Оптимизация диагностики вируса кустистой карликовости малины методом RT-PCR

Немцова, Елена Валентиновна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Оптимизация диагностики вируса кустистой карликовости малины методом RT-PCR
ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Оптимизация диагностики вируса кустистой карликовости малины методом RT-PCR"

003468996

НЕМЦОВА ЕЛЕНА ВАЛЕНТИНОВНА

ОПТИМИЗАЦИЯ ДИАГНОСТИКИ ВИРУСА КУСТИСТОЙ КАРЛИКОВОСТИ МАЛИНЫ МЕТОДОМ ЯТ-РСГ^

специальность 03.00.23. - Биотехнология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 4 у"

Москва-2009

003468996

Диссертационная работа выполнена в ФГОУ ВПО Брянской государственной сельскохозяйственной академии и ИННО-центре биотехнологии и экологии Брянского государственного университета имени академика И.Г. Петровского.

Официальные оппоненты: доктор сельскохозяйственных наук, профессор

Ведущая организация: ГНУ Всероссийский научно-исследовательский институт сельскохозяйственной биотехнологии РАСХН

Защита состоится «26» мая 2009 г. в_ л заседании диссертационного

совета Д 220.043.10 при Российском государственном аграрном университете -МСХА имени К.А. Тимирязева по адресу: 127550, г. Москва, ул. Тимирязевская, д.49; тел./факс. (495) 976-08-94

С диссертацией можно ознакомиться в Центральной научной библиотеке РГАУ-МСХА имени К.А. Тимирязева.

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор Заякин Владимир Васильевич

Белошапкина Ольга Олеговна

кандидат биологических наук Молканова Ольга Ивановна

Автореферат разослан _ апреля 2009 г. и размещен на сайте

университета: www.timacad.ru.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук

Е.А. Калашникова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность. В настоящее время во всем мире описано около 30 вирусных болезней малины, снижающих ее урожайность и ухудшающих качество посадочного материала [Приходько, 1997; Упадышев, 2004; Jones, 2004]. Наиболее распространенным и трудноконтролируемым патогеном малины и ежевики является вирус кустистой карликовости малины (ВККМ), который выявлен во всех областях возделывания культур рода Rubus: в Восточной и Западной Европе, Скандинавии, Северной и Южной Америке, Австралии, Новой Зеландии, Южной Африке, Китае. Поражая различные сорта малины, ВККМ приводит к возникновению хлорозов, некрозов, появлению деформированных и «рассыпчатых» плодов, снижению продуктивности растений. При заболевании число костянок в ягодах снижается до 10-12 шт., в то время как в норме доходит до 60 [Strik, 2003]. ВККМ способен снижать урожайность до 50 % даже при бессимптомном протекании инфекции [Murant, 19766; Jones, 1986а]. В естественных условиях вирус передается при семенном размножении и с пыльцой. Это делает контроль за его распространением в селекционных питомниках и производственных плантациях особенно сложным.

Проведенное в 1991-1996 гг. обследование посадок малины Кокинского опорного пункта ВСТИСП (Брянская область) показало присутствие некоторых опасных вирусных заболеваний (BMP, ВЛКПЗ, ВЧКТом, ВКПМ) [Приходько, 1997]. Однако это обследование не включало скрининг материала на наличие и распространение ВККМ, хотя в посадках малины повсеместно обнаруживается появление симптомов «рассыпчатости» плода, что свидетельствует о возможном присутствии данного вируса в селекционном материале.

В последнее десятилетие, в связи с появлением нового штамма ВККМ (RB -resistance breaking), поражающего сорта, устойчивые к обычным S изолятам вируса, а также с обострением проблемы контроля за распространением этого патогена, активно ведется работа по разработке различных методов обнаружения ВККМ. Так, за рубежом регулярно проводится скрининг ВККМ на плантациях малины и ежевики с использованием ИФА [Martin, 1998а]. В лабораторном материале вирус анализируется методами IC-RT-PCR [Kokko, 1996] и RT-LAMP [Wang, 2008].

Отечественные разработки методов диагностики ВККМ отсутствуют, а готовые коммерческие наборы для его обнаружения труднодоступны, В зарубежной литературе имеется упоминание о наличии ВККМ в образцах из России [Jones, 1998в], но информация о его распространении и характеристика местных изолятов на территории РФ отсутствует.

Поэтому, в настоящее время представляется актуальной разработка доступного метода диагностики ВККМ, позволяющего провести скрининг этого виру-

са, как в посадках малины, так и в лабораторном материале, размножаемом в культуре in vitro.

Цели и задачи исследования. Целью данного исследования являлась разработка методики диагностики ВККМ на основе метода RT-PCR, а также оптимизация условий анализа вируса в различных сортах и формах малины в полевых условиях и in vitro.

Для разработки методики решались следующие задачи:

• Подбор оптимального метода для выделения РНК малины.

• Выбор праймеров, обеспечивающих специфическую и эффективную амплификацию фрагментов вирусного генома.

• Разработка системы положительных и отрицательных контролей и подбор оптимальных условий для проведения RT-PCR.

Для проверки работоспособности методики диагностики ВККМ и характеристики местного изолята вируса предполагалось провести:

• Скрининг ВККМ в растениях различных сортов и форм малины Кокин-ского ОП ВСТИСП в полевых условиях и в культуре in vitro.

• Изучение возможности передачи вируса при семенном размножении различных сортов и форм малины.

• Изучение возможности обнаружения вируса в различных тканях малины в зависимости от стадии годового цикла развития растений.

• Клонирование фрагмента гена белка оболочки ВККМ и определение его нуклеотидной последовательности для идентификации штамма, распространенного в посадках малины Кокинского ОП ВСТИСП.

Научная новизна и значимость. На основе RT-PCR разработана доступная методика чувствительного анализа вируса кустистой карликовости в инфицированных растениях малины.

Осуществлен подбор последовательностей праймеров для амплификации нескольких участков гена белка оболочки РНК-2 ВККМ.

Впервые проведено частичное обследование на наличие ВККМ полевого и лабораторного материала малины, в том числе и ремонтантной. Все изученные формы содержали вирус. Подтверждена способность вируса передаваться при семенном размножении ремонтантной малины. Выявлены толерантные к ВККМ сорта малины. Показано, что выделение меристем ремонтантной малины и введение в культуру in vitro, не приводит к освобождению от ВККМ.

Определена нуклеотидная последовательность клонированного фрагмента гена белка оболочки ВККМ длиной 383 bp. Установлено, что изолят ВККМ, распространенный на территории Кокинского ОП ВСТИСП, имеет наибольшее сходство с изолятом R15, относящимся к группе RB штаммов.

Практическая ценность исследований. Разработана методика диагностики ВККМ, включающая протокол выделения РНК, набор праймеров и условия

метода RT-PCR. Составлены наборы, предназначенные для анализа ВККМ в полевых и лабораторных растениях малины, культивируемых in vitro.

Данная методика необходима для производства безвирусного посадочного материала, а также при проведении селекции малины, направленной на создание сортов, устойчивых к ВККМ.

Получена генетическая конструкция, содержащая фрагмент гена белка оболочки ВККМ, которая может быть использована для создания модельных трансгенных растений малины при изучении механизмов устойчивости к вирусу, а также для получения резистентных к ВККМ сортов малины.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Методика обнаружения ВККМ на основе RT-PCR.

2. Скрининг ВККМ в полевом и лабораторном материале малины.

3. Идентификация штамма ВККМ, распространенного в посадках малины Кокинского ОПВСТИСП.

Апробация работы. Основные положения диссертационной работы были доложены на международной научно-практической конференции «Молодые ученые - возрождению агропромышленного комплекса России» (Брянск, 2006), на IV съезде Общества биотехнологов России им. Ю.А. Овчинникова (Москва, 2006), II Вавиловской международной конференции «Генетические ресурсы культурных растений в XXI веке» (Санкт-Петербург, 2007), международной конференции молодых ученых «Фундаментальные и прикладные аспекты современной биотехнологии» (Брянск, 2008).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 9 работ, в том числе статья в журнале «Сельскохозяйственная биология», включенном в перечень ведущих рецензируемых научных журналов, рекомендуемых ВАК Министерства образования и науки РФ.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, четырех глав, выводов, рекомендаций производству, списка литературы и приложения. Объем работы составляет 163 страницы. В диссертации содержится 22 рисунка и 9 таблиц. Список использованной литературы содержит 251 источник, в том числе 218 работ иностранных авторов.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ 1. Методика и условия исследования

Исследования проводились в Центре биотехнологии БГСХА и в ИННО-центре биотехнологии и экологии БГУ в период с 2005 по 2008 гг. Анализировались полевые растения малины, сеянцы, а также пробирочные клоны на'различных этапах клонального микроразмножения. Использовались сорта и формы малины селекции академика РАСХН Казакова И.В.: неремонтантный -Бальзам; ремонтантные - Атлант, Бабье лето-2, Бриллиантовая, Брянское диво,

Брянская юбилейная, Геракл, Жар-птица, Золотые купола, Золотая осень, Надежная, Пингвин, 13-39-11, 2-205-1 А, 1-220-1, 16-136-6, 37-15-4, 18-183-1, 8202-1,3-2-1; а также ремонтантный сортКалашник (автор - Кичина В.В.).

1.1. Выделение РНК. Выделение РНК проводилось из тканей малины массой 3-500 мг. Для выбора оптимальной методики сравнивались препараты РЖ, полученные с использованием четырех модифицированных стандартных методов [Chomczynski, 1987; Клеменс, 1987; Генетическая инженерия растений, 1991], а также с использованием набора Diatom™ RNA Prep 100 («Изоген»), Общими модификациями являлись: проведение дополнительных этапов очистки; изменение состава некоторых буферов; применение нерастворимого поли-винилпироллидона для связывания примесей; использование гликогена для осаждения РНК. Определение качества полученных препаратов РНК малины осуществлялось спектрофотометрическим и электрофоретическим методом, а также по результатам RT-PCR.

1.2. Проведение RT-PCR. RT-PCR проводился по методикам, рекомендуемым фирмами изготовителями обратной транскриптазы M-MLV и Taq-полимеразы («Силекс», «СибЭнзим»), с небольшими изменениями. Подбор праймеров и определение их температуры плавления осуществлялись с помощью программы Vector NTL

Для проведения PCR использовались следующие температурные условия:

1. Предварительная денатурация 94°С - 3 мин;

2. (10 циклов) денатурация 94°С - 1 мин; отжиг +56°С при использовании праймера RBDV-CP-ЗЖя/, +50°С при использовании праймера RBDV-CP-25am

- 1 мин; синтез 72°С - 1 мин;

3. (20 циклов) денатурация 94°С - 1 мин; отжиг +51°С при использовании праймера RBDV-CP-3Sa/, +45°С при использовании праймера RBDV-CP-25aw

- 1 мин; синтез 72°С - 1 мин;

4. заключительная элонгация 72°С - 3 мин.

1.3. Конструирование вектора, содержащего фрагмент ВККМ. Создание генетической конструкции, содержащей фрагмент ВККМ, проводилось с использованием стандартных методик [Маниатис, 1984; Генная инженерия растений, 1991]. Вирусспецифичный фрагмент ДНК длиной 383 bp использовался для лигирования в pal-TA вектор. Плазмидная ДНК двух клонов, содержащая вирусспецифичный фрагмент, использовалась для секвенирования («Евроген»). Нуклеотидные последовательности клонированного фрагмента сравнивались со всеми вирусными последовательностями РНК-2 ВККМ, имеющимися в GenBank (с использованием программы ClustalW2 и MEGA4).

2. Результаты и обсуждение 2.1. Оптимизация методов выделения РНК из тканей малины. Так как

ткани малины содержат много полифенольных соединений и полисахаридов, то РНК, выделенная стандартными методами, характеризовалась высокой степенью деградации и наличием примесей. Поэтому, данные методы были модифицированы для выделения РНК из малины. Результаты спектрофотометрической оценки качества препаратов РНК, полученных четырьмя модифицированными методами из тканей полевых растений ремонтантной малины, показаны в таблице 1. Наиболее качественные образцы были получены при использовании модифицированных фенолхлороформенного метода и метода экстракции гуа-нидинизотиоционатом. Качество препаратов РНК, выделенных данными методами, достоверно отличалось от качества препаратов РНК, полученных с использованием фенолтриизопропилнафталинсульфонатного метода и метода экстракции горячим фенолом (при Р<0,05).

Таблица 1 - Спектрофотометрическая оценка качества РЖ, выделенной различными модифицированными методами из тканей полевых растений ремонтантной малины

Методы Среднее значение А260/А230 Среднее значение А260/А280

Фенолхлороформенный метод с применением для экстракции БЭЭ 1,19а 1,42 а

Метод экстракции гуанидинизотиоционатом 1,14а 1,35 аб

Фенолтриизопропилнафталинсульфонатный метод 0,71 б 1,23 аб

Метод экстракции горячим фенолом 0,66 б 1,18 6

НСРо,05 0,24 0,23

НСРода - значение наименьшей существенной разности при уровне вероятности < 0,05; а - отличие от группы б достоверно; б - отличие от группы а достоверно; аб - отличия от групп а и б недостоверны; значения, обозначенные одной и той же буквой достоверно не отличаются

Оценка статистической значимости средних значений отношений оптических плотностей препаратов РНК показала, что отличия между образцами, выделенными модифицированными фенолхлороформенным методом и методом экстракции гуанидинизотиоционатом, недостоверны при Р<0,05. Однако оптимальным для выделения РНК из полевых растений малины являлся фенолхло-роформенный метод, так как во всех сравнительных экспериментах знач'ения А260/А230 и А260/А280 для препаратов РНК, полученных данным методом, были всегда выше, чем для препаратов, полученных методом экстракции гуанидинизотиоционатом.

2.2. Характеристика праймеров, используемых для диагностики ВККМ методом RT-PCR. Для обеспечения видоспецифичности анализа были выбраны три пары праймеров (таблица 2). Подбор праймеров проводился при анализе консенсусной последовательности гена белка оболочки шести наиболее изученных на тот момент изолятов ВККМ, нуклеотидные последовательности РНК-2 которых опубликованы в GenBank: RBDV-M, RBDV-Can, RBDV-CanS, RBDV-D1, RBDV-D200, RBDV-R15. Последовательности праймеров комплементарны наиболее консервативным участкам гена белка оболочки ВККМ, поэтому их можно использовать для диагностики всех наиболее распространенных изолятов вируса. Это является существенным отличием разработанных праймеров от зарубежных аналогов, применяемых для обнаружения конкретных штаммов ВККМ - например, для изолята R15 [Kokko, 19966].

Праймеры выбраны таким образом, чтобы исключить возможность перекрестной реакции с BMJ1 (вирус мозаики люцерны, род Ilarvirus), сходным с ВККМ по нуклеотидной последовательности.

Таблица 2 - Нуклеотидные последовательности праймеров, используемых для диагностики ВККМ (сайты рестрикции выделены курсивом)_

Название, тип 5'-3' последовательность

RBDV-CP-1 обратный cgt cat gga tct aaa att tat с

RBDV-CP-2 Ват обратный cac agg ate caa ста ttg tgg agg att tgc

RBDV-CP-3 Sal обратный tgt сgt cga egg cac cgc cc

RBDV-CP+1 прямой tat gag ctt tat aac cgt aag

RBDV-CP+2 Eco прямой cac aga att ctt ttg teg ggt tea gtg ag

RBDV-CP+3 Eco прямой cac aga att cga cat gtc tat gtc tgc таа gg

Во всех праймерах кроме RBDV-CP-3&/, сайты рестрикции добавлены искусственно

Применение различных комбинаций двух пар праймеров для индикации ВККМ в пробах обеспечивало синтез четырех фрагментов ДНК рассчитанного размера. При использовании одной из пар праймеров (RBDV-CP+l и RBDV-СР-1) амплификация вирусных фрагментов ожидаемой длины не происходила или происходила неэффективно. Это вероятно связано с особенностями вторичной структуры вирусной РНК или последовательностью нуклеотидов местного изолята вируса.

Расположение праймеров в нуклеотидной последовательности РНК-2 позволяло провести контрольные эксперименты, подтверждающие специфичность анализа ВККМ (рис. 1). Нуклеотидная последовательность, ограниченная праймерами RBDV-CP+2 и RBDV-CP-2, имела расчетную длину 706 пар оснований. Этот участок содержал внутри более короткие последовательности

654 Ьр, 426 Ьр, 373 Ьр, которые амплифицировались с помощью праймеров, дополнительно содержащих сайты рестрикции, в виде фрагментов длиной 674 Ьр (праймеры КЕШУ-СР+З.Есо и КВБУ-СР-2.8а»1), длиной 435 Ьр (праймеры КВБУ-СР+2£со и ЯВВУ-СР-3&/) и длиной 383 Ьр (праймеры КВБУ-СР+3£со и МЮУ-СР-З&г/) соответственно.

ЯВОУ +3

Р!ВОУ +2 ■ НВЭУ -3

\ \ ] ЯВОУ-113ВОУ-2

454 Ьр

4! I

■5

| Длина амшгафицировакных последовательностей с использованием различных комбинаций праймеров

Ш-2 ЯВО\/

Рис. 1 - Расположение амплифицируемых с использованием различных пар праймеров фрагментов в нуклеотидной последовательности РНК-2 ВККМ, кодирующей ген белка оболочки

2.3. Положительные и отрицательные контроли при проведении КТ-РСЯ. Специфичность определения ВККМ подтверждена рядом положительных и отрицательных контролен. При обратной транскрипции с праймером КВВУ-СР-25а»г синтезировались длинные цепи кДНК, на которых в дальнейшем всегда наблюдалась амплификация 4-х фрагментов:

длиной 726 Ьр при использовании пары праймеров КВБУ-СР+2£со и ЯВВ"У-СР-23ат (рис. 2а, трек 2; рис. 26, треки 2, 3);

длиной 674 Ьр с праймерами ЯВОУ-СР+3£со и ШОЧ-С?-2Ват (рис. 2а, трек 3);

длиной 383 Ьр при использовании пары КВБУ-СР+3£со и КВБУ-СР-З&г/ (рис. 26, трек 5);

длиной 435 Ьр, амплифицируемую с помощью праймеров КВБУ-СР+2£со и

В случае обратной комбинации - праймер ШЮУ-СР-З&г/ использовался для синтеза кДНК, а праймеры, фланкирующие более длинный участок (КВБУ-СР+2Есо и КВВУ-СР-2Вйш), для полимеразной цепной реакции - амплификации вирусспецифичных фрагментов не происходило (рис. 2в, трек 2). В этом случае область комплементарности КВБУ-СР-2Ват находилась за границей

длинных цепей, образованных при использовании для обратной транскрипции праймера RBDV-CP-35ö/ - вариант отрицательного контроля амплификации. Если же на стадии PCR при этом использовался тот же праймер RBDV-CP-3&/, в сочетании с праймером RBDV-CP+3£co или RBDV-CP+2£co, наблюдалась эффективная амплификация фрагментов длиной 383 Ьр (рис. 26, трек 4) и 435 Ьр (рис. 2в, трек 3) соответственно.

Для постановки отрицательных контролей использовались нуклеиновые кислоты культур, не поражающихся ВККМ (люпин, пшеница или ячмень), а также осуществлялись эксперименты с проведением PCR без стадии обратной транскрипции. Эти контроли ставились многократно, но ни разу не дали положительного результата (рис. 3, трек 10, рис. 5, трек 12),

шт

■ü^MÉ"

б) W w в)

Рис. 2 - Специфичность анализа ВККМ при различных комбинациях использования праймеров:

а) треки 1 - маркер pUC-19IMspI, 2 - фрагмент длиной 726 bp (RBDV-СР+2Eco и RBDV-CP-2£am), 3 - фрагмент длиной 674 bp (RBDV-CP+3£co и RBDV-CP-2BÖOT);

б) треки 1 - pUC-19/MspI; 2, 3 - фрагмент длиной 706 bp (RBDV-CP+2 и RBDV-CP-2); 4, 5 - фрагмент длиной 383 bp (RBDV-CP+3£co и RBDV-CP-3Sal). На стадии обратной транскрипции в обоих случаях использовался праймер RBDV-CP-2£a«, кроме трека 4 на рис. 26 - праймер RBDV-CP-3Sa/;

в) треки 1 - Gene Ruler™ 3 kb DNA Ladder, 2 - праймеры RBDV-CP+2£co и RBDV-CP-2Bam, 3 - фрагмент длиной 435 bp (RBDV-CP+2£co и RBDV-CP-3Sal). На стадии обратной транскрипции использовался праймер RBDV-CP-SSa/

2.4. Влияние концентрации РНК малины для обратной транскрипции на протекание RT-PCR. Амплификация вирусспецифичных фрагментов происходила при использовании для обратной транскрипции РНК в количестве 0,31,4 мкг на пробу (в зависимости от метода выделения РНК) и практически отсутствовала при содержании РЖ в смеси в количестве 2-3 и ОД мкг. Это связано с тем, что слишком низкая концентрация РНК с небольшим количеством вирусного компонента не обеспечивала протекание обратной транскрипции и

полимеразной цепной реакции с достаточной интенсивностью. Высокое содержание РНК в количестве 2-3 мкг приводило к ингибированию ферментов 11Т-РСЛ из-за большого содержания примесей (белков, фенольных соединений), что способствовало уменьшению интенсивности свечения полос на электрофо-реграмме или их отсутствию, а, следовательно, к недостоверным результатам.

2.5. Влияние методов выделения РЕПС на эффективность диагностики ВККМ в тканях малины методом ИТ-РСК. Анализ методов выделения РНК показал, что амплификация вирусных фрагментов протекала при использовании РНК, выделенной из полевых растений малины модифицированными фе-нолхлороформенным методом, методом экстракции гуанидинизотиоционатом и методом экстракции горячим фенолом. При использовании для проведения анализа РНК, выделенной из тех же растений фенолтриизопропилнафталин-сульфонатным методом, амплификации специфических вирусных фрагментов не происходило. Это согласовывалось с данными, полученными при спектро-фотометрической оценке - препараты, выделенные этим методом из полевых растений, характеризовались наличием примесей при небольшом количестве РНК на пробу. Это затрудняло протекание ИТ-РСЯ и приводило к появлению ложноотрицательных результатов.

Для получения препаратов РНК из тканей, не содержащих большое количество примесей (пробирочные растения, листья сеянцев, почки), эффективными являлись все методы выделения. Причем не наблюдалось ощутимых различий в интенсивности флуоресценции вирусспецифичных полос. Поэтому для выделения РНК из пробирочных растений и из сеянцев применялся наиболее быстрый модифицированный метод экстракции гуанидинизотиоционатом.

2.6. Скрининг ВККМ методом КТ-РСИ в полевых растениях и сеянцах

малины. С использованием разработанной методики анализировались пробы РНК индивидуальных растений малины и усредненные пробы РНК из тканей 10 растений каждой формы (листья, цветы и ягоды цветущих растений). Образцы, в которых была обнаружена инфекция, отображены в таблице 3. Среди них имеются сорта и формы с явными признаками поражения ВККМ в полевых условиях («рассыпчатость» плодов) - сорта Бальзам, Бриллиантовая, Брянская юбилейная, Золотые купола, Калашник, Надежная и формы 13-39-11, 2-205-1 А, 3-2-1. При анализе индивидуальных растений каждого из перечисленных сортов идентифицированы вирусные фрагменты в 100 % случаев. Это исключает другие возможные причины появления «рассыпчатых» ягод в посадках (например, физиологические). Массовое поражение посадок малины ВККМ является следствием отсутствия контроля за распространением этого патогена в течение длительного времени.

Таблица 3 - Сорта и формы малины, инфицированные ВККМ в полевых условиях и in vitro ____

№ Сорт Номер Наличие ВККМ в полевых условиях (по результатам ЯТ-РСЯ) Наличие ВККМ в культуре in vitro (по результатам RT-PCR) Наличие симптомов ВККМ («рассыпчатые» плоды)

1. Атлант 25-15-1 + + нет

2. Бабье лето-2 8-242-1 + + нет

3. Бальзам - + не изуч. да

4. Бриллиантовая 22-15-1 + не изуч. да

5. Брянское диво 8-79-2 + + нет

6. Брянская юбилейная 5-159-2 + + да

7. Геракл 50-253-1 + + нет

8. Жар птица 3-72-2 не изуч. + нет

9. Золотая осень 24-139-2 + не изуч. нет

10. Золотые купола 8-225-2 + не изуч. Да

11. Надежная 2-200-20 + + да

12. Пингвин 4-43-1 + не изуч. нет

13. - 3-2-1 + не изуч. да

14. - 13-39-11 + не изуч. да

15. - 37-15-4 не изуч. + не изуч.

16. - 18-183-1 не изуч. + нет

17. - 8-202-1 не изуч. + не изуч.

18. - 1-220-1 не изуч. + не изуч.

19. - 2-205-1А + + да

20. - 16-136-6 не изуч. - не изуч.

21. Калашник - + не изуч. да

В питомнике имеются сорта без видимых признаков поражения ВККМ. К ним относятся перспективные и высокоурожайные ремонтантные сорта Атлант, Бабье лето-2, Брянское диво, Геракл, Золотая осень, Пингвин. Результаты анализа цветущих растений некоторых из них изображены на рис. 3. Для повышения надежности анализа использовали две комбинации праймеров для проверки каждой пробы (пара КВБУ-СР+3£со и КВБУ-СР-35я/ и пара КВБУ-СР+2£со и КВВУ-СР-З&з/)- Во всех случаях синтезировались вирусные ампликоны длиной 383 Ьр (рис. 3, треки 6-9) и 435 Ьр (рис. 3, треки 2-5). В полевых условиях снижения продуктивности растений этих сортов не обнаружено, поэтому возможно, что они являются толерантными к ВККМ и вирусная инфекция в них протекает бессимптомно.

С целью изучения возможности передачи ВККМ при семенном размножении, анализировались сеянцы ремонтантной малины, не достигшие цветения. В трех из пяти исследованных семей сеянцев ВККМ не выявлен (Брянская юби-лейнаяхсвободное опыление, 2-205- 1Ахсвободное опыление, ГераклхБрянское диво). ВККМ был обнаружен при анализе сеянцев, полученных из семян сорта Надежная (при свободном опылении) и сорта Геракл (при свободном опылении) со степенью встречаемости 38% (рис. 4) и 10% соответственно.

¡ÉS -

¡¿■аза, . .. ¿j*.______ .

т* »»1 :щ

шЩЩЩтШ

Рис. 3 - Инфицированность ВККМ цветущих растений различных сортов ремонтантной малины в полевых условиях: треки 1 - маркер Gene Ruler™ 3 kb DNA Ladder; 2, 6 - Атлант; 3,7- Пингвин; 4, 8 - Золотая осень; 5,9- Брянское диво; 10 - отрицательный контроль (PCR на ДНК малины). Праймеры RBDV-С?+2Есо и RBDV-CP-3Sa/ - длина вирусного ампликона 435 bp (треки 2-5), праймеры RBDV-CP+3Eco и RBDV-CP-3&/ - 383 bp (треки 6-9)

'.л''-;

Пай" ■

ш •V : г- ;

,«f Ä? ü' « ¿M щ • - Ж '■■г^Ш, Ш&ь

-Vs 3 я 1 Ш' Ш ЦЦр

i шк 1 Ц 5 i, ■ 3 - . * 6 7

Рис. 4 - Инфицированность ВККМ сеянцев ремонтантной малины: треки 1 - маркер Gene Ruler™ 3 kb DNA Ladder, 2-8 - сеянцы, полученные при свободном опылении сорта Надежная. Во всех случаях использовались праймеры RBDV-CP+2Eco и RBDV-CP-3Sa/ (синтез вирусного фрагмента длиной 435 bp)

Наличие ВККМ в сеянцах, полученных при скрещивании пораженных форм, подтверждает предположение о том, что передача вируса среди растений малины, в том числе и ремонтантной, может осуществляться посредством семян [Jones, 1986а]. Однако для различных сортов процент инфицированных

ВККМ сеянцев может варьировать, что необходимо учитывать в процессе проведения селекции.

2.7. Скрининг ВККМ методом RT-PCR в растениях ремонтантной малины, размножаемых в культуре in vitro. Одним из основных способов размножения ремонтантной малины является метод культуры тканей in vitro [Нам, 1998]. В связи с этим проведен анализ пробирочных растений, а также растений, высаженных в стерильный почвенный субстрат для укоренения. ВККМ обнаружен в 12-ти из 13 -ти проанализированных сортов и форм ремонтантной малины: Атлант, Геракл, Бабье лето-2, Брянская юбилейная, Брянское диво, Жар-птица, Надежная, 2-205-1А, 1-220-1, 8-202-1, 18-183-1, 37-15-4 (таблица 3).

Рис. 5 - Инфицированность ВККМ некоторых форм ремонтантной малины, размножаемых микроклонально: треки 1 и 13 - маркер pUC-19IMsp I\ 2, 3, 4 и 5 - соответственно формы 1-220-1, Жар птица, Брянское диво и 16-136-6 (in vitro); 6, 7, 8 и 9 - соответственно формы 1-220-1, Жар-птица, Брянское диво и 16-136-6 (акклиматизация в почвенном субстрате); 11 - форма 2-205-1А (in vitro)', 12 - отрицательный контроль (PCR на ДНК растений малины формы 2-205-1А без обратной транскрипции). Во всех случаях использовались прайме-ры RBDV-CP+3&0 и RBDV-CP-3&/

ВККМ определялся как в пробирочных растениях, так и растениях, адаптированных к стерильному субстрату, но во втором варианте определение давало более надежные результаты, поскольку амплифицированные фрагменты накапливались в большем количестве, а в образце 1-220-1 вирус выявлялся только после переноса растений в почвенный субстрат (рис. 5, треки 2 и 6). Не подчиняются этой закономерности результаты анализа сорта Жар-птица - из элек-трофореграммы следует, что ВККМ определялся в пробирочных растениях, но отсутствовал в растениях, высаженных в субстрат. Это может быть связано с тем, что для анализа использовалась усредненная проба РНК различных клонов. Возможно, что часть из них получена из здоровых меристем.

ВККМ не обнаруживался в растениях формы 16-136-6 (рис. 5, треки 5 и 9), даже после 2-х кратного проведения анализа. Возможно, что при введении в

культуру данной формы использовались экспланты безвирусных растений или она является резистентной к вирусу.

На рис. 6 показаны результаты анализа индивидуальных пробирочных растений ремонтантной малины формы 18-183-1. Для повышения надежности индикации использовали две комбинации праймеров для проверки каждого клона (пара ШШ-С?+2Есо и Шт-С?-2Ват и пара БШБУ-СР+3£ео и КВБУ-СР-2Ват). При этом амплификация с использованием одной и той же РНК всегда приводила к появлению вирусспецифичных фрагментов длиной 726 Ьр (рис. 6, треки 2-7) и длиной 674 Ьр (рис. 6, треки 8-13).

Анализ отдельных пробирочных клонов растений сортов Бабье лето-2 (8 растений), Брянское диво (4 растения), Атлант (5 растений), форм 8-202-1 (8 растений) и 37-15-4 (5 растений) также показал 100% распространенность ВККМ.

«Шг

«МП ** Щт ^ Шшг шт ш

Рис. 6 - Инфицированность ВККМ пробирочных растений ремонтантной малины формы 18-183-1: треки 1 - маркер \iUC-\9IMspI, 2-7 - РНК пробирочных растений (фрагмент длиной 726 Ьр, амплифицируемый с использованием праймеров БШБУ-СР+2£со и КВШ-СР-2£ат), 8-13 - анализ РНК тех же клонов пробирочных растений с использованием праймеров ¡ШБУ-СР+ЗЕсо и Ш!>иЧ-СР-2Ват (фрагмент длиной 674 Ьр)

2.8. Диагностика ВККМ в растениях ремонтантной малины на разных стадиях годового цикла развития. Важной характеристикой аналитической методики является возможность диагностики вируса в разных тканях в зависимости от физиологического состояния растения, фазы онтогенеза, сезонных изменений. С использованием разработанной методики ВККМ определялся в листьях и ягодах ремонтантной малины в течение всего периода вегетации, но не поддавался определению в покоящихся почках в зимнее время (рис. 7, треки 1013). Вероятно, это связано с уменьшением скорости размножения вируса и снижением его содержания в тканях.

ВККМ определялся вскоре после начала пробуждения почек (рис. 7, треки 2-5) - вирусспецифичные ампликоны синтезировались при использовании для анализа РНК распускающихся почек прошлогодних побегов. Однако в этом

случае флуоресценция вирусных ампликонов менее интенсивная, чем при использовании РНК плодоносящих растений (рис. 7, треки 6-9).

Рис. 7 - Инфицированность ремонтантной малины ВККМ в разные периоды сезонного цикла развития растений (форма 2-205-1А): треки 1 и 15 — маркер pUC-19/Msp 2 и 3 - распускающиеся почки (праймеры RBDV-CP+2 и RBDV-CP-2), 4 и 5 - распускающиеся почки (праймеры RBDV-CP+3£co и RBDV-CP-SSa/), 6 и 7 - замороженные листья и ягоды (праймеры RBDV-CP+2 и RBDV-CP-2), 8 и 9 - замороженные листья и ягоды (праймеры RBDV-СР+3Есо и ШЗБУ-СР-З&я/), 10 и 11 - зимние покоящиеся почки (праймеры RBDV-CP+2 и RBDV-CP-2), 12 и 13 - зимние покоящиеся почки (праймеры RBDV-CP+3£co и RBDV-CP-3>Sa/), 14 - «отрицательный контроль» - обратная транскрипция с праймером RBDV-CP-3SaZ, PCR с праймерами RBDV-CP+2 и RBDV-CP-2. Треки 4, 8, 12, 14 - для обратной транскрипции использовали праймер RBDV-CP-3Sal, в остальных случаях RBDV-CP-2

2.9. Анализ нуклеотидной последовательности изолята ВККМ, распространенного в посадках малины. Проведен генетический анализ двух нуклео-тидных последовательностей клонированного фрагмента ВККМ длиной 383 Ьр и последовательностей гена белка оболочки всех известных в настоящее время изолятов вируса. Нуклеотидные последовательности клонированного фрагмента имели наибольшее сходство с участком гена белка оболочки РНК-2 и РНК-3 изолята вируса R15, относящегося к группе RB изолятов [Natsuaki, 1991; Mayo, 1991]. Степень гомологии последовательностей клонированного фрагмента 1 и 2 с последовательностью РНК-2 изолята R15 ВККМ составляла 99,2% и 98,1% соответственно.

Праймеры RBDV-CP+3£co и RBDV-CP-3&/ полностью комплементарны последовательностям всех изолятов ВККМ, кроме штамма, распространенного в Китае [Chamberlain, 2003]. Поэтому с использованием данной пары можно проводить анализ всех остальных изолятов ВККМ, независимо от их серологических свойств.

1 2 3 4 5 б "7 8 9 10 И 12 13 14. 15

> б

Рис. 8 - Филогенетические связи, выявленные на основе анализа нуклео-тидных последовательностей гена белка оболочки ВККМ с использованием метода ближайших соседей (N1): 1 и 2 - нуклеотидные последовательности клонированного фрагмента, остальные - нуклеотидные последовательности различных изолятов ВККМ по данным ОепВапк

Из данных дендрограммы (рис. 8), отображающей филогенетические связи, следует, что нуклеотидные последовательности клонированного фрагмента длиной 383 Ьр с высокой степенью достоверности (98%) образовывали отдельный кластер совместно с изолятами R15 и D1 (кластер а). Штамм D1, относящийся к группе S, получен в лабораторных условиях при непрерывном культивировании изолята D200 в Nicotiana benthamiana [Jones, 2000а]. Последовательности клонированного фрагмента 1 и 2 имели более тесную связь с изолятом R15, чем с D1. Это подтверждает то, что штамм ВККМ, распространенный в посадках малины Кокинского ОП ВСТИСП, имеет наибольшее сходство с R15 изолятом ВККМ. Данный штамм относится к группе изолятов RB, преодолевающих генетическую устойчивость малины к ВККМ. Поэтому, сорта, устойчивые к S изолятам, не являются перспективными для нашей зоны, что необходимо учитывать в процессе проведения селекции.

Выводы

тельных и отрицательных контролей. Амплификация фрагментов вирусного происхождения происходила при различных сочетаниях праймеров, только в том случае, если анализировались инфицированные ВККМ растения.

2. Установлено, что методика обладает достаточной чувствительностью -минимальное количество ткани для анализа ВККМ составляло 3-5 мг. Она успешно использована для обнаружения вируса в генеративных и вегетативных органах полевых растений малины при выраженных или отсутствующих симптомах заболевания, а также в пробирочных растениях в процессе клонального микроразмножения.

3. Обнаружено, что препараты РНК малины, полученные стандартными методами, характеризовались высокой степенью деградации и наличием примесей. Поэтому эти методы были модифицированы: для выделения РНК из закончивших рост грубых и замороженных тканей оптимальным являлся модифицированный фенолхлороформенный метод с применением для экстракции SDS; для выделения РНК из пробирочных растений, почек и сеянцев - модифицированный метод экстракции гуанидинизотиоционатом.

4. Показана зависимость между физиологическим состоянием растений и выявляемостью ВККМ методом RT-PCR. Вирус определялся в листьях и ягодах малины в течение всего периода вегетации, не поддавался определению в покоящихся почках в зимнее время и снова обнаруживался вскоре после начала пробуждения почек.

5. ВККМ обнаружен при обследовании посадок 15-ти сортов и форм малины Кокинского ОП ВСТИСП. При этом, несмотря на наличие вируса в сортах Атлант, Бабье лето-2, Брянское диво, Геракл, Золотая осень, Пингвин в полевых условиях признаков инфекции и снижения продуктивности для них не наблюдалось. Возможно, что эти сорта являются толерантными к ВККМ и инфекция в них протекает бессимптомно.

6. Выделение меристем ремонтантной малины и культивирование их in vitro при клональном микроразмножении не приводит к освобождению от ВККМ. При анализе пробирочных растений 12-ти форм ремонтантной малины не обнаружено ни одного клона свободного от ВККМ.

7. Подтверждена способность ВККМ передаваться при семенном размножении. В некоторых семьях ремонтантной малины вирусной инфекции выявлено не было, в других ВККМ обнаружен с различной степенью встречаемости (от 10% до 38%).

8. В результате генетического анализа установлено, что изолят ВККМ, распространенный в посадках малины Кокинского ОП ВСТИСП, имеет наибольшее сходство с R15 изолятом, относящимся к группе RB штаммов. Степень гомологии двух нуклеотидных последовательностей клонированного фрагмента ВККМ с последовательностью РНК-2 изолята R15 составляла 99,2% и 98,1%.

Рекомендации производству

Предложенную методику рекомендуется использовать для диагностики ВККМ в растениях малины, произрастающих в полевых условиях и в культуре in vitro. Это имеет значение для изучения распространенности ВККМ в посадках, позволяет проводить отбор неинфицированных растений, организовывать производство здорового посадочного материала и планировать проведение селекции малины на устойчивость к вирусу.

Сорта ремонтантной малины Атлант, Бабье лето-2, Брянское диво, Геракл, Золотая осень, Пингвин характеризуются высокой продуктивностью и отсутствием признаков поражения ВККМ, несмотря на присутствие вируса. Рекомендуется исследовать эти сорта на перспективность их использования в селекции как источник толерантности к ВККМ.

Для получения оздоровленного от ВККМ посадочного материала рекомендуется проводить тестирование не только клонов пробирочных растений, но и растений, укорененных в стерильном почвенном субстрате.

Скрининг пораженных ВККМ растений малины в питомниках наиболее целесообразно проводить в тканях однолетних побегов в период с августа по октябрь.

Для проведения массового тестирования ВККМ рекомендуется использовать наборы, включающие праймеры, положительные и отрицательные контро-ли, ферменты и стандартные буферы для обратной транскрипции и полимераз-ной цепной реакции.

Генетическая конструкция, содержащая фрагмент ВККМ, может использоваться для создания трансгенных растений малины, резистентных к этому вирусу.

Полученные результаты могут применяться в процессе преподавания учебных дисциплин биотехнология и вирусология студентам биологических специальностей ВУЗов.

Список опубликованных работ по теме диссертации

1. Нам И .Я., Заякин В.В., Немцова Е.В. Биотехнологические подходы в создании генетического разнообразия для селекции малины и люпина // Материалы II Вавиловской международной конференции «Генетические ресурсы культурных растений в XXI веке» (23-30 ноября 2007 г). Санкт-Петербург, 2007. С. 316-318.

2. Немцова Е.В., Дроздов Е.В. Определение нуклеотидной последовательности изолята ВККМ, распространенного в посадках ремонтантной малины Ко-кинского ОП // Материалы международной научно-практической конференции «Современные проблемы эволюционной биологии» (Брянск, 12-14 февраля 2009 года). Брянск, 2009. С. 335-337.

3. Немцова Е.В., Заякин В.В. Обнаружение RBDV в образцах ремонтантной малины селекции опорного пункта ВСТИСП // Материалы международной научно-практической конференции «Молодые ученые - возрождению агропромышленного комплекса России» (Брянск, 23-24 мая 2006 года). Брянск, 2006. С. 14-17.

4. Немцова Е.В., Заякин В.В. Особенности использования метода RT-PCR для идентификации RBDV в тканях ремонтантной малины // Вестник Брянского госуниверситета. 2006. № 4. С. 76-79.

5. Немцова Е.В., Заякин В.В. Обнаружение вируса кустистой карликовости методом RT-PCR в некоторых генотипах ремонтантной малины селекции опорного пункта ВСТИСП // Материалы четвертого съезда Общества биотехнологов России (6-7 декабря 2006 г). Москва, 2006. С.98.

6. Немцова Е.В., Заякин В.В. Влияние физиологического состояния растений ремонтантной малины на выявление вируса кустистой карликовости методом RT-PCR // Материалы VI съезда физиологов растений России (Международная конференция «Современная физиология растений: от молекул до экосистем»). Сыктывкар, 2007. С. 186-188.

7. Применение клеточных технологий для создания новых высокопродуктивных устойчивых к болезням форм растений малины и люпина с целью использования в селекции / Нам И.Я., Заякин В.В., Заякина О.В., Немцова Е.В., Дроздов Е.В. // Итоговая конференция в рамках приоритетного направления «Живые системы» (6-7 декабря, 2007 г). Москва, 2007. С. 175-176.

8. Распространенность вируса кустистой карликовости малины при кло-нальном микроразмножении различных форм ремонтантной малины / Немцова Е.В., Артюхова А.Н., Заякин В.В., Нам И.Я. // Вестник Брянского госуниверситета. 2007. №4. С. 209-213.

9. 'Скрининг вируса кустистой карликовости малины методом RT-PCR in vitro и в полевом материале / Немцова Е.В., Заякин В.В., Казаков И.В., Евдоки-менко С.Н., Нам И.Я. // С.-х.биология. Сер. Биология растений. 2007. № 5. С. 119-123.

Принята к рассмотрению заявка на изобретение № 2007139203/13 (042908). Заякин В.В., Нам И.Я., Немцова Е.В. «Набор олигонуклеотидов-праймеров для идентификации РНК вируса кустистой карликовости малины». 2008.

' Публикация в журнале, включенном в перечень ВАК

_Отпечатано с готового оригинал-макета_

Формат 60Х84'/16. Объем 1,25 п.л. Тираж 100 экз. Заказ 249.

Издательство РГАУ - МСХА имени К.А. Тимирязева 127550,Москва, ул. Тимирязевская,44

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Немцова, Елена Валентиновна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1 ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР.

1.1 Вирусные болезни малины.

1.2 Способы передачи ВККМ и других вирусов.'.

1.3 Симптомы поражения ВККМ растений рода Rubus.

1.4 Проблемы распространения ВККМ в посадках малины.

1.5 Круг растений, поражаемых ВККМ.

1.6 Систематическое положение ВККМ и свойства вирусных частиц.

1.7 Характеристика изолятов ВККМ.

1.8 Эффективность методов оздоровления малины от ВККМ и других вирусных болезней.

1.9 Методы диагностики ВККМ и других вирусов.

1.10 Создание сортов малины, устойчивых к ВККМ.

ГЛАВА 2 МЕТОДИКА И УСЛОВИЯ ИССЛЕДОВАНИЯ.

2.1 Характеристика объекта исследований.

2.2 Выделение РНК из растений малины.

2.2.1 Выделение тотальной РНК из растительного материала методом экстракции гуанидинизотиоционатом.

2.2.2 Выделение тотальной РНК из растительного материала фенолхлороформенным методом с применением для экстракции SDS.

2.2.3 Выделение тотальной РНК из растительного материала методом экстракции горячим фенолом.

2.2.4 Выделение тотальной РНК из растительного материала фенолтриизопропилнафталинсульфонатным методом.

2.3 Расчет концентрации РНК и определение качества полученных препаратов.

2.4 Разработка методики диагностики ВККМ с помощью RT-PCR.

2.4.1 Обратная транскрипция.

2.4.2 Полимеразная цепная реакция.

2.5 Конструирование вектора, содержащего фрагмент ВККМ.

ГЛАВА 3 РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

3.1 Оптимизация методов выделения РНК из тканей малины.

3.2 Диагностика вируса кустистой карликовости малины в тканях малины методом RT-PCR.

3.2.1 Характеристика праймеров, используемых для диагностики ВККМ методом RT-PCR.

3.2.2 Положительные и отрицательные контроли при проведении RT-PCR.

3.2.3 Влияние концентрации РНК малины для обратной транскрипции на протекание RT-PCR

3.2.4 Влияние методов выделения РНК на эффективность диагностики ВККМ в тканях малины методом RT-PCR.

3.3 Скрининг ВККМ методом RT-PCR' в полевых растениях, сеянцах и пробирочных растениях малины, размножаемой в культуре in vitro.

3.3.1 Анализ ВККМ в цветущих растениях и сеянцах некоторых форм малины в полевых условиях.

3.3.2 Диагностика ВККМ в растениях ремонтантной малины на разных стадиях годового цикла развития.

3.3.3 Анализ ВККМ в растениях ремонтантной малины, размножаемых в культуре in vitro.

3.4 Анализ нуклеотидной последовательности изолята ВККМ, распространенного в посадках малины.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Оптимизация диагностики вируса кустистой карликовости малины методом RT-PCR"

В настоящее время во всем мире описано около 30 вирусных болезней малины, снижающих ее урожайность и ухудшающих качество посадочного материала [Приходько, 1992; Martin, 2002; Jones, 2004; Упадышев, 2004]. Наиболее распространенным и трудноконтролируемым патогеном малины и ежевики является вирус кустистой карликовости малины (ВККМ), который выявлен практически во всех областях возделывания культурных растений рода Rubus: в Восточной и Западной Европе, Скандинавии, Северной и Южной Америке, Австралии, Новой Зеландии, Южной Африке, Китае [Baumann, 1986; Jones, 1992; Kokko, 1996а; Spak, 1997; Martin, 1999; Chamberlain, 2003; Pearson, 2005]. Поражая различные сорта малины, ВККМ приводит к возникновению хлорозов, некрозов, появлению деформированных и «рассыпчатых» плодов, снижению продуктивности растений. При заболевании растений число костянок в ягодах снижается до 10-12 шт., в то время как в норме доходит до 60 [Strik, 2003]. ВККМ способен снижать урожайность на 50 % даже при бессимптомном протекании болезни [Murant, 19766]. В естественных условиях вирус передается с пыльцой и при семенном размножении. До 77 % сеянцев, полученных из семян инфицированной красной малины, поражены ВККМ [Jones, 1996а]. Все это делает контроль за его распространением в селекционных питомниках и производственных плантациях особенно сложным.

Проведенное в 1991-1996 гг. обследование селекционных посадок ма ф лины Кокинского опорного пункта ВСТИСП (Брянская область) показало присутствие некоторых опасных вирусных заболеваний — BMP, ВКПМ, ВЛКПЗ, ВЧКТом с различной степенью встречаемости (от 6% до 44 %) [Приходько, 1997]. Однако это обследование не включало скрининг материа Далее ОП ВСТИСП (Всероссийский селекционно-технологический институт садоводства и питомниковод-ства) ла на наличие и распространение ВККМ, хотя в посадках малины повсеместно обнаруживается появление «рассыпчатых» и деформированных плодов, что свидетельствует о возможном присутствии данного вируса в селекционном материале.

Одним из основных методов диагностики вирусов, в том числе и ВККМ, является иммуноферментный анализ [Converse, 1976; Auger, 1982; Spak, 1995, 1999; Kolber, 1998]. Данный метод широко используется для регулярного проведения скрининга ВККМ на плантациях малины и ежевики в Европе и США [Baumann, 1988; Martin, 1998а, 1999; Strik, 2003; Чернец,

2007].

Другим высокочувствительным методом обнаружения растительных РНК-содержащих вирусов, к которым и относится ВККМ, является метод RT-PCR [Gillaspie, 2001; Pluta, 2002; Jones, 20026; Olmos, 2004; Yardimci,

2008]. В последние десятилетия, в связи с появлением нового RB штамма ВККМ, поражающего сорта, устойчивые к обычным S изолятам вируса, а также с обострением проблемы контроля за распространением патогена, разработана методика обнаружения ВККМ на основе метода IC-RT-PCR [Kokko, 19966]. Эта методика позволяет анализировать вирус в растениях независимо от проявления симптомов. Диагностика ВККМ проводится также с помощью метода RT-LAMP [Wang, 2005, 2008].

Отечественные разработки методов анализа ВККМ отсутствуют, а готовые коммерческие наборы для его обнаружения труднодоступны. В зарубежной литературе имеется упоминание о наличии ВККМ в образцах из России [Jones, 1998в], но информация о его распространении и характеристика местных изолятов на территории РФ отсутствует.

Поэтому, в настоящее время представляется актуальной разработка удобной и доступной методики диагностики ВККМ в растениях малины, которая позволит:

- своевременно выявлять вирус и получать здоровый посадочный материал;

- контролировать распространение ВККМ в селекционных питомниках и производственных плантациях;

- проводить селекцию, направленную на получение устойчивых или толерантных к ВККМ сортов малины.

Для разработки методики решались следующие задачи:

• Подбор оптимального метода для выделения РНК малины.

• Выбор праймеров, обеспечивающих специфическую и эффективную амплификацию фрагментов вирусного генома.

• Скрининг ВККМ в растениях различных сортов и форм малины Кокинского ОП ВСТИСП в полевых условиях и в культуре in vitro.

• Изучение возможности передачи вируса при семенном размножении различных сортов и форм малины.

Практическая ценность исследований. Разработана методика диагностики ВККМ, включающая протокол выделения РНК, набор праймеров и условия метода RT-PCR. Составлены наборы, предназначенные для анализа ВККМ в полевых и лабораторных растениях малины, культивируемых in vitro.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Методика обнаружения ВККМ на основе RT-PCR.

2. Скрининг ВККМ в полевом и лабораторном материале малины.

3. Идентификация штамма ВККМ, распространенного в посадках малины Кокинского ОП ВСТИСП.

Апробация работы. Основные положения диссертационной работы были доложены на международной научно-практической конференции «Молодые ученые - возрождению агропромышленного комплекса России» (Брянск, 2006), на IV съезде Общества биотехнологов России им. Ю.А. Овчинникова (Москва, 2006), II Вавиловской международной конференции* «Генетические ресурсы культурных, растений в XXI веке» (Санкт-Петербург, 2007), международной конференции молодых ученых «Фундаментальные и прикладные аспекты современной биотехнологии» (Брянск, 2008).

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из, введения, четырех глав, выводов, рекомендаций производству, списка литературы и приложения. Объем работы составляет 163 страницы. В диссертации содержится 22 рисунка и 9 таблиц. Список использованной литературы содержит 251 источник, в том числе 218 работ иностранных авторов.

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология", Немцова, Елена Валентиновна

ВЫВОДЫ

1. Разработана методика диагностики ВККМ на основе метода RT-PCR, позволяющая идентифицировать вирус в полевых и пробирочных растениях малины. Специфичность определения ВККМ подтверждена системой положительных и отрицательных контролей. Амплификация фрагментов вирусного происхождения происходила при различных сочетаниях праймеров, только в том случае, если анализировались инфицированные ВККМ растения.

2. Установлено, что методика обладает достаточной чувствительностью — минимальное количество ткани для анализа ВККМ составляло 3-5 мг. Она успешно использована для обнаружения вируса в генеративных и вегетативных органах полевых растений малины при выраженных или отсутствующих симптомах заболевания, а также в пробирочных растениях в процессе клонального микроразмножения.

РЕКОМЕНДАЦИИ ПРОИЗВОДСТВУ

Для проведения массового тестирования ВККМ рекомендуется использовать наборы, включающие праймеры, положительные и отрицательные контроли, ферменты и стандартные буферы для обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции.

ГЛАВА 4 ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Разработанная методика диагностики ВККМ на основе метода RT-PCR имеет ряд достоинств — она является достаточно чувствительной, специфичной и доступной. С использованием данной методики оказалось возможным обнаружение ВККМ в течение всего периода вегетации в различных органах полевых растений малины при выраженных и отсутствующих симптомах заражения. Методика успешно использована для диагностики ВККМ в пробирочных растениях в процессе клонального микроразмножения.

В некоторых ранних источниках упоминается, что можно получить свободные от ВККМ растения из меристем 0,5-1 мм. В более поздних работах сообщается, что даже при выделении меристем 0,1-0,5 мм процент оздоровленного материала невысок [Baumann, 1982а; Lances, 1995]. Такое противоречие вызвано ошибками при проведении ИФА. Предложенная методика диагностики ВККМ на основе метода RT-PCR является достаточно чувствительной, о чем свидетельствует то, что вирус обнаруживался в пробирочных растениях, независимо от размера меристем, из которых они были получены, и массы навески для выделения РНК. ВККМ определялся в навеске растительной ткани 3-5 мг, что является важным преимуществом, так как использование для анализа небольших количеств тканей пробирочных растений позволяет сохранить исследуемое растение для перенесения его в почвенный субстрат.

Определение ВККМ происходило с высокой специфичностью — вирусные фрагменты амплифицировались, только если в пробах присутствовала РНК-2 ВККМ, так как разработанные праймеры комплементарны одному из ее участков. Специфичность анализа подтверждена рядом положительных и отрицательных контролей.

Разработанная методика является универсальной - благодаря особенностям используемых праймеров (RBDV-CP+3iiC0 и RBDV-CP-ЗЛг/) она может использоваться для анализа нескольких известных изолятов ВККМ (кроме штамма из Китая), независимо от их серологических свойств. Праймеры должны взаимодействовать также с последовательностями новых изолятов ВККМ, обнаруженных в 2008 году в Словении (рис. 21).

Преимуществом данной методики являлось то что, она разработана для ферментов и приборов отечественного производства, так как зарубежные наборы для RT-PCR чрезвычайно дороги. Она обладает достаточно хорошей производительностью. В течение одного дня можно провести анализ 15-20 образцов.

Разработанная методика позволила осуществить скрининг ВККМ в сортах и формах малины Кокинского ОП ВСТИСП, культивируемых как в полевых условиях, так и in vitro. Образцы, в которых по данным RT-PCR была обнаружена инфекция, отображены в таблице 7. Среди них имелись сорта и формы с явными признаками поражения ВККМ («рассыпчатость» плодов) — Бальзам, Надежная, Брянская юбилейная, Золотые купола, Калаш-ник, Бриллиантовая, 13-39-11, 2-205-1А, 3-2-1. В растениях таких форм вирусные фрагменты идентифицированы в 100 % случаев, что исключало другие возможные причины возникновения «рассыпчатых» плодов (например, физиологические).

В посадках имелись также сорта ремонтантной малины без видимых признаков поражения ВККМ — Атлант, Брянское диво, Золотая осень, Геракл, Бабье лето-2, Пингвин (таблица 7). При их анализе также обнаружена вирусная инфекция. Данные сорта являются перспективными в селекции -для них отмечена высокая урожайность, отсутствие «рассыпчатости» ягод и других признаков поражения вирусом. Поэтому возможно, что они являются толерантными к ВККМ.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Немцова, Елена Валентиновна, Брянск

1. Борзых Г.Т. Распространение и вредоносность курчавости листьев малины в Черноземной зоне // Сб. научных трудов ВНИИС имени В.В. Мичурина. 1975. Вып. 20. С. 88-92.

2. Борзых Г.Т. Выращивание безвирусного посадочного материала малины во ВНИИС им И.В. Мичурина // Сб. научных трудов ВНИИС. 1986. Вып. 47. С. 44-46.

3. Вердеревская Т.Д. Вирусные и микоплазменные заболевания плодовых культур. Кишинев: Штиинца, 1981. 175 с.

4. Высоцкий В.А. Усовершенствование способов получения растений малины из изолированных меристематических верхушек // Ягодоводство в Нечерноземье: Сб. научн. тр НИЗИСНП. Москва, 1984. С. 3-8.

5. Высоцкий В.А. Использование методов культуры изолированных тканей и органов для оздоровления и ускоренного размножения плодовых и ягодных растений // Селекция плодовых и ягодных культур. Новосибирск, 1989. С.132-138.

6. Генная инженерия растений: Лабораторное руководство. Пер. с англ. / Дж. Дрейпер, Р. Скотт, Ф. Армитидж, Р. Уолден [Под ред. Дж. Дрей-пера]. М.: Мир, 1991. 408 с.

7. Грушечкин В.Г., Помазков К.М. Особенности производства безвирусного посадочного материала ягодных культур в Нечерноземной зоне // Итоги научных исследований по карантину растений за 1970 г. Москва, 1972.

8. Казаков И. В. Проблемы и перспективы создания сортов малины ремонтантного типа // Селекционно-генетические проблемы развития садоводства в средней полосе европейской части России. Мичуринск, 1995. С. 2629.

9. Казаков И.В. Перспективное направление в селекции малины // Материалы международной научно-практической конференции молодых ученых, 2-5 октября 2000 года. Брянск, 2000. С. 85-87.

10. Каплан И.Б., Малышенко С.И., Шакулова Э.Р., Дубинина Е.Р., Тальянский М.Э. Индукция PS-белков и приобретенной противовирусной устойчивости под влиянием кинетина в растениях табака // Физиология растений. 1988. Т.35. Вып. 5. С. 849-856.

11. Келдыш М.А., Помазков Ю.И. Вирусные и микоплазменные болезни древесных растений. Москва: Наука, 1985. 133с.

12. Клеменс М. Выделение эукариотической матричной РНК / Транскрипция и трансляция. Методы Под. ред. Хеймса Б., Хиггинса С.. М.: Мир, 1987. С. 254-275.

13. Колбанова Е.В., Кухарчик Н.В., Барай В.Н., Зинченко А.И. Оздоровление смородины черной от вируса кольцевой пятнистости малины при использовании виразола in vitro II Весщ нацыянальнай навук Беларусь 2004. № 2. С. 90-93.

14. Кузнецова А.А. Вирусные заболевания мозаичного типа на малине: Автореф. дис. докт. с.-х. наук. Харьков, 1970. 22 с.

15. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Методы генетической инженерии: Молекулярное клонирование. М.: Мир, 1984.

16. Нам И.Я., Заякин В.В., Вовк В.В., Казаков И.В. Оптимизация метода клонального микроразмножения для ускоренной селекции межвидовых ремонтантных форм малины // Сельскохозяйственная биология. 1998. №3. С. 51-56.

17. Остерман JI.A. Методы исследования белков и нуклеиновых кислот. Электофорез и ультрацентрифугирование. М.: Наука, 1981.

18. Помазков К.М. Вирусные болезни ягодных культур. Москва: Колос, 1969. 188 с.

19. Помазков К.М. Видовой состав и распространение вирусов плодовых и ягодных культур в средней полосе европейской части СССР // Плодоводство и ягодоводство нечерноземной полосы. 1972. Т.4. С. 354-361.

20. Помазков К.М. Вирусные болезни плодовых и ягодных культур в Нечерноземной зоне: Автореф. дис. докт. с.-х. наук. Москва, 1975. 34 с.

21. Попов Ю.Г. Культура in vitro меристематических верхушек стебля как метод оздоровления и размножения растений // Биологич. науки. 1976. № 6. С. 13-14.

22. Приходько Ю.Н. Вирусные и микоплазменные болезни малины и ежевики. Москва, 1992. С. 536-543. Депонированная рукопись во ВНИИТЭИ Агропром. компл. 24.11.1992, № 139-64 ВС-92.

23. Приходько Ю.Н., Суркова О.Ю., Метлицкий О.З. НЕПО-вирусы на смородине в средней полосе России и пути их диагностики // Плодоводство и ягодоводство Росси. Москва, 1994. С. 135-142.

24. Приходько Ю.Н. Совершенствование технологии оздоровления малины от вирусов и микоплазм // Плодоводство и ягодоводство России (сборник научных трудов). Москва, 1995. т. II. С. 210-214.

25. Приходько Ю.Н. О видовом составе и распространенности вирусов малины в Европейской части России // Плодоводство и ягодоводство России (сборник научных трудов). Москва, 1997. т. IV. С. 97-101.

26. Томилин А.А. НЕПО-вирусы и их переносчики нематоды лонги-дориды на ягодных культурах в европейской части СССР и меры борьбы с ними: Дис. .канд с.-х. наук. Москва, 1991. 209 с.

27. Томилин А.А., Упадышев М.Т. К вопросу об эффективности оздоровления растений малины красной от вируса мозаики резухи с использованием метода культуры меристем // Ягодоводство в Нечерноземье: Сборник научных трудов. Москва, 1993. С. 25-28.

28. Упадышев М.Т. Аспекты оздоровления пробирочных растений ежевики от вируса мозаики резухи // Плодоводство и ягодоводство России (сборник научных трудов). Москва, 1995. Т. II. С. 214-217.

29. Упадышев М.Т. Мониторинг вирусных болезней ягодных и плодовых культур / Материалы международной научно-практической конференции «Мобилизация адаптационного потенциала садовых растений в динамичных условиях внешней среды». Москва, 2004. С. 215-219.

30. Чернец А. Использование имунно-ферментного анализа (ELISA) и Stem Dot Blotting для тестирования вируса кустистой карликовости малины (RBDV) в сортах малины // Бюресурси i Bipycn: V м1жнародна конференщя, 10-13 вересня 2007. Кт'в, 2007.

31. Щелкунова С.Е., Попов Ю.Г. Получение свободных от вируса растений малины методом культуры изолированных апексов // Физиология растений. 1970. Т. 17, № 3. С. 618-622.

32. Auger J., Converse R.H. Raspberry Bushy Dwarf and Tomato Ringspot Viruses in Chilean Red Raspberries // Acta Hort. 1982. Vol.129. P.9-10.

33. Angel-Diaz J.E., Jones A.T., Mayo M.A., Ziegler A., McGavin W.J., de Nova C., Graham J. Transgenic resistance to Raspberry Bushy Dwarf Virus in Nicotiana species // Scottish Crop Research Institute Annual Report 1996. SCRI, 1997. P. 73-75.

34. Barba M., Martino L., Lauretti F. Comparison of different methods to produce virus free stone fruits // Acta Hortic. 1992. Vol. 309. P.385-392.

35. Barbara D.J., Jones А.Т., Hendeson S.J., Wilson S.C., Knight V.H. Isolates of Raspbery Bushy Dwarf Virus differing in Rubus host range // Ann. Appl. Bioi. 1984. Vol. 105. P.49-54.

36. Barbara D.J., Ashby S.C., Knight V.H. The occurrence and distribution of isolates of Raspberry Bushy Dwarf Virus in England // Annals of Applied Biology. 1985. Vol. 106. P.75-81.

37. Barbara D.J., Smith I.M., Dunez J., Phillips D.H., Lelliot R.A., Archer S.A. Raspberry Bushy Dwarf Virus (RBDV) // European Handbook of Plant Diseases. UK, Oxford: Blackwell Scientific Publications, 1988. P.97-98.

38. Barbara D.J., Morton A., Knight V.H. Distribution of Raspberry Bushy Dwarf Virus genotypes in commercial Raspberries in England and Wales // Acta Hort. 2001a. № 551. P.23-26.

39. Barbara D.J., Morton A., Ramcharana S., Coleb I.W., Phillipsc A., Knight V.H. Occurrence and distribution of Raspberry Bushy Dwarf Virus in commercial Rubus plantations in England and Wales // Plant Pathology. 20016. Vol. 50, № 6. P.747-749.

40. Barnett O.W, Murant A.F. Host range, properties and purification of Raspberry Bushy Dwarf Virus //Ann. appl. Biol. 1970. Vol.65. P.435-449.

41. Barnett O.W, Murant A.F. Differential hosts and some properties of Raspberry Bushy Dwarf Virus //Ann. Phytopath. 1971. Vol. 3. P. 129-13 9.

42. Basak W. Choroby wirusowe roslin sadowniczych (The virus diseases of fruit plants) // Panstwowe Wydawnictwo Rolnicze i Lesne. Warszawa, 1968. P.161-163.

43. Basak W. Hosts and properties of Raspberry Line Pattern Vims // Bull. Acad, polonaise des Sciences. Classe V. Serie des Sei. Biol. 1971. Vol. 19. P.681-684.

44. Baumann G. Moglichkaeiten und Grenzen der Virusfreimachung von Himbeeren durch Gewebekcultur. Ostbau Bonn, 1981. Jg.6, № 3. P.83-89.

45. Baumann G. Elimination of a heat-stable Raspberry virus by combining heat treatment and meristem culture // Acta Hort. 1982a. Vol. 129. P. 11-13.

46. Baumann G., Casper R., Converse R. The occurrence of Apple Mosaic Virus in red and black Raspberry and in Blackberry cultivars // Acta Horticulture. 19826. Vol.129. P.13-17.

47. Baumann G., Casper R., Kornkamhaeng P. Detection of Prune Dwarf Virus by ELISA in meristem-propagated sour cherry plants during in vitro culture //Phytopath. 1984a. № 110. P. 168-171.

48. Baumann G. Virusbefall in Ertrags- undi Vermehrungsbestanden von Himbeere und Brombeere. Apple Mosaic Virus und Raspbeny Bushy Dwarf Virus // Erwerbsobstbau. 19846. Vol.26. P.218-221.

49. Baumann G., Basak W. Raspberry Bushy Dwarf Virus in Ertrags-und Vermehrungsbestanden von Himbeere // Erwerbsobstbau. 1985. Vol.28. P. 199-202.

50. Baumann G., Basak W. Zum Vorkommen des Raspberry Bushy Dwarf Virus in Himbeerbestanden // Erwerbsobstbau. 1986. Vol. 28, №7. P. 199-202.

51. Baumann G., Casper R., Converse R.H. Virus Diseases of Small Fruits // USDA Agriculture Handbook No. 631. 1987. 229 p.

52. Baumann G., Theiler-Hedtrich R., Casper R. Detection of sap-transmissible viruses by ELISA in tissue-propagated plants of Red Raspbeny during in vitro culture // J. Phytopathology. 1988. Vol. 122. P.372-375.

53. Belles J.M., Hansen A.J., Granell A., Conejero V. Antiviroid effects of ribavirin on citrus exocortis viroid infection in Gynura aurantiaca DC. // Physiol. Mol. PL Path. 1986. Vol. 28. P.61-65.

54. Buchenauer H., Fleischmann Ch., Hellwald K.-H. Untersuchungen zur Wirkung von n-Alkylverbindungen gegeniiber pflanzenpathogenen Viren // Mitt. Biol. Bundesanst. Land-Forstw. Berlin-Dabiem. 1986. Vol. 232. P.393.

55. Buck K.W. Comparison of the replication of positive-stranded RNA viruses of plants and animals // Adv. Virus Res. 1986. Vol.47. P. 159-251.

56. Bulger M.A., Stace-Smith R., Martin R.R. Transmission and field spead of Raspberry Bushy Dwarf Virus // Plant Dis. 1990. Vol. 74, № 7. P.514-517.

57. Cadman C.H., Hams R.V. // Rep. E. Mailing Res. Stn. for 1950. 1951. P.127-129.

58. Cadman C.H. Studies in Rubus virus diseases. Three types of vein chlorosis of Raspberries // Ann.appl.Biol. 1952. Vol.39. P.61-68.

59. Cadman C.H. // PI. Dis. Reptr. 49. 1965. P.230-235.

60. Cadman C.H. Virus Diseases of Small Fruits and Grapevines. Berkeley: University of California Press, 1970. 149 p.

61. Casper R. Serological properties of Prunus Necrotic Ringspot Virus and Apple Mosaic Virus isolates from Rose // Phytopathology. 1973. Vol. 63. P.238-240.

62. Casper R., Meyer S. Die Anwendung des ELISA-Verfahrens zum Nachweis pflanzenpathogener Viren // Nachrichtenbl. Deut. Pflanzenschukd. 1981. Vol. 33, № 2. P.49-54.

63. Chamberlain С .J., Kraus J., Kohnen P.D., Finn C.E., Martin, R.R. First report of Raspberry Bushy Dwarf Virus in Rubus multibracteatus from China // Plant Dis. 2003. Vol.87. P.603.

64. Chambers J. The production and maintenance of virus-free raspberry plants // J. Hortic. Sci. 1961. № 36. P.48-54.

65. Chard J., Irvine S., Nevison R., Nevison I.M., McGavin W.J., Jones A.T. Incidence and distribution of Raspberry Bushy Dwarf Virus in commercial red raspberry (Rubus idaeus) crops in Scotland // Plant Dis. 2001. Vol.85. P.985-988.

66. Cheplik S.M., Agrios G.N. Effect of injected antiviral compounds on apple mosaic, scar skin, and dapple apple diseases of apple trees // PI. Dis. 1983. Vol.67. P.1130-1133.

67. Chomczynski P., Sacchi N. Single-step method of RNA isolation by Acid guanidine thiocyanate-phenol-chloroform extraction // Anal. Biochem. 1987. Vol. 162. P.156-159.

68. Cieslinska M., Zawadzka B. Preliminary results of investigation on elimination of viruses from Apple, Pear and Raspberry using thermotherapy and chemotherapy in vitro // Phytopathol. Pol. 1999. Vol. 17. P. 41-48.

69. Clark M.F., Adams A.N. Characteristics of the microplate method of enzyme-linked immunosorbent assay for the detection of plant viruses // Journal of General Virology. 1977. Vol. 34. P.475-483.

70. Converse R.H. Occurrence and some properties of Raspberry Bushy Dwarf Vims in Rubus species in the United States // Phytopathology. 1973. Vol. 63. P.780-783.

71. Converse R.H. Serological detection of viruses in Rubus sap // Acta Hort. 1976. Vol. 66. P.53-62.

72. Converse R.H., Casper R. Raspberry Bushy Dwarf Virus in cultivated Red Raspberry in Germany //Phytopath. 1977. Vol. 89. P. 187-190.

73. Converse R.H., Auger J. Identification of the Tomato Ring Spot Virus (TomRSV) and Raspberry Bushy Dwarf Virus (RBDV) in raspberry in Chile // Fi-topatologia. 1984. Vol. 19, №1. P.22-26.

74. Converse R.H. Virus diseases of small fruits. USD A Agriculture Handbook No631. 1987. 287 p.

75. Credi R., Shier J.L., Stace-Smith R. Occurrence of Raspberry Bushy Dwarf Virus in native thimbleberry in British Columbia // Acta Hort. 1986. Vol. 186. P. 17-22.

76. Crossley S.J., Jacobi V., Adams A.N. 1C-PCR amplification of Apple Stem Grooving Virus isolates and comparison of polymerase and coat protein gene sequences // Acta Hort. 1998. Vol. 472. P.l 13-118.

77. Daubeny H. A., Stace-Smith R., Freeman J.A. The occurrence and some effects of Raspberry Bushy Dwarf Virus in Red Raspberry // Journal of the American Society for Horticultural Science. 1978. Vol.103. P.519-522.

78. Daubeny H.A., Freeman J.A., Stace-Smith R. Effects of Raspberry Bushy Dwarf Vims on Yield and Cane Growth in Susceptible Red Raspberry Cul-tivars // Hort science. 1982. Vol. 17, №4. P.645-647.

79. Dulic-Markovic I., Rankovic M. The occurrence of Raspberry Bushy Dwarf Virus in Willamette raspberry in Yugoslavia // Acta Hort. 1992. Vol. 308. P. 109-112.

80. Ellis M.A., Converse R.H., Williams R.N., Williamson B. Compendium of Raspberry and Blackberry diseases and insects // American Phytopa-thological Society. St. Paul, MN, 1991.

81. Ellis M.A., Kraus J., Martin R.R., Wright S. R. First report of Raspberry Bushy Dwarf Virus in Ohio // Online. Plant Health Progress. 2005. URL: http://www.ars.usda.gov/SP2UserFiles/person/3602/manuscripts/05RBDVQhio.pd f. (дата обращения 21.11.2005).

82. Fry P., Wood R. Two berry fruit diseases newly recorded in New Zealand // N. Z. Journal for Agric. 1978. Vol. 21. P.543-547.

83. Gabova R.N. Virus free pome fruits through meristem tip culture // ActaHortic. 1989. Vol. 235. P.69-76.

84. Gillaspie A.G., Pio-Ribeiro G., Andrade G.P., Pappu H.R. RT-PCR detection of seedborne Cowpea aphid-borne mosaic virus in peanut // Plant Dis. 2001. Vol. 85. P.l 181-1182.

85. Goldbach R. Genome similarities between plant and animal viruses // Micribiol. Sci. 1987. Vol. 4. P. 179-202.

86. Grace aux cultures in vitro, le framboisier regenere // Agri sept. 1986. T.1070. P.23.

87. Guy G.L., Sampson P.Y., McGechan J., Stace-Smith R. Occurrence of viruses in Rubus cultivars and species in Australia // Acta Hort. 1982. Vol.129. P.31-40.

88. Halgren A.B., Tzanetakis I.E., Martin, R.R. Characterization of an aphid-transmitted virus associated with Black Raspberry decline in Oregon // Phytopathology. 2003. Vol. 93. P.32.

89. Hansen A.J. Inhibition of Apple Chlorotic Leaf Spot Virus in Chenopodium quinoa by ribavirin // PI. Dis. Reptr. 1979. Vol. 63. P. 17-20.

90. Hansen A.J., Green L. Potential of ribavirin for tree fruit virus inhibition // ActaHortic. 1982. Vol. 130. P. 183-184.

91. Hansen A.J. Effect of ribavirin on Green Ring Mottle causal agent and Necrotic Rinspot Virus in Prunus species // PI. Dis. 1984. Vol.68. P.216-218.

92. Hansen A.J., Lane W.D. Elimination of Apple Chlorotic Leaf Spot Vims from Apple shoot culture by ribavirin // Plant Dis. 1985. № 69. P.134-135.

93. Hedtrich C.M., Feucht W., Schimmelpfeng H. Pathogeneliminierung und Vermehrung von Himbeeren durch Meristemspitzenkulturen // Erwerbsobstbau. 1980. Bd. 22, № 7. P.159-160.

94. Hepp R.F. Transmission of Raspbeny Bushy Dwarf Virus (RBDV) in Raspberry by propagation via etiolated shoots // Acta Hort. 1998. Vol. 471. P. 6770.

95. Huth W. Kultur von Himbeerpflanzen aus apikalen Meristem // Gar-tenbauwissenschaft. 1979. Bd. 44, N 2. S. 53-55.

96. Janeckova M. Eliminace viru jabloni kombinaci termoterapie in vivo se segmentovymi pupenovymi kulturami in vitro II Ved. Pr. Ovoc. 1995. Vol.14. P. 45-50.

97. Janepkova M., Slobodova L., Mysliveckova J. Destabiliti of Raspberry Bushy Dwarf Virus in Raspberry plants without and/or with virus symptoms by ELISA // Zahradnictvi: Horticultural Science. 1997. Vol. 24. P. 21-23.

98. Jennings D.L., Jones A.T. Futher studies on the occurrence and inheritance of resistance in Red Raspberry to a resistance-breaking strain of Raspberry Bushy Dwarf Virus // Ann. Appl. biol. 1989. Vol. 114, № 2. P. 317-323.

99. Jones A.T. The effects of Black Raspberry Necrosis and Raspberry Bushy Dwarf Viruses in Lloyd George raspberry and their involvement in raspberry bushy dwarf disease // Journal of Horticultural Science. 1979. Vol. 54. P.267-272.

100. Jones A.T. Recent research on virus diseases of Red Raspberry the viruses, their effects and control // Bull. Scot. hort. Res. Inst. Assoc No 19, 1981. P.15-25.

101. Jones A.T., Murant A.F., Jennings D.L., Wood J.A. Association of Raspberry Bushy Dwarf Virus with Raspberry yellows disease: reaction of Rubus species and cultivars, and the inheritance of resistance 11 Ann. appl. Biol. 1982a. Vol. 100. P.135-147.

102. Jones A.T., Badenoch S.J. Recent studies on virus and virus-like diseases of Rubus in Scotland 11 Acta Horticulturae. 19826. Vol. 129. P.49-58.

103. Jones A.T. Advances in the study, detection and control of viruses and virus diseases of Rubus, with particular reference to the United Kingdom // Crop Research. 1986a. Vol. 26, № 2. P.127-171.

104. Jones A.T., Mitchell M.J., Jennings D.L., Gordon S.C. Recent research on viruses and virus-like diseases of Rubus in Scotland И Acta Horticulturae: IV International Symposium on Small Fruit Virus Diseases. 19866. Vol. 186. P.9-16.

105. Jones A.T., Mitchell MJ., Birch A.N.E., Brown D.J.F., Jennings D.L. Recent research on the control of virus infections in Raspberry in Britain // Acta Hort. 1989Vol. 236. P. 81-90.

106. Jones A.T., McGavin W.J., Watkins C.A. Recent studies in Scotland on the aetiology of virus and virus-like diseases of small fruit crops // Acta Hort. 1992. Vol. 308. P.31-36.

107. Jones A.T. Recent developments affecting the control of two important diseases of small fruit crops in the UK // Acta Hort. 19946. Vol.385. P.64-69.

108. Jones A.T., Brown D.J.F., Halbrendt J.M., Vrain T.C., Robbins R.T. The transmission of three Nepoviruses by populations of four Xiphinema ameri-саш/777-group species // Acta Hort. 1995. Vol.385. P. 105-109.

109. Jones A.T., Mayo M.A., Murant A.F. Raspberry bushy dwarf idaeovi-rus // The Plant Viruses: Polyhedral Virions and Bipartite Genomes Ed. Harrison B.D., Murant A.F.. Vol. 5. New York, Plenum Press, 1996. P. 283-301.

110. Jones A.T., McGavin W.J. Infectibility and sensitivity of UK raspberry, blackberry and hybrid berry cultivars to Rubus viruses 11 Ann. appl. Biol. 1998a. Vol. 132, № 2. P. 239-251.

111. Jones A.T., Mayo M.A. Raspberry bushy dwarf idaeovirus // Association of Applied Biologists Descriptions of Plant Viruses, No360. 1998в. P.6.

112. Jones A.T., McGavin V.G., Geering A., Lockhart B.B.L Detection by PCR of viruses in Rubus and Ribes II Acta Horticulturae: VII International Symposium on Small Fruit Virus Diseases. 2001a. Vol. 551. P. 59-63.

113. Jones A.T., McGavin W.J., Birch A.N.E. Some factors influencing the effectiveness of resistance genes to the aphid virus-vector, Amphorophora idaei borner, in Raspberry // Acta Hort. 20016. Vol. 551. P.39-44.

114. Jones A.T., McGavin W.J., Karenlampi S.O., Kokko H. Some properties of variants of Raspberry Bushy Dwarf Virus // Acta Hort. 2001b. Vol. 551. P. 27-32.

115. Jones A.T., McGavin W.J., Geering A.D.W., Lockhart B.E.L. Identification of Rubus Yellow Net Virus as a distinct Badnavirus and its detection by PCR in Rubus species and in aphids // Ann.appl.Biol. 2002a. Vol. 141, № 1. P.l-10.

116. Jones A.T., McGavin W.J. Improved PCR detection of Blackcurrant Reversion Virus in Ribes and further evidence that it is the causal agent of Reversion Disease 11 Plant Dis. 20026. Vol. 86. P. 1333-1338.

117. Jones А.Т., McGavin W.J. Different rates of spread of Raspberry Bushy Dwarf Virus and some aphid-bome viruses into Red Raspberry cultivars containing different resistance genes // Acta Hort. 2004. Vol.656. P. 149-153.

118. Iocco P., Franks Т., Thomas M.R. Genetic transformation of major wine grape cultivars of Vitis vinifera L. // Transgenic Research. 2001. №10. P. 105112.

119. Isac V., Isac M., Mladin P. Viruses occurrence in Raspberry cultivars grown in Romania // Acta Hort. 2004. Vol. 656. P. 171-175.

120. Ishikawa H. Evolution of ribosomal RNA // Сотр. Biochem. Physiol. 1977. №58. P. 1-7.

121. Kaden-Kreuziger D., Lamprecht S., Martin R.R., Jelkmann W. Immu-nocapture polymerase chain reaction assay and ELISA for the detection of Strawberry Mild Yellow Edge associated potexvirus // Acta Hort. 1995. Vol. 385. P.33-38.

122. Karesova R., Janeckova M., Paprstein F. Elimination of Raspberry Bushy Dwarf Virus from Raspberry cv. 'Gatineau' // Acta Hort. 2002. Vol. 585. P. 359-362.

123. Knight V.H., Barbara D.J. Susceptibility of red raspberry varieties to Raspberry Bushy Dwarf Virus and its genetic control // Springer Netherlands. 1981. Vol. 30, № 3. P.803-811.

124. Knight V.H., Barbara, D.J. Raspberry bushy dwarf virus at Hri-East Mailing // New Developments in the Soft Fruit Industry (Ashford International Hotel, 6-7 December 1995). 1995. P. 105-110.

125. Knight V.H., Barbara D.J. A review of Raspberry Bushy Dwarf Virus at Hri-East Mailing and the situation on a sample of commercial holdings in England in 1995 and 1996 // Acta Hort. 1999. Vol. 505. P.263-274.

126. Kokko H., Lemmetty A., Haimi P., Karenlampi S. New host for Raspberry Bushy Dwarf Virus: Arctic Bramble {Rubus arcticus) II European Journal of Plant Pathology. 1996a. Vol. 102, № 7. P. 713-717.

127. Kokko H.I., Kivineva M., Karenlampi S.O. Single-step immunocapture RT-PCR in the detection of Raspberry Bushy Dwarf Virus // Biotechniques. 19966. Vol. 20, №5. P.842-846.

128. Kokko H.I., Karenlampi S.O. Transformation of arctic bramble (Rubus arcticus L.) by Agrobacterium tumefaciens I I Plant Cell Reports. 19986. Vol. 17, №10. P.822-826.

129. Kolber M., Nemeth M., Krizbai L., Szemes M., Kiss-Toth E., Dorgai L., Kalman M. Detectability of Prunus Necrotic Ringspot and Plum Pox Viruses by RT-PCR, multiplex RT-PCR, ELISA and indexing on woody indicators // Acta Hort. 1998. Vol. 472. P.243-248.

130. Koonin E.V., Dolja V.V. Evolution and taxonomy of positive-strand viruses: implications of comparative analysis of amino acid sequences // Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol. 1999. Vol.28. P.375-430.

131. Kooyman P., Engelbrecht D.J., Kasdorf G.F. Isolation of Raspberry Bushy Dwarf Virus from Youngberry in South Africa // Acta Hort. 1982. Vol. 129. P. 59-62.

132. Kovarova M., Draber P. New specificity and yield enhancer of polymerase chain reactions //Nucleic Acids Res. 2000. Vol. 28, № 13. P.70.

133. Kraus J.E., Pinkerton J.N., Martin R.R. Detection of plant viruses in nematode vectors by RT-PCR// Phytopathology. 2004. Vol. 94. P.55.

134. Krogstrup P., Thomsen S.A. Use of meristemtip culture in vitro for elimination of Raspbeny Ringspot Virus (RRSV) in red currant (Ribes rubrum L. cv.Rondom) // In vitro techniques. Propagation and long term storage. Dordrecht etc., 1985. P.79-83.

135. Kubelkova D., Spak J. Transmission of Raspberry Bushy Dwarf Virus by seed of Chenopodium quinoa II Acta Virol. 1998. Vol. 42, № 3. P.195-196.

136. Kudell A.R., Weil B. Studies on host range and symptomatology of Raspberry Bushy Dwarf Virus // J. Phytopathology. 1986. Vol. 115, № 4. P.289-293.

137. Kudell A.R., Buchenauer H. Elimination of Raspberry Bushy Dwarf Virus from axillary bud cultures of Red Raspberry cv. Lloyd George by antiviral compounds // J. Phytopathology. 1989a. Vol. 124. P. 332-336.

138. Kudell A.R. Untersuchungen zum Auftreten und zur Chemotherapie von Raspberry Bushy Dwarf Virus und Apple Mosaic Virus in Rubus idaeus L.: Dissertation. University Hannover, Institut fur Pflanzenkrankheiten und Pflanzenschutz, 19896. 121 p.

139. Lankes C. Elimination of Raspberry Bushy Dwarf Virus // Acta Horticulture: VII International Symposium on Small Fruit Virus Diseases. 1995. Vol. 385. P. 70-75.

140. Legg J.T. A vims degeneration of Loganberry // Report of East Mailing Research Station for 1959. 1960. P.102-103.

141. Lister R.M., Allen W.R., Gonsalves D., Gotlieb A.R., Powell C.A., Stouffer R.F. Lister, R.M. Detection of Tomato Ringspot Vims in apple and peach by ELISA // Acta Hort. 1981. Vol. 94. P.47-56

142. Limasset P., Comuet P. Recherche de virus de la mosaique du tabac dans les meristemes des plantes infectees // C. R. Acad. Sc. Paris. 1949. Vol. 228. P. 1971-1972.

143. Mahler S., Qian M., Martin R.R. Fruit quality of transgenic Meeker raspberry with resistance to raspberry bushy dwarf virus. 20066. http://www.ars.usda.gov/research/publications/publications.htm7seqno 115=1920 15(дата обращения 1.12.2006).

144. Malinowski Т., Komorowska В., Golis Т., Zawadzka В. Detection of Apple Stem Pitting Virus and Pear Vein Yellows Virus using Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction // Acta Hort. 1998. Vol. 472. P.87-96.

145. Marbot S., Kummert J., Salmon M., Vendrame M., Dutrecq O., Le-poivre P. Development of RT-PCR assays using fluorogenic 3' minor groove binder DNA probes for detection of fruit tree viruses // Acta Hort. 2004. Vol. 657. P.547-551.

146. Martin R.R., Converse R.H. An improved buffer for mechanical transmission of viruses from Fragaria and Rubus И Acta Hortic. 1982. Vol. 129. P. 69-74.

147. Martin R.R. Appendix I Recommended procedures for detection of viruses of small fruit crops // Acta Hort. 1998a. Vol.471. P. 115-127.

148. Martin R.R. Raspberry viruses in Oregon, Washington and British Columbia//ActaHort. 19986. Vol. 471. P.71-74.

149. Martin R.R. Raspberry viruses in Oregon, Washington and British Columbia // Acta Horticulturae. 1999. Vol. 505. P.259-262.

150. Martin R.R., Mathews H. Engineering resistance to Raspberry Bushy Dwarf Virus // Acta Horticulturae: IX International Symposium on Small Fruit Virus Diseases. 20016. Vol. 551. P.33-38.

151. Martin R.R. Virus diseases of Rubus and strategies for their control // Acta Horticulturae: VIII International Rubus and Ribes Symposium. 2002. Vol. 585. P. 265-270.

152. Martin R.R., Keller K.E., Mathews H. Development of resistance to Raspberry Bushy Dwarf Virus in 'Meeker' Red Raspberry // Acta Horticulturae. 2004a. Vol. 656. P.186-191.

153. Martin R.R. Looking for viruses in all the right places: new vectors and viruses in small fruit crops // Phytopathology. 20046. Vol. 94. P. 137.

154. Martin R.R. Recommended procedures for detection of viruses of small fruit crops // Acta Horticulturae. 2004b. Vol. 656. P. 222-234.

155. Mavric I., Marn M.V., Koron D. Detection of Raspberry Bushy Dwarf Virus in some Raspberry cultivars in Slovenia // Acta Horticulturae. 2004. Vol. 656. P. 155-158.

156. Mavrodieva V.A., Levy L. Real-time RT-PCR of PPV with RAPID a field-hardened PCR unit for in-field detection // Acta Horticulturae. 2004. Vol. 657. P. 141-147.

157. Mayo M.A., Jolly C.A., Murant A.F., Raschke J.H. Nucleotide sequence of raspbeny bushy dwarf virus RNA-3 // J. gen. Virol. 1991. Vol. 72. P.469-472.

158. Mayo M.A., Jolly C.A., Murant A.F., Raschke J.H. Raspberry bushy dwarf virus mRNA for coat protein, complete cds. GenBank DO 1052. 2007. URL: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/viewer.fcgi?db=nuccore&id=222580 (дата обращения 14.01.2008).

159. Mellor F.C., Stace-Smith R. Influence of heat therapy on rooting of, and elimination of Raspbeny Bushy Dwarf Virus from shoot cuttings of red raspberry // Acta Hort. 1976. Vol. 66. P.63-70.

160. Mellor F.C., Stase-Smith R. Virus-free potatoes by tissue culture // Applied and Fundamental Aspects of Plant Cell, Tissue and Organ Culture Rein-ert J., Bajaj Y.P.S. (eds). Berlin Heidelberg - New York, 1977. P.616-635.

161. Mink G.I. Pollen and Seed-Transmitted Viruses and Viroids // Annual Review of Phytopathology. 1993. Volume 31. P. 375-402.

162. Mumford R.A., Skelton A.L., Boonham N., Posthuma K.I., Kirby M.J., Adams A.N. The improved detection of Strawberry Crinkle Virus using real-time RT-PCR (taqman®) // Acta Hort. 2004. Vol. 656. P.81-86.

163. Murant A.F., Chambers J., Jones A.T. Spread of raspberry bushy dwarf virus by pollination, its association with crumbly fruit, and problems of control // Ann. appl. Biol. 1974. Vol. 77. P.271-281.

164. Murant A.F., Jones A.T. Comparison of isolates of Raspberry Bushy Dwarf Vims from red and black raspberries // Acta Hortic. 1976a. Vol. 66. P.47-52.

165. Murant A.F. Raspberry bushy dwarf virus // Description of Plant Viruses, No. 165. Commonwealth Mycological Institute and the Association of Applied Biologists, UK, 19766. 4 p.

166. Murant A.F., Roberts I.M. Particles of raspberry vein chlorosis virus in the aphid vector Aphis idaei II Acta Hort. 1979. Vol.95. P.31-35.

167. Murant A.F., Jones A.T., Jennings D.L. Problems in the control of raspberry bushy dwarf virus // Acta Horticult. 1982. Vol. 129. P.77-87.

168. Murant A.F., Mayo M.A., Raschke J.H. Some biochemical properties of Raspberry Bushy Dwarf Virus // Acta Horticulture: IV International Symposium on Small Fruit Virus Diseases. 1986. Vol. 186. P.23-30.

169. Murant A.F. Virus Diseases of Small Fruits. Raspberry Bushy Dwarf Virus // USDA Agriculture Handbook No. 631. 1987. 229 p.

170. Murant A.F., Mayo M.A. Virus Taxonomy Classification and Nomenclature of Viruses // 6-th Rept Int. (Committee on Taxonomy of Viruses, Springer-Verlag). Vienna, 1995. 458 p.

171. Natsuaki Т., Mayo M.A., Jolly C.A., Murant A.F. Nucleotide sequence of Raspberry Bushy Dwarf Virus RNA-2: a bicistronic component of a bipartite genome // J. Gen. Virol. 1991. Vol. 72. P.2183-2189.

172. Nyerges К., Kolber M., Elekes M., Kollanyi L., Gordon S.C., Jones A.T. Viruses, virus-like diseases and virus vectors in berryfruit crops in Hungary // Acta Horticulturae. 2001. Vol. 551. P. 65-70.

173. Olmos A., Bertolini E., Gil M., Cambra M. Real-Time RT-PCR for quantitative detection of Plum Pox Virus // Acta Horticulturae. 2004. Vol. 657. P.149-153.

174. Olmos A., Bertolini E., Cambra M. Isothermal amplification for detection of Plum Pox Virus // Acta Hort. 2008. Vol. 781. P. 209-214.

175. Pluta S., Malinowski Т., Kuras A., Zurawicz E. Wykorzystanie metody RT-PCR w hodowli odpornosciowej porzeczki czarnej (Ribes nigrum L.) na rew-ersje // Nowoczesne metody i techniki w hodowli i fizjologii roslin. Warszawa, 2002. Cz.l. S.463-468.

176. Pearson M.N., Clover G.R.G., Guy P.L., Fletcher J.D., Beever RE. A review of the plant virus, viroid and mollicute records for New Zealand // Australasian Plant Pathology. 2005. Vol.35, № 2. P. 217-252.

177. Pesic-VanEsbroeck Z., Fernandez G., Guzman T. Identification of Blackberry Viruses in Southeastern U.S. // 5th congress of plant protection: Plant Protection Society of Serbia. Zlatibor, 2004.

178. Pyott J.L., Converse R.H. In vitro propagation of heat treated Red Raspberry clones //Hort.Science. 1981. № 16. P.308-309.

179. Quaq F. Meristem culture and virus-free plants // Applied and Fundamental Aspects of Plant Cell, Tissue and Organ Culture Reinert J., Bajaj Y.P.S. (eds). Berlin-Heidelberg-New York, 1977. P. 598-615.

180. Rover A., Hedtrich C.M., Feuclit W. In vitro kulturen von himbeer triebspifzen unter dem Aspekt der Virusfreicheit // Erwerbsobstbau. 1979. Bd. 21, № 2. P. 28-30.

181. Saitou N., Nei M. The neighbor-joining method: A new method for reconstructing phylogenetic trees // Molecular Biology and Evolution. 1987. № 4. P.406-425.

182. Schneider W.L., Sherman D.J., Stone A.L., Damsteegt V.D., Frederick R.D. Detection and quantification of Plum Pox Potyvirus in aphid vectors by realtime fluorescent Reverse Transcription-PCR // Acta Horticulturae. 2004. Vol. 657. P.73-84.

183. Schuster G. Der EinfluB von Zytokininen und Verbindungen mit Zyto-kininanaloger Wirkung auf die Vermehrung von Pflanzenviren und mogluche praktische Anwendtingen // Potsdam Forsch. 1983. № 35. S. 127-142.

184. Schwarz K., Jelkmann W. Detection and characterization of European Apple Stem Pitting Virus sources from apple and pear by PCR and partial sequence analysis // Acta Hort. 1998. Vol. 472. P.75-86.

185. Sobczykiewicz D. Elimination of heat-stable Raspberry Vein Chlorosis Virus by meristem culture // Acta Horticulturae: Small fruit vims diseases. 1986. Vol. 186. P.47-49.

186. Spak J. The occurrence of Nepoviruses on raspberries and blackberries in the Czech Republic // Acta Hort. 1995. Vol. 385. P. 117-121.

187. Spak J., Kubelkova D., FIonetslegrova-Franova J. Occurrence of Nepoviruses in Rubus species in the Czech Republic // Acta Virol. 1997. Vol. 41, № 3. P.177-179.V

188. Spak J., Kubelkova D., Jane^kova M. Raspberry Bushy Dwarf Virus in the Czech Republic // Acta Hort. 1998. Vol. 471. P. 75-78.

189. Spak J., Kubelkova D. Identificaton of Raspberry Bushy Dwarf Virus strains occurring in the Czech Republic // Acta Virol. 1999. Vol. 43, № 5. P.335-336.

190. Spak J., Kubelkova D. Epidemiology of Raspberry Bushy Dwarf Virus in the Czech Republic // J.Phytopathol. 2000. Vol. 148, № 6. P.371-377.

191. Spiegel S., Frison E.A., Converse R.H. Recent developments in therapy and virus-detection procedures for International Movement of Clonal Plant Germ Plasm//Plant Dis. 1993. № 12. P.l 176-1180.

192. Spiegel S. Problems associated with in vitro culture propagation and virus detection // Acta Horticulturae. 2006. Vol. 722. P.73-84.

193. Stace-Smith R. Studies on Rubus virus diseases in British Columbia, in Separation of the components of raspberry mosaic // Can. J. Botany. 1956. Vol. 34. P. 435-442.

194. Stace-Smith R., Bristow P.R., Daubeny H.A., Baumann G. Incidence of sap transmitted viruses in experimental and commercial plantings of Red Raspberries // Acta Hort. 1982. Vol. 129. P.91-98.

195. Stace-Smith R. Virus Diseases of Small Fruits // USDA Agriculture Handbook No. 631. 1987. 235 p.

196. Stahler M.M., Lawrence F.J., Martin R.R. Incidence of Raspberry Bushy Dwarf Virus in breeding plots of Red Raspberry // Hort Science. 1995. Vol. 30. № 1. P.113-114.

197. StrikB., Martin, R.R. Raspberry Bushy Dwarf Virus (RBDV) reduces yield of'Marion' Blackberry // Acta Hort. 2002. Vol. 585. P.413-416.

198. Strik В., Martin R.R. Impact of Raspberry Bushy Dwarf virus onr

199. Marion' Blackberry // Plant Disease. 2003. Vol. 87, №3. P.294-296.

200. Tamura K., Dudley J., Nei M., Kumar S. MEGA4: Molecular Evolutionary Genetics Analysis (MEGA) software version 4.0. // Molecular Biology and Evolution. 2007. № 24. P. 1596-1599.

201. Theiler-Hedtrich R., Baumann G. Elimination of Apple Mosaic Virus and Raspberry Bushy Dwarf Virus from infected Red Raspberry (Rubus idaeus L.) by tissue culture //J. Phytopathology. 1989. Vol. 127, №3. P.193-199.

202. Thompson J.R., Wetzel S., Jelkmann W. Pentaplex RT-PCR for the simultaneous detection of four aphid-borne viruses in combination with a plant mRNA specific internal control in Fragaria spp. // Acta Hort. 2004. Vol. 656. P. 51-56.

203. Tsao C-w.V., Postman J.D., Reed B.M. Virus infections reduce in vitro multiplication of «Mailing Landmark» Raspberry // In Vitro Cellular and Development Biology Plant. 2000. Vol. 36, № 1. P. 65-68.

204. Ziegler A., Natsuaki Т., Mayo M.A., Jolly C.A., Murant A.F. The nucleotide sequence of RNA-1 of Raspberry Bushy Dwarf Virus // J. Gen. Virol. 1992. Vol.73. P.3213-3218.

205. Ziegler A., Mayo M.A., Murant A.F. Proposed classification of the bi-partite-genomed Raspberry Bushy Dwarf Idaeovirus, with tripartite-genomed viruses in the family Bromoviridae // Archives of Virology. 1993. Vol. 131, № 3-4. P.483-488.

206. Vertesy J. Experiments on the production of virus-free Raspberry propagation material by meristem culture // Acta Hort. 1979. Vol. 95. P.77-79.

207. Welander M. In vitro of culture of raspberry (R. idaeus) for mass propagation // J. Horticultures Science. 1985. Vol. 60, № 4. P. 493-499.

208. Wood N.T., McGavin W.J., Mayo M.A., Jones A.T. Studies on a putative second gene in RNA-1 of Raspberry Bushy Dwarf Vims // Acta Hort. 2001a. Vol. 551. P. 19-22.

209. Wood G.A., Hall H.K. Source of Raspberry Bushy Dwarf Virus m Rubus in New Zealand, and the infectibility of some newer cultivars to this vims // N. Z. J. Crop hortic. Sc. 20016. Vol. 29, № 3. P. 177-186.

210. Wood G.A. Further investigations of Raspberry Bushy Dwarf Virus in New Zealand // New Zealand Journal of Crop and Horticultural Science. 1995. Vol. 23. P.273-281.

211. Yardimci N., Qevik В., Eryigit H. Detection of Apple Mosaic Virus on Apple cultivars growing in south-west turkey by ELISA and RT-PCR methods // Acta Hort. 2008. Vol. 781. P.561-565.

212. Young M., Willits D., Masaki Uchida, Trevor D. Plant Vimses as Bio-templates for Materials and Their Use in Nanotechnology // Annual Review of Phytopathology. 2008. Vol. 46. P. 361-384.

Информация о работе

Немцова, Елена Валентиновна
кандидата биологических наук
Брянск, 2009
ВАК 03.00.23

Диссертация

Оптимизация диагностики вируса кустистой карликовости малины методом RT-PCR - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы