Определение видовой принадлежности клеточных культур методами молекулярно-генетического анализа

Кулешов, Константин Валерьевич

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Определение видовой принадлежности клеточных культур методами молекулярно-генетического анализа
ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Определение видовой принадлежности клеточных культур методами молекулярно-генетического анализа"

Кулешов Константин Валерьевич

ОПРЕДЕЛЕНИЕ ВИДОВОЙ ПРИНАДЛЕЖНОСТИ КЛЕТОЧНЫХ КУЛЬТУР МЕТОДАМИ МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКОГО АНАЛИЗА

Специальность 03.00.23 - биотехнология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

2 8 *2003

003471360

Кулешов Константин Валерьевич

ОПРЕДЕЛЕНИЕ ВИДОВОЙ ПРИНАДЛЕЖНОСТИ КЛЕТОЧНЫХ КУЛЬТУР МЕТОДАМИ МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКОГО АНАЛИЗА

Специальность 03.00.23 - биотехнология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Работа выполнена в отделе клеточной биотехнологии ГНУ Всероссийского научно-исследовательского института экспериментальной ветеринарии (ВИЭВ) имени Я.Р. Коваленко

Научный руководитель:

Лауреат премии Совета Министров СССР, заслуженный деятель науки РФ, доктор биологических наук, профессор Дьяконов Лев Петрович

Официальные оппоненты:

Доктор биологических наук, профессор Кузнецова Светлана Владимировна Доктор биологических наук Набережный Александр Дмитриевич

Ведущая организация:

ФГОУ ВПО Московская Государственная Академия ветеринарной медицины и биотехнологии (МГАВМиБ) имени К.И. Скрябина

Защита состоится «18» июня 2009 в 10— часов на заседании диссертационного совета Д 006.069.01 во Всероссийском научно-исследовательском и технологическом институте биологической промышленности РАСХН (ВНИТИБП) по адресу: 141142, Московская область, Щелковский район, п/о Кашинцево, пос. Биокомбинат.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВНИТИБП

Автореферат разослан «18» мая 2009 г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

кандидат биологических наук

Ю.Д. Фролов

Общая характеристика работы

Актуальность темы

Культуры клеток получили широкое распространение и применение в самых разнообразных областях экспериментальной биологии и медицины для изучения и решения кардинальных проблем общей и частной вирусологии, онкологии, биохимии, биотехнологии и т.д. Чистота и точная характеристика используемой модели, которой во многих случаях служат постоянные клеточные культуры, являются абсолютно необходимым условием работы и требуют их надежной идентификации. Разработка методов идентификации клеточных культур предполагает определение и изучение стабильных клеточных признаков.

Проблема идентификации клеток, в частности видовой, в культуре стала очевидной еще в 50-60-е годы XX века, когда при анализе хромосомных наборов и видоспе-цифических антигенов ряда клеточных линий человека и животных были выявлены случаи межвидовой клеточной контаминации. В большинстве случаев контаминация происходила клетками Hela и L (Gartier, 1968).

Для решения данной проблемы разработан ряд методов, основанных на кариоло-гическом анализе, изучении полиморфизма изоферментов и иммунологическом исследовании клеточных культур (Nelson-Rees et al., 1974; O'Brien et al., 1980; Stulberg et al., 1976). С использованием предложенных подходов было показано широкое распространение явления межвидовой и внутривидовой клеточной контаминации во многих лабораториях (Drexler et al., 1999; Freshney, 2008; Mowles and Doyle, 1990; Novokhatskii et al., 1980; Rojas et al., 2008; Stacey, 2000; Stacey et al., 1991).

Однако, длительность проведения анализа и необходимость глубоких профессиональных навыков при исследовании кариотипа и спектра изоферментов клеточной линии делают эти методы анализа трудоемкими и сложными для интерпритации. Невозможность стандартизации этапов анализа и последующего сравнения результатов между лабораториями затрудняет применение их в повседневной практике.

В последнее десятилетие широкое распространение получили молекулярно-генетические методы идентификации биологических объектов. Наиболее известным и эффективным стал метод полимеразной цепной реакции (ПЦР). Принцип ПЦР основан на многократном умножении исследуемой части генома с последующей детекцией продукта с использованием различных методик. Время анализа снижается до од-

ного дня, а эффективность превосходит традиционные методы идентификации клеток в культуре.

Существует ряд аналитических систем для видовой идентификации биологического материала на основе ПЦР. Но их высокая стоимость и узкий спектр идентифицируемых видов животных являются существенным препятствием для широкого применения в области сертификации клеточных культур. В связи с этим становится актуальным и необходимым разрабатывать новые и адаптировать уже имеющиеся методики определения видовой принадлежности длительно-перевиваемых клеточных культур.

Цель и задачи исследования.

Целью работы являлось совершенствование методов определения видовой принадлежности клеточных культур.

Для достижения поставленной цели было необходимо решить следующие задачи:

1. Оценить стабильность и информативность участков генов цитохрома b (cytb) и субъединицы I цитохром-с-оксидазы (COI) митохондриальной ДНК (мтДНК) клеточных культур с целью последующего использования их в качестве основной мишени в видоспецифичной ПЦР.

2. Сконструировать видоспецифичные олигонуклеотидные праймеры и зонды к нук-леотидным последовательностям гена cytb и COI для идентификации видов животных, клеточные культуры от которых наиболее распространены в специализированных Коллекциях.

3. На основе сконструированных праймеров и зондов разработать методику видоспецифичной ПЦР в реальном времени (вПЦР-РВ) с использованием мультиплексного формата реакции. Оценить специфичность и чувствительность разработанной вПЦР-РВ.

4. Провести цитогенетический анализ клеточных культур разного видового происхождения и сравнить с данными молекулярно-генетического анализа.

5. С помощью вПЦР-РВ и секвенирования участков генов cytb и COI провести видовую идентификацию клеточных культур в специализированных Коллекциях.

Научная новизна

1. Впервые разработана методика на основе ПЦР в режиме реального времени для идентификации 13-ти видов млекопитающих, клеточные культуры от которых наиболее распространены в различных специализированных коллекциях и научно-исследовательских институтах.

2. Адаптирована методика на основе секвенирования участков генов цитохрома b (icytb) и субъединицы I цитохром-с-оксидазы (COI) митохондриальной ДНК (мтДНК) для паспортизации и сертификации культур клеток, полученных от экзотических видов животных.

3. Впервые методами вПЦР-РВ проведен анализ видовой принадлежности 52-х клеточных культур полученных от 20-ти различных видов животных, депонированных в двух специализированных коллекциях: «Коллекция перевиваемых соматических клеточных культур сельскохозяйственных и промысловых животных» Всероссийского института экспериментальной ветеринарии им. Я.Р. Коваленко РАСХН и «Коллекция перевиваемых соматических клеток позвоночных» НИИ Вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН.

Практическая значимость работы

1. Методика вПЦР-РВ предложена в качестве наиболее эффективного подхода для периодического контроля клеточных культур на предмет соответствия исходной видовой принадлежности и возможной контаминации клетками другого вида.

2. Высокая аналитическая чувствительность, специфичность и универсальность по отношению к анализируемому материалу позволяет расширить область применения и использовать данную методику для видовой идентификации широкого спектра биологических объектов.

3. Дополнительное использование подхода на основе секвенирования участков мтДНК при помощи универсальных праймеров, позволяет значительно расширить спектр идентифицируемых видов животных.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Стабильность и сохранение их информативности участков генов мтДНК cytb и COI в условиях длительного культивирования in vitro и использования их в целях видовой идентификации клеточных культур.

2. Разработка методики видовой идентификации клеточных культур с использованием вПЦР-РВ.

3. Сравнительная оценка результатов кариологического анализа и вПЦР-РВ.

4. Использование вПЦР-РВ и секвенирования участков мтДНК для мониторинга и скрининга на видовую принадлежность клеточных культур, полученных от разных видов животных.

Апробация

Результаты диссертационной работы доложены и обсуждены на Международной конференции «Современные достижения и проблемы биотехнологии сельскохозяйственных животных: роль нанотехнологий в реализации приоритетных задач биотехнологии» (Дубровицы, 2008 г.); Школе-конференции молодых ученых «Методы культивирования клеток» (Санкт-Петербург, октябрь 2008 г.); Секции «Ветеринарная биотехнология» Отделения ветеринарной медицины РАСХН, 2008; 12-ой Путинской международной школе-конференции молодых ученых (Пущино, 2008 г.); межлабораторном совещании научных сотрудников ВИЭВ (2009 г.). Публикации

По теме диссертационной работы опубликовано 6 научных работ, в том числе 2 публикации в журналах, рекомендованных ВАК РФ. Объем и структура работы

Диссертационная работа изложена на 150 страницах и включает введение, обзор литературы, собственные исследования, обсуждение, выводы, практические предложения, список литературы и приложения. Материалы диссертации иллюстрированы 14 таблицами, 32 рисунками. Список литературы включает 190 публикаций, в том числе 162 иностранных. Личный вклад соискателя

Представленная диссертационная работа является результатом собственных научных исследований автора.

Работа с культурами клеток и цитогенетический анализ выполнялись на базе Всероссийского НИИ экспериментальной ветеринарии им. Я.Р. Коваленко РАСХН, отдел клеточной биотехнологии, зав. отделом д.б.н., профессор Л.П. Дьяконов. Разработка и апробация методики ПЦР-РВ и секвенирования выполнялась на базе лабо-

ратории механизма гибели опухолевых клеток ГУ РОНЦ им. Н.Н.Блохина РАМН, зав. лабораторией д.м.н., A.A. Штиль.

Автор выражает благодарность за участие в выполнении отдельных фрагментов диссертации сотрудникам ВИЭВ РАСХН: к.б.н. Т.В. Гальнбек, к.б.н. Е.А. Завьяловой, к.б.н. Н.Ф. Ломакиной; сотрудникам ВИЖ РАСХН: д.б.н. П.М. Кленовицкому; к.б.н. Гладырь Е.А.; сотрудникам НИИ Канцерогенеза ГУ РОНЦ им. Н.Н.Блохина РАМН: д.м.н. A.A. Штилю, д.б.н. Г.М. Волгаревой, к.б.н. О.Ю. Сусовой; сотрудникам НИИ Вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН: д.б.н. Подчерняевой Р.Я., Гринке-вич О.М..

Собственные исследования

Материалы

Клеточные культуры. Объектом исследования являлись 52 клеточные культуры и их отвивки, которые были представлены 48-ю наименованиями от 20-ти различных видов животных. Из них 29 клеточных культур из «Коллекции перевиваемых соматических клеточных культур сельскохозяйственных и промысловых животных» (СХЖ РАСН) Всероссийского НИИ экспериментальной ветеринарии им. Я.Р. Коваленко РАСХН, руководитель коллекции проф. Дьяконов Л.П., 23 клеточные культуры любезно предоставлены руководителем «Коллекции перевиваемых соматических клеток позвоночных» д.б.н., проф. Подчерняева Р.Я. Клеточные линии К562, НСТ-116 и CV любезно предоставлены д.м.н. A.A. Штилем (НИИ Канцерогенеза ГУ РОНЦ им. Н.Н.Блохина РАМН).

Образцы тканей. В качестве контрольных образцов при оценке специфичности ПЦР-реакции использовали экстракты ДНК, полученные из тканей различных видов и пород животных.

Методы

Культивирование клеточных линий. Культивирование клеток млекопитающих проводили в питательных средах (Игла MEM, RPMI 1640, DMEM, 199 среда и др.) с добавлением 10% сыворотки крови крупного рогатого скота в монослое или суспензии в соответствии паспортным данным на культуру клеток. Для замораживания клеток использовали питательную среду для культивирования с добавлением 10% сыворотки крови крупного рогатого скота и 10% диметифсульфоксида.

Цитогенетический анализ. Хромосомные препараты готовили по методу Moorhead и др. (1960). Для окраски препаратов использовали готовый краситель азур-эозин по Романовскому-Гимза (ПанЭко, Россия). Для окраски на G-полосы использовали методику «трипсин-Гимза», предложенную Seabright (1971).

Молекулярно-генетические методы анализа.

Олигонуклеотиды. Праймеры синтезированы в лаборатории компании «Литех» (Москва) с помощью стандартного фосфитамидного метода и выделены с помощью обращено-фазовой ВЭЖХ. Зонды с конъюгированными флуоресцеинами (карбоксиф-луоресцеин (FAM), 6-карбоксиродамин (R6G) и карбокси-Х-родамин (ROX)) и тушителями синтезированы в лаборатории Института биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН.

Выделение ДНК из образцов тканей и суспензии культуры клеток животных проводили коммерческими наборами «ДНК-сорб-В» и «Рибо-преп», соответственно («Амплисенс», Россия).

Полимеразную цепную реакцию проводили в микропробирках объемом 0,6 и 0,2 мл на программируемых термоциклерах Терцик («ДНК-технология», Россия), RotorGene 6000 (Corbett Research, Австралия), используя смесь дезоксирибонуклео-тидтрифосфатов (дНТФ), TaqF ДНК-полимеразу и 5-кратный ПЦР-буфер (15мМ MgCl2) («Амплисенс», Россия). В ПЦР-буфере не содержалось бычьего сывороточного альбумина (БСА).

В случае электрофоретического анализа продуктов амплификации использовали 1,5 - 4%-ный агарозный гель с добавлением бромистого этидия (0,5 мкг\мл). Для документирования полученных результатов гелевые пластинки сканировали с помощью системы «GelDoc 2000» («BioRad», США).

Определение первичной структуры участков мтДНК. Для амплификации и определения 650-нуклеотидной последовательности 5' - концевого участка COI гена мтДНК использованы праймеры VFl tl, VRl tl, M13F (-21), M13R (-27) предложенные, Ivanova et al. (2007), для участка гена cytb использовали праймеры L14724 и HI5149 предложенные Irwin (1991). Секвенирование проводили на автоматическом секвенаторе «ABI PRISM 3100 Genetic Analyzer» с использованием набора «BigDye v. 3.1. Terminator».

Программное обеспечение. Для анализа использовали нуклеотидные последовательности митохондриальной ДНК разных видов животных депонированных в базах данных Genbank (www.ncbi.nlm.nih.gov) и BOLD (www.barcodinglife.org). Для подбора специфических праймеров и зондов использовали пакет прикладных программ Vector NTI 10 и PrimerSelect. Анализ и множественное выравнивание нуклеотидных последовательностей мтДНК проводили по методу Clustaw X программы BioEdit и DNA Star. Анализ вторичных структур праймеров и зондов осуществляли при помощи интернет-программы «MFold» (http://eu.idtdna.com).

Статистическая обработка данных. Определение среднего арифметического значения, среднего квадратичного (стандартного) отклонения, ошибки средней арифметической и абсолютной вероятной погрешности проводили при помощи Microsoft Office Excel, 2007.

Результаты исследований

Оценка изменчивости участков генов cytb и COI клеточных культур разного видового происхождения, культивируемых in vitro

Важным критерием выбора нуклеотидной последовательности с целью идентификации клеток является сохранение её стабильности в условиях длительного культивирования in vitro. Для разработки видоспецифической ПЦР нами были выбраны участки генов cytb и COI, поэтому для последующего использования их в качестве диагностических мишеней необходимым являлся предварительный анализ их изменчивости на уровне первичной структуры ДНК.

Для решения данной задачи была сформирована выборка образцов клеточных культур (К562, НСТ-116, CV, Vero, СПЭВ, MDBK, ЛЭК, Р02, ЭКЛ, MDCK, FS, Ь,29, ВНК-21, С6, RK-13, СНО-К1), которые имели разное тканевое, органное, видовое происхождение и время существования (табл.1). Данные каталогов указывают, что клеточные линии были получены в период с 1950-х гг. до 1990-е гг. и, следовательно, длительное время существовали в искусственных условиях.

Методом секвенирования ДНК для клеточных культур были определены нуклеотидные последовательности участков генов cytb и COI, которые сравнивали с существующими последовательностями в базе данных Genbank, полученными из нормаль ных

Гомология иуклеотидиых последовательностей участков генов COI и cytb с существующими последовательностями в Genbank

№ Клеточная Органное происхожде- Год полу- Идентифицируемый Гомология GenBank1 Гомология GenBank1

п/п культура ние чения вид COI, % cytb, %

1 К562 миелогенная лейкемия 1963 человек 99,85 AY495272 99 EF645646

2 НСТ-116 рак толстой кишки 1981 человек 100 DQ304902 100 EF495218

3 CV почка взрослого 1964 зел. афр. мартышка 100 NC007009 100 NC008066

4 Vero почка взрослого 1962 зел. афр. мартышка 100 AY863426 99,3 AB495294

5 СПЭВ почка эмбриона 1960 свинья 100 DQ274110 100 AY237520

6 MDBK почка эмбриона 1958 корова 100 NC006853 100 EU177862

7 ЛЭК почка эмбриона 1985 корова 100 DQ1243 76 100 EU177861

8 ро2 почка эмбриона 1972 овца 100 EF490457 100 DQ097415

9 экл кожа эмбриона 1983 лошадь 98,9 NC001640 100 NC001640

10 MDCK почка эмбриона 1958 собака 100 AG08151 100 DQ480495

И FS селезенка эмбриона 1997 кошка 99 NC001700 99 AB194817

12 L929 фибробласты 1948 мышь 100 АВ042809 100 FJ374665

13 ВНК-21 почка эмбриона 1986 сирийский хомячок 99,5 U97674 100 AJ973379

14 С« глиобластома 1968 крыса 100 AY769440 100 AB033713

15 RK-13 почка эмбриона 1963 кролик 100 AJ001588 100 AY292717

16 СНО-К1 яичник 1965 китайский хомячок 99 NC007936 100 AJ633758

1 - номер последовательности в базе данных ОепВапк, которая наиболее гомологична полученной в ходе секвенирования.

тканей животных. Длина секвенированной последовательности для участка гена С01 составляла в среднем 640 нуклеотидов, в то время как длина участка гена суЛ -440 нуклеотидов. Оценка полученных последовательностей на принадлежность к псевдогенам, показала их соответствие кодирующему участку мтДНК. Стол-кодонов, делеций, инсерций и значительной гетероплазии исследуемых участков не выявлено. В среднем, гомология полученных нуклеотидных последовательностей с уже существующими в базе ОепВапк составила 99%, что говорит о стабильности данных участков независимо от происхождения и времени культивирования.

Разработка методики определения видовой принадлежности клеточных культур на основе вПЦР-РВ

Исследования по разработке методики для видовой идентификации клеточных культур включали следующие этапы: подбор видоспецифичных праймеров и зондов; выбор оптимальных условий проведения вПЦР-РВ в мультиплексном формате реакции для одновременной идентификации ДНК двух видов животных в одной реакционной смеси; оценка чувствительности и специфичности разработанной мультиплексной вПЦР-РВ.

Выбор видоспецифичных прагшеров и зондов

Анализ литературных данных и каталогов различных специализированных коллекций показал, что наиболее распространенными являются клеточные культуры полученные от 13-ти видов животных, а именно от человека, мыши, крысы, китайского хомячка, сирийского хомячка, зеленной африканской мартышки, коровы, свиньи, кролика, собаки, кошки, овцы и лошади. Поэтому было необходимо сконструировать видоспе-цифические праймеры и зонды для их идентификации. С целью подбора видоспеци-фических олигонуклеотидов было использовано около 600 нуклеотидных последовательностей генов суЛ и С01, относящихся к более, чем к 20-ти видам животных. Для каждого вида животного анализировали от 4-х до 30-ти последовательностей. Для исключения внутривидового полиморфизма в области расположения диагностических праймеров и зондов были созданы «консенсусные» последовательности. Дальнейший анализ «консенсусных» последовательностей позволил выбрать консервативные области внутри вида, которые при этом отличались среди разных видов животных. Таким образом, для идентификации клеток коровы и овцы была выбрана область гена суЛ. В то время как для идентификации клеток человека, мыши, крысы, китайского

хомячка, сирийского хомячка, зеленной африканской мартышки, свиньи, кролика, собаки, кошки, и лошади использовалась область гена COI. К данным участкам были подобраны видоспецифические праймеры и зонды (таб. 2, 3). В качестве внутреннего контроля исследуемого образца служил консервативный участок 18S рибосомальной ДНК, который высокогомологичен среди эукариот.

Вторичная структура большинства подобранных зондов, рассчитанная с помощью интернет-программы Mfold, соответствовала линейному типу Taq-man.

Разработка и оптимизация мультиплексной вПЦР-РВ.

Для упрощения процедуры анализа при скрининге определенной клеточной культуры на видовую принадлежность к 13-ти видам животных, а также исключения возможной межвидовой клеточной контаминации, нами было разработано 7 мультиплексных смесей в формате вПЦР-РВ. При этом с использованием одной ПЦР-смеси возможна одновременная идентификация 2-х видов животных за счет использования зондов с различными флуоресцентными красителями.

Определение оптимальных условий проведения мультиплексной вПЦР-РВ осуществляли на амплификаторе RotorGene 6000, изменяя один или несколько из указанных ниже параметров: температура отжига праймеров (от 58°С до 65°С); концентрация праймеров и зондов (от 1 до 6 пмоль на 25 мкл); время каждого шага амплификации (от 10 до 60 сек.). При этом концентрацию остальных компонентов реакции (200 мкМ каждого дНТФ, 1х ПЦР-буфер (без БСА) и 3 ед. TaqF-полимеразы) не изменяли. Для проведения ПЦР был использован принцип «горячего старта» за счет инактивирован-ной TaqF-полимеразы.

В результате проведенных экспериментов выбран оптимальный температурный профиль амплификации: активация TaqF-полимеразы - 95°С 15 мин.; I этап (без учёта флуоресцентного сигнала) - 5 раундов: 95°С-20 сек., 60°С-20 сек., 72°С - 20 сек.; II этап - 40 раундов: 95°С-20 сек., 60°С-20 сек. (учет флуоресцентного сигнала), 72°С -20 сек. Учет результатов осуществляли отдельно по каждому из каналов, в соответствии с инструкцией к прибору.

На основании полученных результатов, для разработанной вПЦР-РВ определено значение пороговой линии для всех каналов (FAM, R6G, ROX), которое составило 0,05. Подобранные концентрации олигонуклеотидов и их сочетания в ПЦР-смеси приведены в таблице 4.

Последовательности впдоспецнфичных праймеров н длина амплнфнцпруемого продукта

Вид животного Названия праймеров Последовательность нуклеотндов (5'-3') Длина ампли-кона, и.о.

Sus scrofa (свинья) Ss-F CTA-CTT-CTA-CTA-TCC-CTG-CCA-GTT 460

Ss-R GGT-GAA-TAG-GAA-GAT-GAA-GCC-C

Homo sapiens (человек) Hs-F ACA-TCG-TAC-TAC-ACG-ACA-CG 391

Hs-R ACT-CCA-GGT-TTA-TGG-AGG-GTT-C

Felis catus (кошка) Fc-F TGC-CAT-TCC-TAC-CGG-GGT-G 341

Fc-R TAT-ATT-GAC-TCC-TAC-AAA-CAT-AAT-C

Ovis aries (овца) Oa-F CCT-AAT-CCT-CAC-ATT-CCT-AGT-GGT-AGT-A A 169

Oa-R TAA-TGA-TGT-CGA-GGT-ATT-CAA-CTG-GCT-G(j

Equus caballus (лошадь) Ec-F AAC-TGC-CCT-AAG-CCT-CCT-AAT 243

Ec-R AGA-AGA-AGT-AGG-AAT-GAT-GGG-GG

Ccreopitheeus acthiops (зеленая мартышка) Ca-F CTT-CTT-TCC-TGC-TGC-TAA-TG 222

Ca-R TTT-GAT-ACT-GGG-ATA-TGG-CG

Canis familiaris (собака) Cf-F CTA-GGT-CAG-CCC-GGT-ACT-T 172

Cf-R TCG-GGG-GAA-TGC-CAT-GTC-C

Oryctolagus cuniculus (кролик) Oc-F GGA-CGC-CTA-TAC-AAT-ATG-AAA-TAC-TGT-T 136

Oc-R GGT-TTG-TGG-TTG-TTA-GTT-CAA-TAG-TCT

Bos taurus (корова) Bt-F GTC-CTT-CCA-TGT-AGC-ATC-ATA-AG-A 675

Bt-R GCT-TCT-TCC-TTC-AGT-CTT-AGG-AGC-TT

Cricetulus griscus (китайский хомяк) Cg-F GGA-TTT-GGG-AAT-TGA-TTA-GTG-CCT-T 326

Cg-R GAA-CTG-GTA-GGG-ATA-AGA-GTA-ATA-GC

Mesocricetus auratus (золотистый хомяк) Ma-F AGC-ATC-TTA-ATT-CGA-GCA-GAG-CTT-AA 604

Ma-R GAA-GCC-CGG-TAG-GAT-TAA-GAT-GTA

Rattus norvégiens (крыса) Rn-F CGG-CCA-CCC-AGA-AGT-GTA-CAT-C 196

Rn-R GGC-TCG-GGT-GTC-TAC-ATC-TAG-G

Mus niusculus (мышь) Mm-F GAA-TTA-GGT-CAA-CCA-GGT-GCA-CTT-T 237

Mm-R CTA-CTA-TTG-ATG-ATG-CTA-GGA-GAA-GG

BK (внутренний контроль) IC-F ACC-CAT-TCG-AAC-GTC-TGC-CCT 143

IC-R CGC-GCC-TGC-TGC-CTT-CCT

Чонды

№ п\п Название зонда Последовательность нуклеотидов (5'-3) Длина, и.о.

