их количества в зоне между местом трансплантации и местом лазерного повреждения и их количества на таком же расстоянии от места введения, но в противоположном направлении (подсчет проводился в одном поле зрения). Статистическая обработка результатов подсчета НСПК, по критерию Манна-Уитни показала достоверно большее (р<0,01) количество клеток, мигрирующих от зоны трансплантации в область лазерного повреждения. При достижении зоны повреждения происходила остановка миграции НСПК, и начиналось образование ими густой сети асинаптических дендритов, распространяющихся во всех плоскостях, а так же агрегация трансплантированных клеток друг с другом (Рис.8). Первые клетки, пришедшие в зону воздействия лазера, были обнаружены уже через 1 час после трансплантации при введении их на расстоянии ЮОмкм от зоны повреждения, через 12 часов — при инъекции на расстоянии в 500мкм и через 3-5 суток — при дальних областях трансплантации (>1000мкм). Наиболее активное привлечение клеток в поврежденную область происходило на протяжении первых 3-х суток после создания дефекта сетчатки и резко угасало в последующие.

При исследовании распределения трансплантированных НСПК в эксплантате с несколькими зонами лазерного повреждения, находящимися на различном

расстоянии от места инъекции (600, 1000 и ЗОООмкм), было показано заселение трансплантированными клетками всех зон через 7 суток после инъекции. Однако происходило уменьшение количества клеток в зонах повреждения, по мере их удаления от области введения. При удалении зоны повреждения от зоны введения на 1000 и на ЗОООмкм клеточные популяции, детектируемые в поле зрения, включающем поврежденный лазером участок, составили 56% и 27% соответственно от количества клеток зоны, удаленной на бООмкм (Рис.9).

В работе было применено 2 метода внесения ММСК в культуру сетчатки: непосредственная инъекция вглубь средней зоны края разрастания эксплантата и поверхностное нанесение клеток. В случае первого ММСК непосредственно контактировали с нейрональной составляющей сетчатой оболочки глаза, второй имитировал супрахориоидальную инъекцию ММСК in vivo. Для трансплантированных ММСК было отмечено образование двух характерных фенотипов: глиалыюго с ламелоподиальными выростами цитоплазмы и крупным ядром с хорошо различимыми ядрышками и нейрональноподобного с длинными тонкими ветвящимися отростками, имеющими ампулярные расширения с оформленным компактным телом клетки (Рис. 10). Нейритоподобные выросты ММСК проникали вглубь эксплантата сетчатки, образовывали анастомозы и контактировали с другими трансплантированными клетками и нейронами самого эксплантата. Таким образом, трансплантированные ММСК, попадая в нейроналыюе микроокружение сетчатки, имели сходное поведение с инъецированными НСПК. Аналогичные результаты были получены с использованием сокультивирования ММСК и агрегатов клеток сетчатки, сформированных в системе висячих капель (HD) и в роллерной установке, где происходило внедрение стволовых клеток вглубь слоев агрегата через 2-е суток и их дифференцировка (Рис.11). В HD культуре ММСК занимали преимущественно центральное положение в агрегате в окружении ганглиозных клеток сетчатки, в то время как в роллерной системе располагались диффузно во всех слоях. При использовании стандартной методики сокультивирования различных типов клеток [Johnson, Martin, 2008] наблюдали незначительное проникновение ММСК вглубь слоев нейросетчатки и отсутствие изменения их фенотипа. Аналогичные результаты по изменению морфологии, выживаемости и миграционной активности трансплантированных клеток в различных системах культивирования были получены и при выделении клеточной популяции мезенхимных стволовых клеток из жировой подкожной клетчатки (СКЖТ).

Однако, в отличие от НСПК, способ введения ММСК не влиял на активность миграции трансплантируемых клеток, их перемещение не было аттрагировано к области травмы. Как при нанесении на поверхность, так и при инъекции вглубь поврежденного эксплантата, ММСК мигрировали по всем направлениям от места введения в течение первых суток. С началом дифференцировки клеток их миграция

останавливалась, что позволяет говорить о важности первых часов после трансплантации для распределения введенных клеток, занятия ими новых ниш. При нанесении повреждения эксплантату, ММСК быстрее изменяли свою морфологию по сравнению с клетками, введенными в контрольные образцы, без повреждения воздействием лазера. В этой серии экспериментов морфологические изменения ММСК детектировали спустя 24 часа после инъекции, в то время как в контроле лишь через трое суток. Эти данные позволяют сделать предположение, что для морфологической дифференцировки трансплантированных клеток, отвечающей условиям их нового микроокружения, чрезвычайно важны регуляторные факторы, высвобождающиеся при гибели клеток в районе нанесения повреждения.

Поведение после инъекции в ONL высокодифференцированных клеток ПЭ значительно отличалось от поведения клеток с широкими потенциями к дифференцировке. Наблюдалась хорошая выживаемость клеток, но изменения морфологии клеток ПЭ отсутствовали даже после длительного (до 2-х месяцев) культивирования после инъекции в эксплантат. Для них была характерна небольшая миграционная способность, сопоставимая с таковой для самих клеток эксплантата. При поверхностном нанесении клеток ПЭ на эксплантат сетчатки (моделирование супрахориоидальной инъекции in vivó) их пролиферация сильно активировалась и уже через 3-е суток они образовывали монослой на поверхности сетчатки.

С использованием критерия Крускала-Уоллиса было показано достоверно лучшая (р<0,05) выживаемость НСПК и клеток ПЭ по сравнению с ММСК на 1-е и 2-е сутки в эксплантатах без повреждения; а также на 5-е и 6-е сутки после трансплантации. При введении более 100 клеток, при помощи теста Стьюдента-Ньюмана-Келса была продемонстрирована достоверно лучшая (р<0,05) выживаемость клеток ПЭ по сравнению с ММСК и НСПК начиная с первого дня культивирования, и отсутствие статистически значимого отличия (р>0,05) в выживаемости между ММСК и НСПК. Данная тенденция появления различий в выживаемости клеток ПЭ и стволовых клеток сохранялась в течение 6 суток после

трансплантации (Рис.5).

При помощи анализа поверхности трансплантированных клеток методами АСМ было показано отсутствие достоверных отличий (р>0,05) в средней квадратичной шероховатости поверхности трансплантированных ММСК, изменивших свою морфологию на нейроноподобную и нейронов сетчатки, а так же отсутствие достоверных отличий (р>0,05) при сравнении асимметрии распределения отростков трансплантированных НСПК и нейронов эксплантата сетчатки. Не удалось выявить достоверных различий и в размахе высот отростков между трансплантированными ММСК, изменившими морфологию, и нейронами сетчатки. Однако были обнаружены достоверные различия (р<0,01) высот нейритоподобных отростков ММСК и высот отростков глиальных и эндотелиальных клеток сетчатки

(Рис.12). Таким образом, присутствуют фактические различия в пространственной организации отростков нейроноподобных ММСК и отростков ненейрональных клеток сетчатки.

Важным критерием заместительной клеточной терапии является функциональное преобразование трансплантированных клеток и приобретение ими возможности реагировать на внешнее раздражение изменением мембранного потенциала. При помощи потенциал-чувствительного красителя R495 (Invitrogen) была продемонстрирована способность некоторых трансплантированных ММСК, изменивших свою морфологию на нейроноподобную, реагировать на прилагаемое внешнее электромагнитное поле частичной либо полной деполяризацией мембраны. Количество таких ММСК составляет не более 0,1% от общего числа трансплантированных клеток.

Некоторые исследователи связывают такой низкий процент трансдифференцировки трансплантированных ММСК с происходящими единичными случаями слияния инъецированных клеток с клетками ткани реципиента [Alvarez-Dolado et al., 2003]. Для исследования этой гипотезы в эксплантаты сетчатки, предварительно окрашенные липофильным красителем Di-I (Invitrogen), были инъецированы EGFP+ ММСК. При исследовании образцов методами конфокальной микроскопии не было обнаружено ни одной клетки, имеющей двойную окраску (Di-I+; EGFP+) даже при культивировании более 2-х месяцев. Данный факт позволяет предположить возможность нахождения среди трансплантированных клеток очень небольшой популяции ММСК-подобных клеток, способной к истинной функциональной трансдифференцировки в нейроноподобные элементы.

Выводы

1. Получены эксплантационные культуры сетчатки, которые сохраняют гистотипическую организацию ткани и ее клеточный состав при культивировании in vitro до 2-х месяцев.

2. Эксплантаты сетчатки реагируют на введение трофических факторов (BDNF, PEDF, эритропоэтина, ангиопоэтина) и препаратов (Авастина™, Церебролизина) усилением процессов миграции клеток края разрастания, ускорением их дифференцировки, увеличением жизнеспособности нейрональных клеток и самоорганизацией выселившихся нейронов в примитивные нервные сети.

3. При трансплантации in vitro ММСК, НСПК и клеток ПЭ в эксплантаты сетчатки с первых часов до 3-х суток наблюдается активная миграция инъецированных клеток от места их введения.

4. Показано, что определяющим фактором дифференцировки трансплантированных in vitro клеток является их новое микроокружение: ММСК приобретают только нейроноподобную морфологию, в то время как НСПК приобретают иммуноцитохимические маркеры дифференцирующихся нейронов.

5. Разработана методика контролируемого повреждения эксплантатов сетчатки инфракрасным лазерным излучением, показано усиление миграционной активности трансплантированных клеток в направлении нанесенного дефекта, а так же ускорение их дифференцировки по сравнению с сетчаткой без травмы.

6. При трансплантации клеток в эксплантаты сетчатки после нанесения лазерного повреждения показана зависимость интеграции клеток от способа их трансплантации: для НСПК и ММСК оптимальным являлось их введение во внутренний ядерный слой эксплантата сетчатки, а для клеток ПЭ - нанесение на его поверхность.

7. Показано, что для эффективного встраивания клеток в состав сетчатки в месте повреждения, их трансплантация должна быть произведена не позднее, чем через сутки после нанесения повреждения.

8. Показана принципиальная возможность заместительной интеграции трансплантированных НСПК и ММСК в поврежденную область сетчатки глаза, однако в последнем случае лишь 0,1% клеток, претерпевает истинную трансдифференцировку и приобретает способность к функциональной репарации дефектов.

Список публикаций по теме диссертации Статьи:

1. Тахчиди Х.П., Гаврилова H.A., Ланевская Н.И., Тищенко O.E., Сабурина И.Н., Сергеев С.А., Павлова Г.В., Рыбалкина Е.Ю., Ревищин A.B. Влияние Авастина и фактора пигментного эпителия (PEDF) на состояние органотипических культур сетчатки // Объединенный медицинский журнал. 2008. - Т. 217. С. 43-48.

2. Гаврилова H.A., Ланевская Н.И., Бакаева Л.М., Борзенок С.А., Шацких A.B., Сабурина И.Н., Сергеев С.А., Павлова Г.В., Рыбалкина Е.Ю., Ревищин A.B. Влияние нейротрофического фактора мозга - BDNF на органотипические культуры сетчатки. // Офтальмохирургия. 2009. №1. С.44-48.

3. Тахчиди Х.П., Гаврилова H.A.. Ланевская Н.И., Тищенко O.E., Сабурина И.Н.. Сергеев С.А., Павлова Г.В., Рыбалкина Е.Ю., Ревищин A.B. Сравнительная харктеристика влияния фактора пигментного эпителия (PEDF) и Авастина на органотипические культуры сетчатки. // Офтальмохирургия. 2009. №4. С.45-50.

4. Сергеев С.А., Горкун A.A., Сабурина И.Н., Ревищин A.B., Семенова М.Л. Исследование распространения и дифференцировки трансплантированных клеток методами конфокальной микроскопии. // Сборник научно-практических статей молодых ученых ВУЗов России -победителей в конкурсе на соискание грантов Carl Zeiss в 2009 году «Инновационные методы исследования в биологии, материаловедении и нанотехнологиях при помощи высокотехнологичного оборудования». Москва. 2010. С. 107-114.

5. Семенова М.Л., Сергеев С.А.. Сабурина И.Н., Кошелева Н.В. Использование органотипической культуры сетчатки как модели для исследования миграционной активности трансплантированных клеток. // Клеточная трансплантология и тканевая инженерия. 2010. T.V. №2. С.55-61.

6. Сергеев С.А.. Павлова Г.В., Тахчиди Х.П., Гаврилова H.A., Ревищин A.B., Сабурина И.Н., Ланевская Н.И., Иванова З.Г., Бастаков В.А., Комова О.Ю., Орлов О.Ю. Влияние стволовых/прогениторных клеток на функциональное состояние и степень выраженности дегенеративных изменений сетчатки у крыс линии Campbell. // Офтальмохирургия. 2010. N 3. С.33-38.

7. .Тахчиди Х.П., Гаврилова H.A., Комова О.Ю., Ланевская Н.И., Иванова З.Г., Сабурина И.Н., Сергеев С.А.. Павлова Г.В., Ревищин A.B., Орлов О.Ю., Бастаков В.А. Экспериментальное изучение эффективности клеточной трансплантации при наследственной пигментной дегенерации сетчатки. // Dentalforum. 2010. N.l. С.56-62.

Тезисы докладов:

8. Сергеев С.А., Кошелева Н.В. Дифференцировка нейронов в эксплантатах сетчатки крысы и человека под действием нейроторофического фактора головного мозга. // Тезисы докладов Ломоносов 2007. Международная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых. Москва 2007. С.197-198.

9. Сергеев С.А.. Кошелева Н.В., Бакаева Л.Н., Ревищин A.B., Семенова М.Л., Сабурина И.Н. Влияние нейротрофического фактора головного мозга (BDNF) на эксплантаты сетчатки крысы и человека in vitro. // Нейронаука для медицины и психологии. Третий международный междисциплинарный конгресс. Москва 2007. С.209-211.

10. Гаврилова H.A., Ланевская Н.И., Бакаева Л.М., Борзенок С.А.,. Павлова Г.В, Ревищин A.B., Рыбалкина Е.Ю.,. Сабурина И.Н., Сергеев С.А. Влияние нейротрофического фактора головного мозга - BDNF на органотипические культуры сетчатки. // Сборник тезисов докладов Юбилейной научно-практической конференции: Федоровские чтения-

2007. Москва 2007. С.214.

11. Сергеев С.А. Использование эксплантационной органотипической культуры сетчатки для исследования воздействия ростовых факторов на различные типы клеток. // Тезисы докладов Ломоносов 2008. Международная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых. Москва 2008. С.20.

12. Сергеев С.А., Кошелева Н.В., Сабурина И.Н., Ревищин A.B., Семенова М.Л. Исследование поведения клеток стромы костного мозга и пигментного эпителия глаза при инъекции в органотипические культуры сетчатки. // Тезисы докладов и сообщений, представленных на школу-конференцию для молодых ученых «Методы культивирования клеток».

2008. Цитология. Т.50. №9. С. 821.

И.Сергеев С.А., Кошелева Н.В., Сабурина И.Н., Семенова М.Л. Поведение ксеногенных стволовых и прогениторных клеток в эксплантационных

культурах. // Тезисы стендовых докладов молодых ученых. XV Школа «Актуальные проблемы биологии развития». ИБР РАН. 2008. С.90-91.

Н.Сергеев С.А., Кошелева Н.В., Сабурина И.Н., Ревищин A.B., Семенова МЛ. Сравнение поведения нейральных стволовых/прогениторных клеток и клеток пигментного эпителия глаза при инъекции in vivo и in vitro. // Тезисы докладов научной школы-конференции «Аутологичные стволовые клетки: экспериментальные и клинические исследования». 2009. Москва С.65.

15. Молчанова Е.С., Семенова М.Л., Кошелева Н.В., Молчанов А.Ю., Сергеев С.А. Проникновение антисмысловых олигонуклеотидов в стромальные клетки жировой ткани мыши. // Материалы Всероссийской научной школы-конференции для молодежи. 2009. Москва. С.42.

16. Сергеев С.А.. Горкун A.A., Кошелева Н.В., Сабурина И.Н., Семенова М.Л. Исследование поведения стромальных клеток костного мозга в составе 3D культур нейросетчатки. // Пятый международный междисциплинарный конгресс «Нейронаука для медицины и психологии». 2009. Судак. С.200-201.

17. Сергеев С.А. Применение 3D культур нейросетчатки в висячих каплях и роллерной установке для исследования поведения стволовых клеток после трансплантации. // Тезисы докладов Ломоносов 2009. Международная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых. Москва 2009. С.50.

18.Тахчиди Х.П., Гаврилова H.A., Комова О.Ю., Сабурина И.Н., Сергеев С.А., Павлова Г.В., Рыбапкина Е.Ю., Ревищин A.B. Влияние различных типов человеческих прогениторных клеток на функциональное состояние сетчатки и степень выраженности дегенеративных изменений сетчатки у крыс линии Кэмпбелл. // Сборник материалов Всероссийской конференции с элементами научной школы для молодежи: Клеточные исследования и технологии в современной биомедицине. Тула. 2009. С. 8-9.

19. Сергеев С.А.. Храмова Ю.В., Кошелева Н.В., Сабурина И.Н., Семенова М.Л. Оптимизация результатов трансплантации клеток в сетчатку, поврежденную лазерным излучением на модели эксплантационной культуры. // III Международный симпозиум "Актуальные вопросы клеточных технологий". Москва. 2010. Клеточная трансплантология и тканевая инженерия T.V. №3. С.184-186.

20. Сергеев С.А., Храмова Ю.В., Кошелева Н.В., Сабурина И.Н., Семенова М.Л. Поведение трансплантированных стволовых клеток в составе органотипической эксплантационной культуры сетчатки глаза. // Всероссийская научная школа-конференция «Стволовые клетки и регенеративная медицина». Москва. 2010. С.69.

21 .Сергеев С.А., Кошелева Н.В., Сабурина И.Н., Семенова М.Л. Исследование поведения трансплантированных НСПК в составе эксплантата сетчатки глаза, подвергшегося повреждению лазерным излучением. // Международный междисциплинарный конгресс «Нейронаука для медицины и психологии». Судак 2010. С.264

22.Sergeev S.A.. Khramova Y.V., Kosheleva N.Vl., Saburina I.N., Semenova M.L. Transplanted stem cell behavior in the explanation retina culture damaged by laser emission. // 6th International Heinrich F.C. Behr Symposium «Stem Cells and Cancer». 2010. Heidelberg, Germany. P.76.

23. Сергеев C.A., Храмова Ю.В., Ефремов Ю.М. Использование атомно-силовой микроскопии для исследования распределения трансплантированных клеток стромы костного мозга при трансплантации in vitro. // Тезисы докладов Ломоносов 2011. Международная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых. Москва. 2011.

24. Сергеев С.А., Храмова Ю.В. Органотипическая культура сетчатки как модель для оценки эффективности трансплантации стволовых клеток в поврежденную сетчатку глаза. // Материаллы III Международной Студенческой Научно - практической Конференции с участием молодых ученых «Клинические и теоретические аспекты современной медицины». РУДН. Москва. 2011. С.25-26.

25. Сергеев С.А.. Храмова Ю.В., Ефремов Ю.М. Исследование поведения и дифференцировки стволовых клеток при in vitro трансплантации в 3D культуру сетчатки. // 5-я международная конференция «Современные достижения бионаноскопии». Москва. 2011. С.47-48.

26.Sergeev S.A.. Khramova Y.V., Kosheleva N.V., Saburina I.N., Semenova M.L. Ex vivo model for stem cells' transplantation. // Human Reproduction. 2011. V.26. Supl.l. P.349.

C.ll.

Список сокращений:

BDNF - brain-derived neurotrophic factor - нейротрофический фактор мозга

EGFP - enhanced green fluorescent protein - модифицированный зеленый флуоресцентный белок

GP-45 - G protein-regulated induser of neurite outgrowth 2 GSL-1B4 - Griffonia simplicifolia IB4 isolectin HD - культивирование в системе висячих капель ONL - наружный ядерный слой сетчатки глаза

PEDF - pigment epithelium growth factor - фактор роста пигментного эпителия

PI - propidium iodide - йодид пропидия

VEGF - vascular endothelial growth factor - фактор роста эндотелия ACM - атомно-силовая микроскопия ИП - индекс площади

ММСК - мультипотентные клетки стромы красного костного мозга НСПК - нейральные стволовые/прогениторные клетки ПЭ - пигментный эпителий

СКЖТ - стромальные клетки подкожной жировой клетчатки

ФР - фактор роста

ЭРГ - электроретинограмма

Заказ № 72-Ь/10/2011 Подписано в печать 11.10.2011 Тираж 100 экз. Усл. п.л.1,2

ООО"Цифровичок", тел. (495) 649-83-30 www.cfr.ru ; e-mail:info@cfr.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Сергеев, Сергей Александрович

1. Введение.

2. Обзор литературы.

2.1. Строение и функциональные взаимосвязи сетчатки.

2.2. Развитие сетчатки.

2.3.Регенерация сетчатки.

2.3.1. Нейротрофические факторы в развитии и репарации сетчатки.

2.4. Культуры клеток сетчатки и их применение.

2.4.1. Первичные культуры сетчатки.

2.4.2. Культуры ретинобластомы.

2.4.3. Культуры, полученные генно-инженерными методами.

2.5. Клеточная терапия дегенеративных заболеваний сетчатки.

2.5.1. Ниша стволовых клеток.

2.5.2. Пластичность стволовых клеток.

2.5.3. Трансплантация клеток ПЭ в сетчатку глаза.

2.5.4. Стволовые клетки мезенхималъпого происхождения.

2.5.5. Нейральные стволовые/прогеииториые клетки (НСПК).

3. Материалы и методы.

3.1. Получение культур сетчатки.

3.2. Нанесение повреждения.

3.3. Получение и культивирование клеток для трансплантации.

3.4. Атомно-силовая микроскопия1.

3.5. Трансплантация клеток in vitro.

3.6. Трансплантация клеток in vivo.

3.7. Оценка результатов.

3.7.1. Иммуногистохимический анализ.

3.7.2. Морфологический анализ популяций клеток.:.

3.7.3. Регистрация деполяризации мембраны трансплантированных клеток.

3.7.4. Индекс площади.

3.7.5. Вестерн-блот анализ.

3.7.6. Сканирующая электронная микроскопия.

3.7.7. Получение изображений.

3.7.8. Статистический анализ.

4. Результаты.

4.Г. Морфологический анализ выселяющихся клеток эксплантатов сетчатки.

4.2. Взаимодействие с трофическими факторами.

4.3. Транспланатция клеток in vivo.

4.4. Трансплантация клеток in vitro - использование эксплантационной культуры сетчатки как модели для прослеживания миграционной способности инъецированных клеток.

4.4.1. Поведение ММСК, трансплантированных в эксплантат сетчатки.

4.4.2.Поведение НСПК, трансплантированных в эксплантат сетчатки.

4.4.2. Поведение клеток ПЭ, трансплантированных в эксплантат сетчатки.

4.5. Исследование последствий трансплантации НСПК и ММСК в органотипическую культуру сетчатки глаза, поврежденную инфракрасным лазерным излучением in vitro.

4.5.1. Возможность функциональной репарации нейросетчатки с использованием трансплантации клеток.

5. Обсуждение.

5.1. Морфологический анализ выселяющихся клеток эксплантатов сетчатки.

5.2. Взаимодействие с трофическими факторами.

5.3. Трансплантация клеток - использование эксплантационной культуры сетчатки как модели для исследования миграционной активности инъецированных клеток.

5.4. Исследование последствий трансплантации НСПК и ММСК в органотипическую культуру сетчатки глаза, поврежденную инфракрасным лазерным излучением.

5.4.1. Возможность функциональной репарации нейросетчатки с использованием трансплантации клеток.

6. Выводы.

7. Литература.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Органотипическая культура сетчатки глаза как модель для оценки эффективности трансплантации клеток"

Возможность направленной и контролируемой дифференцировки стволовых клеток является одной из наиболее актуальных задач современной биологии развития. Накопленные к настоящему времени данные по решающему значению микроокружения для дальнейшего развития трансплантированных стволовых клеток позволили применить принципиально новые подходы для* их терапевтического' введения; а публикации^ по трансдифференцировке одних клеточных типов в. другие открывают широкие перспективы к репарации повреждений* тканейг с использованием клеточной терапии [Hill et al., 2008]. Существует два-подхода к лечению нейродегенеративных заболеваний^ нашедшие широкое применение в нейрохирургии головного мозга и интенсивно внедряющиеся^ офтальмологию [Kretz et al, 2004]. Первый заключается в стимуляции собственных резервных механизмов репарации сетчатой- оболочки* [Z/zö«g et al., 2002] под действием1 нейротрофических факторов, инъецируемых в. непосредственной близости- от возникшего дефекта: Второй' — в, трансплантации малодифференцированных (стволовых/прогениторных) -\Parmar, 2002] или', высокоспециализированных [Ming et al., 2009] клеток.вь место повреждения. Несмотря на значительные методологические отличия этих подходов, их терапевтическое действие достаточно сходно. В обоих случаях в область дегенерации нервных клеток вводятся трофические факторы, обладающие нейропротекторным действием и стимулирующие резидентные стволовые клетки к пролиферации. В случае введения белковых препаратов - это прямая доставка факторов роста, при трансплантации клеток — это доставка опосредованная инъецированными клетками, секретирующими коктейль факторов в окружающую среду. ^

Оба подхода имеют свои преимущества и недостатки. Так, при введении факторов роста происходит их быстрое прониконовение в область повреждения, приводящее к минимизации развития острой дегенерации.

Однако вводимые белковые молекулы либо их комплексы подвержены? 4 быстрому распаду в тканях организма и выведению из них, что существенно снижает концентрацию вводимого препарата и, в свою очередь, ослабляет терапевтическое действие. В противоположность введению необходимых факторов, трансплантация клеток-продуцентов факторов роста решает проблему частых повторных инъекций, способна поддерживать физиологические концентрации регуляторных молекул на протяжении длительного времени в непосредственной близости от места дегенерации. Кроме того, трансплантированные клетки способны интегрироваться в ткани реципиента и сами могут участвовать в репарации возникшего дефекта [Dahlmann et al., 2010]. Для* предотвращения развития необратимых нейродегенеративных процессов в сетчатке глаза применяют трансплантацию клеток с широкими потенциями к дифференцировке — стволовых/прогениторных элементов нервной ткани или клеток стромы костного мозга. Введенные в организм реципиента-данные клетки не только активно мигрируют к месту повреждения и замещают своими дифференцированными потомками утраченные элементы дефектной ткани, но й поддерживают функциональность поврежденной ткани и активируют ее собственные системы репарации Blong et al, 2010]. Фундаментальные исследования возможности заселения трансплантированными клетками' новых ниш с последующей их дифференцировкой согласно новому микроокружению являются основополагающими для разработки и оптимизации наиболее эффективных клинических протоколов клеточной трансплантологии [West et al, 2010].

Изменения в сетчатой оболочке глаза, вызванные разнообразными внешними повреждающими факторами, часто ведут к частичной или полной утрате зрения. Несмотря на различие этиологических факторов, в основе развития целого ряда патологий сетчатки в большинстве случаев дисфункциональные изменения сетчатой оболочки сопровождаются разрушением клеточных взаимосвязей и гибелью нейронов; аналогичные процессы происходят и при старении организма. Функциональная 5 реабилитация сетчатки при патологии различного генеза в настоящее время остается актуальной задачей. Для эффективного лечения патологических состояний сетчатки необходимо детальное рассмотрение процессов, вовлеченных в их возникновение и развитие, и процессов, приводящих к их репарации.

Наиболее перспективными клеточными популяциями, применяемыми для трансплантации при лечении дегенеративных процессов в сетчатке глаза, являются нейральные стволовые/прогениторные клетки (НСПК) [Александрова и др., 2005, Blong а1, 2010], клетки пигментного эпителя глаза (ПЭ) \Semkova ег а1, 2002] и мультипотентные клетки стромы костного мозга (ММСК) [РЫппеу е1 а1, 2004].

Применение НСПК в качестве материала для трансплантации обусловлено их нейрональным происхождением, то есть при введении в сетчатку данные клетки попадают в микроокружение, способствующее поддержанию их пролиферации и дифференцировки, получают возможность взаимодействовать с нейрональным^ клетками самой сетчатки и непосредственно участвовать в замещении- утраченных в результате повреждения элементов сетчатки глаза. Удачные экспериментальные исследования, посвященные использованию НСПК для терапии-нейродегенеративных заболеваний, позволяют говорить о перспективности применения данной клеточной популяции и в клиниеской офтальмологии. Кроме того, инъекции клеток ПЭ и нейральных предшественников при различных патологиях сетчатки приводят к значительному улучшению клинической картины и быстрой репарации повреждений сетчатки глаза. Однако процедура выделения НСПК достаточно трудоемка и требует привлечения в качестве источника эмбрионального материала, что приводит к возникновению морально-этических проблем, трудностям' получения материала в короткие сроки и невозможности получения аллогенных для пациента клеток.

В последние годы накоплен значительный материал по возможности дифференцировки других мультипотентных клеток взрослого организма в нейрональном направлении, в частности — по трансдифференцировке клеток стромы костного мозга - ММСК. В ряде работ по трансплантации клеток костного мозга в ткани нейрального происхождения in vivo (в том числе и в сетчатку глаза) отмечается морфологическое и биохимическое преобразование ММСК не только в нейроны, но и в терминально-дифференцированные фотореципторные клетки \Sanchez-Ramos, 2002; Tomita. et al, 2006; Tao et al., 2010]. Костный мозг представляет собой сравнительно легкодоступный донорский материал для выделения аллогенных мультипотентных клеток, использование которого позволяет избежать многих проблем, присутствующих при применении эмбриональных НСПК [.Kabos et ah, 2002]. Однако вопрос о функциональном замещении нервных клеток* трансдифференцированными ММСК и их потомками остается открытым [Lei et ah, 2007]. Наблюдаемый положительный', клинический эффект после трансплантации ММСК в нейрональные структуры в первую очередь обусловлен коктейлем факторов, секретируемых инъецированными клетками; способных к активации собственных процессов репарации; ткани реципиента. Поэтому целесообразность применения клеток костного мозга в качестве материала для трансплантации при лечении дегенеративных процессов в нейросетчатке требует дальнейшего исследования и разработки новых модельных систем, позволяющих получать информацию на протяжении всего времени эксперимента от отдельных трансплантированных клеток.

Несмотря' на то, что показана способность трансплантированных клеток дифференцироватьсяв нейрональном направлении, длительная сохранность клеток донора в сетчатке и эффективное функциональное восстановление этой комплексной структуры глаза возможно лишь при образовании адекватных взаимосвязей между введенными клетками и тканью реципиента. К сожалению, накопленный к настоящему времени 7 теоретический и практический материал в области биологии стволовых клеток не позволяет достоверно прогнозировать эффективность терапии при помощи клеточной трансплантации. Мы все еще далеки от полного понимания тех механизмов, которые запускают восстановление ткани реципиента при введении клеток, и в настоящее время не представляется возможным этот процесс контролировать. Все еще остаются нерешенными фундаментальные вопросы о взаимодействии, введенных клеток с микроокружением реципиента. Продолжаются дискуссии-, о механизмах избирательной миграции трансплантата в области поражения и восстановления ткани [Levkovitch-Verbin, et ai, 2010]. Таюке недостаточно исследовано поведение инъецированных клеток при трансплантации в развивающиеся структуры, не закончившие свою дифференцировку. И, i наконец, остается непонятным, что происходит с клетками и их потомками в ткани реципиента в первые часы после транспалантации, с ' какими структурами они устанавливают взаимосвязи, и как регулируется их поведение [Klassen étal, 2011].

На все эти вопросы может помочь найти ответы метод органотипического культивирования. Моделирование в экспериментальных условиях трансплантации стволовых клеток в организм реципиента на примере инъекции этих же клеток в эксплантат in vitro позволяет гораздо глубже понять клеточную иерархию в различных тканях и организацию их ниш. При данном типе культивирования удается получить образцы практически нативной ткани, длительное время сохраняющие исходную цитоархитектонику и клеточный состав in vitro. Накопление экспериментальных данных в этой области позволит значительно продвинуться, в понимании функционирования организма на клеточном и субклеточном уровнях, а значит, повысит практический выход из экспериментальных работ [Niemeyer, 2001]. В связи с этим целесообразно создание адекватных модельных систем, максимально приближенных к условиям in vivo, которые позволят не только с легкостью детектировать 8 i процессы клеточной миграции, дифференцировки и гибели клеток на любых сроках после трансплантации, но и вносить коррективы в поведение трансплантируемых клеток. Одной из таких моделей является органотипическая эксплантационная культура сетчатки глаза крысы [Johansson etal., 2000, Ghosh et al., 2010].

Наиболее удачной экспериментальной моделью повреждения сетчатки глаза следует признать индуцированное лазером повреждение клеток [Castanheira et al., 2008]. Данный подход позволяет наносить локальные повреждения заданной интенсивности, то есть получать воспроизводимые результаты во всей серии экспериментов. Кроме того, широкое применение лазерной аппаратуры в повседневной жизни существенно увеличивает шансы травмирования сетчатки ее излучением, что делает данную модель достаточно актуальной. Лазерное излучение - разновидность неионизирующего электромагнитного излучения, характеризующегося монохроматичностью, когерентностью, поляризованностью, изотропностью которое способно оказывать дозозависимый эффект на биологические ткани. Проходя через биологический объект, энергия излучения частично рассеивается в виде тепла, частично • передается окружающим- молекулам,-вызывая их активацию с последующим переизлучением энергии и ее тепловой диссипацией. Существуют три основных типа повреждения тканей, вызванных лазерным облучением: тепловые эффекты, фотохимическое воздействие, а также акустические переходные эффекты. В зависимости от интенсивности воздействия и времени экспозиции, эффект облучения лазером может быть как положительным, стимулирующим пролиферативную активность клеток, так и отрицательным, приводящим к гибели клеток, их разрушению, температурной коагуляции белков и испарению органических веществ. Ввиду возможности независимо контролировать различные параметры лазерного излучения, его применение в экспериментальных работах по моделированию повреждения нейрональных сетей представляется чрезвычайно перспективным и удобным [Zhang et al., 2004].

2. Обзор литературы

Заключение Диссертация по теме "Биология развития, эмбриология", Сергеев, Сергей Александрович

6. Выводы

2. Эксплантаты сетчатки реагируют на введение трофических факторов (BDNF, PEDF, эритропоэтина, ангиопоэтина) и препаратов (Авастина™, Церебролизина) усилением процессов миграции, клеток края разрастания, ускорением их дифференцировки, увеличением жизнеспособности нейрональных клеток и самоорганизацией выселившихся нейронов в примитивные нервные сети.

4. Показано, что определяющим фактором дифференцировки трансплантированных in vitro клеток является их новое микроокружение: ММСК приобретают - только нейроноподобную морфологию, в то время как НСПК приобретают иммуноцитохимические маркеры дифференцирующихся нейронов.

6. При трансплантации клеток в эксплантаты сетчатки после нанесения лазерного повреждения показана зависимость интеграции клеток от способа их трансплантации: для НСПК и ММСК оптимальным являлось их введение во внутренний ядерный слой эксплантата сетчатки, а для клеток ПЭ — нанесение на его поверхность.

7. Показано, что для эффективного встраивания клеток в состав сетчатки в месте повреждения, их трансплантация должна быть

138 произведена не позднее, чем через сутки после нанесения повреждения.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Сергеев, Сергей Александрович, Москва

1. Александрова MA. Дифференцировка эмбрионального неокортекса при трансплантации у крыс // Бюлл.эксперим. биол.мед. 1998. Т. 126, приложение 1. С.88-91.

2. Александрова М.А., Ермакова И.В., Лосева Е.В. Миграция клеток от неокортикальных трансплантатов // Доклады Академии наук. 1993. Т.328". №5.С.619-621.

3. Александрова М.А., Сабурина И.Н., Корочкин Л.И., Ревищин A.B., Репин B.C., Ржанинова A.A., Сухих Г.Т. Поведение и дифференцировка нейрональных стволовых клеток in vivo. // Известия АН. Серия биологическая. 2001. №6. С. 656-665.

4. Александрова М.А., Сабурина И.Н., Полтавцева P.A., Марей М.В., Дубровина И.В., Ревищин A.B., Корочкин Л.И., Сухих Г.Т. Миграция и развитие нейральных стволовых клеток человека при трансплантации в мозг крыс. // Цитология. 2001. Т. 43. №9. С. 838.

5. Викторов И.В., Александрова О.П., Алексеева Т.Ю. Роллерная органная культура сетчатки постнатальных крыс. // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 2006. Т. 142. №4. С.486-489.

6. Ю.Кухарчук A.JI. Стволовые клетки и регенеративно-пластическая медицина//Трансплантология. 2004. Т.7. № 3. С.76-90.

7. П.Максимова Е.В. Онтогенез коры больших полушарий. / М. Наука. 1990. 184С.

8. Межевикина JI.M., Григорьев П.А., Фесенко Е.Е., Серышева В.В. Влияние фактора, ингибирующего лейкемию, на состояние бислойной липидной мембраны // Цитология. 2001. Т.43. № 9. С.878.

9. Милюшина JI.A., Кузнецова A.B., Григорян Э.Н., Александрова М.А. Фенотипическая пластичность клеток ретинального пигментного эпителия глаза взрослого человека in vitro. // Клеточные технологии в биологии и медицине. 2011. №2. С.71.

10. Полтавцева P.A., Марей М.В., Дубровина И.В. и др. Анализ развития стволовых нейральных клеток человека in vitro // Цитология.2001. Т.43. № 9. С.884-885.

11. Репин B.C. Эмбриональная стволовая клетка: от фундаментальных исследований в клинику.// Патологическая физиология и эксперим. терапия. 2001. N.2. С.3-8.

12. Репин B.C., Сабурина И.Н. Эмбриональные и взрослые стволовые клетки: место в современной медицине. // Лабораторная медицина. 2006. №8. С.33-44.

13. Робустова О.В., Бессмертный A.M. Современные представления об этиологии и патогенезе неоваскулярной глаукомы. // Глаукома. 2003. №4. С.58-63.

14. Сабурина И.Н. Эпителио-мезенхимальная пластичность мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток в норме и патологии (эксперимнтальное исследование). / Дис. док. биол. наук. Москва. 2010.

15. Сирман В.М., Сирман Я. В. Проблемные вопросы клеточной трансплантации // Трансплантология,- 2004.-Т.7, № 3.-С.58-67.

16. Сотников О.С. Статика и структурная кинетика живых асинаптических дендритов / Наука. Санкт-Петербург. 2008. 397 с.

17. Шахбазов А.В., Гончарова Н.В., Космачева С.М., Картель Н.А., Потапнев М.П. Пластичность фенотипа и профиля экспрессии мезенхимальных стволовых клеток человека в нейрогенных условиях. // Клеточные технологии в биологии и медицине 2009. № 2, С.77-81

18. Шпак А. А., Гаврилова Н. И., Ланевская Н. И.Дегтярева М. В. Нейротрофический фактор головного мозга у больных первичной глаукомой.// Офтальмохирургия. 2006. V. Р. 14-16.

19. АЬе Т. Regeneration of the retina using pigment epithelial cell transplantation. //Nippon Ganka Gakkai Zasshi. 2002. V.106. N.12. P.778-803.

20. Adams A. Stanford researchers track human stem cells transplanted into rat brain. //Eurekalert.2007. P. 183.

21. Aharonowiz M., Einstein O., Fainstein N., Lassmann H., Reubinoff В., BenHur T. Neuroprotective effect of transplanted human embryonic stem cell-derived neural precursors in an animal model of multiple sclerosis. // PLoS ONE. 2008. V.3. N.9. P.l-10.

22. Aimone J.B., Deng W., Gage F.H. Adult, neurogenesis: integrating theories and separating functions. // Trends Cogn Sci. 2010. V. 14. N.7. P.325-37.

23. Alexandrova M.A., Saburina I.N., Poltavtseva R.A., Revistchin A.V., Korochkin L.I., Sukhikh G.T. Behavior of human neural progenitor cells transplanted to rat brain. // Development Brain Research. 2001. V.132. Supp 1.2. P. 1-3.

24. AH R.R., Sowden J.C. Regenerative medicine: DIY eye. // Nature. 2011. V.472. N.7341. P.42-3.

25. Anjos-Afonso F, Siapati EK, Bonnet D. In vivo contribution of murine mesenchymal stem cells into multiple cell-types under minimal damage conditions. // J Cell Sci. 2004. V.117. P.5655-64.

26. Atkinson J., Panni M.K., Lund R.D. Effects of neurotrophins on embryonic retinal outgrowth. // Brain Res Dev Brain Res. 1999. V.l 12. N.2. P. 173-80.

27. Avwenagha O., Campbell G., Bird M.M. Distribution of GAP-43, beta-III tubulin and F-actin in developing and regenerating axons and their growth cones in vitro, following neurotrophin treatment. // J Neurocytol. 2003. V.32. N.9. P.1077-89.

28. Avwenagha O., Campbell G., Bird M.M. The outgrowth response of the axons of developing and regenerating rat retinal ganglion cells in vitro to neurotrophin treatment. // J Neurocytology. 2003. V.32. P. 1055-1075

29. Bahr S., Wolff J.R. Postnatal development of axosomatic synapses in the rat visual cortex: morphogenesis and quantitative evaluation. // J Comp- Neurol. 1985. V. 233. N.3. P.405-20

30. Bandyopadhyay M., Rohrer B. Photoreceptor structure and function is maintained in organotypic cultures of mouse retinas. // Molecular Vision. 2010. V.16. P. 1178-1185.

31. Banin E., Obolensky A., Idelson M., Hemo I., Reinhardtz E., Pikarsky E., Ben-Hur T., Reubinoff B. Retinal incorporation and differentiation of neural precursors derived- from human embryonic stem cells. // Stem Cells. 2006. V.24. N.2. P.246-57.

32. Beltrami A.P., Cesselli D., Bergamin N. Multi-potent cells can be generated in vitro from several adult humanorgans (heart, liver and bone marrow). // Blood. 2007. V.l 10. N.9. P.343 8-3446.

33. Bischof J., Müller A., Fänder M., Knippschild U., Fischer D. Neurite outgrowth of mature retinal ganglion cells and PC 12 cells requires activity of CK18 and CKle. // PLoS One. 2011. V.6. N.6. P.20857.

34. Borghuis B.G., Tian L., Xu Y., Nikonov S.S., Vardi N., Zemelman B.V., Looger L.L. Imaging light responses of targeted neuron populations in the rodent retina. // J Neurosci. 2011 Feb 23;31(8):2855-67.

35. Brazelton T.R., Rossi F.M., Keshet G.I., Blau H.M. From marrow to brain: expression of neuronal phenotypes in adult mice. // Science. 2000.V.290. N.5497. P. 1775-9.

36. Bronzi D., Bramanti V., Tomassoni D., Laureanti F., Grasso S., Li Volsi G., Avola R. Neural markers expression in rat bone marrow mesenchymal stem cell cultures treated with neurosteroids. // Neurochem Res. 2010. V.35. N.12. P.2154-60.

37. Bull N.D., Martin K.R. Concise Review: Toward Stem Cell-Based Therapies for Retinal'Neurodegenerative Diseases // Stem Cells. 2011. V.29. P. 11701175.

38. Carlson B.M. Human Embryology and Developmental Biology. / Mosby. 4th edition. 1999. 5IIP.

39. Carpenter M.K., Xia Cui, Zhong-yi-Mu, Jackson J., Sherman S., Seiger A., Wahlberg L.U. In vitro expansion of a multipotent population of a human neural progenitor cells. // Experimental Neurology. 1999. V.158. P.265-278.

40. Carri N.G., Perris R., Johansson S., Ebendal T. Differential outgrowth of retinal neurites on purified extracellular matrix molecules. // J Neurosci Res. 1988. V.19.P.428-39.

41. Castanheira P., Torquetti L., Nehemy M.B., Goes A.M. Retinal incorporation and differentiation of mesenchymal stem cells intravitreally injected in the injured retina of rats. // Arq Bras Oftalmol. 2008. V.71. N.5. P.644-50.

42. Castro R.F., Jackson K.A., Goodell M.A., Robertson C.S., Li, H.5 Shine, H.D. Failure of bone marrow cells to transdifferentiate into neural cells in vivo. // Science. 2002. V.297. P. 1299.

43. Chacko D.M., Das A.V., Zhao X., James J., Bhattacharya S., Ahmad I. Transplantation of ocular stem cells: the role of injury in incorporation and differentiation of grafted cells in the retina. // Vision Res. 2003. V.43. N.8. P.937-46.

44. Chen H., Weber A.J. BDNF Enhances Retinal Ganglion Cell Survival in Cats with Optic Nerve Damage. // IOVS. 2001. V.42. N.5. P.966-974.

45. Chiou S.H., Kao C.L., Peng C.H., Chen S.J., Tarng Y.W., Ku H.H., Chen Y.C., Shyr Y.M., Liu R.S., Hsu C.J., Yang D.M., Hsu W.M., Kuo C.D., Lee C.H. Biochem Biophys Res Commun. 2005. V.326. N.3. P.578-85.

46. Colter D.C., Class R., DiGirolamo C.M., Prockop D.J. Rapid expansion of recycling stem cells in cultures of plastic-adherent cells from human bone marrow. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2000. V.97. N.7. P.3213-8.

47. Dahlmann-Noor A., Vijay S., Jayaram H., Limb A., Khaw P.T. Current approaches and future prospects for stem cell rescue and regeneration of the retina and optic nerve. // Can J Ophthalmol. 2010. V.45. N.4. P.333-41.

48. Dai C., Qin Y.Z., Li Y., Raisman G., Li D. Survival of retinal ganglion cells in slice culture provides a rapid screen for olfactory ensheathing cell preparations. // Brain Res. 2010. V.1354. P.40-6.

49. Dawson D.W., Volpert O.V., Gillis P., Crawford S. E., Xu H.-J. Benedict W., Bouck N. P. Pigment Epithelium Derived Factor: a potent inhibitor of angiogenesis. // Science. 1999. V.285. P.244-248.

50. Denton M.L., Foltz M.S., Schuster K.J., Noojin G.D. In vitro model that approximates retinal damage threshold trends. // .J Biomedical Optics. 2008. V.13.N.5. P. 054014-1-6.

51. Devine S.M., Cobbs C., Jennings M., Bartholomew A., Hoffman R. Mesenchymal stem cells distribute to a wide range of tissues following systemic infusion into nonhuman primates. // Blood. 2003. V.101. N.8. P.2999-3001.

52. Doetsch F. A niche for adult neural stem cells. // Curr Opin Genet Dev. 2003. V.13. N.5. P.543-550.

53. Doetsch F., Alvarez-Buylla A. Network of tangential pathways for neuronal migration in adult mammalian brain. // Proc Natl Acad Sci USA. 1996. V.93. N.25 P.14895-900.

54. Doetsch F., Garcia-Verdugo J.M., Alvarez-Buylla A. Regeneration of a-germinal layer in the adult mammalian brain. // Proc Natl Acad Sci USA. 1999. V.96. N.20. P. 11619-24.

55. Doetsch F., Petreanu L., Caille I., Garcia-Verdugo J.M., Alvarez-Buylla A. EGF Converts Transit-Amplifying Neurogenic Precursors in the Adult Brain into Multipotent Stem Cells. //Neuron. 2002. V.36. P. 1021-1034.

56. Edelman, G.M., Jones F.S. Gene regulation of cell adhesion molecules in neural morphogenesis. // Acta Paediatr Suppl. 1997. V.422. P.12-19.

57. Eichler W., Yafai Y., Keller T., Wiedemann P., Reichenbach A. PEDF derived from glial Mu. ller cells: a possible regulator of retinal angiogenesis. // Experimental Cell Research. 2004. V.299. P.68- 78.

58. Eiraku M., Takata N., Ishibashi H., Kawada M., Sakakura E., Okuda S., Sekiguchi K., Adachi T., Sasai Y. Self-organizing optic-cup morphogenesis in three-dimensional culture. //Nature. 2011. V.472. N.7341. P.51-6.

59. Engelsberg K., Ehinger B., Wasselius J., Johansson K. Apoptotic cell death and microglial cell responses in cultured rat retina. // Graefe's Arch Clin Exp Ophthalmol. 2004. V.242. P.229-239.

60. Engelsberg K., Ghosh F. Human Retinal Development in an in situ Whole Eye Culture System. // DevNeurosci. 2011. Jul 21. Epub ahead of print.

61. Engelsberg K., Johansson K., Ghosh F. Development of the Embryonic Porcine Neuroretina in vitro. // Ophthalmic Res. 2005. V.37. P.104-111.

62. Eriksson C., Bjorklund A., Wictorin K. Neuronal differentiation following transplantation of expanded mouse neurosphere cultures derived from different embryonic forebrain regions. // Experimental Neurology. 2003. V. 184. P.615-635.

63. Estes M.L., Ransohoff R.M., McMahon J.T., Jacobs B.S., Barna B.P. Characterization of adult human astrocytes derived from explant culture. // J Neurosci Res. 1990. V.27. P.697-705.

64. Faiz M., Acarin L., Castellano B., Gonzalez B. Proliferation dynamics of germinative zone cells in the intact and excitotoxically lesioned postnatal rat brain. // BMC Neuroscience. 2005. V.6.:N.26. P. 1-16.

65. Fedoroff S., Richardson A. Protocols for Neural Cell Culture. / 3rd Ed. Humana Press, Inc., Totowa, NJ. 2002. 35lp.

66. Fintz A.C., Audo I., Hicks D., Mohand-Said S., Léveillard T., Sahel J. Partial characterization of retina-derived cone neuroprotection in two culture models of photoreceptor degeneration. // Invest Ophthalmol Vis Sci. 2003. V.44. N.2. P.818-25.

67. Forsberg C., Smith-Berdan S. Parsing the niche code: the molecular mechanisms governing hematopoietic stem cell adhesion and differentiation. // Haematologica. 2009. V.94.N.11. P. 1477-1481.

68. Friedenstein A.J., Gorslcaja J.F., Kulagina N.N. Fibroblast precursors in normal and irradiated mouse hematopoietic organs. // Exp Hematol. 1976. V.4. N.5. P.267-74.

69. Friedenstein A.J., Piatetzky-Shapiro II., Petrakova K.V. Osteogenesis in transplants of bone marrow cells. // J Embryol Exp Morphol. 1966. V.16. N.3. P.381-90.

70. Gamm D.M., Nelson A.D., Svendsen C.N. Ann N.Y. Human retinal progenitor cells grown as neurospheres demonstrate time-dependent changes in neuronal and glial cell fate potential. // Acad Sci. 2005. V.1049. P.107-17.

71. Gangaraju V.K., Lin H. MicroRNAs: key regulators of stem cells. // Nat Rev Mol Cell Biol. 2009. V.10. N.2. P.l 16-25.

72. Ghosh F., Arne'r K., Engelsberg K. Isolation of Photoreceptors in the Cultured Full-Thickness Fetal Rat Retina. // Investigative ' Ophthalmology & Visual Science. 2009. V. 50. N.2. P.826-835.

73. Gimble J.M., Zvonic S., Floyd Z.E., Kassem M., Nuttall M.E. Playing with bone and fat. // J. Cell. Biochem. 2006. V.98. P.251-266.

74. Gordon D., Scolding N.J. Human mesenchymal stem cell culture for neural transplantation. //Methods Mol BioL2009. V.549. P. 103-18.

75. Guo L., Yin F., Meng H.Q., Ling L., Hu-He T.N., Li P., Zhang C.X., Yu S., Duan D.S., Fan H.X. Differentiation of mesenchymal stem cells into dopaminergic neuron-like cells in vitro. // Biomed Environ Sci. 2005. V.18. N.l. P.36-42.

76. Gustmann S., Dünker D. In vivo-like Organotypic Murine Retinal Wholemount Culture. // JoVE. V.35. P.l-5. http://www.iove.com/index/Details.stp?ID=l 634.

77. Halfter W., Willem M., Mayer U. Basement Membrane-Dependent Survival of Retinal Ganglion Cells. // IOVS. 2005. V.46. N.3. P.1000-1001.

78. Hara A., Niwa M., Kunisada T., Yoshimura N., Katayama M., Kozawa O., Mori H. Embryonic stem cells are capable of generating a neuronal network in the adult mouse retina. // Brain Res. 2004. V.999. N.2. P.216-21.

79. Harris R.G., Herzog E.L., Bruscia E.M., Grove J.E., Van Arnam J.S., Krause D.S. Lackofafusion requirement for development of bone marrow-derived epithelia. // Science. 2002. V.305. N.5680. P.90-93.

80. Hayes G.M.,Woodroofe M.N., Cuzner M.L. Characterisation of microglia isolated from adult human and' rat brain. // J Neuroimmunol. 1988. V.19. P. 177-89.

81. Herzog E.L., Chai L., Krause D.S. Plasticity of marrow-derived stem cells. // Blood. 2003. V.102. P.3483-3493.

82. Ho M., Yu D., Davidsion M.C., Silva G.A. Comparison of standard surface chemistries for culturing mesenchymal stem cells prior to neural differentiation. // Biomaterials. 2006. V.27. N.24. P.4333-9.

83. Hofstetter C.P., Schwarz E.J., Hess D., Widenfalk J., El Manira A., Prockop D.J., Olson L. Marrow stromal cells form guiding strands in the injured spinal cord and promote recovery. // Proc Natl Acad Sci. USA. 2002. V.99. N.4. P.2199-204.

84. Hu J., Bok D. A cell culture medium that supports the differentiation of human retinal pigment epithelium into functionally polarized monolayers. // Mol Vis. 2001. V.7. P. 14-9.

85. Hutchings H., Maitre-Boube M., Tombran-Tink J., Plou J. Pigment epithelium-derived factor exerts opposite effects on endothelial cells of différent phenotypes. // Biochemical and Biophysical Research Communications. 2002. V.294. P.764-769.

86. Ikeda K., Tanihara H., Honda Y., Tatsuno T., Noguchi H., Nakayama C. BDNF Attenuates Retinal Cell Death Caused by Chemically Induced Hypoxia in Rats. //IOVS. 1999. V.40. N.9 P.2130-2140.

87. Ivey K.N., Srivastava D. MicroRNAs as regulators of differentiation and cell fate decisions. // Cell Stem Cell. 2010. V.7. N.l. P.36-41.

88. Jakeman L.B., Wei P., Guan Z., Stokes B.T. Brain-derived neurotrophic factor stimulates hindlimb stepping and sprouting of cholinergic fibers after spinal cord injury. //Exp Neurol. 1998. V.154. N.l. P. 170-84.

89. Jiang Y., Vaessen B., Lenvik T., Blackstad M., Reyes M., Verfaillie C.M. Multipotent progenitor cells can be isolated from postnatal murine bone marrow, muscle, and brain. // Experimental Hematology. 2002. V.30. N.8. P.896-904.

90. Jin W., Xing Y.Q., Yang A.H. Epidermal growth factor promotes the differentiation of stem cells derived from human umbilical cord blood into neuron-like cells via taurine induction in vitro. // In Vitro Cell Dev Biol Anim. 2009. V.45. N.7. P.321-7.

91. Joannides A., Gaughwin P., Scott M., Watt S., Compston A., Chandran S. Postnatal astrocytes promote neural induction from adult human bone marrow-derived stem cells. // J Hematother Stem Cell Res. 2003. V.12. N.6. P.681-8.

92. Joe A.W., Gregory-Evans K. Mesenchymal stem cells and potential applications in treating ocular disease. // Curr Eye Res. 2010. V.35. N.ll. P.941-52.

93. Johansson K., Ehinger B. Structural changes in the developing retina maintained in vitro. // Vision Research. 2005. V.45. P.3235-3243.

94. Johnson T.V., Bull N.D., Martin K.R. Identification of barriers to retinal engraftment of transplanted stem cells. // Invest Ophthalmol" Vis Sci. 2010. V.51. N.2. P.960-70.

95. Jonas J.B., Witzens-Harig M.5 Arseniev L., Ho A.D. Intravitreal autologous bone marrow derived mononuclear cell transplantation: a feasibility report. // Acta 0phthalmol.2008. V.86. N.2. P.225-6.

96. Jonas J.B., Witzens-Harig M., Arseniev L., Ho A.D. Intravitreal autologous bonemarrow-derived mononuclear cell transplantation. // Acta Ophthalmol. 2010. V.88. N.4. P.131-2.

97. Kabos P., Ehtesham M., Kabosova A., Black K.L., Yu J.S.Generation of Neural Progenitor Cells from Whole Adult Bone Marrow. // Experimental Neurology. 2002. V.178. P.288-293.

98. Kafienan W., Mistry S., Williams C., Hollander. Nucleostemin is a marker of proliferating stromal stem cells in adult human bone marrow. // Stem Cells. 2005. V.24.N.4. P.l 113-20.

99. Kang S.K., JunaS.E., Bae Y.C., Jung J.S. I nteractions between human adipose stromal cells and mouse neural stem cells in vitro. // Developmental Brain Research. 2003. V.145. P.141-149.

100. Karl M.O., Reh Т.A. Regenerative medicine for retinal diseases: activating the endogenous repair mechanisms// Trends Mol Med. 2010. V.16. N.4. P. 193-202.

101. Kashiwagi F., Kashiwagi K., Iizuka Y.,Tsukahara S. Effects of Brain-Derived Neurotrophic Factor and Neurotrophin-4 on Isolated Cultured Retinal Ganglion Cells: Evaluation by Flow Cytometry. // IOVS. 2000. V.41. N.8. P.2373-2377.

102. Kassis I., Vaknin-Dembinsky A., Karussis D. Bone marrow mesenchymal stem cells: agents of immunomodulation and neuroprotection. // Curr Stem Cell Res Ther. 2011. V.6. N.l. P.63-8.

103. Kerrison J.B., Duh E.J., Yu Y., Otteson D.C., Zack D.J. A system for inducible gene expression in retinal ganglion cells. // Invest Ophthalmol Vis Sci. 2005. V.46. N.8. P.2932-9.

104. Kim S., Honmou O., Kato K., Nonaka Т., Houlcin K., Hamada H., Kocsis J.D. Neural differentiation potential of peripheral blood- and bone-marrow-derived precursor cells. // Brain Res. 2006. V.l 123. N.l. P.27-33.

105. Koizumi A., Zeck G., Ben Y., Masland R.H., Jakobs T.C. Organotypic culture of physiologically functional adult mammalian retinas. // PLoS One. 2007. V.2.N.2.P.221.

106. Krause D.S., TheiseN.D., Collector M.I., Henegariu O., Hwang S., Gardner R., Neutzel S., Sharkis S J. Multi-organ, multi-lineage engraftment by a single bone marrow-derived stem cell. // Cell. 2001. V.105. N.3. P.369-77.

107. Kretz A., Hermening S.H., Isenmann S. A novel primary culture technique for adult retina allows for evaluation of CNS axon regeneration in rodents. // J Neuroscience Methods. 2004. V.136 P.207-219.

108. Kucia M., Reca R., Campbell F.R. A population of very small embryonic-like (VSEL) CXCR4(+)SSEA-1 (+)Oct-4+ stem cells identified in adult bone marrow. // Leukemia. 2006. V.20. N.5. P.857-869.

109. Kucia M., Reca R., Jala V.R., Dawn B., Ratajczak J., Ratajczak, M.Z. Bone marrow as a home of heterogenous populations of nonhematopoietic stem cells. //Leukemia. 2005. Y.19.N.7. P.l 118-1127.

110. Kulbatski I. Stem/precursor cell-based CNS therapy: the importance of circumventing immune suppression by transplanting autologous cells. // Stem Cell Rev. 2010. V.6. N.3.405-10.

111. Kurimoto Y., Shibuki H., Kaneko Y., Ichikawa M., Kurokawa T., Takahashi M., Yoshimura N. Transplantation of adult rat hippocampus-derived neural stem cells into retina injured by transient ischemia. // Neurosci Lett. 2001. V.306. N.l-2. P.57-60.

112. Lamoury F.M., Croitoru-Lamoury J., Brew, B.J. Undifferentiated mouse mesenchymal stem cells spontaneously express neural and stem cell markers Oct-4 and Rex-1. // Cytotherapy. 2006. V.8. N.3. P.228-242.

113. Lapidot T., Kollet O. The brain-bone-blood triad: traffic lights for stem-cell homing and mobilization. // Hematology Am Soc Hematol Educ Program. 2010. P.l-6.

114. Layer P.G., Robitzki A., Rothermel A., Willbold E. Of layers and spheres: the reaggregate approach in tissue engineering. // Trends Neurosci. 2002. V.25. N.3. P.131-4.

115. Layer P.G., Rothermel A., Willbold E. From stem cells towards neural layers: a lesson from re-aggregated embryonic retinal cells. //Neuroreport. 2001. V. 12. N7. P.39-46.

116. Lei Z., Yongda L., Jun M., Yingyu S., Shaoju Z., Xinwen Z., Mingxue Z. Culture and neural differentiation of rat bone marrow mesenchymal stem cells in vitro. // Cell Biology International. 2007. V.31. P.916-923.

117. Lepore A.C., Neuhuber B., Connors T.M., Han S.S., Liu Y., Daniels M.P., Rao M.S., Fischer I. Long-term fate of neural precursor cells following transplantation into developing and adult CNS. //Neuroscience. 2006. V.139. N.2. P.513-30.

118. Levin L.A. Retinal Ganglion Cells and Supporting Elements in Culture. // J Glaucoma. 2005. V.14. P.305-307.

119. Li N., Li X.R., Yuan J.Q. Effects of bone-marrow mesenchymal stem cells transplanted into vitreous cavity of rat injured by ischemia/reperfusion. // Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 2009. V.247. N.4. P.503-14.

120. Linser P., Saad A.D., Soh B.M., Moscona A.A. Cell contact-dependent regulation of hormonal induction of glutamine synthetase in embryonic neural retina. // Prog Clin Biol Res. 1982. V.85.B. P.445-58.

121. Lois C., García-Verdugo J.M., Alvarez-Buylla A. Chain migration of neuronal precursors. // Science. 1996. V.271. N.5251. P.978-81.

122. Lu В., Wang S., Girman S., McGill Т., Ragaglia V., Lund R. Human adult bone marrow-derived somatic cells rescue vision in a rodent model of retinal degeneration. // Exp Eye Res. 2010. V.91. N.3. P.449-55.

123. Lu P., Blesch A., Tuszynski M.H. Induction of Bone Marrow Stromal Cells to Neurons: Differentiation, Transdifferentiation, or Artifact? // JNeuroscience Research. 2004. V.77. P.174-191.

124. Lye M.H., Jakobs T.C., Masland R.H., Koizumi A. Organotypic culture of adult rabbit retina. // J Vis Exp. 2007. V.3. P.190.

125. Ma Y. Т., Hsieh Т., Forbes M. E., et al. BDNF injected into the superior colliculus reduces developmental retinal ganglion cell death. // J Neurosci. 1998.- V.18. P.2097-107.

126. Machalinska A., Baumert В., Kuprjanowicz L., Wiszniewska В., Karczewicz D., Machalinski B. Potential application of adult stem cells in retinal repair—challenge for regenerative medicine. // Curr Eye Res. 2009. V.34. N.9. P.748-60.

127. MacLaren R.E., Pearson R.A., MacNeil A., Douglas R.H., Salt Т.Е., Akimoto M., Swaroop A., Sowden J. C., AH R.R. Retinal repair by transplantation of photoreceptor precursors. // Nature. 2006.V.444. P.203-207.

128. Madhavan L., Ourednik V., Ourednik J. Neural stem/progenitor cells initiatethe formation of cellular networks that provide neuroprotection by growth157factor-modulated antioxidant expression. // Stem Cells. 2008. V.26. N.l. P.254-65.

129. Massirer K.B., Carromeu C., Griesi-Oliveira K., Muotri AR. Maintenance and differentiation of neural stem cells. // Syst Biol Med. 2011. V.3. N.l. P.107-14.

130. Merkle F., Alvares-Buylla A. Neural stem cells in mammalian development // Curr. Opin. Cell Biol. 2006. V.18. P.704-709.

131. Merkle F.T., Tramontin A.D., Garcia-Verdugo J.M., Alvarez-Buylla A. Radial glia give rise to adult neural stem cells in the subventricular zone. // Proc Natl Acad Sci USA. 2004. V.101. P. 17528-17532.

132. Meyer J.S., Katz M.L., Maruniak J.A., Kirk M.D. Embryonic stem cell-derived neural progenitors incorporate into degenerating retina and enhance survival of host photoreceptors. // Stem Cells. 2006. V.24. N.2. P.274-83.

133. Mezey E., Chandross K.J., Harta G., Maki R.A., McKercher S.R. Turning blood into brain: cells bearing neuronal antigens generated in vivo from bone marrow. // Science. 2000. V.290. N.5497. P.1779-82.

134. Ming G.L., Song H. Adult neurogenesis in the mammalian brain: significant answers and significant questions. //Neuron. 2011. V.70. N.4. P.687-702.

135. Miyata T., Kawaguchi A., Saito K., Kawano M., Muto T., Ogawa M. Asymmetric production of surface-dividing and non-surface-dividing cortical progenitor cells. //Development. 2004. V.131. N.13. P.3133-45.

136. Momin E.N., Mohyeldin A., Zaidi H.A., Vela G., Quiñones-Hinojosa A. Mesenchymal stem cells: new approaches for the treatment of neurological diseases. // Curr Stem Cell Res Ther. 2010. V.5. N.4. P.326-44.

137. Montana C.L., Myers C.A., Corbo J.C. Quantifying the activity of cis-regulatory elements in the mouse retina by explant electroporation. // J Vis Exp. 2011. V.28. N.52. P.2821.

138. Moritoh S., Tanaka K.F., Jouhou H., Ikenaka K., Koizumi A. Organotypic tissue culture of adult rodent retina followed by particle-mediated acute gene transfer in vitro. // PLoS One. 2010 . V.5. N.9. P.12917.

139. Moscona A.A., Kirk D.L.Control of glutamine synthetase in the embryonic retina in vitro. // Science. 1965. V.148. P.519-21.

140. Munoz-Elias G., Akiva J.M., Coyne T.M.,Woodbury D., Black I.B. Adult Bone Marrow Stromal Cells in the Embryonic Brain: Engraftment, Migration, Differentiation, and Long-Term Survival. // J Neuroscience. 2004. V. 24. N.19. P.4585- 4595.

141. Murer M.G., Yan Q., Raisman-Vozari R. Brain-derived neurotrophic factor in the control human brain, and in Alzheimer's disease and Parkinson's disease. //Prog Neurobiol. 2001. V.63. N.l. P.71-124.

142. Nagasawa T., Omatsu Y., Sugiyama T. Control of hematopoietic stem cells by the bone marrow stromal niche: the role of reticular cells. // Trends Immunol. 2011. V.32. N.7. P.315-20.

143. Narayan P.J., Gibbons H.M., Mee E.W., Faull R.L.M., Dragunow M. High throughput quantification of cells with, complex morphology in mixed cultures. // J Neurosci Meth 2007. V.164. P.339-49

144. Niemeyer G. Retinal research using the perfused mammalian eye. // Progress in Retinal and Eye Research. 2001. V.20. N.3. P.289-318.

145. Oka S.M., Frederick J.M., Landers R.A., Bridges C.D.B. Adult human retinal cells in culture, identification of cell types and expression of differentiated properties. // Experimental Cell Research. 1985. V.159 P. 127140.

146. Orkin S.H., Zon L.I. // Hematopoiesis and stem cells: Plasticity versus developmental heterogeneity. Nature Immunology. 2002. V.3. N.4. P.323-328.

147. Otani A., Kinder K., Ewalt K., Otero F.J., Schimmel P., Friedlander M., Bone marrow-derived stem cells target retinal astrocytes and can promote or inhibit retinal angiogenesis. //Nat. Med. 2002. V.8. P. 1004-1010.

148. Otani T., Yamaguchi Y., Kishi S. Serous macular detachment secondary to distant retinal vascular disorders. // Retina. 2004. V.5. P.758-62.

149. Parmar M., Skogh C., Bjorklund A., Campbell K. Regional specification of neurosphere cultures derived from subregions of the embryonic telencephalon. // Molecular and Cellular Neuroscience. 2002. V.21. P.645-656.

150. Pease M.E., McKinnon S.J., Quigley H.A., Kerrigan-Baumrind L.A., Zack DJ. Obstructed Axonal Transport of BDNF and Its Receptor TrkB in Experimental Glaucoma. // IOVS. 2000. V.41. N.3. P.764-774.

151. Phinney D.G., Hill K., Michelson C. et al. Biological activities encoded by the mMSC transcriptome provide a basis for their developmental potential and broad therapeutic efficacy. // Stem Cells. 2004. P.236.

152. Pinzo-Duarte G., Kohler K., Arango-Gonzalez B., Guenther E. Cell differentiation, synaptogenesis, and influence of the retinal pigment epithelium in a rat neonatal organotypic retina culture. // Vision Research. 2000. V.40. P.3455-3465.

153. Pluchino S., Cusimano M., Bacigaluppi M., Martino G. Remodelling the injured CNS through the establishment of atypical ectopic perivascular neural stem cell niches. //Arch Ital Biol. 2010. V.148. N.2. P. 173-83.

154. Polisetti N., Ghaitanya V.G., Babu P.P., Vemuganti G.K. Isolation, characterization and differentiation potential of rat bone marrow stromal cells. //Neurol India. 2010 . V.58. N.2. P.201-8.

155. Quigley H.A., McKinnon S.J., Zack D.J., Pease M.E., Kerrigan-Baumrind L.A., Kerrigan D.F., Mitchell R.S. Retrograde Axonal Transport of BDNF in Retinal Ganglion Cells Is Blocked by Acute IOP Elevation in Rats. // IOVS. 2000. V.41. N.l 1. P.3460-3466.

156. Rafii S., Lyden, D.L. Therapeutic stem and progenitor cell transplantation for organ vascularization and regeneration. // Natural Medicines. 2003. V.9. N.6. P.702—712.

157. Ratajczak M.Z., Zuba-Surma E.K., Machalinski B., Ratajczak J., Kucia M. Very Small Embryonic-Like (VSEL) Stem Cells: Purification from Adult Organs, Characterization, and Biological Significance. // Stem Cell Rev. 2008. V.4. P.89-99.

158. Ratajczak J., Zuba-Surma E., Paczkowska E., Kucia M., Nowacki P., Ratajczak MZ. Stem cells for neural regeneration—a potential application' of very small embryonic-like stem cells. // J Physiol Pharmacol. 2011. V.62. N.l. P.3-12.

159. Reyes M., Lund T., Lenvik T., Aguar D., Koodie L., Verfaillie C.M. Purification and ex vivo expansion of postnatal human marrow mesodermal progenitor sells. //Blood. 2001. V.98. P.2615-2625.

160. Reynolds B.A., Weiss S. Clonal and'population analyses demonstrate that an EGF-responsive mammalian embryonic CNS precursor is a stem cell. // Developmental Biology. 1996. V.175. P.l-13.

161. Rodriguez F.D., Vecino E. Stem- cell plasticity, neuroprotection and regeneration in human eye diseases. // Curr Stem Cell Res Ther. 2010. V.29

162. Rorke L.B., Gilden D.H., Wroblewska z> Santoli D. Human brain in tissue culture. IV. Morphological characteristics. // J Comp Neurol. 1975. V.161. P.329-40.

163. Sakaguchi D.S., Van Hoffelen S.J., Young M.J. Differentiation and morphological integration of neural progenitor cells transplanted into the developing mammalian eye. // Ann NY Acad Sci. 2003. V.995. P. 127-39.

164. Savelyev S.A., Larsson K.C., Johansson A.S., Lundkvist G.B.Slice preparation, organotypic tissue culturing and luciferase recording of clock gene activity in the suprachiasmatic nucleus. // J'Vis Exp. 2011. V.15. N.48. P.2439.

165. Schraufstatter I.U., Discipio R.G., Khaldoyanidi S. Mesenchymal stem cells and their microenvironment. // Front Biosci. 2011. V. 17. P.2271-88.

166. Schrepfer S., Deuse T., Lange C., Katzenberg R., Reichenspurner H., Robbins R.C., Pelletier M.P. Simplified protocol to isolate, purify, and culture expand mesenchymal stem cells. // Stem Cells Dev. 2007. V.l. P.105-7.

167. Seiler M.J., Aramant R.B., Bergstrom A. Co-transplantation of embryonic retina and retinal pigment epithelial cells to rabbit retina. // Curr Eye Res. 1995. V.14. N.3. P.199-207.

168. Shi H., Yang W„ Cui Z.H., Lu C.W., Li X.H., Liang L.L., Song E. Tracking of CFSE-labeled endothelial progenitor cells in laser-injured mouse retina. // Chin Med J. 2011. V. 124. N.5. P.751 -7.

169. Shi Q., Rafíi S., Wu M.H. Evidence for circulating bone marrow-derived endothelial cell. // Blood. 1998. V.92. N.2. P.362-367.

170. Singh M.S., Maclaren R.E. Stem cells as a therapeutic tool for the blind: biology and future prospects. // Proc Biol Sci. 2011. Aug 3. Epub ahead of print. n

171. Siqueira R.C., Voltarelli'J.C., Messias A.M., Jorge R. Possible mechanisms of retinal function recovery with the use of cell therapy with bone marrow-derived stem cells. // Arq Bras Oftalmol. 2010. V.73. N.5. P.474-9.

172. Soares S., Sotelo C. Adult neural stem cells from the mouse subventricular zone are limited in migratory ability compared to progenitor cells of similar origin. //Neuroscience. 2004. V.128. P.807-817

173. Song S., Sanchez-Ramos J.R. Preparation of Neural Progenitors from Bone Marrow and Umbilical Cord Blood. // Methods in Molecular Biology. 2006. V.438. P.123-133.

174. Spradling A., Drummond-Barbosa D., Kai T. Stem cells find their niche. // Nature. 2001. V.414. N.6859. P.98-104.

175. Steven W., Mu W.X., Bowers W. J., Klein W.H. Retinal, ganglion cell differentiation in cultured mouse retinal explants. // Methods. 2002. V.28. P.448—456.

176. Takahashi M., Palmer T.D., Takahashi J., Gage F.H. Widespread integration and survival of adult-derived neural progenitor cells in the developing optic retina. // Mol Cell Neurosci. 1998. V.12. N.6. P.340-8.

177. Takano M. Brain derived Neutrophic factor Enhances Neurite Regeneration from Retinal Ganglion Cells in Aged Human Retina in vitro. // Exp. Eye. Res. 2002. V.74. P.319-323.

178. Tao Y.X., Xu H.W., Zheng Q.Y., FitzGibbon T. Noggin induces human bone marrow-derived mesenchymal stem cells to differentiate into neural and photoreceptor cells. // Indian J Exp Biol. 2010.V.48. N.5. P.444-52.

179. Tokumine J., Kakinohana O., Cizkova D., Smith D.W., Marsala M. Changes in spinal GDNF, BDNF, and NT-3 expression after transient spinal cord ischemia in the rat. // J Neurosci Res. 2003. V.74. N.4. P.552-61.

180. Tomita M., Mori Т., Maruyama K., Zahir Т., Ward M., Umezawa A., Young M.J. A comparison of neural differentiation and retinal transplantation with bone marrow-derived cells and retinal progenitor cells. // Stem Cells. 2006. V.24. N.10. P.2270-8.

181. Tseng P.Y., Chen С J., Sheu C.C., Yu C.W., Huang Y.S. Spontaneous differentiation of adult rat marrow stromal cells in a long-term culture. // J Vet Med Sci. 2007. V.69. N.2. P.95-102.

182. Uccelli A., Benvenuto F., Laroni A., Giunti D. Neuroprotective features of mesenchymal stem cells. // Best Pract Res Clin Haematol. 2011. V.24. N.l. P.59-64.

183. Uchida N., Buck D.W., He D., Reitsma M.J., Masek M., Phan T.V., -Tsukamoto A.S., Gage F.H., Weissman I.L. Direct isolation of human central nervous system stem.cells. // PNAS. 2000: V.97. N.26. P.14720-14725.

184. Urrea C., Castellanos D. A., Sagen J., Tsoulfas P., Bramlett H. M., Dietrich W. D. Widespread cellular proliferation and- focal neurogenesis after traumatic brain injury in the rat. // Restorative Neurology and Neuroscience. 2007. V.25. P.65-76.

185. Surgeons rats. //ProcNatl Acad Sci USA. 1999. V.96. N.6. P.3126-31.

186. Uccelli A., Benvenuto F., Laroni A., Giunti D. Neuroprotective features of mesenchymal stem cells. // Best.Pract Res Clin Haematol. 2011. V.24. N.l. P.59-64.

187. Valtink M., Engelmann K. Culturing of retinal pigment epithelium cells. // Dev Ophthalmol: 2009. V:43. P. 109-19.

188. Vassilopoulos G., Russell D.W. Cell fusion: an alternative to stem cell plasticity and its therapeutic implications. // Curr Opin Genet Dev. 2003. V.5. P.480-5.

189. Wallace V.A. Stem cells: a source for neuron repair in retinal disease. // Can J Ophthalmol. 2007. V.42. N.3. P.442-6.

190. Wallace V.A. Concise review: making a retina—from the building blocks to clinical applications. // Stem Cells. 2011. V.29. N.3. P.412-7.

191. Wang L., Zhang Z., Wang Y., Zhang R., Chopp M. Treatment of stroke with erythropoietin enhances neurogenesis and angiogenesis and improves neurological function in rats. // Stroke. 2004. V.35. N.7. P. 1732-7.

192. Wang S., Lu B., Girman S., Duan J., McFarland T., Zhang Q.S., Grompe M., Adamus G., Appukuttan B., Lund R. Non-invasive stem cell therapy in a rat model for retinal degeneration and vascular pathology. // PLoS One. 2010V.5. N.2. P.e9200.

193. Wang Z.Y., ShenL.J., Zhao K.IC., Song Z.M., Qu J. Elevated Erythropoietin in Vitreous of Patients with Rhegmatogenous Retinal Detachment and Proliferative Vitreoretinopathy. // Ophthalmic Res. 2009. V.42. N.15. P.138-140.

194. Watanabe M., Tokita Y., Kato M., Fukuda A.Y. Intravitreal Injections of Neurotrofic Factors and Forskolin Enhanse Survival and Axonal Regeneration of Axotomized Ganalion Cells in Cat Retina. // Neuroscience. 2003. V.116 P.733-742.

195. Wojcik-Stanaszek L., Gregor A., Zalewska T. Regulation of neurogenesis by extracellular matrix and integrins. // Acta Neurobiol Exp.2011. V. 1. N. 1. P.103-12.

196. Woodbury D., Schwarz E.G., Prockop D.J., Black I.J. Adult Rat and Human Bone Marrow Stromal Cells Differentiate Into Neurons. // J Neuroscience Research. 2000. V.61. P.364-370.

197. Xu Z., Jiang F., Zeng Y., Alkhodari H.T., Chen F. Culture of rat retinal ganglion cells. // J Huazhong Univ Sci Technolog Med Sci. 2011. V.31. N.3. P.400-3.

198. Yafai Y., Lange J., Wiedemann P., Reichenbach A., Eichler W. Pigment Epithelium-Derived Factor Acts as an Opponent of Growth-Stimulatory Factors in Retinal Glial-Endothelial Cell Interactions. // Glia. 2007. V.55. P.642-651.

199. Yaji N., Yamato M., Yang J., Okano T., Hori S. Transplantation of tissue-engineered retinal pigment epithelial cell sheets in a rabbit model. // Biomaterials. 2009. V.30. N.5. P.797-803.

200. Yamagata M., Sanes J.R. Lamina-specific cues guide outgrowth and arborization of retinal axons in the optic tectum. // Development. 1995. V.121. P. 189-200.

201. Yang X.T., Bi Y.Y., Feng D.F. From the vascular microenvironment to neurogenesis. // Brain Res Bull. 2011. V.84.N.1P.1-7.

202. Yao J., Tucker B.A., Zhang X., Checa-Casalengua P., Herrero-Vanrell R., Young M.J. Robust cell integration from co-transplantation of biodegradable MMP2-PLGA microspheres with retinal progenitor cells. // Biomaterials. 2011. V.32. N.4. P.1041-50.

203. Ying Q.L., Nichols J., Evans E.P., Smith A.G. Changing potency by spontaneous fusion. //Nature. 2002. V.416. N.6880. P.485-7.

204. Young M.J., Ray J., Whiteley S.J., Klassen H., Gage F.H. Neuronaldifferentiation and morphological integration of hippocampal progenitor cells167

205. Работа выполнена при реализации ФЦП «Кадры научной и научно-педагогической России на 2009-2013гг.»6Э

Информация о работе

Сергеев, Сергей Александрович
кандидата биологических наук
Москва, 2011
ВАК 03.03.05

Диссертация

Органотипическая культура сетчатки глаза как модель для оценки эффективности трансплантации клеток - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы