Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Организация транспорта белков через комплекс Гольджи

ВАК РФ 03.00.25, Гистология, цитология, клеточная биология

Автореферат диссертации по теме "Организация транспорта белков через комплекс Гольджи"

На правах рукописи Безкусенко Галина Владимировна

ОРГАНИЗАЦИЯ ТРАНСПОРТА БЕЛКОВ ЧЕРЕЗ КОМПЛЕКС ГОЛЬДЖИ

03.00.25. - Гистология, цитология, клеточная биология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

ООЗОВ14В8

Москва-2007

003061488

На правах рукописи Безиусенко Галина Владимировна

ОРГАНИЗАЦИЯ ТРАНСПОРТА БЕЛКОВ ЧЕРЕЗ КОМПЛЕКС ШЛЬДЖИ

03.00.25. - Гистология, цитология, клепочная биология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

Москва-2007

Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего

профессионального образования «Российский государственный медицинский университет» Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию РФ

Научный консультант: доктор медицинских наук,

член-корреспондент РАМН, профессор В. В. Баннн

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор доктор медицинских наук, профессор доктор биологических наук, профессор

В Л. Бродский Т.К. Дубовая Я.Ю. Комиссярчик

Ведущая организация:

ГОУ ВПО Ярославская государственная медицинская академия Росздрзва

Защита состоится « »_ 2007 г. в _ часов на

заседании диссертационного совета Д.20807204 при Российском государственном медицинском университете по адресу. 117997, г. Москва, ул. Островитянова, д. 1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Российского государственного медицинского университета

Автореферат разослан «___»_2007 г.

Ученый секретарь диссертационного совета Д 20807204

доктор медицинских наук, профессор А,В. Щеголев

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Белки, синтезированные на рибосомах: гранулярного эндоплазматического ретикулума (ЭР), проходят длинный путь,1 прежде чем достигнут плазматической мембраны или других органелл. Эта система различных внутриклеточных хомпартментов, ориентирующая транспорт белков в антероградном направлении, определяется как секреторный или экзоцитозный путь (Миронов А.А. и др. 1998; Банин В.В. 1999). Если ЭР исполняет роль места синтеза белков и липидов, то комплекс (или аппарат) Гольджи (КГ) является местом их посттрансляционной модификации, сортировки и последующей рассылки по различным направлениям. Регуляция и механизмы транспорта на этом участке чрезвычайно сложны и являются предметом активного изучения и горячих научных споров среди ученых ведущих лабораторий, работающих в области клеточной и молекулярной биологии

В течение многих лет дискутировались, в основном, две гипотезы или модели транспорта внутри комплекса Гольджи (Mironov A et al. 2005):' везикулярная гипотеза, предполагающая, что секретируемые и мембранные белки транспортируется между стабильно существующими цистернами в везикулах, и модель прогрессии и созревания самих цистерн в сочетании с ретроградным транспортом ферментов комплекса Гольджи зикулами В последние годы серьезно обсуждаются еще две гипотезы—модель, основанная на непрерывности соединений между цистернами КГ, и модель созревания и прогрессии мембранного домена, содержащего транспортируемый белок.

Везикулярная модель, предложенная Дж. Пал аде (Farquhar MG. and Palade G.E., 1981) почти 30 лет назад, предполагает концентрацию' транспортируемых белков (карго) в покрытых, окаймленных почках (бадах),' формирующихся на проксимальном (вышележащем) компартменте. Шейка бада схлопывется, и сформированная таким образом везикула, отщепляется/

теряет свое белковое покрытие и переносит транспортируемые белки в следующую цистерну, сливаясь с ней. Везикулярная модель долгое время представлялась простой, красивой и подтвержденной фактическими данными. Она излагается во многих учебниках и руководствах на правах уже не гипотезы, а доказанной теории. Тем не менее, с точки зрения везикулярной модели сложно объяснить отсутствие в везикулах многих известных транспортируемых молекул (альбумина, проинсулина, вирусных белков), а также понять, как осуществляется транспорт таких больших, молекулярных комплексов, как, например, проколлаген, размеры которого в 5 раз превышают средний размер везикулы. Основные исследования, послужившие доказательством везикулярной теории, были выполнены в условиях in vitro и методами биохимии. Однако разработанные в последнее время методические морфо-функциональные подходы выявили многие факты, которые позволяют усомниться в доказанности везикулярной теории транспорта

Классический вариант модели созревания и прогрессии цистерн предполагает, что транспортируемый белок, оставаясь в составе цистерны, постепенно направленно продвигается по стаку («стопке») КГ от цис-полюса к транс-полюсу. Такая прогрессия белка сопровождается возвратом (рециклингом) ферментов, который осуществляется везикулами, имеющими СОР 1-покрытие (Glick B.S. at al. 1997; Glick B.S. and Malhotra V. 1998). Данная модель тоже не может быть принята безоговорочно, т.к. исследования, выполненные в последние годы, не выявили в везикулах повышенного содержания ферментов гликозилирования, которые распределяются в соответствующих цистернах комплекса Гольджи и должны возвращаться в «свои» цистерны (Orel Let al. 2000; Kweon H.S. et al 2004) Между тем, согласно данной модели, эти ферменты в процессе транспорта должны рециклировать именно в составе везикул КГ.

Недавно, в том числе и с нашим участием, был опубликован ряд работ, выполненных с использованием такого высокоразрешающего метода, как

электронная томография, и доказывающих факт образования непрерывных тубулярных соединений между цистернами комплекса Гольджи в клетках, осуществляющих активный транспорт (Ladinsky M.S. et al., 1999; 2002; Trueco A. et al. 2004), и отсутствия вышеописанных соединений в условиях блокирования транспорта (Trucco A et al. 2004) На этом основании была предложена еще одна модель — перемещение транспортируемого белка (карго) по межцнстернальным соединениям. Однако, если для карго, имеющего небольшие размеры и обладающего способностью к диффузии (например, альбумина), эти представления еще могут быть близкими к действительности, то для больших, не способных к диффузии белков, таких как агрегаты проколлагена I, размеры которых составляют 300 нм, гипотеза сталкивается с непреодолимыми трудностями — диаметр тубулярных соединений не превышает 50-60 нм. Несмотря на убедительные доказательства существования соединений между различными цистернами КГ, остается открытым вопрос-всегда ли данные соединения присутствуют на всех уровнях стопки цистерн КГ? Возможно, они существуют, в основном, между цистернами, к которым в этот момент присоединен мембранный переносчик транспортируемого белка.

Согласно модели созревания и прогрессии переносчика транспортируемых белков и липидов, обоснованию которой, собственно, и посвящена данная работа, предполагается, что образовавшийся на выходе из ЭР мембранный переносчик сливается с промежуточным компартментом и цис-цистерной КГ, формируя смешанный компартмент, так называемый «карго-домен» Он представляет собой динамичную мембранную структуру достаточно большого размера, в просвете и мембранах которой содержатся транспортируемые белки Затем происходит сегрегация переносчика и его слияние с медиальным (срединным) компартментом комплекса Гольджи, что является сигналом для физического отделения данного мембранного переносчиха от промежуточного компартмента и цис-цистерны. Такая же последовательность событий (слияние, смешивание, повторяющаяся

сегрегация) происходит на других этапах транспорта через комплекс Гольджи Один из возможных механизмов сегрегации белков при последовательном формировании и перемещении переносчиков базируется на известной разнице в толщине мембран на протяжении стака КГ.

Из этой модели можно вывести ряд следствий, которые поддаются экспериментальной проверке. Например, можно предположить, что во врет прохождения мембранного домена, содержащего карго, по стаку, поочередно, на уровне его локализации, длина соответствующих цистерн должна увеличиваться (поскольку к ним добавляются мембраны), в то время как другие цистерны должны оставаться той же длины, что и до прихода карго. По результатам наблюдений за проходом карго по изолированным мини-стакам, образованным под воздействием нокодазола, разница в длине между разноуровневыми цистернами в стопке КГ выявлена не была, однако мы смогли подтвердить увеличение длины цистерн при проходе карго (Тгиссо А е1 а!, 2004). Учитывая вышеописанные данные, оригинальная версия модели созревания и прогрессии мембранного переносчика белков может быть принята за основу, однако она требует существенного дополнения и переосмысления.

Таким образом, несмотря на множество работ, посвященных моделям транспорта белков и липидов через КГ, до сих пор так и не сложилось единого мнения о механизме перемещения транспортируемых веществ (карго) через эту органеллу. Устранение существующих противоречий путем анализа структурной организации КГ в различных функциональных режимах и с применением комплекса современных методов исследования (лазерной конфокальной микроскопии, электронно-микроскопической техники с использованием иммуноцитологических методов и ЭМ-томографки, коррелятивной микроскопии) необходимо для построения непротиворечивой модели, описывающей структуру и модус функционирования этой сложной "' органеллы.

Целью настоящего исследования являлся анализ механизмов транспорта белков черта комплекс Гольджи и разработка на его основе содержательной модели, позволяющей согласовать результаты современных исследований, посвященных изучению переноса через комплекс Гольджи.

Задачи исследования включали:

1. Изучение путей, скорости и механизмов перемещения мембранных и растворимых белков различной молекулярной массы и размера через комплекс Гольджи

2. Разработку методологического подхода, позволяющего совместить изучение ультраструктуры и трехмерной организации мембранных переносчиков белков в комплексе Гольджи с исследованием кинетики их транспорта в живой клетке.

3 Ультраструктурный анализ трехмерной организации путей переноса протеинов через комплекс Гольджи.

4. Выявление зависимости структуры комплекса Гольджи и распределения его ферментов от интенсивности транспорта белка.

5. Создание на основе полученных экспериментальных данных и современных молекулярно-биологических представлений эффективной модели транспорта белков через комплекс Гольджи.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Существующие в настоящее время модели транспорта белков через комплекс Гольджи пересмотрены с учетом результатов исследований, основанных на новых, разработанных нами, методологических подходах.

2 Комплекс Гольджи следует рассматривать как весьма динамичную мембранную органеллу, структура которой, в значительной мере определяется интенсивностью синтеза и транспорта белков.

3. Скорость и механизмы перемещения мембранных и растворимых белков через комплекс Гольджи (от момента входа до момента выхода из данной органеллы) не зависят от молекулярной массы и размера транспортируемых белков.

4. Ферменты, характерные для каждого компартмента комплекса Гольджи, отсутствуют или содержатся в низких концентрациях в СОР I - везикулах и локализуются, преимущественно, в перфорированных зонах на краях цистерн комплекса Гольджи

5. Межцистернапьные тубулярные сообщения открывают возможность рециркуляции ферментов комплекса Гольджи и их возврата в проксимальный компартмент посредством латеральной диффузии в мембранах.

6. Созревание и прогрессия мембранного переносчика транспортируемого белка являются основными механизмами транспорта через комплекс Гольджи. Модель прогрессии мембранного домена, содержащего транспортируемые белки, наиболее полно отражает процесс транспорта на данном участке секреторного пути.

Научная новизна.

Предлагаемая работа представляет собой специальное комплексное исследование с применением частично модифицированных и вновь разработанных нами современных технологий клеточной биологии, основанных на синхронизации транспорта белков через пластинчатый комплекс, световой и электронной микроскопии в сочетании с электронной томографией и трехмерной реконструкцией ультраструюур В работе впервые продемонстрировано, что:

1) Везикулярная модель транспорта белков через пластинчатый комплекс не верна, т.к. отсутствует концентрация транспортируемых молекул белка в СОР1-везикулах;

2) Скорости транспорта для образующего крупные молекулярные агрегаты белка проколлагена и для легко диффундирующего мембранного (3-протеина вируса везикулярного стоматита (УБА/О) одинаховы;

3) Путем выполнения трехмерной реконструкции комплекса Гольджи на основе электронно-микроскопической томографии образцов, фиксированных с помощью сверхбыстрого замораживания, была поставлена под сомнение теория, основанная на мегавезикулах, тк в результате проведенных исследований не было выявлено мегавезикул, а точнее мембранных расширений, содержащих проколлагеновые макромолекулярные агрегаты, которые были бы совершенно изолированы от других мембранных структур;

4) В работе опровергнута классическая модель созревания и прогрессии цистерн, предполагающая рецгаслинг ферментов гликозилирования, локализующихся в аппарате Гольджи. Основанием послужили данные о крайне низкой концентрации ферментов гликозилирования в СОР1-везикулах,

5) Проведен комплексный экспериментальный анализ и дано обоснование модели прогрессии через комплекс Гольджи мембранного переносчика, содержащего транспортируемые белки В результате было показано, что данная модель наиболее полно соответствует имеющимся экспериментальным наблюдениям.

Научно-практическое значение работы. . -, ,

Экспериментальные данные, полученные при проверке существующих моделей транспорта через комплекс Гольджи, представляют собой не только теоретическую базу для понимания истинных механизмов транспорта на этом участке секреторного пути Они позволяют начать целенаправленный поиск новых лекарственных средств для лечения заболеваний, механизмы которых связаны с нарушениями транспорта через пластинчатый комплекс Создание

модели транспорта белков через комплекс Гольджи дает возможность проверки уже существующих специфических лекарств, способных оказывать строго направленное воздействие ка транспорт определенного белка и существенно снизить затраты на проведение исследований по созданию экспериментальных систем для тестирования лекарственных средств. Таким образом, эта модель может стать полезным инструментом не только в клеточной и молекулярной биологии, но и в фармакологии Содержащиеся в рабоге фактический материал, выводы и положения могут быть широко использованы в. преподавании соответствующих разделов клеточной биологии и цитологии.

Они используются в учебном процессе на кафедрах гистологии и эмбриологии лечебного и педиатрического факультетов РГМУ, на кафедре химии, биологии и экологии Шуйского государственного педагогического университета. Разработанные нами новые методы ультраструктурного исследования применяются в Институте эволюционной физиологии и биохимии им И .М.Сеченова РАН и в Институте цитологии РАН.

Личный вклад автора.

Автору принадлежит основная роль в определении направления исследований, в разработке новых методических и экспериментальных подходов, получении и анализе результатов данной научной работы. В работах, выполненных в соавторстве, личный вклад автора заключался в активном участии на всех этапах исследования, начиная с обсуждения проекта до литературного изложения полученных результатов

Апробация диссертации.

Основные положения диссертации и результаты исследования были представлены в 38-ми докладах на конференциях и конгрессах на Научной конференции, посвященной ЮО-летюо со дня открытия аппарата Гольджи (гПавия, Италия, 19-23 сентября 1998 г.); на 39-ом Ежегодном конгрессе

и

Американской ассоциации клеточных биологов (г.Вашингтон, США, 11-15 декабря 1999 г.), на Конгрессе Европейской ассоциации ученых-биологов (г Женева, Швейцария, 2-6 сентября 2000 г. и г.Ницца, Франция, 4-8 сентября 2004 г); на 4-ой Международной конференции Европейского общества световой микроскопии (г. Гетеборг, Швеция, 26-28 мая 2004 г.), на 13-ом Европейском кошрессе по микроскопии (г.Антверпен, Бельгия, 22-27 августа 2004 г.); на 5-ой и 7-ой Анабергских конференциях, посвященных мембранному транспорту и секреторному пути (г Гольдегг, Австрия, 9-14 января 2001г. и 9-14 анваря 2007 г.). Автор выступал как приглашенный докладчик на 2-ой Международной конференции Европейского общества световой микроскопии (г. Париж, Франция, 29-31 июня 2002 г.) и на Международном конгрессе по световой и электронной микроскопии (г. Давос, Швейцария, 28 августа - 2 сентября 2005 г.). Результаты исследований были доложены также на V Всероссийском съезде анатомов, гистологов и эмбриологов (г. Казань, 17-18 сентября 2004 г.) и на VIII Конгрессе Международной ассоциации морфологов (г Орел, 15-16 сентября 2006 г.).

Публикации.

По результатам выполненных исследований опубликовано 55 печатных работ, из них 17 статей в рецензируемых научных журналах.

Структура н объем работы.

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, глав собственных результатов с иллюстрациями, заключения и списка литературы. Работа изложена на 296 страницах машинописного текста, содержит 7 таблиц и 28 комбинированных рисунков. Список литературы включает 321 источников.

СОДЕРЖАНИЕРАБОТЫ Материал и методы исследования.

Клеточные линии. ДНК-конструкыии. антитела и химические реагенты В работе были использованы клеточные линии, фибробласты кожи человека (HF) (IDI, Italy), клетки почки крысы (NRK), фибробласты почки обезьчны (COS 7), клетки базофильной лейкемии крысы (RBL). Кроме того, исследования проводились на клеточной линии NRK, стабильно экспрессирующей ферменг сиалилтрансферазу, конъюгированной с пероксидазой хрена (STf- HRP), полученной от Е. Jokitalo (University of Helsinki, Finland) Конструкция ssHRP-KDEL была предоставлена доктором D.E Culter (University of Helsinki), конструкции маннозидазы-I и маннозидазы - II были изготовлены в нашей лаборатории (Kweon H-S., 2004), мутант His6-a-SNAP (L294A) - доктором R.Burgoyne (University of Liveipool, UK) В ходе выполнения работы были использованы антитела фирмы "Sigma", а так же поликлональные антитела против маннозидазы-I и маннозидазы - II любезно предоставленные доктором К W. Moremen (University of Georgia, Athens, GA), против проколлагена I -доктором L.WJisher (NIH, Bethesda, USA), моноклональные антитела против люминального домена VSVG - доктором J.Gruenberg (University of Geneva, Switzerland) и поликлональные антитела против люминального домена VSVG -доктором К. Simons (Max- Plance- Instititute, Drczden, Germany). При культивировании клеток использовались среды: DMEM для клеточных линий NRK, MEM для RBL клеток, сыворотки (CS) и (FCS) производства Invitrogen (UK).

ТрансФекция. Для трансфекции были использованы растворы ТпзНС1 и EDTA фирмы SIGMA (USA) и кит для приготовления плазмидной ДНК компании Qiagen (USA). Трансфекция клеток (COS 7, HF, NRK) путем электропорации проводилась с помощью электропоратора (BIO-RAD, UK)

Инфицирование клеток вирусом везикулярного стоматита (vesicula; stomatitis virus. VSV). Перед заражением клетки промывались два раза средой

без сыворотки и затем инкубировались со средой, содержащей VSV, в разведении 1-4, 1:10, 1 '30 (в зависимости от типа клеток) в течение 1 часа при +32°. В целях синхронизации транспорта выход VSVG (белка VSV) из ЭР блокировался путем повышения температуры до +40°С в течение 3 часов. Затем проводились эксперименты согласно различным протоколам синхронизации.

Синхронизационные протоколы Синхронизация транспорта белка достигалась путем подконтрольного отпуска из ЭР и промежуточного компартмента. Для предотвращения выхода VSVG из ЭР мы использовали температурно-чувствительный вариант вируса tsVSVG, который накапливался в ЭР при +40°С. Блокирование выхода из ЭР для прсколлагена-I достигалось добавлением к среде аскорбиновой киспоты (Harwood R. et al. 1976). Дополнительно блок прохоллагена-I усиливался путем повышения температуры до +40°С (Bruckner P. and Eikenberry Е 1984). Задержка в ЭР быстро снималась добавлением аскорбиновой кислоты в культуральную среду и снижением температуры. Транспорт VSVG и проколлагена-I блокировался и на уровне промежуточного компартмента ЭР-Гольджи при температуре +15°С (Kuismanen Е and Saraste J. 1989), отпуск этого блока осуществляется путем повышения температуры Комбинируя эти два транспортных блока, изменяя их последовательность и продолжительность, мы разработали несколько типов синхронизационных протоколов, позволяющих регулировать объем прибывающего к КГ транспортируемого белка (карго) во времени и пространстве (Рис. 1).

Иммунофлуопесцентная микроскопия Посадка клеток осуществлялась на специальные предметные стекла с монтированными на них восемью пластиковыми камерами (чамберслайды) за день до эксперимента. После завершения эксперимента клетки фиксировались 4% параформальдегидом на 0,15 М Hepes - буфере, pH 7,4, в течение 10 минут при комнатной температуре, затем проводили иммуномечение и шестикратную отмывку раствором PBS. Пластиковые камеры отделяли от предметного стекла, которое затем

покрывалось покровным, в качестве раствора для заключения использовался мовеол.

Конфокальная микроскопия Все конфокальные изображения были получены с использованием конфокального микроскопа Zeiss LSM 510 (Carl Zeiss, Gottingen, Germany) с использованием 40Х 1,25 NA и 63Х 1,4 NA объективов, диафрагма была поставлена на значение 1 с разрешением 1024x1024 пикселей Количественная оценка распределения иммуномечения проводилась как минимум на 100 случайно выбранных клетках для каждого эксперимента из трех отдельных экспериментов по каждому протоколу. Количественная оценка колокализации флуоресцентных меток была выполнена с помощью специальной программы для подсчета колокализации, имеющейся в приложении к конфокальному микроскопу LSM 510.

Электронная микроскопия Фиксация, осмирование и заключение в эпоксидную смолу (Ероп 812) проводилось по общепринятой методике (MIronov А. et al. 2001), затем смола полимеризировалась в течение 24 часов в термостате при +60°С.

Иммуномечение препаратов для электронной микроскопии (ЕМ) перед заключением в эпоксидные смолы. Образцы фиксировались смесью 4% параформальдегида и 0,05% глутарового альдегида на 0,15 М растворе Hepes в течении 5 минут при комнатной температуре, а затем этот раствор фиксаторов заменяли на 4% формальдегид на 0,15 М Hepes- буфере, pH 7 4 на 30 минут при комнатной температуре. Визуализация имммуномечения достигалась методом золотого усиления или с помощью диаминобензидиновой реакции (Brown W.J. and Farquhar M.G. 1989). Затем клетки постфиксировали редуцированным осмием и заключали в эпоксидную смолу Ероп 812.

Получение и иммуномечение ультратонких криосрезов Ультратонкие криосрезы изготавливали с помощью ультракриомикротома (Leica ultracut R) и собирали металлической петлей с каплей смеси 2,3 М сахарозы и 2% метилцеллюлозы (1:1) и переносили на покрытые бутваром сеточки или

бленды, покрытые формваром (Liou W. et al. 1996) Процедура мечения представляла собой перемещение сеточек или бленд со срезами с капли на каплю различных растворов с определенным временем инкубации на поверхности этих капель (Slot J. and Geuse H 1985) Для заключения использовали смесь 1,8% метилцеллюлозы и 0,4% раствора уранилацетата После высушивания на воздухе, сеточки со срезами изучали с помощью электронного микроскопа «Tecnai-12» фирмы Philips (Philips, Einhoven, The Netherlands) с использованием цифровой видеокамеры (ULTRA VIEW CCD).

Морфометрический анализ. Морфометрический анализ был проведен с использованием программы «Analysis software» (Soft Imaging Software Corporation) Количество белка на каждую структуру определяли по числу золотых гранул в пределах замкнутого мембранного контура (например, цистерны), подсчеты проводились минимум на 30 стопок КГ для каждой временной точки эксперимента в трех-четырех независимо проведенных экспериментах Плотность мечения определялась по общепринятому методу, те вычисляли соотношение количества гранул золота и точек пересечения меченой структуры с сеткой (Lucocq JM et al. 1993) с последующей статистической обработкой данных. Однако для более точной оценки плотности мечения применяли метод с поправкой на уровень фона (Mayhew Т.М. et al 2004)

Коррелятивная микроскопия. Разработанный с нашим участием метод коррелятивной микроскопии представляет собой комплекс взаимодополняющих методов- флуоресцентной (лазерной конфокальной) микроскопии и иммуно-электронномикроскопической техники, в случае необходимости сочетающейся с ЭМ томографией с последующей трехмерной реконструкцией ультраструктур В случае сочетания коррелятивной микроскопии ЭМ томографии изготавливали срезы толщиной 200 нм, проводили забор проекций срезов для выполнения томограммы и создания трехмерной модели.

Метод быстрого замораживания и криозамещенкя Эксперименты с использованием метода быстрого замораживания и криозамещения на NRK клетках были проведены на базе университетов г. Сиены и г. Вены (с разрешения Prof. Lupetti, University of Siena, Siena, Italy и Prof. MPavelka, University of Vienna, Vienna, Austria) по методу описанному ранее (Mironov A. et al. 2001)

Электронная томография. Толстые (толщиной 150-200 nm) серийные эпоновые срезы были изготовлены на ультратоме Leica UltraCut-UCT (Leica, Germany), забор изображений проводили на электронном микроскопе Tecnai 12. Для построения трехмерного изображения использовали программу "IMOD" Количественный анализ межцистернальных соединений был проведен для каждой отдельной томограммы. Для каждого эксперимента с применением томографии оценивались, как минимум, 5 томограм дня каждой временной точки эксперимента. Распределение материала (клеточных культур) в зависимости от использованных методов исследования представлено в табл. 1.

Таблица 1. Материал исследования и использованные методы

Методы исследования Клеточные линии* Всего

HF COS 7 NRK NRK-Sial.Tf -HRP RBL

Иммуно- флюоресцентный метод 135 75 60 12 48 330

Электронная микроскопия эпоновых срезов 70 45 45 50 12 222

Коррелятивная свето-электронная микроскопия 25 29 30 10 - 94

Электронная микроскопия криосрезов 54 45 45 20 60 224

Трансфекция КР-конструкций белков с наблюдением их транспорта в живых клетках 27 52 36 - - 115

Электронная томография 25 10 15 21 - 71

Электронная томография с трехмерной реконтрукцией. 15 5 5 7 32

Всего: 351 261 236 120 120 1080

*HF — фибробласты кожи человека; COS 7 — фибробласты почки обезьяны, NRK — эпителиальные клетки почки крысы; NRK-SialTr-HRP — клетки почки крысы, стабильно экспрессирующие сиалилтрансферазу, конъюгированную с пероксидазой хрена, RBL — клетки базофильной лейкемии крыс.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 1. Мелкие белки-карго и большие агрегаты могут проходить через КГ, используя общий механизм.

1.1. Разница в скоростях проколлагена I п УБУО при транспорте через КГ неразличима.

Скорость внутриклеточного транспорта вариабельна и зависит от типа клеток и экспериментальных состояний Поэтому для стандартизации условий транспорта й-белка вируса везикулярного стоматита (УБУО) и* проколлагена I мы разработали несколько типов синхронизационных протоколов, позволяющих регулировать объем прибывающего к КГ транспортируемого белка (Рис. 1.). Такая организация эксперимента позволила экспресировать в клетках два типа карго одновременно, синхронизировать их транспорт и дала возможность осуществлять контроль на всех этапах транспорта, начинал со стадии ЭР-КГ.

Первый протокол (Рис. 1, А) позволяет генерировать волны с различным количеством карго {пульс-протокол малой и большой волн, соответственно). Количество карго контролируется вариацией в продолжительности блока. Укорочением времени 15-градусного блока достигается уменьшение количества карго (малый или средний объем транспортируемого белка) в промежуточном компартменте. Второй тип протокола позволяет накапливать карго в ЭР при темперетуре +40°С, а затем, после понижения температуры до +32°С, проводить синхронный выход карго. Мы назвали этот тип протоколом накопления карго в ЭР с последующим его отпуском (Рис. 1, Б), а так же применяли его вариант, предусматривающий пульсовой поток карго, получаемый в результате восстановления блока выхода из ЭР после кратковременного отпуска карго при температуре +32°С (протокол накопления, карго в ЭР в сочетании с пульсовой волной) (Рис. 1, В).

А. Лульс-протсхслы (протоколы большой и налой воля).

Вшоди

Бгшш ю ЭР^вюияиз црожэжуточшго Нкиизягаи в ЭР 1 сро»ду*отая ковщгвишг* I_|_ияаартвдиг» ^ ЕдзхвЭР_

-М0°С, - АК +15°С, +АК -М0°С, - АК

Б. Протокол накопление карго в ЭР с поелвдухзщим его

втпускозя.

Наннаоапи в ЭР Выход га ЭР

-М0°С. - АК +32°С, +АК

Б. Протокол накоплении карго в ЭР в сочеташш с пульсовой

волной.

Нмипжета г ЭР ВшояюЭР- ЕшквЭР

+40°С. - АК +32°С, +А2С +40°С. - АК

Г. Протокол волны выхода (постеганного очищения Гольдзки).

ВыаэддЭР—^_ЕпмсмаощяЭР_

+32°С, + АК +40°С, - АК

Рис. 1. Протоколы синхронизации транспорта белка (объяснения в тексте)

Четвертый тип протокола был разработан для наблюдения процесса выхода из КГ, когда клетки вначале находились при температуре +32°С, а затем температура поднималась до +40°С, и выход карго из ЭР блокировался Такой тип протокола был назван "протокол волны выхода (постепенного очищения КГ)" (Рис. 1, Г)-

Используя протокол большой пульсовой волны, с помощью иммунофлуоресценции мы нашли, что когда температура была понижена с +40°С до +15°С, проколлаген-1 и У8\ЧЗ прибывали в промежуточный

компартмент, где наблюдался хороший уровень колокализации маркеров данных белков Когда температуру вновь поднимали до +40°С, распределение двух этих протеинов начинало меняться, и по прошествии 3-4 минут проколлаген-1 и УБУв вплотную приближались к центральному КГ (в качестве маркера центрального КГ использовался белок ^апйп), а через 4-5 минут уже достигали КГ, где находились около 20 минут (время транзита через КГ) Наконец, оба транспортируемых белка выходили из зоны КГ вместе, в хорошо различимых точках, представляющих собой, вероятно, -пост-Гольджи переносчики, в которых белки колокализовались. Таким образом, нам не удалось выявить различий в скорости транспорта проколлагена I и УБУв при их проходе по секреторному пути (Рис. 2). Однако нельзя исключить, что объем транспортируемого белка, прибывающего в КГ в единицу времени при данном типе протокола, возможно, превышает уровень нормального, физиологического транспорта. Для приближения к физиологическим условиям мы использовали протокол малой пульсовой волны, когда в промежуточном компартменте накапливается карго в меньшем объеме, чем при протоколе большой пульсовой волны, но этот объем достаточен для визуализации процесса Нам не удалось выявить какой-либо диссоциации проколлагена-1 и УБУв во время из движения при использовании и этого типа протокола (Рис. 2) Применение других протоколов (протокола накопления карго в ЭР с последующим его отпуском, протокола волны выхода) так же не выявило каких-либо заметных различий в транспорте исследуемых белков.

В

04 о/ оа ол

Протокол большой пульсовой волы

О 2 4 б 8 10 12

Протокол шлой пульсовой ВОЛЙЫ

1,0 ОД 0,0

§ 9 12 15

Протокол средней пульсовой волны

2 4 б 8 10 и 14

Протокол волны выхода

Рнс. 2. Проколлаген I и У8УС проходят через Гольджи комплекс с одинаковыми скоростями. Время прохода УвУО (непрерывная линия) и проколлагена I {пунктир) через комплекс Гольджи в соответствии с синхронизационными протоколами большой, средней и малой волн, а также протоколом волны выхода (По оси абсцисс — время в минутах; по оси ординат — интенсивность флуоресценции (усл. ед) Каждая точка на графике представляет собой среднее значение 7-15 независимых измерений, полученных в трех и более экспериментах. Стандартное отклонение не превышает 15%).

Интересно, что оба белка-карго демонстрировали при протоколе ЭР-накопления и отпуска одно и тоже время транзита через КГ (около 8 минут или чуть меньше), т.е. сходное со временем при использовании протокола малой пульсовой волны. При проведении количественного анализа транспорта проколлагена I и VSVG определялись фракции карго, присутствующие в зоне комплекса Гольджи, для каждой точки синхронизационных протоколов, и была выявлена строгая синхронность транспорта.

Мы проанализировали также перемещение проколлагена I и VSVG через основные субкомпартменты (цис-сеть комплекса Гольджи, CGN; стопку цистерн (стак); транс-сеть комплекса Гольджи, TGN), путем определения уровня колокализации карго и известных маркеров, вышеперечисленных субкомпартментов, таких как протеин Гольджи-матрикса GM 13П, галактазилтрансфераза и протеин TGN-46 (Рис 3)

В

90

60

30

90

60

30

90

30

4 б 10 12

4 б 10 12

4 б 10 12

Рис. 3. Колокализации УвУв (пунктир) и проколлагена I (сплошная линия) с основными маркерами субкомпартментов Гольджи: СМ-130 (А), Се! 1Г (Б), ТСРМб (В) в процессе транспорте. Локализация карго с маркером определенного субкомпартмента вычислена при измерении зоны перекрытия каждого из белков карго с маркером. (По оси абсцисс — время в минутах; по оси ординат — процент пикселей, содержащих карго и маркер Среднее значение 8-10 независимых измерений, полученных в трех и более экспериментах. Стандартное отклонение не превышает 15%).

Используя протокол малой пульсовой волны, мы нашли, что оба карго одновременно достигали КГ после 3-4 минут отпуска блока, их колокализация с протеином вМ 130 была хорошей, с галактазилтрансферазой очень незначительной, а протеином ТОЫ-46 практически отсутствовала (Рис.3, А). В < течение следующих 2-3 минут, постепенно уровень колокализации карго с протеином вМ 130 снижался, а с галактазилтрансферазой возрастал, таким» образом наблюдался процесс перемещения карго внутри стака от цис- к трансстороне (Рис.3, Б). Проколлаген I и УБУО оставались в «зоне галактозилтрансферазы» около 10 минут, и затем перемещались ТОМ-зону (колокализация с протеином Т01-46), где они находились до момента ухода в пост-Гольджи переносчики (Рис 3, В). На протяжении всех этих стадий транспорта нам не удалось выявить разницу в скорости движения проколлагёна I и У8УО — они двигались вместе, хорошо колокализуясь. Дополнительные доказательства совместного движения двух карго удалось получить при использовании в ходе экспериментов иммуно-элекгронной микроскопии, позволяющей, как известно, добиться более высокого разрешения.

1.2. Агрегаты проколопгена I проходят через КГ, не покидая просвета

цистерн.

Как было показано ранее (ВопГапй Ь е1 а1.1998), проколлаген I способен транспортироваться по секреторному пути без диссоциации от цистерн КГ. Однако в литературе описаны и другие типы секреторных контейнеров, так называемые, мегавезикулы, 300-400 нм в диаметре, физически отделенные от цистерн комплекса Гольджи (Уо1сЬик А е{ а1. 2000). Для исключения возможных артефактов, обусловленных химической фиксацией (например, «схлопывания» мембран в зоне контакта агрегатов проколлагёна I и цистерны), мы использовали для фиксации, в момент прохождения карго через КГ, 1 сверхбыстрое замораживание (Егк I ега1. 1998) После криофюссации получали ' серийные ультратонкие срезы для проведения, в последующем, трехмерной реконструкции. Из 120 проанализированных расширений цистерн, содержащих

агрегаты проколлагена I, нам не удалось выявить ни одного расширения, полностью отделенного от цистерны комплекса Гольджи После изготовления толстых срезов (200-250 нм) для электронной томографии и их анализа, включавшего трехмерную реконструкцию на базе томограмм (Koster A.J. et al 1997; Ladinsky M.S. et al. 1999) было показано, что расширения, содержащие агрегаты проколлагена I, всегда связаны с одной или двумя цистернами КГ Это могли быть проксимальная и дистальная цистерны одного стака или цистерны разных стопок, одного или разных уровней. Таким образом, агрегаты проколлагена I, перемещаясь вдоль КГ, оказываются всегда связанными с его цистернами, а содержащие их мембранные контейнеры, представляют собой не дискретные мегавезикулы, а расширения цистерн КГ.

13. Молекулы VSVG транспортируются через КГ без перемещения из цистерны в цистерну н без вхсязденпа в везякулы комплекса

Гольджи.

Наблюдение, что VSVG и проколлаген I транспортируются с одинаковой скоростью через стак, позволило предположить, что для VSVG, как и для проколлагена 1 во время интра-Гольджи транспорта не требуется выходить за пределы цистерны и поступать в диссоциированные от цистерн везикулы. Используя протокол малой пульсовой волны, позволяющий отпускать из ЭР минимальные порции карго и следить за его прохождением по стаку, мы выбирали стаки, в которых вирусным белком VSVG была заполнена лишь одна цистерна, и проверяли возможные сценарии транспорта.

Прогрессия VSVG через стак изучалась с использованием иммуномечения. Эти эксперименты были проведены на фибробластах человека и клетках обезьяны COS 7. В обоих случаях мы получили аналогичные результаты. Так на блоке +40°С (время отпуска «0») VSVG находился в ЭР и давал мечение, характерное для ЭР. Через 15 минут после отпуска при температуре +15°С (15-градусный блок) вирусный белок находился в ЭР-Гольджи промежуточном компартменте, представленном кластерами

переплетающихся тубул Затем, согласно протоколу малой пульсовой волны, температура была повышена до +40°, и через 3 минуты УБУв уже определялся не только в промежуточном компартменте близко к центральному КГ, но и в первой перфорированной цистерне на цнс-стороне стака. Обе эти структуры давали хорошее мечение на цис-маркер ОМ 130. Позднее, между 4 и 9 минутами, УБУБ двигался через стак. Это время было наиболее интересным для определения механизма шпра-Гольджи транспорта и выбора наиболее правильной модели этого процесса. На 7 минутах транспорта локализация У8УО была поразительно четкой Так, в значительной фракции стаков (приблизительно 30-40 %) УБУО локализовался в 1-2 цистернах в центре стака, состоящего, обычно, из 5-6 цистерн Остальные цистерны стопки при малой порции проходящего УБУБ были полностью лишены мечения на данный белок. В некоторых стопках КГ в это время УЭУв уже достигал транс-стороны стопки, что проявлялось в его колокализации с галакгазилтрансферазой, а 2-3 цистерны на цис-стороне оказывались полностью лишенными УБУО. Таким образом, в значительном количестве стаков КГ белок на этапе внутри-Гольджи транспорта не был равномерно распределен по всей стопке цистерн. Позднее, на 11 минуте, фракция мембран, содержащих УБУй, достигала ТОК-зоны (колокализации с белком ТОМб — маркером мембран ТОО, однако часть У8Уй продолжала давать хорошую колокализацию с галакгазилтрансферазой. Затем, на 15 минуте, УБУв покидал ТСЫ-зону и направлялся к клеточной мембране Вышеописанные эксперименты были дополнены использованием иммунопероксидазной техники мечения, позволяющей выявлять даже малые концентрации антигена (Мичэпоу А. ег а1. 2000) Как и ранее, мы нашли, что на 7-ой минуте после отпуска блока только одна или две центральные цистерны стака содержали белок

Таким образом, использование специальных экспериментальных протоколов позволяло быстро получать строго лимитированную порцию вирусного белка УБУО, которая, прибыв в стак, продвигалась от цис- к транс-

стороне КГ без выравнивания градиента концентрации, что делает маловероятной гипотезу физического переноса карго из цистерны в цистерну.

В дополнение к вышеописанным мы провели количественный анализ уровня колокализации У8УО и Гольджи-маркеров с использованием иммуномечения карго на криосрезах и ЭМ-анализа. После 3 минут отпуска блока более 70% вируса колокализовглось с белком СМ 130, маркером цис-Гольджи; на 7 минуте - с галактазилтрансферазой, а на 11 минутах—с ТСЬМб Эти данные полностью соответствовали результатам, полученным на светооптическом уровне с использованием флуоресцентных маркеров.

Аналогичным образом в экспериментах с иммуномечением был проанализирован транспорт и проколлагена I При этом значительных различий в скоростях транспорта выявлено не было. Единственным отличием, и не в скорости транспорта, а в локализации, было характерное распределение агрегатов проколлагена I в просвете расширений цистерн, в то время как УЗУС гомогенно распределялся по всей их длине Используя технику двойного мечения, мы могли наблюдать, каким образом происходит совместное движение проколлагена I и УБУв по стаку через 7 минут после отпуска температурного блока по протоколу малой пульсовой волны. Количественная обработка данных с использованием серийных срезов показала, что основная часть УЗУС находится в плоской части цистерны, хогя может выявляться и в области расширений цистерн, заполненных агрегатами проколлагена. С помощью иммуномечения нанометровым золотом с последующим «золотым усилением» я изготовлением серийных ультратонких эпоновых срезов, мы определили, что около 80% расширений, содержавших проколлаген I, содержали, так же и УБУв, и только около 20% из гг'х на всех этапах транспорта были лишены вирусного белка

Оставалось неясным, однако, исключается ли УБУв из небольших везикул в ходе интра-Гольджи транспорта? Для анализа данного вопроса мы использовали практически все функциональные режимы- протокол матер

пульсовой волны, протокол большой пульсовой волны, а так же протокол накопления белка в ЭР н отпуска его Клетки (фибробласты и COS 7 клетки) были фиксированы на высоте интра-Гольджи транспорта, на 8-9 минутах после отпуска 15-градусного блока Нами анализировались круглые мембранные профили, около 60-80 нм в диаметре, расположенные латерально от края цистерн. Клетки были обработаны антителами, выявляющими VSVG, для определения концентрации белка в везикулах. Чтобы исключить возможные артефакты мы использовали различные подходы. Цистерны комплекса Гольджи были очень хорошо мечены антителами против VSVG (высокое содержание частиц золота), однако, лишь немногие везикулярные профили содержали единичные метки Данные морфометрии показали, что плотность мечения в круглых профилях (в везикулах) была в 6 раз меньше, чем в прилежашей цистерне Соотношение меченкя VSVG в везикулах и в цистернах не зависело от уровня зкспресии данного вирусного белка.

Поскольку VSVG является интегральным мембранным белком, нельзя исключить возможность того, что доступ антител к люменальному эпитопу белка, может быть затруднен, вследствие маскировки этого домена другими люминальными протеинами или геометрическими факторами. Чтобы исключить эту возможность, мы продублировали эксперименты с использованием антител против цитозольного эпитопа VSVG. Соотношение между уровнем плотности мечения в цистернах и везикулах оказалось и в этом случае близким к 6 При использовании пероксидазной метки антител против люменалыгаго домена белка было видно, что в цистернах КГ продукт реакции выявлялся интенсивно, тогда, как везикулы были практически лишенными метки

Наконец, нами был использован радикально другой подход, с использованием других, растворимых, белков Клетки были трансфектированы конструкцией секретируемой растворимой пероксидазы хрена (ssHRP) (Connolly CN, el al, 1994) Использование данной конструкции снимает

проблему доступности эпитопа Трансфектированные клетки были фиксированы без использования протоколов синхронизации, поскольку ssHRP не может быть синхронизирован, а после фиксации их подвергли стандартной процедуре проявления HRP-реакции. И в этом случае мы нашли, что в везикулярных профилях реакция была весьма слабой, а в цистернах, напротив, интенсивной. Это означало, что секретируемая пероксидаза хрена при транспорте через КГ концентрировалась в цистернах и практически исключалась из везикул Таким образом, совокупность всех полученных данных позволяет вполне определенно утверждать, что коатомер-зависимые везикулы, практически не участвуют в транспорте секретируемых белков

Для более точного анализа возможных моделей транспорта мы провели серию экспериментов in vivo на фибробластах человека и COS 7 клетках с использованием белковых конструкций, содержащих зеленый флуоресцирующий белок (GFP) Оба типа клеток были трансфехтированы VSVG-GFP. После предварительного накопления флуоресцирующего конструкта в ЭР применяли протокол малой пульсовой волны и наблюдали за перемещением вирусного белка на высоте интра-Гольджи транспорта (6-12 минут после отпуска 15-градусного температурного блока) Наблюдая движение VSVG-GFP в живых клетках, мы нашли, что белок локализовался в это время в 10—30 удлиненных «частицах», длиной не более 1-2 микрометров, имеющих разный уровень флуоресценции. Если клетки фиксировались в этот момент, а затем дополнительно окрашивались на маркеры Гольджи-«сети», то было видно, что VSVG-GFP заполняет не всю «сеть», а только ее часть Коррелятивная микроскопия показала, что данные «частицы» представляют собой 1-2 цистерны в отдельных стаках, заполненные белком VSVG-GFP Наблюдая за транспортом VSVG в живых клетках сразу после прибытия VSVG-GFP в КГ, мы использовали метод, известный как FRAP (восстановление флуоресценции после «выжигания»), при котором можно «выжечь», обесцветить, флуоресценцию в части органеллы и затем наблюдать

ее восстановление, если флуоресцентная метка имеет возможность достаточно свободно перемещаться. При «выжигании» почти половины видимой зоны комплекса Гольджи восстановления флуоресценции в ней практически не было Данные этих экспериментов в сочетании с результатами, полученными на ЭМ-уровне, показывают, что при проведения экспериментов по протоколу малой пульсовой волны практически на всех этапах внутри-Гольджи транспорта соседние стаки не обменивались УБУО-ОРР. Интересно, что сами «стопки» Гольджи при этом не были изолированы друг от друга, а образовывали сеть (зона Гольджи) Это было подтверждено нами в ходе аналогичных экспериментов с конструкцией галактазилтрансфераза-ОРР (СГ-ОРР). Зона Гольджи выглядела в виде сети и в живых клетках, и в фиксированных, а после экспериментов по «выжиганию» половины зоны Гольджи флуоресценция в ней быстро восстанавливалась, что свидетельствовало о свободном перемещении ОТ-ОРР.

Таким образом, в ходе проведенных экспериментов с использованием различных протоколов, мы могли показать, что проколлаген I и У8\ЧЗ проходят через комплекс Гольджи вместе, с одной и той же скоростью, а значит, их перемещение представляет собой единый процесс. Ни проколлаген I, ни УвУв не покидают цистерн Гольджи во время движения, что является подтверждением существования единого механизма транспорта

Что же представляет собой транспортный механизм для УБУО и проколлагена I? Результаты наших исследований не укладываются в схему везикулярной модели транспорта. Их трудно объяснить и с позиций модели транспорта по непрерывным коммуникациям в ее упрощенном варианте, который предусматривает движение карго по сети, состоящей из соединенных между собой стопок (Мхгопоу А е1 а! 1997,1998) Напротив, модель созревания мембранного переносчика способна объяснить многие экспериментальные данные. Особенно важным доказательством справедливости данной модели является факт перемещения (прогрессии) карго без диссоциации от цистерн

Вышеизложенные результаты описывают механизм транспорта белков-карго, но оставляют нерешенным вопрос о модусе переноса ферментов Гольджи и поддержания их ассиметричного положения в стопке.

2. Ферменты комплекса Гольджи концентрированы в перфорированных зонах цистерн, а не в СОР I везикулах.

Одним из основных принципов общепринятой версии модели созревания и прогрессии цистерн, объясняющей поддержание полярности распределения Гольджи-ферментов, является теория ретроградного транспорта ферментов внутри СОР I-покрытых везикул Однако данные литературы весьма неоднозначны. Мы приведем лишь два примера Некоторые исследователи (Martinez-Menarguez J.A. et al., 2001) нашли, что окаймленные, круглые профили, находящиеся около стаков комплекса Гольджи, которые рассматривались как СОР 1-везгасулы, содержали in vivo фермент КГ маннозидазу-П (Mann II) в концентрации эквивалентной или более высохой, чем в цистернах КГ. Другие авторы, однако, подчеркивают обеднение подобных круглых профилей тем же самым ферментом (Orci L. et al. 2000; Cosson P. et al., 2002). При тех же самых экспериментальных условиях, содержание Mann П в везикулах оценивалось как в 3,2-4,9 раз меньшее, чем содержание фермента в близлежащих цистернах. Для разрешения этих противоречий мы использовали несхольхо независимых подходов

2.1. Ферменты Гольджи исключают«! из круглых профилей, диаметром 50-60 им, расположенных около комплекса Гольдки. Большая часть цитированных выше данных (Martinez-Menarguez J.A et al., 2001; Cosson P. et al., 2001) была получена на основе измерений плотности мечения маннозидазы-П на криосрезах, поэтому мы решили использовать эту же технологию. В качестве транспортных везикул расценивались правильные циркулярные профили, локализованный внутри зоны комплекса Гольджи, т. е в пределах так называемой "зоны исключения" для других органелл В среднем эти везикулы имели диаметр около 52 им (Marsh BJ. et al 2001) Здесь н№

хотелось бы обратить внимание на то, что видимые при ЭМ криосрезах круглые профили обычно рассматриваются исключительно как везикулы КГ. Однако, они или хотя бы часть из них, в равной мере могут быть результатом сечения мембранных трубочек (тубул), если плоскость среза проходит перпендикулярно их длине. Ранее было показано, что тубулы такого диаметра находятся как раз в этой зоне, располагаясь на закругленных краях цистерн (цистеркальных римах). Эти тубулы могут присутствовать на цистернах любого уровня (Ladinsky M.S. et al. 1999). Для проверки этого положения мы проанализировали тангенциальные срезы КГ в NRK клетках после обработки их анти-Р-СОР антителами (антителами против р-СОР-субьединицы СОР I каймы) с использованием техники «золотого усиления». На электронограммах, демонстрирующих тангенциальные срезы цистерн, прослеживался заметный градиент плотности мечения. Большинство гранул золота, маркирующих присутствие одной из субъединиц СОР I каймы, находилось на перфорированных, периферических зонах цистерн. Центральная, солидная, часть цистерн и, что особенно важно, большая часть 50-60 нанометровых везикул, были лишены метки, а, следовательно, не имели СОР I покрытия. Таким образом, наличие СОР I-окаймления не является исключительной характеристикой СОР I-везикул и бадов, которые эти везикулы образуют.

Следующим этапом нашей работы стало изучение распределения ферментов комплекса Гольджи с помощью антител, меченных коллоидным золотом, и флуоресцентных конструкций. Мы исследовали распределение эндогенной гал&ктозшгграисферазы (GalTf) и сиалилтрансферазы (STF) в человеческих фибробластях, маннозидазы-П в NRK- и RBL- клетках, флуоресцентных конструкций маннозидазы-I и маннозидазы-Н (содержащих молекулу полной длины) в транзитарно трансфектированных этими конструкциями COS 7 клетках. Эксперименты проводились в условиях относительного покоя, т е без предварительной синхронизации движения карго Наши подсчеты показали, что круглые профили диаметром 50-60 нм, которые

были расположены в пределах зоны комплекса Гольджи и практически не содержали метку. Чтобы подтвердить данные о том, что СОР1 везикулы не концентрируют ферметы КГ, мы изучили 20 случайно выбранных круглых профилей и бадов, с хорошо видимым СОР1 -покрытием, и ни на одном из них не смогли найти выраженное мечение на галактозилтрансферазу Количественный анализ показал, что концентрация ферментов в круглых профилях в 4-6 раз меньше, чем в соответствующих (т.е. расположенных на одном уровне с круглыми профилями) цистернах.

Формирующиеся на цистернах СОР1-везикулы и имевшие вид почек на цистернах (бады) были также обеднены маннозидазой II. Проанализировав распределение метки на галактозилтрансферазу в человеческих фибробластах, мы получили те же самые результаты, т.е. окраска и на этот фермент в СОР1 везикулах и бадах отсутствовала.

Чтобы исключить неопределенности, связанные с доступностью люменальньгх эпитонов ферментов для антител, мы провели серию контрольных экспериментов на 1ЯКК клетках, стабильно трансфектированных химерным белком, состоящим из сиалилтрансферазы и пероксидазы хрена (вТТ- НИР) фтсЬсотЪе I С. е1 а1. 1995, ЬЫЫо Е е1 а1. 2001) Такие стабильно трансфектированные клетки фиксировали 1% раствором глутарового альдегида, проводили ДАБ-реакцию и приготавливали образцы для ЭМ-томографии Такая пероксидазная техника лишена ошибок, связанных с неэффективным доступом антител и возможных артефактов фиксации (ЗИпсЬсошЬе 1С ^ а1 1995). Как и следовало ожидать, конструкция ЭТТ-ИКР локализовалась в транс-цистерне и ТОМ-сети, т е в компартментах характерной локализаций эндогенной сиалилтрансферазы После анализа ЭМ-томограмм выяснилось, что отдельные круглые профили, содержащие БТР-НЯР, на самом деле являлись поперечными срезами 8ТТ-НКР-окрашенных тубул или перфорированных зон цистерн. Отсутствие пероксидазной метки в везикулах отмечалось и на тангенциальных срезах стаков Более того, химерный белок

ЭТТ-НИР не был выявлен н а СОР I - б ад ах, «почках», которые, как полагают, дают начало СОР I везикулам. В качестве позитивного контроля правильности проведения экспериментов мы использовали другую конструкцию 85Н®РИ5И' — растворимую сегрегируемую пероксидазу хрена, конъюгнрованную с ЫЭЕЬ-снгналом (З^псЬсотЬе 1.С е1 а1 1995) КБЕЬ-сигнал — это последовательность четырех аминокислот Ьуз-Азр-01и-Ьеи, которая распознается специальным ЫЭЕЬ-рецептором, ответственным за возврат резидентных белков в ЭР. Лишь в этом случае нам удалось выявить часть 50-60 нм везикул, в которых содержался продукт ДАБ-реакции.

Наконец, используя технику мечення антител нанометровым золотом с последующим золотым усилением на стадии преимбединга (до заключения в смолу), мы обнаружили отчетливую метку в цистернах КГ для таких эндогенные ферментов как галактозилтрансфераза, сиалилтрансфераза, маинозидЕза П, а так же для конструкции маниозидаза 1 — вРР. Гранулы золота были отмечены и около стаков, однако, не в составе небольших круглых профилей. На тангенциальных срезах КГ значительная концентрация ферментов (особенно маннозидазы-П) наблюдалась в области перфорированных зон цистерн, которая в 6 раз превышала плотность мечения в круглых профилях При использовании антител против цитозольного домена галактозялтрансферэзы мы также могли подтвердить тот факт, что метка была оссоцикрозана с цистернами и тубулами, а не с везикулярными профилями Таким образом, используя различные иммуноэлектронномикроскопические методы, мы пришли к вьшоду о том, что СОР-1 везикулы, имеющие диаметр 5060 им, обеднены ферментами комплекса Гольджи, и, следовательно, вряд ли пригашают участие в их рециклировании между различными компартментами.

2.2. Блокирование слияния мембран не приводит к накоплению везикул, обогащенных ферментами.

Возможной причиной, затрудняющей обнаружение популяции обогащенных ферментами СОР-1 везикул, может быть слишком короткое время

их существования. Можно предположить, что если нарушить процесс слияния мембран, то везикулы должны накапливаться в зоне КГ в большом количестве, и это должно облегчить их обнаружение. Существуют несколько способов блокирования слияния мембран биосекреторного пути Одним из них является микроинъекция мутантного белка His6-a-SNAP (L294A), который не способен выполнить функции нативного SNAP-белка по разъединению SNARE-комплекса, собственно и осуществляющего слияние мембран (Barnard R J. et а!., 1996; Band А.М et al., 2001). Другой способ включает обработку N-этилмалеимидом (NEM) (Mironov A at al., 2001). В цитоплазму NRK-клеток, стабильно трансфектированных конструкцией сиалилтрансфераза-HRP, был микроинъецирован a-SNAP-мутант, затем, через 20 минут после микроинъекции, клетки фиксировали, инкубировали в среде с ДАБ или с соответствующими антителами и проводили по обычной методике. Многочисленные везикулы, диаметром 50-60 нм, накопленные в зоне комплекса Гольджи в результате блокирования слияния мембран, не содержали продукт реакции с ДАБ или нанометровой золотой метки. Поскольку метод микроикъекций отдельных клеток малоэффективен для исследования обширных клеточных популяций, мы использовали также обработку N-этилмалеимидом в хорошо отработанных экспериментальных условиях После такой обработки численность круглых везикулярных профилей в зоне КГ увеличивалась в 2,5 раза, по сравнению с контролем, что подтверждало факт блокирования слияния мембран. Определение концентрации галактозилтрансферазы проводилось путем подсчета частиц «золотой метки» на криосрезах. Результаты показали, что везикулы, расположенные в зоне КГ обеднены ферментом в 4,5 раза, по сравнению с цистернами. Таким образом, при использовании различных методических подходов нам не удалось обнаружить в зоне Гольджи сколько-нибудь существенной фракции 50-60 нанометровых везикул, которые бы содержали ферменты комплекса Гольджи в концентрациях, превышающих концентрации в цистернах КГ. Более того,

практически все везикулярные профили содержали гораздо меньшие (в 3-4 раза) концентрации ферментов, чем соседние цистерны

2.3. СОР I-зависимые везикулы in vitro также бедны ферментами комплекса Гольджи.

В работе Lanoix J. с соавторами (Lanoix J. et al, 1999), фракция маленьких мембраных пузырьков, которые авторы расценили как СОР I-везикулы, полученная in vitro после инкубации изолированных мембран КГ с цитозолем и гуанозинтрифосфатом (GTP), была обогащена ферментами КГ. Однако, принимая во внимание вышеизложенные результаты, мы решили уточнить, какую же часть этой фракции в действительности составляют СОР I-везикулы Напомним, что как показал анализ ЭМ-томограмм, большая часть круглых профилей представляла собой поперечный разрез тубул. Используя тот же самый подход (Lanoix J. et al., 1999), мы проинкубировали мембраны комплекса Гольджи с цитозолем, GTP, АТР-регенерирующей системой в обогащенном калием транспортном буфере, содержащем так же ионы Са2+. Как и следовало ожидать, в этих условиях при добавлении мутантного белка His6-a-SNAP к инкубационной смеси наблюдалось накопление 50-60 нанометровых везикул в зоне, расположенной около цистерн КГ. Затем, мы центрифугированием изолировали легкую фракцию мембран, которая, как показал ЭМ анализ, была представлена круглыми профилями, диаметр которых варьировал от 40 до 150 нм, с достаточно большим содержанием 50-60 нанометровых везикул В нижней части осадка (пелета) находились, в основном фрагменты цистерн, иногда с инвагинациями Большинство 50-60 нанометровых везикул локализовалось в легкой, верхней части пелета. Когда же мы изолировали мембраны после их инкубации с СОР 1-обедненным цитозолем, то полученная легкая фракция занимала существенно меньший объем, была намного меньше в объеме, чем полученная в присутствии His6-a-SNAP-мутанта. Она содержала множество тубулярных фрагментов и незначительное количество 50-60 нанометровых везикул. Для определения

содержания ферментов в различных мембранных фракциях мы использовали криосрезы центрифугированных образцов с последующим иммуномечекием на маннозидазу II. ЭМ анализ показал, что интенсивно метились, в основном, фрагменты цистерн, а не везикулярные профили, диаметром 50-60 нм Отношение в плотности мечения составляло около 2,6, что, в целом, соответствовало результатам экспериментов in vivo. Таким образом, можно заключить, что формирование 50-60 нанометровых везикул действительно является СОР I-зависимым процессом, и что данный тип везикул обеднен ферментами комплекса Гольдки

2.4. Перфорированные зоны цистерн КГобсгащены фермента«.!«

Проводя ЭМ исследование срезов, на которых выявлялись тангенциальные сечения КГ, мы оценивали концентрацию ферментов комплекса Гольджи в цистернах. Изображения, полученные с таких срезов при использовании антител против люминального и цнтоплазменного доменов галактсзилтрансферазы демонстрировали интенсивную окраску перфорированных зон цистерн, локализованных, в основном, у края цистерн. 50-60 накометровые круглые профили, соответствующие везикулам на тех же срезах были лишены метки. Относительная редкость тангенциальных сечений на срезах, которая затрудняет количественную оценку содержания ферментов, заставила нас разработать способ идентификации перфорированных зон цистерн на серийных криосрезах С его помощью мы сравнили распределение метки (частиц золота) в перфорированных зонах и 50-60 нм везикулах При этом учитывались круглые профили, находящиеся на определенном расстоянии от краев цистерн (римов). Измерения проводились в условиях синхронизации транспорта карго — перед отпуском транспортного блока и после него Анализ данной серии экспериментов показал, что галактазилтрансфераза концентрировалась, преимущественно, в области цнстернальных римов до отпуска транспортного блока, однако, после «освобождения» карго эта ассиметрия распределения исчезала. Мы сравнили также плотность мечення

ферментов в круглых профилях, расположенных на расстоянии не более 40 нм от еидимого крал цистерн, которые представляют собой сечения их пзрфорнроЕашшх зон, с плотностью метки остальных везикулярных профилей, расположенных в зоне комплекса Гольджп. Как показали результаты, плотность мечения ферментов Гольджи в круглых профилях, расположенных около краев цистерн не только превышала аналогичный показатель во всех круглых профилях, расположенных в зоне КГ, но нередко была даже выше средней плотности мечения в цистернах. Наши данные свидетельствуют о том, что ферменты КГ распределяются по длине цистерн неравномерно. Они концентрируются, преимущественно, в перфорированных зонах и на краях

цистерн комплекса Гольджи

♦ » »

Таким образом, благодаря разработке новых методов исследования и применению уже известных современных микроскопических технологий в процессе изучения транспорта белков через комплекс Гольджи удалось поде егнуть существенному переосмыслению исторически сложившиеся представления о принципах работы этой органеллы На основании зкепгрнменталшых данных нами была показана несостоятельность двух доминирующи?: в настоящее время моделей транспорта- везикулярной модели переноса белков-карго через комплекс Гольджи с помощью СОР I-везикул и модели созресаяия и прогрессии цистерн. Мы полагаем, что наиболее вероятной и обоснованной моделью транспорта через КГ, является модель созревания переносчика (Mironov A. at al. 2001; Beznoussenko G. and Mironov A. 2002). Данная модель не противоречит результатам исследований. Более того, эти результата можно считать убедительным подтверждением эффективности предлагаемой модели Согласно модели созревания и прогрессии мембранного переносчика после прибытия транспортируемых молекул в промежуточный компартмент и цис-сеть комплекса Гольджи активируется процесс слияния СОР I-везикул с цистернами, что приводит к восстановлению способности

цистерн к слиянию и образованию межцистернальных соединений (Мтопоу А а!., 2005) Непрерывность мембран цистерн КГ обеспечивает диффузию липидов и позволяет достигнуть их быстрого перераспределения, что ведет к выравниванию длины цистерн (Тгиссо А. е! а!., 2004). Мембранный переносчик, транспортирующий секретируемые белки, сливается вначале с медиальми цистернами, а затем с транс-цистернами. Таким образом, перемещение (прогрессия) карго происходит без его диссоциации от цистерн, в крупных, отличных от везикул, мембранных переносчиках, всегда связанных с цистернами КГ тубулярными коммуникациями (М1гопоу А е1 а1, 2001). Частичное «перемешивание» с ферментами КГ, концентрация которых особенно велика на краях цистерн (К\уеоп Н-Б. е1 а1, 2004), также доказывает существование карго-домена, сохраняющего свою идентичность при его переносе через стопку цистерн КГ и доступного для ферментов гликозикирования. Заключительное слияние с транс-сетью имеет важное значение для подготовки переносчика к следующему этапу транспорта, от комплекса Гольджи к плазматической мембране. Однако регуляция постГоль дж и транспорта может использовать несколько иные механизмы и заслуживает специального исследования.

ВЫВОДЫ

1. Результаты изучения кинетики и топологии переноса различных белков через комплекс Гольджи, полученные с помощью взаимодополняющих методов: флуоресцентной (лазерной конфокальной) микроскопии и иммуно-электронномшфоскопической техники, свидетельствуют о том, что существующие в настоящее время модели транспорта белков вдоль экзоцитозного пути нуждаются в существенном пересмотре.

2. Как показали эксперименты с различными протоколами синхронизации транспорта, белки, существенно отличающиеся по своим характеристикам — размерам, положению и принадлежности (проколлаген I и

G-белок вируса везикулярного стоматита (VSVG)), доставляются к комплексу Гольджи из эндоплазматической сети практически одновременно и проходят через данную органеллу с равными скоростями.

3. Крупные секреторные белки (проколлаген I) и небольшие мембранные протеины (VSVG) колокалнзуются в процессе переноса через комплекс Гольджи в одних и тех же компартментах и цистернах.

4. Трехмерное реконструирование комплекса Гольджи на основе данных ЭМ томографии н иммуно-элекгронномикроскопических исследований не выявило крупных везикулярных переносчиков (мегавезикул) и не подтвердило их участие в транспорте на данном участке секреторного пути.

5. Небольшой мембранный белок VSVG при умеренной стимуляции транспорта проходит через комплекс Гольджи, последовательно перемещаясь по цистернам в направлении от цис - к транс- полюсу. При увеличении объема транспортируемого белка отмечается более пологий градиент его концентрации, с максимумом в цистернах соответствующего компартмента.

6. Несмотря на различия по основным характеристикам (размерам, диффузионной способности, положению в просвете или в мембране), исследованные белки (проколлаген I, VSVG, секретируемая пероксидаза хрена в трансфектируемых клетках) совершенно исключаются из СОР 1-окаймленных Еезикул или содержатся в них в низких концентрациях.

7. Вышеперечисленные результаты позволяют утверждать, что доминирующая в настоящее время «везикулярная гипотеза» переноса белков-каргс через комплекс Гольджи с помощью СОР I-окаймленных везикул не может быть достаточно обоснована

8. Неправомочность гипотезы созревания и прогрессии цистерн, последовательно переносящих модифицируемые белки, подтверждается результатами, полученными при исследованиях «in vivo» и «in vitro» в бесклеточной системе-

-СОР I — кайма выявляется не только в везикулах и бадах, но и, в перфорированных зонах цистерн стопок комплекса Гольджи;

-как показали результаты трехмерной реконструкции, округлые мембранные профили, содержащие ферменты комплекса Гольджи, являются не СОР I везикулами, а сечениями тубул, связанных с перфорированными зонами цистерн;

-ферменты, характерные для каждого компартмента комплекса Гольджи отсутствуют или содержатся в низких концентрациях в СОР I везикулах и в образующих их окаймленных бадах, но локализуются, преимущественно, в перфорированных зонах на периферии цистерн

9. Трехмерные реконструкции на основе данных ЭМ томографии выявили непрерывные тубулярные коммуникации между различными цистернами стопки комплекса Гольджи и между стопками. Эти сообщения открывают возможность рециркуляции ферментов комплекса Гольджи и их возврата в проксимальный компартмент посредством диффузии в просвете и латеральной диффузии в мембранах. Структура комплекса Гольджи и частота непрерывных коммуникаций между его цистернами зависят от интенсивности транспорта белков через данную органеллу.

10. В качестве модели, наиболее отвечающей современным данным о переносе белков через комплекс Гольджи, представлена модель прогрессии мембранного домена, содержащего транспортируемые белки В соответствии с этой моделью, мембранный домен последовательно переносится от цистерны к цистерне, при использовании молекулярных механизмов, обеспечивающих слияние и разделение мембран Это позволяет обеспечить доступ белков-карго к резидентным ферментам комплекса Гольджи в соответствующем компартменте и, тем самым, их созревание (модификацию) Профессия мембранного домена регулирует образование непрерывных тубулярных сообщений между соответствующими компартментами комплекса Гольджи.

11В соответствии с предложенной моделью прогрессии мембранного домена, комплекс Гольджи следует рассматривать как весьма динамичную мембранную органеллу, актуальная структура которой, в значительной мере, зависит от интенсивности синтеза и транспорта белков.

РЕКОМЕНДАЦИИ ПО ИСПОЛЬЗОВАНИЮ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЯ

Наиболее эффективным и достоверным методическим подходом в изучении механизмов внутриклеточного транспорта является коррелятивная микроскопия, позволяющая использовать преимущества прижизненного флюоресцентного изучения транспорта молекул с высоким разрешением (конфокальная лазерная микроскопия) с последующим детальным электронно-микроскопическим анализом, включающим ЭМ-иммуноцитохимию и ЭМ-томографшо. Трехмерные реконструкции с высоким разрешением необходимы для суждения о дискретном или непрерывном механизме транспорта молекул в клетке. Анализ структурной организации конкретных мембранных переносчиков возможен при использовании криотехники на этапах фиксации образцов и приготовления срезов. Использованные в диссертации протоколы синхронизации транспорта на различных этапах секреторного пути являются эффективным инструментом, позволяющим проводить анализ внутриклеточного транспорта белков в строго контролируемых условиях.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Beznoussenko G.V., Fusella А, Luini A. and Mironov A. A. Analysis of the role ofCOP-1 in Golgi tubulation // lOOth Anniversary Conference: The Golgi Conference Pavía - 1998 - 19-23 Settembre. - P.37.

2. Weigert R., Spano S., Turachío G, Siletta G., Polishchuk E, Beznoussenko G, Mironov A., Corda D., Luini A. BARS, a substrate of BFA dependent ribosylation,

induces the fission of Golgi tubules via the formation of phosphatide acid // Membrane trafficking and the cytoskeleton: an integrated view. The American Society for Cell Biology, European Molecular Biology Organization, H. Dudley Wright Foundation. Sixth Joint Meeting. - S. Maria Imbaro, June 26-30,1999. - P. 69.

3. Mironov A., Nicoziani P., Beznoussenko G. and Luini A. Ditiusable ana non-difiusable cargoes move through the Golgi complex similarly // Abstract book, Comitate» Telethon Fondazione Onlus. Scientific Convention - November 12-14 — Rimini -1999 - Palazzo dei Congressi. - P. 130.

4. Mironov, A., Beznoussenko, G., Fusella, A., and Di Tullio, G. Coafomer-dependent vesicles fission promotes transformation of Golgi tubules into cisternae.// In: 39th Annual Meeting of American Society for Cell Biology, Washington, December, 11-15 // Mol Biol. Cell, 1999. - .№>12 - P. 115a

5. . Beznoussenko G V, Pilygin S. S., Fusella A., Di Tullio G., Luini A, and Mironov A. A. Morphogenic role of COPI-coated buds/vesicles in the Golgi complex// ELSO. - 2000. - 2-6 September, Geneva, Switzerland, Proceedings, Abstract 176 // Eur. J Cell Biol. - Vol. 79 (suppl 52) - P. 62

6 Mironov A. A., Mironov A A. Jr., Polishchuk R S, Beznoussenko G. V., Poiishchuk E. V, Martone M. E., Deerink T. J, Elhsman M. R, Luini A Ultrastructure of forming and maturing ER-Golgi carriers in mammalian cells ELSO.- 2000. - 2-6 September, Geneva, Switzerland, Proceedings, Abstract 176 // Eur. J. Cell Biol - Vol. 79 (suppl. 52) - P. 66

7 Mironov A A., Beznoussenko G.V, Nicoziani P, Martella O., Trucco A., Kweon H.-S., Di Giandomenico D., Polishchuk R.S., Fusella A., Lupetti P, Berger E G, Geerts W. J. C., Koster A. J., Burger K. N J. and Luini A. Small cargo proteins and large aggregates can traverse the Golgi by a common mechanism without leaving the lumen ofcisternae //J. Cell Biol. -2001 - Vol. 155. -P. 1225-1238.

8. Marra P., Maffucci T., Daniele T, Di Tullio G., Ikehara Y., Chan E. K.L., Luim A, Beznoussenko G, Mironov A., and De Matteis M A. The Golgi matrix proteins

GM130 and GRASP65 cycle through a novel subdomain of the intermediate compartment // Nature Cell Biology. -2001. - № 3.- P. 1101-1113.

9 Maeda Y., Beznoussenko G V , Van Lint J , Mironov A. A. and Malhotra V Recruitment of Protein kinase D to the Trans Golgi Network via the first Cysteine Rich Domain // EMBQ J. -2001. - Vol 20 - №21 -P. 5982-5990

10 Godi A., Di Campli A, Di Tullio G, Lizzi A R, Beznoussenko G., De Matteis M A. The polyphosphoinositides and the Golgi complex: the targeting mechanisms and role of Ptdlns 4-kinase beta at the Golgi.// EMBO workshop "5th Anaberg Conference". - January 9-14 — 2001. - Schloss Goldegg, Austria. - P.35.

11. Beznoussenko G, Fusella A, Luini A and Mironov A. Motphogenic role of COPI-coated buds/vesicles in the Golgi complex // EMBO workshop "5th Anaberg Conference". - January 9-14 - 2001. - Schloss Goldegg, Austria. -P.21.

12. Mironov A.A., Mironov A.A Jr, Beznoussenko G.V., PohshchuK R.S., Luini A. Analysis of intiacellular transport with correlative video-light-electron microscopy // 1st International meeting and workshop on advanced light microscopy - June 6-10 -2001. - Santa Maria Imbaro (Chieti) Italy. - P.38.

13. Beznoussenko G.V., Pilyugin S. S , Fusella A., Di Tullio G., Koster, A.J., Geerts W, Burger KN.J, Kozlov M M., Luini A, Mironov A A COPI controls fast shape change in the Golgi complex // Advanced Course "Lipid-mediated signalling in cellular functions - 21-26 June - 2001. - Santa Maria Imbaro (Chieti) Italy - P.52

14 Mironov A., Beznoussenko G Nicoziani P., Kweon H.-S., Martella O. Trucco A, Fusella A., Lupetti P, Berger E., Luini A. Intra-Golgi transport new models and roles for old players // 43rd Symposium of the Society for Histochemistry -September 26-29. - 2001 - University of Vienna. Austria -P. - 31.

15 Mironov A A. Beznoussenko G., Mironov AJr, Polishchuk R., Geerts W., Burger KN.J., Koster A.J. and Luini A visualizing membrane traffic in vivo by combined video fluorescence and 3-D-electron microscopy // Academy Colloquium Electron Tomography. - 17-20 Amsterdam, - 2001 - The Netherlands -P. - 41.

16 Beznoussenko G. and Mironov A A Models of intracellular transport and evolution of the Golgi complex // Anat Rec.- 2002.- № 268 -P. 226-238.

17. Beznoussenko G.V., A. A. Mironov, Jr., Luini A. and A A. Mironov Analisis of intracellular transport with video-light-electron microscopy // ELM3, Meeting, 2-nd International meeting and workshop, - Institut Pasteur, Pans, France. - May 29-31 -

2002.-P.-17.

18. Mironov A., Mironov A.,Jr., Beznoussenko G., Geerts W J.C., Koster A, Burger K.N J and Luini A Correlative light-electron microscopy of transport intermediates operating between the endoplasmic reticulum and the golgi complex // 15th International Congresson Electron Microscopy. 1-6 September - 2002 - Durban, South Africa.-P.135.

19. Mironov A. A, Mironov Jr A. A, Beznoussenko G V., Trucco A., Lupetti P., Smith J. D., Geerts W. J. C., Koster A. J., Burger K. N. J, Martone M E., Deerinck T. J., Ellisman M. H. and Luini A ER-to-Golgi carriers arise through direct en bloc protrusion and multi-stage maturation of specialized ER exit domains // Dev Cell. -

2003.-Vol. 5 - №4. P. 583-94.

20. Mironov A., Beznoussenko G, Trucco A., Polishchuk R„ Kweon H -S., Luini A. Electron microscopic tomography and correlative microscopy in analysis of secretory transport // 6th Multinational Congress on Microscopy European extension. Pula, Croatia-June 1-5 - 2003 -P 41-42

21. Trucco A, Polishchuk R., Martella O., San Pietro E., Di Giandomenico D, Beznoussenko G., Fusella A., Di Pentima A, Geerts W.G C., Koster A, Burger K.N J , Mironov A.A and Luini A Morpho functional organisation of traffic through Golgi mini-stacks // FEBS Advanced lecture cours on "Liping signaling and membrane traffic" - Santa Maria Imbaro - Italy 20-25 - June 2003 - P. 116

22 Kweon H-S., Beznoussenko G V, Polishchuk R S, Trucco A, Martella O, Di Giandomenico D., Luini A., Mironov A. Golgi enzymes are excluded from COP I vesicles but are inriched in the perforated zones of Golgi cisternae// The ELSO 2003. - Conference Dresden, - Germany, 20-24 - September, 2003 - P 42

23. Beznoussenko G V., Luini A., Mironov A Reorganization and dynamics of Golgi complex upon receipt-incorporation of cargo// The ELSO 2003. - Conference. Dresden, - Germany, 20-24 - September, 2003. - P. 220

24. Trucco A., Polishchuk R.S, Martella O., San Pietro E., Di Giandomenico D., Dipentima A., Fusella A, Beznoussenko G.V., Geerts W.J., Burger K.N., Mironov A.A, Lumi A.. Membranous Connections Between Heterotypic Cistemae Play a Crucial Role in Transport Through Golgi Ministacks.// 43th Annual Meeting of American Society for Cell Biology, Washington, December, 11-15, 2003//.Molec. Biol Cell.-Vol. 14 -P. 105a.

25 Банин B.B., Безнусенко ГЛ., Сесорова И.С. Цитологические подходы к анализу структуры и функций комплекса Гольджи // Морфология. - 2004. - Том 127.-№4-С. 16-17.

26. Банин В.В., Безнусенко Г.В. Сесорова И.С. Транспорт белка через комплекс Гольджи // Вестник морфологии. 2004, том 127, №1-2. - С.10-11.

27. Сесорова И С., Безнусенко Г.В К эволюции комплекса Гольджи // Актуальные проблемы биологии, медицины и экологии. - Томск.- Изд. «ТГСУ», 2004. - С.152-153.

28. Безнусенко Г.В., Сесорова И.С. Метод усиления контрастирования образцов для электронной микроскопии // Актуальные проблемы биологии, медицины и экологии -Томск. Изд. «1ГСУ», 2004. - Том 4.-№ 1.-С. 20-21.

29. Kweon H.-S., Beznoussenko G.V., Polishchuk R. S., Trucco A., Di Tullio G., Martella O., Di Giandomenico D, Marra P., De Matteis M.A., Fusella A., Di Pentima A., Berger E. G., Geerts W. J. C., Koster A. J., Burger K. N. J., Luini A., Mironov A. A. Golgi enzymes are excluded from peri-Golgiolar vesicles but enriched in perforated zones of Golgi cistemae // Mol Biol Cell -2004.- Vol.15.- №10.- C. 471024

30. Trucco A., Polishchuk R.S., Martella O., Pentima A.D., Fusella A., Giandomenico D.D, Pietro E S, Beznoussenko G V., Polishchuk E.V., Baldassarre M., Buccione R, Geerts W.J., Koster AJ, Burger KN., Mironov A.A, Luini A.

Secretory traffic triggers the formation of tubular continuities across Golgi sub-compartments//Nat Cell Biol -2004-Vol.6 -№ 11.-P.1071-81.

31. Mironov A.A., Colanzi A, Polishchuk R.S., Beznoussenko G.V., Mironov A.A. Jr, Fusella A, Di Tullio G., Silletta M G, Corda D, De Matteis M.A., Luini A Dicumarol, an inhibitor of ADP-ribosylation of CtBP3/BARS, fragments golgi non-compact tubular zones and inhibits intra-golgi transport // Eur J Cell Biol. - 2004. -Vol. 83. - № 6. - P. 263-79.

32. Mazzone M., Baldassare M., Beznoussenko G., Giacchetti G., Cao J., Zucker S., Luini A., Buccione R. Intracellular processing and activation of membrane type 1 matrix metalloprotease depends on its partitioning into lipid domains // J Cell Sci -2004. - Vol. 117. - № 26 - P. 6275-87.

33. Beznoussenko G.V, Luini A, Mironov AA. The Golgi stack is not a single functionally interconnected compartment with respect to secretoiy cargo // ELMI, European Light Microscopy Initiative. Meeting, 4-th International meeting and workshop - Gothenburg University, Gothenburg Sweden - May 26- 28 . - 2004 -P. 38.

34. Dolgikh V.V., Beznoussenko G V., Semenov P. B., Sokolova Y. Y. and Mironov A A Intracellular transport of secretory proteins in microsporidia occurs in the absence of small, coat-dependent vesicles // Proceedings of NATO Advanced Research Workshop "Emergent Pathogens in the 21st Century: First United Workshop on Microsporidia from Invertebrate and Vertebrate Hosts" Ceske Budejovice - July 12-15,2004.~P.18.

35. Beznoussenko G.V., K. Burger, A. Fusella, A. J. Koster, W. Geerts, AJLuini, A A Mironov: COP I controls Golgi morphology by segregating transmembrane area asymmetry into vesicles // 13th European Microscopy Congress, EMC-2004. -University of Antwerpen, Antveipen, Belgium. August 22-27,2004.

36. Micaroni M, Beznoussenko G.V., Fusella A., Luini A., Mironov. A.A. Enzyme composition of COP I vesicles isolated from rat liver Golgi// 13th European

Microscopy Congress, EMC 2004, University of Antwerp, Antverp, Belgium. August 22-27 - 2004.-P 37

37 Trucco A, Polishchuk R., Martella 0.,Di Pentima A, San Pietro E, Beznoussenko G, Geerts W, Burger K., Mironov A., Luini A,. Secretory traffic triggers the formation of tubular continuities across Golgi sub-compartment.. //The ELSO 2004 Conference Nice, France 4-8 September, 2004

38 Безнусенко Г.В, Cecopoca И.С., Миронов A.A. Как измерять структуры или новая стерео л огня-1 Способы отбора и ориентации образцов // Морфология -2005.-Том 128.-№5 -С 73-75.

39 Безнусенко Г.В., Сесорова И.С , Миронов А.А., Баиин В.В. Как измерять структуры или новая стереологяя: И. Методы определения абсолютных размеров клеточных структур на светооптическом уровне // Морфология. -2005. - Том 128. - №6 - С 63-66.

40 Миронов А А, Безнусенхо Г В , Сесорова И С, Банин В.В. Как измерять структуры или новая стереология: III Элекгронно-микроскопическая стереолсгия // Морфология - 2005 - Том 129. - №3 - С. 72-75.

41 Mironov A A, Beznoussenko GV., Polishchuk RS., Trucco A. Intra-Goigi transport, a way to a new paradigm? // Biochim.Biophys, Asta - 2005. - Vol 10. -№1744(3).-P. 340-50

42 Mironov A A, Beznoussenko GV, Luini A, Polishchuk R.S Visualizing intracellular events m vivo by combined video fluorescence and 3-D electron microscopy // Methods Enzymol. - 2005. - № 404 - P. 43-57.

43 Mironov A A, Beznoussenko G.V. and Mirnov A.A. Jr. Estimation of subcellular organelle volume from ultrathin sections through centrioles with a discretized version of the nucleator // In Biological Sciences Symposia - Biological Specimen Preparation Microscopy and Microanalysis Cambridge University Press -2005.-v.ll.-P 1168-1169.

44 Trucco A., Martella O, Beznoussenko G.„ Mironov A.A. and Lumi A Evidences for diffusion-based mechanism of intra-Golgi transport for albumin and

other soluble cargo proteins II FEBS Advanced lecture cours on "Lipid-protein interaction in signalling and membrane traffic,", Santa Maria Imbaro (CH), Italy 1015 June 2005.-P.100.

45. Mironov A.A, Luini A., Beznoussenko G.V. Intra-Golgi transport. A way to new paradigm? // Microscopy Conference 2005. - 6.Dreilandertagung 2005. - Davos, Switzerland, - 28 august - 2 September 2005. - P.170.

46. Mironov A.A. and .Beznoussenko G.V. Visualizing of rare intracellular transport events in vivo by combined video fluorescence and 3-D Electron Microscopy // Microscopy Conference 2005. 6.Dreilandertagung 2005.Davos, Switzerland, 28 august - 2 September 2005. - P.386

47. Beznoussenko G.V., Neumuller J., Vetterlein M., Di Giandomenico D., Sesorova I.S., Martella O., Jimenez-Gil N., Burger K, Luini A, Mironov A.A. and Pavelka M. The clatrin-positive endosomal TGN attaches to the Golgi stack during transport of cargo // Microscopy Conference 2005. 6.Dreilandertagung 2005.Davos, Switzerland.

- 28 august - 2 September 2005. - P. 159.

48. Безнусенко Г.В., Сесорова И.С., Банин B.B. Элек1ронно-томо1рафический анализ строения комплекса Гольджи в тканевой культуре клеток II Морфология.

— 2006. - Том 129.-Jfe3.-C. 41-44.

49. Сесорова И.С., Безнусенко Г.В., Банин В.В., Долгих В.В. Эволюционный подход в понимании структурно-функциональной организации комплекса Гольджи // Морфология - 2006. - Том 129.-JNsl.-C. 91-94.

50. Сесорова И.С., Безнусенко Г.В., Долгах В.В. Структурно-функциональная характеристика КГ растительных клеток // Морфология - 2006. - Том 129 -№4.-С.111-112.

51. Безнусенко Г В, Сесорова И.С., Долгих В В , Моржина Е.В, Токарев Ю.С Сравнительный анализ ультраструктурных изменений аппарата Гольджи, индуцированных действием фторида алюминия и NEM в клетках млекопитающих, насекомых и в микроспоридиях // Морфология. - 2006. - Том 129.-№4.-С. 21-22

52. Сесорова ИС, Безнусенко Г В. Комплекс Гольджи как центральная органелла секреторных путей растительных клеток Л Актуальные проблемы морфологии : Сборник научный трудов/ Под ред. проф. Н.С Горбунова.-Красноярск- Из-во КрасГМА, -2006.- С 149-151.

53. Mironov, A.A., Banin V.V., Sesorova I.V., Dolgikh, VV, Luini, A., and Beznoussenko, G.V. Evolution of the Endoplasmic Reticulum and the Golgi Complex // Origins and Evolution of Eukaryotic Endomembranes and Cytoskeleton - 2006. -Editor: Jekely ISBN: 1-58706-204-6.

54. Mironov A.A, Micaroni M., Beznoussenko GV, Luini A.. COP I vesicles regulate formation of intercisternal connections exstracting Qb SNAREs from Golgi cisternae.// EMBO "7th Anaberg Conference". Membrane traffic in the secretori pathway. January 9-14,2007, Schloss Goldegg, Austria

55. Marra P, Salvatore L, Mironov A Jr, Di Campli A, Di Tullio G, Trucco A, Beznoussenko G, Mironov A., De Matteis M.A. The Biogenesis of the Golgi Ribbon: The Roles ofMembraie Input from the ER and of GM130V/Mol Biol Cell.-2007 -Vol. 8.-№5.-P. 1595-608.

Содержание диссертации, доктора биологических наук, Безнусенко, Галина Владимировна

Список используемых сокращений. Введение (общая характеристика работы)

Глава 1. Обзор литературы.

1.1 Основные модели транспорта через комплекс Гольджи.

1.1.1 Модели диссоциации.

1.1.2 Везикулярная модель.

1.1.3 Модель прогрессии.

1.1.4 Модель прогрессии и созревания цистерн.

1.1.5 Модель созревания и прогрессии переносчика транспортируемого белка.

1.1.6 Диффузионная модель (или модель непрерывных коммуникаций).

1.1.7 Модель болюса.

1.2 Транспорт от эндоплазматического ретикулюма к комплексу Гольджи.

1.3 Механизмы транспорта через комплекс Гольджи.

1.3.1 Транспорт белков через комплекс Гольджи согласно везикулярной модели.

1.3.2 Этапы переноса белков через комплекс Гольджи по модели созревания и прогрессии цистерн.

1.3.3 Процесс транспорта белков через комплекс Гольджи согласно модели созревания и прогрессии мембранного переносчика.

1.3.4 Транспорт белков через комплекс Гольджи по механизму латеральной диффузии.

1.3.5 Комбинированные модели о транспорте белков через комплекс Гольджи.

1.4 Транспорт от комплекса Гольджи к плазматической мембране.

1.4.1 Везикулярный транспорт от комплекса Гольджи согласно везикулярной модели.

1.4.2 Транспорт от комплекса Гольджи в специальных мембранных переносчиках по модели созревания и прогрессии цистерн.

1.4.3 Непрерывность коммуникаций и транспорт от комплекса Гольджи по модели латеральной диффузии.

1.4.4 Регулируемая непрерывность и последовательные слияния согласно модели созревания и прогрессии переносчика на этапе транспорта от комплекса Гольджи к плазматической мембране.

Глава 2. Материалы и методы.

2.1 Клеточные линии, ДНК-конструкции, антитела и химические реагенты.

2.2 Условия роста культуры клеток.

2.3 Трансфекция.

2.3.1 Трансформация бактерий с помощью температурного шока (высокой температуры).

2.3.2 Длинный путь приготовления плазмидной ДНК (Large scale).

2.3.3 Трансфекция клеток путем электропорации.

2.4 Инфицирование клеток вирусом везикулярного стоматита (vesicular stomatitis virus, VSV).

2.5 Синхронизационные протоколы.

2.6 Иммунофлуоресцентная микроскопия.

2.6.1 Материалы, использованные для проведения иммуно-флуоресцентной микроскопии.

2.6.2 Метод проведения иммунофлуоресцентного специфического окрашивания.

2.6.3 Метод измерения уровня колокализации иммуно-флуоресцентных протеинов.

2.7 Конфокальная микроскопия.

2.8 Электронная микроскопия.

2.8.1 Материалы, использованные для проведения обычной электронной микроскопии, так же в сочетании с иммуномечением.

2.8.2 Метод приготовления образцов для электронной микроскопии.

2.8.3 Способы улучшение контраста.

2.8.4 Методы иммуномечения препаратов для электронной микроскопии (ЕМ) перед заключением в эпоксидные смолы.

2.8.4.1 Метод золотого усиления.

2.8.4.2 Диаминобензидиновая реакция (ДАБ-реакция).

2.8.4.3 Двойное окрашивание.

2.8.5 Методы иммуноцитохимии после заключения (постэмбеддинг). Криосрезы.

2.8.5.1 Материалы, использованные для приготовления криосрезов и их иммуномечения.

2.8.5.2 Получение ультратонких криосрезов.

2.8.5.3 Иммуномечение криосрезов.

2.8.6 Морфометрический анализ.

2.8.7 Метод быстрого замораживания и криозамещения.

2.8.8. Электронная томография.

2.8.9. Коррелятивная микроскопия.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Организация транспорта белков через комплекс Гольджи"

Клетки синтезируют различные макромолекулы как для секреции их во внеклеточную среду, так и для внутриклеточных процессов. Белки, синтезированные на рибосомах гранулярного эндоплазматического ретикулюма (ЭР), проходят длинный путь, прежде чем достигнут плазматической мембраны и других органелл. Эта система различных внутриклеточных компартментов образует секреторный или эндоцитозный путь (Миронов A.A. и др. 1998; Банин В.В., 1999). Если ЭР является местом синтеза и обеспечивает вхождение макромолекул: белков и липидов, в последующие компартменты мембранной системы клетки, то пластинчатый комплекс или комплекс Гольджи (КГ) является местом их посттрансляционной модификации, сортировки и последующей рассылки по различным направлениям. Регуляция и механизмы транспорта на этом участке чрезвычайно сложны и являются предметом активного изучения и горячих научных споров среди ученых ведущих лабораторий в области современной клеточной и молекулярной биологии. В настоящее время рассматриваются следующие теории и модели транспорта внутри-Гольджи (Mironov A.A., et al. 2005): везикулярная теория, предполагающая, что секретируемые белки транспортируется между стабильно существующими цистернами в везикулах, причем в обоих, в антероградном и ретроградном, направлениях; теория прогрессии и созревания самих цистерн в сочетании с ретроградным транспортом ферментов везикулами; модели, основанные на непрерывности соединений КГ; модели созревания и прогрессии мембранного домена содержащего транспортируемый белок.

Первые две модели имеют существенные недостатки. Везикулярная модель, предложенная Дж. Паладе (Farquhar M.G. and G.E. Palade, 1981) несколько десятилетий назад, кажется на первый взгляд простой, красивой, доказанной множеством исследований. Она предполагает концентрацию транспортируемых белков (карго) в покрытых, окаймленных почках (бадах), формирующихся на проксимальном (вышележащем) компартменте. Шейка бада схлопывается, и сформированная таким образом везикула, отщепляется, теряет свое белковое покрытие и переносит транспортируемые белки в следующую цистерну, сливаясь с ней. Она излагается во многих учебниках и руководствах на правах уже не гипотезы, а доказанной теории.

Тем не менее, с точки зрения везикулярной теории сложно объяснить отсутствие в везикулах многих известных транспортируемых молекул (альбумин, проинсулин, вирусные белки и др.), а также понять, как осуществляется транспорт таких больших молекулярных комплексов, как например, проколлаген, размеры которого в 5 раз превышают средний размер везикулы. Не менее сложно представить себе как везикула может найти нужный компартмент для стыковки и слияния. Основные исследования, послужившие доказательством везикулярной теории, были выполнены в условиях in vitro и методами биохимии. Однако разработанные в последнее время морфо-функциональные подходы позволяют усомниться с абсолютной "доказанности" везикулярной теории транспорта.

Классический вариант модели созревания и прогрессии цистерн предполагает, что транспортируемый белок, оставаясь в составе цистерны, постепенно направленно продвигается по стаку («стопке») КГ от цис-полюса к транс-полюсу. Такая прогрессия белка сопровождается возвратом (рециклингом) ферментов, который осуществляется везикулами, имеющими СОР I-покрытие (Glick B.S. at al. 1997; Glick B.S. and Malhotra V. 1998).

Данная модель тоже не может быть принята безоговорочно, т.к. последние исследования не выявили в везикулах повышенного содержания ферментов гликозилирования (Orci L. et al., 2000; Kweon H.S. et al., 2004), которые являются основным функциональным компонентом КГ. Между тем, согласно данной модели, эти ферменты в процессе транспорта должны рециклировать именно в составе везикул КГ. Модель созревания и прогрессии цистерн не может также объяснить рециклинг ферментов транс-цистерн (например, сиалилтрансферазы) (Mironov А.А. et al., 2005), поскольку на этой цистерне не образуются "СОР Г'-зависимые везикулы (Ladinsky M.S.et al., 1999).

Таким образом, несмотря на множество работ, посвященных моделям транспорта белков и липидов через КГ, до сих пор так и не сложилось единого мнения о механизме транспорта через эту органеллу.

Комплекс Гольджи состоит из трех основных типов структур: плоских цистерн имеющих в своем составе неперфорированную и перфорированную часть, тубул различного диаметра и везикул. В частности, следует отметить, что площадь поверхность тубул КГ и ассоциированных с ними перфорированных зон эквивалентна площади поверхности цистерн (Ladinsky M.S. et al., 1999). Существование такого большого, динамически изменяющегося домена КГ предполагает, что данное образование должно играть важную роль в процессе транспорта. В последнее время был опубликован ряд работ, выполненных, с использованием электронной томографии. Эти работы доказывают факт образования тубулярных соединений между цистернами комплекса Гольджи в клетках осуществляющих активный транспорт (Ladinsky M.S. et al., 1999; 2002; Trucco A. et al., 2004).

Однако вышеописанные соединения не были найдены в условиях блокирования транспорта (Тгиссо А. е1 а1., 2004).

На основании этого была предложена еще одна модель — перемещение транспортируемого белка (карго) по межцистернальным соединениям. Однако, если для карго, имеющего небольшие размеры и обладающего способностью к диффузии (например, альбумина), эти представления еще могут быть близкими к действительности, то для больших, не способных к диффузии белков, таких как агрегаты проколлагена I, размеры которых составляют 300 нм, гипотеза сталкивается с непреодолимыми трудностями — диаметр тубулярных соединений не превышает 50-60 нм. Несмотря на убедительные доказательства существования соединений между различными цистернами КГ, остается открытым вопрос: всегда ли данные соединения присутствуют на всех уровнях стопки цистерн КГ? Возможно, они существуют, в основном, между цистернами, к которым в этот момент присоединен мембранный переносчик транспортируемого белка.

Согласно модели созревания и прогрессии переносчика транспортируемых белков и липидов, обоснованию которой, собственно, и посвящена данная работа, предполагается, что образовавшийся на выходе из ЭР мембранный переносчик сливается с промежуточным компартментом и цис-цистерной КГ, формируя смешанный компартмент, так называемый «карго-домен». Он представляет собой динамичную мембранную структуру достаточно большого размера, в просвете и мембранах которой содержатся транспортируемые белки. Затем происходит сегрегация переносчика и его слияние с медиальным (срединным) компартментом комплекса Гольджи, что является сигналом для физического отделения данного мембранного переносчика от промежуточного компартмента и цис-цистерны. Такая же последовательность событий (слияние, смешивание, повторяющаяся сегрегация) происходит на других этапах транспорта через комплекс Гольджи. Один из возможных механизмов сегрегации белков при последовательном формировании и перемещении переносчиков базируется на известной разнице в толщине мембран на протяжении стака КГ.

Из этой модели можно вывести ряд следствий, которые поддаются экспериментальной проверке. Например, можно предположить, что во время прохождения мембранного домена, содержащего карго, по стаку, поочередно, на уровне его локализации, длина соответствующих цистерн должна увеличиваться (поскольку к ним добавляются мембраны), в то время как другие цистерны должны оставаться той же длины, что и до прихода карго. По результатам наблюдений за проходом карго по изолированным министакам, образованным под воздействием нокодазола, разница в длине между разноуровневыми цистернами в стопке КГ выявлена не была, однако мы смогли подтвердить увеличение длины цистерн при проходе карго (Trucco A. et al., 2004). Учитывая вышеописанные данные, оригинальная версия модели созревания и прогрессии мембранного переносчика белков может быть принята за основу, однако она требует существенного дополнения и переосмысления.

Более того, в литературе мы находим множество противоречий в описании структурны КГ. Так, например, по данным одних исследователей (Ladinsky M.S. et al., 1999) цис-цистерна не является перфорированной, что противоречит описанию данной структуры приводимой в других работах (Rambourg A. and Clermont Y., 1990, 1997). Кроме того в реконструкциях Ладинского (Ladinsky M.S. et al., 1999, 2002) около КГ отсутствуют везикулярно-тубулярные кластеры, которые служат местом выхода секретируемых белков из ЭР и являются промежуточным компартментом на пути транспорта из ЭР в КГ. Еще более противоречивыми выглядят данные о наличии множества везикул по данным одних авторов (Ladinsky M.S. et al., 1999; Marsh BJ. et al., 2001), и описание крайнего малого количества свободных везикул с точки зрения других (Rambourg A. and Clermont Y., 1990;. Trucco A. et al., 2004). He ясным остается описание последней цистерны и ее взаимотношение с вышележащими цистернами и транс-Гольджи сетью (Ladinsky M.S. et al., 1999).

Устранение этих противоречий путем детального анализа структурной организации КГ является необходимой основой для построения моделей функционирования и описание собственно структуры этой сложной органеллы в зависимости от интенсивности транспорта. В нашей работе путем комплексного применения современных методов исследования, а именно: флуоресцентной, лазерной конфокальной микроскопии, электронно-микроскопической техники, включающей иммуномечение и ЭМ-томографию, а так же коррелятивную микроскопию, мы попытаемся частично решить выше описанные противоречия.

Цель работы - анализ механизмов транспорта белков через комплекс Гольджи и разработка на его основе содержательной модели, позволяющей согласовать результаты современных исследований, посвященных изучению переноса через комплекс Гольджи.

Задачи исследования включали:

1. Изучение путей, скорости и механизмов перемещения мембранных и растворимых белков различной молекулярной массы и размера через комплекс Гольджи.

2. Разработку методологического подхода, позволяющего совместить изучение ультраструктуры и трехмерной организации мембранных переносчиков белков в комплексе Гольджи с исследованием кинетики их транспорта в живой клетке.

3. Ультраструктурный анализ трехмерной организации путей переноса протеинов через комплекс Гольджи.

4. Выявление зависимости структуры комплекса Гольджи и распределения его ферментов от интенсивности транспорта белка.

5. Создание на основе полученных экспериментальных данных и современных молекулярно-биологических представлений эффективной модели транспорта белков через комплекс Гольджи.

Основные положения, выносимые на зашиту.

1. Существующие в настоящее время модели транспорта белков через комплекс Гольджи пересмотрены с учетом результатов исследований, основанных на новых, разработанных нами, методологических подходах.

2. Комплекс Гольджи следует рассматривать как весьма динамичную мембранную органеллу, структура которой, в значительной мере определяется интенсивностью синтеза и транспорта белков.

3. Скорость и механизмы перемещения мембранных и растворимых белков через комплекс Гольджи (от момента входа до момента выхода из данной органеллы) не зависят от молекулярной массы и размера транспортируемых белков.

4. Ферменты, характерные для каждого компартмента комплекса Гольджи, отсутствуют или содержатся в низких концентрациях в СОР I - везикулах и локализуются, преимущественно, в перфорированных зонах на краях цистерн комплекса Гольджи.

5. Межцистернальные тубулярные сообщения открывают возможность рециркуляции ферментов комплекса Гольджи и их возврата в проксимальный компартмент посредством латеральной диффузии в мембранах.

6. Созревание и прогрессия мембранного переносчика транспортируемого белка являются основными механизмами транспорта через комплекс Гольджи. Модель прогрессии мембранного домена, содержащего транспортируемые белки, наиболее полно отражает процесс транспорта на данном участке секреторного пути.

Научная новизна.

Предлагаемая работа представляет собой специальное комплексное исследование с применением частично модифицированных и вновь разработанных нами современных технологий клеточной биологии, основанных на синхронизации транспорта белков через пластинчатый комплекс, световой и электронной микроскопии в сочетании с электронной томографией и трехмерной реконструкцией ультраструктур. В работе впервые продемонстрировано, что:

1) Везикулярная модель транспорта белков через пластинчатый комплекс не верна, т.к. отсутствует концентрация транспортируемых молекул белка в СОР1-везикулах;

2) Скорости транспорта для образующего крупные молекулярные агрегаты белка проколлагена и для легко диффундирующего мембранного в-протеина вируса везикулярного стоматита (УЗУС) одинаковы;

3) Путем выполнения трехмерной реконструкции комплекса Гольджи на основе электронно-микроскопической томографии образцов, фиксированных с помощью сверхбыстрого замораживания, была поставлена под сомнение теория, основанная на мегавезикулах, т.к. в результате проведенных исследований не было выявлено мегавезикул, а точнее мембранных расширений, содержащих проколлагеновые макромолекулярные агрегаты, которые были бы совершенно изолированы от других мембранных структур;

4) В работе опровергнута классическая модель созревания и прогрессии цистерн, предполагающая рециклинг ферментов гликозилирования, локализующихся в аппарате Гольджи. Основанием послужили данные о крайне низкой концентрации ферментов гликозилирования в СОР1-везикулах;

5) Проведен комплексный экспериментальный анализ и дано обоснование модели прогрессии через комплекс Гольджи мембранного переносчика, содержащего транспортируемые белки. В результате было показано, что данная модель наиболее полно соответствует имеющимся экспериментальным наблюдениям.

Научно-практическое значение.

Экспериментальные данные, полученные при проверке существующих моделей транспорта через комплекс Гольджи, представляют собой не только теоретическую базу для понимания истинных механизмов транспорта на этом участке секреторного пути. Они позволяют начать целенаправленный поиск новых лекарственных средств для лечения заболеваний, механизмы которых связаны с нарушениями транспорта через пластинчатый комплекс.

Создание модели транспорта белков через комплекс Гольджи дает возможность проверки уже существующих специфических лекарств, способных оказывать строго направленное воздействие на транспорт определенного белка и существенно снизить затраты на проведение исследований по созданию экспериментальных систем для тестирования лекарственных средств. Таким образом, эта модель может стать полезным инструментом не только в клеточной и молекулярной биологии, но и в фармакологии. Содержащиеся в работе фактический материал, выводы и положения могут быть широко использованы в преподавании соответствующих разделов клеточной биологии и цитологии.

Они используются в учебном процессе на кафедрах гистологии и эмбриологии лечебного и педиатрического факультетов РГМУ, на кафедре химии, биологии и экологии Шуйского государственного педагогического университета. Разработанные нами новые методы ультраструктурного исследования применяются в Институте эволюционной физиологии и биохимии им. И.М.Сеченова РАН и в Институте цитологии РАН.

Заключение Диссертация по теме "Гистология, цитология, клеточная биология", Безнусенко, Галина Владимировна

ВЫВОДЫ

1. Результаты изучения кинетики и топологии переноса различных белков через комплекс Гольджи, полученные с помощью взаимодополняющих методов: флуоресцентной (лазерной конфокальной) микроскопии и иммуно-электронномикроскопической техники, свидетельствуют о том, что существующие в настоящее время модели транспорта белков вдоль экзоцитозного пути нуждаются в существенном пересмотре.

2. Как показали эксперименты с различными протоколами синхронизации транспорта, белки, существенно отличающиеся по своим характеристикам — размерам, положению и принадлежности (проколлаген I и в-белок вируса везикулярного стоматита (УБУв)), доставляются к комплексу Гольджи из эндоплазматической сети практически одновременно и проходят через данную органеллу с равными скоростями.

3. Крупные секреторные белки (проколлаген I) и небольшие мембранные протеины (УБУв) колокализуются в процессе переноса через комплекс Гольджи в одних и тех же компартментах и цистернах.

4. Трехмерное реконструирование комплекса Гольджи на основе данных ЭМ томографии и иммуно-электронномикроскопических исследований не выявило крупных везикулярных переносчиков (мегавезикул) и не подтвердило их участие в транспорте на данном участке секреторного пути.

5. Небольшой мембранный белок УБУв при умеренной стимуляции транспорта проходит через комплекс Гольджи, последовательно перемещаясь по цистернам в направлении от цис - к транс- полюсу. При увеличении объема транспортируемого белка отмечается более пологий градиент его концентрации, с максимумом в цистернах соответствующего компартмента.

6. Несмотря на различия по основным характеристикам (размерам, диффузионной способности, положению в просвете или в мембране), исследованные белки (проколлаген I, VSVG, секретируемая пероксидаза хрена в трансфектируемых клетках) совершенно исключаются из СОР I-окаймленных везикул или содержатся в них в низких концентрациях.

7. Вышеперечисленные результаты позволяют утверждать, что доминирующая в настоящее время «везикулярная гипотеза» переноса белков-карго через комплекс Гольджи с помощью СОР 1-окаймленных везикул не может быть достаточно обоснована.

8. Неправомочность гипотезы созревания и прогрессии цистерн, последовательно переносящих модифицируемые белки, подтверждается результатами, полученными при исследованиях «in vivo» и «in vitro» в бесклеточной системе:

-СОР I - кайма выявляется не только в везикулах и бадах, но и, в перфорированных зонах цистерн стопок комплекса Гольджи; -как показали результаты трехмерной реконструкции, округлые мембранные профили, содержащие ферменты комплекса Гольджи, являются не СОР I везикулами, а сечениями тубул, связанных с перфорированными зонами цистерн;

-ферменты, характерные для каждого компартмента комплекса Гольджи отсутствуют или содержатся в низких концентрациях в СОР I везикулах и в образующих их окаймленных бадах, но локализуются, преимущественно, в перфорированных зонах на периферии цистерн.

9. Трехмерные реконструкции на основе данных ЭМ томографии выявили непрерывные тубулярные коммуникации между различными цистернами стопки комплекса Гольджи и между стопками. Эти сообщения открывают возможность рециркуляции ферментов комплекса Гольджи и их возврата в проксимальный компартмент посредством диффузии в просвете и латеральной диффузии в мембранах. Структура комплекса Гольджи и частота непрерывных коммуникаций между его цистернами зависят от интенсивности транспорта белков через данную органеллу.

10. В качестве модели, наиболее отвечающей современным данным о переносе белков через комплекс Гольджи, представлена модель прогрессии мембранного домена, содержащего транспортируемые белки. В соответствии с этой моделью, мембранный домен последовательно переносится от цистерны к цистерне, при использовании молекулярных механизмов, обеспечивающих слияние и разделение мембран. Это позволяет обеспечить доступ белков-карго к резидентным ферментам комплекса Гольджи в соответствующем компартменте и, тем самым, их созревание (модификацию). Прогрессия мембранного домена регулирует образование непрерывных тубулярных сообщений между соответствующими компартментами комплекса Гольджи.

11. В соответствии с предложенной моделью прогрессии мембранного домена, комплекс Гольджи следует рассматривать как весьма динамичную мембранную органеллу, актуальная структура которой, в значительной мере, зависит от интенсивности синтеза и транспорта белков.

Заключение.

Морфо-функциональные принципы транспорта через комплекс Гольджи, несмотря на долгие годы исследований, остаются неясными, что весьма затрудняет понимание молекулярных механизмов регуляции транспорта. Однако, благодаря новым подходам и технологиям морфология комплекса Гольджи (КГ) из описательной науки превратилась в динамичную, способную понять изменения данной органеллы во времени и пространстве, как в нормальных, физиологических условиях, так и в сложных экспериментальных системах. В данной работе приведены основные положения концепции внутри-Гольджи транспорта, а так же анализ основных моделей этого процесса.

Понимание процесса переноса вновь синтезированных в эндоплазматическом ретикулюме протеинов к местам их непосредственного применения стало основной задачей клеточной биологии на протяжении последних десятилетий. Ключевым решением данной проблемы стало применение новых морфологиеских технологий в комбинации с точными синхронизационными протоколами внутри-Гольджи транспорта.

Суммируя накопленные клеточной биологией данные о структуре и динамике мембран секреторного пути, приходишь к пониманию того факта, что произошедший в последние годы значительный скачек в молекулярной биологии не сопровождался углублением знаний о строении и функции органелл. Причинами такой ситуации, вероятно, стали "исторические" и технологические факторы, замедлившие прогресс в данном направлении. К "историческим" факторам следует отнести многолетнее господство везикулярной теории (Palade G., 1997). Предложенная Дж. Палладе, благодаря своей простоте и элегантности, подкрепленная в основном лишь исследованиями на молекулярном уровне "in vitro", однако принятая как догма, данная теория оказала сдерживающее влияние на разработку новых моделей транспорта. Однако, несмотря на множество исследований, открытий новых молекул, справедливость везикулярной теории так и не была доказана на живых клетках. Отсутствовал так называемый критический эксперимент, показывающий "in vivo" каким образом происходит перемещение молекул, покидающих, например, компартмент А, и входящих в СОР I - окаймленные везикулы, и как они, отпочковываясь, сливаются и перемещаются в компартмент В. Наконец, наибольшую трудность представляла собой задача создания доступных экспериментальных технологий, позволяющих ответить на эти и многие другие вопросы, посвященные внутриклеточному транспорту. Так, например, движение карго на пути от ЭР к Гольджи было характеризовано на светооптическом уровне благодаря появлению методов наблюдения живых клеток, однако из-за недостаточной разрешающей способности трудно было понять, какую органеллу приставляет та и ли иная движущаяся флуоресцентная частица (Griffiths G. et al., 1993). Электронная микроскопия, как подход к изучению ультраструктурного строения клетки, весьма статична и не позволяет следить за процессами в динамике, она двумерна, и не способна отразить тонкие детали строения органелл в трехмерном пространстве.

В последние несколько лет с развитием новых технологических подходов в сфере изучения внутриклеточного транспорта и накоплением фактов становится все более видимой несостоятельность везикулярной модели, не способной дать им объяснение (Mironov A. et al., 1997; Bannykh S.I. et al, 1997; Glick B.S. and Malhotra V., 1998; Griffiths G., 2000). Необходимость переосмысления уже имеющихся и вновь полученных данных определяет интерес к разработке новых методик по изучению внутриклеточного транспорта. Исключительно быстрое развитие световой микроскопии в последние годы обусловлено постановкой методов с использованием конструкций с зеленым флуоресцентным протеином (green fluorescent protein (GFP)) при изучении живых клеток (Lippincott-Schwartz J. et al, 2001), так же разработанной в лаборатории Стефана Хелла (S. Hell) нового типа светового микроскопа (STED

4Pi), позволяющего значительно увеличить разрешающую способность за счет разрушения дифракционного барьера путем открытия новых принципов интерференции для лазерного луча. Данный микроскоп позволил добиться визуализации органелл в клетке с ультравысоким для световой микроскопии разрешением - 100 нм на живых клетках и до 50 нм в фиксированных (Hell S., 2003). Другой современной технологией, позволившей наблюдать взаимодействие протеинов " in vivo "(с разрешением до 6 нм), стал FRET (fluorescent resonance energy transfer) (Ballestrem C. and Geiger В., 2004; Meng J.J.et al., 2004; Vereb G. et al., 2004). Несмотря на появление этих новых инструментов световой микроскопии, она так и не достигла уровня разрешения ЭМ, однако, имеет неоспоримое достоинство, а именно, возможность динамического наблюдения.

Разработанный в нашей лаборатории метод коррелятивной микроскопии сделал возможным сочетание двух подходов к изучению внутриклеточного транспорта: видео-световой микроскопии и ЭМ. Это позволило, нивелируя их недостатки (Mironov A.A., et al, 2000) и в полной мере используя преимущества, добиться одновременного мониторинга динамики и ультраструктуры (Polishchuk R.S. et al., 2000, Deerinck T.J. et al., 1994). Коррелятивная микроскопия в сочетании с электронной томографией с последующей трехмерной реконструкцией химически фиксированных препаратов и препаратов после криофиксации позволила получить новые данные о тонком строении внутриклеточных структур, например, о существовании тубулярных соединений между компартментами. (Мс Intosh J.R., 2001; Koster, A.J., et al., 1997; Ladinsky M.S.et al., 1999; Mironov A.A., et al., 2001). Следующим важным этапом в работе по изучению механизмов транспорта явилась разработка и усовершенствование протоколов синхронизации, а так же специализированных синхронизированных клеточных систем (Bonfanti L. et al., 1994; Mironov A.A. et al., 2001,; Volchuk A., 2000). Таким образом, анализирую результаты исследования, полученные с помощью вышеописанных новых методов и технологий, нам удалось показать, что везикулярный транспорт (даже если допустить вероятность существования антроградного везикулярного транспорта) не является основным механизмом транспорта на участке КГ, что обусловило необходимость новых интерпретаций и построение новых моделей организации внутриклеточного транспорта.

Однако, для понимания того, как же на самом деле секретируемый материал проходит через Гольджи стак, необходимо было сначала детально изучить строение самого КГ, который, несмотря на неисчислимое количество работ остается малоизученным, особенно в момент прохождения карго. Попытки систематизации и анализа данных о строении КГ, а так же резидентных белков участвующих в транспорте через Гольджи (Beznoussenko G.V.i Mironov A.A., 2002; Polishchuk R.S. and Mironov A.A., 2004) позволили приблизиться к пониманию морфо-функциональных принципов транспорта на данном этапе экзоцитозного пути. Одним из наиболее приемлемых способов движения в этом направлении стал для нас метод моделирования работы КГ на основе экспериментальных данных.

Начало переосмысления основ везикулярной модели, которая за последние десятилетия стала "везикулярной парадигмой", было положено работами, демонстрирующими, что большие агрегаты проколлагена I (PC I) не способны входить в СОР I- везикулы (размеры агрегатов проколлагена I в 5-6 раз превышают размер СОР I-везикулы), и транспортируются через Гольджи стак, не покидая просвет цистерн (Mironov A.A. et al., 2001; Bonfanti L.,et al., 1998). Тем самым подрывались основы везикулярной модели (Orci L. et al., 1986). Логично было бы предположить, что большие агрегаты проколлагена I (PC I) являются исключением из правил, а более мелкие молекулы могут транспортироваться везикулами. Однако, мы показали, что 5060 нм везикулы обеднены и другими карго-протеинами (см. Табл. 3), причем как в интактных клетках (Trucco А. et al., 2004) так и при проведении экспериментов с использованием синхронизационных протоколов ((Mironov A.A. et al., 2001). Анализируя полученные нами результаты экспериментов и данные других исследователей можно прийти к выводу, что пока не найдено ни одного типа карго-протеина, для которого был бы экспериментально доказан транспорт через Гольджи стак в составе везикул, или его концентрация в их просвете. Нами было показано, что не зависимо от размеров и способности к диффузии (недиффундирующие большие агрегаты проколлагена I и дуффундирующие маленькие молекулы VSVG) проходят через Гольджи с одинаковой скоростью и при этом не входят ни в СОР I-везикулы, ни в мегавезикулы (Mironov A.A. et al., 2001). Таким образом, нами была экспериментально доказана несостоятельность везикулярной модели для различных по дуффузионнной мобильности типов карго.

Классический вариант модели созревания и прогрессии цистерн предполагает, что карго, оставаясь в составе цистерн постепенно направленно продвигается по стаку от цис-полюса к трансполюсу. Такая прогрессия карго сопровождается рециклингом ферментов, который осуществляется СОР I-везикулами (Glick B.S. and Malhotra V., 1998; Glick B.S. at al., 1997), а, следовательно, COP I-везикулы должны быть обогащены ферментами Гольджи, во всяком случае, они не должны быть обеднены данными ферментами. Другими словами, концентрация ферментов в СОР I-везикулах хотя бы не должна быть ниже таковой в цистернах (Glick B.S. and Malhotra V.,

1998). В литературе можно найти работы в поддержку данной гипотезы (Martinez-Menarguez, J.A. et al., 2001), показывающие, что определенная популяция окаймленных круглых профилей (авторы расценили их как СОР I-везикулы), содержат фермент Гольджи маннозидазу II "in vivo" в концентрации, близкой к концентрации данного фермента в цистернах. Другая группа исследователей (Lanoix J., et al, 2001) обнаружила в экспериментах, проведенных "in vitró", что после инкубации изолированных Гольджи мембран с цитозолем и GTP, маленькие мембранные фрагменты, формирование которых зависит от работы СОР I покрытия и функции ARF 1 и содержащие в своем составе какую-то часть СОР I везикул, были обогащены ферментами Гольджи (Lanoix J. et al, 2001). Однако принять модель созревания и прогрессии цистерн в данном варианте не представляется возножным по ряду причин. А именно, 1) концентрация фермента маннозидазы II, обнаруженная в везикулах не превышает таковую в цистернах (Martinez-Menarguez J.A. et al., 2001); 2) в нашей работе и ряде работ других лабораторий был продемонстрировано обеднение круглых профилей, находящихся в непосредственной близости к КГ, ферментом маннозидазой II (Orci L.et al., 2000; Cosson P. at al., 2002; Kweon H.S. et al., 2004); 3) нами было показано, что значительная часть круглых профилей в зоне Гольджи, содержащие Гольджи фермент маннозидазу II, представляют собой поперечные срезы тангенциальных тубул или перфорированных зон цистернальных римов; 4) маннозидаза II стала единственным эндогенным ферментом, наличие которого в круглых профилях было показано "ш vivo" и "in vitro" (Martinez-Menarguez J.A. et al., 2001; Lanoix J. et al, 2001). Напротив, в ходе проведенного нами детального анализа экспериментов "ш vivo" и "ш v/íro" по локализации многих ферментов Гольджи было выявление обеднение истинных СОР I- везикул всеми ферментами (Kweon H.S. et al., 2004), что соответствует и данным других исследователей (Orci L.et al., 2000; Cosson P. at al., 2002).

Согласно модели созревания и профессии цистерн СОР I-бады, а следовательно, и СОР I-везикулы, должны формироваться на всех цистернах Гольджи от цис- до транс-стороны для осуществления рециклинга ферментов и поддержания таким образом полярности расположения ферментов. Однако СОР I-бады не были найдены на транс-цистерне (Ladinsky M.S., et al., 1999; Ladinsky M.S., et al., 2002), в то время как ряд ферментов, например, сиалилтрасфераза и фукозилтрансфераза присутствуют в транс-цистерне (Rabouille et al, 1995). Модель созревания и прогрессии цистерн предполагает, что выход карго должен осуществляться только из последней трансцистерны, однако ранее было показано, что карго может покидать Гольджи из трех последних цистрн (Ladinsky M.S. et al., 2002). Аналогичное несоответствие между данной моделью и результатами исследований наблюдается и при описании процесса входа карго в КГ. Теоретически можно представить минимум два сценария этого процесса. Первый из них, новая цис-цистерна формируется из вновь прибывающих мембран, путем из слияния между собой, а второй сценарий подразумевает слияние прибывающих мембран с карго с уже существующими цистернами Гольджи. Наши данные показали, что ЭР-Гольджи переносчики карго могут сливаться сразу с двумя или тремя уже существующими цистернами на цис-полюсе КГ, лишь частично принимая участие в формировании первой цис-цистерны (Тгиссо А. е1 а1., 2004), что противоречит первому сценарию, а, следовательно и самой модели созревания и прогрессии цистерн. Поэтому данная модель не может быть принята, по крайней мере, в ее классическом варианте, и должна быть пересмотрена.

Отсутствие в СОР 1-зависимых везикулах и карго-протеинов и ферментов Гольджи заставило нас задуматься над тем, какие же структурные элементы выполняют важнейшую функцию перемещения карго через стопку цистерн КГ. Одним из наиболее вероятных кандидатов на эту роль, несомненно, являются межцистернальные тубулярные соединения, детальное изучение которых стало доступным благодаря применению такой новой технологии как электронная томография. Другим интересным моментом, обусловившим такой интерес к данным структурам, стала серия наблюдений, указывающих на увеличение количества межцистернальных тубулярных соединений при активном транспорте (Trucco A. et al., 2004; March B.J. at al., 2004). С другой стороны, когда транспорт был ингибирован путем низкотемпературных блоков или воздействием циклогексамида, тубулярные соединения исчезали ((Trucco A. et al., 2004). Таким образом, такая тесная зависимость образования межцистернальных тубулярных соединений от транспорта позволяет предполагать фундаментальную роль данных структурных элементов в процессе прогрессии карго через стак и требует кардинального пересмотра существующих и возможных моделей с учетом этого факта.

В последние годы был предложен ряд моделей, указывающих на возможную роль мембранных соединений между гетерогенными цистернами КГ в перемещении карго через КГ (Mironov А.А., et al., 1997; Griffiths G. et al., 2000; Mironov A.A., et al., 1998). Однако, если для карго, имеющего меленькие размеры и обладающего способностью к диффузии, эти модели могут, представляются весьма близкими к действительности, то для больших, неспособных к диффузии, таких как агрегаты проколлагена I, размеры которых составляют 300 нм, они сталкиваются с непреодолимыми трудностями, т.к. диаметр тубулярных соединений не превышает 5060 нм.

Согласно модели созревания цистерн, основанной на рециклинге ферментов по тубулярным соединениям, на этапе ЭР-Гольджи транспорта переносчики карго по прибытию в зону КГ сливаются с двумя первыми цистернами на цис-полюсе стака. Это приводит к активации механизмов, ответственных за образование межцистернальных тубулярных соединений и образованию таких соединений на всех уровнях Гольджи стака. Часть промежуточного компартмента формирует новую цистерну на цис-полюсе, а другая его часть сливается с уже существующими цистернами. Прогрессия карго (проколлагена I и УБУв) согласно данной модели осуществляется тем же самым способом, который описывает классическая модель созревания цистерн, т.е. сформированные на цис-полюсе созревшие при проходе через стак цистерны отправляются с транс-полюса. Отличие состоит только в способе рециклинга ферментов, который в классической модели созревания цистерн представлен ретроградным транспортом ферментов в составе СОР I- везикул, а согласно данной модели осуществляется по тубулярным соединениям обусловленный раличными физико-химическими условиями внутри разных цистернах КГ. Предполагается, что три основных механизма вносят свой вклад в процесс образования новой цис-цистерны. Первым из их является постоянное прибытие в Гольджи стак мембран из промежуточного компартмента с последующим формированием соединений между новой и старой (существовавшей до прибытия карго) цистернами. Вторым - ретроградное перемещение мембран из дистальной цистерны во вновь формирующуюся цис-цистерну по тубулярных соединениям. Косвенным доказательством существования ретроградных тубул, явились наблюдения, полученные в ходе исследования матриксного белка GM 130 на живых клетках (Marra Р. et al., 2001), продемонстрировавшие рост и движение тубул, покрытых этим белком от ГК. Впоследствии для таких тубул была предположена роль в формировании цис-систерны, происходящем путем захвата с последующим слиянием тубул с промежуточным компартментом. Согласно данной гипотезе матриксные протеины, такие как GM 130, способствуют трансформации тубул в плоскую цистерну (диск). Карго исключается из растущих ретроградных тубул, однако, Гольджи ферменты могут ретроградно двигаться по тубулам через весь стак, от транс-цистерны до цис-цистрены, синхронно с процессом формирования и поглощения цистерн. Третий механизм образования цис-цистерны предстявляет собой сочетание первой и второй моделей.

Осмысление факта, почему механизм движения по межцистернальным тубулярным соединениям не функционирует для таких карго-протеинов как проколаген I и VSVG, представляется на сегодняшний день крайне сложной задачей. И если для агрегатов проколлагена I логично предположить, что они, имея средний размер 300 нм просто не могут пройти в тонкие тубулы, то для маленьких молекул УБУв должна быть другая причина, ограничивающая их движение по тубулам, которая остается неясной. Известно, что УБУв может, находясь в цистерне формировать кластеры (Ога Ь.,е1 а1., 1986), если предположить, что данные кластеры слишком велики и ригидны чтобы войти в просвет тубул, то причина становится понятной. Однако, согласно результатам наших исследований и данным других исследователей (Мнопоу А. а1., 1997; \Veidman РЛ. 1995; ШгесЫзе^ К. е1 а1., 1998) некоторые виды карго (маленькие протеины, демонстрирующие быструю свободную диффузию по КГ и липиды) способны свободно перемешаться по межцистернальным тубулярным соединениям.

До настоящего времени неясным остается механизм поддержания полярности расположения ферментов в стаке. Единственной гипотезой, объясняющей этот феномен может стать гипотеза основанная на наличии в каждой цистерне особых физико-химических условий, оптимальных для определенной группы ферментов и малоприемлемых для других. Такими физико-химическими условиями могут быть толщина липидного бислоя цистернальных мембран и его липидная композиция (наличие холестерола и сфинголипидов), определенная кислотность среды (рН), а так же композиция межцистерналыюго матрикса. По всей видимости, свой вклад в поддержание полярности расположения ферментов в Гольджи стак вносят различные факторы, нельзя ислючить и роль соседних компартментов (ЭР-Гольджи промежуточного компартмента и эндосомальной системы). Известно, что цис-полюс обменивается мембранными элементами с промежуточным компартментом (Pelham H.R. 1991), а транс- полюс -с эндосомальной системой (Mukherjee S. et al.,1998). Эти два соседствующие с КГ компартмента значительно отличаются друг от друга по описанным нами выше физико-химическими характеристикам и не могут не оказывать слияние не изменение баланса среды и мембранного состава, тесно взаимодействующих с ними полюсов Гольджи стака, а этим, следовательно, и может быть обусловлен градиент между данными полюсами (цис - и транс-Гольджи). Особенно, прибытие с транс-стороны толстых мембран может способствовать ретроградной миграции Гольджи ферментов, а опустошенный от ферментов мембранный домен на транс-стороне, содержащий зрелое карго, подготавливается, таким образом, к отправке на плазматическую мембрану. Таким образом, ретроградный поток Гольджи ферментов "автоматически" синхронизируется с антроградным движением карго через Гольджи стак, как и согласно модели созревания цистерн. Другим фактором, который может вносить вклад в организацию полярности ферментов является синтез сфинголипидов, происходящий одновременно с прогрессией транспорта (Holthuis L.S. et al., 2001). Таким образом, открытие механизмов, участвующих в образовании полярности распределения Гольджи ферментов, является необходимым условием принятия модели созревания цистерн, основанной на рециклинге ферментов по тубулярным соединениям. Несмотря на убедительные доказательства существования соединений между различными цистернами КГ, остается открытым вопрос: всегда ли данные соединения присутствуют на всех уровнях Гольджи стака, не смотря на уровень прогрессии карго? Наши наблюдения показали, что агрегаты проколлагена I и молекулыУБУС проходят через стак с одинаковой скоростью (Mironov A.A. et al., 2001), что дает возможность предположить связь только между цистернами, к которым в этот момент присоединен карго-домен.

Мы полагаем, что наиболее вероятной и обоснованной моделью транспорта через КГ, является модель созревания переносчика (Mironov A. at al. 2001; Beznoussenko G. and Mironov A. 2002). Данная модель не противоречит результатам исследований. Более того, эти результаты можно считать убедительным подтверждением эффективности предлагаемой модели. Согласно модели созревания и прогрессии мембранного переносчика после прибытия транспортируемых молекул в промежуточный компартмент и цис-сеть комплекса Гольджи активируется процесс слияния СОР I-везикул с цистернами, что приводит к восстановлению способности цистерн к слиянию и образованию межцистернальных соединений (Миопоу А. гА., 2005). Непрерывность мембран цистерн КГ обеспечивает диффузию липидов и позволяет достигнуть их быстрого перераспределения, что ведет к выравниванию длины цистерн (Тгиссо А. е1 а1., 2004). Мембранный переносчик, транспортирующий секретируемые белки, сливается вначале с медиальми цистернами, а затем с транс-цистернами. Таким образом, перемещение (прогрессия) карго происходит без его диссоциации от цистерн, в крупных, отличных от везикул, мембранных переносчиках, всегда связанных с цистернами КГ тубулярными коммуникациями (Мпопоу А. е1 а1, 2001). Лишь частичное «перемешивание» с ферментами КГ, концентрация которых особенно велика на краях цистерн (К\уеоп Н-Б. е1 а1., 2004), доказывает существование карго-домена, сохраняющего свою идентичность при его переносе через стопку цистерн КГ и доступного для ферментов гликозикирования. Заключительное слияние с транс-сетью, по всей вероятности, имеет важное значение для подготовки переносчика к следующему этапу транспорта: от комплекса Гольджи к плазматической мембране. Однако регуляция пост-Гольджи транспорта заслуживает специального исследования.

Библиография Диссертация по биологии, доктора биологических наук, Безнусенко, Галина Владимировна, Москва

1. Банин В.В. Куда ведет "путь Гольджи"? (к 100-летию открытия комплекса Гольджи) // Морфология 1999. - Том. 115. - №3. - С. 90-7.

2. Миронов А.А., Комиссарчик Я.Ю., Миронов А.А. Мл., Снигиревская Е.С., Луини А. Современные представления о структуре и функции пластинчатого комплекса // К столетию открытия Камилло Гольджи // Цитология 1998. - Том. 40. - №6. - С. 483-496.

3. Снигиревская Е.С., Соколова Ю.Я., Комиссарчик Я.Ю. Структурно-функциональная организация аппарата Гольджи // Цитология- 2006. -Том. 48. -№1. С. 483-496.

4. Acharya U., Jacobs R., Peters J.M., Watson N., Farquhar M.G., Malhotra V. The formation of Golgi stacks from vesiculated Golgi membranes requires two distinct fusion events // Cell 1995. - Vol. 82. -P. 895-904.

5. Achler C., Filmer D., Merte C., Drenckhahn D. Role of microtubules in polarized delivery of apical membrane proteins to the brush border of the intestinal epithelium // J. Cell Biol. 1989. - Vol. 109. - P. 179-189.

6. Alcalde J., Bonay P., Roa A., Vilaro S., Sandoval I. V. Assembly and disassembly of the Golgi complex: two processes arranged in a cis-trans direction // J. Cell Biol. 1992. - Vol. 116. - P. 69-83.

7. Allan D. and K. J. Kallen. Is plasma membrane lipid composition defined in the exocytic or the endocytic pathway? // Trends in Cell Biol. -1994.-№4.-P. 350-353.

8. Allan V.J., and T.E. Kreis. A microtubule-binding protein associated with membranes of the Golgi apparatus // J. Cell Biol. 1986. - Vol. 103. -P. 2229-2239.

9. Aniento F., Gu F., Parton R.G., Gruenberg J. An endosomal beta COP is involved in the pH-dependent formation of transport vesicles destined for late endosomes // J. Cell Biol. 1996. - Vol. 133. - P. 29-41.

10. Antonny B. and R. Schekman. ER export: public transportation by the COPII coats // Curr. Opin. Cell Biol. 2001. - № 4 - P. 438-443.

11. Aridor M., Bannykh S.I., Rowe T., Balch W.E. Sequential coupling between COPII and COPI vesicle coats in endoplasmic reticulum to Golgi transport // J. Cell Biol. 1995. - Vol. 131. - P. 875-93.

12. Aridor M., Bannykh S I., Rowe T., Balch W.E. Cargo can modulate COPII vesicle formation from the endoplasmic reticulum // J. Biol Chem. -1999. Vol. 274. - P.4389-4399.

13. Aridor M., Fish K.N., Bannykh S., Weissman J., Roberts T.H., Lippincott-Schwartz J., Balch W.E. The Sari GTPase coordinates biosynthetic cargo selection with endoplasmic reticulum export site assembly // J. Cell Biol. 2001. - Vol. 152. P. - 213-229.

14. Aridor M., Weissman J., Bannykh S., Nuoffer C., Balch W. E. Cargo selection by the COPII budding machinery during export from the ER // J. Cell Biol. 1998. - Vol. 141. - P. 61-70.

15. Ayala J. Transport and internal organization of membranes: vesicles, membrane networks and GTP-binding proteins // J. Cell Sci. 1994. Vol. 107.-P. 753-763.

16. Balch W.E., Dunphy W.G., Braell W.A., Rothman J.E. Reconstitution of the transport of protein between successive compartments of the Golgi measured by the coupled incorporation of N-acetylglucosamine // Cell 1984.-Vol. 39. P.-405-416.

17. Balch W.E., Glick B.S., Rothman, J.E. Sequential intermediates in the pathway of intercompartmental transport in a cell-free system //Cell 1984. -Vol. 39.-P. 525-536.

18. Balch W.E., Michael McCaffery J., Plutner H., Farquhar M.G. Vesicular Stomatitis Virus Glycoprotein is sorted and concentrated during export from the endoplasmic rericulum // Cell 1994. - Vol. 76. - P. 841852.

19. Band A.M., Maatta J., Kaariainen L., Kuismanen, E. Inhibition of the membrane fusion machinery prevents exit from the TGN and proteolytic processing by furin // FEBS Lett. 2001. - Vol. 505. - P. 118 -124.

20. Bannykh S.I., and W.E. Balch. Membrane dynamics at the endoplasmic reticulum-Golgi interface // J. Cell Biol. 1997. - Vol. 138: -P. 1-4.

21. Barnard R.J., Morgan A., Burgoyne R.D. Domains of alpha-SNAP required for the stimulation of exocytosis and for N-ethylmalemidesensitive fusion protein (NSF) binding and activation // Mol. Biol. Cell. 1996. - № 7.-P. 693-701.

22. Bannykh S.I., Nishimura N., Balch W.E. Getting into the Golgi // Trends in Cell Biol. 1998. - № 8. - P. 21-25.

23. Barr F.A. Inheritance of the endoplasmic reticulum and Golgi apparatus // Curr. Opin. Cell Biol. 2002. - № 14. - P.496-499.

24. Barr F.A., Nakamura N., Warren G. Mapping the interaction between GRASP65 and GM130, components of a protein complex involved in the stacking of Golgi cisternae // EMBO J. 1998. - Vol. 17. - P. 3258-3268.

25. Barr F.A., Puype M., Vandekerckhove J., Warren G. GRASP65, a protein involved in the stacking of Golgi cisternae // Cell 1997. - Vol. 91. - P. 253-262.

26. Barr F.A. and B. Short. Golgins in the structure and dynamics of the Golgi apparatus // Curr. Opin. Cell. Biol. 2003. - Vol. 15. - P. 405-413.

27. Becker B., Bolinger B., Melkonian M. Anterograde transport of algal scales through the Golgi complex is not mediated by vesicles // Trends Cell Biol. 1995. -№ 5. - P. 305-307.

28. Beckers C.J., Keller D.S., Balch W.E. Semi-intact cells permeable to macromolecules: use in reconstitution of protein transport from the endoplasmic reticulum to the Golgi complex // Cell 1987. - Vol. 50. - P. 523-534.

29. Bednarek S.Y., Ravazzola M., Hosobuchi M., Amherdt M., Perrelet A., Schekman R., Orci L. COPI- and COPII-coated vesicles bud directly from the endoplasmic reticulum in yeast // Cell. 1995. - Vol. 83. - P. 1183-1196.

30. Bergmann J.E. Using temperature-sensitive mutants of VSV to study membrane protein biogenesis // Methods Cell Biol., 1989. - Vol. 32. - P. 85-110.

31. Beznoussenko G.V. and A.A. Mironov. Models of intracellular transport and evolution of the Golgi complex // Anat. Rec. 2002. - Vol. 268. - P. - 226-238.

32. Breitfeld P.P., McKinnon W.C., Mostov K.E. Effect of nocodazole on vesicular traffic to the apical and basolateral surfaces of polarized MDCK cells // J. Cell Biol. 1990. - Vol. 111. - P. 2365-2373.

33. Bretscher M.S. and S. Munro. Cholesterol and the Golgi apparatus // Science 1993. - Vol. 261. - P. 280-281.

34. Brown W.J. and Farquhar M.G. Immunoperoxidase methods for the localization of antigens in cultured cells and tissue sections by electron microscopy// Methods Cell Biol. 1989. - Vol. 31. - P. 553-569.

35. Brown Jr., R. M. Movement of the protoplast and function of the Golgi apparatus in the algae // Publ. Wiss. Film Sekt. Biol. 1971. - № 7. -P.361.

36. Bruckner P. and E.F. Eikenberry. Procollagen is more stable in cellulo than in vitro // Eur. J. Biochem. 1984. - Vol. 140. - P. 397-399.

37. Cabrera-Poch N., Pepperkok R., Shima D.T. Inheritance of the mammalian Golgi apparatus during the cell cycle // Biochim. Biophys Acta. 1998 - Vol. 1404. - P.139-151.

38. Chavrier P. and B. Goud. The role of ARF and Rab GTPases in membrane transport // Curr. Opin. Cell Biol. 1999. - Vol. 11. - P. 466475.

39. Cho M. I. and P.R. Garant. An electron microscopic radioautographic study of collagen secretion in periodontal ligamant fibroblast of the mouse: I Normal fibroblast // Anat. Rec. 1981. - Vol. 201. - P. 577-586.

40. Chen C., Ma J., Lazic A., Backovic M., Colley K.J. Formation of insoluble oligomers correlates with ST6Gal I stable localization in the Golgi // J. Biol. Chem. 2000. - Vol. 275. - P. 13819-13826.

41. Claude A. Growth and differentiation of cytoplasmic membranes in the course of lipoprotein granule synthesis in the hepatic cell. I. Elaboration of elements of the Golgi complex // J. Cell Biol. 1970. - Vol. 47. - P. 74566.

42. Clermont Y., Rambourg A., Hermo L. Segregation of secretory material in all elements of the Golgi apparatus in principal epithelial cells of the rat seminal vesicle // Anat. Rec. 1992. - Vol. 232. - P. 349-358.

43. Clermont Y., Rambourg A., Hermo L. Connections between the various elements of the cis- and mid-compartments of the Golgi apparatus of early rat spermatids // Anat. Rec. 1994. - Vol. 240. - P. 469-480.

44. Clermont Y., Rambourg A., Hermo L. Trans-Golgi network (TGN) of different cell types: three-dimensional structural characteristics and variability // Anat. Rec. 1995. - Vol. 242. - P. 289-301.

45. Cluett E.B. and W.J. Brown. Adhesion of Golgi cisternae by proteinaceous interactions: intercisternal bridges as putative adhesive structures //J. Cell Sci. 1992. - Vol. 103. - P. 773-784.

46. Cluett E.B., Kuismanen E., Machamer C.E. Heterogeneous distribution of the unusual phospholipid semilysobisphosphatidic acid through the Golgi complex // Mol. Biol. Cell. 1997. - Vol. 8. - P. 2233-2240.

47. Cluett E.B. and C.E. Machamer. The envelope of vaccinia virus reveals an unusual phospholipid in Golgi complex membranes // J. Cell Sci. 1996. -Vol. 109.-P. 2121-2131.

48. Cluett E.B., Wood S.A., Banta M., Brown W.J. Tubulation of Golgi membranes in vivo and in vitro in the absence of brefeldin A // J. Cell Biol. 1993.-Vol. 120.-P. 15-24.

49. Cole N.B., Ellenberg J., Song J., DiEuliis D., Lippincott-Schwartz J. Retrograde transport of Golgi-localized proteins to the ER // J. Cell Biol. -1998.-Vol. 140.-P. 1-15.

50. Cole N.B., Sciaky N., Marotta A., Song J., Lippincott-Schwartz J. Golgi dispersal during microtubule disruption: regeneration of Golgi stacks at peripheral endoplasmic reticulum exit sites // Mol. Biol. Cell. 1996b. -Vol. 7.-P. 631-650.

51. Cole N.B., Smith C.L., Sciaky N., Terasaki M., Edidin M, Lippincott-Schwartz J. Diffusional mobility of Golgi proteins in membranes of living cells // Science. 1996a. - Vol. 273. - P. 797-801.

52. Colley K.J. Golgi localization of glycosyltransferases: more questions than answers // Glycobiology. 1997. Vol. 7. - P. 1-13.

53. Connolly C.N., Futter C.E., Gibson A., Hopkins C.R., Cutler D.F. Transport into and out of the Golgi complex studied by transfecting cells with cDNAs encoding horseradish peroxidase // J.Cell Biol. 1994. - Vol. 127.-P.641-652.

54. Cosson P., Letourneur F. Coatomer interaction with di-lysine endoplasmic reticulum retention motifs // Science 1994. - Vol. 263. - P. 1629-1631.

55. Cosson P., Amherdt M., Rothman J.E., Orci L. A resident Golgi protein is excluded from peri-Golgi vesicles in NRK cells // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2002. - Vol. 99. - P. 12831-12834.

56. Dahan S., Ahluwalia J.P., Wong L., Posner B.I., Bergeron J.J. Concentration of intracellular hepatic apolipoprotein E in Golgi apparatussaccular distensions and endosomes // J. Cell Biol. 1994. - Vol. 127. - P. 1859-1869.

57. Davidson H.W. and W.E. Balch. Differential inhibition of multiple vesicular transport steps between the endoplasmic reticulum and trans Golgi network // J. Biol Chem. 1993. - Vol. 268. - P. 4216-4226.

58. Dal ton A.J. and D. Felix. Cytologic and cytochemical characteristics of the Golgi substance of epithelial cells of the epididymis in situ, in homogenates and after isolation // Am. J. Anat. 1954. - Vol. 94. - P. 171207.

59. Di Lazzaro C., Campadelli-Fiume G., Torrisi M.R. Intermediate forms of glycoconjugates are present in the envelope of herpes simplex virions during their transport along the exocytic pathway//Virology. 1995. - Vol. 214.-P. 619-623.

60. Donaldson J.G., Cassel D., Kahn R.A., Klausner R.D. ADP-ribosylation factor, a small GTP-binding protein, is required for binding ofthe coatomer protein beta-COP to Golgi membranes // Proc. Natl. Acad. Sei. USA.- 1992. Vol. 89. P. 6408-6412.

61. Donaldson J.G., Finazzi D., Klausner R.D. Brefeldin A inhibits Golgi membrane-catalysed exchange of guanine nucleotide onto ARF protein // Nature 1992. - Vol. 360. - P. 350-352.

62. Donaldson J.G., Kahn R.A., Lippincott-Schwartz J., Klausner R.D. Binding of ARF and beta-COP to Golgi membranes: possible regulation by a trimeric G protein // Science 1991. - Vol. 254. - P. 1197-1199.

63. Donaldson J.G. and R. D. Klausner. ARF: a key regulatory switch in membrane traffic and organelle structure // Curr. Opin. Cell Biol. 1994. -Vol. 6. - P. 527-532.

64. Donaldson J.G., Lippincott-Schwartz J., Bloom G.S., Kreis T.E., Klausner R.D. Dissociation of a 110-kD peripheral membrane protein from the Golgi apparatus is an early event in brefeldin A action. // J. Cell Biol. 1990.-Vol. 111.-P. 2295-2306.

65. D'Souza-Schorey C., Li G., Colombo M.I., Stahl P.D. A regulatory role for ARF6 in receptor-mediated endocytosis // Science 1995. - Vol. 267.-P. 1175-1178.

66. Duden R., Griffiths G., Frank R., Argos P., Kreis T.E. Beta-COP, a 110 kd protein associated with non-clathrin-coated vesicles and the Golgi complex, shows homology to beta-adaptin // Cell 1991 - Vol. 64. - P. 649-665.

67. Dylewski D.P., Haralick R.M, Keenan T.W. Three-dimensional ultrastructure of the Golgi apparatus in bovine mammary epithelial cells during lactation // J. Ultrastruct. Res. 1984. - Vol. 87 - P. 75-85.

68. Eilers U., Klumperman J., Hauri H.P. Nocodazole, a microtubule-active drug, interferes with apical protein delivery in cultured intestinal epithelial cells (Caco-2) // J. Cell Biol. 1989. - Vol. 108. - P. 13-22.

69. Eisner M., Hashimoto H., Nilsson T. Cisternal maturation and esicle transport: join the band wagon! // Mol. Membr. Biol. 2003. - Vol. 20. - P. 221-229.

70. Erk I., Nicolas G., Caroff A., Lepault J. Electron microscopy of frozen biological objects: a study using cryosectioning and cryosubstitution // J. Microsc. 1998. - Vol. 189. - P. 236-248.

71. Farquhar M.G., Palade G.E. The Golgi apparatus (complex)-(1954-1981)-from artifact to center stage // J. Cell Biol. 1981. - Vol. 91. - P. 77103.

72. Farquhar M.G. and H-P Hauri. Protein sorting and vesicular traffic in the Golgi apparatus. // In: The Golgi apparatus. Birkhauser Verlag, Basel 1997-P. 63-129.

73. Featherstone C., Griffiths G., Warren G. Newly synthesized G protein of vesicular stomatitis virus is not transported to the Golgi complex in mitotic cells // J Cell Biol. 1985. - Vol. 101. - P. 2036-2046.

74. Fujiwara T., Oda K., Yokota S., Takatsuki A., Ikehara Y. Brefeldin A causes disassembly of the Golgi complex and accumulation of secretory proteins in the endoplasmic reticulum // J. Biol. Chem. 1988. Vol. 263. -P. 18545-18552.

75. Gaynor, E.C. and S.D. Emr. COPI-independent anterograde transport: cargo-selective ER to Golgi protein transport in yeast COPI mutants // J. Cell Biol. 1997. - Vol. 136. - P. 789-802.

76. Gaynor E.C., te Heesen S., Graham T.R., Aebi M., Emr S.D. Signalmediated retrieval of a membrane protein from the Golgi to the ER in yeast // J. Cell Biol. 1994. - Vol. 127. - P. 653-665.

77. Gillingham A. K., Munro S. Long coiled-coil proteins and membrane traffic // Biochim. Biophys. Acta. 2003 - Vol. 1641. - P. 71-85.

78. Gleeson PA. Targeting of proteins to the Golgi apparatus // Histochem. Cell Biol. 1998. - Vol. 109. - P. 517-32.

79. Glick B.S., Elston T., Oster G. A cisternal maturation mechanism can explain the asymmetry of the Golgi stack // FEBS Lett. G. Vol. 414. - P. 177-181.

80. Glick B.S. and V. Malhotra. The curious status of the Golgi apparatus // Cell 1998. - Vol. 95. - P. 883-889.

81. Godi A. ADP ribosylation factor regulates spectrin binding to the Golgi complex // Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1998. - Vol. 95. - P. 86078612.

82. Golgi C. Intorno alia struttura delle cellule nervose. XXV. Sulla struttura delle cellule nervose dei gangli spinali // Bollettino Societa Medico-Chirurgica di Pavia. 1898. - Vol. 1. - P. 655-665.

83. Gomez M., Scales S.J., Kreis T.E., Perez F. Membrane recruitment of coatomer and binding to dilysine signals are separate events // J.Biol.Chem. 2000. - Vol. 275. - P. 29162-29169.

84. Goud B., Zahraoui A., Tavitian A., Saraste J. Small GTP-binding protein associated with Golgi cisternae // Nature 1990. - Vol. 345. - P. 553-556.

85. Graham T.R., Scott P.A., Emr S.D. Brefeldin A reversibly blocks early but not late protein transport steps in the yeast secretory pathway. // EMBO J. 1993. - Vol. 12. - P. 869-877.

86. Grassè P.P. Ultrastructure, polarité et reproducion de l'appareil de Golgi // Comptes Rendus de l'Accadémie des Sciences Vol. 245. - P. 1278-1281.

87. Griffiths G. Gut thoughts on the Golgi complex // Traffic 2000. -Vol. l.-P. 738-745.

88. Griffiths G., Doms R.W., Mayhey T., Lucocq J. The bulk flow hypothesis: not quite the end. Trends in Cell Biology. 1995. - Vol. 5. - P. 9-13.

89. Griffiths G., Pepperkok R., Locker J.K., Kreis T.E. Immuno-cytochemical localisation of beta-COP to the ER-Golgi boundary and the TGN // J. Cell Sci. 1995a. - Vol. 108. - P. 1839-2856.

90. Griffiths G. and K. Simons. The trans Golgi network: sorting at the exit site of the Golgi complex // Science. 1986. - Vol. 234. - P. 438-443.

91. Guo Q., Vasile E., Krieger M. Disruptions in Golgi structure and membrane traffic in a conditional lethal mammalian cell mutant are corrected by epsilon-COP // J. Cell Biol. 1994. - Vol. 125. - P. 12131224.

92. Happe S., Cairns M., Roth R., Heuser J., Weidman P.J. Coatomer vesicles are not required for inhibition of Golgi transport by G-protein activators // Traffic. 2000. - Vol. 1. - P. 342-353.

93. Hauri H.P., Schweizer A. The endoplasmic reticulum-Golgi intermediate compartment // Curr. Opin. Cell Biol. 1992. - Vol. 4. - P. 600608.

94. Hauri H.P., Kappeler F., Andersson H., Appenzeller C. ERGIC-53 and traffic in the secretory pathway // J. Cell Sci. 2000. - Vol. 113. - P. 587596.

95. Heuser J.E., Reese T.S., Dennis M.J., Jan Y., Jan L., L. Evans. Synaptic vesicle exocytosis captured by quick freezing and correlated with quantal transmitter release // J.Cell. Biol. 1979. - Vol. 81: - P. 275-300.

96. Hay J.C., Klumperman J., Oorschot V., Steegmaier M., Kuo C.S., Scheller R.H. Localization, dynamics, and protein interactions reveal distinct roles for ER and Golgi SNAREs // J. Cell Biol. 1998. - Vol. 141. -P. 1489-1502.

97. Helms J.B. and J. E. Rothman. Inhibition by brefeldin A of a Golgi membrane enzyme that catalyses exchange of guanine nucleotide bound to ARF // Nature. 1992. - Vol. 360. - P. 352-354.

98. Hermo L. and C.E. Smith. The structure of the Golgi apparatus: a sperm's eye view in principal epithelial cells of the rat epididymis // Histochem. Cell Biol. 1998. - Vol. 109. - P. 431-447.

99. Ho W.C., Allan V.J., van Meer G., Berger E.G., Kreis T.E. Reclustering of scattered Golgi elements occurs along microtubules // Eur. J. Cell Biol. 1989. - Vol. 48. - P. 250-263.

100. Hohl T.M., Parlati F., Wimmer C., Rothman J.E., Sollner T.H., Engelhardt H. Arrangement of subunits in 20 S particles consisting of NSF, SNAPs, and SNARE complexes // Mol. Cell. 1998. - Vol. 2. - P.539-548.

101. Holthuis J.C., Pomorski T., Raggers R.J., Sprong H., Van Meer G. The organizing potential of sphingolipids in intracellular membrane transport // Physiol. Rev. 2001. - Vol. 81. - P. 1689-1723.

102. Hong W. Protein transport from the endoplasmic reticulum to the Golgi apparatus // J.Cell Sci. Vol. 111. - P. 2831- 2839.

103. Hong W. SNAREs and traffic // Biochim. Biophys. Acta. 2005. -Vol. 1744, -P.493-517.

104. Hopkins C.R., Gibson A. Shipman M. Miller K. Movement of internalized ligand-receptor complex along a continuous endosomal reticulum // Nature 1990. - Vol. 346. - P. 335-339.

105. Horton A.C. and M.D. Ehlers. Dual modes of endoplasmic reticulum-to-Golgi transport in dendrites revealed by live-cell imaging // J. Neurosci. 2003. - Vol. 23 - P. 6188-6199.

106. Ioannou Y.A., Bishop D.F., Desnick R.J. Overexpression of human alpha-galactosidase A results in its intercellular aggregation, crystallization in lyzosomes, and selective secretion // J. Cell Biol. 1992. - Vol. 119. - P. 1137-1150.

107. Inoue T. and H. Osatake. A new drying method of biological specimens for scanning electron microscopy: the t-butyl alcohol freeze-drying method // Arch. Histol. Cytol. 1988. - Vol. 51. - P. 53-59.

108. Inoue T. Complementary scanning electron microscopy: technical notes and applications // Arch. Histol. Cytol. 1992. - Vol. 55. - P. 45-51.

109. Jamieson J.D. and G.E. Palade. Role of the Golgi complex in the intracellular transport of secretory proteins // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1966. - Vol. 55. - P. 424-431.

110. Jamora C., Takizawa P.A., Zaarour R.F., Denesvre C., Faulkner D.J., Malhotra V. Regulation of Golgi structure through heterotrimeric G proteins // Cell. 1997. - Vol. 91. - P. 617-626.

111. Jamora C., Yamanouye N., Van Lint J., Laudenslager J., Vandenheede J.R., Faulkner D.J., Malhotra V. Gbetagamma-mediated regulation of Golgi organization is through the direct activation of protein kinase D // Cell. 1999. - Vol. 98. - P. 59-68.

112. Jeckel D., Karrenbauer A., Birk R., Schmidt R.R, Wieland F. Sphingomyelin is synthesized in the cis Golgi // FEBS Lett. 1990. - Vol. 261.-P. 155-157.

113. Jokitalo E., Cabrera-Poch N., Warren G., Shima D.T. Golgi clusters and vesicles mediate mitotic inheritance independently of the endoplasmic reticulum // J. Cell Biol. 2001. - Vol. 154. - P. 317-330.

114. Keller P., Simons K. Post- Golgi biosynthetic trafficking // J. Cell. Sci. 1997. - Vol. 110. - P. 3001-3009.

115. Keller P., Toomre D., Diaz E., White J., Simons K. Multicolour imaging of post-Golgi sorting and trafficking in live cells // Nat. Cell Biol. -2001.-Vol.3.-P. 140-149.

116. Klausner R.D., Donaldson J.G., Lippincott-Schwartz J. Brefeldin A: insights into the control of membrane traffic and organelle structure // J. Cell Biol.- 1992.-Vol. 116.-P. 1071-1080.

117. Klumperman J., Schweizer A., Clausen H., Tang B.L., Hong W., Oorsschot V., Hauri H.P. The recycling pathway of protein ERGIC-53 and dynamics of the ER-Golgi intermediate compartmant // J.Cell. Sci. 1998. -Vol. 111.-P. 3411-3425.

118. Klumperman J. Transport between ER and Golgi // Curr Opin. Cell. Biol.-Vol. 12.-P. 445-449.

119. Knowles B.B., Howe C.C., Aden D.P. Human hepatocellular carcinoma cell lines secrete the major plasma proteins and hepatitis B surface antigen // Science. Vol. 209. - P. 497-499.

120. Kornfeld R. and S. Kornfeld. Assembly of asparagine-linked oligosaccharides // Annu. Rev. Biochem. 1985. - Vol. 54. - P. 631-664.

121. Koster A.J, Grimm R., Typke D., Hegerl R., Stoschek A., Walz J., Baumeister W. Perspectives of molecular and cellular electron tomography // J Struct Biol. 1997. - Vol. 120. - P. 276-308.

122. Kreis T.E. and R. Pepperkok. Coat proteins in intracellular membrane transport // Curr. Opin. Cell Biol. 1994. - Vol. 6. - P. 533-537.

123. Kremer J.R., D.N. Mastronarde, Mcintosh J.R. Computer visualization of tree-dimensional image data using IMOD. // Jstruct. Biol. -1996.-Vol. 116.-P. 71-76.

124. Kuehn, M.J., Herrmann J.M., Schekman R. COPII-cargo interactions direct protein sorting into ER-derived transport vesicles // Nature 1998. -Vol. 391.-P. 187-190.

125. Kuismanen E. and J. Saraste. Low temperature-induced transport blocks as tools to manipulate membrane traffic // Methods Cell Biol. -1989.-Vol. 32.-P. 257-274.

126. Ladinsky M.S., Kremer J.R, Furcinitti P.S. Mcintosh J.R. Howell K.E. 1994. HVEM tomography of the trans-Golgi network: structural insights and identification of a lace-like vesicle coat // J. Cell.Biol. 1994 -Vol. 127. - P.29-38.

127. Ladinsky M.S., Mastronard D.N., Mcintosh J. R., Howell K.E., Staehelin L.A. Golgi structure in three dimensions: functional insights from the normal rat kidney cell // J. Cell Biol. 1999. - Vol. 144. - P. 11351149.

128. Ladinsky M.S., Wu C.C., Mcintosh S., Mcintosh J.R., Howell K.E. Structure of the Golgi and distribution of reporter molecules at 20°C reveals the complexity of the exit compartments // Mol. Biol. Cell. 2002. - Vol. 13.-P. 2810-2825.

129. Lanoix J., Ouwendijk J., Lin C.C., Stark A., Love H.D., J. Ostermann, Nilsson T. GTP hydrolysis by arf-1 mediates sorting and concentration of Golgi resident enzymes into functional COP I vesicles // EMBO J. 1999. - Vol. 18. - P. 4935-4948.

130. Lanoix J., Ouwendijk J., Stark A., Szafer E., Cassel D., Dejgaard K., Weiss M., Nilsson T. Sorting of Golgi resident proteins into different subpopulations of COPI vesicles: a role for ArfGAPl // J. Cell Biol. 2001. -Vol. 155.-P. 1199-1212.

131. Leblond C.P. Synthesis and secretion of collagen by cells of connective tissue, bone, and dentin // Anat. Rec. 1989. - Vol. 224. - P. 123-138.

132. Lewis MJ. and H.R. Pelham. Ligand-induced redistribution of a human KDEL receptor from the Golgi complex to the endoplasmic reticulum // Cell. 1992. - Vol. 68. - P. 353-364.

133. Lewis M.J. and H.R. Pelham. SNARE-mediated retrograde traffic from the Golgi complex to the endoplasmic reticulum. // Cell 1996. - P. 85.-P. 205-215.

134. Liljedahl M., Maeda Y.,Colanzi A., Ayala I., Van Lint J., Malhotra V. Protein kinase D regulates the fission of cell surface destined transport carriers from the trans-Golgi network // Cell -2001. Vol. 104. - P. 409420.

135. Lindsey J.D. and M. H. Ellisman. The neuronal endomembrane system. II. The multiple forms of the Golgi apparatus cis element // J. Neurosci. 1985. - Vol. 5. - P. 3124-3134.

136. Linstedt A.D. and H.P. Hauri. Giantin, a novel conserved Golgi membrane protein containing a cytoplasmic domain of at least 350 kDa // Mol. Biol. Cell. 1993. - Vol. 4. - P. 679-693.

137. Lippincott-Schwartz J. Cytoskeletal proteins and Golgi dynamics // Curr. Opin. Cell Biol. 1998. - Vol. 10. - P. 52-59.

138. Lippincott-Schwartz J., Roberts T.N., Hirschberg K. Secretory protein trafficking and organelle dynamics in living cell // Annu. Rev. Cell. Dev.Biol 2000. - Vol. 16. - P.557-589.

139. Lippincott-Schwartz J., Yuan L.C., Bonifacino J.S., Klausner R.D. Rapid redistribution of Golgi proteins into the ER in cells treated with brefeldin A: evidence for membrane cycling from Golgi to ER. // Cell. -1989.-Vol. 56.-P. 801-813.

140. Lodish H.F., Kong N., Snider M., Strous G.J. Hepatoma secretory proteins migrate from rough endoplasmic reticulum to Golgi at characteristic rates // Nature. 1983. - Vol. 304. - P. 80-83.

141. Lotti L.V., Torrisi M.R., Pascale M.C., Monatti S. Immunocytochemical analysis of the transfer of vesicular stomatitis virus G glycoprotein from the intermediate compartment to the Golgi complex // J. Cell. Biol. 1992. - Vol. 118. - P. 43-50.

142. Love H.D., Lin C.C., Short C.S., Ostermann J. Isolation of functional Golgi-derived vesicles with a possible role in retrograde transport // J. Cell Biol. 1998. - Vol. 140. - P. 541-551.

143. Lowe M. and T.E. Kreis. Regulation of membrane traffic in animal cells by COPI // Biochim. Biophys. Acta. 1998. - Vol. 1404. - P. 53-66.

144. Lu L., Horstmann H., Ng C., Ng C., Hong W. Regulation of Golgi structure and function by ARF-like protein 1 (Aril) // J.Cell Sci. 2001 -Vol. 114.-P. 4543-4555.

145. Lucocq J. Unbiased 3-D quantitation of ultrastructure in cell biology // Trends Cell Biol. 1993. - Vol. 3. - P. 354-358.

146. Machamer C.E. Golgi retention signals: do membranes hold the key? // Trends in Cell Biol. 1991. - Vol. 1. - P. 141-144.

147. Machamer C.E. Targeting and retention of Golgi membrane proteins // Curr. Opin. Cell Biol. 1993. - Vol. 5. - P. 606-612.

148. Malhotra V., Orci L., Glick B.S., Block M.R., Rothman J.E. Role of an N-ethylmaleimide-sensitive transport component in promoting fusion of transport vesicles with cisternae of the Golgi stack // Cell 1988. - Vol. 54. P. 221-227.

149. Malhotra V., Serafini T., Orci L., Shepherd J.C., Rothman J.E. Purification of a novel class of coated vesicles mediating biosynthetic protein transport through the Golgi stack // Cell 1989. - Vol. 58. - P. 329-336.

150. Marsh B.J., Volkmann N., Mcintosh J.R., Howell K.E. Direct continuities between cisternae at different levels of the Golgi complex in glucose-stimulated mouse islet beta cells // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. // 2004. Vol. 1012. - P. 5565-5570.

151. Martinez O., Antony C., Pehau-Arnaudet G., Berger E.G., Salamero J., Goud B. GTP-bound forms of rab6 induce the redistribution of Golgi proteins into the endoplasmic reticulum // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. -1997.-Vol. 94.-P. 1828-1833.

152. Martinez O., Schmidt A., Salamero J., Hoflack B., Roa M., Goud B. The small GTP-binding protein rab6 functions in intra-Golgi transport // Cell Biol. 1994. - Vol. 127. - 1575-1588.

153. Martinez-Menarguez J.A., Geuze H.J, Slot J.W., Klumperman J. Vesicular tubular clusters between the ER and Golgi mediate concentration of soluble secretory proteins by exclusion from COPI-coated vesicles // Cell.-Vol. 98.-P. 81-90.

154. Maxfield F.R. and D. Wustner. Intracellular cholesterol transport // J. Clin Invest. Vol. 110. - P. 891-898.

155. McFadden G. I. and M. Melkonian. Golgi apparatus activity and membrane flow during scale biogenesis in the green flagellate Scherfellia dubia (Prasinophyceae) //1. Flaggellar regeneration. Protoplasma. 1986. -Vol. 130.-P. 186-198.

156. McNew J.A., Parlati F., Fukuda R., Johnston R.J., Paz K., Paumet F., Sollner T.H., Rothman J.E. Compartmental specificity of cellular membrane fusion encoded in SNARE proteins // Nature. 2000. - Vol. 407.-P. 153-159.

157. Melan^on P., Glick B.S., Malhotra V., Weidman P.J., Serafini T., Gleason M. L., Orci L., Rothman J.E. Involvement of GTP-binding "G" proteins in transport through the Golgi stack // Cell. 1987. - Vol. 51. - P. 1053-1062.

158. Melkonian M., Becker B., Becker D. Scale formation in algae // J. Electron Microsc. Tech. 1991. - Vol. 17. - P. 165-178.

159. Mellman I., Simons K. The Golgi complex: in vitro Veritas? // Cell. -1992. Vol. 66. - P. 829-840.

160. Mellman I., Warren G. The road taken: past and future foundation of membrane traffic // Cell. 2000. - Vol. 100. - P. 99-112.

161. Mironov A.A., Beznoussenko G.V., Polishchuk R.S., Trucco A. Intra-Golgi transport. A way to a new paradigm? // BBA-Molecular Cell Research 2005. - Vol. 1744. - P. 340350.

162. Mironov A.A., Weidman P., Luini A. Variations on the intracellular transport theme: maturing cisternae and trafficking tubules // J. Cell Biol. --Vol. 138.-P. 481-484.

163. Mironov Jr. A., Luini A., Mironov A.A. A synthetic model of intra-Golgi traffic // FASEB J. 1998. - Vol. 12. - P. 249-252.

164. Misteli T, Warren G. COP-coated vesicles are involved in the mitotic fragmentation of Golgi stacks in a cell-free system // J. Cell Biol. 1994. -Vol. 125.-P. 269-282.

165. Misteli T., Warren G. Mitotic disassembly of the Golgi apparatus in vivo // J. Cell Sci. 1995. - Vol. 108. - P. 2715-2727.

166. Misteli T., Warren G. A role for tubular networks and a COP I-independent pathway in the mitotic fragmentation of Golgi stacks in a cellfree system // J. Cell Biol. 1995. - Vol. 130. - P. 1027-1039.

167. Mollenhauer H.H., Morre D.J. The tubular network of the Golgi apparatus // Histochem. Cell Biol. 1998. - Vol. 109. -P. 533-543.

168. Monck J.R., Alvarez de Toledo G., Fernandez J.M. Tension in secretory granule membranes causes extensive membrane transfer through the exocytotic fusion pore // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1990. - Vol. 87. - P. 7804-7808.

169. Morin-Ganet M.N., Rambourg A., Deitz S.B, Franzusoff A., Kepes F. Morphogenesis and dynamics of yeast Golgi apparatus //Traffic 2000. -Vol. l.-P. 56-68.

170. Morre D.J., Keenan T.W. Golgi apparatus buds vesicles or coated ends of tubules? // Protoplasma - 1994. - Vol. 179. - P. 1-4.

171. Mukherjee S., Zha X., Tabas I., Maxfield F.R. Cholesterol distribution in living cells: fluorescence imaging using dehydroergosterol as a fluorescent cholesterol analog // Biophys.J. 1998. - Vol. 75. - P.1915-1925.

172. Munro S. Localization of proteins to the Golgi apparatus // Trends in Cell Biol. 1998. - Vol. 8. -P. 11-15.

173. Munro S. An investigation of the role of transmembrane domains in Golgi protein retention // EMBO J. 1995. - Vol. 14. - P. 4695-4704.

174. Nakamura N. Rabouille C., Watson R., Nilsson T., Hui N., Slusarewicz P., Kreis T.E., Warren G. Characterization of a cis-Golgi matrix protein, GM130 // J. Cell Biol. 1995. - Vol. 131. - P. 1715-1726.

175. Nakamura N., Lowe M., Levine T.P., Rabouille C., Warren G. The vesicle docking protein pi 15 binds GM130, a cis-Golgi matrix protein, in a mitotically regulated manner // Cell. 1997. - Vol. 89. - P. 445-455.

176. Neumann U., Brandizzi F., Hawes C. Protein transport in plant cells: in and out of the Golgi // Ann. Bot. 2003. - Vol. 92. - P. 167-180.

177. Nilsson T., Slusarewicz P., Hoe M.H., Warren G. Kin recognition. A model for the retention of Golgi enzymes // FEBS Lett. 1993. Vol. 330. -P. 1-4.

178. Nilsson T., Hoe M.H., Slusarewicz P., Rabouille C., Watson R., Hunte F., Watzele G., Berger E.G., Warren G. Kin recognition between medial Golgi enzymes in HeLa cells // EMBO J. 1994. - Vol. 13. - P. 562-574.

179. Novikoff P.M., Novikoff A.B., Quintana N. Hauw J.J. Golgi apparatus, GERL, and lysosomes of neurons in rat dorsal root ganglia, studied by thick section and thin section cytochemistry // J. Cell Biol. -1971.-Vol. 50.-P. 859-886.

180. Ojakian G.K., and R. Schwimmer. Antimicrotubule drugs inhibit the polarized insertion of an intracellular glycoprotein pool into the apical membrane of Madin-Darby canine kidney (MDCK) cells // J. Cell Sci. -1992. Vol. 103. - P. 677-687.

181. Opat A. S., Houghton F., Gleeson P.A. Medial Golgi but not late Golgi glycosyltransferases exist as high molecular weight complexes. Role of luminal domain in complex formation and localization // J. Biol. Chem. 2000. Vol. 275. - P. 11836-11845.

182. Oprins A., Duden R., Kreis T.E., Geuze H.J., Slot J.W. Beta-COP localizes mainly to the cis-Golgi side in exocrine pancreas // J. Cell Biol. -1993.-Vol. 121.-P. 49-59.

183. Orci, L., Amherdt M., Ravazzola M., Perrelet A., Rothman J.E. Exclusion of Golgi residents from transport vesicles budding from Golgi cisternae in intact cells // J. Cell Biol. 2000. - Vol. 150. - P. 1263-1270.

184. Orci L., Glick B.S., Rothman J.E. A new type of coated vesicular carrier thet appears not to contain clathrin: its possible role in protein transport within the Golgi stack // Cell. 1986. Vol. 46. - P. 171-184.

185. Orci L., Palmer D.J., Ravazzola M., Perrelet A., Amherdt M., Rothman J.E. Budding from Golgi membranes requires the coatomer complex of non-clathrin coat proteins // Nature. 1993 - Vol. 362. - P. 648-652.

186. Orci L., Perrelet A., Rothman J.E. Vesicles on strings: morphological evidence for processive transport within the Golgi stack // Proc. Natl. Acad. Sei. U. S. A. 1998. - Vol. 95. - P. 2279-2283.

187. Orci L., Stamnes M., Ravazzola M., Amherdt M., Perrelet A., Sollner T.H., Rothman J.E. Bidirectional transport by distinct populations of COPI-coated vesicles // Cell. 1997. - Vol. 90. - P. 335-349.

188. Ostermann J., Orci L., Tani K., Amherdt M., Ravazzola M., Elazar Z., Rothman J. E. Stepwise assembly of functionally active transport vesicles // Cell. 1993. - Vol. 75. - P. 1015-1025.

189. Palade G. Intracellular aspects of the process of protein synthesis // Science. 1975. - Vol. 89. - P. 347-358.

190. Parczyk K., Haase W., Kondor-Koch C. Microtubules are involved in the secretion of proteins at the apical cell surface of the polarized epithelialcell, Madin-Darby canine kidney // J. Biol. Chem. 1989. - Vol. 264. - P. 16837-16846.

191. Parent J.B., Bauer H.C., Olden K. Three secretory rates in human hepatoma cells // Biochim. Biophys. Acta. 1985. - Vol. 846. - P. 44-50.

192. Pavelka M. and A. Ellinger. Early and late transformations occurring at organelles of the Golgi area under the influence of brefeldin A: an ultrastructural and lectin cytochemical study // J. Histochem. Cytochem. -1993. Vol. 41. - P. 1031-1042.

193. Pavelka M., Ellinger A., Debbage P., Loewe C., Vetterlein M., Roth J. Endocytic routes to the Golgi apparatus // Histochem. Cell Biol. 1998. -Vol.-109.-P. 555-570.

194. Pelham H.R. Recycling of proteins between the endoplasmic reticulum and Golgi complex // Curr Opin Cell Biol. 1991. - № 3. - P. 585-591.

195. Pelham H.R., Roberts L.M., Lord J.M. Toxin entry: how reversible is the secretory pathway? // Trends Cell Biol. 1992. - № 2. - P. 183-185.

196. Pelham H.R. About turn for the COPs? // Cell 1994. - Vol. 79. - P. 1125-1127.

197. Pelham H.R. 1997 Membrane transport. Green light for Golgi traffic. Nature 389:17-19.

198. Pelham H.R. Getting stuck in the Golgi // Traffic. 2000. - №. 1. - P. 19119-2.

199. Pelham H. R. Traffic through the Golgi apparatus // J. Cell Biol. -2001.-Vol. 155.-P. 1099-1101.

200. Pelham H.R., J.E. Rothman. The debate about transport in the Golgi-two sides of the same coin? // Cell. 2000. - Vol. 102. - P. 713-719.

201. Pereira-Leal J.B., M.C. Seabra. Evolution of the Rab family of small GTP-binding proteins // J. Mol. Biol. 2001. - Vol. 313. - P.889-901.

202. Pepperkok R., Scheel J., Horstmann H., Hauri H.P., Griffiths G. Kreis T.E. Beta-COP is essential for biosynthetic membrane transport from the endoplasmatic reticulum to the Golgi complex in vivo // Cell 1993. -Vol. 74.-P. 71-82.

203. Peters P. Cryoimmunogold electron microscopy // In Current Protocols in Cell Biology. John Wiley & Sons, New York. 1999.

204. Pfeffer S. R. Constructing a Golgi complex // J. Cell Biol. 2001. -Vol. 155.-P. 873-875.

205. Polishchuk R.S. and A.A. Mironov. Structural aspects of Golgi function // Cell Mol. Life Sci. 2004. - Vol. 61. - P. 146-158.

206. Presley J. F., Cole N.B., Schroer T.A., Hirschberg K., Zaal K.J., Lippincott-Schwartz J. ER-to-Golgi transport visualized in living cells // Nature. 1997. - Vol. 389. P. 81-85.

207. Preuss D., Mulholland J., Franzusoff A., Segev N., D. Botstein. Characterization of the Saccharomyces Golgi complex through the cell cycle by immunoelectron microscopy // Mol Biol Cell. 1992. - Vol. 3: P. 789-803.

208. Pullikuth A.K. and Weidman P.J. In vitro transport on cis and trans-sides of the Golgi involves two distinct types of coatomer and ADP-ribosylation factor-independent transport intermediates // J. Biol Chem. 2002. Vol. 277. - P. 50355-50364.

209. Rabouille C., Hui N., Hunte F., Kieckbusch R., Berger E.G., Warren G., Nilsson T. Mapping the distribution of Golgi enzymes involved in the construction of complex oligosaccharides // J. Cell Sci. Vol. 1995. Vol. 108.-P. 1617-1627.

210. Rabouille C., Kuntz D.A., Lockyer A., Watson R., Signorelli T., Rose D.R., van den Heuvel M., Roberts D.B. The Drosophila GMII gene encodes a Golgi alpha-mannosidase II // J. Cell Sci. 1999. - Vol. 112. - P. 3319-3330.

211. Rambourg A. and Y. Clermont. Three-dimensional electron microscopy: structure of the Golgi apparatus // Eur. J. Cell Biol. 1990. -Vol. 51.-P. 189-200.

212. Rambourg A. and Y. Clermont. Three dimensional structure of the Golgi apparatus in mammalian cells // In: The Golgi Apparatus. 1997. -Berger E.G. and J. Roth, editor. Birkhauser Verlag, Basel (CH). - P.37-62.

213. Rambourg A. and Y. Clermont. Tridimensional structure of the Golgi apparatus in type A ganglion cells of the rat // Am. J. Anat. 1986. Vol. 176. -P. 393-409.

214. Rambourg A., Clermont Y., Hermo L. Three-dimensional architecture of the Golgi apparatus in Sertoli cells of the rat // Am. J. Anat. 1979. - Vol. 154. - P. 455-476.

215. Rambourg, A., Clermont Y., Ovtracht L., Kepes F. Three-dimensional structure of tubular networks, presumably Golgi in nature, in various yeast strains: a comparative study // Anat. Rec. 1995. Vol 243. -P. 283-293.

216. Rindler M.J., Ivanov I.E., Sabatini D.D. Microtubule-acting drugs lead to the nonpolarized delivery of the influenza hemagglutinin to the cell surface of polarized Madin-Darby canine kidney cells // J. Cell Biol. -1987.-Vol. 104.-P. 231-241.

217. Robinson M.S. and J.S. Bonifacino. Adaptor-related proteins // Curr. Opin. Cell Biol. 2001. - Vol. 13. - P.444-453.

218. Rogalski A.A., J.E. Bergmann, Singer S.J. Effect of microtubule assembly status on the intracellular processing and surface expression of an integral protein of the plasma membrane // J. Cell Biol. 1984. - Vol. 99. -P. 1101-1109.

219. Rojo M., Pepperkok R., Emery G., Kellner R., Stang E., Parton R.G., Gruenberg J. Involvement of the transmembrane protein p23 in biosynthetic protein transport // J. Cell Biol. 1997. - Vol. 139. - P. 1119 - 1135.

220. Rose J.K. and J.E. Bergmann. Altered cytoplasmic domains affect intracellular transport of the vesicular stomatitis virus glycoprotein // Cell. -1983. Vol. 34.-P. 513-524.

221. Rossanese O.W. and B.S. Glick. Deconstructing Golgi inheritance // Traffic 2001. Vol. 2. - P. 589-596.

222. Roth J. Topology of glycosylation in the Golgi apparatus // In: The Golgi Apparatus. 1997. Birkhauser Verlag, Basel (CH). - P. 131-161.

223. Rothman J.E. Mechanisms of intracellular protein transport // Nature. 1994. - Vol. 372. - P. 55-63.

224. Rothman J.E., Miller R.L., Urbani L.J. Intercompartmental transport in the Golgi complex is a dissociative process: facile transfer of membrane protein between two Golgi populations // Cell Biol. 1984a. - Vol. 90. -P.260-271.

225. Rothman J.E, L.J. Urbani, R. Brands. Transport of protein between cytoplasmic membranes of fused cells: correspondence to processes reconstituted in a cell-free system // J. Cell Biol. 1984b - Vol. 99. - P. 248-259.

226. Rothman J. E. and F. T. Wieland. Protein sorting by transport vesicles // Science 1996. - Vol. 272. - P. 227-234.

227. Rothman J.E. and G. Warren. Implications of the SNARE hypothesis for intracellular membrane topology and dynamics // Curr. Biol. 1994. -Vol. 4. - P. 220-233.

228. Rowe T., Dascher C., Bannykh S., Plutner H., Balch W.E. Role of vesicle-associated syntaxin-5 in the assembly of pre-Golgi intermediates // Science. 1998. - Vol. 279. - P. 696-700.

229. Sabesin S.M. and S. Frase. Electron microscopic studies of the assembly, intracellular transport, and secretion of chylomicrons by rat intestine // J. Lipid Res. 1977. - Vol. 18. - P. 496-511.

230. Salama N.R. Schekman R.W. The role of coat proteins in the biosyntesis of secretory proteins // Curr. Opin. Cell.Biol. 1995. - Vol. 7. -P.536-543.

231. Saraste J. and E. Kuismanen. Pre- and post-Golgi vacuoles operate in the transport of Semliki Forest Virus membrane glycoproteins to the cell surface // Cell 1984. - Vol. 38. - P. 535-549.

232. Sasaki T. Ultrastructure and cytochemistry of the Golgi apparatus and related organelles of the secretory ameloblasts of the rat incisor // Arch. Oral. Biol. 1983. - Vol. 28 - P. 895-905.

233. Scales S.J., Pepperkok R., Kreis T.E. Visualization of ER-to-Golgi transport in living cells reveals a sequential mode of action for COPII and COPI // Cell 1997 - Vol. 90. - P. 1137-1148.

234. Scheel J., Matteoni R., Ludwig T., Hoflack B., Kreis T.E. Microtubule depolymerization inhibits transport of cathepsin D from the Golgi apparatus to lysosomes // J. Cell Sci. 1990. - Vol. 96. - P. 711-720.

235. Schekman R. and I. Melmann. Does COPI go both ways? // Cell 1997.-Vol. 90.-P. 197-200.

236. Schekman R. and Orci L. Coat proteins and vesicle budding // Science. 1996. - Vol. 271. - P. 1526-1533.

237. Schnitzer T.J., Dickson C., Weiss R.A. Morphological and biochemical characterization of viral particles produced by the ts045 mutant of vesicular stomatitis virus at restrictive temperature // J. Virol. -1979.-Vol. 29.-P. 185-195.

238. Schweizer R., Matter K., Ketcham C. A., Hauri H. The isolated ER-Golgi intermediate compartment exhibits properties that are different from ER and cis-Golgi // J. Cell Biol. 1991. - Vol. 113. - P. 45-54.

239. Sciaky N., Presley J., Smith C., Zaal K.J., Cole N., Moreira J.E., Terasaki M., Siggia E., Lippincott-Schwartz J. Golgi tubule traffic and the effects of brefeldin A visualized in living cells // J. Cell Biol. 1997. - Vol. 139.-P. 1137-1155.

240. Seemann J., Jokitalo E.J., Warren G. The role of the tethering proteins pi 15 and GM130 in transport through the Golgi apparatus in vivo // Mol. Biol. Cell. 2000. - № 11. - P. 635-645.

241. Short B. and F.A. Barr. Membrane traffic: a glitch in the Golgi matrix // Curr. Biol. 2003. - № 13. - P. 311-313.

242. Shorter J. and G. Warren. A role for the vesicle tethering protein, pi 15, in the post-mitotic stacking of reassembling Golgi cisternae in a cellfree system // J. Cell Biol. 1999. - Vol. 146. - P. 57-70.

243. Shorter J. and G. Warren. Golgi architecture and inheritance // Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 2002. - № 18. - P. 379-420.

244. Sitia R. and J. Meldolesi. Endoplasmic reticulum: a dynamic patchwork of specialized subregions // Mol. Biol. Cell. 1992. - № 3. - P. 1067-1072.

245. Sjostrand F.S., and V. Hanzon. Ultrastructure of Golgi apparatus of exocrine cells of mouse pancreas // Exp. Cell Res. 1954. - № 7. - P. 415429.

246. Slusarewicz P., Nilsson T., Hui N., Watson R., Warren G. Isolation of a matrix that binds medial Golgi enzymes // J Cell Biol. 1994. -Vol. 124.-P. 405-413.

247. Sollner T., Whiteheart S.W., Brunner M., Erdjument-Bromage H., Geromanos S., Tempst P., Rothman J.E. SNAP receptors implicated in vesicle targeting and fusion // Nature. 1993. - Vol. 362. - P. 318-324.

248. Somsel Rodman J. and A. Wandinger-Ness. Rab GTPases coordinate endocytosis // J. Cell Sci. 2000. - Vol. 113.-P. 183-1.

249. Sonnichsen B., Watson R., Clausen H., Misteli T., Warren G. Sorting by COP I-coated vesicles under interphase and mitotic conditions // J. Cell Biol. 1996. - Vol. 134. - P. 1411-1425.

250. Stinchcombe J.C., Nomoto H., Cutler D.F., Hopkins C.R. Anterograde and retrograde traffic between the rough endoplasmic reticulum and the Golgi complex // J. Cell Biol. 1995. - Vol.131. - P. 1387-1401.

251. Storrie B. and T. Nilsson. The Golgi apparatus: balancing new with old // Traffic. 2002. - № 3. - P. 521-529.

252. Storrie B., Pepperkok R., Nilsson T. Breaking the COPI monopoly on Golgi recycling // Trends Cell Biol. 2000. - № io. - P.385-391.

253. Stults N.L., Fechheimer M., Cummings R.D. Relationship between Golgi architecture and glycoprotein biosynthesis and transport in Chinese hamster ovary cells // J. Biol. Chem. 1989. - Vol. 264. - P. 19956-19966.

254. Tanaka K., and H. Fukudome. Three-dimensional organization of the Golgi complex observed by scanning electron microscopy // J. Electron Microsc. Tech. 1991. - № 17. - P. 15-23.

255. Tanaka K., Mitsushima A., Fukudome H., Kashima Y. Three-dimensional architecture of the Golgi complex observed by high resolution scanning electron microscopy // J. Submicrosc. Cytol. 1986. - № 18. -P.l-9.

256. Tang B.L., Low S.H., Hauri H.P., Hong W. Segregation of ERGIC53 and the mammalian KDEL receptor upon exit from the 15 degrees C compartment//Eur. J. Cell Biol. 1995. -№ 68. - P.398-410.

257. Tang B.L., Wong S.H, Qi X.L., Low S.H., Hong W. Molecular cloning, characterisation, subcellular localization and dynamics of p23, the mammalian KDEL receptor // J. Cell Biol. 1993. - Vol.120. - P.325-328.

258. Tanigawa G., Orci L., Amherd M., Ravazzola M., Helms J.B., Rothman J.E. Hydrolysis of bound GTP by ARF protein triggers uncoating of Golgi-derived COP-coated vesicles // J. Cell Biol. 1993.- Vol. 123. -P. 1365-1371.

259. Taylor T.C., Kahn R.A., Melancon P. Two distinct members of the ADP-ribosylation factor family of GTP-binding proteins regulate cell-free intra-Golgi transport // Cell. 1992. - Vol. 70. - P. 69-79.

260. Taylor T.C., Kanstein M., Weidman P., Melangon P. Cytosolic ARFs are required for vesicle formation but not for cell-free intra-Golgi transport: evidence for coated vesicle-independent transport // Mol. Biol. Cell. 1994. - № 5. p. 237-252.

261. Thyberg J. and S. Moskalewski. Microtubules and the organization of the Golgi complex // Exp. Cell Res. 1985. - Vol. 159. P. 1-16.

262. Thyberg J. and S. Moskalewski. Role of microtubules in the organization of the Golgi complex // Exp. Cell Res. 1999. - Vol. 246. P. 263-279.

263. Thorne-Tjomsland G., Dumontier M., Jamieson J.C. 3D topography of non-compact zone Golgi tubules in rat spermatids: a computer-assisted serial section reconstruction study // Anat. Rec. 1998. - Vol. 250. -P.381-96.

264. Varki A. Factors controlling the glycosylation potential of the Golgi apparatus // Trends in Cell Biol. 1998. - № 8. - P. 34-40.

265. Velasco A., Hendricks L., Moremen K.W., Tulsiani D.R., Touster O., Farquhar M.G. Cell type-dependent variations in the subcellular distribution of alpha-mannosidase I and II // J. Cell Biol. 1993. - Vol. 122. - P.39-51.

266. Warren G. and V. Malhotra. The organisation of the Golgi apparatus // Curr. Opin. Cell Biol. 1998. - № 10. - P. 493-498.

267. Weber T., Zemelman B.V., McNew J.A., Westermann B., Gmachl, F. Parlati M., Sollner T.H., J. E. Rothman. SNAREpins: minimal machinery for membrane fusion // Cell 1998. - Vol. 92. -P. 759-772.

268. Weidman P.J. Anterograde transport through the Golgi complex: do Golgi tubules hold the key? // Trends Cell Biol. 1995. - № 5. - P. 302305.

269. Weidman P., Roth R., Heuser J. Golgi membrane dynamics imaged by freeze-etch electron microscopy: views of different membrane coatings involved in tubulation versus vesiculation // Cell 1993. - Vol. 75. -P.123-133.

270. Weidman P.J. and W.M. Winter. The G protein-activating peptide, mastoparan, and the synthetic NH2-terminal ARF peptide, ARFpl3, inhibit in vitro Golgi transport by irreversibly damaging membranes // J. Cell Biol. 1994. Vol. 127. P. 1815-1827.

271. Weiss M. and T. Nilsson. Protein sorting in the Golgi apparatus: a consequence of maturation and triggered sorting // FEBS Lett. 2000. -Vol. 486. - P. 2-9.

272. Weisz O.A., Swift A.M., Machamer C.E. Oligomerization of a membrane protein correlates with its retention in the Golgi complex // J. Cell Biol. 1993. - Vol. 122.-P. 1185-1196.

273. Whitney J.A., Gomez M., Sheff D., Kreis T. E., Mellman I. Cytoplasmic coat proteins involved in endosome function // Cell 1995. -Vol. 83.-P. 703-713.

274. Wilson B.S., Nuoffer C., Meinkoth J.L., McCaffery M., Feramisco J.R., Balch W.E., M.G. Farquhar. A Rabl mutant affecting guanine nucleotide exchange promotes disassembly of the Golgi apparatus // J. Cell Biol. 1994. - Vol. 125. - P. 557-571.fa

275. Wooding S. and H.R. Pelham. The dynamics of Golgi protein traffic visualized in living yeast cells. Mol.Biol // Cell. 1998. - № 9. - P.2667-2680.

276. Yang J.S., Lee S.Y., Gao M., Bourgoin S., Randazzo P.A., Premont R.T., Hsu V.W. ARFGAP1 promotes the formation of COPI vesicles, suggesting function as a component of the coat // J. Cell Biol. 2002. -Vol. 159. - P. 69 - 78.

277. Yang W. and B. Storrie. Scattered Golgi elements during microtubule disruption are initially enriched in trans-Golgi proteins // Mol. Biol. Cell. -1998.-№9.-P. 191-207.