1 КбС-ТСС-АОС-АОО-ТОС-ТСО-АОА-ССС-Т -В НО1 22

2 осгг КОХ - АОА-АОС-СТТ-СОС-СТС-ААЛ-ЛСС-АаА-ВНС) 1 24

3 сш К6О-ТСТ-САТ-СОТ-ЛАС-ССС-ССА-ТСС-Т-ВН01 22

4 Есгз [16О-СОТ-ССТ-ОАА-ТТА-ССС-САЛ-ССТ-СС-ВН01 23

5 РАМ-СТС-ССС-СТА-ТСС-ССА-АТС-ССС-ВН(31 21

6 В1/Л К6С-СО-СОТ-АСТ-АСА-САС-СТС-САА-АСА-ССО-О-ВН01 28

7 ОлХ1 РАМ-САО-СГО-СОТ-АСА-ТСА-АТС-САА-ССС-АОа-ВНд1 27

8 Мт/Л РАМ-СОТ-ООО-ААТ-ССТ-АТА-ТСТ-СОО-С- ВНСН 22

9 (Ж/Л К6С- ССА-АСС-ТСС-ТСС-АТО-ОСС-ТАО-АТ- ВН01 23

10 МаТ1 ГЮХ- АТС-ТСС-ТСС-ТСС-ООС-АСС-АТС-О - ВН01 22

11 1<п22 К60- ССА-ССО-ТТТ-ООА-АТГ-АТТ-ТСЛ-САТ-ОТЛ-а - внсл 28

12 Саг1 ГЮХ СаС-ССО-ААС-ЛСС-ТТО-ААС-ООТ-АТ-ВНд 1 23

13 Гс/Л КОХ - АСС-ОТА-ООА-ОСС-СТА-АСС-ССА-А-ВПО1 22

14 1сг1 1'АМ-ЛСС'-СОТ-ТТС-ТСА-аСС-ТСС-СТС-Т-ВН01 22

Таблица 4

Мультиплексные ПЦР смеси

Л» Название мультиплексной смеси Идентифицируемые виды животных

ГАМ И6С иох

1 Ш-вз человек (2/2/1)' свинья (8/8/3) -

2 СГ-Ос собака (6/6/3) кролик (6/6/3)

3 Гс-1с ВК (6/6/3) . кошка (3/3/1,5)

4 В1-Оа овца (6/6/3) корова (7,5/7,5/3) -

5 Ес-Са - лошадь (7,5/7,5/1,5) мартышка (6/6/3)

6 Мпш5-Сё мышь (5/5/2,5) сирийский хомяк (6/6/3)

7 Ип-Ма - крыса (5/5/2,5) золотистый хомяк (4,5/4,5/1,5)

Изучение чувствительности разработанной вПЦР-РВ

Чувствительность методики определялась как минимально детектируемое количество клеток, как в чистой культуре, так и в смеси с высоким количеством посторонних клеток. В качестве объекта исследования были использованы клеточные культуры 13-ти разных видов животных: К562, СУ, А4С2, МОВК, Р02, ЕК1, МБСК, РБ, 1.929, ВНК-21, С6, ЛК-13, СНО-К1. Чувствительность оценивали на основе последовательных десятикратных разведений суспензии клеток каждой из культур в пита-

1 -концентрации олигонуклеотидов в мультиплексных ПЦР смесях (прямой праймер, пмоль / обратный прай-мер, пмоль / зонд, пмоль) (концентрации олигонуклеотидов на 25 мкл реакционной ПЦР-смеси).

тельной среде с последующим выделением ДНК из 0,1 мл пробы в 5-и повторах и тестированием с помощью вПЦР-РВ. По результатам исследования чувствительность методики для идентификации разных видов животных составила не менее 1-ой клетки в пробе.

Так же была оценена чувствительность разработанной методики при идентификации клеток в смеси. Для этого были приготовлены смеси клеток каждой из вышеперечисленных клеточных культур с концентрацией 0,001%, 0,01%, 0,1% в пробе, что соответствует 1, 10 и 100 клеткам, содержащихся в 100000 клеток человека (К562) в объеме 0,1 мл. При определении минимальной концентрации клеток человека (К562) в качестве балластной суспензии использовали культуру клеток мыши (Lm). Смеси клеток готовили в объеме 0,5 мл питательной среды с последующим выделением ДНК из 0,1 мл в 5-ти повторах.

Согласно результатам исследования с помощью вПЦР-РВ возможно достоверно идентифицировать наличие от 10 до 100 клеток при одновременном присутствии 100000 посторонних клеток, что составляло 0,01-0,1% .

Изучение специфичности разработанной вПЦР-РВ

Специфичность разработанной вПЦР-РВ была оценена на панели специфичных и гетерологичных экстрактов ДНК из нормальных тканей 20-ти видов животных и их пород. Специфичность также была подтверждена на культурах клеток разного видового происхождения. В результате исследований показана специфичность при идентификации соответствующих образцов и отсутствие флуоресценции при исследовании экстрактов ДНК гетерологичных организмов, при высокой нагрузке. Также было показано отсутствие конкурентного ингибирования в каждой из мультиплексных ПЦР-смесей, что выражалось в сохранении специфичности и чувствительности в случае присутствия двух гомологичных мишеней в разных концентрациях.

Сравнительная оценка кариологического и молекулярно-генетнческого методов определения видовой принадлежности клеточных культур

В качестве объектов для цитогенетического анализа были использованы клеточные культуры, полученные от 6-ти видов млекопитающих: человека (Homo sapiens) -клеточная культура К562; кролика (Or\>ctolagus cuniculus) - клеточная культура RK-13; лошади (Equus cabaïïus) - клеточная культура ЭКЛ; коровы (Bos taunis) - клеточные культуры MDBK и ЛЭК, свиньи (Sus scrofa) - клеточная культура A4xL (межви-

довая гибридная клеточная культура - свинья х лошадь) и А4ХС2 (внутривидовая гибридная клеточная культура - свинья х свинья); собаки (Сяии/атШаш) - МОСК.

Наиболее гетерогенными по присутствию клеток с разным числом хромосом оказались клеточные культуры К562, ЯК-13, ЭКЛ. В них наблюдается значительное смещение модального класса хромосом в сторону три- и тетраплоидизации кариоти-па. Модальный класс хромосом клеточных культур МОСК, А4ХС2 , А^хЬ, ЛЭК и МЭВК был близок к нормальному диплоидному числу хромосом (табл.5).

Таблица 5

Модальный класс и пределы варьирования числа хромосом

Л® п/п Название клеточной культуры Нормальное число хромосом данного вида Пределы варьирования хромосом II модальный класс

1 К562 46 30-140 (64-69)

2 ШС-13 44 35-64(58)

3 А4ХС2 38x38 37-40 (39)

4 А)хЬ 38 х 36-78 (39)

5 экл 64 45-103 (96-103)

6 МДБК 60 45-67 (64)

7 ЛЭК 60 38-51 (46)

8 МБСК 78 79

По результатам исследования в клеточных культурах МЭВК и ЛЭК выявлена высокая частота робертсоновских транслокаций, приводящая к изменению морфологии и числа хромосом. Так, для культуры клеток МОВК. характерны робертсоновские транслокации гетеролитического типа. Напротив, в клетках культуры легкого эмбриона коровы (ЛЭК) характерно равное соотношение транслокаций как гомологичного, так и гетеролитического типа (рис. 1).

Наряду с высокой количественной изменчивостью хромосомного набора, характерного для большинства исследованных клеточных культур, методами рутинного окрашивания с последующей раскладкой и анализа различных морфологических групп хромосом достаточно легко идентифицировались кариотипы человека, кролика и свиньи (Рис. 1 К562, 11К-13, А4ХС2, А4ХЦ.

Ш Щ | § н

II К1 1«$ Ц (III II» ИМ II

а« 1111 а м

ЖШ

К562

«I III «« XXX «» ««* III т щ т Ш IX

1 , I III II Ш м

ик-о

II ш III

¿а Xiit.ir.-sz Ь I а*

** *» щ» *$ _ „

р г> V* » * т. £ » в г

с | #

А4ХС2

б! пщзгг

£ X " ^ * * «я

„ *------ и

и г I-

ЖII 1/"

в ^ II Ц Л Ц

II И

К / £ш й!" 1111 ь

Ц Й! С ^ || г «Г «9 11 г!

1У »)•" 1 II «1 II ш #• II Ц 1 - Г

, - м я< , ( § -, ,1 -. > ~ 1 -, - ~ ^^

мпвк ЛЭК

Рис. 1. Кариотипы клеточных культур К562 (п=64), ЯК-13 (п=58) (Микрофото. ок. х 10. об. х90, окраска по Романовскому-Гимзе); А4ХС 2 (п=39), А(хЬ ,1УШВК, ЛЭК (Микрофото, ок. х 10, об. х90, оркаска на в-полосы). ? - хромосомы не известной природы. (А(хЬ) Кариотип гибридной клетки, а,с - группа хромосом свиньи, Ь,с1 - группа хромосом лошади. (МОВК. ЛЭК) В кариотипах стрелками указаны робертсоновкие транслокации гомологичного типа, квадратной скобкой - гетеролитического.

Рис. 2. Кариотип клеточной культуры ЭКЛ (п=97) (Микрофото, ок. х 10, об. х90, оркаска на G-полосы); MDCK (п=79) метафазная пластинка модального класса хромосом, стрелкой обозначена единственная метацентрическая Х-хромосома встречающаяся во всех метафазах (Микрофото, ок. х 10, об. х90, окраска rio Романовскому-Гимзе). ? - хромосомы не известной природы.

Таким образом, результаты исследования показывают, что in vitro кариотип многих клеточных культур претерпевает значительные количественные изменения, что сильно затрудняет интерпритацию видовой принадлежности некоторых клеточных культур. Результаты проведенного кариологического анализа на предмет видовой принадлежности клеточных культур полностью совпадали с результатами видоспе-цифичной ПЦР-РВ и секвенированием участков генов cytb и СО! мтДНК.

Вместе с тем, методами молекулярно-генетического анализа не удалось подтвердить гибридную природу клеточной культуры A4xL, хотя цитогенетический анализ позволил выявить присутствие некоторых гибридных кариотипов (Рис. 2, A4XL). Отсутствие мтДНК лошади в клеточной культуре A4XL, согласуется с ранее опубликованными данными о потере мтДНК одного из доноров во время гибридизации.

Видовая идентификация культур клеток с использованием вПЦР-РВ и анализа нуклеотидных последовательностей участков генов cytb и COI

Исследовано 73 образца клеточных культур депонированных в двух специализированных коллекциях (табл. 6).

Каждый из образцов клеточной культуры оценивали на видовую принадлежность к каждому из 13-ти видов с использованием разработанной вПЦР-РВ, в том числе исследовали клеточные культуры млекопитающих и рыб (МК-2, РЮтК, ПС, СНН-1, СН5Е-214, ЕРС, ЯТС-2, \VSSK), исходная видовая принадлежность которых не входила в перечень видов идентифицируемых в разработанной вПЦР-РВ. Результаты вПЦР-РВ в случае обнаружения видового несоответствия исследуемой клеточной культуры были подтверждены методами секвенирования участков мтДНК.

Таблица 6

Результаты анализа видовой принадлежности клеточных культур в специализированных коллекциях

«Коллекция перевиваемых соматических клеточных культур сельскохозяйственных и промысловых животных» ВНЭВ «К"оллекция перевиваемых соматических клеток позвоночных» НИИ Вирусологии им. Д.И. Ивановского

Млекопитающие: человек (L41); свинья (А4ХС2, A4XL, J1TC, ДЩС, СПЭВ, 1ЦС); зеленая мартышка (Vero); корова (MDBK, ЛЭК, ЛЭК BM3B-90(ref), ПТ-80); собака (MDCK); кошка (ПК-91, CRFK, FS); овца (FLK, ПОхСО, СЯ, П02); кролик (RK-13, RSK); лошадь (ЭКЛ). Рыбы: кета (СНН-1); чавыча (CHSe-214); карп (ЕРС); радужная форель (RTG-2); белый осётр (WSSK). ' ¡\ [лекопптающие: человек (L41, СН-5, GL-6, GL-6\ Нер-2, Lunet, ЛЭЧ-Т); зеленая мартышка (Vero); макак резус (МК-2, FRhK-4); мышь (ЭПНТ-5, L929); крыса (С6); свинья (СПЭВ, РК-15); корова (MDBK); собака (MDCK); кошка (CRFK, FS); китайский хомяк (СНО-К1); сирийский хомяк (ВНК-21, BSR); сайга (ПС).

14 видов 29 наименований 42 образца 12 видов 23 наименования 31 образец

Выявленные несоответствия

кета (СНН-1) - чавыча (1/1)"; чавыча (СНЭе-214) - черный толстоголов (1/1); карп (ЕРС) - черный толстоголов(1/1); радужная форель ^ТО-2) - синежаберный солнечник(1/1); корова (М1ЭВК) - свинья (1/3); кролик ^8К) - свинья (3/3). человек (GL-6*) - корова( 1 /2); макак резус (МК-2) - мышь(1/1); китайский хомячок (СНО-К1) - человек (2/4).

Согласно результатам исследования с использованием вПЦР-РВ и секвеиирования мтДНК все наименования клеточных культур и их отвивки, которые относились к ви-

* - клеточная культура получена в ходе сотрудничества из другой лаборатории;

- в знаменателе - кол-во отвивок в которых выявлено несоответствие; в числителе - общее число исследованных отвивок данной клеточной культуры.

дам: Ccmis familiaris (собака) (MDCK), Felis catus (кошка) (ПК-91, CRFK, FS), Sus scrofa (свинья) (A4.4C2, A4XL, ЛГС, ДЩС, СПЭВ, ЩС), О vis aries (овца) (FLK, ПОхСО, СЯ, П02), Saïga tatarica (сайга) (ПС), Mesocricetus auratus (сирийский хомячек) (BHK-21, BSR), Mus musculus (мышь) (ЭПНТ-5, L929), Rattus norvégiens (крыса) (C6), соответствовали паспортным данным.

В некоторых клеточных культурах или их отвивках: Homo sapiens (человек), Macacus mulatta (макак резус), Bos taurus (корова), Oryetolagus cuniculus (кролик), Cricelus gricetus (китайский хомяк), Cyprinus carpio (карп), Oncorhynchus tshawytscha (чавыча), Oncorhynchus keta (кета), Oncorhynchus mykiss (радужная форель) были выявлены несоответствия.

Исследование клеток из коллекции перевиваемых соматических клеток позвоночных показало, что среди 8-и исследованных клеточных культур человека одна из от-вивок глиобластомы человека (GL-6*), которая была получена из другой лаборатории в ходе сотрудничества, идентифицировалась, как клетки вида Bos taurus.

При этом анализ отвивки клеточной культуры GL-6, непосредственно депонированной в коллекции, показал полное соответствие клеткам человека. Клетки почки эмбриона макаки резус (МК-2) идентифицировались, как клетки мыши. Исследование 4-х отвивок клеток яичника китайского хомячка (СНО-К1), заложенных в криобанк в разное время показало, что 2 отвивки являлись клетками человека. Клетки остальных 2-ух отвивок соответствовали исходному виду животного.

В «Коллекции перевиваемых соматических клеточных культур сельскохозяйственных и промысловых животных» было выявлено, что одна из ранних отвивок клеток почки эмбриона коровы (MDBK) и все три исследуемые отвивки клеточной культуры кожи кролика (RSK) по видовой принадлежности относились к клеткам свиного происхождения.

Клеточные культуры СНН-1, CHSE-214, RTG-2, WSSK-1, FRhK и ПС в вПЦР-РВ не идентифицировались, поэтому последующий анализ их видовой принадлежности основывался на определении нуклеотидной последовательности участков митохонд-риальных генов cytb и COL

По результатам анализа нуклеотидных последовательностей клетки эмбриона осётра (WSSK-1), почки плода макаки резус (FRhK) и клетки почки сайги (ПС) соответствовали исходной видовой принадлежности. Идентификация клеток почки сайги

основывалась на последовательности участка гена cytb из-за отсутствия последовательностей гена COI.

Анализ клеточных культур разных пассажей, полученных от рыб, показал, что клетки сердца кеты (СНН-1) (Oncorhynchus keta) относились по видовой принадлежности к клеткам чавычи, клетки эмбриона чавычи (CHSE-214) (Oncorhynchus tshawytschá) и клетки эпителиальной папилломы карпа (ЕРС) (Cyprinus carpió) относились к одному виду и идентифицировались, как черный толстоголов, а клеточная культура, полученная из гонад радужной форели (RTG-2) (Oncorhynchus mykiss), относилась к виду синежаберный солнечник (Lepomis macrocliints) (рис. 4).

Полученные нами данные по определению видовой принадлежности клеточной культуры ЕРС соответствуют с недавно обновленными данными каталога американской коллекции типовых культур, где показано, что данная культура относится виду черный толстоголов (ЕРС Кат.№ СRL-2872, 2009 г.).

При изучении истории клеточных линий (СНН-1, CHSE-214, ЕРС, RTG-2) мы не нашли каких-либо данных об их периодической проверке на предмет видового соответствия. Поэтому можно предположить, что при длительной работе исследователей с данными клеточными линиями произошла их контаминация или перепутыва-ние.

• ЕРС

• SHSe

BCFa»0-0«|BCF-0472-SPim«Wak» ргол

_™ ВСРвгвв-ОбрСТ-'МТг-^РтжрПаЬ« ргол

BCFB288-06P CF-0462-3 Piirwphalei рччт

1FO A D203<05|6W-176 3|Су рл ñus carpo BCFB pnn irt c> ipe

BCFBT72-06|BCF.«U9-l|Cyf»inii» carpe BCFB76e-OS)BCF-eM7-21Cypr»i<j« еагрю

27| BCTB60W6|BCF-CC13-3l.»eomr» maeroctv.

2<J- RTG2 MEV) • RTG«2

__122JвСРМИОврсР-ОМвИPapóme таегоеП. lBCF6S07«6|BCF^346-3|Lecome macroch..

fGB GC16 5 >06¡|NC 004713|Acc<ns*r Iraní BCF0n-071BCF-735-HScip«o«wtian$mo.

wss<jvev) «WSSK......

_BCFB94M7|Aa«|Oncorhynchü!

I ВСРвММ7|АаМ(ОпсоЛупсП1> 74j В СУ436^7pCFJX?33»1 |Onc ortry nehus myk i» П BCF444-Q7IBCF-7tt-40ncoítwnchu» my»ii I 6CF442«?|BCF^3M|0»KOitiYnchu» mykiM t &CF&6-Q TJSCF-в f 3-врпеоЛ y nehut t»M

-¡- BCF45 M7IBCF-813-5|Oneoifiynchu* «

4 Ц- В CF« 5^07|BC F-® 13-7| Oftcorhync hj* 1« ,] BCF454-07]BCF-в 13-6|Oncofry nchuí ts> JcHHMEV, • CHH

Pimephalespmmclas {черный толстоголов) Cyprinus carpió (карп)

Lepomis wacrochiriis (синежаберный солнечник)

Acipenser tronsnionianus (белый осетр) Oncorhynchus keta (кета) Oncorhynchus mxkiss (радужная форель)

Oncorhynchus tshmt-yfscha (чавыча)

Рис.4 Фрагмент филогенетического дерева, построенного при анализе последовательностей участка гена С01 клеточных линий для определения видовой принадлежности клеточных культур рыб: ЕРС. 5Н8е, ЯТС-2, СНН, \VSSK. Кластеризация последовательностей в группы, характерных для разных видов животных, подтверждена 100%-ми значениями бут-

стреп-анализа (число повторов 1000). В качестве референтных использованы последовательности, депонированные в базе данных BOLD и Genbank. Группы последовательностей, относящиеся к определенному виду животного, отделены горизонтальными линиями.

Выводы

1. Доказана стабильность и информативность участков генов цитохрома b (cytb) и субъединицы I цитохром-с-оксидазы (COI) мтДНК в качестве генетического маркера для определения видовой принадлежности клеточных культур, полученных от разных видов животных и длительно-культивируемых in vitro.

2. Сконструированы видоспецифические олигонуклеотидные праймеры и зонды для идентификации 13-ти видов млекопитающих на основании анализа около 600 нук-леотидных последовательностей участков генов cytb и COI.

3. На основе сконструированных праймеров и зондов для идентификации 13-ти видов животных разработано 7 мультиплексных тест-систем, с использованием каждой из которых возможна одновременная идентификация 2-х видов животных. Показана специфичность праймеров и зондов на панели специфичных и гетероло-гичных экстрактов ДНК, полученных как непосредственно из тканей животных, так и перевиваемых клеточных культур. Чувствительность метода составляла не менее 10 кл/мл. В случае идентификации примеси клеток методика способна детектировать 10 - 100 клеток определяемого вида животного в присутствии 100000 клеток посторонней культуры.

4. Проведен цитогенетический анализ клеточных культур: человека (К562), кролика (RK-13), лошади (ЭКЛ), КРС (MDBK и ЛЭК), собаки (MDCK), соматических межи внутривидовых гибридов клеток лошадь х свинья (A4XL) и свинья х свинья (А4ХС2), реконструирован кариотип каждой клеточной культуры и подтверждена видовая принадлежность. Показано, что для клеточных культур характерен высокий уровень гетерогенности и анеуплоидия различным парам хромосом. Выявлен высокий уровень робертсоновских транслокаций в клеточных культурах ЛЭК и MDBK. Сравнение результатов кариологического и молекулярно-генетического анализа показало совпадение в интерпретации видовой принадлежности всех исследованных клеточных культур.

5. Проведен анализ 73- образцов клеточных культур, полученных от 20-ти различных видов животных и человека, депонированных в «Коллекции перевиваемых соматических клеточных культур сельскохозяйственных и промысловых животных» Всероссийского НИИ экспериментальной ветеринарии им. Я.Р. Коваленко РАСХН и «Коллекции перевиваемых соматических клеток позвоночных» научно-исследовательского института вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН. В 9-ти наименованиях клеточных культур с использованием методов видоспецифичной ПЦР-РВ и секвенирования участков мтДНК выявлено несоответствие результатов молекулярно-генетического анализа паспортным данным.

Практические предложения

Методические рекомендации по определению видовой принадлежности клеточных культур методом полимеразой цепной реакции с детекцией в реальном времени (ПЦР-РВ): утв. отделением ветеринарной медицины РАСХН 24.11.2008. М. - 19 с. авторы: К.В. Кулешов.

Список опубликованных работ по теме диссертации

1. Методические рекомендации по определению видовой принадлежности клеточных культур методом полимеразой цепной реакции с детекцией в реальном времени (ПЦР-РВ): утв. отделением ветеринарной медицины РАСХН 24.11.2008. М. - 19 с. автор: К.В. Кулешов

2. Кулешов, К. В. Идентификация видовой принадлежности клеток в культуре / Л. П. Дьяконов, Т. В. Гальнбек, К. В. Кулешов//Животная клетка в культуре (Методы и применение в биотехнологии) - М.:КомпанияСпутник+, 2009. -С. 244-255.

3. Кулешов, К. В. Видовая идентификация клеточных культур: разработка новых подходов основанных на полимеразной цепной реакции с детекцией продукта в реальном времени (ПЦР-РВ) / К. В. Кулешов // Ветеринарная патология. -2008. - Том. 26, № 3. - С. 40-45.

4. Кулешов, К. В. Разработка молекулярно-генетических методов видовой идентификации клеточных культур / К. В. Кулешов // Цитология. - 2008. - Том. 50, №9.-С. 812-813.

5. Кулешов, К. В. Видовая идентификации клеточных линий на основе ПЦР в реальном времени (ПЦР-РВ) / К. В. Кулешов, Т. В. Гальнбек // Биология - наука XXI века: 12-я Пущинская международная школа-конференция молодых ученых: тез. докл. науч. конф. 10-14 ноября 2008 г. - Пущино, 2008. - С. 211.

6. Кулешов, К. В. Использование современных молекулярно-генетических методов анализа для идентификации клеточных линий /Кулешов К.В., Дьяконов Л.П.// Современные достижения и проблемы биотехнологии сельскохозяйственных животных, роль нанотехнологий в реализации приоритетных задач биотехнологии: 7-ая международная научная школа-конференция: сборник трудов науч. конф. 23 -24 октября 2008 г. - Дубровицы, 2008. - С. 65-74.

Подписано в печать 14.05.2009 г. Принято в печать 15.05.2009г. Отпечатано 15.05.2009г. Тираж 100 экз. Заказ № 1170 Отпечатано в типографии «АллА Принт» Тел. (495) 621-86-07, факс (495) 621-70-09 www.allaprint.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Кулешов, Константин Валерьевич

Список условных сокращений.

Введение.

Глава 1. Обзор литературы.

1.1. Проблема межвидовой контаминации клеточных культур. >, , |

1.2. Традиционные методы определения видовой принадлежности клеток в культуре.

1.2.1. Изоферментный анализ клеточных культур.

1.2.2. Кариологический анализ.

1.2.2.1. Закономерности изменения кариотипа клеток длительно-культивируемых in vitro.

1.3. Молекулярно-генетические методы видовой идентификации.

1.3.1. Полиморфизм длин рестрикционных фрагментов ДНК (ПДРФ)

1.3.2. ПЦР с использованием произвольных праймеров.

1.3.3. Полиморфизм длин амплифицированных фрагментов.

1.3.4. ПЦР-ПДРФ анализ.

1.3.5. Видоспецифичная ПЦР.

1.3.6. Секвенирование маркерных последовательностей.

Глава 2. Собственные исследования.

2.1. Материалы и методы исследования.

2.1.1 Материалы.

2.1.1.1. Реактивы, препараты и оборудование.

2.1.1.2. Клеточные культуры.

2.1.1.3. Образцы тканей.

2.2.1. Методы.

2.2.1.1. Культивирование и криоконсервация клеточных культур.

2.2.1.2. Кариологический анализ клеточных культур.

2.2.1.2.1. Приготовление кариологических препаратов.

2.2.1.2.2. Рутинная окраска препаратов.

2.2.1.2.3. Окраска на G-полосы.

2.2.1.2.4. Анализ хромосомных препаратов.

2.2.1.3. Молекулярно-генетический анализ видовой принадлежности клеточных культур.

2.2.1.3.1. Выделение ДНК.

2.2.1.3.2. Определение нуклеотидной последовательности участков мтДНК.

2.2.1.3.3. Видоспецифичная ПЦР.

2.2.1.3.4. Электрофорез продуктов ПЦР в агарозном геле.

Глава 3. Результаты исследований.

3.1. Кариологический анализ клеточных культур.

3.1.1. Клетки линии К562 промиелоцентарного лейкоза человека.

3.1.2. Клетки почки кролика, линия RK-13.

3.1.3. Соматический гибрид свиных клеток, линия А4ХС2.

3.1.4. Соматический гибрид клеток свиньи и лошади, линия A4xL.

3.1.5. Клетки кожи лошади, линия ЭКЛ.

3.1.6. Клетки почки коровы, линия MDBK.

3.1.7. Клетки легкого коровы, линия ЛЭК.

3.1.8. Клетки почки собаки, линия MDCK.

3.2. Оценка изменчивости и информативности участков генов cytb и COI в клеточных культурах.

3.3. Разработка методики определения видовой принадлежности культур клеток на основе вПЦР-РВ.

3.3.1. Выбор диагностической мишени, конструирование видоспецифичных праймеров и зондов.

3.3.2. Первичная оценка сконструированных олигонуклеотидов и оптимизация условий проведения вПЦР-РВ.

3.3.3. Разработка и оптимизация мультиплексной вПЦР-РВ.

3.3.3. Изучение чувствительности разработанной вПЦР-РВ.

3.3.4. Изучение специфичности разработанной вПЦР-РВ.

3.4. Видовая идентификация культур клеток с использованием вПЦР-РВ и анализа нуклеотидных последовательностей участков генов cytb и COI.

Обсуждение результатов исследований.

Выводы.

Практические предложения.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Определение видовой принадлежности клеточных культур методами молекулярно-генетического анализа"

Актуальность темы

Проблема идентификации клеток в культуре стала очевидной еще в 5060-е годы XX века, когда при анализе хромосомных наборов и видоспецифических антигенов ряда клеточных линий человека и животных были выявлены случаи межвидовой клеточной контаминации. В большинстве случаев контаминация происходила клетками HeLa и L (Gartier, 1968).

Для решения данной проблемы разработан ряд методов, основанных на кариологическом анализе, изучении полиморфизма изоферментов и иммунологическом исследовании клеточных культур (Nelson-Rees et al., 1974; O'Brien et al., 1980; Stulberg et al., 1976). С использованием предложенных подходов было показано широкое распространение явления межвидовой и внутривидовой клеточной контаминации во многих лабораториях (Drexler et al., 1999; Freshney, 2008; Mowles and Doyle, 1990; Novokhatskii et al., 1980; Rojas et al., 2008; Stacey, 2000; Stacey et al., 1991).

Однако длительность проведения анализа и необходимость глубоких профессиональных навыков при исследовании кариотипа и спектра изоферментов клеточной линии делают эти методы анализа трудоемкими и сложными для интерпретации. Невозможность стандартизации этапов анализа и последующего сравнения результатов между лабораториями затрудняет их применение в повседневной практике.

В последнее десятилетие широкое распространение получили молекулярно-генетические методы идентификации биологических объектов. Наиболее известным и эффективным стал метод полимеразной цепной реакции (ПЦР). Принцип ПНР основан на многократном умножении исследуемой части генома с последующей детекцией продукта с использованием различных методик. Время анализа снижается до одного дня, а эффективность превосходит традиционные методы идентификации клеток в культуре.

Цель и задачи исследования.

Целью работы являлось совершенствование методов определения видовой принадлежности клеточных культур.

Для достижения поставленной цели было необходимо решить следующие задачи:

2. Сконструировать видоспецифичные олигонуклеотидные праймеры и зонды к нуклеотидным последовательностям генов cytb и COI для идентификации видов животных, клеточные культуры от которых наиболее распространены в специализированных коллекциях.

5. С помощью вПЦР-РВ и секвенирования участков генов суЛ и С01 провести видовую идентификацию клеточных культур в специализированных коллекциях клеточных культур.

Научная новизна

2. Адаптирована методика на основе секвенирования участков генов цитохрома Ь (суШ) и субъединицы I цитохром-с-оксидазы (С01) митохондриальной ДНК (мтДНК) для паспортизации и сертификации культур клеток, полученных от экзотических видов животных.

3. Впервые методами вПЦР-РВ проведен анализ видовой принадлежности 52-х клеточных культур полученных от 20-ти различных видов животных, депонированных в двух специализированных коллекциях: «Коллекция перевиваемых соматических клеточных культур сельскохозяйственных и промысловых животных» Всероссийского НИИ экспериментальной ветеринарии им. Я.Р. Коваленко РАСХН и «Коллекция перевиваемых соматических клеток позвоночных» НИИ Вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН.

Практическая значимость работы

Основные положения, выносимые на защиту

1. Стабильность и сохранение информативности участков генов cytb и COI мтДНК в условиях длительного культивирования in vitro и использования их в целях видовой идентификации клеточных культур.

2. Разработка методики видовой идентификации клеточных культур с использованием ПЦР с детекцией продукта амплификации в режиме реального времени.

3. Сравнительная оценка результатов кариологического анализа и вПЦР-РВ.

Апробация

Результаты диссертационной работы доложены и обсуждены на Международной конференции «Современные достижения и проблемы биотехнологии сельскохозяйственных животных: роль нанотехнологий в реализации приоритетных задач биотехнологии» (Дубровицы, 2008 г.); Школе-конференции молодых ученых «Методы культивирования клеток» (Санкт-Петербург, октябрь 2008 г.); Секции «Ветеринарная биотехнология» Отделения ветеринарной медицины РАСХН, 2008; 12-ой Пущинской международной школе-конференции молодых ученых (Пущино, 2008 г.); межлабораторном совещании научных сотрудников ВИЭВ (2009 г.).

Публикации

По теме диссертационной работы опубликовано 6 научных работ, в том числе 2 публикации в журналах, рекомендованных ВАК РФ.

Объем и структура работы

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология", Кулешов, Константин Валерьевич

Выводы

2. Сконструированы видоспецифичные олигонуклеотидные праймеры и зонды для идентификации 13-ти видов млекопитающих на основании анализа около 600 нуклеотидных последовательностей участков генов cytb и COI.

3. На основе сконструированных праймеров и зондов для идентификации 13-ти видов животных разработано 7 мультиплексных тест-систем, с использованием каждой из которых возможна одновременная идентификация 2-х видов животных. Показана специфичность праймеров и зондов на панели специфичных и гетерологичных экстрактов ДНК, полученных как непосредственно из тканей животных, так и перевиваемых клеточных культур. Чувствительность метода составляла не менее 10 кл/мл. В случае идентификации примеси клеток методика способна детектировать 10 - 100 клеток определяемого вида животного в присутствии 100000 клеток посторонней культуры.

4. Проведен цитогенетический анализ клеточных культур: человека (К562), кролика (RK-13), лошади (ЭКЛ), КРС (MDBK и ЛЭК), собаки (MDCK), соматических меж- и внутривидовых гибридов клеток лошадь х свинья (A4xL) и свинья х свинья (А4хС2), реконструирован кариотип каждой клеточной культуры и подтверждена видовая принадлежность. Показано, что для клеточных культур характерен высокий уровень гетерогенности и анеуплоидия различным парам хромосом. Выявлен высокий уровень робертсоновских транслокаций, в клеточных культурах ЛЭК и MDBK.

Сравнение результатов кариологического и молекулярно-генетического анализа показало совпадение в интерпретации видовой принадлежности всех исследованных клеточных культур.

5. Проведен анализ 73-х образцов клеточных культур, полученных от 20-ти различных видов животных и человека, депонированных в «Коллекции перевиваемых соматических клеточных культур сельскохозяйственных и промысловых животных» Всероссийского НИИ экспериментальной ветеринарии им. Я.Р. Коваленко РАСХН и «Коллекции перевиваемых соматических клеток позвоночных» научно-исследовательского института вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН. В 9-ти наименованиях клеточных культур с использованием методов видоспецифичной ПЦР-РВ и секвенирования участков мтДНК выявлено несоответствие результатов молекулярно-генетического анализа паспортным данным.

Практические предложения

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Кулешов, Константин Валерьевич, Щёлково

1. Алтухов, Ю. П. Генетические процессы в популяциях: Учебное пособие. 3-е изд., перераб. и доп. / Ю. П. Алтухов; Отв. ред. JI. А. Животовский. М.: ИКЦ «Академкнига», 2003. - 431 с.

2. Бахтин, Ю. Б. Генетика соматических клеток. — Л.:Наука Ленингр. отд., 1974.-258 с.

3. Волгарева, Г. М. Кариологическое исследование мышиных В-клеточных гибридом / Г. М. Волгарева // Цитология. 1985. - Том. 27, № 12. - С. 1394 -1403.

4. Графодатский, А. С. Хромосомы сельскохозяйственных и лабораторных млекопитающих. Атлас/ А. С. Графодатский, С. И. Раджабли — Новосибирск.: Наука Сиб. отд-ние, 1988. 128 с.

5. Дарлингтон, С. Д. Хромосомы. Методы работы. Пер. с 6-го англ. издания / С. Д. Дарлингтон, Л. Ф. Ла Кур; под ред. д.б.н., проф. Н. Н. Воронцова. -М.: Атомиздат, 1980. 216 с.

6. Добротворцева, В. Г. Контроль безопасности культуральных вирусных вакцин / В. Г. Добротворцева, Н. И. Миловидова // Вопросы вирусологии — 1980.-№ 6-С. 132-136.

7. Животная клетка в культуре (Методы и применение в биотехнологии)/ под ред. проф. Л. П. Дьяконова, проф. В. И. Ситько. М.: Компания Спутник+, 2000. - 400 с.

8. Калинина, Л. И. Получение и характеристика штаммов диплоидных клеток из тканей эмбриона коровы / Л.И. Калинина, Л.Г. Степанова, Э. Э. Розина, О. Г. Анджапаридзе // Вопросы вирусологии 1978. - № 4.- С. 152156.

9. Каталог Российской коллекции клеточных культур //С.-П., Омск: ОмГПУ, 1999.-226 с.

10. Кленовицкий, П. М. Цитогенетика животных/ В. А. Багиров, Н. А. Зиновьева, Ш. Н. Насибов, Б. С. Иолчиев. М.: РАСХН, 2007. - 81 с.

11. Колокольцова, Т. Д. Создание аттестованных коллекций и банков культур клеток для научных исследований, производства препаратов, диагностики и лечения: Дис. . докт. биол. наук: 03.00.23/ Т. Д. Колокольцова; ГИСК. М., 2007. - 272 с.

12. Мамаева, С. Е. Цитогенетика клеток в культуре / С. Е. Мамаева // В. сб.: Биология клетки в культуре. Л.: Наука, 1984.-136 с.

13. Мамаева С. Е. Закономерности кариотипической эволюции клеток в культуре / С. Е. Мамаева // Цитология.- 1996. Том. 38, № 8. - С. 787-814.

14. Мамаева, С. Е. Характеристика кариотипа постоянных клеточных линий. II Изменчивость и сбалансированность хромосомного набора клеток М— HeLa. / С. Е. Мамаева, Л. Ф. Литвинчук, Г. П. Пинаев // Цитология 1986. — Том. 28, №2.-С. 193-203.

15. Мамаева, С. Е. Атлас хромосом постоянных клеточных линий человека и животных. М.: Научный Мир, 2002. - 236 с.

16. Никольский, Н. Н. Биология клетки в культуре/ Н. Н. Никольский, Ю. Б. Бахтин, Т. Н. Игнатова и др.. Л.: Наука, 1984. - 280 с.

17. Новохатский, А. С.'Проблема контаминации клетками и новые подходы к контролю перевиваемых линий / А. С. Новохатский, Г. Р. Михайлова, А. А. Царева // Вопросы вирусологии.- 1976. -№ 7. С. 396-408.

18. Новохатский, A.C. Контаминация клеток перевиваемых линий / А. С. Новохатский, А. А. Царева, Г. Р. Михайлова, В. М. Жданов // Вопросы вирусологии 1979. -№ 8. - С. 432-439.

19. Полянская, Г.Г. Влияние условий культивирования на кариотпическую структуру двух клеточных сублиний фибробластов кожи индийского мунтжака / Г.Г. Полянская // Цитология 1989. - Том. 31, № 7. - С. 807-817.

20. Полянская, Г.Г. Закономерности кариотипической изменчивости в клеточных культурах при длительном культивировании в разных условиях: автореф. дис. . д-р биол. наук : 03.00.25 / Г.Г. Полянская. С.-П.,2000. - 38 с.

21. Полянская, Г.Г. Кариотипическая изменчивость в длительно культивируемых клеточных линиях без маркерных хромосом. / Г. Г. Полянская, Т. Н. Ефремова, Г. А. Сакута // Тезисы II съезда ВОГиС 2000. № 1.-С. 246-247.

22. Попечителев, Е. П. Аналитические исследования в медицине, биологии и экологии: Учеб. пособие для вузовУ Е. П. Попечителев, О. Н. Старцева. М.: Высш. шк., 2003. - 279 с.

23. Сингер; М. Гены и геномы: В 2-х т. Пер. с англ./ М. Сингер, П. Берг М.: Мир, 1998.-373 с.

24. Стегний, Б.Т. Цито генетические методы оценки стабильности биотехнологйческих параметров перевиваемых клеточных линий/ Б. Т. Стегний, М. Ю. Стегний, А. А. Лаврик // Цитология. 2008. - Том. 50, № 9. -С. 823-824.

25. Филатов, Л.В. Стабильность кариотипа двух постоянных клеточных линий клеток китайского хомячка — СНО-К1 и V—79 /Филатов Л.В., Мамаева С.Е.// Цитология.-1985.-Том. 27,№9.-С. 1031-1038.

26. Царева, A.A. Идентификация линий клеток насекомых /Царева A.A., Колокольцова Т.Д., Немцов Ю.В., Исаенко A.A., Бочкова ТТЛ Вопросы вирусологии.- 1986. -№ 2. С. 87-95.

27. Altschul, S.F Basic local alignment search tool /Altschul S.F., Gish W., Miller W., Myers E.W., Lipman D.J.// J Mol Biol.- 1990. Vol. 215, № 3. - P. 403-10.

28. Anichkov, N.M. Specific chromosomal changes (aberrations) -supplementary marker of malignant degeneration in oncomorphologic studies /Anichkov N.M., Mamaev N.N., Mamaeva S.E., Skripnik S.V.// Arkh Patol.- 1986. Vol. 48, № 6. -P. 87-91.

29. Araviashvili, D.E. The cytogenetic characteristics of human B-lymphoblastoid cell lines /Araviashvili D.E., Agrba V.Z., Timanovskaia V.V., Tsvileneva N.N., Mamaeva S.E.// Tsitologiia 1994. - Vol. 36, № 7. - P. 696700.

30. Bardakci, F. RAPD technique in tilapia fish: species and subspecies identification /Bardakci F., Skibinski D.O.// Heredity.- 1994. Vol. 73. - P. 11723.

31. Bataille, M. Multiplex amplification of mitochondrial DNA for human and species identification in forensic evaluation /Bataille M., Crainic K., Leterreux M., Durigon M., de Mazancourt P.// Forensic Sei Int.- 1999. Vol. 99, № 3. - P. 165— 70.

32. Becak, M.L. Amphibia: new insights /Becak M.L., Becak W.// Cytogenet Cell Genet.- 1998. Vol. 80, № 1-4. - P. 28-33.

33. Bellis, C. A molecular genetic approach for forensic animal species identification /Bellis C., Ashton K.J., Freney L., Blair B., Griffiths L.R.// Forensic Sei Int.-2003. Vol. 134, № 2-3. - P. 99-108.

34. Benson, D.A. GenBank /Benson D.A., Karsch-Mizrachi I., Lipman D.J., Ostell J., Wheeler D.L.// Nucleic Acids Res 2008. - Vol. 36, № Database issue. -P. D25-30.

35. Berman, L. Eight culture strains (Detroit) of human epithelial-like cells /Berman L., Stulberg C.S.// Proc Soc Exp Biol Med.- 1956. Vol. 92, № 4. - P. 730-5.

36. Blaxter, M.L. The promise of a DNA taxonomy /Blaxter M.L.// Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences 2004. - Vol. 359, № 1444.- P. 669-679.

37. Brand, K.G. Immunology of cultivated mammalian cells. I. Species specificity determined by hemagglutination /Brand K.G., Syverton J.T.// J Natl Cancer Inst-1960.-Vol. 24.-P. 1007-19.

38. Brown, G.G. Structural conservation and variation in the D-loop-containing region of vertebrate mitochondrial DNA /Brown G.G., Gadaleta G., Pepe G., SacconeC., SbisaE.// J Mol Biol.- 1986.-Vol. 192, №3.-P. 503-11.

39. Buntjer, J.B. Mammalian species identification by interspersed repeat PCR fingerprinting /Buntjer J.B., Lenstra J. A.// Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology.- 1998. Vol. 21, № 3. - P. 121-127.

40. Chang, R.S. Continuous subcultivation of epithelial-like cells from normal human tissues /Chang R.S.// Proc Soc Exp Biol Med.- 1954. Vol. 87, № 2. - P. 440-3.

41. Chen, M.H. Polymorphism and heteroplasmy of mitochondrial DNA in the D-loop region in Taiwanese /Chen M.H., Lee H.M., Tzen C.Y.// J Formos Med Assoc.- 2002. Vol. 101, № 4. - P. 268-276.

42. Chicago Conference: Standartization in Human Cytogenetic. Birth Defects: Original Article, Series 11:2, 1966. The N. Foundation, N.Y.

43. Civera, T. Species identification and safety of fish products /Civera T.// Vet Res Commun.- 2003. -Vol. 27 Suppl l.-P. 481^189.

44. Clausen, J.J. Comparative chromosomal study of 31 cultured mammalian cell lines /Clausen J.J., Syverton J.T.// J Natl Cancer Inst 1962. - Vol. 28. - P. 117145.

45. Coombs, R.R. The mixed agglutination reactions in the study of normal and malignant cells /Coombs R.R.// Cancer Res.- 1961. Vol. 21. - P. 1198-1202.

46. Cooper, J.K. Species identification in cell culture: a two-pronged molecular approach /Cooper J.K., Sykes G., King S., Cottrill K., Ivanova N.V., Hanner R., Ikonomi P.// In Vitro Cell Dev Biol Anim.- 2007. Vol. 43, № 10. - P. 344-351.

47. Coriell, L.L. Detection and elimination of contaminating organisms /Coriell L.L.// Natl Cancer Inst Monogr- 1962. Vol. 7. - P. 33-53.

48. Coriell, L.L. Common antigens in tissue culture cell lines /Coriell L.L., Tall M.G., Gaskill H.// Science.- 1958. Vol. 128, № 3317. - P. 198-9.

49. Defendi, V. Immunological and karyological criteria for identification of cell lines /Defendi V., Billingham R.E., Silvers W.K., Moorhead P.// J Natl. Cancer. Inst.- 1960. Vol. 25. - P. 359-85.

50. Deinhardt, F. Studies on the viral spectra of tissue culture lines of human cells /Deinhardt F., Henle G.// J Immunol.- 1957. Vol. 79, № 1. - P. 60-7.

51. Dooley, J.J. Detection of meat species using TaqMan real-time PCR assays /Dooley J.J., Paine K.E., Garrett S.D., Brown H.M.// Meat Science.- 2004. Vol. 68, №3.-P. 431-438.

52. Drew, R.M. Isolation and propagation of rabbit kidney epithelialike cells /Drew R.M.// Science.- 1957. Vol. 126, № 3277. - P. 747-8.

53. Drexler, H.G. False human hematopoietic cell lines: cross-contaminations and misinterpretations /Drexler H.G., Dirks W.G., MacLeod R.A.// Leukemia 1999. -Vol. 13, № 10.-P. 1601-7.

54. Drexler, H.G. Cross-contamination: HS-Sultan is not a myeloma but a Burkitt lymphoma cell line /Drexler H.G., MacLeod R.A., Dirks W.G.II Blood.-2001. Vol. 98, № 12. - P. 3495-6.

55. Drexler, H.G. DNA profiling and cytogenetic analysis of cell line WSU-CLL reveal cross-contamination with cell line REH (pre B-ALL) /Drexler H.G., Quentmeier H., Dirks W.G., Uphoff C.C., MacLeod R.A.// Leukemia.- 2002. -Vol. 16, №9.-P. 1868-70.

56. Eagle, H. Propagation in a fluid medium of a human epidermoid carcinoma, strain KB /Eagle H.// Proc Soc Exp Biol Med.- 1955. Vol. 89, № 3. - P. 362-4.

57. Eledath, F.M. Detection of nucleotide variations in the D-loop region of bovine mitochondrial DNA using polymerase chain reaction-based methodologies /Eledath F.M., Hines H.C.// Anim Genet.- 1996. Vol. 27, № 5. - P. 333-6.

58. Fitzgerald, P.H. Total aneuploidy and age-related sex chromosome aneuploidy in cultured lymphocytes of normal men and women /Fitzgerald P.H., McEwan C.M.// Hum Genet.- 1977. Vol. 39, № 3. - P. 329-37.

59. Freshney, R.I. Authentication of cell lines: ignore at your peril! /Freshney R.I.// Expert Review of Anticancer Therapy 2008. - Vol. 8, № 3. - P. 311-314.

60. Galloway, S.M. Aneuploidy and ageing: chromosome studies on a random sample of the population using G-banding /Galloway S.M., Buckton K.E.// Cytogenet Cell Genet.- 1978. Vol. 20, № 1-6. - P. 78-95.

61. Gartier, S.M. Apparent Heia cell contamination of human heteroploid cell lines /Gartier S.M.// Nature.- 1968. Vol. 217, № 5130. -P. 750-1.

62. Gibson, U.E. A novel method for real time quantitative RT-PCR /Gibson U.E., Heid C.A., Williams P.M.// Genome Res.- 1996. Vol. 6, № 10. - P. 9951001.

63. Grasela, J.J. Application of inter-simple sequence repeats to insect cell lines: identification at the clonal and tissue-specific level /Grasela J.J., Mcintosh A.H.// In Vitro Cell Dev Biol Anim 2003. - Vol. 39, № 8-9. - P. 353-63.

64. Guo, H.R. Analysis of three marine fish cell lines by rapd assay /Guo H.R., Zhang S.C., Tong S.L., Xiang J.H.// In Vitro Cell Dev Biol Anim.- 2001. Vol. 37, №7.-P. 430-3.

65. Halton, D.M. Cell culture quality control by rapid isoenzymatic characterization /Halton D.M., Peterson W.D., Jr., Hukku B.// In Vitro 1983. -Vol. 19, № l.-P. 16-24.

66. Hay, RJ. Methods for authenticating cell lines /Hay R.J.// Dev Biol Stand.-1992.-Vol. 76.-P. 25-37.

67. He, L. Identification of necrophagous fly species using IS SR and SCAR markers /He L., Wang S., Miao X., Wu H., Huang Y.// Forensic Sei Int.- 2007. -Vol. 168, №2-3.-P. 148-53.

68. Heath, D.D. PCR primed with VNTR core sequences yields species specific patterns and hypervariable probes /Heath D.D., Iwama G.K., Devlin R.H.// Nucleic Acids Res.- 1993. Vol. 21, № 24. - P. 5782-5.

69. Hebert, P.D. Barcoding animal life: cytochrome c oxidase subunit 1 divergences among closely related species /Hebert P.D., Ratnasingham S., deWaard J.R.// Proc Biol Sei.- 2003. Vol. 270 Suppl 1. - P. S96-9.

70. Heid, C.A. Real time quantitative PCR /Heid C.A., Stevens J., Livak K.J., Williams P.M.// Genome Res.- 1996. Vol. 6, № 10. - P. 986-94.

71. Hershfield, B. A polymerase chain reaction-based method for the identification of DNA samples from common vertebrate species /Hershfield B., Chader G., Aguirre G.// Electrophoresis.- 1994. Vol. 15, № 7. - P. 880-4'.

72. Higuchi, R. Kinetic PCR analysis: real-time monitoring of DNA amplification reactions /Higuchi R., Fockler C., Dollinger G., Watson R.// Biotechnology (N Y).- 1993. Vol. 11, № 9. - P. 1026-30.

73. Hoelzel, A.R. Evolution of the cetacean mitochondrial D-loop region /Hoelzel A.R., Hancock J.M., Dover G.A.// Mol Biol Evol.- 1991. Vol. 8, № 4. -P. 475-93.

74. Hsieh, H.M. Cytochrome b gene for species identification of the conservation , animals /Hsieh H.-M., Chiang H-L., Tsai L.-C., Lai S—Y., Huang N.-E., Linacre

75. A., Lee J.C.-I.// Forensic Science International.- 2001. Vol. 122, № 1. - P. 718.

76. Imaizumi, K. Development of species identification tests targeting the 16S ribosomal RNA coding region in mitochondrial DNA /Imaizumi K., Akutsu T., Miyasaka S., Yoshino M.// International Journal of Legal Medicine 2007. - Vol. 121, №3.-P. 184-191.

77. Irwin, D.M. Evolution of the cytochrome b gene of mammals /Irwin D.M., Kocher T.D., Wilson A.C.// J Mol Evol.-1991. Vol. 32, №2.-P. 128-44.

78. Jones, S.W. DNA assays for detection, identification, and individualization of select agent microorganisms /Jones S.W., Dobson M.E., Francesconi S.C., Schoske R., Crawford R.// Croat Med J.- 2005. Vol. 46, № 4. - P. 522-9.

79. Jonker, K.M. Species identification in meat products using real-time PCR /Jonker K.M., Tilburg J.J., Hagele G.H., de Boer E.// Food Addit Contam Part A Chem Anal Control Expo Risk Assess 2008. - Vol. 25, № 5. - P. 527-33.

80. Kang, H.W. Fingerprinting of diverse genomes using PCR with universal rice primers generated from repetitive sequence of Korean weedy rice /Kang H.W., Park D.S., Go S.J., Eun M.Y.// Mol Cells.-2002. Vol. 13, № 2.-P. 281-7.

81. Kawai, Y. An insect cell line discrimination method by RAPD-PCR /Kawai Y., Mitsuhashi J.// In Vitro Cellular & Developmental Biology Animal - 1997. -Vol. 33, №7.-P. 512-515.

82. Kitano, T. Two universal primer sets for species identification among vertebrates /Kitano T., Umetsu K., Tian W., Osawa M.// Int J Legal Med.- 2007. -Vol. 121, №5.-P. 423-7.

83. Lee, J.C. Random amplified polymorphic DNA polymerase chain reaction (RAPD PCR) fingerprints in forensic species identification /Lee J.C., Chang J.G.// Forensic Sei Int.- 1994. Vol. 67, № 2. - P. 103-7.

84. Lehman, J.M. Early chromosome changes in diploid Chinese hamster cells after infection with Simian virus 40 /Lehman J.M.// Int J Cancer- 1974. Vol. 13, №2.-P. 164-72.

85. Leighton, J. The similarity in histologic appearance of some human cancer and normal cell strains in sponge-matrix tissue culture /Leighton J., Kline I., Belkin M., Legallais F., Orr H.C.// Cancer Res.- 1957. Vol. 17, № 5. - P. 35963.

86. Linacre, A. Species determination: the role and use of the cytochrome b gene /Linacre A., Lee J.C.// Methods Mol Biol.- 2005. Vol. 297. - P. 45-52.

87. Litvinchuk, L.F. Karyotype of continuous cell lines. I. The karyotype variability of M-HeLa cells cultured by static and roll—tube methods /Litvinchuk L.F., Mamaeva S.E., Kovtunova N.G., Pinaev G.P.// Tsitologiia- 1986. Vol. 28, № l.-P. 56-62.

88. Liu, M.Y. Rapid identification and authentication of closely related animal cell culture by polymerase chain reaction /Liu M., Liu H., Tang X., Vafai A.// In Vitro Cell Dev Biol Anim.- 2008. Vol. 44, № 7. - P. 224-7.

89. Liu, M.Y. A. Identification and authentication of animal cell culture by polymerase chain reaction amplification and DNA sequencing /Liu M.Y., Lin S.C., Liu H., Candal F., Vafai A.// In-Vitro Cell Dev Biol Anim.- 2003. Vol. 39, № 10.-P. 424-7.

90. Lopez-Andreo, MJ. Identification and quantitation of species in complex DNA mixtures by real-time polymerase chain reaction /Lopez—Andreo M., Lugo L., Garrido-Pertierra A., Prieto M.I., Puyet A'.// Anal Biochem 2005. - Vol. 339, № l.-P. 73-82.

91. Lopez-Pinon, M.J. Identification of four scallop species using PCR and restriction analysis of the ribosomal DNA internal transcribed spacer region /Lopez-Pinon M.J., Insua A., Mendez J.// Mar Biotechnol (NY).- 2002. Vol. 4, №5.-P. 495-502.

92. Luo, H.5 Species identification of biomaterials by amplifying 12S rRNA gene /Luo H., Lu H.L., Zhou X.C., Zhang Y.Q., Yao Y.N.// Fa.Yi Xue Za Zhi.- 2008. -Vol. 24, №3.-P: 185-8, 193.

93. Mamaeva, S.E. Karyotypic evolution- of cells; in culture: a new concept /Mamaeva S.E.// Int Rev Cytol.- 1998. Vol. 178. - P. 1-40.

94. Matlashewski, G. Transformation of primary human fibroblast cells with-human, papillomavirus type 16 DNA and.EJ-ras /Matlashewski G., Osborn K., Banks L., Stanley M., Crawford L.// Int J Cancer.- 1988. Vol. 42, № 2. - P. 232-8.

95. McClelland, E.K. A genetic linkage map for coho salmon-(Oncorhynchus kisutch) /McClelland E.K., Naish K.A.// Anim Genet.- 2008. Vol. 39, № 2. - P. 169-79.

96. Meyer, R. Polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism analysis: a simple method»for species identification in food</Meyer139

97. R., Hofelein C., Luthy J., Candrian U.// J AOAC Int.- 1995. Vol. 78, № 6. - P. 1542-51.

98. Moore, A.E. Culture characteristics of four permanent lines of human cancer cells /Moore A.E., Sabachewsky L., Toolan H.W.// Cancer Res.- 1955. Vol. 15, № 9. - P. 598-602.

99. Moore, A.E. Neoplastic changes developing in epithelial cell lines derived from normal persons /Moore A.E., Southam C.M., Sternberg S.S.// Science-1956.-Vol. 124, №3212.-P. 127-9.

100. Moorhead, P.S. Choromosome preparations of leukocytes cultured from human peripheral blood /Moorhead P.S., Mellman W.J., Batteps D.M., Hungerford D.A.// Exp Cell Res.- 1960. Vol. 20, № 4. - P. 613-616.

101. Mowles, J.M. Cell culture standards—time for a rethink? /Mowles J.M., Doyle A.// Cytotechnology.— 1990. Vol. 3, № 2. - P. 107-8.

102. Mukherji, B. Spontaneous in vitro transformation of human fibroblasts /Mukherji B., MacAlister T.J., Guha A., Gillies C.G., Jeffers D.C., Slocum S.K.// J Natl Cancer Inst.- 1984. Vol. 73, № 3. - P. 583-93.

103. Murray, B.W. Forensic identification of ungulate species using restriction digests of PCR-amplified mitochondrial DNA /Murray B.W., McClymont R.A., Strobeck CM J Forensic Sei.- 1995. Vol. 40, № 6. - P. 943-51.

104. Naimuddin, M. Genome analysis technologies: towards species identification by genotype /Naimuddin M., Nishigaki K.// Brief Funct Genomic Proteomic — 2003.-Vol. 1,№4.-P. 356-71.

105. Nelson-Rees, W.A. The identification and monitoring of cell line specificity /Nelson-Rees W.A.// Prog Clin Biol Res.- 1978. Vol. 26. - P. 25-79.140

106. Nelson-Rees, W.A. Clonal derivatives of a bovine kidney cell line (MDBK) and continuing preservation of total chromosomal material /Nelson-Rees W.A., Darby N.B., Siegel S.T.// Chromosoma.- 1966. Vol. 18, № 1. - P. 70-78.

107. Nelson-Rees, W.A. Banded marker chromosomes as indicators of intraspecies cellular contamination /Nelson-Rees W.A., Flandermeyer R.R., Hawthorne P.K.// Science.-1974.-Vol. 184, № 4141.-P. 1093-6.

108. Nims, R.W. Sensitivity of isoenzyme analysis for the detection of interspecies cell line cross-contamination /Nims R.W., Shoemaker A.P., Bauernschub M.A., Rec L.J., Harbell J.W.// In Vitro Cell Dev Biol Anim.- 1998. Vol. 34, № 1. - P. 35-9.

109. Novokhatskii, A.S. Contamination of continuous cell lines /Novokhatskii

110. A.S., Tsareva A.A., Mikhailova G.R., Zhdanov V.M.// Vopr Virusol.- 1980.- № 4.-P. 432-9.

111. O'Brien, S,J. A molecular approach to the identification and individualization., of human and animal cells in culture: isozyme and allozyme genetic signatures /O'Brien S.J., Shannon J.E., Gail M.H.// In Vitro.- 1980. Vol. 16, № 2. - P. 119-35.

112. Ono, K. Species identification of animal cells by nested PCR targeted to mitochondrial DNA /Ono K., Satoh M., Yoshida T., Ozawa Y., Kohara A., Takeuchi M., Mizusawa H., Sawada H.// In Vitro Cell Dev Biol Anim 2007. -Vol. 43, №5-6.-P. 168-75.

113. Partis, L. Identification of fish species using random amplified polymorphic DNA (RAPD) /Partis L., Wells R.J.// Mol Cell Probes.- 1996. Vol. 10, № 6. -P. 435-41.

114. Paul, D.N.H. Biological identifications through DNA barcodes /Paul D.N.H., Alina C., Shelley L.B., Jeremy R.d.// Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences.-2003. Vol. 270, № 1512. -P. 313-321.

115. Pepe, T. Mitochondrial cytochrome b DNA sequence variations: an approach to fish species identification in processed fish products /Pepe T., Trotta M., di Marco I., Cennamo P., Anastasio A., Cortesi M.L.// J Food Prot 2005. - Vol. 68, №2.-P. 421-5.

116. Percifield, R.J. Genetic diversity in Hypericum and AFLP Markers for species-specific identification of H. perforatum L /Percifield R.J., Hawkins J.S., McCoy J.A., Widrlechner M.P., Wendel J.F.// Planta Med.- 2007. Vol. 73, № 15. -P. 1614-21.

117. Pereira, F. Identification of species with DNA-based technology: current progress and challenges /Pereira F., Carneiro J., Amorim A.// Recent Pat DNA Gene Seq.-2008. Vol. 2, № 3. - P. 187-99.

118. K37. Poljanskaya, G. G. The karyotypic structure of cell populations in vitro as integral system / G. G. Poljanskaya, Y. B. Vakhtin// Tsitologiya: 2003. - Vol. 45, №2'.-P. 115-131.

119. Rey, J.A. Serial cytogenetic study of a human glioma cellline /Rey JJ.A., Belloi M.J., Ramos,C., Benitez J., MuelasJ.M.// Cancer Genet Cytogenet- 1983. Vol. 8, №4.-P. 287-95.

120. Risterucci, A.M. Identificationt of QTLs related^to cocoa resistance to*three species of Phytophthorai/Risterucci A.M:, Paulin Di, Ducamp M., N'Goran, J.A., Lanaud CM Theor Appl Genet.- 2003. Vol. 108, № 1. - P. 168-74.

121. Rodrigo, A.G. Quantitation of target molecules from polymerase chain' reaction-based! limiting dilution assays /Rodrigo A.G., Goracke P.C., Rowhanian K., Mullins J.I.// AIDS Res Hum Retroviruses.- 1997. Vol. 13, № 9. - P. 73742:

122. Rojas, A. Cell line cross-contamination in biomedical- research: a call to prevent unawareness /Rojas A., Gonzalez L, Figueroa H.// Acta Pharmacol Sin.— 2008. Vol. 29, № 7. - P.1 877-80.

123. Rothfels, K.H. The chromosome complement of the rhesus monkey (Macaca mulatta) determined in kidney cells cultivated in vitro /Rothfels K.H., Siminovitch L.// Chromosoma.- 1958. Vol. 9, № 2. - P. 163-75.

124. Saitou, N. The neighbor-joining method: a new method for reconstructing phylogenetic trees /Saitou N., Nei M.II Mol Biol Evol.- 1987. Vol. 4, № 4. - P. 406-25.

125. Salk, J.E. Some characteristics of a continuously propagating cell derived from monkey heart tissue /Salk J.E., Ward E.N.// Science 1957. - Vol. 126, № 3287.-P. 1338-9.

126. Sarkar, P. Karyologic Studies on Cells From Rabbit Cornea and Other Tissues Grown in Vitro /Sarkar P., Basu P.K., Miller I.// Invest. Ophthalmol. Vis. Sci-1962.-Vol. 1, № 1. — P. 33—40.

127. Seabright, M. A rapid banding technique for human chromosomes /Seabright MM Lancet.- 1971. Vol. 2, № 7731. - P. 971-2.

128. Silva, L.M. Fingerprinting of cell lines by directed amplification of minisatellite-region DNA (DAMD) /Silva L.M., Monies de Oca H., Diniz C.R., Fortes-Dias C.L.// Braz J Med Biol Res.-2001.-Vol. 34, № 11.-P. 1405-10.

129. Simpson, W.F. Species Identification of Animal Cell Strains by . Immunofluorescence /Simpson W.F., Stulberg C.S.// Nature.- 1963. Vol. 199.1. P. 616-7.

130. Sotelo, C.G. Identification of flatfish (Pleuronectiforme) species using DNA—based techniques /Sotelo C.G., Calo-Mata P., Chapela M.J., Perez-Martin R.I.,144

131. Rehbein H., Hold G.L., Russell V.J., Pryde S., Quinteiro J., Izquierdo M., Rey-Mendez M., Rosa C., Santos A.T.// J Agric Food Chem.- 2001. Vol. 49, № 10. -P. 4562-9.

132. Sperling, F.A. A DNA-based approach to the identification of insect species used for postmortem interval estimation /Sperling F.A., Anderson G.S., Hickey D.A.// J Forensic Sci.- 1994. Vol. 39, № 2. - P. 418-27.

133. Stacey, G.N. Cell contamination leads to inaccurate data: we must take action now /Stacey G.N.// Nature.- 2000. Vol. 403, № 6768. - P. 356.

134. Stacey, G.N. The quality control of cell banks using DNA fingerprinting /Stacey G.N., Bolton B.J., Doyle A.// EXS.- 1991. Vol. 58. - P. 361-70.

135. Stacey, G.N. DNA fingerprinting transforms the art of cell authentication /Stacey G.N., Bolton B.J., Doyle A.// Nature.- 1992. Vol. 357, № 6375. - P. 261-2.

136. Stacey, G.N. Authentication of animal cell cultures by direct visualization of repetitive DNA, aldolase gene PCR and isoenzyme analysis /Stacey G.N., Hoelzl H., Stephenson J.R., Doyle A.// Biologicals.- 1997. Vol. 25, № 1. - P. 75-85.

137. Stanley, S.E. Cytochrome b evolution in birds and mammals: an evaluation of the avian constraint hypothesis /Stanley S.E., Harrison R.G.// Mol Biol Evol-1999. Vol. 16, № 11.-P. 1575-1585.

138. Steube, K. Identification and verification of rodent cell lines by polymerase chain reaction /Steube K., Koelz A.-L., Drexler H.// Cytotechnology.- 2008a. -Vol. 56, № l.-P. 49-56.

139. Steube, K.G. Identification and verification of rodent cell lines by polymerase chain reaction /Steube K.G., Koelz A.L., Drexler H.G.// Cytotechnology.- 2008b. -Vol. 56, № l.-P. 49-56.

140. Steuber, S. PCR-RFLP analysis: a promising technique for host species identification of blood meals from tsetse flies (Diptera: Glossinidae) /Steuber S., Abdel-Rady A., Clausen P.H.// Parasitol Res.- 2005. Vol. 97, № 3. - P. 247-54.

141. Stulberg, C.S. Identification of cells in culture /Stulberg C.S., Peterson W.D., Jr., Simpson W.F.// Am J Hematol.- 1976. Vol. 1, № 2. - P. 237-42.

142. Stulberg, C.S. Species-related antigens of mammalian cell strains as determined by immunofluorescence /Stulberg C.S., Simpson W.F., Berman L.// Proc Soc Exp Biol Med.- 1961. Vol. 108. - P. 434-9.

143. Tamura, K. MEGA4: Molecular Evolutionary Genetics Analysis (MEGA) software version 4.0 /Tamura K., Dudley J., Nei M., Kumar S.// Mol Biol Evol.-2007. Vol. 24, № 8. - P. 1596-9.

144. Thiel, G. Karyotypes in 90 human gliomas /Thiel G., Losanowa T., Kintzel D., Nisch G., Martin H., Vorpahl K., Witkowski R.// Cancer Genet Cytogenet-1992.-Vol. 58,№2.-P. 109-20.

145. Tobe, S.S. Linacre A.M. A multiplex assay to identify 18 European mammal species from mixtures using the mitochondrial cytochrome b gene /Tobe S.S., Linacre A.M.// Electrophoresis 2008. - Vol. 29, № 2. - P. 340-7.

146. Trewyn, R.W. Karyotype and tumorigenicity of 1-methylguanine-transformed Chinese hamster cells /Trewyn R.W., Kerr S.J., Lehman J.M.// J Natl Cancer Inst.- 1979. Vol. 62; № 3. - P. 633-8.

147. Bokhoven, A. TSU-Prl and JCA-1 cells are derivatives of T24 bladder carcinoma cells and are not of prostatic origin /van Bokhoven A., Varella-Garcia M., Korch C., Miller G.J.// Cancer Res.-2001.-Vol. 61,№17.-P. 6340-4.

148. Vaudano, E. Application of real-time RT-PCR to study gene expression-in active dry yeast (ADY) during the rehydration phase /Vaudano E., Costantini A., Cersosimo M., Del Prete V., Garcia-Moruno E.// Int J Food Microbiol.- 2009. -Vol. 129, № l.-P:30-6.

149. Vos, P. AFLP: a new technique for DNA fingerprinting /Vos P., Hogers R., Bleeker M., Reijans M., van de Lee T., Homes M., Frijters A., Pot J., Peleman J., Kuiper MM Nucleic Acids Res.- 1995. Vol. 23, № 21. - P. 4407-14.

150. Walker, J.A. Quantitative PCR for DNA identification based on genome-specific interspersed repetitive elements /Walker J.A., Hughes D.A., Hedges D.J.,

151. Anders B.A., Laborde M.E., Shewale J., Sinha S.K., Batzer M.A.// Genomics — 2004.-Vol. 83, №3.-P. 518-27.

152. Waugh, J. DNA barcoding in animal species: progress, potential and pitfalls /Waugh J.// Bioessays.- 2007. Vol. 29, № 2. - P. 188-97.

153. Westwood, J.C. Transformation of normal cells in tissue culture: its significance relative to malignancy and virus vaccine production /Westwood J.C., Macpherson I.A., Titmuss D.H.// Br J Exp Pathol.- 1957. Vol. 38, № 2. - P. 138-54.

154. Wolf, C. PCR-RFLP analysis of mitochondrial DNA: a reliable method for species identification /Wolf C., Rentsch J., Hubner P.// J Agric Food Chem.-1999. Vol. 47, № 4. - P. 1350-5.

155. Xuan, S.Y. Test for hepatitis B virus infection with radical immunoassay and real-time PCR: which method is the gold standard? /Xuan S.Y., Xin Y.N., Zhong Y.D., Zheng M.H., Guan U.S.// J Hepatol.- 2009. Vol. 50, № 1. - P. 211-2; author reply 213.

156. Yan-chun, X. Molecular genetic strategies for species identification /Yan-chun X., Su-ying B., Yu J., Song-yan J.// Journal of Forestry Research 2000. — Vol. 11, №4.-P. 249-251.

157. Ye, Y. Multiple amplification of 16SrRNA gene and Cytb gene in mitochondrial DNA for species identification/Ye Y., Wu J., Luo H.B., Wang Z., Li Y.B.// Fa Yi Xue Za Zhi.- 2008. Vol. 24, № 4. - P. 259-61.

158. Zaayman, D. A highly sensitive method for the detection and genotyping of West Nile virus by real-time PCR /Zaayman D., Human S., Venter M.// J Virol Methods 2009. -.

159. Zuker, M. Mfold web server for nucleic acid folding and hybridization prediction /Zuker MM Nucleic Acids Res.- 2003. Vol. 31, № 13. - P. 3406-15.

Информация о работе

Кулешов, Константин Валерьевич
кандидата биологических наук
Щёлково, 2009
ВАК 03.00.23

Диссертация

Определение видовой принадлежности клеточных культур методами молекулярно-генетического анализа - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы