Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему
Определение стимулятора роста-рактопамина в мясе и печени методом иммуноферментного анализа
ВАК РФ 06.02.05, Ветеринарная санитария, экология, зоогигиена и ветеринарно-санитарная экспертиза

Автореферат диссертации по теме "Определение стимулятора роста-рактопамина в мясе и печени методом иммуноферментного анализа"

Лемясева Светлана Васильевна

ОПРЕДЕЛЕНИЕ СТИМУЛЯТОРА РОСТА - РАКТОПАМИНА В МЯСЕ И ПЕЧЕНИ МЕТОДОМ ИММУНОФЕРМЕНТНОГО АНАЛИЗА

06.02.05 - ветеринарная санитария, экология, зоогигиена и ветеринарно-санитарная

экспертиза

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

15 ЯКВ 2015

005557925

Москва - 2014

005557925

Работа выполнена в Государственном научном учреждении Всероссийский научно-исследовательский институт ветеринарной санитарии, гигиены и экологии Российской академии сельскохозяйственных наук (ГНУ ВНИИВСГЭ Россельхозакадемии).

Научный руководитель: заслуженный деятель науки РФ,

доктор ветеринарных наук, профессор Бутко Михаил Павлович, ГНУ Всероссийский научно-исследовательский институт ветеринарной санитарии, гигиены и экологии Россельхозакадемии, заведующий лабораторией

Научный консультант: кандидат химических наук

Галкин Александр Викторович,

ООО «Компания Стайлаб», директор

Официальные оппоненты: доктор ветеринарных наук, профессор

Белоусов Василий Иванович,

ФБГУ «Центральная научно-методическая ветеринарная лаборатория», заместитель директора

доктор биологических наук Никанова Людмила Анатольевна ФГБНУ «Всероссийский научно-исследовательский институт животноводства имени академика Л.К. Эрнста», главный научный сотрудник отдела биохимических и химико-аналитических исследований, эксперт в области подтверждения соответствия мяса, мясной продукции, мяса птицы, яиц и продуктов их переработки (Регистр системы сертификации персонала Росстандарта РФ)

Ведущая организация: ФГБОУ ВПО «Московская государственная академия

ветеринарной медицины и биотехнологии имени К.И.Скрябина». (ФГБОУ ВПО МГАВМиБ) Защита состоится «11» марта 2015 г. в 12-00 часов на заседании диссертационного совета Д 006.008.01 на базе ГНУ Всероссийского научно-исследовательского института ветеринарной санитарии, гигиены и экологии Россельхозакадемии (ГНУ ВНИИВСГЭ Россельхозакадемии) по адресу: 123022, г. Москва, Звенигородское шоссе, 5.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГНУ Всероссийского научно-исследовательского института ветеринарной санитарии, гигиены и экологии Россельхозакадемии (ГНУ ВНИИВСГЭ Россельхозакадемии) по адресу: 123022, г. Москва, Звенигородское шоссе, 5 и на сайте института http://www.vniivsge.ru.

Автореферат разослан V» 2014 г.

Ученый секретарь диссертационного совета. /"

кандидат биологических наук ^-¡¿лЛ/ Крутько Наталья Сергеевна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы. В промышленном животноводстве нередко прибегают к

использованию стимуляторов роста, так как они позволяют добиться значительного

повышения эффективности производства продукции животного происхождения.

Использование стимуляторов роста (в т.ч. рактопамина) при выращивании

животных в странах Евросоюза и РФ запрещено и находится под строгим контролем

ветеринарных служб в соответствии с Директивами ЕС 96/22/ЕС, 96/23/ЕС (1996), а

также Указанием Россельхознадзора от 21 сентября 2012 г. (http://www.fsvps.ru.),

соответственно. Импортное мясо в этих странах проверяется и уничтожается при

обнаружении следов стимуляторов роста.

Следует отметить, что Управлением по контролю за продуктами питания и

лекарственными средствами США (1999) и Канадским агентством

продовольственной инспекции (2005) был утвержден для применения препарат

рактопамин под названием торговой марки Paylean (для свиней), Optaflexx (для

крупного рогатого скота) и Томах (для индейки).

Вместе с тем, имеются сообщения, что добавление рактопамина в корм

небезопасно для животного. Так, по данным «Европейского управления

безопасности пищевых продуктов» (EFSA), препарат приводит к значительным

нарушениям здоровья животных, включая сердечно - сосудистый стресс, тремор

скелетной мускулатуры, повышенную агрессивность и гиперактивность

(http://www.fsvps.ru, 2013). Установлено, что употребление в пищу мяса

сельскохозяйственных животных и птицы, содержащих стимуляторы роста,

небезопасно для человека (Белоусов В.И., Матрёшин A.B., Мамаев М.А. и др., 2000;

Цеденова В.А., 2002; Галимов Б.А., Тухбатуллин Х.Т., 2002; Островская A.B., 2004).

В связи с поступлением мяса и субпродуктов в Российскую Федерацию из

ряда зарубежных стран, в которых используется препарат рактопамин для

стимуляции роста сельскохозяйственных животных и птицы, становится ясным

необходимость усиления контроля наличия рактопамина в продукции

животноводства, в частности, с применением экспресс-методов контроля

ОЦ

безопасности пищевых продуктов. В этом плане среди скрининговых методов лидирующее положение занимают иммуноферментные методы анализа (ИФА).

Все вышеизложенное легло в основу выбора темы, представленной в исследовательской работе.

Степень разработанности темы. Основанием для проведения настоящих исследований является практическая необходимость разработки экспресс-методов контроля безопасности пищевых продуктов животного происхождения в связи с импортом мяса и субпродуктов в РФ из ряда зарубежных стран (США, Канада, Бразилия и др.).

Нами впервые проведены исследования по разработке и применению методики по определению стимулятора роста - рактопамина в свинине, говядине, говяжьей печени и мясе индейки импортного и отечественного происхождения методом иммуноферментного анализа с использованием тест-системы RIDASCREEN® Ractopamin R9901 (производство R-Biopharm AG, Германия).

Предложены рекомендации для практического применения.

Цели и задачи. Целью данной работы являлось изучение возможности применения и совершенствования методики иммуноферментного анализа для обнаружения стимулятора роста - рактопамина в мясе и печени, с решением следующих задач:

1. Определить предел обнаружения (limit of detection - LOD) рактопамина при исследовании свинины, говядины, говяжьей печени и мяса индейки методом иммуноферментного анализа.

2. Определить предел количественного определения (limit of quantitation -LOQ) рактопамина в свинине, говядине, говяжьей печени и мясе индейки методом иммуноферментного анализа.

3. Провести исследования по определению содержания стимулятора роста -рактопамина в мясе и печени импортного и отечественного происхождения методом иммуноферментного анализа.

4. Изучить влияние температурной обработки на содержание рактопамина в мясе и печени.

5. На основании проведенных исследований разработать «Методическое пособие по количественному определению стимулятора роста - рактопамина в мясе и печени на основе метода иммуноферментного анализа».

Научная новизна. Проведенными исследованиями по усовершенствованию методики определены пределы обнаружения и пределы количественного определения рактопамина при исследовании свинины, говядины, говяжьей печени и мяса индейки с помощью иммуноферментного анализа. Предел обнаружения (ЬСЮ) составил для свинины 0,345 мкг/кг, говядины - 0,390 мкг/кг, говяжьей печени -0,390 мкг/кг и мяса индейки - 0,400 мкг/кг, а предел количественного определения (ШС>) составил для свинины 0,561 мкг/кг, говядины - 0,708 мкг/кг, говяжьей печени - 0,762 мкг/кг и мяса индейки - 0,688 мкг/кг.

Кроме того, определены в мясе индейки степень извлечения рактопамина, которая составила 91,0% и относительное стандартное отклонение (коэффициент вариации) для определения содержания рактопамина - 14,0%.

Проведен мониторинг свинины, говядины, говяжьей печени и мяса индейки импортного (Аргентина, Белоруссия, Бразилия, Германия, Дания, Испания, Литва, Парагвай, США, Украина, Уругвай, Франция) и отечественного происхождения.

Впервые установлено, что процессы замораживания мяса (при температуре минус 18°С) и его хранения (до 270 суток), а также варки (в течение 30, 60 и 120 минут при температуре 100°С) не снижают уровня содержания рактопамина в пробах мяса в сравнении с его исходной концентрацией (срок наблюдения). Это дает основание считать, что мясо и субпродукты, содержащие рактопамин не должны подлежать реализации на пищевые цели, независимо от вида их обработки (охлаждение, замораживание, варка, длительное хранение).

Теоретическая и практическая значимость работы. Показана высокая эффективность метода конкурентного иммуноферментного анализа при определении рактопамина в мясе и субпродуктах.

Проведенные исследования позволили установить верификацию оборудования (подтверждена эффективность применения имеющегося оборудования в технологическом процессе определения рактопамина) и валидацию

метода (определена пригодность метода ИФА для определения рактопамина в мясе и печени различных видов животных).

На основании проведенных исследований разработано «Методическое пособие по количественному определению стимулятора роста - рактопамина в мясе и печени на основе метода иммуноферментного анализа» (утв. Отделением ветеринарной медицины РАСХН 08.02.2012 г.), рекомендованное для применения как в научно-исследовательских учреждениях, так и ветеринарных лабораториях для ускоренного скринингового контроля наличия рактопамина в свинине, говядине, говяжьей печени и мясе индейки.

«Методическое пособие...» отмечено Серебряной медалью и Дипломом на XIV Российской агропромышленной выставке «Золотая осень» (2012 г.).

Методология и методы исследования. Для определения стимулятора роста -рактопамина в свинине, говядине, говяжьей печени и мясе индейки использовали усовершенствованный метод иммуноферментного анализа. Для этого применили методики построения калибровочной кривой по стандартным растворам рактопамина, определения предела обнаружения рактопамина в мясе и печени, расчета предела количественного определения рактопамина в мясе и печени, определения извлекаемое™ рактопамина из проб мяса индейки.

Учет результатов определения рактопамина проводили с помощью специализированного программного обеспечения 1Ш)А®8ой. Статистическую обработку данных проводили методом вариационной статистики.

Положения, выносимые на защиту.

1. Результаты исследований по определению методом ИФА:

- предела обнаружения рактопамина в свинине, говядине, говяжьей печени и мясе индейки;

- предела количественного определения рактопамина в свинине, говядине, говяжьей печени и мясе индейки.

2. Исследование по определению содержания стимулятора роста - рактопамина в свинине, говядине, говяжьей печени и мясе индейки импортного и отечественного происхождения, отобранные из розничной сети в период 2011-2013гг.

3. Изучение влияния температурной обработки на содержание рактопамина в пробах мяса (свинина, говядина, говяжья печень и мясо индейки).

Степень достоверности и апробация результатов. Материалы диссертации доложены и одобрены на: Международной научно-практической конференции, посвященной 100-летию со дня рождения Заслуженного деятеля науки, доктора ветеринарных наук, профессора Абуладзе К.И. и доктора ветеринарных наук, профессора Колоболотского Г.В. (ФГБОУ ВПО «Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии им. К.И. Скрябина», г. Москва 15-16 мая 2012 г.); VIII международной научно-практической конференции «Обеспечение качества и безопасности продуктов животного происхождения» (ГНУ ВНИИ ветеринарной санитарии, гигиены и экологии Россельхозакадемии, г. Москва 15 мая 2013 г.); Международной научно-практической конференции «Актуальные вопросы товароведения и безопасности товаров», посвященной 20-летию экономического факультета (ГАОУ ВПО «Московский государственный областной социально-гуманитарный институт», г. Коломна 17 мая 2013 г.); X международной научно-практической конференции «Научные проблемы обеспечения ветеринарно-санитарного благополучия животноводства и пути их решения» (ГНУ ВНИИ ветеринарной санитарии, гигиены и экологии, г. Москва 2 апреля 2014 г.); расширенном совещании ГНУ ВНИИ ветеринарной санитарии, гигиены и экологии (14 октября 2014 г.).

Публикации. Опубликовано 7 научных статей, в том числе 4 - в изданиях, входящих в перечень ВАК Минобрнауки РФ (журналы «Ветеринария Кубани», «Проблемы ветеринарной санитарии, гигиены и экологии»).

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 147 страницах машинописного текста. Состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследований, изложения результатов собственных исследований, обсуждения, заключения, практических предложений, списка литературы, включающего 141 источников, в том числе 60 зарубежных авторов, приложений - 8. Диссертация содержит 18 таблиц, 27 рисунков, 7 формул.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ 1 Материалы и методы исследований

Диссертационная работа выполнена в период с 2011 по 2014 гг. в лаборатории ветеринарной санитарии на государственной границе, транспорте и мясоперерабатывающих предприятиях ГНУ ВНИИВСГЭ и на материально-технической базе лаборатории ООО «Компании Стайлаб», сотрудникам которой, химику - аналитику Арслановой С.С., специалисту по качеству Елагиной A.A. выражаю благодарность за оказание практической помощи при выполнении ряда исследований.

Материалом для исследований служили образцы мяса свиней, крупного рогатого скота и говяжьей печени, мяса индейки отечественного и импортного происхождения, которые отбирали на ряде предприятий (ООО «Проторг+», ООО «Рамфуд») и продовольственных рынках г. Москвы и Московской области (ТК «Петровско-Разумовский», ТЦ «ЮНИОН»), а также образцы, поступившие в ФБУ «Центральная научно-методическая ветеринарная лаборатория» Федеральной службы по ветеринарному и фитосанитарному надзору. Всего исследовано 136 проб, в том числе: свинины - 36; говядины - 46; говяжьей печени - 23; мяса индейки - 31, из них 75 проб отечественного происхождения, 61 проба импортного происхождения (Аргентина, Белоруссия, Бразилия, Германия, Дания, Испания, Литва, Парагвай, США, Украина, Уругвай, Франция).

Для адаптации метода иммуноферментного анализа для выявления наличия рактопамина в мясе и печени крупного рогатого скота, а также в мясе свиней и индейки, были исследованы стандартные растворы рактопамина для построения калибровочной кривой, определены предел обнаружения и предел количественного определения в мясе и печени.

1.1 Метод иммуноферментного анализа для определения стимулятора роста - рактопамина. Определение стимулятора роста - рактопамина осуществляли с помощью иммуноферментного анализа с использованием тест-системы RIDASCREEN® . Ractopamin R9901 (производство R-Biopharm AG, Германия), где в основе процедуры анализа лежит взаимодействие антигенов с

антителами при протекании ферментативной цветной реакции. Планшет, входящий в состав набора RIDASCREEN® Ractopamin, сенсибилизирован антителами «захвата», специфическими к антителам к рактопамину.

1.2 Методика построения калибровочной кривой по стандартным растворам рактопамина. Исследовали стандартные растворы рактопамина различной концентрации (0 мкг/кг (0 нг/кг), 0,1 мкг/кг (100 нг/кг), 0,3 мкг/кг (300 нг/кг), 0,9 мкг/кг (900 нг/кг), 2,7 мкг/кг (2700 нг/кг), 8,1 мкг/кг (8100 нг/кг)) с определением средней и относительной оптической плотности и последующим построением калибровочной кривой, по которой определяли концентрацию рактопамина в исследуемых растворах.

1.3 Методика определения предела обнаружения рактопамина в мясе и печени. Для определения предела обнаружения (limit of detection - LOD) использовали формулу 1:

LOD = х + 3xs, (1)

где x - средняя арифметическая концентрация аналита;

s - стандартное отклонение шума. Среднюю арифметическую концентрацию аналита рассчитывали по формуле 2:

X = -

п

(2)

где - сумма всех значений анализируемого аналита;

п - количество параллельных измерений. Стандартное отклонение шума рассчитывали по формуле 3:

(3)

•ш

где s - стандартное отклонение шума; х - измеренная концентрация аналита; х - средняя арифметическая концентрация аналита; п — количество параллельных измерений. 1.4 Методика расчета предела количественного определения рактопамина в мясе и печени. Определение предела количественного определения (limit of quantitation - LOQ) рассчитывали по формуле 4:

LOQ = х + 9xs, (4)

где л - средняя арифметическая концентрация аналита; э — стандартное отклонение.

1.5 Методика определения нзвлекаемости рактопамина из проб мяса индейки. Для расчета определения степени извлечения применили формулу 5:

Л = —хЮО, (5)

где х - измеренное количество аналита; х0 - внесенное количество аналита; Я - степень извлечения.

Относительное стандартное отклонение (коэффициент вариации) вычисляли по формуле 6:

К = ^х100, (6)

х

где V - коэффициент вариации; х - среднее содержание аналита; б - стандартное отклонение.

1.6 Изучение влияния температурной обработки мяса и печени на содержание рактопамина. При изучении влияния сроков хранения на содержание рактопамина часть проб мяса замораживали при температуре минус 18 °С и длительно хранили в течение 30, 60 и 270 суток, а также подвергали процессу варки в кипящей воде до достижения температуры 100°С с последующим исследованием через 30, 60 и 120 минут. Интервал, в котором лежит измеряемая величина, вычисляли по формуле 7:

х±кхБ, (7)

где х - измеренное значение аналита;

к - коэффициент охвата; б - стандартное отклонение.

Измерение температурных показателей проводили согласно ГОСТ'а 29224-91 «Посуда лабораторная стеклянная. Термометры жидкостные стеклянные лабораторные».

1.7 Статистическая обработка экспериментальных данных.

Статистическую обработку данных проводили методом вариационной статистики с определением средней арифметической величины, стандартного отклонения, предела обнаружения, предела количественного определения, коэффициента

вариации и степени извлечения согласно рекомендаций «Простое руководство для пользователей по разработке и валидации методов» (Хамиде 3. Сеньюва & Джон Гилберт, 2011).

2 Результаты исследований 2.1 Построение калибровочной кривой по стандартным растворам рактопамина

Для построения калибровочного графика использовали стандартные растворы

рактопамина с 0 мкг/кг (0 нг/кг), 0,1 мкг/кг (100 нг/кг), 0,3 мкг/кг (300 нг/кг), 0,9

мкг/кг (900 нг/кг), 2,7 мкг/кг (2700 нг/кг), 8,1 мкг/кг (8100 нг/кг). Оптическую

плотность микротитровального планшета в лунках при 450 нм измеряли с помощью

спектрофотометра ЕЕОЕТЕСТ 96. Учет результатов проводили с помощью

специализированного программного обеспечения ШОА®8ой.

Средние значения оптической плотности, измеренной в лунках со

стандартными и исследуемыми растворами, делилось на среднее значение

оптической плотности, измеренной в лунках с первым (нулевым) стандартом,

результат умножался на 100. Таким образом, результат измерения оптической

плотности выражается в процентах от оптической плотности лунки с нулевым

стандартом, то есть:

Средняя оптическая плотность лунки со стандартом (пробой)

X ] од = о/о поглощения

Средняя оптическая плотность лунки с нулевым стандартом

Результаты показаны в таблице 1.

Таблица 1 - Результаты измерения концентрации стандартных растворов

рактопамина

Концентрация Средняя Коэффициент Относительная Измеренная

стандартных оптическая вариации, оптическая концентрация

растворов, плотность % плотность стандартных

мкг/кг (нг/кг) лунки со раствора в растворов в

стандартом лунке, % лунке, мкг/кг

(нг/кг)

1 2 3 4 5

0 1,185 0,2 100,0

0,1(100) 1,060 1,3 89,5 0,1(100,13)

0,3 (300) 0,873 3,2 73,7 0,3 (299,34)

1 2 О J> 4 5

0,9 (900) 0,557 8,3 47,0 0,9 (901,75)

2,7 (2700) 0,329 1,7 27,8 2,7 (2697,86)

8,1 (8100) 0,148 0,5 12,5 8,1 (8099,63)

По величинам относительной оптической плотности, вычисленным для стандартных растворов и соответствующим значениям концентрации рактопамина в мкг/кг (нг/кг), была построена калибровочная кривая (рисунок 1), которая использована при проведении исследований проб мяса на наличие рактопамина для получения достоверных результатов.

У

го

CMJ йо

Q тоо оо зоо.оо эоо.оо г70и,(да вюо.оо ^

Г1о оси ОХ - концентрация стандартных растворов, нг/кг По оси ОУ - относительная оптическая плотность раствора в лунке, %

Рисунок 1 — Калибровочная кривая стандартных растворов рактопамина 2.2 Определение предела обнаружения и предела количественного определения рактопамина при исследовании свинины Были проведены исследования, в рамках которых определяли предел обнаружения и предел количественного определения рактопамина в свинине. Пробоподготовку выполняли согласно методике. Оптическую плотности микротитровального планшета измеряли с помощью спектрофотометра LEDETECT 96, снабженного фильтром длиной волны 450 нм. Учет результатов проводили с помощью специализированного программного обеспечения RIDA®Soft.

Для определения предела обнаружения (limit of detection - LOD) использовали формулу 1: LOD = х + 3*s, где х - средняя арифметическая концентрация аналита: s - стандартное отклонение шума.

Определение предела количественного определения (limit of quantitation -LOQ) рассчитывали по формуле 4: LOQ = х + 9><s, где i - средняя арифметическая концентрация аналита; s — стандартное отклонение.

Среднюю арифметическую концентрацию аналита рассчитывали по формуле - YV- VI

2:х = —— ,где ¿_,х, ~ сумма всех значений анализируемого аналита; п - количество параллельных измерений.

Стандартное отклонение - по формуле 3: s = , где s

V п-1

стандартное

отклонение; х - измеренная концентрация аналита; х - средняя арифметическая концентрация аналита; п - количество параллельных измерений. Результаты представлены в таблице 2. Таблица 2 - Определение предела обнаружения рактопамина в свинине

Нумерация проб № п/п Оптическая плотность раствора проб в лунке, % Измеренная концентрация раствора проб в лунке (мкг/кг)

1 74,4 0,209

2 70,8 0,255

3 74,3 0,210

4 72,0 0,238

5 70,8 0,255

6 68,3 0,291

7 76,3 0,262

8 77,2 0,179

Среднее 0,237

Стандартное отклонение 0,036

Предел обнаружения 0,345

Предел количественного определения 0,561

Таким образом, из таблицы 2 видно, что предел обнаружения рактопамина свинине составил 0,345 мкг/кг, а предел количественного определения - 0,561 мкг/кг.

2.3 Определение предела обнаружения и предела количественного определения рактопамина при исследовании говядины и говяжьей печени

Были проведены исследования, в рамках которых определяли предел обнаружения и предел количественного определения рактоп амина в говядине и говяжьей печени. Пробоподготовку выполняли согласно методике. Оптическую плотность микротитровалыгого планшета измеряли с помощью спектрофотометра LEDETECT 96, снабженного фильтром длиной волны 450 нм. Учет результатов проводили с помощью специализированного программного обеспечения RIDA®Soft.

Для определения предела обнаружения (limit of detection - LOD) использовали формулу 1: LOD = * + 3><s, где x — средняя арифметическая концентрация аналита; s - стандартное отклонение шума.

Определение предела количественного определения (limit of quantitation -LOQ) рассчитывали по формуле 4: LOQ = х + 9*s, где х — средняя арифметическая концентрация аналита; s — стандартное отклонение.

Среднюю арифметическую концентрацию аналита рассчитывали по формуле

2:х= ,где У^х, - сумма всех значений анализируемого аналита; п - количество п

параллельных измерений.

Стандартное отклонение - по формуле 3: 5 = ^А*_х-1~, где б - стандартное

V л -1

отклонение; х - измеренная концентрация аналита; х - средняя арифметическая концентрация аналита; п — количество параллельных измерений. Результаты представлены в таблицах 3 и 4.

Таблица 3 — Определение предела обнаружения рактопамина в говядине

Нумерация проб Оптическая плотность Измеренная концентрация

№ п/п раствора проб в лунке, % раствора проб в лунке

(мкг/кг)

1 2 3

1 84,1 0,160

2 81,8 0,188

3 71,3 0,334

4 84,2 0,158

5 73,4 0,303

6 76,9 0,254

7 77,3 0,248

8 75,6 0,272

1 2 3

9 76,8 0,255

10 76,7 0,256

11 75,2 0,278

12 74,6 0,286

13 78,2 0,235

14 79,8 0,214

15 77,8 0,241

16 82,0 0,185

17 85,1 0,148

18 78,6 0,166

19 75,0 0,203

Среднее 0,231

Стандартное отклонение 0,053

Предел обнаружения 0,390

Предел количественного определения 0,708

Таблица 4 - Определение предела обнаружения рактопамина __в говяжьей печенн

Нумерация проб № п/п Оптическая плотность раствора проб в лунке, % Измеренная концентрация раствора проб в лунке (мкг/кг)

1 70,0 0,266

2 76,0 0,191

3 77,0 0,182

4 _ 89,7 0,100

5 67,2 0,310

6 75,2 0,200

7 75,6 0,195

8 76,7 0,184

Среднее 0,204

Стандартное отклонение 0,062

Предел обнаружения 0,390

Предел количественного определения 0,762

Таким образом, из таблиц 3, 4 видно, что предел обнаружения рактопамина в говядине составил 0,390 мкг/кг, в говяжьей печени - 0,390 мкг/кг, а предел количественного определения - 0,708 мкг/кг и 0,762 мкг/кг, соответственно.

2.4 Определение предела обнаружения и предела количественного определения рактопамина при исследовании мяса индейки

Были проведены исследования, в рамках которых определяли предел обнаружения и предел количественного определения рактопамина в мясе индейки. Пробоподготовку выполняли согласно методике. Оптическую плотность микротитровального планшета измеряли с помощью спектрофотометра LEDETECT 96, снабженного фильтром длиной волны 450 нм. Учет результатов проводили с помощью специализированного программного обеспечения RIDA®Soft.

Для определения предела обнаружения (limit of detection - LOD) использовали формулу 1: LOD = x + 3xs, где x - средняя арифметическая концентрация аналита; s — стандартное отклонение шума.

Определение предела количественного определения (limit of quantitation -LOQ) рассчитывали по формуле 4: LOQ = х + 9xs, где I - средняя арифметическая концентрация аналита; s - стандартное отклонение.

Среднюю арифметическую концентрацию аналита рассчитывали по формуле

= —^-.где ~ сумма всех значений анализируемого аналита; п - количество параллельных измерений.

Стандартное отклонение - по формуле 3: s = -J-

ЕИГ

и-1

где s - стандартное

отклонение; х - измеренная концентрация аналита; х - средняя арифметическая концентрация аналита; п - количество параллельных измерений.

Результаты представлены в таблице 5. Таблица 5 - Определение предела обнаружения рактопамина в мясе индейки

Нумерация проб № п/п Оптическая плотность раствора проб в лунке, % Измеренная концентрация раствора проб в лунке (мкг/кг)

1 2 3

1 73,8 0,310

2 75,8 0,277

3 75,4 0,281

4 77,8 0,244

17 Продолжение таблицы 5

1 2 3

5 72,1 0,340

6 80,6 0,205

7 76,7 0,261

8 73,2 0,319

9 80,7 0,204

10 76,6 0,264

11 78,6 0,233

12 81,3 0,197

13 81,3 0,196

Среднее 0,256

Стандартное отклонение 0,048

Предел обнаружения 0,400

Предел количественного определения 0,688

Таким образом, из таблицы 5 видно, что предел обнаружения рактопамина в мясе индейки - 0,400 мкг/кг, а предел количественного определения - 0,688 мкг/кг.

2.4.1. Определение степени извлечения и относительного стандартного отклонения для определения содержания рактопамина в пробах мяса индейки

В связи с тем, что в методике ИФА не предусмотрено определение степени извлечения и относительного стандартного отклонения для определения содержания рактопамина в пробах мяса индейки, нами проведены исследования по определению этих показателей. Для этого пробы мяса индейки, искусственно контаминированных рактопамином из расчета 1000 нг/кг (1,0 мкг/кг) были получены следующие результаты:

- для расчета определения степени извлечения применили формулу 5: д = — хЮО, где х - измеренное количество аналита; х0 - внесенное количество

хо

аналита; Я - степень извлечения;

- относительное стандартное отклонение (коэффициент вариации) вычисляли по формуле 6: V = 100, где V - коэффициент вариации; х - среднее содержание аналита; э - стандартное отклонение.

Результаты представлены в таблице 6.

Таблица 6 - Степень извлечения и относительное стандартное отклонение для определения содержания рактопамина в пробах мяса индейки

Мясо индейки из частного хозяйства с добавкой рактопамина из расчета 1000 нг/кг

Относительная оптическая плотность проб в лунке, %

48,6

49,9

50,1

48,9

52,6

53,8

46,3

55,7

53,5

55,5

Содержание рактопамина, мкг/кг

Степень извлечения рактопамина, %

1,030

0,972

0,964

1,016

0,860

0,815

1,138

0,747

0,828

0,755

103

97

96

102

86

82

114

75

83

76

Среднее (х)

Среднее (Я)

0,913

91

Относительное стандартное отклонение (%КБР)

14

Как видно из таблицы 6, что степень извлечения рактопамина в мясе индейки, искусственно контаминированных из расчета 1000 нг/кг (1,0 мкг/кг) составила 91 %. Относительное стандартное отклонение (коэффициент вариации) составило 14 %, из чего следует, что методика соответствует критерию оценки пригодности метода (до 23,0 %) (согласно требованиям, приведенным решением Евросоюза № 2002/657/ЕС).

3 Определение стимулятора роста - рактопамина в мясе и печени импортного и отечественного происхождения 3.1 Исследование свинины

Исследовали на наличие рактопамина 12 образцов свинины, поступивших из Дании, Парагвая, Бразилии, Испании и Российской Федерации, результаты представлены в таблице 7. В результате проведенных исследований наличие рактопамина в свинине обнаружили в двух пробах из Дании в количестве 0,516 мкг/кг и 0,906 мкг/кг, при положительном ответе контрольной пробы (2,55 мкг/кг).

Таблица 7 - Результаты исследований по определению рактонамина в свинине

№ п/п Вид мяса Страна -производитель Результаты измерений, мкг/кг

1 Свинина Дания 0,516

2 Свинина Дания 0,906

3 Свинина Дания не обнаружено

4 Свинина Бразилия не обнаружено

5 Свинина Россия не обнаружено

6 Свинина Россия не обнаружено

7 Свинина Россия не обнаружено

8 Свинина Россия не обнаружено

9 Свинина Парагвай не обнаружено

10 Свинина Испания не обнаружено

11 Свинина Испания не обнаружено

12 Свинина Испания не обнаружено

13 Контроль положительная проба 2,550

отрицательная проба не обнаружено

Примечание: Здесь и далее в качестве положительных проб (наличие рактопамина) использовали пробы мяса, представленные фирмой ООО «Компания Стайлаб», которые подтверждены методом хромато-масс-спектрометрии (ВГНКИ).

3.2 Исследование говядины

Исследовали на наличие рактопамина 19 образцов говядины, поступивших из различных стран: Бразилии, Украины, Литвы, Белоруссии, Уругвая, Германии, что дано в таблице 8. В результате проведенных исследований наличие рактопамина в говядине не обнаружено при положительном ответе контрольной пробы (1,371 мкг/кг).

Таблица 8 - Результаты исследований по определению рактопамина в говядине

№ п/п Вид мяса Страна — Результаты измерений,

производитель мкг/кг

1 2 3 4

1 Говядина Бразилия не обнаружено

2 Говядина Бразилия не обнаружено

3 Говядина Бразилия не обнаружено

4 Говядина Бразилия не обнаружено

5 Говядина Литва не обнаружено

6 Говядина Литва не обнаружено

7 Говядина Уругвай не обнаружено

8 Говядина Уругвай не обнаружено

9 Говядина Германия не обнаружено

1 2 3 4

10 Говядина Германия не обнаружено

11 Говядина Германия не обнаружено

12 Говядина Украина не обнаружено

13 Говядина Украина не обнаружено

14 Говядина Белоруссия не обнаружено

15 Говядина Белоруссия не обнаружено

16 Говядина Белоруссия не обнаружено

17 Говядина Белоруссия не обнаружено

18 Говядина Белоруссия не обнаружено

19 Говядина Белоруссия не обнаружено

20 Контроль положительная проба 1,371

отрицательная проба не обнаружено

3.3 Исследование говяжьей печени

Исследовали на наличие рактоиамина 12 образцов говяжьей печени, поступивших из Аргентины и США, результаты представлены в таблице 9. В результате проведенных исследований наличие рактопамина в говяжьей печени обнаружили в четырех пробах из США, где концентрация рактопамина превысила верхнюю границу рабочего диапазона метода (>8,100 мкг/кг), при положительном ответе контрольной пробы (1,0 мкг/кг).

Таблица 9 - Результаты исследований по определению рактопамина ____в говяжьей печени

№ п/п Вид субпродукта Страна -производитель Результаты измерений, мкг/кг

1 Говяжья печень Аргентина не обнаружено

2 Говяжья печень Аргентина не обнаружено

3 Говяжья печень Аргентина не обнаружено

4 Говяжья печень Аргентина не обнаружено

5 Говяжья печень Аргентина не обнаружено

6 Говяжья печень Аргентина не обнаружено

7 Говяжья печень Аргентина не обнаружено

8 Говяжья печень Аргентина не обнаружено

9 Говяжья печень США >8,100

10 Говяжья печень США >8,100

11 Говяжья печень США >8,100

12 Говяжья печень США >8,100

13 Контроль положительная проба 1,0

отрицательная проба не обнаружено |

3.4 Исследование мяса индейки

Исследовали на наличие рактопамина 10 образцов мяса индейки, поступивших из Франции, Бразилии, США и Российской Федерации, результаты представлены в таблице 10. В результате проведенных исследований наличие рактопамина в мясе индейки не обнаружено, при положительном ответе контрольной пробы (0,715 мкг/кг).

Таблица 10 - Результаты исследований по определению рактопамина в _мясе индейки

№ п/п Вид мяса Страна - Результаты измерений,

производитель мкг/кг

1 Мясо индейки Франция не обнаружено

2 Мясо индейки Франция не обнаружено

3 Мясо индейки Россия не обнаружено

4 Мясо индейки Россия не обнаружено

5 Мясо индейки Россия не обнаружено

6 Мясо индейки Бразилия не обнаружено

7 Мясо индейки Бразилия не обнаружено

8 Мясо индейки США не обнаружено

9 Мясо индейки США не обнаружено

10 Мясо индейки США не обнаружено

11 Контроль положительная проба 0,715

отрицательная проба не обнаружено

4 Изучение влияния температурной обработки мяса н печени на

содержание рактопамина

Поскольку повышенный уровень стимулятора роста - рактопамина в мясе и печени выдвигает определенные ограничения для использования такого сырья при производстве продуктов питания, поэтому нахождение путей его технологической реализации является актуальной задачей.

В опытах использовали пробы свинины, говядины, говяжьей печени и мяса индейки, с целью определения возможности снижения уровня стимулятора роста -рактопамина в мясе, изучили влияние температурной обработки мяса и печени - его замораживания с последующим хранением и варки.

Таким образом, используя метод иммуноферментного анализа исследовали пробы свинины, говядины, говяжьей печени и мясо индейки на содержание рактопамина после замораживания при минус 18 °С и длительного хранения в

течение 30, 60 и 270 суток, а также процесса варки в кипящей воде до достижении температуры 100°С с последующим исследованием через 30, 60 и 120 минут.

По результатам проведенных исследований установлено, что процессы замораживания мяса (г = -18 °С), его последующего хранения (до 270 суток) и варки (30-120 мин.) при температуре 100°С не снижают уровня содержания рактопамина в исследуемых пробах в сравнении с исходной его концентрацией (срок наблюдения) и длительное время сохраняется в них.

Препарат рактопамин длительное время сохраняется в замороженных продуктах и выдерживает термическую обработку.

4.1 Влияние процессов замораживания и варки на содержание рактопамина в свинине, говядине и говяжьей печени

В первом опыте изучалось влияние замораживания (1 = - 18 °С) последующее хранение проб свинины, говядины и говяжьей печени исследованием через 30, 60, 270 суток. Интервал, в котором лежит измеряема величина, вычисляли по формуле 7: х±к*Б, где х - измеренное значение аналита; к коэффициент охвата; в - стандартное отклонение (Руководство по использовани] оценок повторяемости, воспроизводимости и правильности при оценк неопределенности измерений, 2007). Результаты проведены в таблице 11. Согласи ЫШАБСЯЕЕЫ® Яасюратш Art.No.R990!, при исследовании свинины и говядинь учитывали стандартные расчеты: степень извлечения (80% и 78%) и относительно стандартное отклонение (6% и 11 %).

Таблица II - Влияние процесса замораживания и последующего

хранения свинины, говядины и говяжьей печени на содержание рактопамина

Вид мяса и субпродукта Изначальная концентрация рактопамина, мкг/кг Температура хранения, °С Концентрация рактопамина через 30 сут. Концентрация рактопамина через 60 сут. Концентрация рактопамина через 270 сут.

Свинина 0,906 -18 0,905±0,11 0,900±0,11 0,906±0,11

Говядина 1,371 -18 1,3 81 ±0,3 1,378±0,3 1,375±0,3

Говяжья печень >8,1 -18 >8,1 >8,1 >8,1

Во втором опыте было изучено влияние варки проб свинины и говядины в кипящей воде до достижении температуры 100°С с последующим исследованием через 30, 60 и 120 минут. Результаты анализа приведены в таблице 12.

Таблица 12 - Влияние процесса варки свинины и говядины на содержание __ рактопамина__

Вид мяса Изначальная концентрация рактопамина, мкг/кг Концентрация рактопамина после варки в течение 30 мин, мкг/кг Концентрация рактопамина после варки в течение 60 мин, мкг/кг Концентрация рактопамина после варки в течение 120 мин, мкг/кг

Свинина 0,906 0,905±0,11 0,908±0,11 0,904±0,11

Говядина 1,371 1,363±0,3 1,386±0,3 1,223±0,27

Таким образом, по результатам исследований было установлено, что процессы

замораживания и варки проб свинины, говядины и говяжьей печени не снижают уровня содержания рактопамина.

4.2 Влияние процессов замораживания и варки на содержание рактопамина в мясе индейки

Было проведено исследование положительной пробы мяса индейки, искусственно контаминированной рактопамином из расчета 1000 нг/кг (1 мкг/кг) на содержание рактопамина после замораживания и хранения, а также воздействия процесса варки при температуре 100 °С с последующим исследованием через 30, 60 и 120 минут. Интервал, в котором лежит измеряемая величина, вычисляли по формуле 7: х±к><8, где х — измеренное значение аналита; к — коэффициент охвата; в -стандартное отклонение. Результаты исследований проведены в таблицах 13 и 14.

Таблица 13 - Влияние процесса замораживания и последующего хранення мяса индейки на содержание рактопамина__

Мясо индейки, Изначальная Температура Концентрация

контаминиро- концентрация хранения, °С рактопамина

ванное рактопамина, в течение 30 после

рактопамином, нг/кг (мкг/кг) мкг/кг суток замораживания и хранения 30 суток, мкг/кг

1000(1,0) 1,03 -18 1,02±0,29

Таблица 14 - Влияние процесса варки мяса индейки на содержание _|_ рактопамина_

Мясо индейки, контами-нированное рактопа-мином, нг/кг (мкг/кг) Изначальная концентрация рактопамина, мкг/кг Концентрация рактопамина после варки в течение 30 мин, мкг/кг Концентрация рактопамина после варки в течение 60 мин, мкг/кг Концентрация рактопамина после варки в течение 120 мин, мкг/кг

1000 (1,0) 1,03 1,028±0,29 1,023±0,29 1,030±0,29

Таким образом, по результатам исследований было установлено, что процессы замораживания и варки проб мяса индейки не снижают уровня содержания рактопамина.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

1. Усовершенствована методика иммуноферментного анализа для обнаружения стимулятора роста - рактопамина в мясе свиней, крупного рогатого скота и индейки, при этом определены следующие критерии:

- предел обнаружения (limit of detection - LOD) рактопамина в свинине -0,345 мкг/кг, в говядине - 0,390 мкг/кг, в говяжьей печени - 0,390 мкг/кг, в мясе индейки - 0,400 мкг/кг;

- предел количественного определения (limit of quantitation - LOQ) рактопамина в свинине - 0,561 мкг/кг, в говядине - 0,708 мкг/кг, в говяжьей печени - 0,762 мкг/кг, в мясе индейки - 0,688 мкг/кг.

2. Методом иммуноферментного анализа рактопамин обнаружен в 9,8% исследованных проб мяса и печени (в двух пробах свинины из Дании в количестве 0,516 мкг/кг и 0,906 мкг/кг и в четырех пробах говяжьей печени из США - более 8,100 мкг/кг); в мясе отечественного происхождения рактопамин не обнаружен.

3. Экспериментально установлено, что замораживание мяса при температуре -18 °С и последующее хранение до 270 суток, а также варка в течение 30-120 минут при температуре 100°С не приводят к снижению уровня содержания рактопамина.

4. Полученные результаты дают основания считать, что мясо и субпродукты, содержащие рактопамин, не должны подлежать реализации на пищевые цели, независимо от вида их обработки.

5. Предложена технологическая схема исследований мяса и субпродуктов на наличие рактопамина, при которой на первом этапе рекомендуется проводить анализ скрининговым методом ИФЛ, а на втором - пробу с положительным ответом направлять на анализ методом хромато-масс-спектрометрии.

ПРЕДЛОЖЕНИЯ ДЛЯ ПРАКТИКИ

Для практики предложен усовершенствованный метод иммуноферментного анализа: «Методическое пособие по количественному определению стимулятора роста - рактопамина в мясе и печени на основе метода иммуноферментного анализа» (утв. Отделением ветеринарной медицины РАСХН 08.02.2012г.), которое предложено для использования в производственных лабораториях в целях эффективного контроля на наличие рактопамина в говядине, говяжьей печени, свинине и мясе индейки, как в импортируемых в Российскую Федерацию из различных стран, так и в порядке контроля внутреннего производства.

Данная схема исследований с применением скринингового метода ИФА обеспечивает одновременный анализ большого количества проб (~ 100) и значительно сокращает затраты на проведение исследования в сравнении с методом хромато-масс-спектрометрии.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Лемясева, С. В. Определение стимулятора роста - рактопамина в мясе / С. В. Лемясева // Международная научно-практическая конференция, посвященная 100-летию рождения Заслуженного деятеля науки, доктора ветеринарных наук, профессора Абуладзе К.И. и доктора ветеринарных наук, профессора Колоболотского Г.В. М.; в МГАВМиБ им. К.И. Скрябина. - 2012. - С.92-94.

2. Лемясева, С. В. Определение содержания гормонального стимулятора роста рактопамина з мясе методом иммуноферментного анализа / С. В. Лемясева

//Журнал «Ветеринария Кубани». -2013. -№1.-С.10-12. [Примечание: в связи с технической ошибкой название статьи на стр. 10-12 журнала №1/2013 следует читать в следующей редакции: «Определение содержания стимулятора роста рактопамина в мясе методом иммуноферментного анализа» (Журнал «Ветеринария Кубани». 2013. - №2. - С.25)].

3. Лемясева, С. В. Использование стимуляторов роста сельскохозяйственных животных и безопасность продуктов животноводства / С. В. Лемясева // Российский журнал «Проблемы ветеринарной санитарии, гигиены и экологии». - 2013. -№1(9). — С.97-101.

4. Лемясева, С. В. Проблема применения стимулятора роста - рактопамина в животноводстве / С. В. Лемясева // Газета «Ветеринарная жизнь». — 2013. - №7(223). -С.6.

5. Лемясева, С. В. Эффективный контроль мяса и мясопродуктов на наличие рактопамина / С. В. Лемясева // Актуальные вопросы товароведения и безопасности товаров. Материалы Международной научно-практической конференции. Коломна, МГОСГИ. - 2013. - Т. 1. - С.77-79.

6. Лемясева, С. В. Определение стимулятора роста рактопамина в мясе индейки методом иммуноферментного анализа / С. В. Лемясева // Российский журнал «Проблемы ветеринарной санитарии, гигиены и экологии». - 2013. -№2(10). — С.12-16.

7. Лемясева, С. В. Влияние температурных факторов на содержание в пробах мяса и печени стимулятора роста - рактопамина / С. В. Лемясева // Российский журнал «Проблемы ветеринарной санитарии, гигиены и экологии». — 2014. — №1(11).-С. 23-27.

Подписано в печать 19.12.2014г. Усл. печ. л. 1,0, гараж 80 экз., заказ 462/5 ГНУ ВНИИВСГЭ 123022, Москва, Звенигородское ш„ д.5.