Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Организация и динамика телец кахала и кластеров интерхроматиновых гранул в ооцитах домового сверчка Acheta domesticus

ВАК РФ 03.00.25, Гистология, цитология, клеточная биология

Автореферат диссертации по теме "Организация и динамика телец кахала и кластеров интерхроматиновых гранул в ооцитах домового сверчка Acheta domesticus"

На правах рукописи

СТЕПАНОВА Ирина Сергеевна

ОРГАНИЗАЦИЯ И ДИНАМИКА ТЕЛЕЦ КАХАЛА И КЛАСТЕРОВ ИНТЕРХРОМАТИНОВЫХ ГРАНУЛ В ООЦИТАХ ДОМОВОГО СВЕРЧКА ACHETA DOMESTICUS

03.00.25 - гистология, цитология, клеточная биология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

□ОЗОВ727Ь

Санкт-Петербург 2006

003067275

Работа выполнена в Институте цитологии РАН, Санкт-Петербург

Научный руководитель: кандидат биологических наук

Боголюбов Дмитрий Сергеевич

Институт цитологии РАН, Санкт-Петербург

Официальные оппоненты: доктор биологических наук,

профессор

Гагинская Елена Романовна

Биологический НИИ СПбГУ, Санкт-Петербург

доктор биологических наук, профессор

Скопичев Валерий Григорьевич

Санкт-Петербургская государственная академия ветеринарной медицины

Ведущая организация: ГУ НИИ Экспериментальной медицины РАМН, Санкт-

Петербург

Защита состоится « ■/ £ » А. Л 2007 года в /.3 час на заседании

Диссертационного совета Д.002.230.01 при Институте цитологии РАН по адресу: Тихорецкий пр., д. 4, 194064, Санкт-Петербург, cellbio@mail.cytspb.rssi.ru

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института цитологии РАН. / "" 0

Автореферат разослан « » , ОКбД КС 2007 года.

Ученый секретарь Диссертационного совета, кандидат биологических наук - Е. В. Каминская

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. В последние годы достигнут значительный прогресс в понимании различных аспектов экспрессии генов, однако вопросы структурной организации молекулярно-биологических процессов в трехмерном пространстве ядра, участие в них различных экстрахромосомных ядерных образований, или доменов, остаются открытыми.

В этой связи актуальной проблемой представляется изучение внутриядерного распределения основных «участников» экспрессии генов, в том числе РНК-полимераз, включая РНК-полимеразу И (РНК-пол II), факторов транскрипции и процессинга разных типов РНК. Следует учитывать, что в настоящее время преобладают представления о том, что на регуляцию экспрессии генов и координацию составляющих ее многостадийных событий наряду с особенностями упаковки генетического материала в хроматине и расположения собственно хромосом в ядре существенное влияние оказывают экстрахромосомные домены нуклеоплазмы (Misteli and Spector, 1998; Cremer et al., 2004).

Часть таких доменов представлена в виде перихроматиновых фибрилл, являющихся морфологическим «выражением» первичных транскриптов мРНК (Fakan, 1994), а другая оформлена в виде различных ядерных телец (nuclear bodies) (Brasch and Ochs, 1992). Среди ядерных телец, очевидно, имеются универсальные для разных типов клеток структуры, а также такие, которые характеризуют лишь определенный тип клеток или существуют лишь в определенных физиологических условиях (Gall et al., 2004).

На роль наиболее универсальных ядерных телец, по современным представлениям, подходят кластеры интерхроматиновых гранул (КИГ) и тельца Кахала (ТК) (Gall et al., 2004). В настоящее время можно считать установленным, что ТК и КИГ участвуют в ядерном биогенезе малых ядерных (мя) РНК, однако морфодинамика этих структур, их функциональная взаимосвязь друг с другом и непосредственная роль в процессинге РНК остаются до конца не изученными (Cioce and Lamond, 2005).

Весьма перспективными модельными объектами для изучения доменной организации экстрахромосомной части ядра в настоящее время становятся ооциты в силу крупных размеров их ядер и внутриядерных структур, динамичности самого процесса оогенеза, что позволяет одновременно выделять различные стадии развития яйцеклетки - от активных до инертных. Особенную привлекательность подобного рода исследованиям придают сложные и разнообразные взаимоотношения половых и вспомогательных клеток в оогенезе, при которых ядро ооцита может быть активным, либо инактивироваться. В последнем случае ядерные синтетические функции принимают на себя питающие клетки.

Имеющиеся в литературе данные по организации экстрахромосомных ядерных доменов ооцитов насекомых и по локализации в них компонентов ТК и КИГ весьма ограничены и касаются в основном видов с мероистическими яичниками, характеризующимися инактивацией ядра ооцита (Bogolyubov and Parfenov, 2001; Biliñski and Kl ос, 2002; Zelazovvska and Jaglarz, 2004; Batalova et al., 2005; Jaglarz et al., 2005). Кроме того, использование традиционных подходов по локализации маркерных компонентов ТК и КИГ в ооцитах насекомых привело к противоречивым результатам, что подчас затрудняет даже простую их идентификацию в связи с высокой гетерогенностью по размерам, количеству, ультраструктурной организации на разных стадиях оогенеза, а в ряде случаев - и по молекулярному составу.

Таким образом, в связи с отсутствием четких и адекватных критериев идентификации ТК и КИГ, противоречивыми данными по их молекулярному составу и преобладанием работ, выполненных на ядрах ооцитов в период их инактивации, представляется актуальным изучение организации, состава, динамики поведения и взаимоотношений друг с другом ТК и КИГ в активных ядрах ооцитов насекомых, характеризующихся паноистическимн яичниками. В настоящей работе мы по существу впервые обращаемся к изучению ядерных доменов ооцитов таких насекомых на примере домового сверчка Acheta domesticiis.

Цель и задачи исследования. Основной целью данной работы являлась идентификация и анализ экстрахромосомных структур, содержащих компоненты транскрипции и процессинга РНК, в диплотенных ядрах ооцитов Acheta domesticas.

Для достижения поставленной цели были сформулированы следующие экспериментальные задачи.

1. Охарактеризовать транскрипционный статус ядер ооцитов A. domesticus на стадии диплотены.

2. Описать экстрахромосомные структуры интерхроматиновой области ядер ооцитов этого вида.

3. Проанализировать внутриядерное распределение компонентов транскрипции, осуществляемой РНК-пол II (факторов, непосредственно входящих в состав голоэнзима РНК-пол II или функционально с ним связанных), а также факторов процессинга РНК.

4. Идентифицировать структуры, соответствующие КИГ. С целью усиления сравнительного подхода и поиска возможных общих принципов организации КИГ ооцитов выявить гомологичные структуры в ооцитах животных, обладающих другими типами оогенеза: Sarcophaga sp. и Tenebrio molitor (нутриментарный оогенез), а за пределами класса насекомых - у моллюска Achatina fúlica, обладающего типичным солитарным оогенезом.

5. С помощью комплексного подхода идентифицировать ТК ооцитов A. domesticus, исследовать динамику их основных компонентов, оценить структурно-пространственные взаимоотношения ТК с КИГ, хромосомами и ядрышками.

6. Изучить поведение внутриядерных структур, содержащих факторы созревания РНК, в транскрипционно активных ядрах и при подавлении транскрипции с помощью ингибиторов.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. В ядрах ооцитов домового сверчка A. domesticus присутствуют ТК и КИГ -универсальные ядерные органеллы половых и соматических клеток, содержащие ведущие компоненты экспрессии генов.

2. ТК диплотенных ооцитов A. domesticus содержат маркерный белок - коилин, фактор процессинга пре-мРНК - фибрилларин, факторы сплайсинга пре-мРНК - мяРНП и белок SC35, компоненты РНК-пол П-транскрипции - базальный фактор транскрипции TFIID и белки-коактиваторы транскрипции СВР/рЗОО, но не содержат РНК-пол II.

3. КИГ ооцитов насекомых различных систематических групп имеют сходную ультраструктурную организацию и молекулярный состав.

4. Подавление транскрипции с помощью ингибиторов с разными механизмами действия вызывает сходные эффекты: существенную сегрегацию ультраструктурных компонентов ТК и КИГ и увеличение количества КИГ в нуклеоплазме. Действие ингибиторов не приводит к перераспределению основных молекулярных компонентов ТК и к накоплению в ТК РНК-пол II, которая аккумулируется в фибриллярных областях КИГ.

Научная новизна работы. Впервые в транскрипционно активных ядрах ооцитов насекомых с помощью различных адекватных критериев идентифицированы ТК и КИГ и доказана их гомология соответствующим структурам ооцитов других животных и соматических клеток млекопитающих. Впервые представлены сведения об особенностях организации, состава ТК и КИГ и их связи на разных стадиях оогенеза в нормальных условиях и после подавления транскрипции с помощью ингибиторов. Впервые с помощью лазерной сканирующей конфокальной микроскопии выявлена колокализация ряда ведущих компонентов процессинга разных типов РНК в ТК и КИГ ооцитов насекомых.

Теоретическое и практическое значение работы. Результаты работы могут быть использованы для дальнейшего изучения структуры, функции и динамики ядерных структур, содержащих компоненты экспрессии генов; и способствуют углублению знаний о перераспределении факторов транскрипции и процессинга РНК на разных стадиях оогенеза. Полученные в работе данные создают базис для перспективного изучения

проблемы взаимосвязи различных ядерных доменов. Кроме этого, результаты работы используются в учебных спецкурсах, читаемых на кафедре биологии развития биолого-почвенного факультета СПбГУ, на факультете медицинской физики СПбГТУ, а также в учебно-методических пособиях для студентов.

Апробация работы. Основные положения работы были доложены и обсуждены на XIII, XIV и XV Всероссийских симпозиумах «Структура и функция клеточного ядра», (Санкт-Петербург, 1999, 2002, 2005), I Всероссийском съезде клеточных биологов (Санкт-Петербург, 2003), конгрессе ELSO (European Life Scientist Organization) (Ницца, Франция, 2004), XIV школе-конференции «Актуальные проблемы биологии развития и биотехнологии» (Звенигород, 2005), межинститутском семинаре «Современные конфокальные микроскопы фирмы Leica и их применение в биологии» (Санкт-Петербург, 2006), научных семинарах Лаборатории морфологии клетки Института цитологии РАН.

Финансовая поддержка работы. Работа выполнена при финансовой поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (проекты 03-04-49389, 04-04-48080, 06-04-48904) и Администрации Санкт-Петербурга.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 13 печатных работ, из них 5 статей и 8 тезисов.

Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения экспериментальных данных, обсуждения результатов, выводов и списка цитируемой литературы. Работа изложена на j^ij страницах машинописного текста и иллюстрирована

рисунками и Д таблицами.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДИКА

Животные. Основным объектом исследования являлись нимфы и взрослые самки домового сверчка Acheta domesticus L. (Insecta, Orthoptera: Gryllidae). В качестве дополнительных объектов были использованы самки серой мясной мухи Sarcophaga sp. L. (Insecta, Diptera: Sarcophagidae) и скорпионницы Panorpa communis L. (Insecta, Mecoptera: Panorpidae), а также мучного хрущака Tenebrio moliíor L. (Insecta, Coleóptera: Tenebrionidae), а помимо насекомых - особи гигантской африканской улитки Achatina fúlica (Gastropoda, Stylommatophora: Helicidae).

Подготовка материала для флуоресцентной микроскопии. Гонады изолировали в растворе Рингера для насекомых (0.75 % NaCl; 0.035 % KCl; 0.021 % СаС12) или в физиологической среде OR2 (Wallace et al., 1973). Для флуоресцентного окрашивания использовали давленые препараты, приготовленные по методике Хулсебоса с соавторами (Hulsebos et al., 1984).

Антитела и нммунофлуоресцентное окрашивание препаратов. Препараты инкубировали в течение 10 мин в 10 %-ном растворе фетальной сыворотки, приготовленной на PBS, а затем - в растворе соответствующих первых антител (Таблица) в течение ночи во влажных камерах при 4 °С, после чего инкубировали в растворе вторых антител в течение 1.5 ч при комнатной температуре. В качестве вторых антител использовали антитела, конъюгированные с флуорохромами FITC или Alexa 594 при разведении 1:200.

При проведении двойного иммунофлуоресцентного окрашивания препараты инкубировали в смеси соответствующих антител (Cmarco et al., 1999). После обработки антителами препараты заключали или в 50 %-ный раствор глицерина на PBS, содержащий 1 мг/мл парафенилендиамина, с добавлением DAPI (1 мкг/мл) или йодистого пропидия (2.5 мкг/мл), или в среду Vectashield*1, предварительно окрашивая в течение 2-3 мин с помощью ДНК-специфичного флуорохрома To-Pro-3 (1 мкг/мл).

Использованные в работе антитела_Таблица.

« Антитела Выявляемый антиген Разведение/ концентрация Источник

а» н S а» h С-30 Двухнепо'гсчная ДНК 1:20 Chemicon International, USA

2 5 к я s 41 = 3 Е s л л 8WG16 Нефосфорилированный СТО РНК-иол 11 1:200 Thompson et al., 1989 Santa Cruz, USA

S i ARNA3 Эпитоп вне СТО РНК-пол II 5 мкг/мл Krämer et al., 1980

о Y12 Бт-эпигон мяРНП 1:1 Lerner et al., 1981

ü о X о K12I Триметилгуанозиновый кэп мяРНК 1 мкг/мл Krainer, 1988

Е aSC35 5Я-белок БС35 5 мкг/мл Fu and Maniatis, 1990

aRNAP Гнперфосфорилированный СТО РНК-пол И 1:800 Kim and Dahmus, 1986

£ s 3 J s т j а R288 С-концевой фрагмент молекулы коилина рХО, 1:200 Andrade et al., 1991

R S ф о я н ass SI-1 Назальный фактор транскрипции ТР1Ю 1:50 Santa Cruz, USA

м § в в « ч N-15 Ы-конец белка коактиватора транскрипции рЗОО 1:50 Santa Cruz, USA

в C-20 С-конец коактиватора транскрипции СВР 1:50 Santa Cruz, USA

Микроинъекции U7 мяРНК. В ооциты инъецировали меченную флуоресцеином U7 мяРНК шпорцевой лягушки (Wu et al., 1996). В качестве контроля использовали меченую РНК, не гомологичную ни одной из известных клеточных РНК (обе конструкции предоставлены проф. Дж. Голлом). Инъекции проводили с помощью микроинъектора Eppendorf 5242. После микроинъекций овариолы инкубировали в среде Грейса для насекомых в течение 12 ч во влажных камерах при комнатной температуре. Затем готовили давленые препараты овариол, которые докрашивали в течение 2 мин в растворе То-Рго-3, заключали в среду Vectashield и анализировали с помощью конфокального микроскопа Leica TCS SL.

Микроинъекции 5-бромоуридин-5'-трнфосфата (бромо-УТФ). Для инъекций использовали раствор 100 мМ бромо-УТФ (Sigma), приготовленный на инъекционном буфере (140 мМ KCl, 2 мМ PIPES, pH 7.4) (Wansink et al., 1994). После инъекций овариолы инкубировали в среде Грейса в течение 0.5-2 ч во влажных камерах при комнатной температуре. Затем готовили давленые препараты овариол, которые обрабатывали моноклональными антителами к бромодезоксиуридину (Sigma) при разведении 1:500- 1:1000, затем FITC-конъюгированными вторыми антителами (1: 200) и докрашивали То-Рго-3. В качестве контроля использовали препараты не инъецированных ооцитов, окрашенные с помощью антител к бромодезоксиуридину.

Обработка актипомнцином D. Изолированные ооциты A. fiilica инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре в среде OR2, содержащей 5 мкг/мл актиномицина D. Овариолы A. domesticus инкубировали в течение ночи при комнатной температуре в среде Грейса, содержащей 100 мкг/мл актиномицина D. Концентрация ингибитора была выбрана так, чтобы заблокировать транскрипцию, осуществляемую всеми тремя РНК-полимеразами (Perry and Kelley, 1970), а также с учетом видовых особенностей объектов (Методы биологии развития, 1974). Время инкубации подбирали экспериментальным путем. Контрольные препараты инкубировали в тех же условиях, но без добавления ингибитора в среду.

Обработка DRB. Овариолы A. domesticus инкубировали при комнатной температуре в среде Грейса, содержащей 500 мкМ DRB (Morgan et al., 2000). Время инкубации подбирали экспериментальным путем.

Флуоресцентная и конфокальная микроскопия. Препараты анализировали с помощью лазерного сканирующего конфокального микроскопа Leica TCS SL (Heidelberg, Germany), с использованием аргонового (488 нм) и гелий-неоновых (543 нм и 633 нм) лазеров. Для предотвращения возможного перекрывания спектров флуоресценции красителей при анализе препаратов с тройной обработкой использовали последовательное сканирование кадров по каждому каналу, предварительно осуществляя корректировку спектральных каналов, а затем совмещали полученные изображения.

Микроскопия по Номарскому и выявление ДНК в нефиксированных ядрах. Нефиксированные овариолы или изолированные ядра помещали в каплю физиологического раствора (около 5 мкл), содержащего 1 мкг/мл DAPI, и просматривали с помощью флуоресцентного микроскопа Leica DM IRB, оснащенного оптикой по Номарскому. Настройку дифференционного интерференционного контраста проводили в соответствии с рекомендациями фирмы-изготовителя. Изображения записывали с помощью цифровой камеры Leica DFC 320.

Стандартная электронная микроскопия. Гонады фиксировали в 2.5%-ном растворе глутаральдегида, приготовленном на 0.05 M какодилатном буферном растворе (pH 7.4) в течение ночи при 4 °С, отмывали в нескольких сменах какодилатного буфера, после чего дофиксировали в 4 %-ном растворе OsC>4, приготовленном на том же буфере, в течение 1.5 ч при комнатной температуре. Образцы заключали в смолу Эпон-812. Полутонкие срезы толщиной 1-1.5 мкм окрашивали в смеси 1 %-ного раствора метиленового синего и 1 %-ного раствора буры при нагревании. Ультратонкие срезы контрастировали в насыщенном спиртовом растворе уранилацетата и затем цитратом свинца, после чего просматривали в электронном микроскопе JEM 7А при ускоряющем напряжении 80 кВ.

Иммуноэлектронная микроскопия. Материал фиксировали в растворе, содержащем 4 % параформальдегида и 0.5 % глутаральдегида на PBS, в течение 2 ч при комнатной температуре, после чего дофиксировали в 2 %-ном растворе параформальдегида на PBS в течение ночи, отмывали в течение 10 мин в PBS, содержащем 0.05 M NH4CI, и заключали в смолу LR White. Для предотвращения неспецифического связывания антител ультратонкие срезы инкубировали в PBS, содержащем 0.5 % желатина, 0.05 % Tween 20 (pH 7,4) в течение 10 мин, после чего - в растворе первых антител (Таблица) во влажных камерах в течение ночи при 4 °С. Сетки отмывали в PBS, содержащем 0.1 % желатина, 0.05 % Tween 20 (pH 7,4), и инкубировали 1.5 ч при комнатной температуре в растворе вторых антител, в качестве которых использовали козьи антитела против иммуноглобулинов мыши при разведении 1:10 или иммуноглобулинов кролика при разведении 1:20, коньюгированные с коллоидным золотом диаметром частиц 10 или 15 нм соответственно (BBInternational). Срезы контрастировали в насыщенном спиртовом растворе уранилацетата. В случае двойного мечения сетки последовательно инкубировали в течение 2 ч в растворе соответствующих первых антител, а затем в течение 1.5 ч в смеси растворов вторых антител при комнатной температуре.

Электрофоретическое разделение белков и иммуноблотинг. Выделенные вручную ядра ооцитов A. domesticas, Т. moliíor (около 100 ядер на дорожку) или гомогенизированные овариолы Р. communis и Sarcophaga помещали в буфер, содержащий 62.5 mM Tris-HCl, pH 6.8, 10 % глицерина, 2 % SDS, 5 % 2-меркаптоэтанола (Laemmli, 1970). Белковые экстракты разделяли в 10 %-ном ПААГ в присутствии SDS, используя установку Mini-PROTEIN® II (BIO-RAD), и переносили на нитроцеллюлозную мембрану, которую инкубировали в 5 %-ном растворе BSA на PBS, содержащем 0.1 % Tween-20 (PBST) в течение 1 ч при комнатной температуре, а затем - в растворе антител R288 (1:5000) в течение ночи при 4 °С. После отмывки в PBST мембрану на 2 ч помещали в раствор вторых антител, коньюгированных с пероксидазой хрена, в разведении 1:10000, при комнатной температуре. Белки выявляли методом усиленной хемилюминесценции (ECL, Amersham).

РЕЗУЛЬТАТЫ

Строение овариол домового сверчка. Морфодинамика ядерных структур диплотенных ооцитов Acheta domesticus. Парные женские гонады домового сверчка Acheta domesticus состоят примерно из 100-120 яйцевых трубок паноистического типа. Длительная стадия диплотены, соответствующая периоду большого роста ооцитов, была нами разделена на три последовательные стадии по состоянию хромосомно-ядрышкового аппарата, а также количеству и внутренней организации телец Кахала (ТК) (Степанова и др., 2007).

В ядрах ооцитов I стадии присутствуют 1-2 нуклеолярные массы, образованные множеством мелких амплифицированных ядрышек, расположенных вокруг так называемого большого хромомера, представляющего собой результат амплификации рДНК 6-й хромосомы; хромосомы равномерно распределены по ядру. Кроме ядрышек в ооцитах I стадии присутствуют несколько различающихся по размеру структур правильной сферической формы, представляющих собой ТК (см. ниже).

В ядрах ооцитов II стадии хромосомы по-прежнему

распределены по всему объему ядра, в котором все еще различим хромомер, значительно

уменьшающийся в размерах этой стадии. Нуклеолярные массы фрагментируются, а ядрышки неравномерно распределяются по нуклеоплазме. Количество ТК в ядре уменьшается, и к концу II стадии обнаруживается, как правило, единственное ТК. На данной стадии ТК могут иметь как однородную организацию, подобно таковой на I стадии, так и усложненную внутреннюю структуру (рис. 1).

На III стадии хромосомы имеют вид ламповых щеток и по-прежнему распределены по всему ядру. Хромомер более не обнаруживается. В ядрах всегда присутствует лишь одиночное крупное ТК (до 30 мкм в диаметре), которое всегда имеет сложную внутреннюю организацию (рис. 1 ; 2, а).

Оценка транскрипционной активности хромосом ооцитов A. domesticus с помощью микроинъекций бромо-УТФ. В ядрах ооцитов всех трех стадий выявлено включение бромо-УТФ, что свидетельствует о сохранении ими синтетической активности. Сигнал выявлялся дискретно, в виде небольших флуоресцирующих пятен.

Ультраструктурная организация телец Кахала в ооцитах домового сверчка. На ультраструктурном уровне ТК ооцитов домового сверчка, находящихся на I и в начале II стадии, выглядят однородными образованиями, состоящими из плотно упакованных тонких (примерно 5 нм) фибрилл. «Сложное» ТК ооцитов III стадии включает три области: а) тонкофибриллярный матрикс, состоящий из плотно упакованных фибрилл толщиной около 5 нм; б) центральную полость (ЦП), внутри которой обнаруживаются отдельные гранулы (диаметром около 40 нм); в) фиброгранулярное тельце, эксцентрично расположенное внутри ЦП, - «внутренний» КИГ, который состоит из гранулярного материала (гранулы диаметром 35-45 нм), ассоциированного с участками, образованными тонкими (порядка 5 нм), очень плотно упакованными фибриллами (рис. 2, б) «внутреннего» КИГ неровная, возможно, из-за постоянного присоединения-отсоединения от его поверхности гранул, обнаруживаемых в ЦП (Stepanova et al., 2007).

Рис. 1. Схема организации и морфодинамики ТК в ядрах ооцитов А. ¿¡отеяНсия. КИГ — «внутренний» кластер интерхроматиновых гранул.

Pftc. 2, Ялерные структуру диплотенных ооцитов домового сверчка Acheta dornest icus в норме (я, б, <>) н после обработки о вар иол с помощью ингибитора транскрипции DRB (я, <)).

а изолированное ядро ди плотен и о го ооцита Ш стадии. Оптика по Номарекому. тк тельца Кахала.

О ультратонкий срез фрагмента «сложного» ТК. В центральной полости (цф расположен кластер ивтерхром атино вых гранул (киг), в состав которого входят фибриллярные юны {стрелки), м матрнкс ТК.

в Тельце Кахала витсллогенкых ооцитов А. domesticus после инкубации овариол в среде с HRB. 11а периферии его видны многочисленные KU Г (стрелки), м матрикс ТК; 1/п центральная полость.

ультраструктур пая организация кластеров интерхроматиновых гранул ядер диплотенных ооцитов сверчка в норме.

'> кластеры интерхроматнновых гранул (№<■) в нуклеоплазмс ядер ооцитов домового сверчка, после инкубации овариол в среде с DRB.

Шсштабные линейки 20 мкм (о): I мкм (6. в, ()), 0,5 м км (¿>).

Идентификация и молекулярный состав ТК в ооцитах домового сверчка. Для

окончательного решения вопроса о гомологии ТК ооцитов сверчка соответствующим структурам других клеток мы предприняли их комплексное изучение, нацеленное на их идентификацию и описание молекулярного состава.

В качестве одного из маркеров ТК был использован белок коилин. Вестерн-блот анализ белков ядер ооцитов A. domesticas с антителами к р80-коилину человека выявил единственную полосу специфического окрашивания, соответствующую белку с молекулярной массой примерно 38 кДа (рис. 3, I) (Stepanova et al., 2007), что значительно меньше массы р80-коилина млекопитающих, которая составляет 80 кДа (Andrade et al., 1991).

Иммуноблотинг белков овариол P. communis показал, I Л III IV что данные антитела связывают белок массой около 43

210__кДа; при этом на мембране выявляются две близко

^g__расположенные полосы (рис. 3, III, стрелка), которые,

по-видимому, соответствуют нефосфорилированной и 82 — фосфорилированной формам коилина в случае

использования гомогенатов целых овариол, содержащих разнородный клеточный материал. В t Ж ядерных экстрактах T. molitor антитела к коилину 40 — __ srs связываются с белком молекулярной массой около 70

кДа (рис. 3, Я), что соответствует ранее полученным данным (Bogolyubov and Parfenov, 2001). Что касается * экстракта белков овариол Sarcophaga, то четкой

специфической реакции выявлено не было (рис. 3, IV).

Рис. 3. Иммуноблот При непрямом иммунофлуоресцентном

содержимого выделенных ядер окрашивании давленых препаратов овариол домового

ооцитов (1,11) и лизатов овариол сверчка с помощью сыворотки R288 к коилину

(III, IV) после обработки обнаружено, что только ТК окрашиваются с помощью антителами R288 к коилину.

этих антител. В случае I К со сложной организацией метка выявлялась только в фибриллярном матриксе.

Однако использование антител к коилину в иммуноцитохимических опытах, очевидно, не может служить единственным подходом для идентификации этих структур на всех объектах. Так, мы получили отрицательные результаты при попытке электронного иммуномечения с помощью антител R288 ядерных структур Sarcophaga и A. fúlica.

Идентификация телец Кахала с помощью микроииъекций U7 мяРНК. В опытах по микроинъекциям в ооциты Acheta флуоресцентно меченной U7 мяРНК оказалось, что через 12 ч после инъекции специфическое накопление сигнала происходит именно в ТК, а в случае сложных ТК - исключительно в их матриксе. Проведенные опыты окончательно подтвердили, что данная структура ооцитов домового сверчка представляет собой ТК.

Иммунологическая характеристика ТК ооцитов сверчка с помощью антител к факторам транскрипции, сплайсинга пре-мРНК и процессинга пре-рРНК.

Фибрилларип - мажорный компонент ТК ооцитов домового сверчка. В опытах по иммунофлуоресцентному окрашиванию ядер при помощи антител к фибрилларину -белку плотного фибриллярного компонента ядрышек - наблюдалось свечение как многочисленных ядрышек, так и матрикса ТК. В опытах по двойному иммуномечению была выявлена колокализация коилина и фибрилларина в матриксе ТК (рис. 4, I а).

/ II Ш IV

Pue. 4. Ядра диилотенных ооцитов Acheta domesticus в норме (а) и после инкубации о вар пол в среде с ингибиторами (б). Каждая иллюстрация представляет собой совмещение конфокальных изображений одного и того же ядра после обработки соответствующими антителами и окраски ДНК с помощью красителя То-Рго-3.

Распределение факторов сплайсинга (мяРНП и SR-белка SC35) в составе сложных ТК ооцитов домового сверчка. Использование антител к Sm-эпитопу мяРНП и триметилгуанозиновому (ТМГ) кэпу мяРНК выявило интенсивное окрашивание ТК, а в случае сложноорганизованных ТК - как матрикса ТК, так и внутреннего КИГ. При двойном окрашивании препаратов антителами против мяРНП и коилина наблюдалась колокализация флуоресцентных сигналов только в матриксе ТК (рис. 4, II, а). На ультраструктурном уровне при использовании антител к Sm-эпитопу мяРНП и ТМГ-кэпу мяРНК было выявлено интенсивное равномерное включение метки в матрикс ТК.

В ядрах ооцитов I и II стадий однородные по структуре ТК не реагируют с антителами против белкового фактора сплайсинга SC35, что подтверждает более ранние наблюдения других авторов (Gall et al., 1995). На более поздних стадиях (поздняя II и III стадии) с помощью конфокальной микроскопии после обработки препаратов антителами к белку SC35 была обнаружена не только флуоресценция внутреннего КИГ, но и слабое, но тем не менее различимое свечение матрикса сложных ТК (рис. 4, III, а). Эти данные нашли подтверждение в ходе наших экспериментов по двойному иммуномечению ультратонких срезов, в ходе которых выявлена колокализация белка SC35 и коилина в матриксе ТК.

ТК ооцитов домового сверчка содержат коактиваторы транскрипции СВР/рЗОО и базальный фактор транскрипции TFIID, но не содержат РНК-пол II. Анализ ультратонких срезов ТК после обработки их с помощью антител к белкам-коактиваторам транскрипции СВР/рЗОО и к белку ТВР - ТАТА-связывающему компоненту базального фактора транскрипции TFIID - выявил равномерное и весьма интенсивное мечение матрикса ТК. Материал, расположенный в ЦП, включая внутренний КИГ, практически не метился с помощью этих антител.

Для выявления РНК-пол II были использованы антитела к двум ее формам -фосфорилированной и нефосфорилированной по С-концевому домену (CTD) большой субъединицы, а также антитела к эпитопу CTD вне сайтов фосфорилирования. В этих опытах все эти антитела не реагировали с матриксом ТК (рис. 4, IV, а).

Идентификация и ультраструктурная организация КИГ в ооцитах насекомых. Для идентификации КИГ были использованы два критерия: высокая концентрация в них факторов сплайсинга, особенно белка SC35, и присутствие в их составе гранулярного материала - интерхроматиновых гранул. По этим признакам среди экстрахромосомных структур ооцитов A. domesticus идентифицированы КИГ, лежащие свободно в нуклеоплазме (до 5 на ядро), и «внутренний» КИГ, расположенный в центральной полости ТК. Все эти структуры - фиброгранулярные образования размером 0.5-3 мкм, состоящие из гранулярного материала (диаметр гранул 35-45 нм), включающие хорошо выраженные фибриллярные области (толщина фибрилл около 5 нм), а также участки, образованные слабо оформленными гранулами, заключенными в тонкофибриллярный матрикс (рис. 2, г). При использовании антител к ТМГ-кэпу мяРНК и белку SC35 в ядрах ооцитов было обнаружено интенсивное связывание этих антител с КИГ, преимущественно с гранулярным материалом.

В ооцитах некоторых других насекомых, имеющих по сравнению с A. domesticus гонады иного типа, КИГ по составу и ультраструктурной организации оказались сходными.

В диплотенных ядрах ооцитов мясной мухи Sarcophaga в состав КИГ, имеющих размеры от 0.5 до 5 мкм, входят обособленные фибриллярные и гранулярные (диаметр гранул около 20-40 нм) зоны. После обработки ультратонких срезов антителами к белку SC35, а также к Sm-эпитопу мяРНП и ТМГ-кэпу мяРНК было выявлено интенсивное включение метки в гранулярный материал КИГ. Кроме того, было выявлено включение метки в фибриллярные области КИГ после обработки срезов антителами к РНК-пол II.

В ядрах вителлогенных ооцитов Т. molitor обнаруживаются относительно мелкие (в среднем около 2 мкм) КИГ. На ультраструктурном уровне они также имеют

фиброгранулярную организацию. В их составе можно обнаружить как гранулы 30-40 нм в диаметре, так и фибриллы около 10 нм толщиной. В большинстве случаев в состав КИГ входит материал обоих типов. В одних случаях материал разного типа может занимать довольно обособленные области, а в других - располагаться в составе телец вперемешку. При анализе ультратонких срезов, обработанных антителами к белку SC35, было выявлено интенсивное мечение гранулярного материала в составе КИГ.

За пределами класса насекомых - у моллюска Achatina fúlica, обладающего типичным солитарным оогенезом, - в нуклеоплазме ооцитов обнаружены единичные структуры, имеющие сложную морфологическую организацию (Степанова и Боголюбов, 2003). На периферии их центрального фибриллярного матрикса расположена область, образованная крупными (диаметром около 55-60 нм) гранулами и тонкими фибриллами. Гранулярный материал при этом интенсивно метится антителами к белку SC35. Мы считаем, что он представляет собой интерхроматиновые гранулы.

Морфологические эффекты действия DRB и актиномнцина D на ядерные структуры ооцитов домового сверчка. В экспериментах по искусственному подавлению транскрипции нами были использованы два ингибитора транскрипции: актиномицин D и DRB. Несмотря на разный механизм их действия, морфологические изменения ядер оказались во многом сходными.

На светооптическом уровне четко выраженные изменения организации ядер были отмечены через 6 ч инкубации овариол в среде с ингибиторами. На ультратонких срезах ядер ооцитов, обработанных ингибиторами транскрипции, отчетливо выявляли участки конденсированного хроматина и ядрышки, лишенные гранулярного компонента. В связи с хромосомами обнаружены мелкие (около 0.5-1 мкм) КИГ. Кроме того, многочисленные КИГ были выявлены и в нуклеоплазме вне связи с хромосомами, причем их количество по сравнению с контролем увеличилось в несколько раз. Появившиеся после обработки ингибиторами КИГ разнообразны по морфологической организации. В состав отдельных КИГ может входить только гранулярный материал, в состав других - и гранулярный, и фибриллярный материал с разной плотностью упаковки фибрилл (рис. 2, д). При этом в КИГ происходит еще большая, по-сравнению с нормой, сегрегация фибриллярного и гранулярного материала.

Отмечены значительные изменения организации не только КИГ, но и ТК ооцитов сверчка после обработки овариол их ингибиторами транскрипции. На серийных ультратонких срезах на периферии ТК обнаружено появление сплошного слоя гранул диаметром около 35-45 нм, что соответствует размеру гранул в КИГ, а также выявлены образования, по организации сходные со «свободными» КИГ (рис. 2, б). В случае сложных ТК на поверхности матрикса, обращенной к центральной полости, также появляются гранулярные области. Внутри центральной полости значительно увеличивается объем, занимаемый внутренним КИГ, который лежит в непосредственном контакте с матриксом ТК. В состав внутреннего КИГ, как и в норме, входят четко сегрегированные зоны, образованные гранулярным и фибриллярным материалом. Однако после обработки ооцитов ингибиторами наблюдается существенное увеличение фибриллярных зон.

Иммуноцитохимическая характеристика ядерных структур (ТК и КИГ) ооцитов домового сверчка при действии ингибиторов транскрипции. На давленых препаратах ядер ооцитов, обработанных ингибиторами транскрипции, после окраски То-Рго-3 отчетливо выявляется конденсация хромосом, имеющая место при подавлении транскрипции; при этом происходит ретракция боковых петель ламповых щеток. Обработка ооцитов как актиномицином D, так и DRB, не влияла на распределение в ядре коилина: как и в норме, антитела к коилину неизменно связывались только с матриксом ТК; так же не изменился характер окрашивания ядерных структур и с помощью антител к фибрилларину. Как и в норме, с помощью этих антител интенсивно метились многочисленные ядрышки и ТК (рис. 4,1, б).

При окрашивании препаратов с помощью антител к ТМГ-кэпу мяРНК, также как и в норме, обнаружено свечение ТК, но по сравнению с контролем, увеличилось количество светящихся доменов в нуклеоплазме (рис. 4, II, б), которые на ультраструктурном уровне соответствуют интенсивно включающим метку КИГ; причем в этом случае метка выявлялась исключительно в гранулярном материале, а фибриллярные зоны КИГ оставались немечеными.

Появление многочисленных, различающихся по размеру светящихся доменов наблюдали в нуклеоплазме и после окрашивания ядер с использованием антител к белку SC35. В данном случае часть таких образований находилась в непосредственном контакте с ТК. При анализе оптических срезов сложного ТК было обнаружено свечение вокруг внешней границы матрикса и вдоль границы центральной полости. При двойном иммуномечении препаратов с использованием антител к SC35 и коилину значительной колокализации этих белков в матриксе ТК обнаружено не было. Внутри центральной полости наблюдали флуоресценцию области, соответствующей внутреннему КИГ (рис. 4, III, б). На ультратонких срезах, обработанных антителами против белка SC35, на периферии ТК выявлено интенсивное включение метки в гранулярный слой на периферии ТК. Матрикс ТК ооцитов, обработанных ингибиторами, с помощью этих антител не метился. Гранулярный материал в составе КИГ, появившихся в нуклеоплазме при действии DRB и актиномицина D, интенсивно метится с помощью антител к белку SC35.

При иммунофлуоресцентном окрашивании ядер с помощью антител к РНК-пол II не удалось выявить сколько-нибудь заметных ее количеств в ТК как на контрольных препаратах, так и на препаратах ядер ооцитов, обработанных актиномицином D и DRB. В то же время наблюдали появление мелких светящихся доменов (рис. 4, IV, б), которые на ультраструктурном уровне, вероятно, соответствуют фибриллярным зонам КИГ, метящимся с помощью антител к РНК-пол И.

Иммуноэлектронная микроскопия не выявила изменений по сравнению с контролем в характере мечения ТК ооцитов, обработанных актиномицином D, при использовании антител к белкам СВР/рЗОО. При этом отмечалось накопление этих белков в КИГ.

ОБСУЖДЕНИЕ

О транскрипционной активности хромосом при автотрофном типе оогенеза. В

гонадах Acheta domesticus, относящихся к паноистическому типу, отсутствуют питающие клетки, и следует ожидать, что потребность растущей яйцеклетки в разных типах РНК обеспечивается ядром самого ооцита. Полученные нами результаты вполне соответствуют данному предположению. Действительно, мы никогда не наблюдали конденсации хромосом на стадии диплотены и их объединения в кариосферу, как это происходит в оогенезе многих животных и служит признаком определенной инактивации хромосомного аппарата (Gruzova and Parfenov, 1993).

В настоящей работе с помощью микроинъекций в ооплазму бромо-УТФ нам удалось выявить синтетическую активность ядер ооцитов A. domesticus. Интенсивность включения предшественника была примерно одинакова на всех стадиях роста (ядра ооцитов I, II и III стадий по нашей классификации), хотя и не очень высока.

Экстрахромосомные ядерные структуры ооцитов насекомых с паноистическими яичниками. Сведения о составе ядерных телец ооцитов таких насекомых до недавнего времени ограничивались светооптическими данными (Gall et al., 1995).

В настоящей работе нам удалось показать ультраструктурную организацию ТК ооцитов сверчка и проследить их динамику в ходе стадии диплотены. Было обнаружено, что по мере роста ооцита ТК приобретают сложную внутреннюю организацию и включают три области: тонкофибриллярный матрикс, центральную полость и «внутренний» КИГ. Причем если на II стадии можно найти ТК обоих типов, то на III стадии ядра всех исследованных ооцитов содержали только «сложные» ТК.

Природа внутреннего КИГ была установлена не только по присутствию в его составе гранулярного материала, но и на основании связывания с этим материалом антител к

мяРНП и SR-белку SC35 ведущим компонентам КИГ (Mintz et al., 1999; Lamond and Speetor, 2003).

Присутствие же в ядре ооцитов как свободных КИГ, так и ассоциированных с ТК, хорошо известно на примере ооцитов амфибий (Wu et al., 1991; Gall et al., 1995, 2004). Исследуя организацию и состав различных компонентов сложных ТК ооцитов домового сверчка, в настоящей работе мы впервые документировали факт присутствия в их составе фактора сплайсинга SC35, что придает данным по составу ТК ооцитов и соматических клеток противоречивый характер, поскольку белок SC35 - характерный компонент другого ядерного домена, КИГ.

Проблема идентификации экстрахромосомных ядерных структур в ооцитах. В настоящее время не существует единого критерия для идентификации отличных от ядрышек ядерных органелл (например, ТК или КИГ).

Очевидно, что для этого совершенно не достаточен морфологический критерий, поскольку морфологические особенности экстрахромосомных доменов ооцитов насекомых не только видоспецифичны, но и отличаются довольно широкой изменчивостью в пределах одного вида (Gruzova and Parfenov, 1993).

В настоящее время для идентификации ядерных доменов стал уже традиционным иммунофлуоресцентный подход, хотя и он не является самодостаточным, поскольку обнаруживаемые в той или иной ядерной органелле компоненты присутствуют и в других ядерных компартментах. Тем не менее, в ряде случаев для идентификации ядерных структур удается использовать антитела к определенным «маркерным» компонентам, которые в довольно высокой концентрации локализуются в структуре конкретного типа.

Поскольку экстрахромосомные ядерные структуры ооцитов, как правило, имеют отличную от соматических клеток морфологическую организацию, более объективным, на наш взгляд, является выявление в интересующей структуре комплекса факторов, характерных для конкретной органеллы, в том числе ТК и КИГ. Наиболее адекватными маркерами КИГ, на наш взгляд, являются SR-белок SC35 и мяРНП, а маркером ТК -мяРНП (прежде всего U7 мяРНП) и коилин.

Коилин как маркерный компонент телец Кахала. В настоящее время коилин является наиболее распространенным молекулярным маркером ТК в клетках различного происхождения, хотя он не является консервативным белком.

Однако в нашей работе мы обнаружили специфическую реакцию данных антител с ТК ооцитов сверчка, что позволило использовать их в опытах по двойному иммуномечению данной структуры и подтвердило полученные ранее данные других авторов (Gall et al., 1995). Специфичность работы данных антител на материале ооцитов насекомых была проверена с помощью Вестерн-блотинга, который выявил полосы специфического окрашивания при использовании белковых экстрактов ядер ооцитов или овариол Acheta, Tenebrio и Panorpa. Исключение составили экстракты овариол Sarcophaga. Молекулярный вес выявляемых белков в значительной степени отличался у насекомых разных видов. Так, в ядерных экстрактах ооцитов A. domesticus и T. molitor молекулярная масса белка оказалась равной примерно 38 кДа и 70 кДа соответственно, а в экстракте белков овариол P. communis - около 43 кДа. Во всех случаях масса выявляемого белка отличалась от молекулярной массы коилина (80 кДа) человека и шпорцевой лягушки (Andrade et al., 1991; Turna et al., 1993).

В настоящее время полученных нами данных не достаточно для объяснения различий в молекулярной массе белков, выявляемых на блотах материала овариол и ооцитов разных насекомых с помощью антител к коилину. Мы можем лишь предположить, что этот факт связан с разницей в длине вариабильного срединного участка молекулы коилина у разных видов при наличии консервативного С-концевого домена молекулы, с которым реагируют антитела R288 (Andrade et al., 1991).

Требуют дополнительного изучения наши данные об отсутствии специфического связывания антител против коилина и других компонентов ТК с какими-либо ядерными

тельцами в ооцитах Sarcophaga. Отметим, что морфологическая организация ядра ооцитов Sarcophaga, по нашим наблюдениям, оказывается весьма похожей на таковую Drosophila (Liu et al., 2006b), принадлежащей к тому же отряду Díptera, а в геноме D. melanogaster пока не найдено последовательности, гомологичной коилину человека (Liu et al., 2006а).

U7 мяРНК и тельца Кахала. Помимо присутствия коилина другим адекватным критерием идентификации ТК, на наш взгляд, является связывание с ними U7 мяРНК. Известно, что U7 мяРНК входит в состав ТК соматических клеток млекопитающих (Frey and Matera, 1995) и ооцитов X. laevis, в которых основная ее часть (до 85 %) локализуется именно в ТК (Wu and Gall, 1993). Проведенные недавно специальные эксперименты убедительно доказали, что при инъекции в ооплазму ооцитов X. laevis флуоресцентно меченной U7 мяРНК она ассоциирует с Sm-белками, образуя стабильные U7 мяРНП-комплексы, которые затем импортируются в ядро и концентрируются в ТК точно так же, как и эндогенные U7 мяРНП (Handwerger et al., 2003). Установлено также, что U7 мяРНК и коилин могут формировать специфичные комплексы (Bellini and Gall, 1998). Именно коилин, представляющий собой, как известно, челночный белок, способен доставлять в ТК различные молекулярные комплексы, в том числе и U7 мяРНП (Bellini and Gall, 1999).

Паши эксперименты по микроинъекциям в ооплазму A. domesticas меченной флуоресцеином U7 мяРНК, выполненные с целью дополнительной идентификации ТК в ооцитах A. domesticas, показали отчетливое накопление этого компонента в матриксе этих внутриядерных образований. Следует подчеркнуть, что ни с какими другими ядерными структурами ооцитов A. domesticus связывания U7 мяРНК не наблюдали. Ранее подобные эксперименты позволили идентифицировать ТК среди чрезвычайно гетерогенной популяции экстрахромосомных ядерных структур ооцитов P. communis (Batalova et al., 2005). В то же время, в клетках Drosophila накопление U7 мяРНК было выявлено не в ТК, а в отдельных ядерных доменах, расположенных в связи с гистоновыми генными локусами на 2-й хромосоме и получивших название HLB (histone locus body) (Liu et al., 2006a). Чем вызвано разделение компонентов ТК на две различные структуры в ооцитах Drosophila, остается неясным; во всяком случае, в ооцитах A. domesticus такого разделения мы не наблюдаем и структуры, подобные HLB, не обнаруживаются.

О присутствии белка SC35 в тельцах Кахала ооцитов насекомых. Белок SC35, как известно, не является компонентом ТК соматических клеток млекопитающих (Raska et al., 1991; Spector et al., 1991; Matera, 1999). В транскрипционно активных ядрах ооцитов амфибий белок SC35 присутствует в ТК только в составе расположенных на их поверхности В-снёрпосом (КИГ) и в морфологически подобных им внутренних включениях, но не в матриксе ТК (Wu et al., 1991; Gall et al., 1999).

В настоящей работе мы подтвердили более ранние наблюдения других авторов (Gall et al., 1995), что белок SC35 не выявляется в гомогенных ТК молодых ооцитов А. domesticus. Однако нам удалось показать присутствие некоторого количества белка SC35 и в матриксе сложных ТК.

Таким образом, ТК ооцитов A. domesticus, в отличие от ТК соматических клеток млекопитающих, участвуют, вероятно, не только в перераспределении мяРНП, но и белка SC35. В ТК активно транскрибирующих ядер ооцитов сверчка этот белок, в отличие от мяРНП, действительно не накапливается, однако при подавлении транскрипции с помощью ингибиторов происходит его накопление в связи с ТК в виде гранул, подобно тому, как это имеет место в нормальных условиях на неактивных стадиях оогенеза насекомых с меронстическими яичниками (Bogolyubov et а!., 2000; Batalova et al., 2005).

Выявление компонентов РНК-пол П-транскрипции в ТК ооцитов сверчка. Несмотря на то, что вновь синтезированные пре-мРНК отсутствуют в ТК (Raska, 1995; Cmarco et al., 1999), компоненты, принимающие участие в транскрипции, осуществляемой РНК-пол II, включая многие транскрипционные факторы, обычно являются компонентами ТК соматических клеток млекопитающих (Cioce and Lamond, 2005). В матриксе ТК ооцитов амфибий была обнаружена фосфорилированная по серину-5 РНК-пол II (Doyle et

al., 2002), транскрипционные факторы (ТВР и TFIIF), а также факторы дробления и полиаденилирования CstF77 и CPSF100 (Morgan et al., 2000) и была предложена гипотеза об участии ТК в регуляции процессов транскрипции. Неожиданные данные были получены при выявлении PIIK-пол II в ТК ооцитов некоторых насекомых с мероистнческими овариолами: Р. communis, Т. molitorw Vespula germanica (Баталова и др., 2000; Batalova et al., 2005; Jaglarz et al., 2005). Оказалось, что в ТК ооцитов этих насекомых присутствуют обе (фосфорилированная и нефосфорилированная) формы РНК-пол II, причем, поскольку известно, что синтеза РНК в ТК не происходит, роль двух форм РНК-пол II в составе ТК остается неясной.

Что касается ооцитов сверчка, то с помощью конфокальной и иммуноэлектронной микроскопии при использовании антител к трем различным эпитопам РНК-пол II нам не удалось выявить сколько-нибудь заметных количеств РНК-пол 11 в матриксе ТК. Однако другие компоненты, ассоциированные с голоэнзимом РНК-пол II, представлены в ТК ооцитов сверчка. Здесь накапливается белок ТВР, являющийся ТАТА-связывающей субъединицей базального фактора транскрипции TFIID (Thompson et al., 1993), а также белки-коактиваторы транскрипции СВР/р300, функция которых состоит в облегчении связывания голоэнзима РНК-пол II и регуляторных белков с ДНК при инициации транскрипции (von Mikecz et al., 2000).

Поскольку нельзя было исключить, что в активно транскрибирующих ядрах ооцитов A. clomesticus РНК-пол II быстро проходит через ТК и в конкретный момент времени присутствует в нем в количествах, которые невозможно обнаружить иммуноцитохимически, мы блокировали транскрипцию с помощью ингибиторов - DRB и актиномицина D, ожидая при этом выявить заметное накопление РНК-пол II в ТК. Однако этого не наблюдалось: РНК-пол II выявлялась не в ТК, а в фибриллярных зонах, ассоциированных с КИГ.

Обработка ингибиторами заметно не повлияла на содержание TFIID и СВР/р300 в ТК; наряду с этим, отмечалось накопление белков СВР/р300 в КИГ подобно тому, как это происходит в соматических клетках млекопитающих (von Mikecz et al., 2000).

Факт отсутствия заметных количеств РНК-пол II в ТК ооцитов A. domesticus заслуживает специального обсуждения в связи с активно разрабатываемой в настоящее время моделью функционирования ТК (Gall et al., 1999; Gall, 2000, 2001), которая, прежде всего, основывается на обнаружении в ТК ооцитов Xenopits компонентов транскрипции, осуществляемой всеми тремя РНК-полимеразами. Основная идея этой модели заключается в том, что ТК представляет собой первичный ядерный домен, в котором собираются сложные структурные комплексы (транскриптосомы), вовлеченные в процессинг разных видов РНК. После сборки такие комплексы перераспределяются к соответствующим участкам хроматина.

Очевидно, что к ТК ооцитов сверчка данная модель применима лишь с большими оговорками п требует серьезных уточнений, построенных на дальнейших экспериментальных работах. В настоящей работе мы не обнаружили в ТК ооцитов сверчка РНК-пол И и потому предполагаем, что они, по-видимому, действительно участвуют во внутриядерном распределении некоторых компонентов транскрипции и процессинга пре-мРНК, но их роль в распределении РНК-пол II, вероятно, менее существенна. Эту функцию, по-видимому, принимает на себя другой ядерный компартмент, а именно фибриллярные области в составе КИГ.

Кластеры ннтерхроматиновых гранул ооцитов насекомых. В ооцитах А. domesticus нам впервые удалось идентифицировать КИГ, которые в соматических клетках, по-видимому, представляют собой ядерные домены, в которых происходит накопление-сборка-рециклирование факторов сплайсинга (Puvion et al., 1984; Spector et al., 1991; Puvion and Puvion-Dutilleul, 1996).

В ядрах ооцитов всех исследованных нами насекомых КИГ имеют сложную и весьма характерную организацию: в состав этих структур входит как гранулярный, так и

фибриллярный материал. Последний часто выявляется в виде хорошо оформленных областей. Правда, неизвестно, насколько такие фибриллярные области по составу и функциям соответствуют фибриллярным зонам, ассоциированным с КИГ (interchromatin granule associated zones, (GAZ), иногда обнаруживаемым в соматических клетках (Visa et al., 1993а; Cmarco et al., 1999) и ооцитах млекопитающих и человека (Parfenov et al., 1998). В фибриллярных зонах КИГ ооцитов A. domesticas и Sarcophaga обнаружена нефосфорилированная форма РНК-пол II, что отличает их, например, от В-снёрпосом (КИГ) ооцитов амфибий, в составе которых не было выявлено РНК-пол II (Doyle et al., 2002). Гранулярный материал (собственно интерхроматиновые гранулы) и в том, и в другом случае всегда содержит белок SC35 - маркерный компонент КИГ.

При действии ингибиторов транскрипции на ооциты A. domesticus было отмечено накопление в КИГ факторов сплайсинга. Наши результаты находятся в соответствии с известными данными о том, что в соматических клетках млекопитающих в ответ на блокирование транскрипции с помощью ингибиторов пропадает диффузное распределение факторов сплайсинга в нуклеоплазме и происходит их накопление в составе многочисленных КИГ (Lamond and Carmo-Fonseca, 1993; Malatesta et al., 1999). Однако, очевидно, подавление транскрипции может приводить и к другим эффектам. Так, при подавлении транскрипции в ооцитах моллюска Achatina fúlica, мы не наблюдали увеличения количества КИГ, а факторы сплайсинга при этом концентрировались вокруг конденсированного хроматина. Подобную картину наблюдали и на другой неактивной модели - в ядрах эмбрионов мыши в состоянии «2-клеточного блока in vitro» (Bogolyubova et al., 2006). С чем связаны такие различия, пока сказать трудно.

Наше исследование является по существу первым, в котором проведен комплексный анализ ядерных структур ооцитов насекомого с паноистическими яичниками. Многие результаты проделанной работы, безусловно, еще требуют детальной проверки в будущем с целью систематического поиска фундаментальных закономерностей организации и функций ядерных доменов. Несомненно одно: ядра ооцитов A. domesticus демонстрируют яркий пример морфофункционального единства различных экстрахромосомных доменов -ТК и КИГ.

ВЫВОДЫ

1. Хромосомы ооцитов Acheta domesticus в течение диплотены сохраняют транскрипционную активность; конденсации хромосом и их объединения в кариосферу, характерных для оогенеза многих насекомых, не происходит.

2. Среди экстрахромосомных ядерных доменов идентифицируются ТК и КИГ.

3. ТК ооцитов A. domesticus имеют сложную организацию и обнаруживают структурную связь с другим ядерным доменом - КИГ.

4. ТК диплотенных ооцитов A. domesticus содержат коилин, фактор процессинга пре-рРНК фибрилларин, факторы сплайсинга пре-мРНК (мяРНП и, в отличие от ТК клеток других типов, - белок SC35), ряд компонентов РНК-пол П-транскрипции (базальный фактор транскрипции TFIID и белки-коактиваторы СВР/рЗОО), но не содержат РНК-иол II.

5. КИГ ооцитов A. domesticus состоят из четко выраженных гранулярных и фибриллярных областей. Организация и молекулярный состав КИГ оказываются сходными у насекомых различных систематических групп, а за пределами класса насекомых - у моллюска Achatina fúlica. Их характерная особенность - присутствие SR-белка SC35.

6. Подавление транскрипции с помощью ингибиторов вызывает существенное изменение морфологии ТК, увеличение количества КИГ в нуклеоплазме, сегрегацию ультраструктурных компонентов ТК и КИГ, но не приводит к перераспределению коилина, фибрилларина, мяРНП, TFIID и СВР/рЗОО и к накоплению в ТК РНК-пол II, которая аккумулируется в фибриллярных областях КИГ.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Баталова Ф.М., Степанова И.С., Боголюбов Д.С. 2000. В ядрах ооцитов скорпионницы Panorpa communis отсутствуют ядрышки. Цитология. 42 (3): 263.

2. Баталова Ф.М., Степанова И.С., Боголюбов Д.С. 2000. Тельца Кахала в ядрах ооцитов скорпионницы Panorpa communis. Цитология. 42 (11): 1037-1047.

3. Боголюбов Д.С., Цветков А.Г., Степанова И.С., Парфенов В.11. 2002. Кариосфера и тельца Кахала в ооцитах жука-чернотелки. Цитология. 44 (9): 863.

4. Степанова И.С., Боголюбов Д.С. 2002. Ядро днплотенных ооцитов гигантской африканской улитки: ультраструктурное и иммуноцитохимическое исследование. Цитология. 44 (9): 907-908.

5. Степанова И.С., Боголюбов Д.С. 2003. РНК-полимераза И и факторы сплайсинга пре-мРНК в ядрах днплотенных ооцитов гигантской африканской улитки Achatina fulica. Цитология. 45 (2): 166-178.

6. Боголюбов Д.С., Степанова И.С. 2003. Идентификация и структурно-функциональная характеристика телец Кахала в ооцнтах насекомых. Цитология. 45 (9): 850-851.

7. Parfenov V., Stepanova I., Batalova F., Pochukalina G., Bogolyubov D. 2004. Nuclear bodies in insect and mammalian oocytes. ELSO 2004 Proceedings. Nice: 278.

8. Баталова Ф.М., Сковородкин И.11., Степанова U.C., Боголюбов Д.С., Парфенов В.H. 2005. Особенности организации ядерных структур ооцитов скорпионницы Panorpa communis. Цитология. 47 (9): 792-793.

9. Степанова И.С., Боголюбов Д.С. 2005. Организация и состав внутриядерных телец ооцитов домового сверчка в норме и при искусственном подавлении транскрипции. Цитология. 47 (9): 834-835.

10. Степанова И.С., Боголюбов Д.С. 2005 Тельца Кахала в ядрах ооцитов домового сверчка Acheta domesticus. Онтогенез. 36 (5): 395.

11. Batalova F.M., Stepanova I.S., Skovorodkin I.N., Bogolyubov D.S., Parfenov V.N. 2005 Identification and dynamics of Cajal bodies in relation to karyosphere formation in scorpionfly oocytes. Chromosoma. 113: 428-439.

12. Степанова И.С., Боголюбов Д.С., Парфенов B.H. 2007. Тельца Кахала в ооцитах насекомых. II. Новые данные по молекулярному составу телец Кахала ооцитов домового сверчка. К вопросу о взаимосвязи телец Кахала и кластеров интерхроматиновых гранул. Цитология. 49(1): 5-20.

Английская версия:

Stepanova I.S., Bogolyubov D.S., Parfenov V.N. 2007. Cajal bodies in insects. II. Molecular composition of Cajal bodies in oocytes of house cricket. Relationship between Cajal bodies and interchromatin granule clusters. Cell and Tissue Biology. 1(1): 14-29.

13. Stepanova I.S., Bogolyubov D.S., Skovorodkin I.N., Parfenov V.N. 2007. Cajal bodies and interchromatin granule clusters in cricket oocytes: composition, dynamics and interractions. Cell Biol. Int. 31: doi: 10.1016/j.cellbi.2006.04.010

СПИСОК ЦИТИРОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ Баталова Ф.М., Степанова И.С., Боголюбов Д.С. 2000. Цитология. 42 (11): 10371047. Методы биологии развития. 1974. М.: Наука, 619 с. Степанова И.С., Боголюбов Д.С. 2003. Цитология. 45 (2): 166-178. Степанова U.C., Боголюбов Д.С., Парфенов В.Н. 2007. Цитология. 49 (1): 5-20. Andrade L.E.C., Chan E.K.L., Raska I., Peebles C.L., Roos G., Tan E.M. 1991. J. Exp. Med. 173: 1407-1419. Bakken A., Morgan G., Sollner-Webb В., Roan J., Busby S., Reeder R.H. 1982. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 79: 56-60. Batalova F.M., Stepanova I.S., Skovorodkin I.N., Bogolyubov D.S., Parfenov V.N. 2005. Chromosoma. 113: 428-439. Bellini M., Gall J.G. 1998. Mol. Biol. Cell. 9: 2987-3001. Bellini M., Gall J.G. 1999. Mol. Biol. Cell. 10: 3425-3434. Bilinski S.M., Kloc M. 2002. Chromosoma 111: 62-68. Bogolyubov D., Parfenov V. 2001. Tissue and Cell. 33: 549-561. Tissue and Cell. 36: 13-17. Bogolyubov D., Alexandrova O., Tsvetkov A., Parfenov V. 2000. Chromosoma. 109: 415-425.

Bogolyubova I.O., Bogoliubova N.A., Bogolyubov D.S. Parfenov V.N. 2006. Tissue and Cell. 38: 389-398. Brasch K.; Ochs R.L. 1992. Exp. Cell Res. 202: 211-223. Cioce M., Lamond Л.1.

2005. Annu. Rev. Cell. Dev. Biol. 21: 105-131. Cmarco D., Verschure P.J., Martin Т.Е., Dahmus M.E., Krause S., Fu X.-D., van Driel R. Fakan S. 1999. Mol. Biol. Cell. 10: 211-223. Cremer Т., Kupper K„ Dietzel S., Fakan S. 2004. Biol. Cell. 96: 555-567. Doyle O., Corden J.L., Murphy C., Gall J.G. 2002. J. Struct. Biol. 140: 154-166. Fakan S. 1994. Trends Cell Biol. 4: 86-90. Frey M.R., Matera A.G. 1995. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 92: 5915-5919. Fu X.-D., Maniatis T. 1990. Nature. 343: 437-441. Gall J.G. 2000. Annu. Rev. Cell. Dev. Biol. 16: 273300. Gall J.G., Tsvetkov A., Wu Z., Murphy C. 1995. Dev. Genet. 16: 25-35. Gall J.G., Bellini M„ Wu Z„ Murphy C. 1999. Mol. Biol. Cell. 10: 4385-4402. Gall J.G., Wu Z., Murphy C„ Gao H. 2004. Exp. Cell Res. 296: 28-34. Gruzova M.N., Parfenov V.N. 1993. Int. Rev. Cytol. 144: 1-52. Handwerger K.E., Murphy C„ Gall J.G. 2003. J. Cell Biol. 160: 495-504. Hulsebos Т., Hackstein J., Henning W. 1984. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 16: 9415-9429. Jaglarz M.K., Biliiiski S.M., Kloc M. 2005. Differentiation. 73: 99-108. Kim YV.-Y., Dahmus M.E. 1986. J. Biol. Chem. 261: 14219-14225. Krainer A. 1988.. Nucl. Acids Res. 16: 9415-9429. Kramer A., Haars R., Kabisch R., Will H., Bautz F.A., Bautz E.K. 1980. Mol. Gen. Genet 180: 193-199. Laemmli U.K. 1970. Nature. 227: 680-685. Lamond A.I., Carmo-Fonseca M. 1993. Trends Cell Biol. 3: 198-204. Lamond A.I., Spector D.L. 2003. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 4: 605-612. Lerner E.A., Lerner M.R., Janeway C.A., Steitz J. 1981. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 78: 27372741. Liu J.-L., Murphy C„ Buszczak M„ Clatterbuck S„ Goodman R., Gall J.G. 2006a. J. Cell Biol. 172: 875-884. Liu J.-L., Buszczak M„ Gall J.G. 2006b. Chromosome Res. 14: 465-475. Malatesta M., Cardinali A., Battistelli S., Zancanaro C., Martin Т.Е., Fakan S., Gazzanelli G. 1999. Anat. Rec. 254: 389-395. Matera A.G. 1999. Trends Cell Biol. 9: 302-309. Matera A.G.

2006. Drosophila Cajal bodies: accessories not included. J. Cell Biol. 172: 791-793. von Mikecz A., Zhang S., Montminy M., Tan E.M., Hemmerich P. 2000. J. Cell Biol. 150: 265-274. Mintz P.J., Patterson S.D., Neuwald A.F., Spahr C.S., Spector D.L. 1999. EMBO J. 18: 4308-4320. Misteli Т., Spector D.L. 1998. Curr. Opin. Cell Biol. 10: 323-331. Morgan G.T., Doyle O., Murphy C., Gall J.G. 2000. J. Struct. Biol. 129: 258-268. Parfenov V.N., Davis D.S., Pochukalina G.N., Kostyuchek D., Murti K.G. 1998. J. Cell Biochem. 69: 72-80. Perry R.P., Kelley D.E. 1970. J. Cell Physiol. 76: 127-139. Puvion E., Viron A., Assens C., Leduc E.H., Jeanteur P. J. Ultrastruct Res. 87: 180-189. Puvion E., Puvion-Dutilleul F. 1996. Exp. Cell Res. 229: 217-225. Raska I. 1995. J. Cell Biochem. 59: 11-26. Raska I., Andrade L.E.C., Ochs R.L., Chan E.K.L., Chang C.M., Roos G., Tan E.M. 1991. Exp. Cell Res. 195: 27-37. Spector D.L., Fu X.-D., Maniatis T. 1991. EMBO J. 10: 3467-3481. Stepanova I.S., Bogolyubov D.S., Skovorodkin I.N., Parfenov V.N. 2007. Cell Biol. Int. 31: doi: 10.1016/j.cellbi.2006.04.010. Thompson C.M., Koleske A.J., Chao D.M., Young R.A. 1993. Cell. 73: 1361-1375. Thompson N.E., Steinberg Т.Н., Aronson D.B., Burgess R.R. 1989. J. Biol. Chem. 264: 11511-11520. Tuma R., Stolk J.A., Roth M.B. 1993. J. Cell Biol. 122: 767-773. Visa N., Puvion-Dutilleul F., Harper F., Bachellerie J.P., Puvion E. 1993. Exp. Cell Res. 208: 19-34. Wallace R.A., Jared D.W., Dumont J.N., Sega M.W. 1973. J. Exp.Zool. 184: 321-333. Wansink D.G., Nelissen R.L., de Jong L. 1994. Mol Biol Rep. 19: 109-113. VVu C.-H., Gall J.G. 1993. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 90: 6257-6259. Wu C.-H., Murphy C„ Gall J.G. 1996. RNA. 2: 811-823. Wu Z., Murphy C., Callan H.G., Gall J.G. 1991. J. Cell Biol. 113: 465-483. Wu Z., Gall J.G. 1997. Chromosoma. 105: 438-443. Zelazowska M., Jaglarz M.K. 2004. Arthr. Struct. Dev. 33: 161-172.

Лицензия ЛР №020593 от 07.08.97

Подписано в печать 26.12.2006. Формат 60x84/16. Печать цифровая. Усл. печ. л. 1,0. Тираж 100. Заказ 1118Ь.

Отпечатано с готового оригинал-макета, предоставленного автором, в Цифровом типографском центре Издательства Политехнического университета. 195251, Санкт-Петербург, Политехническая ул., 29. Тел.: 550-40-14 Тел./факс: 297-57-76

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Степанова, Ирина Сергеевна

Список условных сокращений

1. Введение

2. Обзор литературы

2.1. Ядро ооцита насекомых как модельная система. Классификация типов оогенеза насекомых

2.2. Структурно-функциональная организация ядер ооцитов

2.2.1. Особенности организации хроматина

2.2.1.1. Хромосомы типа ламповых щеток

2.2.1.2. Кариосфера в оогенезе насекомых

2.2.1.3. Амплификация рДНК в ооцитах насекомых

2.2.2. Внутриядерные тельца в ядрах ооцитов

2.2.2.1. Внутриядерные тельца в ядрах ооцитов амфибий

2.2.2.2. Внутриядерные тельца в ядрах ооцитов насекомых

2.3. Ядерные домены эукариотической клетки и их молекулярные компоненты

2.3.1. Перихроматиновые фибриллы

2.3.2. Роль РНК-пол II в координировании процессов созревания

2.3.3. Кластеры интерхроматиновых гранул

2.3.4. Тельца Кахала

2.3.4.1. Коилин

2.3.4.2. U7 мяРНП

2.3.4.3. Тельце Кахала и ядрышко

2.3.4.4. Тельце Кахала и биогенез сплайсосомных мяРНП

2.3.4.5. Тельце Кахала - динамичная структура

3. Материал и методика

3.1. Животные

3.2. Использование различных объектов для конкретных методических задач

3.3. Подготовка материала для флуоресцентной микроскопии

3.4. Антитела и ммунофлуоресцентное окрашивание препаратов

3.5. Микроинъекции 65 3.5.1. и7мяРНК 65 3.5.2.5-бромоуридин-5'-трифосфат

3.6. Ингибиторный анализ

3.6.1. Актиномицин D

3.6.2. DRB

3.7. Светооптическая микроскопия

3.7.1. Флуоресцентная микроскопия

3.7.2. Конфокальная микроскопия

3.7.3. Микроскопия по Номарскому и выявление ДНК в нефиксированных ядрах

3.8. Электронная микроскопия

3.8.1. Стандартная электронная микроскопия

3.8.2. Иммуноэлектронная микроскопия

3.9. Электрофоретическое разделение белков и иммуноблоттинг

4. Результаты 72 4.1. Строение овариол домового сверчка. Морфодинамика ядерных структур ооцитов Acheta domesticus на диплотене

4.2. Оценка транскрипционной активности ядер ооцитов A. domesticus с помощью микроинъекций бромо-УТФ

4.3. Ультраструктурная организация телец Кахала в ооцитах домового сверчка

4.4. Идентификация и молекулярный состав телец Кахала в ооцитах домового сверчка

4.4.1. Вестерн-блотинг антител к коилину с экстрактами белков ооцитов насекомых

4.4.2. Иммуноцитохимическая идентификация телец Кахала в ооцитах

4.4.3. Идентификация телец Кахала с помощью микроинъекций U7 мяРНК

4.4.4. Иммунологическая характеристика телец Кахала ооцитов сверчка с помощью антител к факторам транскрипции, сплайсинга пре-мРНК и процессинга пре-рРНК

4.4.4.1. Фибрилларин - мажорный компонент телец Кахала ооцитов домового сверчка

4.4.4.2. Распределение факторов сплайсинга (мяРНП и SR-белка SC35) в составе сложных телец Кахала ооцитов домового сверчка.

4.4.4.3. Тельца Кахала ооцитов домового сверчка содержат коактиваторы транскрипции СВР/рЗОО и базальный фактор транскрипции TFIID, но не содержат РНКпол им еразу II

4.5. Идентификация и ультраструктурная организация кластеров ^ ^ ^ интерхроматиновых гранул в ооцитах насекомых

4.6. Особенности организации и молекулярного состава телец Кахала и кластеров интерхроматиновых гранул ооцитов в условиях ^ ^ подавления транскрипции с помощью ингибиторов

4.6.1. Морфологические эффекты действия DRB и актиномицина D ^ ^ на ядерные структуры ооцитов домового сверчка

4.6.2. Иммуноцитохимическая характеристика ядерных структур (телец Кахала и кластеров интерхроматиновых гранул) ооцитов домового сверчка при действии ингибиторов ^ транскипции

4.6.3. Действие актиномицина D на ооциты моллюска Achatinafulica 129 5. Обсуждение

5.1. О транскрипционной активности хромосом при автотрофном типе ^ оогенеза

5.2. О ядрышковом аппарате ооцитов насекомых

5.3. Экстрахромосомные ядерные структуры ооцитов насекомых с ^ паноистическими яичниками

5.4. Проблема идентификации экстрахромосомных ядерных структур в J43 ооцитах

5.5. Коилин как маркерный компонент телец Кахала

5.6. U7 мяРНК и тельца Кахала

5.7. О присутствии белка SC35 в тельцах Кахала ооцитов насекомых

5.8. Выявление компонентов РНК-пол П-транскрипции в тельцах Кахала 151 ооцитов сверчка. Функции телец Кахала ооцитов

5.9. Кластеры интерхроматиновых гранул ооцитов насекомых

6. Выводы

Введение Диссертация по биологии, на тему "Организация и динамика телец кахала и кластеров интерхроматиновых гранул в ооцитах домового сверчка Acheta domesticus"

В последние годы функции клеточного ядра являются предметом самого интенсивного изучения с использованием ряда современных методов, развитие которых позволило добиться существенного прогресса в понимании различных аспектов экспрессии генов. Вместе с тем, вопросы о структурной организации молекулярно-биологических процессов в нуклеоплазме, их связи с ядерными органеллами, о том насколько сравнимы макромолекулярные комплексы, выделяемые в ходе биохимических экспериментов in vitro (например, транскриптосомы, сплайсосомы), с известными морфологическими структурами, обнаруженными в клеточном ядре с помощью электронной микроскопии, остаются открытыми.

Трудность решения вопроса о локализации тех или иных ядерных функций во многом связана с тем, что, в отличие от цитоплазмы, внутри ядра, за редким исключением, отсутствуют мембраны, изолирующие ядерные органеллы и определяющие ядерные компартменты, а ведущие молекулярные компоненты того или иного домена присутствуют также и в других участках ядра.

На заре цитологических исследований ядро считали слабо организованным клеточным образованием. Огромный прогресс в исследовании его тонкой структуры пришел с развитием техники ультраструктурных исследований. Появились первые описания ряда универсальных для эукариотических клеток ядерных структур, многие из которых служат объектами пристального внимания исследователей и в настоящее время.

Успехи, достигнутые классической морфологией клетки в первой половине XX века, привели к возникновению представления о том, что в ядре эукариотической клетки присутствуют определенные морфологические области: хроматин, организованный в отдельные хромосомные территории, и интерхроматиновая область с множеством субструктур (Raska et al., 1992; Spector, 1993, 2001; Cremer and Cremer, 2001). Долгое время единственной активно изучаемой структурой интерхроматиновой области ядра оставалось ядрышко, открытое еще в 1781 г. Фонтанной (Gerbi, 1997). Современные представления об интерхроматиновом пространстве как о сложно структурированной области клеточного ядра, содержащей различные структурно-функциональные компартменты, или домены (Spector, 1993, 2001; Lamond and Earnshow, 1998; Matera, 1999; Dundr and Misteli, 2001), были заложены работами Моннерона и Бернара (Bemhard, 1969; Monneron and Bernhard, 1969), разработавшими метод селективного выявления РНП-содержащих структур на ультратонких срезах и описавшими ряд экстрахромосомных доменов интерхроматиновой области ядра. К настоящему времени известно около десятка различных экстрахромосомных доменов, в совокупности называемых «ядерные тельца» (nuclear bodies) (Brasch and Ochs, 1992).

Актуальной проблемой остается исследование распределения в связи с ядерными доменами основных «участников» процессов синтеза и созревания РНК: РНК-полимеразы II (РНК-пол II) и факторов сплайсинга пре-мРНК. Тем более, что в настоящее время преобладают представления о том, что на регуляцию экспрессии генов и координацию составляющих ее многостадийных событий, наряду с особенностями упаковки генетического материала в хроматине и специфическим расположением собственно хромосом в ядре, существенное влияние оказывают высокоорганизованные домены нуклеоплазмы (Misteli and Spector, 1998; Cremer and Cremer, 2001; Cremer et al., 2004).

На роль универсальных доменов, обнаруживаемых в интехроматиновом пространстве ядер большинства типов клеток, претендуют кластеры интерхроматиновых гранул (КИГ) и тельца Кахала (ТК) (Gall, 2003). Данные многочисленных исследований свидетельствуют о том, что различные ядерные органеллы (например, КИГ и ТК, ТК и ядрышки и т.д.) находятся между собой в тесном функциональном, а нередко и структурном единстве (Malatesta et al., 1994; Gall et al., 1995, 1999; Dundr and Misteli, 2001; Leung et al., 2003).

Развитие новых методов молекулярной и клеточной биологии, в особенности иммуноморфологии и методов, связанных с возможностью изучения динамики макромолекул в реальном времени на живых клетках, привело к значительному прогрессу в понимании функций ТК и КИГ (Misteli, 2001; Carmo-Fonseca, 2002; Ogg and Lamond, 2002; Lamond and Spector, 2003; Handwerger and Gall, 2006). В общих словах, можно считать установленным, что ТК и КИГ играют ключевую роль в ядерном биогенезе различных типов РНК.

Основная функция КИГ, очевидно, состоит в сборке, модификации, временном хранении и рециклировании, прежде всего, факторов сплайсинга пре-мРНК - сплайсосомных малых ядерных (мя) РНП и SR-белков (Spector et al., 1991; Spector, 1993; Misteli and Spector, 1998; Misteli, 2000). При этом регуляция рекрутирования факторов сплайсинга из КИГ к местам транскрипции и обратно обеспечивается циклами фосфорилирования и дефосфорилирования входящих в КИГ белков (Misteli, 2000). Само же накопление факторов сплайсинга в участках транскрипции напрямую зависит от С-концевого домена (CTD) большой субъединицы РНК-полимеразы 11 (РНК-пол 11) (Du and Warren, 1997; Kim et al., 1997; Misteli and Spector, 1999).

Появились многочисленные данные, свидетельствующие о том, что КИГ представляют собой не только пассивные депо факторов сплайсинга, но играют активную роль, непосредственно связанную с регуляцией экспрессии генов. По мнению некоторых авторов (Sacco-Bubulya and Spector, 2002), именно КИГ обеспечивают сопряжение транскрипции и сплайсинга. Кроме того, были сделаны выводы, указывающие на возможность прямого участия КИГ в процессинге и транспорте мРНК (Miralles et al., 2000; Melcak et al., 2001; Shopland et al., 2002; Molenaar et al., 2004), что возвращает исследователей к высказанному ранее предположению (Johnson et al., 2000) о прямой роли КИГ в контроле корректного сплайсинга и приобретении мРНК компетентности к экспорту.

Вопрос о возможных функциях других универсальных ядерных доменов -телец Кахала (ТК), как и о функциях КИГ, в настоящее время широко дискутируется в литературе (см. обзоры: Gall, 2000, 2001; Carmo-Fonseca, 2002; Ogg and Lamond, 2002; Cioce and Lamond, 2005). Существуют три взаимодополняющие точки зрения относительно функций ТК (Dundr and Misteli, 2001).

Во-первых, ТК, по-видимому, непосредственно участвуют в регуляции экспрессии генов, располагаясь в тесной связи с определенными генными локусами. Это может проявляться в связи ТК с тандемными повторами гистоновых генов на ламповых щетках ооцитов амфибий (Callan et al., 1991) или генов, кодирующих ряд малых ядерных (включая ядрышковые) РНК в соматических клетках млекопитающих (Gao et al., 1997; Schul et al., 1998; Frey and Matera, 1995; Jacobs et al., 1999).

Во-вторых, ТК принимают участие в различных этапах биогенеза мяРНК (Matera, 1999). В них происходит псевдоуридинилирование и специфическое Т-Ометилирование участвующих в сплайсинге Ul, U2, U4 и U5 мяРНК (Darzacq et al., 2002; Jady et al., 2003), без чего невозможна правильная сборка сплайсосом и реакции сплайсинга (Yu et al., 1998). Эти этапы процессинга сплайсосомных мяРНК осуществляются при участии недавно открытого особого класса так называемых ТК-специфичных малых РНК (Darzacq et al., 2002). Показано, что основные этапы посттранскрипционного процессинга малых ядрышковых РНК (в том числе U3 мяшРНК) также осуществляются в ТК (Verheggen et al., 2002).

Наконец, существуют представления о ТК как о месте сборки макромолекулярных комплексов, обеспечивающих процессы транскрипции и процессинга РНК (Gall, 2001; Ogg and Lamond, 2002). Для ооцитов Xenopus laevis была предложена модель функционирования ТК, согласно которой в них происходит первичная ассоциация РНК-полимераз с факторами транскрипции и процессинга, которые затем перераспределяются к соответствующим генам в зоны активного хроматина (Gall et al., 1999; Gall, 2000, 2001). Главным аргументом в пользу данной гипотезы явилось обнаружение в составе ТК ооцитов Xenopus всех трех РНК-полимераз и многих факторов транскрипции и процессинга соответствующих РНК (Gall et al., 1999; Morgan et al., 2000; Doyle et al., 2002; Murphy et al., 2002). В настоящее время остается неизвестным, насколько данная модель применима к ТК других типов клеток, в том числе ооцитам других животных.

В настоящее время ооциты постепенно становятся важными и весьма перспективными модельными объектами для изучения доменной организации экстрахромосомной части ядра (Gall et al., 2004). Однако следует учитывать, что ооциты - это клетки, находящиеся в процессе деления, а именно в профазе мейоза, которая в оогенезе многих животных может быть чрезвычайно растянута во времени. Кроме того, в ооцитах накапливаются различные компоненты не только для реализации различных процессов в самой яйцеклетке, но и для обеспечения ранних этапов эмбриогенеза.

При исследовании ооцитов неизбежно встает проблема взаимоотношений половых и вспомогательных клеток в оогенезе. В контексте нашей работы из нее следует, в частности, вопрос, насколько универсальны будут различные ядерные домены ооцитов при разных типах оогенеза, то есть в зависимости от того, активно ли ядро самого ооцита или же оно инактивировано, а ядерные синтетические функции принимают на себя питающие клетки - трофоциты. В связи с этим, на наш взгляд, особенно перспективны для подобного рода исследований ядра ооцитов насекомых с их довольно широким спектром микроанатомических особенностей организации женских гонад.

Имеющиеся в литературе сравнительно немногочисленные данные по ультраструктурной иммунолокализации компонентов ТК и КИГ в ядрах ооцитов насекомых (Bogolyubov et al., 2000; Bogolyubov and Parfenov, 2001, 2004; Jaglarz, 2001; Bilinski and Kloc, 2002; Боголюбов, 2003; Zelazowska and Jaglarz, 2004; Баталова и др., 2005; Batalova et al., 2005; Jaglarz et al., 2005; Liu et al., 2006a; b) свидетельствуют о том, что как ТК, так и КИГ в ооцитах разных видов насекомых представляют собой чрезвычайно гетерогенную популяцию ядерных телец, заметно различающихся по размерам, количеству в ядре, ультраструктурной организации, соотношению структурных компонентов на разных стадиях оогенеза, а в ряде случаев - и по молекулярному составу.

Следует подчеркнуть, что все приведенные выше работы касались насекомых с яичниками мероистического типа, характеризующихся нутриментарным оогенезом, при котором ядро ооцита инактивируется, а источником большей части РНК являются трофоциты.

В настоящей работе мы по существу впервые обращаемся к изучению ядерных доменов ооцитов насекомого с паноистическими яичниками (домовой сверчок Acheta domesticus), ядра ооцитов которого, в отсутствие трофоцитов, должны, по-видимому, сохранять свою транскрипционную активность в течение всего периода роста ооцита.

Основной целью данной работы являлась идентификация и анализ экстрахромосомных структур, содержащих компоненты транскрипции и процессинга РНК, в диплотенных ядрах ооцитов A. domesticus в нормальных условиях и после подавления транскрипции с помощью ингибиторов.

Для достижения поставленной цели были сформулированы следующие экспериментальные задачи:

1. Охарактеризовать транскрипционный статус ядер ооцитов сверчка на стадии диплотены.

2. На ультраструктурном уровне охарактеризовать ядерные структуры интерхроматиновой области диплотенных ооцитов сверчка.

3. Проанализировать внутриядерное распределение компонентов транскрипции, осуществляемой РНК-полимеразой II (факторов, непосредственно входящих в состав голоэнзима РНК-пол II или функционально с ним связанных), а также факторов процессинга пре-мРНК, обращая особое внимание на возможную колокализацию различных компонентов экспрессии генов в ядерных субкомпартментах.

4. В ядрах ооцитов идентифицировать структуры, соответствующие кластерам иитерхроматиновых гранул (КИГ). С целью усиления сравнительного подхода и поиска возможных общих принципов организации КИГ ооцитов идентифицировать гомологичные структуры в ооцитах животных, обладающих другими типами оогенеза: Sarcophaga sp. и Tenebrio molitor (нутриментарный оогенез), а за пределами класса насекомых - у моллюска Achatina fulica, обладающего типичным солитарным оогенезом.

5. С помощью комплексного подхода идентифицировать ТК ооцитов сверчка, исследовать динамику их ведущих компонентов, оценить структурно-пространственные взаимоотношения ТК с КИГ, хромосомами и ядрышками.

6. Изучить поведение внутриядерных структур, содержащих факторы созревания РНК, в транскрипционно активных ядрах и при искусственном подавлении транскрипции с помощью ингибиторов синтеза РНК различного механизма действия.

Заключение Диссертация по теме "Гистология, цитология, клеточная биология", Степанова, Ирина Сергеевна

7. ВЫВОДЫ

Хромосомы ооцитов Acheta domesticus в течение диплотены сохраняют транскрипционную активность; конденсации хромосом и их объединения в кариосферу, характерных для оогенеза многих насекомых, не происходит. Среди экстрахромосомных ядерных доменов идентифицируются ТК и КИГ. ТК ооцитов A. domesticus имеют сложную организацию и обнаруживают структурную связь с другим ядерным доменом - КИГ.

ТК диплотенных ооцитов A. domesticus содержат коилин, фактор процессинга пре-рРНК фибрилларин, факторы сплайсинга пре-мРНК (мяРНП и, в отличие от ТК клеток других типов, - белок SC35), ряд компонентов РНК-пол II-транскрипции (базальный фактор транскрипции TFIID и белки-коактиваторы СВР/рЗОО), но не содержат РНК-пол II.

КИГ ооцитов A. domesticus состоят из четко выраженных гранулярных и фибриллярных областей. Организация и молекулярный состав КИГ оказываются сходными у насекомых различных систематических групп, а за пределами класса насекомых - у моллюска Achatina fulica. Их характерная особенность - присутствие SR-белка SC35.

Подавление транскрипции с помощью ингибиторов вызывает существенное изменение морфологии ТК, увеличение количества КИГ в нуклеоплазме, сегрегацию ультраструктурных компонентов ТК и КИГ, но не приводит к перераспределению коилина, фибрилларина, мяРНП, TFIID и СВР/рЗОО и к накоплению в ТК РНК-пол II, которая аккумулируется в фибриллярных областях КИГ.

Автор глубоко признателен научному руководителю Дмитрию Сергеевичу Боголюбову за мудрое руководство, заботу и терпение, Владимиру Николаевичу Парфенову за предоставленную возможность работать в Лаборатории морфологии клетки и постоянное внимание к работе.

Автор благодарен Галине Николаевне Почукалиной и Флорине Михайловне Баталовой за всестороннюю поддержку и ценные критические замечания по данной работе, Юлии Ивановне Гукиной за помощь в приготовлении препаратов, а также всем сотрудникам Лаборатории морфологии клетки за создание тёплой атмосферы.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Степанова, Ирина Сергеевна, Санкт-Петербург

1. Айзенштадт Т.Е. 1984. Цитология оогенеза. М.: Наука, 247 с. Александрова О.А. 1992. Внутриядерные тельца и формирование капсулы кариосферы в ооцитах жука-чернотелки Tentyria nomas taurica. Цитология. 346.: 30-37.

2. Александрова О.А., Боголюбов Д.С., Грузова М.Н. 1995. Кариосфера и внутриядерные тельца в ядрах ооцитов жука-чернотелки Tenebrio molitor. Цитология. 37 (12): 1142-1150.

3. Александрова О.А., Боголюбов Д.С., Цветков А.Г. 1999. Синтез рРНК в овариолах жуков-чернотелок Tentyria nomas taurica и Tenebrio molitor. Цитология. 41 (1): 60-65.

4. Баталова Ф.М. 2000. Ядрышки и перинуклеолярные тельца в трофоцитах Panorpa communis содержат факторы сплайсинга пре-мРНК. Цитология. 427.: 624-634.

5. Баталова Ф.М., Боголюбов Д.С., Парфенов В.Н. 2005. Кариосфера и экстрахромосомные ядерные тельца ооцитов скорпионницы Panorpa communis. Цитология. 47 (10): 847-859.

6. Боголюбов Д.С. 2003. Тельца Кахала в ооцитах насекомых. I. Идентификация и иммуноцитохимическая характеристика телец Кахала в вителлогенных ооцитах жука-чернотелки. Цитология. 45 (И): 1083-1093.

7. Боголюбов Д.С., Александрова О.А., Цветков А.Г. 1997. Ядро ооцитов жука-чернотелки Tenebrio molitor. (Электронно-микроскопическое, цитохимическое и авторадиографическое исследование). Цитология. 39 (8): 643-650.

8. Гагинская Е.Р. 1972. Ядерные структуры в ооцитах половозрелых птиц. II. Белковые тела и кариосфера. Цитология. 14 (5): 568-577.

9. Гагинская Е.Р. 1975. О классификации типов оогенеза. Онтогенез. 6 (6): 539545.

10. Гагинская Е.Р., Грузова М.Н. 1975. Выявление амплифицированной рДНК в клетках яичников некоторых насекомых и птиц методом гибридизации нуклеиновых кислот на препаратах. Цитология. 17 (10): 1132-1137.

11. Гилберт С. 1993. Биология развития. 2 т. Москва: Мир, 235 с.

12. Грузова М.Н. 1960. Образование кариосферы в оогенезе сетчатокрылых насекомых рода Chrysopa. Цитология. 2 (5): 519-527.

13. Грузова М.Н. 1975. Кариосфера в оогенезе. Цитология. 17 (3): 219-237.

14. Грузова М.Н. 1977. Ядро в оогенезе. (Структурно-функциональный аспект). В кн.: Современные проблемы оогенеза. М.: Наука, 51-98.

15. Грузова М.Н. 1979. Ядерные структуры в телотрофных овариолах жуков-чернотелок. I. Трофоциты Blaps lethifera (Tenedrionidae, Polyphaga). Светооптические и электронномикроскопические данные. Онтогенез. 10 (1): 13-23.

16. Грузова М.Н., Баталова Ф.М. 1979. Ядерные структуры в телотрофных овариолах жуков-чернотелок. II. Ядро ооцитов Blaps lethifera и Gnaptor spinimanus. Светооптические данные. Онтогенез. 10 (4): 323-331.

17. Грузова М.Н., Зайчикова З.П. 1968. Ультраструктура кариосферы в оогенезе златоглазки. Цитология. 10 (9): 1180-1182.

18. Грузова М.Н., Зайчикова З.П. 1972. Структурная и функциональная организация ядра ооцитов златоглазки (отр. сетчатокрылых). II. Ультраструктура капсулы кариосферы. Цитология. 14 (6): 699-705.

19. Грузова М.Н., Цветков А.Г., Почукалина Г.Н., Парфенов В.Н. 1995. Формирование кариосферы в оогенезе некоторых насекомых и амфибий. Цитология. 37 (8): 744-769.

20. Дондуа А.К. 2005. Биология развития, т. 1: Начала сравнительной эмбриологии. СПб: Изд. Санкт-Петербургского университета, 295 с.

21. Зыбина Е.В. 1975. Электронномикроскопическое исследование хромосом типа ламповых щеток и продуктов их активности в оогенезе кролика. Цитология 17 (8): 875-880.

22. Квасов И.Д., Парфенов В.Н., Цветков А.Г. 2000. Внутриядерные структуры, содержащие факторы созревания РНК, в ранних вителлогенных ооцитах травяной лягушки. Цитология. 42 (6): 536-549.

23. Методы биологии развития. 1974. М.: Наука, 619 с.

24. Романова Л.Г. 1977. Сравнительное изучение структуры амфинуклеолуса в оогенезе пластинчатожаберных моллюсков. Цитология. 19(11): 1225-1231.

25. Романова Л.Г 1985. Ультрастура ядра и цитоплазмы ооцитов моллюска Littorina saxatilis. III. Строение ядрышка. Цитология. 24 (4): 383-391.

26. Степанова И.С., Боголюбов Д.С. 2003. РНК-полимераза II и факторы сплайсинга пре-мРНК в ядрах диплотенных ооцитов гигантской африканской улитки Achatina fulica. Цитология. 45 (2): 166-178.

27. Цветков А.Г., Грузова М.Н., Голл И. 1996. Сферы из ядер ооцитов домового сверчка и стрекозы-красотки содержат факторы сплайсинга пре-мРНК и процессинга пре-рРНК. Цитология. 38 (3): 311-318.

28. Цветков А.Г., Сковородкин И.Н., Боголюбов Д.С., Квасов И.Д., Парфенов В.Н. 2002. Экстрахромосомные структуры, содержащие малые ядерные РНП и коилин, в ядрах поздних вителлогенных ооцитов зимующих травяных лягушек. Цитология. 44 (11): 1037-1045.

29. Штейн Г.И. 2004. Лазерная сканирующая конфокальная микроскопия. СПб, ИНЦ РАН, 32 с.

30. Alberts В., Johnson A., Lewis J., Raff М. Roberts К., Walter P. 2002. Molecular biology of the cell. New York and London, Garland Science.

31. Allen E.R., Cave M.D. 1972. Nucleolar organization in oocytes of gryllid crickets: subfamilies Gryllinae and Nemobiinae. J. Morphol. 137: 433-447.

32. Anderson E. 1964. Oocyte differentiation and vitellogenesis in the roach Periplaneta americana. J. Cell Biol. 20: 131-155.

33. Andrade L.E.C, Chan E.K.L., Raska I., Peebles C-.L., Roos G., Tan E.M. 1991. Human antibody to a novel protein of the nuclear coiled body: immunological characterization and cDNA cloning of p80-coilin. J. Exp. Med. 173: 1407-1419.

34. Angelier N., Penrad-Mobayed M, Billoud В., Bonnanfant-Jais M-L., Coumailleau P. 1996. What role might lampbrush chromosomes play in maternal gene expression? Int. J. Dev. Biol. 40: 645-652.

35. Azzouz T.N., Schumperli D. 2003. Evolutionary conservation of the U7 small nuclear ribonucleoprotein in Drosophila melanogaster. RNA. 9 (12): 1532-1541.

36. Badian Z., Simiczyjew В., Kubrakiewicw J. 2002. Ovary structure and oogenesis in Pholcus phalangioides (Aranei: Pholcidae). Zool. Polon. 47, Suppl.: 7.

37. Bakken A., Morgan G., Sollner-Webb В., Roan J., Busby S„ Keeder R.H. 1982. Mapping of transcription initiation and termination signals on Xenopus laevis ribosomal DNA. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 79: 56-60.

38. Batalova F.M., Stepanova I.S., Skovorodkin I.N., Bogolyubov D.S., Parfenov V.N. 2005. Identification and dynamics of Cajal bodies in relation to karyosphere formation in scorpionfly oocytes. Chromosoma. 113: 428-439.

39. Bauer D. W, Gall J.G. 1997. Coiled bodies without coilin. Mol. Biol. Cell. 8: 73-82.

40. Bauer D.W., Murphy C., Wu Z., Wu C.-H., Gall J.G. 1994. In vitro assembly of coiled bodies in Xenopus egg extract. Mol. Biol. Cell. 5: 633-644.

41. Bellini M. 2000. Coilin, more than a molecular marker of the Cajal (coiled) body. BioEssay. 22: 861-867.

42. Bellini M., Gall J.G. 1998. Coilin can form a complex with the U7 small nuclear ribonucleoprotein. Mol. Biol. Cell. 9: 2987-3001.

43. Bellini M., Gall J.G. 1999. Coilin shuttles between the nucleus and cytoplasm in Xenopus oocytes. Mol. Biol. Cell. 10: 3425-3434.

44. Bentley D.L., 2005. Rules of engagement: co-transcriptional recruitment of pre-mRNA processing factors. Curr Opin Cell Biol. 17: 251-256.

45. Bemhard W. 1969. A new staining procedure for electron microscopical cytology. J. Ultrastruct. Res. 27: 250-265.

46. Berry S.J. 1985. RNA synthesis and storage during insect oogenesis. In: Developmental Biology. A comprehensive synthesis. New York, London, Plenum Press. 351-384.

47. Beven A.F., Simpson G.G., Brown J.W., Shaw P.J. 1995. The organization of spliceosomal components in the nuclei of higher plants. J Cell Sci. 108 (Pt 2): 509518.

48. Beyer A.L., Osheim Y.N. 1988. Splice site selection, rate of splicing, and alternative splicing on nascent transcripts. Genes Dev. 2 (6): 754-65.

49. Bier K., Kuntz W., Ribbert D. 1967. Struktur und Funktion der Oocytenchromosomen und Nukleolen sowie der Extra-DNS wahrend der Oogenese panoistischer und meroistischer Insekten. Chromosoma. 23: 214-254.

50. Bilinski S.M. 1998. Filogeneza owadow a struktura i ultrastruktura ich jajnikow. Przegl^d Zool. 42:35-51.

51. Bilinski S.M., KlocM. 2002. Accessory nuclei revisited: the translocation of snRNPs from the germinal vesicle to the periphery of the future embryo. Chromosoma 111: 62-68.

52. Bogolyubov D., Alexandrova 0., Tsvetkov A., Parfenov V. 2000. An immunoelectron study of karyosphere and nuclear bodies in oocytes of mealworm beetle, Tenebrio molitor (Coleoptera: Polyphaga). Chromosoma. 109: 415-425.

53. Bogolyubov D., Parfenov V. 2001. Immunogold localization of RNA polymerase II and pre-mRNA splicing factors in Tenebrio molitor oocyte nuclei with special emphasis on karyosphere development. Tissue and Cell. 33: 549-561.

54. Bogolyubov D., Parfenov V. 2004. Do nuclear bodies in oocytes of Tenebrio molitor (Coleoptera: Polyphaga, Tenebrionidae) contain two forms of RNA polymerase II? Tissue and Cell. 36: 13-17.

55. Bonnet F., Vigneron M., Bensaude O., Dubois M-F. 1999. Transcription-independent phosphorylation of the RNA polymerase II C-terminal domain (CTD) involves ERK kinases (MEK 1/2). Nucl. Acids Res. 27 (22): 4399-4404.

56. Braseh K., Oehs R.L. 1992. Nuclear bodies (NBs): a newly "rediscovered" organelle. Exp. Cell Res. 202: 211-223.

57. Bregman D.B., Du L., van der Zee S., Warren S.L. 1995. Transcription-dependent redistribution of the large subunit of RNA polymerase II to discrete nuclear domains. J. Cell Biol. 129: 287-298.

58. Btining J. 1972. Untersuchungen am Ovar von Buehidius obtecus Say (Coleoptera-Polyphaga) zur Klarung des Oocytenwachstums in der Pravitellogenese. Cell Tiss. Res. 128: 241-282.

59. Btining J. 1984. Development, morphology and function of insect ovarioles: reproductive adaptations in phylogeny. In.: Advances in invertebrate reproduction 3. Engels et al., ed. pp. 87-95.

60. Biining J. 1994. The Insect Ovary: Ultrastructure, Previtellogenic Growth and Evolution. London, Chapman and Hall.

61. Callan H.G. 1986. Lampbrush chromosomes. Springer-Verlag. 254 p.

62. Callan H.G., Gall J.G., Murphy C. 7iW.Histone genes are located at the sphere loci of Xenopus lampbrush chromosomes. Chromosoma. 101: 245-251.

63. Carmo-Fonseca M. 2002. New clues to the function of the Cajal body. EMBO Reports. 3: 726-727.

64. Carmo-Fonseca M, Ferreira J, LamondA.I. 1993. Assembly of snRNP-containing coiled bodies is regulated in interphase and mitosis-evidence that the coiled body is a kinetic nuclear structure. J. Cell Biol. 120 (4): 841-852.

65. Cave M.D. 1973. Synthesis and characterization of amplified DNA in oocytes of the house cricket Acheta domesticus (Orthoptera, Gryllidae). Chromosoma. 42: 1-22.

66. Cave M.D. 1982. Morphological manifestation of ribosomal DNA amplification during insect oogenesis. In: Insect Ultrastructure. New York, London, Plenum Press. 1: 86-117.

67. Cave M.D., Allen E.ll 1969. Extra-chromosomal DNA in early stages of oogenesis in Acheta domesticus. J. Cell Sci. 4: 593-609.

68. Cave M.D., SixbeyJ. 1976. Absence of ribosomal DNA amplification in a meroistic polythrophic ovary. Exp. Cell Res. 101: 23-31.

69. Cazalla D., Zhu J., Manche L., Huber E., KrainerA.R., Caceres J.F. 2002. Nuclear export and retention signals in the RS domain of SR proteins. Mol. Cell Biol. 22: 6871-6882.

70. Cerami B.A., Reich E., Ward D.C., Goldberg I.H. 1967. The interaction of actynomycin with DNA: requirement for the 2-amino group of purines. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 57: 1036-1042.

71. CioceM., LamondA.I. 2005. Cajal bodies: a long history of discovery. Annu. Rev. Cell. Dev. Biol. 21: 105-131.

72. Cmarco II, Verschure P.J., Martin Т.Е., Dahmus M.E., Krause S., Fu X.-D., van Driel R. Fakan S. 1999. Ultrastructural analysis of transcription and splicing in the cell nucleus after bromo-UTP microinjection. Mol. Biol. Cell. 10: 211-223.

73. Collier S, Pendle A, Boudonck K, van Rij T, Dolan L, Shaw P. 2006. A distant coilin homologue is required for the formation of Cajal bodies in Arabidopsis. Mol Biol Cell. 2006. 17:2942-51.

74. Corden J.L., Patturajan M. 1997. A CTD function linking transcription to splicing. Trends Biochem. Sci. 22: 413-416.

75. Cremer Т., Cremer C. 2001. Chromosome territories, nuclear architecture and gene regulation in mammalian cells. Nat. Rev. Genet. 2: 292-301.

76. Cremer Т., Kupper K, Dietzel S., Fakan S. 2004. Higher order chromatin architecture in the cell nucleus: on the way from structure to function. Biol. Cell. 96: 555-567.

77. Cummings M.R., King R.S. 1969. The cytology of the vitellogenic stages of oogenesis in Drosophila melanogaster. I. General stading characteristics. J. Morphol. 128: 427-442.

78. Dahmus M.E. 1996. Reversible phosphorylation of the C-terminal domain of RNA polymerase II. J. Biol. Chem. 271: 19009-19012.

79. Deryusheva S., Gall J.G. 2004. Dynamics of coilin in Cajal bodies of the Xenopus germinal vesicle. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 101: 4810-4814.

80. Dominski Z, MarzluffW.F. 1999. Formation of the 3' end of histone mRNA. Gene. 239: 1-14.

81. Dorris D.R., Struhl K. 2000. Artificial recruitment of TFIID, but not RNA polymerase II holoenzyme, activates transcription in mammalian cells. Mol. Cell Biol. 20: 4350-4358.

82. Dostie J., Lejbkowicz F., Sonenberg N. 2000. Nuclear eukaryotic initiation factor 4E (elF4E) colocalizes with splicing factors in speckles. J. Cell Biol. 148: 239-247.

83. Doyle O., Corden J.L., Murphy C, Gall J.G. 2002. The distribution of RNA polymerase II largest subunit (RPB1) in the Xenopus germinal vesicle. J. Struct. Biol. 140: 154-166.

84. Du L., Warren S.L. 1997. A functional interaction between the carboxy-terminal domain of RNA polymerase II and pre-mRNA splicing. J. Cell Biol. 136: 5-18.

85. Dundr M., Hebert M.D., Karpova T.S., Stanek D„ Xu #., Shpargel K.B., Meier U. Т., Neugebauer K.M., Matera A.G., Misteli T. 2004. In vivo kinetics of Cajal body components. J. Cell Biol. 164: 831-842.

86. Dundr M., Misteli T. 2001. Functional architecture in the cell nucleus. Biochem. J. 356: 297-310.

87. Fakan S. 1994. Perichromatin fibrils are in situ forms of nascent transcripts. Trends Cell Biol. 4: 86-90.

88. Fakan S., Leser G., Martin Т.Е. 1984. Ultrastructural distribution of nuclear ribonucleoproteins as visualized by immunocytochemistry on thin sections. J. Cell Biol. 98: 358-363.

89. Fakan S., Puvion E. 1980. The ultrastructural visualization of nucleolar and extranucleolar RNA synthesis and distribution. Int. Rev. Cytol. 65: 255-299.

90. Fiil A. 1974. Structural and functional modifications of the nucleus during oogenesis in the mosquito Aedes aegypti. J. Cell Sci. 14: 51-67.

91. Fiil A., Moens P. 1973. The development structure and function of modified synaptonemal complexes in mosqito oocytes. Chromosoma. 41: 37-62.

92. Filek K., Jarek E., Bilinski S.M. 2002. Cajal bodies (coiled bodies) in the nuclei of the house cricket (Acheta domesticus) oocytes. Folia Histochem. Cytobiol. 40: 221-222.

93. Frey M.R., Bailey A.D., Weiner A.M., Matera A.G. 1999. Association of snRNA genes with coiled bodies is mediated by nascent snRNA transcripts. Curr. Biol. 9: 126-135.

94. Frey M.R., Matera A.G. 1995. Coiled bodies contain U7 small nuclear RNA and associate with specific DNA sequences in interphase human cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 92: 5915-5919.

95. Fu X.-D., Maniatis T. 1990. Factor required for mammalian spliceosome assembly is localized to discrete regions in the nucleus. Nature. 343: 437-441.

96. Gall J. G. 1954. Lumpbrush chromosomes from oocyte nuclei of the newt. J. Morphol. 94: 283-352.

97. GallJ.G. 2000. Cajal bodies: the first 100 years. Annu. Rev. Cell. Dev. Biol. 16: 273-300.

98. Gall J.G. 2001. A role of Cajal bodies in assembly of the nuclear transcription machinery. FEBS Lett. 498: 164-167.

99. Gall J.G. 2003. The centennial of the Cajal body. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 4: 975-980.

100. GallJ.G., Bellini M., Wu Z., Murphy C. 1999. Assembly of the nuclear transcription and processing machinery: Cajal bodies (coiled bodies) and transcriptosomes. Mol. Biol. Cell. 10: 4385-4402.

101. Gall J.G, Callan H.G. 1989. The sphere organelle contains small nuclear ribonucleoproteins. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 86: 6635-6639.

102. Gall J.G., Macgregor H.C., Kids Ion M.E. 1969. Gene amplification in the oocyte of dytiscid water beetles. Chromosoma. 26: 169-187.

103. Gall J.G., Stephenson E.C., Erba H.P., Diaz M.O., Barsacchi-Pilone G. 1981. Histone genes are located at the sphere loci of newt lampbrush chromosomes. Chromosoma (Berl.). 84: 159-171.

104. Gall J.G., Tsvetkov A., Wu Z., Murphy C. 1995. Is the sphere organelle/coiled body a universal nuclear component? Dev. Genet. 16:25-35.

105. Gall J.G., Wu Z., Murphy C, Gao H. 2004. Structure in the amphibian germinal vesicle. Exp. Cell Res. 296: 28-34.

106. Gama-Carvalho M., Krauss RD., Chiang L., Valcarcel J., Green M.R., Carmo-Fonseca M. 1997. Targeting of U2AF65 to sites of active splicing in the nucleus. J. Cell Biol. 137: 975-987.

107. Gao L., FreyM.R., Matera A.G. 1997. Human genes encoding U3 snRNA associate with coiled bodies in interphase cells and are clustered on chromosome 17pll.2 in a complex inverted repeat structure. Nucleic Acids Res. 25: 4740-4747.

108. Gerbi S.A. 1997. The nucleolus: then and now. Chomosoma 105: 385-387.

109. Gerbi S.A., Borovjagin A.V., Lange T.S. 2003. The nucleolus: a site of ribonucleoprotein maturation. Curr. Opin. Cell Biol. 15: 318-325.

110. Girard C., Mouaikel J., Neel H., Bertrand E., Bordonne R 2004. Nuclear localization properties of a conserved protuberance in the Sm core complex. Exp. Cell Res. 299: 199-208.

111. Grande M.A., van der Kraan I., de Jong L., van Driel R. 1997. Nuclear distribution of transcription factors in relation to sites of transcription and RNA polymerase II. J. Cell Sci. 110: 1781-1791.

112. Greenblatt J. 1997. RNA polymerase II holoenzyme and transcriptional regulation. Curr. Opin. Cell Biol. 9: 310-319.

113. Greenleaf A.L. 1993. Positive patches and negative noodles: linking RNA processing to transcription? Trends Biochem Sci. 18: 117-119.

114. Griffond В., Bolzoni-Sungur D. 1986. Stages of oogenesis in the snail, Helix aspersa: cytochemical and ultrastructural studies. Reprod. Nutr. Develop. 26 (2A): 461-474.

115. Gruzova M.N. 1988. The nucleus during oogenesis with special reference to extrachromosomal structures. In: Oocyte growth and maturation. New York, Plenum Press, 77-163.

116. Gruzova M.N., Parfenov V.N. 1993. Karyosphere in oogenesis and intranuclear morphogenesis. Int. Rev. Cytol. 144: 1-52.

117. Gruzova M.N., Zaichikova Z.P., Sokolov I.I. 1972. Functional organization of the nucleus in the oogenesis of Chrysopa perla L. (Insecta, Neuroptera). Chromosoma. 37: 353-385.

118. Guillot P.V., Xie S.Q., Hollinshead M., Pombo A. 2004. Fixation-induced redistribution of hyperphosphorylated RNA polymerase II in the nucleus of human cells. Exp. Cell Res. 295: 460-468.

119. Halkka L., Halkka 0. 1968. RNA and protein in nucleolar structures of dragonfly oocytes. Science. 162: 803-805.

120. Halle J.P., Meisteremst M., 1996. Gene expression: increasing evidence for a transcriptosome. Trends Genet. 12: 161-163.

121. Hampsey M. 1998. Molecular genetics of the RNA polymerase II general transcriptional machinery. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 62: 465-503.

122. Handwerger K.E., Cordero J.A., Gall J.G. 2005. Cajal bodies, nucleoli, and speacles in the Xenopus oocytes nucleus have a low-density, sponge-like structure. Mol. Cell Biol. 16:202-211.

123. Handwerger K.E., Gall J.G. 2006. Subnuclear organelles: new insights into form and function. Trends Cell Biol. 16: 19-26.

124. Handwerger K.E., Murphy C., Gall J.G. 2003. Steady-state dynamics of Cajal body components in the Xenopus germinal vesicle. J. Cell Biol. 160: 495-504.

125. Heinonen L, Halkka O. 1967. Early stages of oogenesis and metabolic DNA in the oocytes of the Louse cricket Acheta domesticus. Ann. Med. Exper. Fenn. 1967. 45: 101-109.

126. Henderson S.A. 1971. Grades of chromatid organization in mitotic and meiotic chromosomes. I. The morphological features. Chromosoma. 35: 28-40.

127. Herbert M.D., Matera A.G. 2000. Self-association of coilin reveals a common theme in nuclear body localization. Mol. Biol. Cell. 11: 4159-4171.

128. Hebert M.D., Shpargel K.B., Ospina J.K., Tucker K.E., Matera A.G. 2002. Coilin methylation regulates nuclear body formation. Dev Cell. 3: 329-337.

129. Hebert M.D., Szymczyk P.W., Shpargel K.B., Matera A.G. 2001. Coilin forms the bridge between Cajal bodies and SMN, the Spinal Muscular Atrophy protein. Genes Dev. 15: 2720-2729.

130. Hirose Y., Manley J. L. 2000. RNA polymerase II and the integration of nuclear events. Genes Dev. 14: 1415-1429.

131. Но C.K., Shuman S. 1999. Distinct roles for CTD Ser-2 and Ser-5 phosphorylation in the recruitment and allosteric activation of mammalian mRNA capping enzyme. Mol. Cell. 3:405-411.

132. Hock R., Carl M., Lieb В., Gebauer D., Scheer U. 1996. A monoclonal antibody against DNA topoisimerase II labels the axial granules of Pleurodeles lampbrush chromosomes. Chromosoma. 104: 358-366.

133. Huang S, Deerinck TJ, Ellisman MH, Spector DL. 1994. In vivo analysis of the stability and transport of nuclear poly (A)+ RNA. J Cell Biol. 6: 877-899.

134. Huang S., Spector D.L. 1991. Nascent pre-mRNA transcripts are associated with nuclear regions enriched in splicing factors. Genes Dev. 5: 2288-2302.

135. Hulsebos Т., Hackstein J., Henning W. 1984. Lampbrush loopspecific protein of Drosophila hydei. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 16: 9415-9429.

136. Isaac C., Yang Y., Meier U.T. 1998. Noppl40 functions as a molecular link between the nucleolus and the coiled bodies. J. Cell Biol. 142: 319-329.

137. Ivanovska I., Khandan Т., Ito Т., Orr-Weaver T.L. 2005. A histone code in meiosis: the histone kinase, NHK-1, is required for proper chromosomal architecture in Drosophila oocytes. Gen. Dev. 19: 2571-2582.

138. Jady B.E., Bertrand E., Kiss T. 2004. Human Telomerase RNA and box H/ACA scaRNAs share a common Cajal body specific localization signal. J. Cell Biol. 164: 647-652.

139. Jady B.E., Darzacq X., Tucker K.E., Matera A.G., Bertrand E., Kiss T. 2003. Modification of Sm small nuclear RNAs occurs in the nucleoplasm^ Cajal body following import from the cytoplasm. EMBO J. 22: 1878-1888.

140. Jaworska H., Lima-de-Faria A. 1973a. Ultrastructure of two types of nucleolar components associated with rDNA. Hereditas. 74: 169-186.

141. Jaworska H., Lima-de-Faria A. 1973b. Trasfer of DNA-RNA assemlies from nucleus to cytoplasm. Hereditas. 74: 187-204.

142. Jaworska H., Lima-de-Faria A. 1973c. Amplification of ribosomal DNA in Acheta. VI. Ultrastructure of two types of nucleolar components associated with ribosomal DNA. Hereditas. 74: 309-327.

143. Jordan P., Cunha C., Carmo-Fonseca M. 1997. The cdk7-cyclin H-MAT1 complex associated with TFIIH is localized in coiled bodies. Mol. Biol. Cell. 8: 1207-1217.

144. Jorgensen M. 1913. Zellenstudien. I. Morphologische Beitrage zum Problem des Eiwachstums. Arch. Zellforsch. 10: 1-126.

145. Kim E., Du L., Bregman D.B., Warren S.L. 1997. Splicing factors associate with hyperphosphorylated RNA polymerase II in the absence of pre-mRNA. J. Cell Biol. 136: 19-28.

146. Kim W.-Y., Dahmus M.E. 1986. Immunocytochemical analysis of mammalian RNA polymerase II subspecies. Stability and relative in vivo concentration. J. Biol. Chem. 261: 14219-14225.

147. Kimura H., Sugaya K, Cook P.R. 2002. The transcription cycle of RNA polymerase II in living cells. J. Cell Biol. 159: 777-782.

148. King R.C., Biining J. 1985. The origin and functioning of insect oocytes and nurse cells. In.: Comprehensive Insect Physiology, Biochemistry and Pharmacology. Oxford, Pergamon Press, vol. 1, pp. 37-82.

149. Kiss A.M., Jady B.E., Bertrand E., Kiss T. 2004. Human box H/ACA pseudouridylation guide RNA machinery. Mol. Cell Biol. 24: 5797-5807.

150. Kiss A.M., Jady B.E., Darzacq X., Verheggen C., Bertrand E., Kiss T. 2002. A Cajal body-specific pseudouridylation guide RNA is composed of two box H/ACA snoRNA-like domains. Nucl. Acids Res. 30: 4643-4649.

151. Kielbowna L., Koscielski B. 1974. A cytochemical and autoradiographic study of oocyte nucleoli in Limnea stagnalis L. Cell Tiss. Res. 152: 103-111.

152. Kolev N.G., Steitz J.A. 2005. In vivo assembly of functional U7 snRNP requires RNA backbone flexibility within the Sm-binding site. Nat. Struct. Mol. Biol. 13: 347-353.

153. Kornblihtt A.R., de la Mata M., Fededa J.P., Munoz M.J., Nogues G. 2004. Multiple links between transcription and splicing. RNA. 10: 1489-1498.

154. Krainer А. 1988. Pre-mRNA splicing by complementation with purified human Ul, U2, U4/U6 and U5 snRNPs. Nucl. Acids Res. 16: 9415-9429.

155. Krasikova A., Barbero J.L., Gaginskaya E. 2005. Cohesion proteins are present in centromere protein bodies associated with avian lampbrush chromosomes. Chromosome Res. 13: 675-685.

156. Krasikova A., Kulikova Т., Saifitdinova A., Derjusheva S., Gaginskaya E. 2004. Centromeric protein bodies on avian lampbrush chromosomes contain a protein detectable with an antibody against DNA topoisomerase II. Chromosoma. 113:316323.

157. Kramer A., Haars R., KabischR, Will H., Bautz F.A., BautzE.K 1980. Monoclonal antibody directed against RNA polymerase II of Drosophila melanogasler. Mol. Gen. Genet 180: 193-199.

158. Kruhlak M.J., Lever M.A., Fischle W., Verdin E., Bazell-Jones D.P., Hendzel M.J. 2000. Reduced mobility of the alternate splicing factor (ASF) through the nucleoplasm and steady state speckle compartments. J. Cell Biol. 150: 41-51.

159. Kubrakiewicz J. 2002. Extrachromosomal rDNA amplification in the oocytes of Polysloechotes punctalus (Fabricius) (Insecta, Neuroptera: Polystoechotidae). Arthr. Struct. Dev. 31: 23-31.

160. Kunz W. 1967a. Funktionsstrukturen im Oocytenkem von Locusla migratoria. Chromosoma. 20: 332-370.

161. Kunz W. 1967b. Lampenbiirstenchromosomen und multiple Nukleolen bei Orthopteren. Chromosoma. 21: 446-462.

162. Kunz W. 1969. The origin of multiple oocyte nucleoli from accessory DNA bodies in Gryllus domesticus. Chromosoma. 26: 41-75.

163. Laemmli U.K. 1970. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of the bacteriophage T4. Nature. 227: 680-685.

164. Lam Y.W., Lyon C.E., Lamond A.I. 2002. Large-scale isolation of Cajal bodies from HeLa cells. Mol. Biol. Cell. 13:2461-2473.

165. LamondA.I., Carmo-FonsecaM. 1993. The coiled body. Trends Cell Biol. 3: 198204.

166. LamondA.I., Earnshaw W.C. 1998. Structure and function in the nucleus. Science. 280: 547-553.

167. Lamond A.I., Spector D.L. 2003. Nuclear speckles: a model for nuclear organelles. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 4: 605-612.

168. Lee T.I., Young R.A. 2000. Transcription of eukaryotic protein-coding genes. Annu. Rev. Genet. 34: 77-137.

169. Lerner E.A., Lerner M.R., Janeway C.A., Steitz J. 1981. Monoclonal antibodies to nucleic acid-containing cellular consistuents: probes for molecular biology and autoimmune diseases. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 78: 2737-2741.

170. Leung A.K.L., Andersen J.S., MannM., Lamond A.I. 2003. Bioinformatic analysis of the nucleolus. Biochem. J. 376: 553-569.

171. Lima-de-Faria A. 1974. The molecula organization of the chromomeres of Acheta involved in ribosomal DNA amplification. Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 38: 559-571.

172. Lima-de Faria A., Nillson В., Cave D., Puga A., Jaworska H. 1968. Tritium labelling and cytochemistry of extra DNA in Acheta. Chrotnosoma. 25: 1-20.

173. Liu J.-L., Hebert M.D., Ye Y., Templeton D.J., Kung H.-J., Matera A.G. 2000. Cell cycle-dependent localization of the CDK2-cyclin E complex in Cajal (coiled) bodies. J. Cell Sci. 113: 1543-1552.

174. Liu J-L, Murphy C., Buszczak M., Clatterbuck S., Goodman R., Gall J.G. 2006a. The Drosophila melanogaster Cajal body. J. Cell Biol. 172: 875-884.

175. Liu J.-L., BuszczakM., Gall J.G. 2006b. Nuclear bodies in the Drosophila germinal vesicle. Chromosome Res. 14: 465-475.

176. Lyon C.E., Bohmann K., Sleeman J., Lamond A. 1997. Inhibition of protein dephosphorylation results in the accumulation of splicing snRNPs and coiled bodies within the nucleolus. Exp. Cell Res. 230: 84-93.

177. Macgregor H.C. 1972. The nucleolus and its genes in amphibian oogenesis. Biol. Rev. Camb. Philos. Soc. 47: 177-210.

178. Macgregor H.C. 1980. Recent developments in the study of lampbrush chromosomes. Heredity. 44: 3-35.

179. Mahowald A.P. 1972. Ultrastructural observations on oogenesis in Drosophila. J. Morphol. 137: 29-48.

180. Mahowald A.P., Tieferi M. 1970. Fine structural changes in the Drosophila oocytes nucleus during a short period of RNA synthesis. Wilhelm Roux' Arch. Entw. Mech. Org. 165: 8-25.

181. Malatesta M., Zancanaro C., Martin Т.Е., Chan E.K., Amalric F., Luhrmann R., Vogel P., Fakan S. 1994. Is the coiled body involved in nucleolar functions? Exp. Cell Res. 211:415-419.

182. Malatesta M., Cardinali A., Battistelli S., Zancanaro C., Martin Т.Е., Fakan S., Gazzanelli G. 1999. Nuclear bodies are usual constituents in tissues of hibernating dormice. Anat. Rec. 254: 389-395.

183. ManleyJ.L., Tacke R. 1996. SR proteins and splicing control. Genes Dev. 10: 15691579.

184. Matera A.G. 1999. Nuclear bodies: multifaceted subdomains of the interchromatin space. Trends Cell Biol. 9: 302-309.

185. MatlinA.J., ClarkF., Smith C.W. 2005. Understanding alternative splicing: towards a cellular code. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 6: 386-398.

186. MatsuzakiM. 1971. Electron microscopic studies on the oogenesis of dragonfly and cricket with special reference to the panoistic ovaries. Dev. Growth Differ. 13: 379398.

187. Melcak /, Melcakova S., Kopsky V., Vecerova J., Raska I. 2001. Prespliceosomal assembly on microinjected precursor mRNA takes place in nuclear speckles. Mol. Biol. Cell. 12: 393-406.

188. Meininghaus M., Chapman R.D., Horndasch M., Eick D. 2000. Conditional expression of RNA polymerase II in mammalian cells. J. Biol. Chem. 275: 2437524382.

189. Meister G, Eggert C, Buhler D, Brahms H, Kambach C, Fischer U. 2001. Methylation of Sm proteins by a complex containing PRMT5 and the putative U snRNP assembly factor pICln. Curr. Biol. 11: 1990-1994.

190. Millhouse S., Manley J.L. 2005. The C-terminal domain of RNA polymerase II functions as a phosphorylation-dependent splicing activator in a heterologous protein. Mol Cell Biol. 25: 533-544.

191. Mintz P.J., Patterson S.D., Neuwald A.F., Spahr C.S., Spector D.L. 1999. Purification and biochemical characterization of interchromatin granule clusters. EMBO J. 18:4308-4320.

192. Miralles F., Ojverstedt L.-G., Sabri N., Aissoimi Y., Hellman U., Skoglimd U., Visa N. 2000. Electron tomography reveals posttranscriptional binding of pre-mRNPs to specific fibers in the nucleoplasm. J. Cell Biol. 148: 271-282.

193. Misteli T. 2000. Cell biology of transcription and pre-mRNA splicing: nuclear architecture meets nuclear function. J. Cell Sci. 113: 1841-1849.

194. Misteli T. 2001. Protein dynamics: implications for nuclear architecture and gene expression. Science. 291: 843-847.

195. Misteli Т., Caceres J.F., Spector D.L. 1997. The dynamics of a pre-mRNA splicing factor in living cells. Nature. 387: 523-527.

196. Misteli Т., Spector D.L. 1998. The cellular organization of gene expression. Curr. Opin. Cell Biol. 10:323-331.

197. Misteli Т., Spector D.L. 1999. RNA polymerase II targets pre-mRNA splicing factors to transcription sites in vivo. Mol. Cell. 3: 697-705.

198. Molenaar C, Abdulle A., Gena A., Tanke H.J., Dirks R.W. 2004. Poly(A)+ RNAs roam the cell nucleus and pass through speckle domains in transcriptionally active and inactive cells. J. Cell Biol. 165: 191-202.

199. Monneron A., Bemhard W. 1969. Fine structural organization of the interphase nucleus in some mammalian cells. J. Ultrastruct. Res. 27: 266-288.

200. Morgan G.T. 2002. Lampbrush chromosomes and associated bodies: new insight into principles of nuclear structure and function. Chromosome Res. 10: 177-200.

201. Morgan G.T., Doyle 0., Murphy C, Gall J.G. 2000. RNA polymerase II in Cajal bodies of amphibian oocytes. J. Struct. Biol. 129: 258-268.

202. Murphy C.f Wang Z., Roeger R.G., Gall J.G. 2002. RNA polymerase III in Cajal bodies and lampbrush chromosomes of the Xenopus oocyte nucleus. Mol. Biol. Cell. 13: 3466-3476.

203. Narayanan A., Speckmann W, Terns R, Terns M.P. 1999. Role of the box C/D motif in localization of small nucleolar RNAs to coiled bodies and nucleoli. Mol. Biol. Cell. 10: 2131-2147.

204. Narayanan A., Eifert J., Marfatia K.A., Macara I.G., Corbett A.H., Terns R.M., Terns M.P. 2003. Nuclear RanGTP is not required for targeting small nucleolar RNAs to the nucleolus. J. Cell Sci. 116: 177-186.

205. Nesic D., Tanackovic G., Kramer A. 2004. A role for Cajal bodies in the final steps of U2 snRNP biogenesis. J. Cell Sci. 117: 4423-4433.

206. Neugebauer KM., Roth M.B. 1997. Transcription units as RNA processing units. Gen Dev. 11:3279-3285.

207. Ochs R.L., Lischwe M.A., Spohn W.H., Busch Y 1985. Fibrillarin: a new protein of the nucleolus identified by autoimmune sera. Biol. Cell. 54: 123-134.

208. Ochs R.L., Stein T.W. Jr, Tan EM 1994. Coiled bodies in the nucleolus of breast cancer cells. J. Cell Sci. 107: 385-399.

209. OggS.C., Lamond A.I. 2002. Cajal bodies and coilin — moving towards function. J. Cell Biol. 159: 17-21.

210. O'Keefe R.T., Mayeda A., Sadowsky C.L., Krainer A.R. Spector D.L. 1994. Disruption of pre-mRNA splicing in vivo results in reorganization of splicing factors. J. Cell Biol. 124: 249-250.

211. Palancade В., Bensaude O. 2003. Investigating RNA polymerase II carboxyl-terminal domain (CTD) phosphorylation. Eur. J. Biochem. 270: 3859-3870.

212. Parfenov V., Davis D.S., Pochukalina G., Sample C.E., Murti K.G. 1996. Nuclear bodies of stage 6 oocytes of Rana temporaria contain nucleolar and coiled body proteins. Exp. Cell Res. 228: 229-236.

213. Parfenov V.N., Davis D.S., Pochukalina G.N., Kostyuchek D., Murti K.G. 1998. Dynamics of distribution of splicing components relative to the transcriptional state of human oocytes from antral follicles. J. Cell Biochem. 69: 72-80.

214. Parfenov V., Potchukalina G., DudinaL., Kostyuchek D., GruzovaM. 1989. Human antral follicles: oocyte nucleus and the karyosphere formation (electron microscopic and autoradigraphic data). Gamete Res. 22: 219-231.

215. Perry R.P., Kelley D.E. 1970. Inhibition of RNA synthesis by actynomycin D: characteristic doze response of different RNA species. J. Cell Physiol. 76: 127139.

216. Pillai R.S., Will C.L., Lurmann R., Schtimpcrli D., Miiller B. 2001. Purified U7 snRNPs lack the Sm proteins D1 and D2 but contain LsmlO, a new 14 kDa Sm Dl-like protein. EMBO J. 20 (19): 5470-5479.

217. Pinheru R, Liaw P., Bertens K., Yankulov K. 2004. Three cyclin-dependent kinases preferentially phosphorylate different parts of the C-terminal domain of the large subunit of RNA polymerase II. Eur. J. Biochem. 271: 1004-1014.

218. PlataniM., Goldberg 1., LamondA.I., Swedlow J.R. 2002. Cajal body dynamics and association with chromatin are ATP-dependent. Nat Cell Biol. 4 (7): 502-508.

219. PlataniM., Goldberg I., Swedlow J.R., Lamond A.I. 2000. In vivo analysis of cajal body movement, separation, and joining in live human cells. J. Cell Biol. 151: 1561-1574.

220. Politz J.C.R., TuftR.A., PrasanthK.V., BaudendistelN., FogartyK.E., LifshitzL.M., Langowski J., Spector D.L., Pederson T. 2006. Rapid, diffusional shuttling of poly(A) RNA between nuclear speckles and the nucleoplasm. Mol. Biol. Cell. 17: 1239-1249.

221. Postlethwait J.H., Giorgi F. 1985. Vitellogenesis in insect. In.: Developmental Biology. A comprehensive synthesis, vol. 1. N.Y., London: Plenum Press, pp. 351380.

222. Proudfoot N., O'Sullivan J. 2002. Polyadenylation: a tail of two complexes. Curr. Biol. 12: 855-857.

223. Puvion E., Bachellerie J.P., Burglen M.J. 1979. Nucleolar perichromatin granules induced by dichlorobenzimidazole riboside. J. Ultrastruct Res. 69: 1-12.

224. Puvion E., Moyne G. 1981. In situ localisation of RNA structures. In: The Cell Nucleus. Nuclear particles. 8 (A): 59-116.

225. Puvion E., Puvion-Dutilleul F. 1996. Ultrastructure of the nucleus in relation to transcription and splicing: roles of perichromatin fibrils and interchromatin granules. Exp. Cell Res. 229: 217-225.

226. Raska I. 1995. Nuclear ultrastructures associated with the RNA synthesis and processing. J. Cell Biochem. 59: 11-26.

227. Raska 1., Andrade L.E.C., Ochs RL., Chan E.K.L., Chang C.M., Rous G., TanE.M. 1991. Immunological and ultrastructural studies of the nuclear coiled body with autoimmune antibodies. Exp. Cell Res. 195: 27-37.

228. Raska I., Dundr M., Koberna K. 1992. Structure-function subcompartments of the mammalian cell nucleus as revealed by the electron microscopic affinity cytochemistry. Cell Biol. Int. Rep. 16: 771-789.

229. Ray A., Ramamurty P.S. 1979. Sources of RNA oocytes in Crynodes peregrinus Fuessly (Coleoptera, Chrysomelidae). Int. J. Insect Morphol. Embryol. 8: 113-122.

230. Riibsam R., Bunning J. 2001. F-actin is a component of the karyosome in neuropteran oocyte nuclei. Arthr. Struct. Dev. 30: 125-133.

231. Sacco-Bubulya P., Spector D.L 2002. Disassembly of interchromatin granule clusters alters the coordination of transcription and pre-mRNA splicing. J. Cell Biol. 156: 425-436.

232. Saifitdinova A., Derjusheva S., Krasikova A., Gaginskaya E. 2003. Lainpbrush chromosomes of the chaffinch (Fringilla coelebs L.). Chromosome Res. 11: 99-113.

233. Saitoh N., Spahr C.S., Patterson S.D., Bubulya P., Neuwald A.F., Spector D.L. 2004. Proteomic analysis of interchromatin granule clusters. Mol. Biol. Cell. 15: 3876-3890.

234. Schroeder S.C., Schwer В., Shuman S., Bentley D. 2000. Dynamic association of capping enzymes with transcribing RNA polymerase II. Genes Dev. 14: 2435-2440.

235. Schul W., van Driel R., de Jong L. 1998. Coiled bodies and U2 snRNA genes adjacent to coiled bodies are enriched in factors required for snRNA transcription. Mol. Biol. Cell. 9: 1025-1036.

236. Sehgal P.В., Darnell J.E., Jr., Tamm I. 1976. The inhibition by DRB (5,6-dichloro-1-P-D-ribofuranosylbenzimidazole) of hnRNA and mRNA production in HeLa cells. Cell. 9: 473-480.

237. Shikama N., Lyon J., La Thangue N. 1997. The p300/CBP family: integrating signals with transcription factors and chromatin. Trends Cell Biol. 7: 230-236.

238. Shopland L.S., Byron M., Stein J.L., Lian J.B. Stein G.S., Lawrence J.B. 2001. Replication- dependent histone gene expression is related to Cajal body (CB) association but does not requer sustained CB contact. Mol. Biol. Cell. 12: 565-576.

239. Shopland L.S., Johnson C.V., Byron M., McNeil J., Lawrence J.B. 2003. Clustering of multiple specific genes and gene-rich R-bands around SC-35 domains: evidence for local euchromatic neighborhoods. J. Cell Biol. 162: 981-990.

240. Shopland L.S., Johnson C.V., Lawrence J.B. 2002. Evidence that all SC-35 domains contain mRNAs and that transcripts can be structurally constrained within these domains. J. Struct. Biol. 140: 131-139.

241. Shpargel К.В., OspinaJ.K., Tucker K.E., Matera A.G., Hebert M.D. 2003. Control of Cajal body number is mediated by the coilin C-terminus. J. Cell Sci. 116: 303312.

242. Sims III K.J., Mandal S.S., Reinberg D. 2004. Recent highlights of RNA-polymerase-ll-mediated transcription. Curr. Opin. Cell Biol. 16: 263-271.

243. Sleeman J.E., Lamond A.I. 1999. Nuclear organization of pre-mRNA splicing factors. Curr. Opin. Cell Biol. 11: 372-377.

244. Sleeman J.E., Lyon C.E., Platani M., Kreivi J.-P., Lamond A.I. 1998. Dynamic interaction between splicing snRNPs, coiled bodies and nucleoli revealed using snRNP protein fusions to the green fluorescent protein. Exp. Cell Res. 243: 290304.

245. Sleeman J.E., Lyon C.E., Platani M., Kreivi J.-P., Lamond A.I. 1999. Dynamic interaction between splicing snRNPs, coiled bodies and nucleoli revealed using snRNP protein fusions to the green fluorescent protein. Exp. Cell Res. 243: 290304.

246. Sleeman J.E., Trinkle-Mulcahy L., PrescottA.R., OggS.C., Lamond A.I. 2003. Cajal body proteins SMN and coilin show differential dynamic behaviour in vivo. J. Cell Sci. 116: 2039-2050.

247. Smith K.P., Lawrence J.B. 2000. Interactions of U2 gene loci and their nuclear transcripts with Cajal (coiled) bodies: evidence for pre-U2 within Cajal bodies. Mol. Biol. Cell. 11:2987-2998.

248. Sobell H.M. 1985. Actinomycin and DNA transcription. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 82: 5328-5331.

249. Solovei I., Gaginskaya E., Hutchison N., Macgregor H. 1993. Avian sex chromosomes in the lampbrush form: the ZW lampbrush bivalents from six species of bird. Chromosome Res. 1: 153-166.

250. Solovei Л, Gaginskaya E.R., Macgregor H.C. 1994. The arrangement and transcription of telomere DNA sequences at the ends of lampbrush chromosomes of birds. Chromosome Res. 2: 460-70.

251. Spector D.L. 1993. Macromolecular domains within the cell nucleus. Annu. Rev. Cell Biol. USA. 9:265-315.

252. Spector D.L. 1996. Nuclear organization and gene expression. Exp. Cell Res. 229: 189-197.

253. Spector D.L. 2001. Nuclear domains. J. Cell Sci. 114: 2891-2893.

254. Spector D.L., FuX.-D., Maniatis T. 1991. Associations between distinct pre-mRNA splicing components and the cell nucleus. EMBO J. 10: 3467-3481.

255. Stanek D., Neugebauer KM. 2004. Detection of snRNP assembly intermediates in Cajal bodies by fluorescence resonance energy transfer. J. Cell Biol. 166: 10151025.

256. Stanek D., Neugebauer KM. 2006. The Cajal body: a meeting place for spliceosomal snRNPs in the nuclear maze. Chromosoma. 115: 343-354.

257. Stanek D., Racier S.D., KlingaufM., Neugebauer KM. 2003. Targeting of U4/U6 small nuclear RNP assembly factor SART3/pl 10 to Cajal bodies. J Cell Biol. 160: 505-516.

258. Stepanova I.S., Bogolyubov D.S., Skovorodkin I.N., Parfenov V.N. 2006. Cajal bodies and interchromatin granule clusters in cricket oocytes: composition, dynamics and interactions. Cell Biol. Int. doi: 10.1016/j.cellbi.2006.04.010.

259. Swiqtek P. 1999. Formation of the karyosome in developing oocytes of weevils (Coleoptera, Curculionidae). Tissue and Cell. 31: 587-593.

260. Swiqtek P., Jaglarz M.K 2004. SnRNPs are present in the karyosome capsule in the weevil germinal vesicle. Tissue and Cell. 36: 253-262.

261. Swift H. 1963. Cytochemical aspects on nuclear fine structure. Exp. Cell Res. 9: 5467.

262. Szentirmay M.N., Sawadogo M. 2000. Spatial organization of RNA polymerase II transcription in the nucleus. Nucleic Acids Res. 28: 2019-2025.

263. Thiry M. 1995. Behavior of interchromatin granules during the cell cycle. Eur. J. Cell Biol. 68: 14-24.

264. Thompson C.M., Koleske A.J., Chao D.M., Young R.A. 1993. A multisubunit complex associated with the RNA polymerase II CTD and TATA-binding protein in yeast. Cell. 73: 1361-1375.

265. Trout W. 1975. Die Transkriptionsaktivitat der Chromosomen in den Oocyten von Ephestia (Lepidoptera). Cytobiologie. 2: 172-180.

266. Tsvetkov A., Alexandrova 0., Bogolyubov D., Gruzova M. 1997. Nuclear bodies from cricket and mealworm oocytes contain splicing factors of pre-mRNA. Eur. J. Entomol. 94: 393-407.

267. Tucker K.E., Massello L.K., Gao L, Barber T.J., Hebert M.D., Chan E.K., Matera A.G. 2000. Structure and characterization of the murine p80 coilin gene, Coil. J. Struct. Biol. 29: 269-277.

268. Tucker K.E., Matera, A.G. 2005. The Cajal body—a nuclear gathering place. In: Visions of the Nucleus, ed. P. Hemmerich and S. Diekmann. Stevenson Ranch, CA: American Scientific Publishers, pp. 159-171.

269. Tuma R., StolkJ.A., RothM.B. 1993. Identification and characterization of a sphere organelle protein. J. Cell Biol. 122: 767-773.

270. Туе K., Steitz J.A. 1989. U3, U8 and U13 comprise a new class of mammalian snRNPs localized in the cell nucleolus. EMBO J. 8: 3113-3119.

271. Tycowski K.T., You Z.H., Graham P.J., Steitz J.A. 1998. Modification of U6 spliceosomal RNA is guided by other small RNAs. Mol. Cell. 2: 629-638.

272. Uhlman F. 2001. Chromosome condensation: Packaging the genome. Curr. Biol. 11:384-387.

273. Ullmann S.L. 1973. Oogenesis in Tenebrio molitor: histological and autoradiography observations on pupal and adult ovaries. J Embryol Exp Morphol. 30: 179-217.

274. Vanderlaan M., Thomas C.B. 1985. Characterization of monoclonal antibodies to bromodeoxyuridine. Cytometry. 6: 501-505.

275. Verheggen C., Lafontaine D.L.J., Samarsky D., Mouaikel J., Blanchard J.-M., Bordonne R., BertrandE. 2002. Mammalian and yeast U3 snoRNPs are matured in specific and related nuclear compartments. EMBO J. 21: 2736-2745.

276. Visa N., Puvion-Dutilleul F., Harper F., Bachellerie J.P., Puvion E. 1993a. Intranuclear distribution of poly(A)+-RNA determined by electron microscope in situ hybridization. Exp. Cell Res. 208: 19-34.

277. Wallace R.A., Jared D. W., Dumont J.N., Sega M. W. 1973. Protein incorporation by isolated amphibian oocytes. III. Optimum incubation conditions. J. Exp.Zool. 184: 321-333.

278. Wansink D.G., Nelissen R.L., de Jong L. 1994. In vitro splicing of pre-mRNA containing bromouridine. Mol Biol Rep. 19: 109-113.

279. Wei X., Somanathan S., Samarabandu J., Berezney R. 1999. Three-dimensional visualization of transcription sites and their association with splicing factor-rich nuclear speckles. J. Cell Biol. 146: 543-558.

280. Will C.L., Liihrmann R. 1997. Protein functions in pre-mRNA splicing. Curr. Opin. Cell Biol. 9: 320-328.

281. Will C.L., Liihrmann R. 2001. Spliceosomal UsnRNP biogenesis, structure and function. Curr. Opin. Cell Biol. 13: 290-301.

282. Wu C.-H., Gall J.G. 1993. U7 small nuclear RNA in С snurposomes of the Xenopus germinal vesicle. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 90: 6257-6259.

283. Wu C.-H., Murphy C., Gall J.G. 1996. The Sm binding site targets U7 snRNA to coiled bodies (spheres) of amphibian oocytes. RNA. 2: 811-823.

284. Wu J.Y., Maniatis T. 1993. Specific interactions between proteins implicated in splice site selection and regulated alternative splicing. Cell. 75: 1061-1070.

285. Wu Z., Gall J.G. 1997. "Micronucleoli" in the Xenopus germinal vesicle. Chromosoma. 105: 438-443.

286. Wu Z., Murphy C, Callan H.G., Gall J.G. 1991. Small nuclear ribonucleoproteins and heterogeneous nuclear ribonucleoproteins in the amphibian germinal vesicle: loops, spheres and snurposomes. J. Cell Biol. 113: 465-483.

287. Wu Z, Murphy C, Wu C.-H.H., Tsvetkov A., Gall J.G. 1994. Snurposomes and coiled bodies. Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 58: 747-754.

288. Xu H., Pillai R.S., Azzouz T.N., Shpargel K.B., Kambach C., Herbert M.D., Schumperli D., Matera A.G. 2005. The C-terminal domain of coilin interacts with Sm proteins and U snRNPs. Chromosoma. 114: 155-166.

289. Yannoni Y.M., White К 1997. Association of the neuron-specific RNA binding domain-containing protein ELAV with the coiled body in Drosophila neurons. Chromosoma. 105:332-341.

290. Yu Y.T., Shu M.D., Steitz J.A. 1998. Modifications of U2 snRNA are required for snRNP assembly and pre-mRNA splicing. EMBO J. 17: 5783-5795.

291. YuryevA., Patturajan M., Litingtung Y., Joshi R., Gentile C., GebaraM., CordenJ. 1996. The CTD of RNA polymerase II interacts with a novel set of SR-like proteins. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 93: 6975-6980.

292. Zandomeni R., Zandomeni M.C., Shugar D., Weinmann R. 1986. Casein kinase type II is involved in the inhibition by 5,6-Dichloro-l-P-D-ribofuranosylbenzimidazole of specific RNA polymerase II transcription. J. Biol. Chem. 261: 3414-3419.

293. Zelazowska M., Jaglarz M.K. 2004. Oogenesis in phthirapterans (Insecta: Phthiraptera). I. Morphological and histochemical characterization of the oocyte nucleus and its inclusions. Arthr. Struct. Dev. 33: 161-172.

294. Zeng C., Kim E., Warren S.L., Berget S.M. 1997. Dynamic relocation of transcription and splicing factors dependent upon transcriptional activity. EMBO. J. 16(6): 1401-1412.

295. Zhang J., CordenJ.L. 1991. Identification of phosphorylation sites in the repetitive carboxyl-terminal domain of the mouse RNA polymerase II largest subunit. J Biol Chem. 266 (4): 2290-2296.