Определение гена полифункционального пептида гуманина и белков, физически взаимодействующих с ним

Максимов, Вадим Владимирович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Определение гена полифункционального пептида гуманина и белков, физически взаимодействующих с ним
ВАК РФ 03.02.07, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Определение гена полифункционального пептида гуманина и белков, физически взаимодействующих с ним"

На правах рукописи

МАКСИМОВ ВАДИМ ВЛАДИМИРОВИЧ

ОПРЕДЕЛЕНИЕ ГЕНА ПОЛИФУНКЦИОНАЛЬНОГО ПЕПТИДА ГУМАШША И БЕЛКОВ, ФИЗИЧЕСКИ ВЗАИМОДЕЙСТВУЮЩИХ С НИМ.

03.02.07-Генетика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

О 5 СЕН 2013

Москва-2013

005532766

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте молекулярной генетики Российской академии наук

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор Зам. директора по науке Зав. ОВиКМГ

ФГБУН ИМГ РАН, г. Москва

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук

Зам. директора по научным вопросам

Зав. Лабораторией

ФГБУН ИБГ РАН, г. Москва

доктор биологических наук, доцент

руководитель группы

ИФР им. К.А. Тимирязева РАН, г. Москва

Тарантул Вячеслав Залманович

Шидловский Юлий Валерьевич

Голденкова-Павлова Ирина Васильевна

Ведущая организация:

Федеральное государственное бюд жетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Российский химико-технологический университет имени Д.И. Менделеева», г. Москва

Защита состоится 013 г. в 14— часов на заседании диссертационного

совета Д 217.013.01 при ФГУП «Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов» по адресу: 117545, г. Москва, 1-ый Дорожный проезд, д. 1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУП «ГосНИИгенгетика».

Автореферат разослан Л? » ¿(/гудС; 2013 г.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат химических наук, доцент

Татьяна Львовна Воюшина

Общая характеристика работы.

Актуальность исследования. Диагноз диффузная крупноклеточная В-клеточная лимфома (ДКВКЛ) ставится в 30% всех случаев не-Ходжкинских лимфом (Blood 1997; V. 89(11): pp. 3909-3918). Эта агрессивная лимфома остается смертельной для 30% всех пациентов и 45% пациентов с наиболее неблагоприятным прогнозом (Sehn L.H. et al., 2007). Таким образом, разработка более эффективных методов лечения этого заболевания по-прежнему актуально. Рациональный подход к поиску эффективной терапии для ДКВКЛ требует понимания механизмов патогенеза для этого типа лимфомы. Несмотря на значительные успехи, достигнутые за последние три десятилетия, наши знания о молекулярных и клеточных механизмах этого заболевания всё ещё фрагментарны и далеко не полны.

Одним из этапов в изучении этих механизмов было определение изменений экспрессии генов в ДКВКЛ по сравнению с В-лимфоцитами здорового человека. В нашей лаборатории для достижения этой цели был успешно использован метод вычитающей гибридизации. В результате этих исследований удалось идентифицировать ряд генов с изменённой экспрессией в ДКВКЛ (Николаев А.И. и др., 1999; Tarantul V.Z. et al., 2000; Tarantul V. et al., 2001; Николаев А.И. и др., 2001; Nenasheva V.V. et al., 2005). Полиаденилированные транскрипты митохондриального гена 16S рибосомальной РНК (рРНК) были среди генов, сверхэкспрессированных в ДКВКЛ (Tarantul V. et al., 2001; Nenasheva V.V. et al., 2005). Значение сверхэкспрессии этих транскриптов в лимфомогенезе не было исследовано и, следовательно, изучение этого явления могло осветить неизвестные раннее механизмы лимфомогенеза.

Целью настоящего исследования является установление, кодирует ли митохондриальный ген 16S рРНК какие-либо биологически-активные белки или пептиды и, если таковые имеются, исследование механизмов их биологической активности. Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

1. Используя биоинформационный подход определить, способны ли полиаденилированные транскрипты человеческого митохондриального гена 16S рРНК кодировать экспрессирующиеся белки или пептиды.

2. При наличии таких белков или пептидов, найти с помощью дрожжевого двухгибридного скрининга белки, взаимодействующие с ними физически, что может прояснить молекулярные механизмы, посредством которых сверхэкспрессия полиаденилированных транскриптов гена 16S рРНК связана с процессом лимфомогенеза.

3. Для взаимодействий, потенциально важных для лимфомогенеза, определить участки белков и/или пептидов, отвечающие за эти взаимодействия, посредством ко-иммунопреципитации. Решение этой задачи способствует дальнейшему изучению функционального значения таких взаимодействий для лимфомогенеза и поиску путей к терапии этого злокачественного заболевания.

Научная новизна и практическая ценность исследования. Впервые представлены детальные биоинформационные доказательства того, что митохондриальная 168 рибосомальная РНК (рРНК) человека кодирует полифункциональный пептид гуманин. Впервые сформулирована и обоснована гипотеза о том, что гуманин может быть онкопептидом и роль сверхэкспрессии полиаденилированных транскриптов гена 16Б рРНК в лимфомогенезе может быть связана с тем, что эти транскрипты кодируют пептид гуманин. Методом дрожжевого двухгибридного скрининга обнаружены физические взаимодействия гуманина с 7 различными белками: протеасомная субъедининца а5 (ПСМА5); белок теплового шока, 90 кДа, а, класс А, член 1 (БТШ90АА1); неорганическая пирофосфатаза 1 (ПФА1); пероксиредоксин 1 (ПРДКС1); фосфобелок М-фазы 8 (ФБМФ8); эукариотический фактор элонгации трансляции 1, а-1 (ЭФЭТ1А1) и митохондриальный фактор элонгации трансляции Те (МФЭТТ8). Все взаимодействия обнаружены впервые. Впервые также физическое взаимодействие гуманина с фосфобелком М-фазы 8, который участвует в метастазировании раковых клеток, подтверждено методом ко-иммунопреципитации сверхэкспрессированных белков из культур клеток млекопитающих. Впервые определено, что за физическое взаимодействие гуманина и фосфобелка М-фазы 8 отвечают участок гуманина с 5 по 12 а.о. и участок фосфобелка М-фазы 8 с 431 по 560 а.о.. Полученные данные, указывающие на то, что пептид гуманин может иметь онкогенный потенциал, особенно важны в свете того, что идут исследования возможности использования этого пептида для терапии нейродегенеративных заболеваний.

Апробация работы. Работа была апробирована на заседании Учёного совета ФГБУН ИМГ РАН 20 мая 2013 года и на заседании секции генетики Учёного совета ФГУП «ГосНИИгенгетика» 22 мая 2013 года.

Публикации. По материалам диссертации было опубликовано 5 статей в рецензируемых журналах, в том числе, в 3 международных рецензируемых журналах.

Структура и объём диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, выводов, перечня условных обозначений, списка литературы, 2-х приложений и 4-х глав: «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты» и «Обсуждение

результатов». Работа изложена на 117 страницах машинописного текста, включая 7 таблиц и 25 рисунков. Список использованной литературы состоит из 162 источников.

Содержание работы.

Обзор литературы. Обзор литературы состоит из двух частей. Первая часть посвящена анализу эффекта Варбурга (Warburg О., 1956), заключающемуся в повышении доли гликолиза относительно окислительного фосфорилирования в раковых клетках. Обосновано утверждение, что эффект Варбурга, в общем случае, возникает скорее вследствие интенсификации гликолиза, чем вследствие ослабления окислительного фосфорилирования. Рассматрены данные по мутациям, ведущим к онкогенезу, в генах, кодирующих ферменты цикла Кребса: SDHD (succinate dehydrogenase complex, subunit D), FH (fumarate hydratase), IDH1 и 2 (isocitrate dehydrogenase 1 и 2). Подчеркнуто, что мутации далеко не во всех генах, кодирующих ферменты цикла Кребса, ведут к раковым заболеваниям. Особенное внимание уделено соматическим мутациям в генах IDH1 и 2. Проанализированы данные, указывающие на то, что канцерогенное действие этих мутаций связано с появлением новой ферментной активности: мутантные ферменты катализируют превращение альфа-кетоглутарата в К(-)-2-гидроксиглутарат. Также описан «обратный эффект Варбурга» и влияние на онкогенез конечных продуктов гликолиза - 3-гидроксибутирата и L-лактата. В заключение обосновывана идея о том, что вся совокупность данных лучше объясняется представлением о сигнальной и онкогенной роли метаболитов гликолиза и, возможно, цикла Кребса, чем представлением об изменении энергетического баланса в раковой клетке.

Во второй части литературного обзора проанализированы данные, указывающие на существование большого класса длинных некодирующих РНК, в том числе, кольцевых РНК. Рассматрены примеры длинных некодирующих РНК, выполняющих роли онкогенов и опухолевых супрессоров, таких как XIST (X-inactive specific transcript), MALAT1 (Metastasis associated in lung adenocarcinoma transcript 1), HOT AIR (HOX transcript antisense intergenic RNA) и LET (Low expression in tumor). Обсуждено, что если молекулярные механизмы, вовлекающие дерегуляцию экспрессии длинных некодирующих РНК XIST, MALAT1 и HOTAIR в онкогенез, связаны с регуляцией транскрипции, то действие LET опосредовано, в основном, физическим взаимодействием этой РНК с белком NF90 (Nuclear factor of activated T cells, 90-kD), что приводит к дестабилизации и деградации этого белка. В заключение приведены некоторые данные по возможному участию полиаденилированных транскриптов митохондриального гена 16S рибосомальной РНК человека в лимфомогенезе и указание на то, что функция этих транскриптов в лимфомогенезе может быть связана с кодируемым ими нейропротекторным анти-апоптотическим пептидом гуманином. Так

как затрагиваемые вопросы являются темой настоящего исследования, то в обзоре литературы они затронуты вскользь и основное обсуждение может быть найдено в главах «Результаты» и «Обсуждение результатов». Тем не менее, на основании этих данных, обсуждена возможность того, что некоторые длинные некодирующие РНК кодируют пептиды.

Материалы и методы. В этом разделе описаны условия культивирования клеток кишечной палочки, дрожжей и культур клеток млекопитающих. Также описаны использованные методы трансформации клеток кишечной палочки и дрожжей и трансфекции культур клеток млекопитающих. Кроме того описаны рекомбинантные конструкты, использованные в исследовании, и методы их создания. Описаны процедуры иммунопреципитации и вестерн-блота, а также использованные антитела. Процедура нозерн-блота также была описана. В заключение описаны использованные биоинформационные методы. Карты плазмид, использованных в исследовании, могут быть найдены в приложении 1.

Результаты. В первой части данной главы проведён анализ митохондриальной 16S рРНК на наличие открытых рамок считывания (ОРС) длиннее 50 нуклеотидов. В результате было обнаружено 7 ОРС согласно митохондриальному генетическому коду трансляции позвоночных и 4 ОРС согласно стандартному генетическому коду трансляции (таблица 1). Одна из этих ОРС кодирует пептид, идентичный ранее открытому пептиду гуманину, ген которого был неизвестен. Чтобы определить этот ген, было проведено сравнение нуклеотидной последовательности мРНК гуманина с нуклеотидными последовательностями ядерного и митохондриального генома человека (таблица 2). Сравнение позволяет сделать вывод, что мРНК гуманина есть не что иное, как полиаденилированная митохондриальная 16S рРНК человека. Также проведено сравнение аминокислотной последовательности пептидов, кодируемых ОРС в ядерном и митохондриальном геноме человека, с аминокислотной последовательностью пептида гуманина (рисунок 1). Только митохондриальный ген 16S рРНК содержит ОРС, которая кодирует пептид, идентичный гуманину. Трансляция ОРС из ядерного генома человека ведёт к пептидам, содержащим по сравнению с гуманином замену 12 лейцина на серин. Другой группой исследователей было показано, что 12-ый лейцин необходим для нейропротекторной активности гуманина Hashimoto Y. et al., 2001b; Yamagishi Y. et al., 2003). Это указывает на то, что ядерные ОРС кодируют, по-видимому, нефункциональные пептиды, по крайней мере, в отношении нейропротекторной активности. Следует также отметить, что укороченный пептид, получающийся в результате концептуальной трансляции ОРС гуманина согласно митохондриальному генетическому коду трансляции позвоночных,

I " " 1

является полностью функциональным (Hashimoto Y. et al., 2001b; Yamagishi Y. et al., 2003).

Таблица 1. ОРС в человеческом митохондриальном гене 16S рРНКабв.

Участок человеческого гена Размер пептида, Генетический код

16SpPHK кодируемого ОРС (а.о.) трансляции

(порядковые номера

нуклеотидных остатков)

665-766 33 Митохондриальный, позвоночных

712-777 21 Митохондриальный, позвоночных

963-1028 21 Митохондриальный, позвоночных

963-1037 24г Стандартный

■НИ Ю34-1 шНННК ш

!_ ННюзвоночных^^Н

тмят») iE ■МСкшшршк, нМН1

1232-1288 18 Митохондриальный, позвоночных

^^НВпозвоночныхН1[^Н

320-1382НМШ ш ^ЙВНСтандартный^ВНВ!

штмж ш

№Ф№НН1 щ ЩВМСтандартпмйННЁК

а - Нуклеотидная последовательность гена 168 РНК взята из нуклеотидной последовательности человеческого митохондриального генома с инвентарным номером ЫСВ1 - АР346981.1. Порядковые номера нуклеотидов указаны от начала митохондриального гена 168 рРНК. б - В рассмотрение включены ОРС размером более 50 нуклеотидов.

в - Одинаковым цветом выделены ОРС, существующие в обоих генетических кодах трансляции, г - ОРС гуманина.

д - ОРС выходит за пределы гена 168 рРНК на 3'-конце на 7 нуклеотидов (митохондриапьный код трансляции) или на 31 нуклеотид (стандартный код трансляции).

Таким образом, совокупность данных указывает на то, анти-апоптотический пептид гуманин кодируется человеческим митохондриальным геном 16Б рРНК. Этот факт, в сочетании со сверхэкспрессией поли(А)-содержащих транскриптов митохондриального гена 168 рРНК человека в лимфомах, позволяет предположить, что гуманин является онкопептидом, что, в свою очередь, может объяснить роль I сверхэкспрессии поли(А)-содержащих транскриптов митохондриального гена168 рРНК человека в лимфомогенезе. Следует отметить, что наряду с анти-апоптотическими свойствами, независимые группы исследователей обнаружили у

Таблица 2. Сравнение нуклеотидной последовательности мРНК гуманина (АУ029066.1) с нуклеотидными последовательностями человеческого митохондриального и ядерного геномов.

Геном МСВ1 ОепВапк инвентарный номер Участок геномной нуклеотидной последовательности, имеющий сходство с мРНК гуманина Участок мРНК гуманина, имеющий сходство к геномным нуклеотидным последовательностям3 Сходство % Сходство ч.и.н./п.ч.н.6

Митохонд-риальный АР346981.1 КС257404.1 1685—3237г 1682-3234г 1-1553 1-1553 99,9 99,9 1151/1553д 1551/1553д

Ядерный, хромосома 11 ЭТ_009243.5 407832-406543 1-1290 92,9 1198/1290

Ядерный, хромосома 3 ЭТ_022475.4 511544-510509 1-1036 94,9 986/1039

а - мРНК гуманина имеет протяжённость в 1567 нуклеотидов. Из них первые 1553 нуклеотида являются продуктом транскрипции и последние 14 нуклеотидов представляют собой поли(А)-хвост. б - ч.и.н./п.ч.н. - число идентичных нуклеотидов / полное число нуклеотидов на сравниваемом участке, г - 16Б рРНК ген находится с 1673 по 3230 нуклеотид в нуклеотидной последовательности человеческого генома с N031 инвентарным номером АР346981.1. 168 рРНК ген находится с 1670 по 3227 нуклеотид в нуклеотидной последовательности человеческого генома с N031 инвентарным номером КС257404.1. д - Нуклеотидная последовательность мРНК гуманина идентична нуклеотидной последовательности человеческого митохондриального генома за исключением 2 нуклеотидных замен. Тимидин в 711 позиции мРНК гуманина (АУ029066.1) заменен на цитидин в митохондриальной нуклеотидной последовательности (АР346981.1, КС257404.1) и тимидин в 935 позиции мРНК гуманина заменён на аденин в митохондриальной нуклеотидной последовательности. Обе замены находятся вне ОРС гуманина и могут быть полностью объяснены полиморфизмом митохондриальной ДНК. Была клонирована кДНК, содержащая ОРС гуманина, с аденином вместо тимидина в 935 позиции. Замена аденина в 735 позиции РНК гуманина на тимидин является уже опубликованным полиморфизмом.

гуманина и многие другие функции. В частности, гуманин увеличивает синтез АТФ в лимфоцитах. Кроме того, гуманин является хемоаттрактантом и вызывает хемотаксис макрофагов. Гуманин также усиливает действие инсулина и снижает уровень глюкозы в крови. В дополнение, гуманин защищает от ишемии сердечной мышцы и мозговой ишемии. Этот пептид восстанавливает обучение и память в мышиных моделях болезни Альцгеймера и в мышах и крысах после воздействия различных алколоидов и амилоида р. Наконец, гуманин предотвращает развитие атеросклеротических бляшек, внутрипочечное ремоделирование микрососудов и воспаление в мышах с инактивированным геном АроЕ (АроНрорго1ет Е) и гиперхолестеринемией.

Митохондриальиая ОРС

АТС йСТ ССА СвА ООО ТТС АйС ТСТ СТС ТТА СТТ ТЗЗА АСС АСТ йАА

Мнтохондриальный пептид М М Митохондриальный пептид С IV!

Гуманин Ядерный пептид

¥ М

* Г

$ I I Е

А Р

Е |

Ядерная ОРС

АТС ОСТ ССА СвА ООО ТТС А ОС ТОТ СТС ТТА СТТ ТС А АСС А ОТ ОАА

Митохондриальиая ОРС

Митохондриальный пептид М Митохондриальный пептид С Гуманин Ядерный пептид

Ядерная ОРС

АТТ ОАС ста ССС ОТО ААв Аво СйО ОСА ТА®

? I1 У ¥ *

э 1 V р У ¥ я 1 я 1 А |

I V { у ? 1 1 5 1 \

ь р V к я и А

АТТ ОАС СТИ ССС ОТО ААй АСО СОО ОСА ТАК

Рисунок 1 (см. на обороте). Сравнение открытых рамок считывания (ОРС), потенциально кодирующих гуманин, находящихся в митохондриальном и ядерном геномах человека. Митохондриальная ОРС находится внутри гена 16Б рРНК в митохондриальном геноме человека (АР346981.1, КС257404.1 или 1ЧС_012920.1). Две ядерные ОРС находятся на хромосоме 11 (ЫТ_009243.6) и одна - на хромосоме 3 (N7 022475.4) ядерного генома человека. Митохондриальный пептид М получается трансляцией митохондриальной ОРС с использованием митохондриального генетического кода трансляции. Митохондриальный пептид С получается трансляцией митохондриальной ОРС с использованием стандартного генетического кода трансляции. Ядерный пептид получается трансляцией ядерных ОРС с использованием стандартного генетического кода трансляции. ОРС гуманина идентична митохондриальной ОРС. Я - это А (аденин) или в (гуанин). * - обозначает стоп-кодон.

Следующим шагом был проведён дрожжевой двухгибридный скрининг белков, взаимодействующих с гуманином. Для этого использован вариант дрожжевой двухгибридной системы с двойным бэйтом и Оа1-индуцибельной библиотекой прэев (рисунок 2). В результате многоэтапного дрожжевого двухгибридного скрининга найдено 7 белков, физически взаимодействующих с гуманином в дрожжевой двухгибридной системе (рисунок 3, таблица 3). Нуклеотидные последовательности кДНК, кодирующие эти прэи, помещены в приложение 2. Так как фосфобелок М-фазы 8 (ФБМФ8) увеличивает подвижность и инвазивность опухолевых клеток (Кокига К. е1 а1., 2010), что указывает на его возможное участие в метастазировании, то наши дальнейшие исследования были сосредоточены на подтверждении и детальном изучении физического взаимодействия между гуманином и этим белком.

Среда с галактозой и раффинозой (Gal-Raff)

Взаимодействие

Транскрипция г—»n.

Репортёриый ген интегрирован в дрожжевой геном

ш:

Транскрипция

1ас2 [— Репортёриый ген находится на плазиде р1Ж8

Рост дрожжей на среде без лейцина

Колонии голубые при добавлении XGal

Среда с глюкозой (Glue)

Нет экспрессии

Хг^Ь

Репоргёрный ген интегрирован в дрожжевой геном Нет экспоессии

-1 LexA-t

Репортёриый ген находится на плазиде pDR8

Нет роста дрожжей на среде без лейцина

Колонии белые при добавлении ХСа!

и раффинозой (Gal-Raff)

гмна}

cl-on [—

Нет взаимодействия j-fTMHA}

—| cl-on ]-

Нет транскрипции

I. х.

LYS2

С>

Репортёриый ген интегрирован в дрожжевой геном

Нет транскрипции

Нет роста дрожжей на среде без лизина

gusA

5н~ге1

Репортёрнын ген находится на плазиде pDR8

С>

Колонии белые при добавлении

хаис

Среда с галактозой

Нет взаимодействия

Рисунок 2. Дрожжевая двухгибридная система с двойным бэйтом и индуцибильным прэем для поиска белков, физически взаимодействующих с гуманином. На рисунке изображена принципиальная схема для обнаружения и проверки специфичности взаимодействия белков с гуманином. Основным бэйтом (LexA-ГМН) является гибридный белок гуманина (ГМН) и бактериального репрессора транскрипции LexA (Brent R. et al., 1981). Альтернативным бэйтом (cl-ГМНА) является гибридный белок мутанта гуманина (ГМНА) с заменой 8-ого цистеина на аланин (С8А) и репрессора транскрипции бактериофага лямбда cl (Sauer R.T. et al., 1978). Мутант гуманина ГМНА не обладает нейропротекторным действием и не связывается с клеточным(и) рецептором(ами) гуманина на поверхности клеток нервной клеточной линии Fl 1 (Hashimoto Y. et al., 2001a; Hashimoto Y. et al., 2001b; Yamagishi Y. et al., 2003). Таким образом, отсутствие взаимодействия с альтернативным бэйтом - это хороший показатель специфичности взаимодействия. Прэй - это гибридный белок, одна часть которого представляет собой транс-активирующий транскрипцию домен (ТАД), а другая - белок, кодируемый кДНК. В качестве ТАД был использован белок В42, который кодируется в геноме Е. Coli (Ma J. et al., 1987). Экспрессия прэя находится под контролем Gal-индуцибильного промотора. Таким образом, прэй не экспрессируется в дрожжах на среде с глюкозой и его экспрессия возникает только в дрожжах на среде с галактозой и без глюкозы. LexA-on обозначает оператор LexA, - нуклеотидную последовательность, с которой связывается белок LexA. cl-on обозначает оператор cl, - нуклеотидную последовательность, с которой связывается белок cl. При взаимодействии бэйта с прэем ТАД оказывается рядом с промоторами репортёрных генов и активирует экспрессию этих генов. Таким образом, экспрессия репортётных генов указывает на физическое взаимодействие между бэйтом и прэем. Gal-Raff -галактоза и раффиноза. Glue - глюкоза.

nil III» 1ГТТ1 „ ГЩЩДЩ

itililijg» 1Н11ИД

••••••••

с •

0 $ J *t Щ <я»

Рисунок 3. Подтверждение взаимодействия гуманина с белками, отобранными в результате дрожжевого двухгибридного скрининга. Во всех колониях содержится плазмида pDR8, несущая репортёрный ген LexA-lacZ. На каждом рисунке в 1-ой горизонтальной строке все колонии содержат плазмиду pMW103-rMH, кодирующую бэйт LexA-ГМН. Во 2-ой горизонтальной строке все колонии содержат плазмиду pMW103, кодирующую бэйт LexA. В 3-ей горизонтальной строке все колонии содержат плазмиду pEG202-Ras, кодирующую бэйт LexA-Ras. В каждой вертикальной строке все колонии содержат один и тот же прэй: 1 - HNIP-13, 2 - HNIP-14, 3 - HNIP-16, 4 - HNIP-18, 5 - HNIP-21,6- HNIP-8, 7 - HNIP-12, 8 - HNIP-11, 9 - ТАД В42 (pJG4-5), 10 - B42-Krit (pJG4-5-Krit), 11 -B42-Raf (pJG4-5-Raf). Leu - лейцин. Gal-Raff - среда с галактозой и раффинозой. Glue - среда с глюкозой. Пара бэйт LexA-Ras и прэй B42-Raf представляет положительный контроль на наличие взаимодействия. (А) Верхняя часть - среда с галактозой и раффинозой без триптофана, гистидина, урацила и лейцина. Нижняя часть - среда с галактозой и раффинозой без триптофана, гистидина и урацила (содержит лейцин). (Б) Верхняя часть - среда с глюкозой без триптофана, гистидина, урацила и лейцина. Нижняя часть - среда с глюкозой без триптофана, гистидина и урацила (содержит лейцин). (В) Среда с галактозой и раффинозой без триптофана, гистидина, урацила и лейцина.

Таблица 6. Белки, взаимодействующие с гуманином в дрожжевой двухгибридной системе.

Дрожжевой клон Название белка Инвентарный номер мРНК, кодирующей белок, в базе данных 1ЧСВ1 Сходство кДНК прэя с мРНК из базы данных NCBI % (ч.и.н./п.ч.н.)а

HNIP-8 Субъединица протеасомы, тип альфа, 5 (ПСМА5) ММ_001199774 99,9% (688/689)

HNIP-11 Белок теплового шока, 90 кДа, А1_, альфа (БТШ90АА1) КМ_005348 100% (553/553)

HNIP-12 Неорганическая пирофосфатаза 1 (ПФА1) 1ММ_021129 99,8% (652/653)

HNIP-13 Пероксиредоксин 1 (ПРДКС1) ЫМ_001202431 99,0% (622/628)

HNIP-14 Фосфобелок М-фазы 8 (ФБМФ8) ЫМ_017520 (мРНК ФБМФ8) 100% (552/552)

КШ_004078077 (интрон гена ФБМФ8)6 100% (84/84)

HNIP-16 Эукариотический фактор элонгации трансляции 1 альфа I (ЭФЭТ1А1) ЫМ_001402 99,5% (598/601)

HNIP-l 8 Митохондриальный фактор элонгации трансляции Т§ (МФЭТТБ) КМ_001172696 99,7% (608/610)

а - ч.и.н./п.ч.н. - число идентичных нуклеотидов / полное число нуклеотидов на сравниваемом участке.

б - первые 552 нуклеотида кДНК HNIP-14 идентичны мРНК ФБМФ8, а следующие 84 нуклеотида-из середины прилегающего интрона и, скорее всего, являются неизвестным раннее экзоном.

Взаимодействие между гуманином и ФБМФ8 было подтверждено методом ко-иммунопреципитации сверхэкспрессированных белков из нейробластомной мышиной клеточной линии Neuro 2А (рисунки 4 и 5). Также были определены участки гуманина

и ФБМФ8, отвечающие за физическое взаимодействие между гуманином и ФБМФ8 (рисунки 4, 6, 7, 8 и 9). Из результатов экспериментов по ко-иммунпреципитации следовало, что за физическое взаимодействие между гуманином и ФБМФ8 отвечает участок гуманина с 5 по 12 а.о. и участок ФБМФ8 с 431 по 560 а.о. (рисунок 10).

MYC CHROMO I E5CI

AN К

MYC

MYC CHROMO

860

-ï

.MYC

567 MYC^_ ANK

MYC

MYC^_

431 560

568 MYC

860

2хМус-ФБМФ8 2хМус-ФБМФ8-Фр(1-567) 2хМус-ФБМФ8-Фр(568-860) 2хМус-ФБМФ8-Фр(431-560)

уЗФБ-ГМН

уЗФБ-ГМН-ДЕЛ(1-8)

уЗФБ-ГМН-ДЕЛ(9-16)

уЗФБ-ГМН-ДЕЛ( 17-24)

уЗФБ-ГМН-ДЕЛ(1-4)

уЗФБ-ГМ Н-ДЕЛ (5-12)

уЗФБ-ГМН-ДЕЛ(13-16)

Рисунок 4. Схематическое изображение полипептидов, кодируемых рекомбинантными конструктами. (А) ФБМФ8 и его фрагменты с Мус-эпитопом на N- и С-концах. Числа обозначают положения аминокислотных остатков в полипептидной цепи ФБМФ8. (Б) Гибридные белки гуманина (ГМН) и его делиционных мутантов на С-конце и уЗФБ на N-конце. Числа обозначают положения аминокислотных остатков в полипептидных цепях ФБМФ8 и гуманина. CHROMO -хромодомен (chromodomain). ANK - анкириновые повторы (ankyrin repeats).

2хМус-ФБМФ8 2хМус-ФБМФ8 + у"$ФБ-ГМН + уЗФБ

ИП ИП

н 5 . и у t S >. ьо е го о S S- я

Блот: Мус Г 1 k i в

Столбцы 1 2 3 4 5 6

2х\1ус-ФБМФ8 2хМус-ФЬМФ8 + у ЗФБ-ГМН + уЗФБ

ИП ИП

г я в ш •э н я

Блот: уЗФБ

Столбцы

Рисунок 5. Ко-иммунопреципитация 2хМус-ФБМФ8 с уЗФБ-ГМН, но не с уЗФБ. Клетки Neuro 2А были ко-трансфецированы плазмидами 2хМус-ФБМФ8 и уЗФБ-ГМН или 2хМус-ФБМФ8 и уЗФБ. Иммунопреципитации выполнены, как описано в материалах и методах. Одна четвёртая лизата, использованного в

иммунопреципитации, была нанесена на гель, чтобы подтвердить и сравнить экспрессию уЗФБ, уЗФБ-ГМН и 2хМус-ФБМФ8 в обоих образцах. Вестерн-блоты проведены с использованием анти-Мус (верхняя часть рисунка) или анти-уЗФБ (нижняя часть рисунка) антител. Было выполнено, как минимум, три эксперимента со сходными результатами. Один из этих экспериментов показан на рисунке.

2хМус-ФБМФ8-2хМус-ФБМФ8 Фр(|-567) + уЗФБ-ГМН + уЗФБ-ГМН

ИП: уЗФБ ИМ: И|<; Лиич.

Блпт: Мус

нп ип

1 <2 1 = t. I % Я

■

Обряшы

Блот: Мус

Неспецпфичсекие^ полосы

"-"С

2хМус-ФБМФ9-2хМус-ФБМФ8 ФрО-567) + уЗФБ-ГМН + уЗФБ-ГМН И1| ИИ

ИШуЗФБ Лшяты

Обра и|ы Блот: ; )ФБ ЩвШШШ — — (голбцы 12 3 4

Обрятец 1 - уЗФБ-ГМН + 2хМу С-ФБМФ8-Фр(568-8Й» Образец 2 - уЗФБ-ГМН + 2iMy с-ФБМФ8-Фр(1-567)

Блот: у ЗФБ| Столбцы

Рисунок 6. Ко-иммунопреципитация 2хМус-ФБМФ8 и 2хМус-ФБМФ8-Фр(1-567), но не 2хМус-ФБМФ8-Фр(568-860) с уЗФБ-ГМН. Иммунопреципитации выполнены, как описано в материалах и методах. Одна четвёртая лизата, использованного в иммунопреципитации, была нанесена на гель, чтобы подтвердить и сравнить экспрессии уЗФБ-ГМН, 2хМус-ФБМФ8, 2хМус-ФБМФ8-Фр( 1-567) и 2хМус-ФБМФ8-Фр(568-860). Вестерн-блоты проведены с использованием анти-Мус (верхняя часть каждой панели) или анти-уЗФБ (нижняя часть каждой панели) антител. (А) Клетки Кеиго2А ко-трансфецированы плазмидами уЗФБ-ГМН и 2хМус-ФБМФ8-Фр( 1-567) или плазмидами уЗФБ-ГМН и 2хМус-ФБМФ8. (Б) Клетки Ыеиго2А ко-трансфецированы с уЗФБ-ГМН и 2хМус-ФБМФ8-Фр(568-860) или с уЗФБ-ГМН и 2хМус-ФБМФ8-Фр( 1-567). Неспецифические полосы являются тяжёлой и лёгкой цепями иммуноглобулинов. Было выполнено, как минимум, три эксперимента со сходными результатами. Один из этих экспериментов показан на рисунке.

Рисуиок 7. Ко-иммунопреципитация 2хМус-ФБМФ8-Фр(431-560) с уЗФБ-ГМН, но не с уЗФБ. Клетки Neuro 2А были ко-трансфецированы плазмидами 2хМус-ФБМФ8-Фр(431-560) и уЗФБ-ГМН или плазмидами 2хМус-ФБМФ8-Фр(431-560) и уЗФБ. Иммунопреципитации выполнены, как описано в материалах и методах. Одна четвёртая лизата, использованного в иммунопреципитации, была нанесена на гель, чтобы подтвердить и сравнить экспрессии уЗФБ, уЗФБ-ГМН и 2хМус-ФБМФ8-Фр(431-560) в обоих образцах. Вестерн-блоты проведены с использованием анти-Мус (верхняя часть рисунка) или анти-уЗФБ (нижняя часть рисунка) антител. Было выполнено, как минимум, три эксперимента со сходными результатами. Один из этих экспериментов показан на рисунке.

ИП: уЗФБ Лизаты

Образец

Блот: Мус

Блот: уЗФБ Столбцы

Образец 1 - уЗФБ-ГМН-ДЕЛ(1-8) + 2хМус-ФБМФ8 Образец 2 - уЗФБ-ГМН-ДЕЛ(9-16) + 2хМус-ФБМФ8 Образец 3 - уЗФБ-ГМН-ДЕЛ (17-24) + 2хМус-ФБМФ8 Образец 4 - уЗФБ-ГМН + 2хМус-ФБМФ8

Рисунок 8. Ко-иммунопреципитация 2хМус-ФБМФ8 с с уЗФБ-ГМН и с уЗФБ-ГМН-ДЕЛ( 17-24), но не с уЗФБ-ГМН-ДЕЛ (1-8) и не с уЗФБ-ГМН-ДЕЛ(9-16). Клетки Neuro 2А были ко-трансфецированы плазмидами 2хМус-ФБМФ8 и уЗФБ-ГМН-ДЕЛ(1-8); или 2хМус-ФБМФ8 и уЗФБ-ГМН-ДЕЛ(9-16); или 2хМус-ФБМФ8 и уЗФБ-ГМН-ДЕЛ( 17-24); или 2хМус-ФБМФ8 и уЗФБ-ГМН. Иммунопреципитации выполнены, как описано в материалах и методах. Одна четвёртая лизата, использованного в иммунопреципитации, была нанесена на гель, чтобы подтвердить и сравнить экспрессии уЗФБ-ГМН-ДЕЛ( 1-8), уЗФБ-ГМН-ДЕЛ(9-16), уЗФБ-ГМН-ДЕЛ(17-24), уЗФБ-ГМН и 2хМус-ФБМФ8 во всех четырёх образцах. Вестерн-блоты проведены с использованием анти-Мус (верхняя часть рисунка) или анти-уЗФБ (нижняя часть рисунка) антител. Было выполнено, как минимум, три эксперимента со сходными результатами. Один из этих экспериментов показан на рисунке.

Образцы

Столбцы

Образец 1 - уЗФБ-ГМН + 2хМус-ФБМФ8-Фр(431-560) Образец 1 - уЗФБ + 2хМус-ФБМФ8-Фр(431 -560)

Лизаты

ИП: уЗФБ

Образцы

Блот: Мус

1 2 3 4 12 3 4

—--

Столбцы 1

2 3 Лизаты

5 6 7 ИП: \ЗФБ

Рисунок 9. Ко-иммунопреципитация 2хМус-ФБМФ8 с уЗФБ-ГМН-ДЕЛ( 1 -4), с уЗФБ-ГМН-ДЕЛ( 13-16) и уЗФБ-ГМН, но не с уЗФБ-ГМН-ДЕЛ(5-12). Клетки Neuro 2А были ко-трансфецированы плазмидами 2хМус-ФБМФ8 и уЗФБ-ГМН-ДЕЛ(1-4); или 2хМус-ФБМФ8 и уЗФБ-ГМН-ДЕЛ(5-12); или 2хМус-ФБМФ8 и уЗФБ-ГМН-ДЕЛ( 13-16); или 2хМус-ФБМФ8 и уЗФБ-ГМН. Иммунопреципитации выполнены, как описано в материалах и методах. Одна четвёртая лизата, использованного в иммунопреципитации, была нанесена на гель, чтобы подтвердить и сравнить экспрессии уЗФБ-ГМН-ДЕЛ( 1 -4), уЗФБ-ГМН-ДЕЛ(5-12), уЗФБ-ГМН-ДЕЛ(13-16), уЗФБ-ГМН и 2хМус-ФБМФ8 во всех четырёх образцах. Вестерн-блоты проведены с использованием анти-Мус (верхняя часть рисунка) или анти-уЗФБ (нижняя часть рисунка) антител. Было выполнено, как минимум, три эксперимента со сходными результатами. Один из этих экспериментов показан на рисунке.

Образцы 1

Блот: уЗФБ Столбцы

1 - у ЗФБ-ГМН-ДЕЛ ( 1 -4) + 2хМус-ФБМФ8

2 - уЗФБ-ГМН-ДЕЛ(5-12) + 2хМус-ФБМФ8

3 - уЗФБ-ГМН-ДЕЛ(13-16) + 2хМус-ФБМФ8

4 - уЗФБ-ГМН + 2хМус-ФБМФ8

ФБМФ8

CHROMO

ANK

1 ~43Ï7~

Физическое /

взаимодействие,'

-Û

/560

860

5 12

ГУМАНИН

анкириновые повторы (ankyrin repeats).

Рисунок 10. Участки аминокислотных последовательностей, опосредующие

физическое взаимодействие между ФБМФ8 и гуманином. Числа обозначают положения аминокислотных остатков в полипептидных цепях ФБМФ8 и гуманина. CHROMO -хромодомен (chromodomain). ANK -

В ходе экспериментов было замечено, что добавление гуманина значительно понижает экспрессию зелёного флуоресцентного белка (уЗФБ). Соответственно, было проверено, на каком уровне возникает понижение экспрессии - РНК или белка. Продемонстрировано, что экспрессия мРНК гибридного белока уЗФБ и гуманина (уЗФБ-ГМН) сопоставима с экспрессией мРНК зелёного флуоресцентного белка самого по себе. В тоже время, на уровне белка экспрессия уЗФБ-ГМН значительно ниже, чем экспрессия ЗФБ самого по себе. Любопытно, что делеция участка гуманина с 5 по 12 а.о. приводит к полному восстановлению экспрессии на уровне белка (рисунок 11).

А Нозерн блот Б Вестерн блот

Образцы 1 2 3 4 5 Образцы 1 2 3 4 5

уЗФБ **

уЗФБ

Образцы 1 2 3 4 5

Актин

Образцы 1 2 3 4 5 Гуманны

Образцы 1 2 3 4 5

Актин

1 - уЗФБ-ГМН; 2 - >ЗФБ-ГМН-ДЕЛ(5-12); 3 - уЗФБ; 4 - рЫвЕ;

5 - нет трансфекцин

Рисунок 11. Экспрессия уЗФБ, уЗФБ-ГМН и уЗФБ-ГМН-ДЕЛ(5-12) на уровне белка и РНК. Клетки НЕК293 были трансфецированы плазмидами: (1) уЗФБ-ГМН, (2) уЗФБ-ГМН-ДЕЛ(5-12), (3) уЗФБ и (4) плазмидой рШЕ. Образец 5 представляет собой не трансфецированные клетки НЕК293. Через 36 часов после трансфекции из каждого образца были выделены тотальная РНК и белок. (А) Нозерн-блот был выполнен, как описано в «Материалах и методах». Первоначально проводили гибридизацию с радиоактивно-меченой пробой к мРНК уЗФБ (верхняя часть рисунка), а затем с радиоактивно-меченой пробой к мРНК актина (нижняя часть рисунка). (Б) Вестерн-блот был выполнен, как описано в «Материалах и методах». Были использованы антитела к уЗФБ (верхняя часть рисунка), к гуманину (средняя часть рисунка) и к актину (нижняя часть рисунка).

Таким образом, полученные данные позволили сделать вывод, что аминокислотная последовательность гуманина и/или нуклеотидная последовательность его ОРС несут сигнал значительно понижающий экспрессию на уровне белка, но не РНК.

Обсуждение результатов. Первая часть главы посвящена обсуждению того, что поли(А)-содержащие транскрипты митохондриального гена 168 рРНК человека являются примером длинных некодирующих РНК, которые кодируют пептид. Указано как на необходимость исследования того, могут ли другие длинные некодирующие РНК кодировать пептиды, так и на необходимость исследования существования и функции пептидов, кодируемых другими ОРС в митохондриальной 16Б рРНК человека.

Во второй части обсуждён широкий спектр функций у белков, физически взаимодействующих с гуманином. Сделано предположение о том, что физические взаимодействия с гуманином разных белков с различными функциями может быть нужно для полифункциональности гуманина.

В третьей части высказано предположение, что физическое взаимодействие гуманина с ФБМФ8 может вовлекать гуманин в процесс метастазирования раковых клеток и регуляцию экспрессии генов, так как ФБМФ8 участвует в этих процессах (Kokura К. et al., 2010). Указано на необходимость исследования этой возможности. Приведены литературные данные по локализации гуманина в ядерном хроматине наряду с другими его локализациями в митохондриях и цитозоле (Moretti Е. et al., 2010). Так как ФБМФ8 локализован в клеточном ядре и участвует в регуляции транскрипции генов, то локализация гуманина в ядерном хроматине указывает на физиологическое значение физического взаимодействия между гуманином и ФБМФ8.

В заключение внимание обращено на то, что аминокислотная последовательность гуманина и/или нуклеотидная последовательность его ОРС несут сигнал сильно понижающий экспрессию на уровне белка, но не РНК. Высказано предположение, что гены, влияющие на экспрессию гуманина, могут быть вовлечены в онкогенез. Приведены литературные данные о том, что убиквитин-лигаза TRIM11 (Tripatite motif-containing protein Ц) убиквитилирует гуманин, что приводит к деградации гуманина по протеасомному пути (Niikura Т. et al., 2003). Отмечено, что нет данных о том, что TRIM11 является единственным или даже основным фактором, регулирующим экспрессию гуманина. Это указывает на необходимость поиска других факторов, регулирующих экспрессию гуманина. Обсуждена связь между TRIM11 и онкогенезом.

Выводы.

1. С помощью биоинформационного анализа установлено, что в митохондриальном гене 16S рРНК человека присутствует 7 ОРС размером более 50 нуклеотидов (согласно митохондриальному генетическому коду трансляции) и 4 ОРС размером более 50 нуклеотидов (согласно стандартному генетическому коду трансляции). Одна из этих ОРС кодирует ранее описанный пептид гуманин (24 а.о.), природа кодирующей области которого до нашего исследования оставалась неизвестной.

2. Методом дрожжевого двухгибридного скрининга обнаружено 7 белков, физически взаимодействующих с гуманином: протеасомная субъедининца а5 (ПСМА5); белок теплового шока, 90 кДа, а, класс А, член 1 (БТШ90АА1); неорганическая пирофосфатаза 1 (ПФА1); пероксиредоксин 1 (ПРДКС1); фосфобелок М-фазы 8 (ФБМФ8); эукариотический фактор элонгации трансляции 1, а-1 (ЭФЭТ1А1) и митохондриальный фактор элонгации трансляции Ts (МФЭТТБ).

3. Физическое взаимодействие фосфобелка М-фазы 8 (ФБМФ8) с пептидом гуманином было подтверждено методом ко-иммунопреципитации сверхэкспрессированных ФБМФ8 с гуманином из культур клеток млекопитающих.

4. Методом ко-иммунопреципитации с использованием делеционных мутантов гуманина и ФБМФ8 определено, что за их взаимодействие отвечают участок ФБМФ8 с 431 по 560 а.о. и участок гуманина с 5 по 12 а.о.

5. Аминокислотная последовательность гуманина и/или нуклеотидная последовательность его ОРС несут сигнал, значительно понижающий экспрессию на уровне белка, но не РНК.

6. Совокупность имеющихся данных по повышенной экспрессии мРНК гуманина в раковых клетках, его физическом взаимодействии с ФБМФ8, который участвует в метастазировании, и наличии у гуманина антиапоптотического действия позволяют предположить, что этот пептид обладает онкогенным потенциалом.

Список публикаций.

1. Maximov V.V., Martynenko A.V., Arman I.P., Tarantul V.Z. Humanin binds MPP8: mapping interaction sites of the peptide and the protein. J Pept Sei. 2013; V. 19(5): pp. 301-307.

2. Максимов B.B., Арман И.П., Тарантул В.З. Идентификация белков-партнёров нейропротекторного пептида гуманина с помощью дрожжевой двухгибридной системы. Генетика 2006; т. 42, № 2: стр. 208-211.

3. Maximov V., Martynenko A., Hunsmann G., Tarantul V., Mitochondrial 16S rRNA gene encodes a functional peptide, a potential drug for Alzheimer's disease and target for cancer therapy. Med Hypotheses 2002; V. 59: pp. 670-673.

4. Tarantul V., Nikolaev A., Hannig H., Kalmyrzaev В., Muchoyan I., Maximov V., Nenasheva V., Dubovaya V., Hunsmman G., Bodmer W. Detection of abundantly transcribed genes and gene translocation in human immunodeficiency virus-associated non-Hodgkin's lymphoma. Neoplasia 2001; V. 3: pp. 132-142.

5. Ненашева B.B., Максимов B.B., Николаев А.И., Тарантул В.З. Сравнительный анализ уровней транскрипции генов в двух типах ВИЧ-ассоциированных лимфом. Мол. генетика, вирусол., микробиол. 2001; № 4, стр. 27-31.

Подписано в печать:

29.05.2013

Заказ № 8570 Тираж - 75 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Максимов, Вадим Владимирович, Москва

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ НАУКИ ИНСТИТУТ МОЛЕКУЛЯРНОЙ ГЕНЕТИКИ РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ НАУК

На правах рукописи

04201 361 098 Максимов Вадим Владимирович

«Определение гена полифункционального пептида гуманина и белков, физически взаимодействующих с ним»

03.02.07-Генетика Диссертация на соискание учёной степени кандидата биологических наук

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор Тарантул Вячеслав Залманович

Москва - 2013

ОГЛАВЛЕНИЕ.

ПЕРЕЧЕНЬ УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ..............................5

ВВЕДЕНИЕ...........................................................................9

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.............................................11

1.1 Митохондрии и рак. Эффект Отто Варбурга и гипотеза Отто Варбурга об этиологии рака: современный взгляд........................................11

1.2 Длинные некодирующие РНК и онкогенез.............................17

1.2.1 Доказательства существования большого класса генов, кодирующих длинные некодирующие РНК.....................................................17

1.2.2 Длинные некодирующие РНК в онкогенезе............................22

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.......................................28

2.1 Рекомбинантные конструкты.............................................28

2.2 Культивирование кишечной палочки Е. coli...........................32

2.3 Культивирование дрожжей................................................33

2.4 Культивирование клеток млекопитающих..............................36

2.5 Иммунопреципитация и Вестерн-блот..................................36

2.6 Выделение тотальной клеточной РНК и нозерн-блот................38

2.7 Биоинформационные методы.............................................39

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ........................................................40

3.1 Биоинформационный анализ митохондриального гена, кодирующего 16S рРНК человека, на наличие открытых рамок (ОРС)....................40

3.2 Идентификация белков, физически взаимодействующих с гуманином, методом дрожжевого двухгибридного скрининга.............................46

3.3 Подтверждение физического взаимодействия гуманина с фосфобелком М-фазы 8 (ФБМФ8) методом ко-иммунопреципитации сверхэкспрессированных белков из клеток млекопитающих и картирование участков гуманина и ФБМФ8, отвечающих за это взаимодействие......61

3.4 Аминокислотная последовательность гуманина и/или нуклеотидная последовательность его ОРС содержат сигнал, значительно уменьшающий экспрессию на уровне белка, но не РНК....................................... 70

ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.............................. 73

4.1 Человеческая митохондриальная 168 рибосомальная РНК как пример длиной «некодирующей» РНК, которая кодирует, как минимум, один пептид................................................................................. 73

4.2 Физические взаимодействия гуманина со многими белками могут быть необходимы для осуществления его разнообразных биологических функций...............................................................................76

4.3 Физическое взаимодействие гуманина с ФБМФ8 может вовлекать гуманин в метастазирование и эпигеномную регуляцию экспрессии генов................................................................................... 79

4.4 Регулирование экспрессии гуманина и гены, осуществляющие это регулирование, могут быть вовлечены в канцерогенез......................80

ВЫВОДЫ........................................................................... 82

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ.......................................................84

ПРИЛОЖЕНИЕ!................................................................. 107

ПРИЛОЖЕНИЕ 2

ПЕРЕЧЕНЬ УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ.

168 рРНК - 16Э рибосомальная РНК

АТФ - аденозинтрифосфат

БСА - бычий сыворочный альбумин

БТШ90АА1 - белок теплового шока, 90 кДа, А1, альфа

ГМН - гуманин

ГМНА - мутант гуманина с заменой 8-ого цистеина на аланин ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота ДКВКЛ - диффузная крупноклеточная В-клеточная лимфома ДСД - ДНК-связывающий домен

кДНК - комплементарная дезоксирибонуклеиновая кислота

мРНК - матричная рибонуклеиновая кислота

МФЭТТз - митохондриальный фактор элонгации трансляции Тб

ОРС - открытая рамка считывания

ПРДКС1 - пероксиредоксин 1

ПСМА5 - субъединица протеасомы, тип альфа, 5

ПФА1 - неорганическая пирофосфатаза 1

ПЦР - полимеразная цепная реакция

РНК - рибонуклеиновая кислота

ТАД - транс-активирующий транскрипцию домен

уЗФБ - зелёный флуоресцентный белок с увеличеной флуоресценцией ФБМФ8 - фосфобелок М-фазы 8

ЭФЭТ1А1 - эукарнотнческий фактор элонгации трансляции 1 альфа 1

AGO - argonaute protein

ANK - ankyrin repeats

BAX - BCL2-associated X protein

BID - BH3-interacting protein

BimEL - BCL2-interacting protein, extra-long

Cav-1 - caveolin 1

CD11С - cluster of differentiation 11С CDC42 - cell division cycle 42

CDRlas - antisense to the cerebellar degeneration-related protein 1 transcript

CHROMO - chromodomain

CoREST - rest corepressor

DUSP1 - dual specificity protein phosphatase 1

Ezh2 - enhancer of zeste, drosophila, homolog 2

FH - fumarate hydratase

FPRL1 — G protein-coupled formylpeptide receptor-like 1 FPRL2 - G protein-coupled formylpeptide receptor-like 2 Gal - galactose

Glue - glucose

H3K4me3 - триметилирование 4-ого лизина гистона НЗ

НЗКЗбшеЗ - триметилирование 36-ого лизина гистона НЗ

HIF-1 а - hypoxia-inducible factor 1, alpha subunit

HNIP - humanin-interacting protein

HOT AIR - HOX transcript antisense intergenic RNA

HOXC - homeobox С

HOXD - homeobox D

FBS - fetal bovine serum

IDH1 - isocitrate dehydrogenase 1

IDH2 - isocitrate dehydrogenase 2

IGFBP3 - insulin-like growth factor-binding protein 3

LET - low expression in tumor

MALAT1 - metastasis associated in lung adenocarcinoma transcript 1

NF90 - nuclear factor of activated T cells, 90-kD

NFkB - nuclear factor kappa В

Oct4 - octamer-binding transcription factor 4

PBS - Phosphate Buffered Saline

PRC2 - polycomb group repression complex 2

Рахб - paired box gene 6

Raff - raffinose

RhoA - Ras homolog family member A

SDHD - succinate dehydrogenase complex, subunit D

Suzl2 - Suppressor of zeste 12

Tlr4 - toll-like receptor 4

TRIM11 - tripartite motif protein 11

VSTM2L - V-set and transmembrane domain containing 2 like protein XIST - X-inactive specific transcript

ВВЕДЕНИЕ.

Диагноз диффузная крупноклеточная В-клеточная лимфома (ДКВКЛ) ставится в 30% всех случаев не-Ходжкинских лимфом (Blood 1997; V. 89(11): pp. 3909-3918). Эта агрессивная лимфома остается смертельной для 30% всех пациентов и 45% пациентов с наиболее неблагоприятным прогнозом (Sehn L.H. et al., 2007). Таким образом, разработка более эффективных методов лечения этого заболевания по-прежнему актуально. Рациональный подход к поиску эффективной терапии для ДКВКЛ требует понимания механизмов патогенеза для этого типа лимфомы. Несмотря на значительные успехи, достигнутые за последние три десятилетия, наши знания о молекулярных и клеточных механизмах этого заболевания всё ещё фрагментарны и далеко не полны.

Целью настоящей работы является установление, кодирует ли

митохондриальный ген 16S рРНК какие-либо биологически-активные белки

или пептиды и, если таковые имеются, исследование механизмов их

биологической активности. Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

1. Используя биоинформационный подход определить, способны ли полиаденилированные транскрипты человеческого митохондриального гена 168 рРНК кодировать экспрессирующиеся белки или пептиды.

2. При наличии таких белков или пептидов, найти с помощью дрожжевого двухгибридного скрининга белки, взаимодействующие с ними физически, что может прояснить молекулярные механизмы, посредством которых сверхэкспрессия полиаденилированных транскриптов гена 168 рРНК связана с процессом лимфомогенеза.

Все эксперименты были выполнены автором самостоятельно или в сотрудничестве с другими сотрудниками Института молекулярной генетики.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1 Митохондрии и рак.

Эффект Отто Варбурга и гипотеза Отто Варбурга об этиологии рака:

современный взгляд.

Работы Отто Варбурга и других исследователей, посвященные

изменению метаболизма в раковой клетке, позволили Отто Варбургу

сформулировать его гипотезу о происхождении рака (Warburg О., 1956).

Накопленные к тому времени данные указывали на следующее: (1) в раковой

клетке энергия, полученная за счёт анаэробного гликолиза, приблизительно

равна энергии, полученной за счёт дыхания, в то время как нераковая клетка

взрослого организма производит приблизительно в 100 раз больше энергии

за счёт дыхания, чем за счёт анаэробного окисления; (2) если система,

производящая энергию за счёт дыхания повреждена, то это повреждение

оказывается необратимым; (3) ионизирующая радиация, вызывающая рак,

также эффективно повреждает клеточное дыхание; (4) как минимум,

некоторые токсины, повреждающие клеточное дыхание, являются

канцерогенами; (5) кратковременный дефицит кислорода одновременно

повреждает клеточное дыхание и приводит к перерождению нераковых

клеток в раковые клетки. Эти данные легли в основу гипотезы Отто Варбурга

о том, что частичное и необратимое повреждение клеточного дыхания,

компенсированное впоследствии интенсификацией гликолиза, лежит в

основе возникновения и развития всех типов рака. Латентное время, которое

необходимо для развития ракового заболевания после воздействия

канцерогена, Отто Варбург объяснил тем, что оно требуется для

постепенного увеличения интенсивности гликолиза (Warburg О., 1956). Сам

факт увеличения доли гликолиза и уменьшения доли внутриклеточного

дыхания в метаболизме раковой клетки по сравнению с метаболизмом

нераковой клетки назван эффектом Варбурга. Важно отметить, что данные,

положенные в основу гипотезы Варбурга, не были пересмотрены. Тем не менее, в результате последующих исследований стало понятно, что гипотеза Варбурга в общем случае не верна в той части, что в основе рака лежит нарушения во внутриклеточном дыхании и ситуация намного сложнее.

В настоящее время хорошо известно, что процесс клеточного дыхания, приводящий к производству внутриклеточного АТФ, происходит в митохондриях и представляет собой сопряжение бета-окисления и цикла Кребса (цикла трикарбоновых кислот) с окислительным фосфорилированием (см. обзор Benard G. et al., 2008). Как рассмотрено в обзоре (Moreno-Sánchez R. et al., 2007), эффект Варбурга связан, в основном, с увеличением роли гликолиза в клеточном метаболизме, в то время как митохондриальная энергия часто остаётся достаточной для обеспечения жизнедеятельности раковой клетки. Одним из примеров такого рода является то, что только одновременное ингибирование гликолиза и окислительного фосфорилирования приводило к ингибированию роста опухолей Walker 356 после имплантации в крысы. Ингибирование только гликолиза или только окислительного фосфорилирования не влияло на рост этих опухолей (Fearon К.С. et al., 1987). Подобного рода результаты являются типичными (см. обзор Moreno-Sánchez R. et al., 2007). Эти данные противоречат гипотезе Варбурга как в том, что интенсификация гликолиза нужна для компенсации дефицита митохондриального АТФ, так и в том, что дальнейшее ингибирование окислительного фосфорилирования должно селективно убивать раковую клетку.

Любопытно, что чуть более десятилетия назад были найдены мутации в генах SDHD (succinate dehydrogenase complex, subunit D) и FH (fumarate hydratase), вызывающие наследственную параганглиому и наследственную лейкомиому соответственно (Baysal В.Е. et al., 2000; Tomlinson I.P. et al., 2002). Оба заболевания проявляются в предрасположенности к

определённым типам опухолей и рака. Гены SDHD и FH кодируют субъединицу сукцинатдегидрогеназы и фумаразу соответственно. Оба этих фермента необходимы в цикле Кребса. Это можно было бы рассматривать как подтверждение гипотезы Варбурга, если бы другие наследственные заболевания, вызванные нарушениями в окислительном фосфорилировании, приводили бы к предрасположенности к возникновению опухолей и рака, чего не наблюдается (см. обзор Wallace D.C., 2013). Таким образом, наследственная предрасположенность к опухолям и раку, вызванная мутациями в генах SDHD и FH, скорей всего, связана со специфическими функциями сукцинатдегидрогеназы и фумаразы, а не с общим нарушением в митоходриальной дыхательной функции. Альтернативные объяснения влияния мутаций в генах SDHD и FH на предрасположенность к опухолям и раку предполагают, что канцерогенную роль играют изменения в концентрации метаболитов цикла Кребса, в том числе и в цитоплазме (см. обзор Raimundo N. et al., 2011).

Следует также отметить, что частые соматические мутации в генах IDH1 (isocitrate dehydrogenase !) и IDH2 (isocitrate dehydrogenase 2) были недавно найдены в глиомах, остром миелоидном лейкозе, злокачественных опухолях хрящевой ткани, гемангиомах, холангиокарциномах и в единичном случае меланомы (Parsons D.W. et al., 2008; Balss J. et al., 2008; Bleeker F.E. et al., 2009; Yan H. et al., 2009(a, b); Mardis E.R. et al., 2009; Hartmann C. et al., 2009; Gravendeel L.A. et al., 2010; Ward P.S. et al., 2010; Marcucci G. et al., 2010; Lopez G.Y. et al., 2010; Paschka P. et al., 2010; Amary M.F. et al., 2011; Pansuriya T.C. et al., 2011; Borger D.R. et al., 2012; Kipp B.R. et al., 2012). Оба гена кодируют изоцитратдегидрогеназу, которая необходима для цикла Кребса. Тем не менее, только ген IDH2 кодирует митохондриальную форму изоцитратдегидрогеназы, а ген IDH1 кодирует цитозольную форму изоцитратдегидрогеназы. Учитывая то, что цикл Кребса локализован в

митохондриях, а мутации возникают в обоих генах, можно сделать вывод, что онкогенное влияние мутаций связано с функциями изоцитратдегидрогеназы вне цикла Кребса и не имеет отношения к производству АТФ митохондриями. Действительно, выяснилось, что в результате мутаций изоцитратдегидрогеназа приобретает новую ферментную активность - мутант катализирует превращение альфа-кетоглутарата в R(-)-2-гидроксиглутарат и злокачественные опухоли с мутациями в генах IDH1 и IDH2 содержат примерно 100-кратный избыток 11(-)-2-гидроксиглутарата (Dang L. et al., 2009; Ward P.S. et al., 2010). Позднее было продемонстрировано, что экспрессия мутантных генов приводит к глобальным изменениям в метилировании геномной ДНК и делает метилом схожим с метиломом опухолевой клетки, а также влияет на метилирование гистонов и блокирует клеточную дифференцировку в адипоциты (Turcan S. et al., 2012; Lu С. et al., 2012; Duncan С.G. et al., 2012). Добавление І-октил-(О)-2-гидроксиглутарата также ингибировало дифференцировку в адопоциты (Lu С. et al., 2012), что указывает на то, что биологическое действие мутантной изоцитратдегидрогеназы связано с её новой ферментной активностью, по крайней мере, частично. Любопытно, что сверхэкспрессия IDH1 дикого типа также меняло метилом, но иначе чем экспрессия мутантного ЮНІ. Исследователи предположили, что уровень альфа-кетоглутарата также влияет на метилирование генома и это объясняет эффект сверхэкспрессии IDH1 дикого типа (Turcan S. et al., 2012). Другим доказательством того, что онкогенное действие мутанта IDH связано с его новой ферментной активностью является то, что специфическое ингибирование этой ферментной активности ингибитором AGI-6780 индуцировало дифференцировку эритролейкозной клеточной линии TF-1, сверхэкспрессирующей мутант IDH2/R140Q, и первичных человеческих клеток острого миелоидного лейкоза, несущих мутацию R140Q в гене IDH2, in vitro (Wang F. et al., 2013).

С точки зрения объяснения эффекта Варбурга интересна также серия работ одной из групп исследователей, посвященная так называемому «обратному эффекту Варбурга». На том основании, что человеческие фибробласты, ассоциированные с раковой опухолью груди, и потерянной экспрессией гена сауеоИп-1 (Сду-7), равно как и Сау-1(-/~) мышиные фибробласты имели увеличенную интенсивность гликолиза, эта группа исследователей предположила существование так называемого «обратного эффекта Варбурга» (РауНёез Э. е1 а1., 2009). Следует отметить, что потеря экспрессии Сау-7 в строме раковой опухоли ассоциировано с плохим прогнозом для пациентов с раком груди ("^Наелуюг А.К. е1 а1., 2009). Исследователи предположили, что интенсификация гликолиза в фибробластах, ассоциированных с раковой опухолью, приводит к секреции этими фибробластами конечных метаболитов гликолиза - лактата • и пирувата. Лактат и пируват затем усваиваются раковыми клетками и используются в цикле Кребса, что даёт раковым клеткам энергию и приводит к росту раковой опухоли. Вывод об интенсификации гликолиза в фибробластах, ассоциированных с раковой опухолью, был сделан на основании увеличения экспрессии в них генов некоторых ферментов, участвующих в гликолизе (РауНёез Э. е1 а1., 2009). Прямых измерений уровня лактата и пирувата сделано не было. Не было также предоставлено прямых доказательств увеличения потребления кислорода раковыми клетками. Тем не менее, было продемонстрировано, что ко-инъекция клеток человеческой клеточной линии рака груди МОА-МВ-231 с Сем-7(-/-) фибробластами в иммунодефицитные мыши приводило к более быстром

Информация о работе

Максимов, Вадим Владимирович
кандидата биологических наук
Москва, 2013
ВАК 03.02.07

Диссертация

Определение гена полифункционального пептида гуманина и белков, физически взаимодействующих с ним - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы