Оптимизация получения комплексов пептидов с рекомбинантным HSP70 человека для повышения иммуногенности белковых антигенов

Черников, Владимир Александрович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Оптимизация получения комплексов пептидов с рекомбинантным HSP70 человека для повышения иммуногенности белковых антигенов
ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Оптимизация получения комплексов пептидов с рекомбинантным HSP70 человека для повышения иммуногенности белковых антигенов"

□0347402 1

На правах рукописи

Черников Владимир Александрович

ОПТИМИЗАЦИЯ ПОЛУЧЕНИЯ КОМПЛЕКСОВ ПЕПТИДОВ С РЕКОМБИНАНТНЫМ ШР70 ЧЕЛОВЕКА ДЛЯ ПОВЫШЕНИЯ ИММУНОГЕННОСТИ БЕЛКОВЫХ АНТИГЕНОВ

03.00.04. - биохимия

Автореферат диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 0 ^

Москва-2009

003474021

Работа выполнена на кафедре биохимии лечебного факультета ММА им. И.М. Сеченова

Научный руководитель:

член-корр. РАМН,

доктор химических наук, профессор

Северин Сергей Евгеньевич

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессо Залетаев Дмитрий Владимирович

доктор биологических наук, профессо Москалева Елизавета Юрьевна

Ведущая организация: Институт биоорганической химии им, академиков

М. М. Шемякина и Ю. А. Овчинникова РАН

Защита состоится 26 июня 2009 г. в 14.00, на заседании диссертационного Совета Д 212.203.13 по защите докторских и кандидатских диссертаций при Российском университете дружбы народов по адресу: 117198, 117198, Москва, улица Миклухо-Маклая, д.8, медицинский факультет, e-mail: info@rudn.ru.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Российского университета дружбы народов по адресу: 117198, Москва, улица Миклухо-Маклая, Д.6.

Автореферат разослан «^5» мая 2009 года.

Ученый секретарь Совета по защите

докторских и кандидатских диссертаций, кандидат биологических наук

Е.В.Лукашева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Белки теплового шока (HSP), открытые в 1974 году (Tissieres А., 1974), в настоящее время представляют наибольший интерес, как векторпыс молекулы для создания на их основе противоопухолевых и противовирусных терапевтических вакцин. Наиболее изучены белки теплового шока с молекулярной массой около 70 и 90 кДа, выполняющие шаперонные функции внутри клеток. Кроме того, эти белки способны образовывать комплексы с нефолдированными белками и широким спектром пептидных фрагментов, которые, в свою очередь, являются предшественниками антигенных пептидов, презентируемых на мембране клеток в составе молекул MHC-I. На взаимодействие HSP с пептидами внутри клеток оказывает влияние множество факторов, наиболее изученными из которых являются концентрация АТР и ADP, а также присутствие ко-шаперонов (Banecki В., 1996).

Первые данные об иммуногенности злокачественных новообразований были получены в 1960 году (Klein G., 1960), а в начале 90-х годов P.K.Srivastava показал, что наиболее иммуногенными фракциями лизатов опухолевых клеток являются комплексы пептидов с HSP90 и HSP70. Позже разными группами исследователей (Basu S., 2001, Bendz Н., 2007) было показано участие HSP70 в процессе презентации экзогенных антигенов антиген-презентирующими клетками в составе молекул МНС I типа, которые, в свою очередь, индуцируют специфический клеточный иммунный ответ. Клинические испытания вакцин на основе HSP70 демонстрируют их высокую безопасность при достаточно большой дисперсии эффективности, которая может быть объяснена не только иммуносупрессорным влиянием опухоли, но и факторами, связанными с технологией получения препаратов. Наиболее перспективным подходом представляется терапия с использованием аутологичных вакцин на основе комплексов пептидов с HSP70 и HSP90, выделенных из опухолевого материала пациента, что позволяет использовать уникальные опухолеассоциированные антигены, и достичь максимальной эффективности. Основной проблемой аутологичных вакцин является зависимость количества выделяемой вакцины от размеров опухоли. До 50% пациентов исключаются из клинических испытаний по причине невозможности выделения достаточного для иммунизации количества вакцины (Wood С., 2008). Второй проблемой, объясняющей большую дисперсию эффективности, является избирательность образования комплексов пептидов с HSP70 внутри опухолевых клеток, приводящая к исключению опухолеассоциированных пептидов из состава комплексов. Разрешить обе описанные проблемы может применение для получения вакцин рекомбинантного HSP70 человека и разработка методики нагрузки данного белка антигенами, выделяемыми из пептидной фракции лизата клеток аутологичной опухоли in vitro.

Цель работы: определение оптимальных условий получения комплексов пептидных антигенов с рекомбинантным HSP70 человека in vitro для повышения содержания антигенных пептидов в составе комплексов и расширения спектра связываемых антигенов.

Задачи:

1. Клонирование генов белков теплового шока человека HSPA1B, HSPA8 и создание генно-инженерных конструкций их гибридных аналогов HSP70HYB и HSC70HYB.

2. Экспрессия клонированных генов в клетках E.coli и получение высокоочищенных рекомбинантных белков HSP70Aib> HSC70, HSP70hyb и HSC70hyb.

3. Определение спектральных характеристик и функциональной активности рекомбинантных белков;

4. Исследование влияния на процесс образования комплексов выделенных белков с НЬА-А2-рестриктированными пептидами рН среды, температуры, концентрации нуклеотидных факторов, соотношения компонентов смеси;

5. Отработка методики получения комплексов белков с пептидной фракцией лизатов опухолевых клеток.

6. Исследование цитотоксической активности Т-лимфоцитов, активированных ДК, нагруженных комплексами HLA-A2 рестриктированных антигенных пептидов с полученными белками.

Научная новизна и практическая значимость работы. Получено четыре высокопродуктивных штамма JM109/pQE-hHSP70AlB, JM109/pQE-hIISP 70HYB, JM109/pQE-hHSC70, JM109/pQE-hHSC70HYB. Отработана методика получения высокоочищенных рекомбинантных белков человека HSP70aib, HSC70, и их гибридных аналогов.

Впервые была показана корреляция изменений в УФ-спектре рекомбинатных HSP70 человека со структурными изменениями, происходящими при взаимодейстии данных белков с пептидами. Показаны различия пептид-связывающей активности рекомбинантных белков HSP70Aib> HSP70hyb, HSC70 и HSC70hyb-

Определен характер взаимодействий АТР-азного и пептид-свзывающего доменов в рекомбинантных белках и впервые предложен способ определения количества пептидных комплексов в препаратах HSP70, который может быть использован для стандартизации вакцин на основе рекомбинантных HSP70.

Показана возможность увеличения количества вакцины, выделяемой из фиксированного количества опухолевых клеток, за счет использования пептидной фракции лизата опухолевых клеток.

Предложена методика получения противоопухолевых вакцин на основе полученных рекомбинантных белков HSP70hyb и HSC70. Работа в целом представляет собой основу для создания технологического регламента получения индивидуальных противоопухолевых, а также противовирусных вакцин на основе рекомбинантных белков HSP70.

Всероссийская выставка научно-технического творчества молодежи ШТМ-2008 (Москва, 2008. Автор награжден медалью «За успехи в научно-техническом творчестве»). Международная научная конференция студентов, аспирантов и молодых учёных "Ломоносов-2009" (Москва, 2009). Методическая конференция кафедры биохимии ММА им. И.М.Сеченова 22.04.2009.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 10 научных работ (из них 2 - в журнале из списка ВАК, 1 - в других научных изданиях, 7 - тезисы докладов).

Структура и объём диссертации. Диссертация состоит из введения, 3 глав, заключения, выводов и списка литературы. Работа изложена на 109 страницах, содержит 28 рисунков и 2 таблицы. Список цитируемой литературы включает 195 наименований.

Благодарности. Автор глубоко признателен за помощь в освоении генно-инженерных и биохимических методов, а также ценные указания во время работы над диссертацией к.б.н. Гороховец Н.В., к.х.н. Савватеевой JI.B и к.х.н. Макарову В.А. Автор благодарит за постоянную поддержку и внимание д.б.н. Белушкину Н.Н., к.б.н. Коваленко Н.А., коллектив кафедры биохимии и лично к.б.н. Силуянову С.Н. Благодарю всех коллег и друзей, проявивших интерес к настоящей работе. Отдельная благодарность всем родным, жене Леночке и Джимми за постоянную заботу, понимание и терпение.

Работа поддержана грантом НШ-4018.2008.7.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Методы исследования Гены HSPA1B и HSPA8 клонировали стандартными методами (Chomczynski Р. 1987). Получение рекомбинантных экспрессионных плазмид осуществляли через промежуточное клонирование в плазмиду pUC19 фрагментов транслируемой области генов, примерно соответствующих АТР- и пептид-связывающим доменам белков теплового шока. Экспрессионными плазмидами трансформировали клетки E.coli штамма JM109. Синтез рекомбинантных белков индуцировали добавлением IPTG. Рекомбинантные белки выделяли №2+-хелатной хроматографией.

УФ спектр белков снимали при помощи спектрофотометра BioRad Smart Spec 3000 Анализ спектров проводился с помощью ПО OriginPro 8.

Гидролиз АТР тестировали колориметрическим методом по накоплению неорганического фосфата (Chan К1986).

Комплексы пептидов с белками HSP70 получали путем совместной инкубации пептида с HSP70 в буферных растворах с рН 8.0 и рН 6. в отсутствии или присутствии 1, 2 ,3 и 5 мМ ADP в течение 30, 60, 90, 120 минут при температуре 4, 15, 25 и 37°С. Количество связавшегося меченого FITC пептида определяли по оптической плотности при длине волны 495 нм. Комплексы смесей (1:1) меченого и немеченого пептидов с HSP70hyb получали путем совместной инкубации 5-, 10- и 20-кратного избытка пептидной смеси с белком в буферных растворах с рН 8.0 и рН 6.0 в присутствии ADP. Очищенный препарат комплексов делили на 2 части для определения АТР-азной активности и количества связавшегося меченого FITC пептида. Анализ данных проводили с помощью ПО OriginPro 8, аппроксимируя полученные данные на функцию вида y = A(l-e'h).

Эмпирические значения коэффициентов интерпретировали следующим образом:

A = fiSi°'pep°, где HSPo и pepo- исходные концентрации соответствующего белка и pep0 + Kd

свободного пептида, a Kd-равновесная константа диссоциации комплексов; к = к1:вр ■ рер0 + к„ю, где кобр и кдисс - константы скоростей образования и диссоциации комплексов соответственно. Kd, k„gp и кдисс определяли используя эмпирически определенные значения величин А и к.

Клетки лимфомы Беркитта линии Raj i культивировали в среде RPMI 1640 с добавлением 10% сыворотки крупного рогатого скота и 50 мкг/мл гентамицина. Суспензию осаждали центрифугированием. Клеточные осадки лизировали. Из растворимой фракции отделяли пептиды с молекулярной массой менее 10 кДа. Из оставшегося концентрата выделяли фракцию пептидов, связанных с клеточными HSP70, а затем фракцию пептидов, связанных с клеточными HSP90, gp96 и МНС. Все пептидные фракции подвергали введению метки FITC.

Комплексы выделенных из лизата опухолевых клеток меченых FITC коротких пептидов с HSP70hyb и HSC70 получали путем совместной инкубации пептидной фракции с белком в буферах рН 8.0 и рН 6.0 в течение суток в присутствии ADP. Комплексы рекомбинантных HSP70 с мечеными FITC пептидами разрушали, добавляя АТР, и анализировали методом ВЭЖХ на колонке с сорбентом С,8. Анализ результатов проводили с помощью ПО OriginPro 8.

Клетки Т-В-клеточной гибридомы линии Т2 и клетки эритролейкоза человека линии К562 культивировали в среде RPMI 1640 с добавлением 10% фетальной сыворотки крупного рогатого скота и 100 мкг/мл гентамицина. Клетки линии Т2 культивировали в среде, содержащей 3Н-тимидин, затем в течение 3-х часов с пептидом PSMA и использовали в качестве мишеней в цитотоксическом тесте.

ДК выделяли из моноцитов периферической крови здоровых доноров. Для нагрузки зрелых ДК опухолеспецифическими антигенами к ним добавляли следующие препараты: 1. 100 мкг HSP70hyb;

2.100 мкг комплексов HSP70Hyb-PSMA, с содержанием пептида около 40%. 3. 0.5 мкг пептида PSMA.

Нагруженные опухолеспецифическими антигенами ДК смешивали с аутологичными лимфоцитами в соотношении 1:10. Соотношение клетки-мишени : клетки-эффекторы в цитотоксическом тесте составляло 1:10. Через 24 ч инкубации клетки собирали на фильтры и измеряли их радиоактивность. ЦТА лимфоцитов человека определяли по выживаемости опухолевых клеток-мишеней. Статистическую обработку данных проводили с помощью ПО OriginPro 8.0.

Клонирование генов семейства HSP70 в экспрессионных плазмидных

векторах.

На основе известных последовательностей мРНК HSP70 и HSC70 человека (GenBank NM_005346 и GetiBank NM_ 006597) были синтезированы праймеры для амплификации транслируемой области ДНК генов (CDS) семейства белков теплового шока HSP70A1 и HSC70. Получение рекомбинантных экспрессионных плазмид осуществляли через промежуточное клонирование в pUC19 плазмиду отдельных фрагментов CDS, примерно соответствующих АТР- и пептид-

связывающим доменам белков теплового шока для возможности создания гибридных белков.

Тотальную РНК выделяли из лимфоцитов человека, подверженных тепловому шоку. Комплементарную ДНК (кДНК) генов HSPA1B и HSPA8 человека синтезировал« на мРНК с помощью обратной транскриптазы мышиного вируса лейкемии Молони (RT M-MuLV). Амплификацию кДНК проводили с помощью ПЦР, используя три пары праймеров. В результате получили по два перекрывающихся фрагмента ДНК HSP70AIB и ДНК HSP70A8: N-концевой фрагмент (HSP70J и HSC70J) и С-концевой фрагмент (HSP70JI и HSC70JI в смеси), примерно соответствующие АТР- и пептид-связывающим доменам белков. Фрагменты клонировали по Smal-camy в плазмиде pUC19. Для этого рестриктированную Smal и дефосфорилированную плазмиду pUC19 лигировали с предварительно кинированными фрагментами ДНК. Лигазные смеси, содержащие плазмидную ДНК, трансфицировали в компетентные клетки E.coli JM109 модифицированным методом кальциевой трансформации с использованием буфера FSB с последующей селекцией на чашках Петри с агаризованной питательной средой LB, содержащей ампициллин. Скрининг клонов проводили методом ПЦР с помощью универсальных M13/pUC праймеров по длине продуктов амплификации . Клоны, содержащие плазмиды со вставками HSP70_II и HSC70_II, отбирали методом рестрикционного анализа соответствующих амплификатов, используя наличие в HSC70_II фрагменте уникального EcoRI сайта рестрикции. Отобранные колонии наращивали в среде LB с ампициллином. Из клеточной массы выделяли плазмиды и секвенировали встроенные фрагменты на генетическом анализаторе.

Полноразмерную последовательность транслируемой области генов HSPA1B, HSC70 получали лигированием соотвественно фрагментов HSP70J и HSP70 II и фрагментов HSC70_I и HSC70II по сайту Pstl, находящегося в области перекрывания этих фрагментов (рис. 1). Гибридные ДНК-последовательности белков HSP70hyb и HSC70hyb получали лигированием фрагментов HSP70_I и HSC70_II и фрагментов HSC70J и HSP70_II по сайту Pstl, соотвественно. Конструкции генов выделяли из промежуточных pUCI9 плазмид после рестрикции ферментами BamHI и Hindlll и встраивали в полилинкер коммерческого экспрессионного вектора pQE80L по указанным сайтам рестрикции (рис. 1). Использование данного вектора позволяет при трансляции получать белки с несколькими дополнительными аминокислотами на N-конце: Met-Arg-Gly-Ser-(His)e-Gly-Ser- (далее обозначаемыми His-tag, рис. 1). Лигазные смеси, содержащие рекомбинантные экспрессионные вектора, трансфицировали в компетентные клетки E.coli JM109 модифицированным методом кальциевой трансформации с последующей селекцией на чашках Петри с агаризованной питательной средой LB, содержащей ампициллин. Отбор колоний с генной конструкцией проводили методом ПЦР с помощью стандартных праймеров для pQE-векторов по длине продуктов амплификации. Отобранные колонии наращивали в среде LB с ампициллином и из клеточной массы выделяли экспрессионные рекомбинантные плазмиды для хранения.

Таким образом, получены четыре экспрессионные плазмиды pQE-hHSP70AlB, pQE-hHSP70HYB, PQE-hHSC70 и pQE-hHSC70HYB.

з3'мРНК HSP70

праймер 1

^ араймер 3

^ праймер 2

фрагмент ДНК HSP70 I

я кДНК HSP70

праймер 4

фрагмент ДНК HSP70 II I ' I

Экстракция рсстриктированного фрагмента ДНК HSP70JI

ДНК HSP70A1B

Je HindIU, BamHl

литирование .

rhHSP70AlB

" Col El..i

Рис. 1. Схема конструирования экспрессионных плазмид на примерее pQE-hHSP70A№.

Получение рекомбинантных белков.

Для получения штаммов-продуцентов рекомбинантных белков теплового шока отдельные колонии Е.соИ ХМ 109, трансформированные экспрессионными рекомбинантными плазмидами, наращивали в среде ЬВ с ампициллином для оценки продуктивности, устойчивости к антибиотик^' и стабильности трансформации. Были получены следующие штаммы-продуцепты: Ш109/р<ЗЕ-Ш8Р70А1В, М109/рС>Е-Ш8Р70НУВ, М109/рРЕ-1гН8С70, М109/РдЕ-Ш8С70НУВ.

Все четыре штамма являются суперпродуцентами. Выделение рекомбинантных Н5Р70 из растворимой фракции проводили в одну стадию -методом металло-хелатной хроматографии с использованием иминодиацетат-сефарозы, активированной ионами никеля, благодаря наличию в составе полипептидной цепи рекомбинантных белков шести остатков гистидина (в последовательности №з-1а§). Такой способ не только значительно упрощает выделение, но и предотвращает контаминацию ОпаК - бактериальным аналогом эукариотического НБР70. Выход целевых белков составил примерно 30 мг с 1 л бактериальной культуры. Чистота выделенных рекомбинантных белков составляла

Рис. 2. Электрофореграмма препарата рекомбинантного Н8Р70д1в в 12% полиакриламидном геле с додецилсульфатом патрия в восстанавливающих условиях: до очистки (1) и после очистки (2).

не менее 90% (рис. 2).

«а и 1 2

В работе представлены рекомбинантные белки Н8Р70А1В и Н8С70, соответствующие индуцибельному гену НБРАШ и конститутивно экспрессирующемуся гену НБРА8. Кроме того, путем комбинирования АТР-азного и пептид-связьшающего доменов двух белков впервые получены гибридные белки: Н8Р70нув состоит из АТР-азного домена от Н5>Р70А1В и пептид-связывающего домена от Н8С70; Н8С70нув состоит из АТР-азного домена от ШС70 и пептид-связывающего домена от Н8Р70аш-

Таким образом, исследование свойств полученных нами четырех рекомбинантных белков представляет интерес не только с точки зрения выбора оптимального объекта для создания вакцин, но и для исследования междоменных взаимодействий этих важных клеточных шаперонов. Достаточно простая и вместе с тем высокоэффективная методика выделения и очистки белков позволяет использовать их для мелкосерийного (актуально для аутологичных вакцин) и промышленного производства иммунотерапевтических препаратов.

Исследование спектральных характеристик рекомбинантных HSP70.

Анализ спектров поглощения в УФ области позволяет выявить макроструктурные изменения, происходящие с белком в тех или иных условиях. В работе было проведено исследование влияния пептидов на изменение конформации белков путем измерения УФ-спектров комплексов белок-пептид, для чего использовали синтетические пептиды. Сводные данные об использованных пептидах приведены в таблице 1. Исследуемый белок смешивали с пептидом в соотношении 1:5 в буфере PBS рН 7.4.

В результате исследования динамики изменения положения скрытых пиков триптофана и тирозина в течение 180 мин инкубации HSP70aib с пептидами NS5, PSMA и Е7 было выявлено, что сдвиг пика тирозина носит волнообразный характер, а профиль изменений пика триптофана различался в зависимости от структуры пептида.

Цикличность изменений тирозинового пика была подтверждена в экспериментах с остальными рекомбинантными белками при взаимодействии с пептидом NS5 (рис. 3). Время цикла зависит, по-видимому, от ряда параметров, наиболее существенными из которых, по нашему мнению, являются характер и сила междоменных взаимодействий.

Таблица 1. Структура и аффинность пептидов, использованных в исследовании._

Название Происхождение Структура Аффинность к белку

HSP70Aib HSP70hyb HSC70

Е7 Папиломавирус человека YMLDLQPETT + + +++

ЙРЮО Меланома ITDQVPFSV ++ ++ ++++

HCV2a Вирус гепатита С YLLPRRGPRL +++ +++ +

NS5 Вирус гепатита С VVLDSLDPMV Mil 1 Н 1 ++

PSMA Рак простаты ALFDIESKV ++ ++ н/д

Как видно из рис. 3, для HSP70Aib, HSC70 и HSP70hyb наблюдалась общая тенденция к снижению длины волны пика триптофана при образовании комплексов с пептидом NS5. Существенное отличие профиля сдвигов триптофанового пика у HSC70hyb следует, по-видимому, объяснять слабостью взаимодействий данного белка с пептидом NS5. Исследование профилей сдвигов пиков тирозина и триптофана в процессе образования комплексов между рекомбинантными белками и пептидами не выявило наличия универсального для комплексов разных пептидов с HSP70 «стационарного» положения максимума поглощения ни одного из исследованных пиков.

Проводившиеся ранее исследования структурных перестроек, происходящих в HSP70 были основаны на применении, в основном флуоресцентных методов анализа (Banecki В., 1996, Fan Н, 2006), которые позволяют отслеживать локальные конформационные изменения. Сопоставляя результаты исследования с литературными данными, можно предположить, что способность белков семейства HSP70 связываться с широким спектром пептидов основана на вовлечении в этот процесс разных а-спиральных участков пептид-связывающего домена. Активность участия разных а-спиралей в образовании комплексов с пептидами определяется

| * по№и«и гум Тер |

А .А Л

I \

V / \ / / V / \

О 20 АО 00 вО 1С0 120 140 100 лрти имгубации. <*п«

О ао 40 «О Ю 100 130 140 «во 1*0

2ВМ-. 2М.2-2М.0. I 2В7,§'

а »7,4-

ч 2М.З-

2яя.|. гам- ■

а)

А Л Л

Л„~/

I ? \ /

У У

V • V

Я « «I Ю 100

• |ММЯ ММуб|фМ, II

■ положив ИМ Тф

ео ао на 120 ко 1» •р*ия маувяцм

■ погюже»м гмп

А л Нг?' V

./ л

!! |

8 134-\ §2

1 * | ■ голо»« ни* пи» Тгр 1

I /*> ■ \ Л

\ /

\ .у V

о та 40 ео во «о 120 но 1« 1во

гремя инкубации- мп

О 20 40 «О во >00 120 140 160 ■ркя инкубации, ниц

| :м ?

« га

положение пика Туг 1

Л / \ . 7 ^

¡¡¿.«А ■/■ / \

1 /

/ V/

О 20 « 60 во 100 120

время инкубации, мин

| > погюмяну пик» Тгр)

Л- '/

Л/

О 20 40 60 в 100 120 140 1в0 160 •рема имкубироввпм, мин

Рис 3. Динамика изменений во времени положения пиков, соответствующих максимумам поглощения тирозина (Туг) и триптофана (Тф) при инкубации белков ШС70 (А,Б), Н8Р70нув (В,Г) и ГОС70нув (ДД)с пептидом N85.

ключевыми аминокислотными остатками каковыми являются, например, Val^ и А1а429 в DnaK (Rüdiger S.,2000).

Исследование динамики связывания рекомбинантных HSP70 с

пептидами.

Важным параметром, влияющим на образование комплексов HSP70 с пептидами, является концентрация ADP в среде. Большинство методик получения комплексов HSP70 с пептидами in vitro предполагают использование 1-5 мМ ADP для стабилизации получаемых комплексов.

Нами было изучено влияние концентрации ADP в диапазоне от 0 до 5 мМ на динамику связывания HSP70 in vitro с различными пептидами. Для этого использовали меченые FITC пептиды, которые смешивали с HSP70aiB, HSP70hyb, HSC70 и HSC70hyb в соотношении 5:1. Свободный пептид отделяли с помощью ультрафильтрации, а количество связавшегося с рекомбинантным белком пептида измеряли по оптическому поглощению метки. Было показано, что повышение концентрации ADP приводит к увеличению количества комплексов HSC70 (рис.4) и HSP70AiB (рис.5) с НЬА-А2-рестриктированными пептидами.

О » « «О Ю КО 1» О 20 <0 ао «3 100 120

Рис 4. Динамика образования комплексов меченых БИС пептидов с Н8С70.

Было показано также, что Н5Р70Аш и Н8С70 обладают разной аффинностью к одним и тем же пептидам и, следовательно, могут различаться по спектру пептидов, которые образуют с ними стойкие комплексы. Влияние концентрации АБР на динамику образования комплексов пептидов с Н5Р70Нув носило более сложный характер и зависело от аффинности пептида (рис.6).

Наибольшее количество комплексов каждого из пептидов при инкубации в течение 120 мин с Н8Р70иув удалось получить при концентрации ЛОР 1мМ. Повышение концентрации АОР приводило к более быстрому достижению «плато», но снижало максимальное количество образующихся комплексов у пептидов с относительно невысокой аффинностью.

Рис 5. Дипамика образования комплексов меченых Р1ТС пептидов с Н5Р70аш.

Точка перекреста графиков зависимости количества образовавшихся комплексов от времени инкубации при разных значениях концентрации АБР была тем ближе к началу координат, чем выше аффинность пептида. Для высокоаффинных пептидов оптимальным значением концентрации АБР также является 1мМ, хотя перекрестов графиков не наблюдалось.

Получить стойкие комплексы Н8С70нув ни с одним пептидом не удалось, что свидетельствует об отсутствии функциональной активности у этого гибридного белка.

На основе полученных экспериментальных данных были определены зависимости констант скоростей образования комплексов и равновесных констант диссоциации комплексов Н8Р70Ат, НБС70 (рис. 7) и Н5Р70нув (рис. 8) с мечеными Р1ТС пептидами. Расчеты констант были проведены на основе эмпирически определенных коэффициентов экспоненциальных уравнений, описывающих зависимость насыщения рекомбинантных белков пептидами от времепи инкубации.

Было показано, что повышение концентрации АБР в среде увеличивает константу скорости образования комплексов рекомбинантных Н5Р70Лт, НБС70 и

Т/Ж.....

~Т//- ■;........

//¿у,...........:........

1тМ АОР '• 2п-.МА0Р \ ЗГП.М АОР ч-,5тМ АОР

100 12

«О 130

Рис 6. Динамика образования комплексов меченых ИТС пептидов с НБР70цув-

I 0.0045 С 0.0040 .1 0,0035

Л О.ООЭО *

0.0025 0.0020 0.0316-

у«4,2'10'4,**0.00]

Ю^к+о .0016 ,НСУ2»

у*2.в*104*«*010012

концентрация АОР, глМ

коч^етрация АОР. гпМ

1.0 Т.9 2.0 2.3 10 3.5 40

концентрации АОР, тМ

-Е7 ... др100

-мгз

Р5МА

1.5 2.0 2.5 Э.О 3.5 4 0 концентрация АОР, тМ

4.5 5.0 5 5

Рис 7. Зависимость констант скоростей образования комплексов с разными пептидами белков Н8С70 (А) и Н8Р70Ат (В) и равновесных констант диссоциации комплексов белков НБС70 (Б) и Н8Р70а№ (Г) от концентрации АБР.

Н5Р70цув со всеми исследованными пептидами. При этом было отмечено более сильное влияние изменения концентрации АОР на константу скорости образования комплексов с высоко аффинными пептидами.

Константа диссоциации комплексов с пептидами при повышении концентрации АОР снижалась в случае белков Н8Р70А|в и ШС70, но не Н8Р70Нув (рис. 8). Гибридный белок характеризовался увеличением равновесной константы диссоциации комплексов со всеми исследованными пептидами при одновременном увеличении константы скорости образования комплексов (рис. 8). Сопоставляя полученные данные о динамике образования комплексов, можно сделать вывод о том, что нуклеотидный фактор способствует ускорению взаимодействий белков семейства НБР70 с пептидами, индуцируя конформационные изменения в АТР-азном домене, приводящие к облегчению взаимодействия пептида с Н8Р70.

Несмотря на разную структуру субстрат-связывающих доменов, Н8Р70АШ и Н8Р70нув обладают сходством относительно предпочтительного мотива для связывания. Исследованные пептиды можно ранжировать по увеличению аффинности к данным рекомбинантным белкам в следующем порядке: Е7^р100<Р5МА<НСУ2а<Ы55. В то же время для Н8С70 ряд увеличения аффинности пептидов выглядит следующим образом: НСУ2а<Н85<Е7^р100. Другие функциональные характеристики ШР70нув отличаются как от Н8Р70аш> так и Н5С70. Это касается, в первую очередь, максимального количества комплексов, которое удавалось получить.

1.007

6 0.006 I 0.005

ОФЗ 0002 0.001

y=0.001Z7*K+0.00234

конце кграция АОР. тМ

концентрация АОР, тМ

Рис 8. Зависимость констант скоростей образования комплексов (А) и равновесных констант диссоциации комплексов (Б) белка Н8Р70нув с разными пептидами от

концентрации АОР.

Исследование АТР-азной активности HSP70.

Гидролиз АТР является основной функцией N-концевого домена. АТР-азную активность рекомбинантных HSP70AiB, HSP70i1YB и HSC70 определяли после выделения и очистки рекомбинантных белков, а также каждый раз после процедуры получения и очистки комплексов колориметрическим методом по количеству образовавшегося при гидролизе АТР неорганического фосфата.

АТР-азная активность белков HSP70hyB, HSP70Aib и HSC70 после выделения из биомассы бактерий варьировала в пределах от 0.7 до 2.8 нмоль/мг-мин. HSC70hyb АТР-азной активностью не обладал. После Зх-часовой

инкубации с 2мМ АТР и последующей очистки от низкомолекулярной пептидной фракции (менее ЮкДа) белки теряли АТР-азную активность, что, по-видимому, объясняется диссоциацией комплексов белков с бактериальными пептидами. Очищенные от свободного меченого пептида комплексы белков HSP70hyb,HSP70a,b и HSC70 с пептидами Е7, PSMA и NS5 проявляли АТР-азную активность, величина которой линейно зависела от количества образовавшихся комплексов (рис. 9). Было показано отсутствие статистически достоверных различий между сглаживающими прямыми, показывающими зависимость АТР-азной активности HSP70Ajb от количества образовавшихся комплексов с пептидами Е7 и PSMA (р=0.01), а также сглаживающими прямыми, показывающими зависимость АТР-азпой активности HSP70hyb и HSC70 от количества образовавшихся комплексов с пептидами Е7 и PSMA и Е7 и NS5, соответственно.

Угловой коэффициент сглаживающей прямой, отражающей зависимость АТР-азной активности препарата HSP70aib от количества связанного пептида составил 1.14. Аналогичный показатель для HSP70hyb и HSC70 составил 0.7.

Ранее зарубежными исследователями отмечалось повышение АТР-азной активности различных членов семейства HSP70 при добавлении к ним пептидов (Mayer М, 2003). Было также показано влияние на АТР-азную активность ко-шаперонов, таких как DnaJ и grpE (Russell R, 1999). При этом, механизм влияния ко-шаперонов на изменение АТР-азной активности отличается от механизма влияния пептидных субстратов (Mayer М, 2003).

Рис 9. Зависимость АТР-азной активности белков Н8С70, ШР70нув и Н8Р70ат от доли комплексов с мечеными пептидами Е7, N85 или Р8МА в препарате белка.

Прерывистыми линиями показан 95% доверительный интервал.

В результате проведенного исследования была показана линейная зависимость АТР-азной активности от количества пептидных комплексов в препарате рекомбинантного белка независимо от природы связываемого пептида, что позволяет использовать процедуру измерения АТР-азной активности для количественного определения комплексов ШР70 с немечеными пептидами. Данный способ предоставляет возможность разработки метода стандартизации вакцин на основе рекомбинантных ШР70, что особенно актуально при внедрении их в клиническую практику. При реализации предлагаемого нами подхода -

нагрузке антигенными пептидами рекомбинантных белков HSP70 in vitro -возможно создание стандартизуемых вакцин на базе смеси белков HSP70hyb и HSC70. Как было отмечено ранее, данные белки различаются предпочтениями к пептидным мотивам, что позволит расширить спектр связываемых пептидов.

Значение углового коэффициента прямой, отражающей зависимость АТР-азной активности препарата белка от количества связанного пептида позволяет в некоторой степени охарактеризовать междоменные взаимодействия в белках HSP70A1B, HSP70hyb и HSC70. Оптимальная нагрузка пептидом HSP70Hyb осуществляется при синхронизации конформационных изменений, возбуждаемых ADP в АТР-азном домене и пептидами в пептид-связывающем.

Таким образом, в дальнейшей работе были использованы рекомбинантные белки HSP70hyb и HSC70, представляющие наибольший практический интерес для создания стандартизуемой вакцины.

Исследование влияния различных параметров на связывание HSP70 с

пептидами.

Основными факторами, влияющими на скорость протекания практически шобой реакции в растворе, являются значение температуры и рН среды. Для изучения влияния температуры на эффективность образования комплексов рекомбинантных белков HSP70 с пептидами, меченый FITC пептид NS5 инкубировали с HSP70hyb при значениях температуры 4, 15, 25, 37 и 50°С. Как видно из рис.1 OA, максимальное количество комплексов образовывалось при температуре 25°С. Полученные результаты соответствуют данным зарубежных публикаций, в которых отмечается наиболее легкий переход из «открытой» R-конформации в «закрытую» Т-конформацню, стабилизирующую комплекс с пептидом, при температуре 25°С [Ни В, 2007]. Аналогичный эксперимент, проведенный с белком не очищенным от бактериальных пептидов с помощью АТР, показал существенную роль процесса предварительной очистки для эффективной нагрузки рекомбинантных HSP70 пептидами in vitro.

тшпот "с fc"7 jplOO fSMA MCVJ» К*>

Рис. 10. Влияние температуры (А) и значения величины рН (Б) на количество образующихся комплексов Н8Р70Нув с пептидами N85 (А и Б) и Е7, £р100, Р8МА, НСУ2а (Б) после 60 (А) и 30 (Б) минут инкубации.

Возможными причинами снижения эффективности нагрузки белка, могут быть, во-первых, отличная от нативной конформация, обусловленная отсутствием в АТР-азном центре какого-либо нуклеотида, и, во-вторых, наличие в препарате НБР70нув до 4% комплексов с высоко аффинными бактериальными пептидами.

Влияние рН среды на связывание пептидов с HSP70hyb продемонстрировано на рис. 10Б. Было показано, что при значении рН 6.0 связывание пептидов «кислой» группы (Е7, gplOO, PSMA, NS5) усиливается, тогда как пептиды «основной» группы (HCV2a) лучше образуют комплексы при рН 8.0. Следует отметить, что влияние сдвига рН среды на повышение аффинности пептида к HSP70hyb было тем заметнее, чем выше его гидрофильпость.

Таким образом, были определены оптимальные условия для связывания МНС-рестриктированных пептидов с HSP70hyb in vitro.

Исследование взаимодействия HSP70 со смесью пептидов.

Обнаружение зависимости АТР-азной активности от доли комплексов в препарате HSP70 сделало возможным проведение экспериментов со смесью меченого и немеченого пептидов, обладающих разной аффинностью к исследуемым белкам. Нами были подготовлены 3 смеси, содержащие один из меченых FITC пептидов - NS5, Е7 или gplOO и немеченый пептид PSMA в молярном соотношении 1:1. Белок HSP70hyb инкубировали с 5-, Ю- и 20-кратным молярным избытком каждой из данных смесей в оптимизированных условиях нагрузки в течение 2-х часов. В результате было показано, что высоко аффинные пептиды обладают способностью вытеснять низко аффинные из состава комплексов с HSP70hyb при повышении общего соотношения пептид:ШР70 (рис 11).

5 И * I RI 10 ГЗ 1.* VS 1.« ю 12 г* ZB г< л.о «

Рис. 11. Зависимость доли комплексов Н8Р70нув-пептид, образованных пептидами различной аффинности (N85, £р100, Е7) в эквимолярной смеси с пептидом РБМА после 2х часов инкубации, от общего молярного соотношения Н8Р70:пептиды (А) и времени инкубации (Б) при фиксированном общем молярном отношении Н8Р70:пептиды, равном 1:5.

В то же время было продемонстрировано слабое изменение соотношения пептидов разной аффинности в комплексах в зависимости от времени инкубации (рис. 11). Сдвиг рН среды, изменяющий аффинность пептидов к Н8Р70 приводит к изменению предпочтений Н8Р70Нув. Так, несмотря на то, что для Н8Р70нув отдельно с пептидом Р8МА удавалось получить большее количество комплексов чем с пептидом Е7 при значениях рН 6.0 и 8.0, инкубирование Н5Р70НУв со смесью этих пептидов при рН 6.0. приводило к незначительному преобладанию в составе комплексов Е7, а при рН 8.0 - Р8МА.

Аналогичные эксперименты были проведены с HSC70 и смесью 3-х немеченых пептидов с использованием метода ВЭЖХ на колонке Cig. Пептидная смесь содержала пептиды NS5, Е7 и HCV2a в эквимолярном соотношении. Также как и в серии экспериментов с HSP70hyb было показано вытеснение наименее аффинного пептида из состава комплексов при увеличении соотношения пептидная смссь:Н8С70. Было также подтверждено влияние рН среды на количество образующихся комплексов с различными пептидами. Таким образом, проведенные в работе исследования позволили определить такие параметры, которые обеспечили бы максимальное связывание пептидов с белками HSP70hyb и HSC70 при условии сохранения разнообразия пептидного состава исходной смеси в составе комплексов in vitro.

Исследование взаимодействия HSP70 с пептидной фракцией лизата опухолевых клеток.

Для подтверждения результатов, полученных на модельных смесях, и гипотез, предложенных в ходе теоретического анализа данных, исследовали закономерности образования комплексов рекомбинантных HSP70 с пептидной фракцией лизатов опухолевых клеток лимфомы Беркитта линии Raji. Для количественного и качественного анализа пептидов, элюированных из комплексов с HSP70hyb и HSC70, был использован метод ВЭЖХ на колонке С^. Для повышения чувствительности детекции и определенной гарантии специфичности было решено ввести метку FITC в состав пептидов, находящихся в пептидной фракции клеточного лизата..

Лизат клеток линии Raji получали по стандартной методике. Ультрафильтрацией из растворимой клеточной фракции выделяли низкомолекулярную (менее ЮкДа) фракцию пептидов, которую подвергли введению метки FITC. Из оставшегося концентрата высокомолекулярной фракции клеточных белков были последовательно элюированы пептиды, связанные с клеточными HSP70, и находившиеся в комплексе с клеточными HSP90, gp96 и МНС-Г. Элюаты также подвергли введению метки. Результаты анализа клеточных пептидов методом ВЭЖХ приведены на рис. 12. Количество свободных пептидов, выделенных из 60 млн. клеток лимфомы Беркитта линии Raji превышает количество пептидов, находящихся в комплексах с HSP70, HSP90, gp96 и MHC-I, элюированных из такого же количества клеток.

По профилю свойств элюированных пептидов можно констатировать, что состав свободной пептидной фракции более разнообразен, чем состав пептидов, связанных с HSP90, gp96 и MHC-I. В то же время, в связанном состоянии могут находиться такие пептиды, которые отсутствуют в клетках в свободном виде.

0,025 0.020

. 0,015

О*

0.010 0,0050,000- -i

---Г-'-1-'-1-'-1->

« . 6 8 10 12

время элюции, мин

Рис. 12. Хроматограмма низкомолекулярной (менее ЮкДа) фракции лизата опухолевой линии Raji (лизат), пептадов, элюированпых из комплексов с клеточными HSP70 (hsp70) и MHC-I, gp96 и HSP90 (МНС, gp96,hsp90).

Таким образом, предположение о возможности снизить необходимый для выделения достаточного количества аутологичной вакцины объем изолируемой у пациента опухли за счет использования свободной пептидной фракции, является волне обоснованным. Можно также предположить возможность расширения передаваемого антигенного репертуара за счет получения комплексов с HSP70 in vitro.

I ■---лизат

1 ——комплекс рН8.0 I -комплекс рНбО

! ' i ' I ' Та ' Тг ' и 4 в в ю 12 н

«ремя элккци, шм 4»« элюции, ник

Рис. 13. Хроматограмма низкомолекулярной (менее ЮкДа) фракции лизата клеток

опухолевой линии Raji (лизат), пептидов, элюированпых из комплексов с HSP70hyb. полученных после инкубации 40 мкг данного белка в течение 24 часов с 40 мкг пептидной фракции лизата (А) и 10 мкг пептидной фракции лизата (Б) при рН 6.0 (комплекс рН 6.0.) и рН 8.0 (комплекс рН 8.0).

Эксперименты по нагрузке HSP70hyb пептидной фракцией лизата (рис. 13) показали расширение спектра связываемых HSP70hyb пептидов по сравнению с пептидами, элюированными из клеточных комплексов с HSP70 (рис. 12). Этот факт еще раз показывает, что избирательность связывания HSP70 с пептидами in vivo является результатом создания внутри клеток специфических условий, не

-----лизат

| —г МНС, др96, hsp90 ¡ -- hsp70

являющихся оптимальными с точки зрения получения иммунотерапевтических препаратов.

Были отмечены некоторые различия в спектре пептидов, связываемых при значениях рН 6.0 и 8.0, как при высоком, так и при низком соотношении пептид:белок для Н8Р70нув (рис.13) и НБС70. Были показаны также различия в спектре связываемых пептидов между Н8Р70Нув и Н8С70, которые были более выражены при нагрузке белков небольшим избытком пептида.

Таким образом, результаты, полученные на модельных пептидных смесях и в экспериментах с лизатами опухолевых клеток, показали, что пара рекомбинантных белков Н8Р70нув и Н8С70 является оптимальной для создания комплексов с наиболее разнобразным антигенным пептидным составом.

Исследование цитотоксической активности.

Участие в кросс-презентации антигенов и активации специфического клеточного иммунитета комплексами пептидов с нативными и рекомбинантными ШР70 и ШС70 была показана многими авторами (вгаЬо А., 1994, Шопо Н.,1993). Для подтверждения наличия аналогичных свойств у Н8Р70Нув был поставлен цитотоксический тест.

Зрелые дендритные клетки (ДК) инкубировали с пептидом Р8МА, рекомбинантным Н8Р70нув или препаратом рекомбинантного Н8Р70нув, содержащим около 40% комплексов данного белка с пептидом РЭМА. После нагрузки антигенами ДК инкубировали с аутологичными лимфоцитами для индукции цитотоксических лимфоцитов (ЦТЛ). Специфичность индуцированных ЦТЛ по отношению к пептиду Р8МА оценивали с помощью НЬА-А2+ клеток Т-В-клеточной гибридомы человека линии Т2. Специфические мишени получали путем инкубации клеток линии Т2 с пептидом РЭМА. Отношение количества клеток-эффекторов к количеству клеток-мишеней составляло 10:1. Для ингибирования активности ИК-клеток цитотоксический тест проводили в присутствии 30-кратного избытка (по отношению к Т2) клеток линии К562, не экспрессирующих МНС-1 на своей поверхности.

пептид РЭМА

ганврто^

Рис. 14. Цитогоксическая активность в отношении клеток линии Т2, нагруженных пептидом Р8МА, аутологичных лимфоцитов, активированных интактными зрелыми ДК (ДК) и ДК, нагруженными пептидом РвМА (пептид Р8МА), препаратом белком Н8Р70нув не содержащим комплексов (Н8Р70нув) с данным пептидом и содержащим около 40% комплексов (комплекс 40%).

В результате проведенного эксперимента было показано, что ДК, нагруженные препаратом HSP70hyb. содержащим около 40% комплексов с пептидом PSMA, наиболее эффективно индуцировали созревание цитотоксических лимфоцитов (рис.14). Цитотоксическая активность лимфоцитов индуцированных зрелыми ДК, нагруженными эквивалентным количеством пептида PSMA, была приблизительно на 30% ниже.

Таким образом, было показано наличие у рекомбинантного HSP70hyb свойств, необходимых для применения данного белка в качестве средства направленной доставки антигенных пептидов при создании аутологичных противоопухолевых вакцин.

Заключение.

В результате работы получен рекомбинантный белок HSP70hyb> обладающий новыми свойствами, обуславливающими его перспективность для дальнейшего использования при создании вакцин. Обнаружено увеличение избирательности связывания HSP70 с пептидами при повышении концентрации ADP. Сложный характер влияния ADP необходимо учитывать при нагрузке HSP70 in vitro смесью пептидов. Проведенные в работе исследования позволили определить оптимальные значения рН среды, температуры и концентрации ADP для получения комплексов пептидов с HSP70 in vitro. Совместное использование HSP70hyb и HSC70 дает дополнительную возможность расширить спектр захватываемых пептидов.

Показано, что взаимное влияние доменов проявляется в форме линейной зависимости АТР-азной активности препарата белка от количества образовавшихся комплексов, угловой коэффициент которой определяется, по-видимому, структурой субстрат-связывающего домена и поэтому различается для HSP70aib и HSP70hyb- Кроме того, субстратные предпочтения пептид-связывающего домена определяются, по-видимому, структурой АТР-азного домена, следствием чего является сходство параметров аффинности исследованных пептидов к HSP70A1B и HSP70hvb.

Благодаря одинаковому коэффициенту зависимости АТР-азной активности от количества комплексов в препарате этих белков, получаемый композитный препарат возможно стандартизовать по значению АТР-азной активности, характеризующему содержание комплексов с пептидами.

В экспериментах с лизатами опухолевых клеток показана возможность увеличения количества и повышения качества вакцины за счет использования свободных опухолевых пептидов. Таким образом, имеющиеся в настоящее время разработки могут послужить основой для создания технологического регламента получения индивидуальных противоопухолевых вакцин на базе рекомбинантных HSP70 и проведения необходимого комплекса доклинических и клинических испытаний для внедрения нового подхода в современную онкологическую практику в России.

осуществляется путем подкожной инъекции, а данная манипуляция является рутинной для медицинского персонала среднего звена. Таким образом, введение в практику предлагаемых разработок будет способствовать улучшению качества и повышению количества медицинских услуг, оказываемых населению в области онкологии.

Таким образом, на субстратные предпочтения HSP70 оказывают влияние не только ко-шапероны, способные модулировать пептид-связывающую активность, но и другие внутриклеточные факторы, среди которых особое значение имеет концентрация ADP. В опухолевых клетках это приводит к преимущественному связыванию белков семейства HSP70 с высокоаффинными пептидами, что неизбежно понижает разнообразие антигенного состава клеточных комплексов.

ВЫВОДЫ

1. Сконструированы четыре рекомбинантные плазмидные ДНК и на их основе получены высокопродуктивные штаммы E.coli JM109/pQE-HSP70AlB, JM109/pQE-HSP70HYB, JM109/pQE-HSC70HYB и JM109/pQE-HSC70.

2. Разработана методика получения рекомбинантных белков HSP70aib и HSC70, а также гибридных белков HSP70hyb и HSC70hyb-

3. Обнаружены и охарактеризованы особенности спектральных характеристик полученных рекомбинантных белков HSP70Aib. HSC70, HSP70hyb и HSC70hyb и их комплексов с пептидами.

4. При исследовании взаимодействия рекомбинантных белков HSP70 с пептидами обнаружена линейная зависимость их АТР-азной активности от количества образующихся комплексов Н8Р70-пептид и на основе полученных данных предложен способ количественного определения пептидных комплексов в препаратах HSP70.

5. Установлены основные параметры, определяющие степень связывания пептидов с белками семейства HSP70 (концентрация ADP, температура и рН среды, соотношение пептидов и HSP70, типы белков и предложен оптимизированный метод получения комплексов пептидов с рекомбинантными HSP70 in vitro.

6. Показано, что спектр низкомолекулярных пептидов лизатов опухолевых клеток, связываемых рекомбинантными HSP70hyb и HSC70, зависит от условий образования комплексов in vitro (рН среды, молекулярное соотношение компонентов).

7. Продемонстрирована способность комплекса гибридного белка HSP70hyb с пептидным антигеном индуцировать образование специфических цитотоксических лимфоцитов in vitro.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ:

1. Черников В.А., Гороховец Н.В., Макаров В.А, Савватеева JI.B., Северин С.Е. Функциональная характеристика доменов и междоменных взаимодействий в рекомбинантном белке HSP70A1B человека. Молекулярная медицина, 2009, № 1, с. 49-54.

2. Гороховец Н.В., Черников В.А., Савватеева JI.B., Северин С.Е. Белки теплового шока человека HSP70 семейства и их роль в противоопухолевой терапии. Вестник НИИ Молекулярной медицины, 2008, выпуск 8, с. 30 - 51.

3. Савватеева JI.B., Гороховец Н.В., Черников В.А. Данилевский М.И., Северин С.Е. Получение рекомбинантного HSP70A1B человека. Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии, 2007, №3, с. 38 - 42.

4. Савватеева JI.B., Гороховец Н.В., Черников В.А. Данилевский М.И., Северин С.Е. Получение рекомбинантного HSP70 человека. Тезисы докладов Российского Медицинского Форума-2006 «Фундаментальная наука и практика», Москва, 18-20 октября, 2006, с. 119.

5. Sawateeva LV, Gorokhovets NV, Chernikov VA, Danilevskiy MI, Severin SE. Recombinant human HSP70 and its potential application in cancer immunotherapy. Abstracts of the International Scientific-Practical Interdisciplinary Workshop "New Technologies in Medicine and Experimental Biology", Bangkok-Pattaya, Thailand, February 28-March 8, 2007, p. 62.

6. Черников B.A., Гороховец H.B., Макаров B.A., Савватеева JI.B., Северин С.Е. Разработка способа стандартизации терапевтических вакцин на основе рекомбинантного белка HSP70A1B человека. Сборник материалов 72-й итоговой студенческой научно-практической конференции с международным участием имени профессора В.Ф. Войно-Ясенецкого, посвященной 100-летию со дня рождения профессора Подзолкова, 22-25 апреля 2008 года. Красноярск: Изд-во ООО «Версо», 2008г. с. 598-601.

7. Черников В.А., Гороховец Н.В., Макаров В.А., Савватеева Л.В., Северин С.Е. Разработка способа стандартизации терапевтических вакцин на основе рекомбинантного белка HSP70A1B человека Приложение к журналу «Вестник РАМН», 2008, №6 с.467-468.

8. Черников В.А., Гороховец Н.В., Макаров В.А., Савватеева Л.В., Северин С.Е Характеристика доменов и междоменных взаимодействий в рекомбинантном белке HSP70A1B человека. Молодь - медицин! майбутнього: Тези доп. М1жнар. наук. конф. студентгв та молодих вчених. 24-25 квггая 2008, Одеса: Одес. держ. мед. ун-т. 2008, с. 98.

9. Черников В.А. Наночастицы для доставки биологически активных веществ в антиген-презентирующие клетки на основе белков теплового шока 70 кДа. Лучшие проекты VIII Всероссийской выставки Научно-технического творчества молодежи Москва, ВВЦ 25-28 июня 2008, Москва: ООО "Рекламно-информационное агентство ВВЦ", с. 177-179.

Ю.Черников В.А. Исследование кинетических характеристик связывания белков теплового шока HSP70 с антигенными пептидами. Материалы докладов XVI Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов» 13-18 апреля 2009, Москва: Издательство МГУ, 2009, с. 34-35.

Черников Владимир Александрович Оптимизация получения комплексов пептидов с рекомбинантным HSP70 человека для повышения иммуногенности белковых антигенов

Важные клеточные шапероны белки теплового шока HSP70 принимают участие в иммунологическом контроле над опухолями. Иммунизация аутологичными комплексами пептидов с HSP70 представляет собой реальную альтернативу традиционной химиотерапии. Работа посвящена повышению эффективности препаратов на основе комплексов HSP70 за счет использования нового рекомбинантного белка и оптимизации условий его нагрузки антигенами in vitro. Были определены оптимальные значения рН среды, температуры, концентрации ADP и соотношения компонентов. Разработан способ количественного определения получаемой вакцины. В ходе работы получены новые данные о функционировании шаперонной системы HSP70.

Chernikov Vladimir Alexandrovich Optimization of human HSP70-peptide complexes reconstitution for enhancing protein immunogenicity

HSP70 are proposed to be important chaperones inside cells, but extracellular ones also play a role in anticancer immunity. Autologous HSP70-peptide complexes-based cancer vaccines are dramatically less harmful than conventional chemotherapy. This work aims to enhance efficacy of such vaccines by using recombinant human HSP70. Optimal pH, temperature, ADP concentration and components ratios have been determined. We have developed a peptide complex assay for HSP70 preparations. A knowledge of the chaperone machinery mechanisms has been enriched too.

Подписано в печать: 21.05.2009

Заказ № 2123 Тираж -100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Черников, Владимир Александрович

Список сокращений

ВВЕДЕНИЕ

I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1. Иммунтерапевтические подходы к лечению злокачественных новообразований

1.1. пассивная иммунотерапия

1.2. активная иммунотерапия и противоопухолевые вакцины

1.3. противоопухолевые вакцины: проблемы и перспективы

2. Белки теплового шока 70кДа и их внутриклеточные функции

2.1. Молекулярная структура белков семейства HSP

2.2. Номенклатура генов белков семейства HSP

2.3. Функции HSP70 внутри клетки

2.4. Механизм связывания пептидов с HSP

3. Внеклеточные функции HSP

3.1. Механизмы выхода HSP70 из клеток

3.2. Иммунологические функции HSP

3.3. Стратегии создания вакцин на основе HSP

II. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Материалы

Методы исследования

1. Получение мРНК и к ДНК генов семейства HSP70 человека

2. Конструирование экспрессионных векторов

2.1. Амплификация ДНК

2.2. Электрофорез ДНК в агарозном геле и экстракция фрагментов ДНК из легкоплавкой агарозы

2.3. Рестрикция плазмид 40 2.3.1. Рестрикция плазмиды pUC19 Smal рестриктазой

2.3.2. Рестрикция плазмид pUC19-HSP70I, pUC19- HSP70 II, pUC19-HSC70I и pUC19- HSC70 II рестриктазами PstI и Hindlll

2.3.3. Рестрикция плазмиды pQE80L рестриктазами BamHI и Hindlll

2.3.4. Рестрикция плазмид pUC19-HSP70aib. pUC19-HSP70hyb, pUC19-HSC70 и pUC19-HSC70hyb рестриктазами BamHI и Hindlll

2.4. Дефосфорилирование рестриктированной Smal плазмиды pUC

2.5. Фосфорилирование фрагментов ДНК

2.6. Лигирование

2.7. Получение компетентных клеток и их трансформация

2.8. Выделение плазмид методом щелочного лизиса

3. Наращивание клеточной биомассы штамма-продуцента E.coli и индукция синтеза рекомбинантных белков

4. Выделение рекомбинантных белков из биомассы штаммов-продуцентов E.coli

5. Определение спектральных характеристик белков

5.1. Измерение спектральных характеристик белков при различных значениях рН среды

5.2. Измерение спектральных характеристик белков при взаимодействии с пептидами

6. Определение АТРазной активности рекомбинантных белков

7. Получение комплексов рекомбинантных белков HSP70 с синтетическими пептидами

7.1. Получение меченых FITC синтетических пептидов

7.2. Получение комплексов индивидуальных пептидов с HSP

7.3. Получение комплексов смеси меченого и немеченого пептидов с HSP70hyb

7.4. Получение комплексов смеси немеченых пептидов с HSC

8. Определение кинетических характеристик HSP

9. Получение комплексов рекомбинантных белков с пептидной фракцией лизата опухолевых клеток

9.1. Получение пептидной фракции лизата опухолевых клеток

9.2. Получение комплексов пептидной фракции лизата опухолевых клеток с HSP

10. Анализ клеточных пептидов, образующих комплексы с HSP

11. Анализ индукции цитотоксичсской активности Т лимфоцитов 48 11.1. Культивирование клеток

11.2. Получение дендритных клеток

11.3. Анализ фенотипа ДК

11.4. Нагрузка ДК опухолеспецифическими антигенами

11.5. Индукция специфических цитотоксических лимфоцитов

11.6. Определение цитотоксической активности ЦТЛ

III. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. Клонирование генов семейства HSP70 в экспрессионных плазмидных векторах

2. Получение рекомбинантных белков

3. Исследование спектральных характеристик рекомбинантных HSP

4. Исследование динамики связывания рекомбинантных HSP70 с пептидами

5. Исследование АТР-азной активности HSP

6. Исследование влияния различных параметров на связывание HSP с пептидами

7. Исследование взаимодействия HSP70 со смесью пептидов

8. Исследование взаимодействия HSP70 с пептидной фракцией лизата опухолевых клеток

9. Исследование цитотоксической активности 86 ЗАКЛЮЧЕНИЕ

ВЫВОДЫ

Введение Диссертация по биологии, на тему "Оптимизация получения комплексов пептидов с рекомбинантным HSP70 человека для повышения иммуногенности белковых антигенов"

Актуальность темы.

Одним из наиболее динамично развивающихся в настоящее время подходов к лечению злокачественных новообразований является иммунотерапия, предполагающая подавление роста опухоли за счет индукция цитотоксических лимфоцитов (CTL), специфичных к антигенам опухоли. Необходимым условием получения специфического клеточного иммунного ответа является представление специализированными антиген-презентирующими клетками (АПК) опухолевых антигенов наивным CD8+ Т-лимфоцитам, осуществляемое благодаря процессу кросс-презентации, заключающемуся в способности АПК презентировать экзогенные антигены в составе MHC-I [135,182]. В 1990-х годах Р.К. Srivastava показал, что наибольшей иммуногенностыо обладают выделенные из опухолевых клеток белковые фракции с молекулярной массой около 70 и 90 кДа, а также, что иммуногенность данных фракций объясняется присутствием в них комплексов пептидных опухолевых антигенов с белками теплового шока HSP70, HSP90 и gp96 [77].

Белки теплового шока выполняют шаперонные функции внутри клеток и потому способны образовывать комплексы с широким спектром пептидов, а при попадании во внутренние среды организма в результате активной секреции при стрессе, или после гибели клеток комплексы пептидов с белками теплового шока могут быть захвачены АПК путем эндоцитоза, опосредуемого рецепторами CD91 и CD40, и включены в механизм кросс-презентации антигенов [11].

Клинические испытания вакцин [189], созданных на основе белков теплового шока, демонстрируют их высокую безопасность при достаточно большой дисперсии эффективности, которая может быть объяснена не только иммуносупрессорным влиянием опухоли, но и факторами, связанными с технологией получения препаратов. Наиболее перспективным подходом представляется создание аутологичных вакцин на основе выделенных из опухоли комплексов антигенных пептидов с HSP70 и gp96. Данный подход обеспечивает использование уникальных антигенов, присущих именно этой опухоли. Основной проблемой аутологичных вакцин является зависимость количества выделяемой вакцины от размеров опухоли. До 50% пациентов исключается из клинических испытаний по причине невозможности выделения достаточного для иммунизации количества вакцины [189]. Повышение концентрации шаперонов внутри клетки связано с воздействием на нее стрессовых факторов. Условия, создающиеся в период стресса различной природы внутри клетки, могут значительно различаться, что, по-видимому, может отражаться на степени нагрузки HSP70 антигенами и сужать спектр пептидов, образующих стойкие комплексы с данным белком in vivo. Неполная передача антигенного репертуара опухоли является, по-видимому, второй проблемой, объясняющей высокую дисперсию эффективности, характерную для аутологичных вакцин. Разрешить обе указанные проблемы может применение для получения вакцин рекомбинантного HSP70 человека и разработка методики нагрузки данного белка антигенами, выделяемыми'из пептидной фракции лизата клеток аутологичной опухоли in vitro.

Целью данной работы является: определение оптимальных условий получения комплексов пептидных антигенов с рекомбинантным HSP70 человека in vitro для повышения содержания антигенных пептидов в составе комплексов и расширения спектра связываемых антигенов.

В соответствии с поставленной целью были сформулированы следующие задачи:

• Клонирование генов белков теплового шока» человека HSPA1B, HSPA8 и создание генно-инженерных конструкций их гибридных аналогов HSP70HYB и HSC70HYB.

• Экспрессия клонированных генов в клетках E.coli и получение высокоочищенных рекомбинантных белков HSP70aib, HSC70,' HSP70hyb и HSC70hyb.

• Определение спектральных характеристик и функциональной активности рекомбинантных белков.

• Исследование влияния на процесс образования комплексов рекомбинантных белков с НЬА-А2-рестриктированными пептидами следующих факторов: рН среды, температура, концентрация ADP и аденозиновых нуклеотидных аналогов, соотношение компонентов смеси.

• Отработка методики получения* комплексов рекомбинантных белков с пептидной фракцией лизатов опухолевых клеток.

• Исследование способности полученного in vitro комплекса Н8Р70-пептид вызывать активацию антигенспецифических цитотоксических Т-лимфоцитов.

Научная новизна и практическая значимость работы.

В результате проведенных работ получено четыре высокопродуктивных штамма JM109/pQE-hHSP70AlB, JM109/pQE-hHSP70HYB, JM109/pQE-hHSC70, JM109/pQEhHSC70HYB. Отработана методика получения высокоочищенных рекомбинантных белков человека HSP70aib> HSC70, и их гибридных аналогов, что позволяет исследовать разнообразные функции этих важных клеточных шаперонов.

Продемонстрировано влияние междоменных взаимодействий на спектральные характеристики белков. Впервые была показана корреляция изменений в УФ-спектре рекомбинатных HSP70 человека со структурными изменениями, происходящими при взаимодейстии данных белков с пептидами. Показаны различия пептид-связывающей активности рекомбинантных белков HSP70Aib, HSP70hyb> HSC70 и HSC70hyb

В ходе исследований был определен характер взаимодействий АТР-азного и пептид-свзывающего доменов в рекомбинантных белках и на основе полученных данных впервые предложен способ определения количества пептидных комплексов в препаратах HSP70, который может быть использован для стандартизации вакцин на основе рекомбинантных HSP70.

Наиболее перспективными из полученных рекомбинантных белков являются HSP70hyb и HSC70. Предложена методика получения противоопухолевых вакцин на их основе.

Работа в целом представляет собой основу для создания технологического регламента получения индивидуальных противоопухолевых, а также противовирусных вакцин на основе рекомбинантных белков HSP70. В работе проанализированы возможности дальнейшего совершенствования данного направления с учетом полученных в ней новых научных данных.

Апробация работы. Результаты работы были представлены на следующих конференциях: International Scientific-Practical Interdisciplinary Workshop "New Technologies in Medicine and Experimental Biology" (Bangkok-Pattaya, Thailand, 2007). М1жнародна наукова конференщя студенев та молодых вчених «Молодь — медициш майбутнього» (Одесса, Украина, 2008. Работа награждена дипломом I степени.) V Конференция молодых ученых России с международным участием «Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины» (Москва, 2008). VIII Всероссийская выставка научно-технического творчества молодежи НТТМ-2008 (Москва, 2008. Автор награжден медалью «За успехи в научно-техническом творчестве»). Международная научная конференция студентов, аспирантов и молодых учёных "Ломоносов-2009" (Москва, 2009). Методическая конференция кафедры биохимии ММА им. И.М.Сеченова 22.04.2009.

I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Черников, Владимир Александрович

ВЫВОДЫ

2. Разработана методика получения рекомбинантных белков HSP70aib и HSC70, а также гибридных белков IISP70hyb и HSC70hyb

3. Обнаружены и охарактеризованы особенности спектральных характеристик полученных рекомбинантных белков HSP70aib> HSC70, HSP70hyb и HSC70hyb и их комплексов с пептидами.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В результате проведенных исследований получен рекомбинантный белок HSP70hyb, обладающий новыми свойствами, обуславливающими его перспективность для дальнейшего использования при создании вакцин. С ним удалось получить наибольшее количество пептидных комплексов, а для стабилизации образовавшихся комплексов не требуется ADP. Исследование временной динамики образования комплексов пептидов с рекомбинантными HSP70aib> HSP70hyb и HSC70 позволило впервые показать двойную роль ADP, как нуклеотидного фактора, в работе шаперонной системы HSP70. Связывание ADP с N-концевым доменом индуцирует конформационные изменения в белке и облегчает его переход в «закрытую» конформацию, тем самым достигается не только повышение стойкости комплекса, но и увеличивается эффективность связывания с пептидами.

С другой стороны, при исследовании спектральных характеристик белков было показано, что при взаимодействии С-концевого домена HSP70 с пептидом также возникают конформационные изменения, затрагивающие не только субстрат-связывающий, но и АТР-азный домен. Причем индуцированные пептидами конформационные перестройки тем сильнее, чем выше сродство HSP70 к пептиду. Обнаруженные взаимодействия доменов в HSP70, согласующиеся с описанными в литературе данными о работе шаперонной системе, обуславливают следующие свойства HSP70, показанные в нашей работе. Это — зависимость АТР-азной активности от количества пептида, связанного с HSP70 и увеличение избирательности связывания HSP70 с пептидами при повышении концентрации ADP. Сложный характер влияния ADP необходимо учитывать при нагрузке HSP70 in vitro смесью пептидов.

В ходе проведения экспериментов было показано, что взаимное влияние доменов проявляется не только в форме линейной зависимости АТР-азной активности препарата белка от количества образовавшихся комплексов, угловой коэффициент которой определяется, по-видимому, структурой субстрат-связывающего домена и поэтому различается для HSP70aib и HSP70hyb- Субстратные предпочтения пептид-связывающего домена определяются, по-видимому, структурой АТР-азного, следствием чего является сходство параметров аффинности исследованных пептидов к HSP70aib и HSP70hyb

Проведенные в работе исследования позволили определить оптимальные значения рН среды, температуры и концентрации ADP для получения комплексов пептидов с HSP70 in vitro. Совместное использование HSP70hyb и HSC70 дает дополнительную возможность расширить спектр захватываемых пептидов. Благодаря одинаковому коэффициенту зависимости АТР-азной активности от количества комплексов в препарате этих белков, получаемый композитный препарат возможно стандартизовать по значению АТР-азной активности, характеризующему содержание комплексов с пептидами.

Следует отметить, что предложенная методика не требовательна к техническому оснащению и необходимые для получения вакцины процедуры могут быть выполнены практически в любом лечебно-профилактическом учреждении, плоть до районной поликлиники, где есть собственная биохимическая лаборатория и хирургический кабинет. Введение же вакцины осуществляется путем подкожной инъекции, а данная манипуляция является рутинной для медицинского персонала среднего звена. Таким образом, введение в практику предлагаемых разработок будет способствовать улучшению качества и повышению количества медицинских услуг, оказываемых населению в области онкологии.

Определенный интерес для дальнейшего изучения может представлять поиск наиболее эффективных методов лизирования опухолевых клеток, например с применением протеаз. Проведенные исследования показали, что свойства пептидов эшоированных из комплексов с MHC-I, HSP90 и gp96 несколько отличаются, от свойств свободных опухолевых пептидов. Это дает возможность расширения спектра антигенов, извлекаемых из лизата опухолей, за счет элюции антигенов из комплексов с названными выше белковыми молекулами. Другим направлением оптимизации подхода, основанного на получении индивидуальных вакцин с применением рекомбинантного HSP70 является исследование возможности получения комплексов белков HSP70 с крупными белковыми молекулами, например, при кратковременной денатурации последних. Развитие этого направление позволит более эффективно преодолевать МНС-рестрикцию, однако, возможно, крупные белковые агрегаты будут индуцировать продукцию антител, которые в свою очередь, снизят их эффективность.

Полученные нами результаты дают также возможность несколько дополнить представления о работе шаперонной системы HSP70 in vivo, не смотря на то, что в клетке на нее действует множество дополнительных факторов по сравнению с изученными в данной работе. Нам удалось показать, что HSP70 обладает способностью связываться с более широким спектром пептидов, чем удается элюировать из комплексов, образовавшихся с HSP70 in vivo. Простота процедуры элюции эндогенных пептидов из комплексов с HSP70 обеспечивает уверенность в том, что узкий спектр свойств элюировапных пептидов не обусловлен потерями на разных этапах выделения и очистки. Таким образом, на субстратные предпочтения HSP70 оказывают влияние не только ко-шапероны, способные модулировать пептид-связывающую активность, но и другие внутриклеточные факторы, среди которых особое значение имеет концентрация ADP. Развитие гипоэпергетических состояний, характеризующихся низкой концентрацией АТР и высокой ADP, вследствие стрессовых воздействий приводит к преимущественному связыванию белков семейства HSP70 с высокоаффинными пептидами.

Резкое изменение кинетических характеристик HSP70hyb и практически полная потеря способности HSC70hyb связываться с пептидами позволяют судить о причинах высокой гомологии белков семейства HSP70 у людей, проживающих в разных регионах и относящихся к различным этническим группам, а также об их высокой эволюционной консервативности.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Черников, Владимир Александрович, Москва

1. Варфоломеев С.Д., Гуревич К.Г. Биокинетика: Практический курс. М.: ФАИР1. ПРЕСС, 1999-720с.

2. Крыштановский А.О. Ограничения метода регрессионного анализа. Социология:4М. 2000. № 12. С. 96-112.

3. Мейл Д., Бростофф Дж., Рот Д.Б., Ройт А.Иммунология/ пер. с англ. —

4. М.:Логосфера, 2007. 568 с.

5. Adachi Н, Tsujimoto М. Endothelial scavenger receptors. Prog Lipid Res. 20061. Sep;45(5):379-404.

6. Alexander M., Salgaller M.L., Celis E., Sette A., Barnes W.A., Rosenberg S.A., Steller

7. M.A. Generation of tumor-specific cytolytic T lymphocytes from peripheral blood of cervical cancer patients by in vitro stimulation with a synthetic human papillomavirus type 16 E7 epitope. Am J Obstet Gynecol. 1996 Dec;175(6):1586-93.

8. Anderson, S. L., Shen, Т., Lou, J., Xing, L., Blachere, N. E., Srivastava, P. K., Rubin,

9. B. Y. The endoplasmic reticular heat shock protein gp96 is transcriptionally upregulated in interferon-treated cells. J. Exp. Med. (1994)180: 1565-1569.

10. Asea A., Rehli M., Kabingu E., Boch J.A., Bare O., Auron P.E., Stevenson M.A.,

11. Caldervvood S.K. Novel signal transduction pathway utilized by extracellular HSP70: role of toll-like receptor (TLR) 2 and TLR4. J Biol Chem, 2002, 277(17), 1502815034.

12. Arnaiz B, Madrigal-Estebas L, Todryk S, James TC, Doherty DG, Bond U. A novelmethod to identify and characterise peptide mimotopes of heat shock protein 70-associated antigens.//.! Immune Based Ther Vaccines. 2006. - V. 4. - P. 2-14.

13. Baez-Astiia A., Herraez-Hernandez E., Garbi N., Pasolli H.A., Juarez V., Zur Hausen

14. H., Cid-Arregui A. Low-dose adenovirus vaccine encoding chimeric hepatitis В virus surface antigen-human papillomavirus type 16 E7 proteins induces enhanced E7-specific antibody and cytotoxic T-cell responses. J Virol. 2005 0ct;79(20):12807-17.

15. Banecki В., Zylicz M. Real time kinetics of the DnaK/DnaJ/GrpE molecular chaperonemachine action // J. Biol Chem. 1996. - Vol. 271. - P. 6137-6143.

16. Basu S., Binder R.J., Ramalingam Т., Srivastava P.K. CD91 is a common receptor forheat shock proteins gp96, hsp90, hsp70, and calreticulin // Immunity. 2001. - Vol. 14(3).-P. 303-313.

17. Bccker T, Hartl F.U, Wieland F. CD40, an extracellular receptor for binding and uptakeof Hsp70-peptide complexes. J Cell Biol. 2002 Sep 30;158(7):1277-85.

18. Bendz H., Ruhland S.C., Pandya M.J, Hainzl O., Riegelsberger S., Braiichlc C.,

19. Mayer M.P., Buchner J., Issels R.D., Noessner E. Human heat shock protein 70 enhances tumor antigen presentation through complex formation and intracellular antigen delivery without innate immune signaling. J Biol Chem. 2007 Oct 26;282(43):31688-702.

20. Blake, M. J., Udelsman, R., Feulner, G. J., Norton, D.D., Holbrook, N. J.: Stressinduced heat shock protein 70 expression in adrenal cortex: an adrenocorticotropic hormone-sensitive, age-dependent response. Proc Natl Acad Sci USA (1991) 88, 9873-9877

21. Brabletz Т., Jung A., Spaderna S., Hlubek F., Kirchner T. Opinion: migrating cancerstem cells an integrated concept of malignant tumour progression. Nat Rev Cancer. 2005 Sep;5(9):744-9.

22. Bredenbeck A, Losch FO, Sharav T, Eichler-Mertens M, Filter M, Givehchi A, Sterry

23. W, Wrede P, Walden P. Identification of noncanonical melanoma-associated T cell epitopes for cancer immunotherapy. J Immunol. 2005 Jun 1;174(11):6716-24.

24. Breloer M., Marti Т., Fleischer В., von Bonin A. Isolation of processed, H-2Kb-bindingovalbumin-derived peptides associated with the stress proteins HSP70 and gp96 // Eur. J. Immunol.- 1998. Vol. 28. - P. 1016- 1021.

25. Brocchieri L., Conway de Macario E., Macario A.J. hsp70 genes in the human genome:

26. Conservation and differentiation patterns predict a wide array of overlapping and specialized functions // BMC Evol. Biol. 2008. - P. 8-19.

27. Broquet, A. H., Thomas, G., Masliah, J., Trugnan, G., Bachelet, M. Expression of themolecular chaperone Hsp70 in detergent-resistant microdomains correlates with its membrane delivery and release. J Biol Chem (2003) 278, 21601-21606

28. Bryant P., Ploegh H. Class II MHC peptide loading by the professionals. Curr Opin1.munol. 2004 Feb;16(l):96-102.

29. Buchberger A., Theyssen H., Schroder H., McCarty J.S., Virgallita G., Milkereit P.,

30. Reinstein J., Bukau B. Nucleotide-induced conformational changes in the ATPase and substrate binding domains of the DnaK chaperoneprovide evidence for interdomain communication//J. Biol. Chem. 1995. - Vol. 270. -P. 16903-16910.

31. Buczynski.G., Slepenkov S.V., Sehorn M.G. and Witt S.N. Characterization of a Lidless

32. Form of the Molecular Chaperone DnaK. // J. Biol. Chem. 2001. - Vol. 276 (29). - P. 27231-27236

33. Burch P.A., Croghan G.A., Gastineau D.A., Jones L.A., Kaur J.S., Kylstra J.W.,

34. Richardson R.L., Valone F.H., Vuk-Pavlovic S. Immunotherapy (APC8015,

35. Provenge) targeting prostatic acid phosphatase can induce durable remission of metastatic androgen-independent prostate cancer: a Phase 2 trial. Prostate. 2004 Aug 1;60(3): 197-204.

36. Caldcrwood S.K., Mambula S.S,. Gray P.J. Jr. Extracellular heat shock proteins in cellsignaling and immunity. Ann N Y Acad Sci. 2007 Oct;l 113:28-39.

37. Callahan M.K., Chaillot D., Jacquin C., Clark P.R. and Menoret A. Differential

38. Acquisition of Antigenic Peptides by Hsp70 and Hsc70 under Oxidative Conditions // J. Biol. Chem.- 2002. Vol. 277 (37). - P. 33604-33609.

39. Carlos C.A, Dong H.F., Howard O.M., Oppenheim J.J., Hanisch F.G., Finn O.J.

40. Human tumor antigen MUC1 is chemotactic for immature dendritic cells and elicits maturation but does not promote Thl type immunity. J Immunol. 2005 Aug l;175(3):1628-35.

41. Carter P.J. Potent antibody therapeutics by design. Nat Rev Immunol. 20061. May;6(5):343-57.

42. Ccgielska A., Georgopoulos C. Functional Domains of the Escherichia coli dnaK Heat

43. Shock Protein as Revealed by Mutational Analysis // J. Biol. Chem. 1989. - Vol. 264(35).- P. 21122-21130.

44. Chakroborty N.G., Stevens R.L., Mehrotra S. et al. Recognition of PSA-derived peptideantigens by T cells from prostate cancer patients without any prior stimulation. //Cancer Immuno.Immunother. 2003. - V.52. - P.497-505

45. Chan K., Delfert D., Junger K. A direct colorimetric assay for Ca2+-stimulated ATPaseactivity. Analitical Biochemistry 157, 375-380, 1986.

46. Chang M.H., Chen C.J., Lai M.S., Hsu H.M., Wu T.C., Kong M.S., Liang D.C., Shau

47. W.Y., Chen D.S. Universal hepatitis В vaccination in Taiwan and the incidence of hepatocellular carcinoma in children. Taiwan Childhood Hepatoma Study Group. N Engl J Med. 1997 Jun 26;336(26): 1855-9.

48. Chomczynski P., Sacchi N. Single-step method of RNA isolashion by acid guanidiniumthiocyanate-phenol-chloroform extraction. Anal Biochem 1987,162, 156-159.

49. Delneste Y, Magistrelli G, Gaiichat J, Haeuvv J, Aubry J, Nakamura K, Kawakami

50. Honda N, Goetsch L, Sawamura T, Bonnefoy J, Jeannin P. Involvement of LOX-1 in dendritic cell-mediated antigen cross-presentation. Immunity 17: 353-362.

51. Denisenko O.N., Yarchuk O.B. Regulation of LacZ mRNA translatability in a cell-freesystem at heat shock by the last four sense codons // FEBS Lett. 1989. - Vol. 247 (2). -P. 251-254.

52. Denzer, K., Kleijmeer, M. J., Heijnen, H. F., Stoorvogel, W., Geuze, H. J.: Exosome:from internal vesicle of the multivesicular body to intercellular signaling device. J Cell Sci 113 Pt 19 (2000), 3365-3374

53. Dunn G.P, Bruce A.T, Ikeda H., Old L.J., Schreiber R.D. Cancer immunoediting: fromimmunosurveillance to tumor escape. Nat Immunol. 2002 Nov;3(l l):991-8.

54. Dunn G.P., Old L.J., Schreiber R.D. The immunobiology of cancer immunosurveillanceand immunoediting. Immunity. 2004 Aug;21(2): 137-48.

55. Eberlein T.J., Rosenstein M., Rosenberg S.A. Regression of a disseminated syngeneicsolid tumor by systemic transfer of lymphoid cells expanded in interleukin 2. J Exp Med. 1982 Aug 1;156(2):3 85-97.

56. Edwards D.P., Estes P.A., Fadok V.A., Bona B.J., Onate S., Nordeen S.K., Welch W.J.

57. Heat shock alters the composition of heteromeric steroid receptor complexes and enhances receptor activity in vivo // Biochemistry. 1992. - Vol. 31. - P. 2482-2491.

58. Ellis R.J. The molecular chaperone concept // Semin. Cell Biol. 1990. - Vol. 1. - P. 1-9.

59. Fan H., Kashi R.S., Middaugh C.R. Conformational lability of two molecular chaperones

60. Hsc70 and gp96: cffects of pH and temperature. Arch Biochem Biophys. 2006 Mar l;447(l):34-45.

61. Figlin R.A., Thompson J.A., Bukowski R.M., Vogelzang N.J., Novick A.C., Lange P.,

62. Steinberg G.D., Belldegrun A.S. Multicenter, randomized, phase III trial of CD8(+) tumor-infiltrating lymphocytes in combination with recombinant interleukin-2 in metastatic renal cell carcinoma. J Clin Oncol. 1999 Aug;17(8):2521-9.

63. Flaherty K.M., DeLuca-Flaherty C., McKay D.B. Three-dimensional structure of the

64. ATPase fragment of a 70K heat-shock cognate protein // Nature. 1990. — Vol. 346(6285). - P. 623-628.

65. Flynn G.C., Chappell T.G., Rothman J.E. Peptide Binding and Release by Proteins1.plicated as Catalysts of Protein Assembly // Science. 1989. - Vol. 245 (4916). - P. 385-390.

66. Fourie A.M., Sambrook J.F., and Gething M.J. Common and Divergent Peptide Binding

67. Specificities of hsp70 Molecular Chaperones // J. Biol. Chem. 1994. - Vol. 269 (48). - P. 30470-30478.

68. Freitag, D. G., Ouimet, P. M., Girvitz, T. L. and Kapoor, M. Heat shock protein 80 of

69. Neurospora crassa, a cytosolic molecular chaperone of the eukaryotic stress 90 family, interacts directly with heat shock protein 70. (1997) Biochemistry 36: 10221-10229.

70. Gao В., Eisenberg E., Greene L. Interaction of Nucleotide-Free Hsc70 with Clathrin and

71. Peptide and Effect of ATP Analogues // Biochemistry. 1995. - Vol. 34. - P. 1188211888.

72. Gastpar R, Gross C, Rossbacher L, Ellwart J, Riegger J, Multhoff G. The cell surfacelocalized heat shock protein 70 epitope TKD induces migration and cytolytic activity selectively in human NK cells. J Immunol. 2004 Jan 15;172(2):972-80.

73. Gattinoni L., Powell D.J. Jr., Rosenberg S.A., Restifo N.P. Adoptive immunotherapy forcancer: building on success. Nat Rev Immunol. 2006 May;6(5):383-93.

74. Geladopoulos T.P., Sotiroudis T.G., Evangelopoulos A.E. A malachite greencolorimetric assay for protein phosphatase activity. Anal Biochem 1991, 192(1), 112116.

75. Gogvadze V, Orrenius S. Mitochondrial regulation of apoptotic cell death. Chem Biol1.teract 2006;163:4-14.

76. Gragerov A., Gottesman M.E. Different peptide binding specificities of hsp70 familymembers // J. Mo.l Biol. 1994. - Vol. 241(2). - P. 133-135.

77. Gragerov A., Zeng L., Zhao X., Burkholder W., and Gottesman M.E. Specificity of

78. DnaK-peptide binding // J. Mol. Biol. 1994. - Vol. 235 - P. 848-854.

79. Graziano D.F, Finn O.J. Tumor antigens and tumor antigen discovery. Cancer Treat Res.2005; 123:89-111.

80. Greenberg M.A., Fefer P.D. Specificity of adoptive chemoimmunotherapy of establishedsyngeneic tumors. Cheever J Immunol. 1980 Aug;125(2):711-4.

81. Grossmann ME, Madden BJ, Gao F, Pang YP, Carpenter JE, McCormick D, Young

82. CY. Proteomics shows Hsp70 does not bind peptide sequences indiscriminately in vivo.// Exp Cell Res. 2004. - V. 297(1). - P. 108-117.

83. Guerrero C.A., Bouyssounade D., Zarate S., Isa P., Lopez Т., Espinosa R., Romero P.,

84. Mendez E., Lopez S., Arias C.F. Heat shock cognate protein 70 is involved in rotavirus cell entry. J Virol, 2002, 76(8), 4096-4102.

85. Guidon P.T., Hightower L.E. Purification and initial characterization of the 71-kilodaltonrat heat-shock protein and its cognate as fatty acid binding proteins // Biochemistry. -1986.-Vol. 25.-P. 3231-3239.

86. Guzhova I., Kislyakova K., Moskaliova O., Fridlanskaya I., Ту tell M., Cheetham M.,

87. Margulis В.: In vitro studies show that Hsp70 can be released by glia and that exogenous Hsp70 can enhance neuronal stress tolerance. Brain Res (2001) 914, 66-73

88. Ha J-H., Hellman U., Johnson E.R., Li L., McKay D.B., Sousa M.C., Takedai S.,

89. Wernstedt C. and Wilbanks S.M. Destabilization of Peptide Binding and Interdomain Communication by an E543K Mutation in the Bovine 70-kDa Heat Shock Cognate Protein, a Molecular Chaperone // J. Biol. Chem. 1997. - Vol. 272 (44). - P. 2779627803.

90. Haanen J.B., Baars A., Gomez R., Weder P., Smits M., de GruijI T.D., von Blomberg

91. B.M., Bloemena E., Scheper R.J., van Ham S.M., Pinedo H.M., van den Eertwegh

92. A.J. Melanoma-specific tumor-infiltrating lymphocytes but not circulating melanoma-specific T cells may predict survival in resected advanced-stage melanoma patients. Cancer Immunol Immunother. 2006 Apr;55(4):451-8

93. Hartl F.U. Molecular chaperones in cellular protein folding // Nature. 1996. - Vol. 381.-P. 571-579.

94. Haug M, Dannecker L, Schepp CP, Kwok WW, Wernet D, Buckner JH, Kalbacher

95. H, Dannecker GE, Holzer U. The heat shock protein Hsp70 enhances antigen-specific proliferation of human CD4+ memory T cells. Eur J Immunol. 2005 Nov;35(l l):3163-72

96. Hersey P., Coates A.S., McCarthy W.H., Adjuvant immunotherapy of patients with highrisk melanoma using vaccinia viral lysates of melanoma: results of a randomized trial, J Clin Oncol 20 (2002):4181-4190.

97. Hightower, L. E., Guidon, P. Т., Jr.: Selective release from cultured mammalian cells ofheat-shock (stress) proteins that resemble glia-axon transfer proteins. J Cell Physiol 138 (1989), 257-266

98. Hishiya A., Takayama S. Molecular chaperones as regulators of cell death. Oncogene.2008 Oct 27;27(50):6489-506.

99. Houghton J. Morozov A., Smirnova I., Wang T.C. Stem cells and cancer. Semin Cancer

100. Biol. 2007 Jun; 17(3):191-203.

101. Ни В., Tomita М. The Hsp70 chaperone system maintains high concentrations of activeproteins and suppresses ATP consumption during heat shock. Syst Synth Biol. 2007 Mar;l(l):47-58.

102. Huang J., Klionsky D.J. Autophagy and human disease. Cell Cycle. 2007 Augl;6(15):1837-49.

103. Huang Q.Q., Sobkoviak R., Jockheck-Clark A.R., Shi В., Mandelin A.M. 2nd, Так

104. P.P., Haines G.K. 3rd, Nicchitta C.V., Pope R.M. Heat shock protein 96 is elevated in rheumatoid arthritis and activates macrophages primarily via TLR2 signaling. J Immunol. 2009 Apr 15;182(8):4965-73.

105. Hunt C., Morimoto R.I. Conserved features of eukariotic hsp70 genes revealed bycomparison with the nucleotide sequence of human hsp70. Proc Natl Acad Sci USA, 1985, 82(19), 6455-6459.

106. Hunter-Lavin, C., Davies, E. L., Bacelar, M. M., Marshall, M. J., Andrew, S. M.,

107. Williams, J. H.: Hsp70 release from peripheral blood mononuclear cells. Biochem Biophys Res Commun 324 (2004), 511-517

108. Ishii Т., Udono H., Yamano Т., Ohta H., Uenaka A., Ono T.,. Hizuta A, Tanaka N.,

109. Srivastava P.K., Nakayama E. Isolation of MHC class I-restricted tumor antigen peptide and its precursors associated with heat shock proteins Hsp70, hsp90, and gp96 // J. Immunol. 1999. -Vol. 162. - P. 1303- 1309.

110. Italiano A. Targeting the epidermal growth factor receptor in colorectal cancer: advancesand controversies. Oncology. 2006;70(3): 161-7.

111. Iwamoto M., Shinohara H., Miyamoto A., Okuzawa M., Mabuchi H., Nohara Т., Gon

112. G., Toyoda M., Tanigawa N. Prognostic value of tumor-infiltrating dendritic cells expressing CD83 in human breast carcinomas. Int J Cancer. 2003 Mar 10;104(l):92-7.

113. Jain R.K., Duda D.G., Clark J.W., Loeffler J.S. Lessons from phase III clinical trials onanti-VEGF therapy for cancer. Nat Clin Pract Oncol. 2006 Jan;3(l):24-40.

114. Janssen E.M., Lemmens E.E., Wolfe Т., Christen U., von Herrath M.G.,

115. Schoenberger S.P. CD4+ T cells are required for secondary expansion and memory in CD8+ T lymphocytes. Nature. 2003 Feb 20;421(6925):852-6.

116. Javid В., MacAry P.A., Oehlmann W., Singh M., Lehner P.J. Peptides complexed withthe protein HSP70 generate efficient human cytolytic T-lymphocyte responses // Biochem. Soc. Trans. 2004. - Vol. 32(4). - P. 622-625.

117. Jensen P.E. Recent advances in antigen processing and presentation. Nat Immunol. 20071. Oct;8(10):1041-8.

118. Jindal S., Murrey P., Rosenberg S., Young R.A., Williams K.P. Human stress proteinhsp70: overexpression in E.coli, purification and characterization. Biotechnology, 1995, 13, 1105-1109.

119. Karwacz K., Mukherjee S., Apolonia L., Blundell M.P., Bouma G., Escors D., Collins

120. M.K., Thrasher A.J. Nonintegrating lentivector vaccines stimulate prolonged T-cell and antibody responses and are effective in tumor therapy. J Virol. 2009 Apr;83(7):3094-103.

121. Kim R., Emi M., Tanabe K., Arihiro K. Tumor-driven evolution of immunosuppressivenetworks during malignant progression. Cancer Res. 2006 Jun 1;66(11):5527-36.

122. Kim S.Y., Sharma S., Hoskins J.R., Wickner S. Interaction of the DnaK and DnaJchaperone system with a native substrate, PI RepA. J Biol Chem. 2002 Nov 22;277(47):44778-83.

123. Klein G., Sjogren H.O., Klein E., Hellstrom K.E.Demonstration of resistance againstmethylcholanthrene-induced sarcomas in the primary autochthonous host., Cancer Res. 1960 Dec; 20:1561-72.

124. Koelle D.M, Magaret A, McClurkan C.L, Remington M.L, Warren T, Teofilovici F,

125. Kregel, Kevin C.: Molecular Biology of Thermoregulation: Invited Review: Heat shockproteins: modifying factors in physiological stress responses and acquired thermotolerance. JAppl Physiol (2002) 92, 2177-2186

126. Kumar S., Deepak P., Acharya A. Hsp70 induces Thl polarization through tumorassociated macrophages in a T-cell lymphoma. Neoplasma. 2007;54(2): 113-22.

127. Kyte J.A., Mu L., Aamdal S., Kvalheim G., Ducland S., Hauser M., Gullcstad H.P.,

128. Ryder Т., Lislerud K., Hammerstad H., Gaudernack G. Phase I/II trial of melanoma therapy with dendritic cells transfected with autologous tumor-mRNA. Cancer Gene Ther. 2006 0ct;13(10):905-18.

129. Laemmly U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head ofbacteriophge T4. Nature 1970, 227, 680-685.

130. Lammert, E., Arnold, D., Nijenhuis, M., Momburg, F., Hammerling, G. J., Brunner,

131. J., Stevanovic, S., Rammensee, H. G. and Schild, H. The endoplasmic reticulum-resident stress protein gp96 binds peptides translocated by TAP. (1997) Eur. J. Immunol. 27: 923-927.

132. Leist M, Jaattela M. Four deaths and a funeral: from caspases to alternative mechanisms.

133. Nat Rev Mol Cell Biol 2001;2:589-98

134. Leung S.-M., Hightower L.E. Mammalian Hsc70 and Hsp70 proteins. In: Guidebook to

135. Molecular Chaperones and Protein Folding Catalysts. Gething M.-J. (ed.) Oxford University Press, Sambrook & Tooze Imprint, Oxford. 1997. - P. 52-58.

136. Levene A.P., Singh G., Palmieri C. Therapeutic monoclonal antibodies in oncology. J R

137. Soc Med. 2005 Apr;98(4): 146-52.

138. Levine В., Deretic V. Unveiling the roles of autophagy in innate and adaptive immunity.

139. Nat Rev Immunol. 2007 Oct;7(10):767-77.

140. Lewis, M. J., Turco, S. J., Green, M. Structure and assembly of the endoplasmicreticulum. Biosynthetic sorting of endoplasmic reticulum proteins. J. Biol. Chem. (1985) 260:6926-6931.

141. Li L., Neaves W.B. Normal stem cells and cancer stem cells: the niche matters. Cancer

142. Res. 2006 May l;66(9):4553-7.

143. Livingston P.O., Wong G.Y.C., Adluri S. Improved survival in stage III melanomapatients with GM2 antibodies: a randomized trial of adjuvant vaccination with GM2 ganglioside, J Clin Oncol 12 (1994):1036-1044.

144. Liyanage U.K., Moore T.T., Joo H.G., Tanaka Y., Herrmann V., Doherty G., Drebin

145. J.A., Strasberg S.M., Eberlein T.J., Goedegebuure P.S., Linehan D.C. Prevalence of regulatory T cells is increased in peripheral blood and tumor microenvironment of patients with pancreas or breast adenocarcinoma. J Immunol. 2002 Sep 1;169(5):2756-61.

146. Lodge P.A., Jones L.A., Bader R.A., Murphy G.P., Salgaller M.L. Dendritic cell-basedimmunotherapy of prostate cancer: immune monitoring of a phase II clinical trial. Cancer Res. 2000 Feb 15;60(4):829-33.

147. Lu Y, Hu Q, Yang C, Gao F. Histidine 89 is an essential residue for Hsp70 in thephosphate transfer reaction. Cell Stress Chaperones. 2006 Summer; 11(2): 148-53.

148. Luo W., Rodina A., Chiosis G. Heat shock protein 90: translation from cancer to

149. Alzheimer's disease treatment? BMC Neurosci. 2008 Dec 3;9 Suppl 2:S7.

150. Macejak D., Rayfield M., Luftig R. Isolation and characterization of human HSP70expressed in Echerichia coli. Arch Biochem Biophys, 1990, 280(1), 55- 60.108109110111.112.113114115116,117.118119.120,121.

151. Mach H., Middaugh C.R. Simultaneous monitoring of the environment of tryptophan, tyrosine, and phenylalanine residues in proteins by near-ultraviolet second-derivative spectroscopy. Anal Biochem. 1994 Nov 1;222(2):323-31.

152. Malmberg K.J. Effective immunotherapy against cancer: a question of overcoming immune suppression and immune escape? Cancer Immunol Immunother. 2004 C)ct;53(10):879-92.

153. Marini, M., Frabetti, F., Musiani, D., Franceschi, C.: Oxygen radicals induce stress proteins and tolerance to oxidative stress in human lymphocytes. Int JRadiat Biol (1996) 70, 337-350

154. Matz, J. M., LaVoi, K. P., Blake, M. J.: Adrenergic regulation of the heat shock response in brown adipose tissue. J Pharmacol Exp Ther (1996) 277, 1751-1758

155. Mao Y., Deng A., Qu N., Wu X. ATPase domain of Hsp70 exhibits intrinsic ATP-ADP ' exchange activity. Biochemistry (Mosc). 2006 Nov;71(l 1): 1222-9.

156. Mayer M, Reinstein J, Buchner J. Modulation of the ATPase cycle of BiP by peptides and proteins. J Mol Biol. 2003 Jun 27;330(1): 137-44.

157. Mazzarella, R. A., Green, M. ERp99, an abundant, conserved glycoprotein of theendoplasmic reticulum, is homologous to the 90 kDa heat shock protein (hsp90) and the 94-kDa glucose regulated protein (grp94). J. Biol. Chem. (1987) 262: 8875-8883.

158. McCarty J.S., Buchberger A., Reinstein J., Bukau B. The role of ATP in the functional cycle of the DnaK chaperone system // J. Mol. Biol. 1995. - Vol. 249. -P. 126-137.

159. Mehlen P., Puisieux A. Metastasis: a question of life or death. Nat Rev Cancer. 2006 Jun;6(6):449-58.

160. Melief C.J. Cancer immunotherapy by dendritic cells. Immunity. 2008 Sep;29(3):372-83.

161. Mitchell M.S., Von Eschen K.B., Phase III trial of Melacine melanoma theraccine versus combination chemotherapy in the treatment of stage IV melanoma, Proc Am Soc Clin Oncol 16 (1997), p. 494

162. Minami, Y., Kawasaki, H., Suzuki, K. and Yahara, I. The calmodulin-binding domain of the mouse 90-kDa heat shock protein. (1993) J. Biol. Chem. 268: 9604-9610.

163. Morath C., Mueller M., Goldschmidt H., Schwenger V., Opelz G., Zeier M. Malignancy in renal transplantation. J Am Soc Nephrol. 2004 Jun; 15(6): 1582-8.

164. Moroi Y., Mayhew M., Trcka J., Hoe M. H., Takechi Y., Hartl F. U., Rothman J. E.,

165. Houghton A. N. Induction of cellular immunity by immunization with novel hybrid peptides complexed to heat shock protein 70 PNAS, 2000; 97: 3485-90.

166. Morshauser R.C., Wang H., Flynn G.C., Zuidervveg E.R. The peptide-binding domainof the chaperone protein Hsc70 has an unusual secondary structure topology // Biochemistry. 1995. - Vol. 34(19). - P. 6261-6266.

167. Nicland T.J., Tan M.C., Monne-van Muijen M., Koning F., Kruisbeek A.M., van

168. Bleek G.M. Isolation of an immunodominant viral peptide that is endogenously bound to the stress protein GP96/GRP94 // Proc Natl Acad Sci USA.- 1996. Vol. 93 (12). -P. 6135-6139.

169. Nickel W. Unconventional secretory routes: direct protein export across the plasmamembrane of mammalian cells. Traffic (2005) 6, 607-614

170. Ohno M., Kitabatake N., Tani F. Role of the C-terminal region of mouse inducible

171. Hsp72 in the recognition of peptide substrate for chaperone activity // FEBS Letters. — 2004.-Vol. 576.-P. 381-386.

172. Okudo H., Kato H., Arakaki Y., Urade R. Cooperation of ER-60 and BiP in theoxidative refolding of denatured proteins in vitro. JBiochem, 2005,138(6), 773-780.

173. Palleros D.R., Shi L., Reid K.L., Fink A.L. Hsp70-protein complexes. Complex stabilityand conformation of bound substrate protein // J. Biol. Chem. 1994. - Vol. 269. - P. 13107-13114.

174. Parmiani G, De Filippo A, Novellino L, Castelli C. Unique human tumor antigens:immunobiology and use in clinical trials. J Immunol 2007; 178: 1975-9.

175. Pavlenko M., Roos A.K., Lundqvist A., Palmborg A., Miller A.M., Ozenci V.,

176. Peng M, Chen M, Ling N, Xu H, Qing Y, Ren H. Novel vaccines for the treatment ofchronic HBV infection based on mycobacterial heat shock protein 70.Vaccine. 2006 Feb 13;24(7):887-96.

177. Peng P., Menoret A., Srivastava P.K. Purification of immunogenic heat shock protein70.peptide complexes by ADP-affinity chromatography // J. Immunol. Methods. — 1997.-Vol. 204.-P. 13-21.

178. Pierpaoli E.V., Sandmeier E., Baici A., Schonfeld H.J., Gisler S., Christen P. Thepower stroke of the DnaK/DnaJ/GrpE molecular chaperone system // J. Mo.l Biol. -1997. Vol. 269. - P. 757-768.

179. Pockley A.G. Heat shock proteins as regulators of the immune response. Lancet. 2003 Aug9;362(9382):469-76.

180. Cancer Immunetherapy: Immune suppression and tumor growth. Edited by Prendergast

181. G.C., Jaffee E.M., 2007, Acad. Press. London., UK.

182. Qiao Y, Liu B, Li Z. Activation of NK cells by extracellular heat shock protein 70 throughinduction ofNKG2D ligands on dendritic cells. Cancer Immun. 2008 Jul 10;8:12.

183. Qu D., Mazzarella, R. A., Green, M. Analysis of the structure and synthesis of GRP94,an abundant stress protein of the endoplasmic reticulum. DNA Cell Biol. (1994)13: 117-124.

184. Quinones Q.J., de Ridder G.G., Pizzo S.V. GRP78: a chaperone with diverse rolesbeyond the endoplasmic reticulum. Histol Histopathol. 2008 Nov;23(l 1):1409-16.

185. Robert J., Cohen N., Maniero G.D., Goyos A., Morales H., Gantress J. Evolution of theimmunomodulatory role of the heat shock protein gp96. Cell Mol Biol (Noisy-le-grand). 2003 Mar;49(2):263-75.

186. Rodriguez R., Rubio R., Masip M., Catalina P., Nieto A., de la Cueva Т., Arriero M.,

187. San Martin N., de la Cueva E., Balomenos D., Menendez P., Garcfa-Castro. Loss of p53 induces tumorigenesis in p21 -deficient mesenchymal stem cells J. Neoplasia. 2009 Apr;l l(4):397-407.

188. Roman L.D., Wilczynski S., Muderspach L.I., Burnett A.F., O'Meara A., Brinkman

189. J.A., Kast W.M., Facio G., Felix J.C., Aldana M, Weber J.S. A phase II study of Hsp-7 (SGN-00101) in women with high-grade cervical intraepithelial neoplasia. Gynecol Oncol. 2007 Sep;106(3):558-66.

190. Rosenberg S.A., Yang J.C., Restifo N.P, Cancer immunotherapy: moving beyond currentvaccines. Nat Med. 2004 Sep;10(9):909-15.

191. Rosenthal R., Viehl C.T., GuIIer U., Weber W.P., Adamina M., Spagnoli G.C.,

192. Heberer M., Zuber M. Active specific immunotherapy phase III trials for malignant melanoma: systematic analysis and critical appraisal. J Am Coll Surg. 2008 Jul;207(l):95-105.

193. Rudiger S., Germeroth L., Schneider-Mergener J., Bukau B. Substrate specificity ofthe DnaK chaperone determined by screening cellulose-bound peptide libraries // EMBOJ.- 1997.-Vol. 16 (7).-P. 1501-1507.

194. Rudiger S., Mayer M.P., Schneider-Mergener J. and Bukau B. Modulation of Substrate

195. Specificity of the DnaK Chaperone by Alteration of a Hydrophobic Arch // J. Mol. Biol. 2000. - Vol. 304. - P. 245-251.

196. Russell R., Wali Karzai A., Mehl A.F, McMacken R. DnaJ dramatically stimulates ATPhydrolysis by DnaK: insight into targeting of Hsp70 proteins to polypeptide substrates. Biochemistry. 1999 Mar 30;38(13):4165-76.

197. Savina, A., Furlan, M., Vidal, M., Colombo, M. I.: Exosome release is regulated by acalcium-dependent mechanism in K562 cells. J Biol Chem 278 (2003), 20083-20090

198. Savina A., Amigorena S. Phagocytosis and antigen presentation in dendritic cells.1.munol Rev. 2007 Oct;219:143-56.

199. Schadendorf D., Ugurel S., Sehuler-Thurner B. DC study group of the DeCOG

200. Dacarbazin (DTIC) versus vaccination with autologous peptide-pulsed dendritic cells (DC) in first-line treatment of patients with metastatic melanoma: a randomized phase III trial of the DC study group of the DeCOG, Ann Oncol 17 (2006):563-570.

201. Schmid D., Mtinz C. Innate and adaptive immunity through autophagy. Immunity. 20071. Jul;27(l): 11-21.

202. Schmielau J., Nalesnik M.A., Finn O.J. Suppressed T-cell receptor zeta chain expressionand cytokine production in pancreatic cancer patients. Clin Cancer Res. 2001

203. Shi Y., Thomas J. The transport of proteins into the nucleus requires the 70-kilodaltonheat shock protein or its cytosolic cognate // Mol. Cell Biol. 1992. - Vol. 12. - P. 2186-2192.

204. Slepenkov S.V. and Witt S.N. Peptide-Induced Conformational Changes in the Molecular

205. Chaperone DnaK // Biochemistry. 1998. - Vol. 37. - P. 16749-16756.

206. Smith D.F., Toft D.O. Steroid receptors and their associated proteins // Mol. Endocrinol.1993.-Vol. 7.-P. Ml.

207. Sonna L.A., Fujita J., Gaffin S.L., Lilly C.M. Effects of heat and cold stress onmammalian gene expression. JAppl Physiol, 2002, 92, 1725-1742.

208. Srivastava, P. К., DeLeo, А. В., Old, L. J. Tumor rejection antigens of chemicallyinduced tumors of inbred mice. Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1986) 83: 3407-3411.

209. Srivastava P.K. Purification of heat shock protein-peptidc complexes for use invaccination against cancers and intracellular pathogens. Methods. 1997 Jun; 12(2): 16571. Review.

210. Srivastava P.K, Menoret A., Basu S., Binder R.J., McQuade K.L. Heat shock proteinscome of age: primitive functions acquire new roles in an adaptive world. Immunity. 1998 Jun;8(6):657-65.

211. Stevens S.Y., Cai S., Pellecchia M. and Zuiderweg E.R. The solution structure of thebacterial HSP70 chaperone protein domain DnaK(393-507) in complex with the peptide NRLLLTG // Protein Sci. 2003. - Vol.12. - P. 2588-2596.

212. Stewart S.A., Poon В., Jowett J.B., Chen I.S. Human immunodeficiency virus type 1 Vprinduces apoptosis following cell cycle arrest // J Virol. 1997. - Vol. 71. - P. 55795592.

213. Su Z., DannuII J., Heiser A., Yancey D., Pruitt S., Madden J., Coleman D.,

214. Niedzwiecki D., Gilboa E., Vieweg J. Immunological and clinical responses in metastatic renal cancer patients vaccinated with tumor RNA-transfected dendritic cells. Cancer Res. 2003 May 1;63(9):2127-33.

215. Sun, L., Chang, J., Kirchhoff, S. R., Knowlton, A. A.:Activation of HSF and selectiveincrease in heat-shock proteins by acute dexamethasone treatment. Am J Physiol Heart Circ.Physiol 2(2000)78, 1091-1097

216. Szabo A., Langer Т., Schroder H., Flanagan J., Bukau В., HartI F.U. The ATPhydrolysis-dependent reaction cycle of the Escherichia coli Hsp70 system DnaK, DnaJ, and GrpE // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1994. - Vol. 91. - P. 10345-10349.

217. Tavaria M., Gabriele Т., Kola I., Anderson R.L. A hitchhiker's guide to the human

218. Hsp70 family // Cell Stress Chaperones. 1996. - Vol. 1. P. 23-28.

219. Takenaka I.M., Leung S.M., McAndrew S.J., Brown J.P., and Hightower L.E. Hsc70binding peptides selected from a phage display peptide library that resemble organellar targeting sequences // J. Biol. Chem. 1995. - Vol. 270. - P. 19839-19844.

220. Theriault J.R., Mambula S.S., Sawamura Т., Stevenson M.A., Calderwood S.K.

221. Extracellular HSP70 binding to surface receptors present on antigen presenting cells and endothelial/epithelial cells. FEBS Lett. 2005 Mar 28;579(9): 1951-60.

222. Thurner B, Roder C, Dieckmann D, Heuer M, Kruse M, Glaser A, Keikavoussi P,

223. Kampgen E, Bender A, Schuler G. Generation of large numbers of fully mature andstsble dendritic cells from leukapheresis products for clinical application. J. Immunol. Meth. 1999. -V.223. - P. 1-15.

224. Tsamandas A.C., Kardamakis D., Tsiamalos P., Liava A., Tzelepi V., Vassiliou V.,

225. Tsai M.Y., Wang C. Uncoupling of peptide-stimulated ATPase and clathrin-uncoatingactivity in deletion mutant of hsc70. J Biol Chem, 1994, 269(8), 5958-5962.

226. Tsan M.F., Gao B. Heat shock protein and innate immunity. Cell Mol Immunol. 20041. Aug;l(4):274-9.

227. Tyagi R.K., Mangal S., Garg N., Sharma P.K. RNA-based immunotherapy of cancer:role and therapeutic implications of dendritic cells. Expert Rev Anticancer Ther. 2009 Jan;9(l):97-114.

228. Udono H., Srivastava P.K. Heat shock protein 70-associated peptides elicit speci.c cancerimmunity // J. Exp. Med. 1993. - Vol. 178. - P. 1391-1396.

229. Udono H., Srivastava P.K. Comparison of tumor-specific immunogenicities of stressinduced proteins gp96, hsp90, and hsp70. J Immunol. 1994 Jun 1;152(11):5398-403.

230. Udelsman, R., Li, D. G., Stagg, C. A., Gordon, С. В., Kvetnansky, R.: Adrenergicregulation of adrenal and aortic heat shock protein. Surgery (1994)116, 177-182

231. Van den Eynde B.J., van der Bruggen P. T cell-defined tumor antigens. Curr Opin1.munol 1997; 9: 684-93.

232. Villegas F.R., Coca S., Villarrubia V.G., Jimenez R., Chillon M.J., Jareno J., Zuil M.,

233. Callol L. Prognostic significance of tumor infiltrating natural killer cells subset CD57 in patients with squamous cell lung cancer. Lung Cancer. 2002 Jan;35(l):23-8.

234. Vos M.J, Hageman J., Carra S., Kampinga H.H. Structural and functional diversitiesbetween members of the human HSPB, HSPH, HSPA, and DNAJ chaperone families. Biochemistry. 2008 Jul 8;47(27):7001-11.

235. Vyas J.M., Van der Veen A.G., Ploegh H.L. The known unknowns of antigen processingand presentation. Nat Rev Immunol. 2008 Aug;8(8):607-18.

236. Wainberg Z., Oliveira M., Lerner S., Tao Y., Brenner B.G. Modulation of stress proteinhsp27 and hsp70) expression in CD4+ lymphocytic cells following acute infection with human immunodeficiency virus type-1 // Virology. 1997. - Vol. 233. - P. 364373.

237. Walsh, R. C., Koukoulas, I., Garnham, A., Moseley, P.L., Hargreaves, M., Febbraio,

238. M, A.: Exercise increases serum Hsp72 in humans. Cell Stress Chaperones (2001) 6, 386-393.

239. Wei J., Gaut J.R. and Hendershot L.M. In Vitro Dissociation of BiP-Peptide Complexes

240. Requires a Conformational Change in BiP after ATP Binding but Does Not Require ATP Hydrolysis // J. Biol. Chem. 1995. - Vol. 270 (44). - P. 26677-26682.

241. Weide В., Garbe C., Rammensee H.G., Pascolo S. Plasmid DNA- and messenger RNAbased anti-cancer vaccination. Immunol Lett. 2008 Jan 15; 115(l):33-42.

242. Wood C, Srivastava P, Bukowski R, Lacombe L, Gorelov AI, Gorelov S, Mulders P,

243. Yanagimoto H., Takai S., Satoi S., Toyokawa H., Takahashi K., Terakawa N., Kwon

244. A.H., Kamiyama Y. Impaired function of circulating dendritic cells in patients with pancreatic cancer. Clin Immunol. 2005 Jan;l 14(l):52-60.

245. Yu M., Finn О.J. DNA vaccines for cancer too. Cancer Immunol Immunother. 20061. Feb;55(2): 119-30.

246. Zitzler S., Hellwig A., Hartl F.U., Wieland F., Diestelkotter-Bachert P. Distinct bindingsites for the ATPase and substrate-binding domain of human Hsp70 on the cell surface of antigen presenting cells. Mol Immunol. 2008 Sep;45(15):3974-83.

247. Zhu X., Zhao X., Burkholder W.F., Gragerov A., Ogata C.M., Gottesman M.E. and

248. Hendrickson W.A. Structural analysis of substrate binding by the molecular chaperone DnaK // Science. 1996. - Vol. 272. P. 1606-1614.

249. Zou W. Immunosuppressive networks in the tumor environment and their therapeuticrelevance. Nat Rev Cancer. 2005 Apr;5(4):263-74.

250. Zuckerman A.J. Prevention of primary liver cancer by immunization. N Engl J Med. 19971. Jun 26;336(26): 1906-7.

Информация о работе

Черников, Владимир Александрович
кандидата биологических наук
Москва, 2009
ВАК 03.00.04

Диссертация

Оптимизация получения комплексов пептидов с рекомбинантным HSP70 человека для повышения иммуногенности белковых антигенов - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Оптимизация получения комплексов пептидов с рекомбинантным HSP70 человека для повышения иммуногенности белковых антигенов - тема автореферата по биологии, скачайте бесплатно автореферат диссертации

Похожие работы