Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Очистка и характеристика стимулятора гемопоэза млекопитающих из тканей среднеазиатской черепахи Testudo horsfieldi

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Очистка и характеристика стимулятора гемопоэза млекопитающих из тканей среднеазиатской черепахи Testudo horsfieldi"

АКАДЕМИЯ НАУК РЕСПУБЛИКИ УЗБЕКИСТАН фц ИНСТИТУТ БИОХИМИИ

1 У :|'П|] 19°!л На правах рукописи

УДК 577.343; 576.3.7 599.591.044

АЛЕКСАНДРОВ ВИТАЛИЙ ВИТАЛЬЕВИЧ

ОЧИСТКА И ХАРАКТЕРИСТИКА СТИМУЛЯТОРА ГЕМОПОЭЗА МЛЕКОПИТАЮЩИХ ИЗ ТКАНЕЙ СРЕДНЕАЗИАТСКОЙ ЧЕРЕПАХИ Testudo horsfieldi

03.00.04-Биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Ташкент-1996

Работа выполнена в лаборатории радиационной биохимии и цитологии Института биохимии АН РУз.

НАУЧНЫЕ РУКОВОДИТЕЛИ: доктор биологических наук,

профессор A.A. Турдыев кандидат биологических наук Р.Б. Усманов

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ: доктор биологических наук,

профессор С.К. Халиков кандидат биологических наук Э.С. Садыков

ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ: Ташкентски« Педиатрический

медицинский институт

Защита состоится " ^ " • ^ _1996 года в _часов

на заседании Специализированного Совега д 015.16.01 по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора биологических наук при Институте биохимии АН РУз по адресу: 700143, Ташкент, пр. Х.Абдуллаева, 56.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биохимии АН РУз.

Автореферат разослан J-иХЛ. 1996 г.

Ученый секретарь Специализированного у

Совета, доктор биологических наук '' П. Мнрхамилова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ. Проблема постлучевого восстановления кроветворения - одна из ключевых проблем современной радиобиологии. Поэтому любые попытки решения этой проблемы имеют как теоретическое, так и практическое значение и являются весьма актуальными.

Установлено, что клеточным детерминантом восстановления кроветворения являются стволовые кроветворные клетки (СКК). Их уровень в летально облученном организме черезвычайно низок. Помочь организму восстановить их уровень до необходимых значений - значит найти новый путь эффективной терапии (В. Бонд и др., 1971, А.Г. Коноплянников, 1984, К.С. Чертков и др., 1976).

На радиотерапевтическую эффективность были проверены сотни веществ различных классов. Наиболее эффективными оказались •жсгракты селезенки, тимуса, костного мозга, а также плазма и сыворотка животных различных видов. Показано, что они содержат вещесгва, способствующие восстановлению пораженного кроветворения (Б.Б. Мороз и др., 1973, Д.Х. Маджидова и др., 1982, Г.А.Шалышва и Н.Н.Клемпарская, 1984). Имеющиеся немногочисленные экспериментальные данные наталкивают на мысль о возможном существовании прямой корреляции между радиорезистентностью животного и степенью радиотерапевтической эффективности экстракта селезенки данного животного. Так, у мышей экстракт более эффективен, чем у морской свинки - одной из наиболее чувствительных в ряду позвоночных животных. Экстракт селезенки черепахи - животного, известного своей феноменальной радиорезистентностью, гораздо более эффективен, чем экстракт селезенки мышей (О.И. Олонцева и др., 1987, А.А.Турдыев и др., 1982, 1985, F. Ellinger, 1956, 1961, L.C. Ford, 1968). .

Было показано, что плазма крови черепахи, ее экстракт селезенки п ■экстракт фетальной печени, являются хорошими терапевтическими препаратами (Д.Х. Маджидова, 1982, Р.Б. Усманов, 1986, Т.Н.Соколова, 1988). Однако неизвестна радиотерапевтическая активиосп. препаратов из других органов черепахи. Поэтому поиск новых рздиотерапевтических препаратов из черепахи и очистка веществ, ответственных за эффект, представляются весьма актуальными.

ЦЕЛЬ II ЗАДАЧИ РАБОТЫ. Целью настоящей работы являет! получение из черепахи факторов - стимуляторов кроветворения в очищенном виде.

В соответствии с целью были определены следующие задачи:

1. Исследовать радиотерапевтический эффект экстрактов различны \ тканей среднеазпщской черепахи.

2. Максимально очистить препарат , обладающий наиболее выраженным эффектом.

3. Дать физико-химическую и биологическую характеристику очищенного препарата.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА И ПРАКТИЧЕСКАЯ ЦЕННОСТЬ РАБОТЫ Разработаны способы получения водных экстрактов желчи, почек, печени и мышц, а также цитозоля клеток крови среднеазиатской черепахи. Обнаружено, что все эти препараты, за исключением экстракта желчи, способствуют увеличению выживаемости облученных животных. Максимальным радиотерапевтическим эффектом обладает цитозоль клеток крови. Его удельная активность в 4 раза выше, чем у экстракта селезенки черепахи, а выход - в 12 раз выше при практически равной эффективности.

Изучен состав и биологическое действие цитозоля клеток крови черепахи, названного авторами "Тортезин". В состав препарата входят белки (87%), большую часть которых составляет гемоглобин, сахара (около 5%), липиды (0,74%). Гемоглобин представлен двумя формами с ИЭТ 7,5 и 9,5. Лечебное действие препарата проявляется в стимуляции синтеза РНК и ДНК в костном мозге. Выживаемость леченых животных возрастает на 50-70% (ФУД около 1,4). При введении препарата интактным мышам наблюдается заметная стимуляция реакции антнтелобразования.

Разработан способ трехэтапной очистки препарата "Тортезин" методами колоночной хроматографии. Степень очистки по веществу составила 300, по активности - 100. Новый препарат назван авторами "ТАУ-тортезин". Его биологическое действие аналогично действию препарата "Тортезин". Изучены основные физико-химические свойства нового препарата и доказана его пептидная природа. Препарат содержит до 10 пептидов с М.м. 2400±400 Да, причем два пептида имеют свободные аминогруппы и ИЭТ 5,2±0,2 и 8,0±0.2. Определен аминокислотный состав препарата (16 аминокислот).

Дальнейшая очистка препарата и выделение в гомогенном виде фактора, ответственного за стимулирующий эффект, может дагь в руки исследователей тонкий инструмент, способный избирательно воздействовать на пролиферативную активность кроветворных клеток-предшественников. Это открывает перспективы коррекции иммунного статуса и лечения Некоторых гематологических и онкологических заболеваний.

ПУБЛИКАЦИИ И АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ. По материалам диссертации опубликовано 14 печатных работ, получено 1 Авторское свидетельство СССР и 4 Предварительных Патента РУз. Резулыагы работы доложены на Шестом Всесоюзном симпозиуме по химии белков и пептидов (Рига, 1983), 1-й Конференции биохимиков \'«Г>ек-1!сгана (Ташкент, 1986), 2-й Коиференинм биохимиков

Узбекистана (Ташкент, 1993), 3-й научно-практической Конференции "Актуальные вопросы медицины" (Ташкент, 1994), 1-м Съезде онкологов Республики Узбекистан с международным участием (Ташкент, 1994), Конференции "Структура и функции биологических мембран" (Ташкент, 1995), 3rd Internat. Meeting NPPE-95 (Dubna, Russia, 1995).

СТРУКТУРА И ОБЪЕМ РАБОТЫ. Диссертационная работа изложена на 110 страницах машинописного текста, состоит из Введения, Обзора литературы (Глава I), Материалов и методов исследований (Глава 2), Результатов исследования и их обсуждения (Глава 3), Заключения, Выводов и списка цитированной литературы, включающего 205 источников. Диссертация иллюстрирована 13 рисунками н 17 таблицами.

МАТЕРИАЛЫ II МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Исследования проведены на среднеазиатских черепахах Testudo horsfieldi, самках массой 1050±150 г., мышах линий СВА и С57 BL/6, беспородных белых мышах обоего пола массой 18-22 г, и крысах Вистар обоего пола массой 140-200 г. В работе использовано 600 черепах, 1400 мышей и 400 крыс.

В работе применялись производные декстрана (сефадексы) G-10, G-25, СМ-сефадекс фирмы Pharmacia (Швеция), Ультрогели АсА-202, АсА-34 и А-6 фирмы ЛКБ (Швеция), нейтральный оксид алюминия (СССР), химреактивы и среды ЧДА и ХЧ (СССР).

Использовались 3Н-тимидин и 3Н-уридин производства Чехословакии.

Тотальное облучение животных проводили гамма-лучами Cof0 при мощности дозы 1,00 Р/с на установке "Агат-Р" в НИИ ОиР АН РУз, и при мощности дозы 1,43 Р/с в ИЯФ АН РУз.

Растворы препаратов, готовили непосредственно перед введением. Вводили внутрибрюшинно через 2-4 ч после облучения в объеме: мышам - 0,3 мл, крысам - 0,5-2,0 мл.

Выживаемость определяли в течение месяца после облучения. Клеточность костного мозга и крови определяли на автоматическом счетчике клепок Пикоскаль-4Р в присутствии сапонина.

Лпофнлиэированные водные экстракты органов и тканей черепахи получали по оригинальным методикам, допускающим длительное хранение. Определение ДНК- и РНК- синтетазной активности клегок KOC1HOIO мочга проводили п соответствии с методическими рекомендациями (Владивосток, 1990) в макро- и микромоднфикации Г1одече1 радиоактивности на фильтрах проводили на счегчике "Рак бега - 1217/1219" фирмы ЛКБ, Швеция, с использованием спинни i'üiropn ЖС-7Л или ЖС-8, с эффективности счет по ipimiio

30 - 40 %. Оценку достоверности различий проводили методами вариационной статистики (В.Ю. Урбах, 1964).

Количество антителообразующих клеток в селезенке определяли прямым методом локального гемолиза в агаре по Jeme N.K.., Nordin A.A., 1963. Изозлектрофокуснрование проводили на стандартных ПААГ-пластинках с амфолннами фирмы ЛКБ, Швеция, в соответствии с рекомендациями фирмы.

Электрофорез на бумаге проводили с использованием 0,2 М ацетатного и 0,2 М фосфатного буферов на бумаге Ватман 3 ММ. После окончания электрофореза полоски окрашивали 0,5% раствором нингидрина в ацетоне. Обработку проназой Е проводили при pH 8,3. Эффективность. переваривания определяли гель-фнльграцией контрольной пробы альбумина человека.

Белок определяли по Лоури (1954) и по реакции связывания с Кумасси (Скоупс Р. 1985).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕН И Е

1. СКРИНИНГ СТИМУЛЯТОРОВ ГЕМОПОЭЗА ИЗ ТКАНЕЙ ЧЕРЕПАХИ.

Ранее было показано, что селезенка и эмбриональная печень черепахи содержат белково-пептидиые факторы, стимулирующие гемопоэз. Очевидно, что и другие органы и тканн должны содержать эти же факторы. В этой связи'были получены данные о массе некоторых органов черепах в осенний и весенний периоды (Табл. I).

Показатели (в % ог массы тела)

Селезенка Печень

Желчный пузырь Мышцы Почки ■

Эмбриональная печень

Кровь

Гемоглобин, Г-% Эритроциiы, млн/мм1 Лейкоцшы, 1ыс/мм5 Гемаюкрш. %

Осень Весна

0,12*0,02 0,20*0,02

3,70*0,50 5,30*0,40

0,47*0,02 0,73*0,03

18,6±4,3 21,0*4,2

0,25*0,09 0,30*0,07

3,20*0,80 4,30*1,00

на 60-е сутки на 70-е сутки

шбриогенеза эмбриогенеш

4,2*0,10 6,0*0,12

5,4*0,16 10,0*0,87

1,2*0,19 1,33*0,21

13,3*0,65 16,5*1,58

3-1,0*3,40 30,6*2,9

Были выбраны органы, традиционные для народной медицины Средней Азии и упоминавшиеся еще Авиценной . В качестве потенциальных источников заметных количеств препаратов могут использоваться мышцы, кровь, печень, желчь. Так как масса всех этих органов в весенний период достоверно выше, и черепах весной гораздо больше, дальнейшая работа проводилась с препаратами именно из весенних черепах.

Были разработаны оригинальные методы получения экстрактов вышеперечисленных органов (Табл.2).

Препарат Выход на 100 черепах,г

Экстракт мышц 270

Экстракт селезенки 8,6

Экстракт печени 96

Цитозоль клеток крови ПО

Желчь 31

Экстракт почек 13,4

Экстракт эмбриональной печени 0,54

Полученные препараты проверены на биологическую эффективность по тесту на уменьшение дозы облучения (Табл.3). Оптимальные дозы введения были определены ранее опытным путем.

Препарат Доза введения, мг/кг ФУД

1. Экстракт селезенки 20 1,45

2. Экстракт печени 20 1,10

3. Экстракт эмбриональной 20 1,46

печени

4. Экстракт мышц 20 1,09

5. Пит поль слеток гропн 1,33 1.22.

о. Экстгагг поче!' _________

•ЪрЧГ.' С 1!1,!С(!!.'НМ(! ¡V.'. 11Г О ! <: Г ■ ! ' < ■! Г'• ■ *'.".М'Л Г..'?П.'.

:-:-(П|-а;пл сглеич»-и г^р-ма - ¡'хил::- (Г.'-'п.г:'МП!.!ч;'

Д.Х.. !*>Ч?. Кр.чмч'- Л >< др , • '"<?. ! {?., ¡гмсшт"

активностью обладают также экстракты печени, мышц и цитозоль клеток крови. Эти препараты могут рассматриваться в качестве потенциально радиотерапсвтических и,особенно, в качестве потенциальных источников факторов, ответственных за эффект, что связано с их высоким выходом. Причем оптимальная доза введения цитозоля клеток крови в 4. раза ниже дозы экстрактов селезенки, и эмбриональной печени при практически равной эффективности. Несмотря на то, что если в случае экстракта эмбриональной печени источником факторов, восстанавливающих гемопоэз, и, возможно, воздействующих иа стволовую кроветворную клетку, служат клетки эмбриональной печени - органа кроветворения, то клетки крови более чем на 99% состоят из эритроцитов. В этой связи на радиогерапевтнческую эффективность были также проверены цитозоля клеток крови мыши, крысы и человека, приготовленные по аналогичной методике. (Табл.4).

Для этих препаратов характерно слабое радиотсрапевгическое действие ( ФУД не выше 1,10), что делает их малоперспектнвпммп для дальнейшего изучения.На их фоне эффект препарата из черепахи вмглядит особенно впечатляюще (ФУД=1.41).

Табл.4

Терапевтическая эффективность цптозолеп клеток крови некоторых позвоночных (б/п мыши, 7.0 Гр)

Доза введения мг/кг Выживаемость за 30 суток. % ФУД

1. Интактные - 94 (17 из 18) -

2. Контроль - 18 (4 из 22) -

3. Цитозоль клеток крови черепахи 10 70 (14 из 20) 1.41

4. Цитозоль клеток крови крысы 10 25(5 из 20) 1.03

5. Цитозоль клеток крови мыши 10 35 (7 из 20) 1,111

('• Цитозоль клеток крови человека 10 30 (6 И1 20)

- Г. -

Биологическое действие цитозоля клеток крови.

Два самых эффективных радиотерапевтических препарата - экстракт селезенки и цитозоль клеток крови - были проверены на независимом тесте антителообразующих клеток - (АОК). Этот тест позволяет выявить вещества - иммуностимуляторы (Рис. 1).

25 50 155 500 каг/иы«

Рис 1. Количество АОК (индекс к контролю) на ! млн. клеток селезенки мышей, иммунизированных эритроцитами барана

Рис.?.. Восстановление клеточкосш костного мои а облученных мышей под зоздействием цитозол:? хлпш; крот: сречнеплиатссой черепахи

Оба препарата оказались сильными иммуностимуляторами (индекс стимуляции 2,5), но эффект цитозоля клеток крови проявляется при меньших дозах • 50 мкг/мышь вместо 150 мкг у экстракта селезенки.

Повышение выживаемости после облучения теснейшим образом связано с восстановлением системы гемопоэза, важнейшим звеном которой является костный мозг (В.Бонд и др., 1971, Чертков И.Л. и Гуревич O.A., 1984). Поэтому была изучена динамика восстановления клеточностн костного мозга облученных мышей под действием цитозоля клеток крови (Рис.2).

Уже с 5-х суток эксперимента опытные значения достоверно превышают контрольный уровень, что говорит о благотворном действии препарата на костный мозг и гемопоэз в целом.На 14-15 сутки наблюдается "овершут", когда клеточное! ь даже превосходит интактный уровень. Это возможно только в том случае, если на 4-7-е сутки содержание СКК превышает интактный уровень ( Коноплян-ников А.Г., 1984, Till J.E., McCulloch Е.А., 1961). "Овершут" можно рассматривать как подтверждение того, что действие препарата затрагивает самые высшие этажи кроветворения.К этому же выводу приводит изучение динамики синтеза ДНК и РНК в костном мозге.

По совокупности параметров (высокий выход и простота получения, высокая радиотерапевтическая эффективность, огромное влияние на синтетические процессы в костном мозге, сильное иммуностимулирующее действие) цитозоль клеток крови черепахи (препарат "Тортезнн") является чрезвычайно перспективным препаратом для дальнейшего изучения.

Были определены основные физико-химические свойства препарата (Табл.4).

Физико-химические свойства цитозоля клеток крови среднеазиатской черепахи

Растворимость в воде Белок по Лоури

Белок по Бредфорд (связывание с Кумасси) Сахара по.Дюбуа Общие лнпиды

Содержание гемоглобина (колориметрически) Максимум поглощения

более 98% 84,0*2,6% 88,6*3,7% 4,6*0,8%, 0,74*0,10% 82,1 ±3.9% 408 нм

Е4оа(при рН=7,4)

33,0

Е2го(ири рН=7,4) Jifiä

Е280

18,5 1,78

Основные физико-химические свойства препарата определяются гемоглобином, на долю которого приходится 82% сухого вещества. По данным ИЭФ, гемоглобин у черепахи представлен двумя формами с ИЭТ 7,9 и 9,5. Хроматографический анализ методом обратно-фазовой хроматографии, наряду с ИЭФ, выявил высокую гетерогенность препарата.

2. ОЧИСТКА ЦИТОЗОЛЯ КЛЕТОК КРОВИ

После обнаружения высокого радиотерапевтического и иммуностимулирующего действия цитозоля клеток крови черепахи, названного авторами "Тортезин", встал вопрос об очистке факторов, ответственных за эффект. На первом этапе, учитывая большое количество гемоглобина в препарате и его высокие сорбциониые свойства (Коржуев П.А., 1964), была использована асорбционная хроматография на оксиде алюминия (Рис.3). После обессоливания на сефадексе G-10 и лиофилизации выход фракций составил : Фр 1 - 3-5%, Фр 2 - 86-92"/. и Фр 3 - 5-9%.

Рис.3. Разделение цитозоля клеток крови черепахи на оксиде алюминия. 0,5 М ацетатный буфер, рН 6,0.

Колонка: 4x15 см, уравновешена базовым ацетатным буфером

Смена буфера : I - 0,2 М фосфат натрия, рН 8,2 2 - 0.2 М аммиак.

Полученные фракции были протестированы на облученных мышах и крысах. Максимальным радиотерапевтическим эффектом обладает Фр I, причем доза введения ее минимальна и составляет всего 0,24 мг/кг, или 5 мкг/мышь. ФУД достигает значений 1,21-1,36.

Фр 1, состоящая преимущественно из ннзкомолехулярных компонентов, далее была разделена на Ультрогеле АсА-202 (Рис.4).

Колонка : 2,6x60 см, элюент - бидистиллированная вода.

Нанесено 50 мг Фр 1.

При этих условиях фракция I дает 7-8 пиков, которые были объединены в 4 фрахцми. Их относительное содержание по УФ-поглощешно составило: Фр.1-1 - 2%, Фр.1-2 - 55%, Фр.1-3 - 23%, Фр.1-4 - 20%.

В соответствии с их относительным содержанием фракции были протестированы на облученных мышах и крысах. Оказалось, что фракция 1-2 почти втрое увеличивает выживаемость облученных животных (до 60-80% вместо 20% в контроле). Гораздо слабее было выражено падение клеточности костного мозга, заметно вырос синтез ДНК. По совокупности результатов можно заключить, что ответственные за стимуляцию гемопоэза в облученном организме факторы преимущественно содержатся во фракции 1-2.

При гель-фильтрации иа "Молселекте О-Ю" эта фракция разделилась на 2 подфракции - 1-2-1 и 1-2-2. относительное содержание которых по УФ-поглошению при 206 им составляет 17% н 83% (рис.5).

Рис.5. Разделение Фр 1-2 на "Молселекте 0-10".

Колонка 1,6x70 см, элюент - бидистнллированная пода.

Нанесено 20 мг Фр 1-2.

По совокупности показателей восстановления кроветворения был сделан вывод о высокой радиотерапевтической эффективности фракции 1-2-1 препарата "Тортезин". Это проявляется в меньшем падении клеточности костного мозга и массы селезенки, неизбежно вызываемых облучением, а также усиленном синтезе ДНК, который более чем в 4 раза превышает контрольные значения, достигая интактного уровня. Эта фракция получила название - препарат "ТАУ-тортезин".

Степень очистки составила: по массе - в 300 раз;

по активности - в 100 раз.

3. СВОЙСТВА ОЧИЩЕННОГО СТИМУЛЯТОРА ГЕМОПОЭЗА Физико-химпческне свойства _

Лиофильно высушенный очищенный стимулятор гемопоэза (препарат "ТАУ-тортезин") - порошок слабо коричневатого цвета, с характерным запахом, чрезвычайно гигроскопичен. Без остатка растворим в воде и 50% этаноле. Растворы бесцветные, при храпении желтеют. Молекулярная масса, определенная методом гель-фнлмра-ции - 2400+400 Да.

УФ-спектр поглощения водного раствора препарата не имеет ярко выраженных максимумов в диапазоне 205-305 им, однако имеет "плато" в области 260-285 им, что характерно для смеси компонентов, содержащих ароматические группы. Совпадение (в пределах ошибки опыта) результатов определения белка (Табл.5), а также устойчивость фактора к проназе • указывает на пептидную природу фактора -стимулятора гемопоэза.

Табл.5

Способ определения Концентрация, мкг/мл

Белки: поЛоури 510 + 23

по связыванию с

Кумасси синим С-250 478 + 17

по УФ-поглощению

при 206 и 280 нм 503 + 6

Сахара: по Дюбуа менее 3%

Таким образом, не менее чем на 95% препарат имеет белково-пепгидную природу.

Для 1% раствора оптическая плотность составляет:

г/.

Егоб= 362;

Ем- 36,0 и и/.

Еио= 33,6.

По данным обратнофазовой хроматографии на сефадексе ЬН-20, в состав препарата входят 10 индивидуальных компонентов, с относительным содержанием (по поглощению 206 нм) от 2 до 21%.

Общий аминокислотный анализ показал, что в состав препарата входят 16 аминокислот. Бумажный электрофорез выявил 2 компонента, содержащих свободную аминогруппу и активно реагирующих с ниигидрином. Их ИЭТ 5,2±0,2 и 8,0±0.2. На долю этих компонентов приходится более 85% всех свободных аминогрупп препарата. Оставшиеся аминогруппы принадлежат минорным компонентам. Полученных данных достаточно для полной идентификации препарата.

Биологические свойства

Даже небольшие количества (0,05 мг/кг, или I мкг/мышь) препарата "ТАУ-тортезин" при в/б введении облученным мышам и крысам оказывают благотворное воздействие на систему гемопоэза. Это проявляется в меньшем падении клегочностн костного мозга и массы селезенки, стимуляции синтеза ДИК и РНК, ускоренном восстановлении лейкоцитов крови, и как следствие, увеличение выживаемости облученных животных.

Для определения рабочего диапазона препарат был в различных концентрациях испытан на облученных мышах . Оптимальными, по-видимому, следует считать дозы 0,15-0,40 мг/кг, при которых выживаемость, а следовательно, и ФУД выходят на "плато" (Табл.6).'

Доза препарата:

мг/кг мкг/мышь ФУД

0,01 0,2 1,04

0,05 1,0 1,18

0,15 3,0 1,24

0,40 8,0 1,28

1,00 20,0 1,14

При возрастании дозы препарата до 1,00 мг/кг ФУД заметно падает , что может быть связано с угнетающим действием отдельных компонентов препарата на систему гемостаза. До выделения в гомогенном виде ответственных за стимуляцию гемопоэза факторов вопрос о механизмах стимуляции остается открытым.

Препарат "ТАУ-тортезин" оказался также сильным стимулятором реакции антителобразованкя у ннтактиых мышей. Дозы 5-500 мкг/кг увеличивают число антителообразующнх клеток в селезенке в 2-3 раза. Число ядросодержащнх клеток в селезенке при этом также возрастает, что говорит о несомненной стимуляции препаратом процессов, непосредственно не связанных с антителообразованием и иммунным ответом, например - процессов миграции клеток. Вероятно, препарат содержит несколько пептидов-регуляторов, избирательно воздействующих на различные звенья систем кроветворения и иммунопоэза.

Клетками - источниками стимулятора , очевидно , являются эритроциты, которые у черепах содержат ядро. Наиболее вероятно, что компоненты ядерного материала (возможно, регуляторные пептиды хроматина) при экстракции попали в препарат, значительно обогатив его.

Таким образом, из цитозоля клеток крови черепахи впервые получен в очищенном виде стимулятор кроветворения и иммунопоэза и дана его подробная физико-химическая характеристика. Полученный препарат может стать тонким инструментом для изучения процессов регуляции кроветворения, а также может найти применение в гематологии и онкологии.

ВЫВОДЫ.

1. Цитозоль клеток крови среднеазиатской черепахи Testudo horsfleldi, наряду с водными экстрактами селезенки, почек, взрослой и эмбриональной печени, мышц, способствует увеличению выживаемости облученных млекопитающих. Максимальным радиотерапевтическим эффектом обладают экстракты эмбриональной печени, селезенки и цитозоль клеток крови.

2. Разработан метод получения цитозоля клеток крови черепахи -препарата "Тортезин". Удельная активность препарата в 4 раза, а выход - в 12 раз выше, чем у экстракта селезенки черепахи при равной эффективности.

3. В состав препарата "Тортезин" входят белки ( 87% ), большую часть которых составляет гемоглобин, сахара ( около 5% ), липиды ( 0,74% ). Гемоглобин представлен двумя формами с нзоэлектричес-кимн точками 7,5 и 9,5 соответственно.

4. Лечебное действие препарага "Тортезин" проявляется в стимуляции синтеза ДНК и РНК в костном мозге. Выживаемость облученных животных возрастает до 70%.

5. Трехзтаиной очисгкой методами колоночной хромаю!рафии из npenapaia "Тортезин" получен новый радиогераневтческнй препарат, получивший название "ТАУ- горзезин". Степень очистки по вещессву составила 300, по акшшюсш - 100

6. Препарат " I АУ-юргезин" содержи! до 10 пешидов с Мы. 2-lOü-MOO Да. Два пешнда нмеш свободные аминогруппы и ИЭТ 5,2*0,2 и 8,ОМ), 1 "Т АУ-iopieiHH" (.одержи) 16 аминокианх.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Турдыев A.A., Усмапов Р.Б., Юкельсои Л.Я., Нигматов 3., Александров В.В. Белковый стимулятор гемопоэза (БСГ) из селезенки черепахи //Шестой Всесоюзный симпозиум по химии белков и пептидов. Тез. докл. -Рига, 1983. С. 123-124.

2. "Гурдыеп A.A., Усманов Р.Б., Юкельсои Л.Я., Нигматов 3., Маджидова Д.Х., Александров В.В. Исследование лечебного эффекта очищенных компонентов экстракта селезенки черепахи. //Радиобиология, 1986. г.26, N 5. с.685-688.

3. Александров В.В., Усманов Р.Б. Влияние белковых компонентов селезенки черепахи на восстановление клеточности костного мозга облученных мышей. //Тез. докл. 1 Конференции биохимиков Узбекистана. -Ташкент, 1986, с.22.

■4. Александров В.В. Сравнительный анализ рздиомодифицирующего эффекта методом "одной точки". //Актуальные вопросы развития науки и техники в Узбекистане. -Тез. докладов конференции молодых ученых АН УзССР. -Ташкент, 17-IS декабря 1987. Ташкент, ФАН, с.76.

5. Турдыев A.A., Усманов Р.Б., Александров В.В., Филтотович О.С. Модель оценки устойчивости эритроцитов к радпомиметику. //Узб. бпол. ж., 1993, N 1, с.77-79.

6. Турдыев A.A., Усманов Р.Б., Александров В.В., Филютович О.С. Тортезни - новый препарат для лечения лучевой болезни. //2-я Конф. биохимиков Узбекистана. Тез. докл. -Ташкент, 1993, с.83.

7. Батырбеков A.A., Турдыев A.A., Комаров П.Г., Александров В.В., Усманов Р.Б., Филютович О.С. Влияние очищенных фракций различных тканей черепах на иммуногенез. //Актуальные вопросы медицины. Материалы 3-й науч.-практ. конф. -Ташкент, 1994, с. 13.

8. Усманов Р.Б., Александров В.В., Меметов Ф.Ю., Филютович О.С. Влияние на ДНК- и РНК-синтетазную активность клезок карциномы Эрлиха препаратов из селезенки черепахи. //Труды Т Съезда онкологов Узбекистана с междунар. участ.. -Ташкент, 1994, с.23-29.

9. Турдыев A.A., Александров В.В., Филютович О.С., Усманов Р.Б. Гемолитическое действие препаратов селезенки черепахи на мембраны эритроцитов. //Структура и функции биологических мембран. -Тез. конф. 23-21 Mapia |9<>5 1яшкент, 1995. с.109.

10. An.A. Kist, A.A. Turdiev, A.G. Kist, A.A. Kim, V.V. Alexandrov, R.B.Usmanov. THE DISTRIBUTION STUDY OF TRITIUM LABELED TORTEZIN IN MOUSE TISSUE //-3rd Internat. Meeting NPPE-95. -Dubna, Russia,'l995, p.136.

11. А.Г. Кист, B.B. Александров, Ан.А. Кисг, A.A. Ким, Р.Б. Усманов, A.A. Турдыев. Исследование биологической активности препаратов из тканей среднеазиатской черепахи. //'Радиоизотопы и их исгюльзование"-Тез. докл. 1-й Республпкана ой конф. 24-26 окт. 1995. Ташкент, 1995, с.72. ■

12. Турдыев A.A., Батырбеков A.A.. Усманов Р.Б., Александров В.В., Иванов В.И., Колбаев И., Филютович О.С. Стимуляция иммунопоэза препаратами из тканей средне-азиатской черепахи. -//Матер. IV Съезда терапевтов Узбекистана. Ташкент, 24-25 окт. 1995, 271.

13. Турдыев A.A., Колбаев И.Б., Александров В.В., Усманов Р.Б., Филютович О.С. Восстановление иммуногенеза мышеи веществами из лимфоидных органов рептилий при пестициднон интоксикации. //Профилактика и лечение иммунодефяцитных состояний. Ташкент, 1995,56-57.

14. Колбаев И.Б., Батырбеков A.A., Турдыев A.A., Усманов Р.Б., Александров В.В., Иванов В.И., Филютович О.С. Влияние препаратов из селезенки и крови черепах на иммуногенез у животных со вторичным иммунодефицитом. //В Сб. "Актуальные вопросы иммунологии и аллергологии, т.7. -Ташкент, 1995, с. 103-106.

Авторские свидетельства и патенты.

1. Турдыев A.A., Усманов Р.Б., Александров В.В. Средство, стимулирующее колониеобразованне в селезенке при облучении животных. /-Авторское свидетельство СССР N 1476644 от 3.01.89.

2. Турдыев A.A., Усманов Р.Б., Александров В.В., Филютович О.С. Способ получения препарата для лечения лучевой болезни. /-Предварительный Патент РУз N 369 or 27.12.93.

3. Турдыси A.A., Усманои Р.Б., Александров О.!!., Филютович О.С. Способ получилнл лреппрлта "Т^ртсзип" для лечения лучевой болезни. '-Предварительный Патент РУз N 2099 от 21.07.94.

■!. Турдыев A.A., Усманои Р.Б., Александрии 13.В., Филютович О.С. Способ получения препарата "ТАУ-Тортезип" для лечения заболеваний системы кроветворения/-Предварительный Пак-нг РУз N 2721 or 27.06.95.

V.V.AIexandrov

Purification and characterization of mammalia haemopoesis stimulator from tlv2 tissue of the Central Asian tortoise Tcstudo horsfieldi

Selected tissues of the Central Asian tortoise (Testudo horsfieldi) were screened for compounds with radiotherapeutic activity. "Tortesine" - a purified fraction from blood cells cytosol turned out tu be one of the most biologicsily active. Therapeutic effect were obserwed on the stimulation of DNA and RNA synthesis in bone marrow and the immune process of antibody forming cells (AFC). Laboratory mice treated with "Tortesine" after e-:posive to lethal radiation experienced a 50 lo 70% survival rate. The comp-.und consist of protein (87%) , chiefly haemoglobin ; sugars (about 5%) ; and lipids (0,74%) . Two Kinds of haemoglobin were seen with isoelectric point (IEP) of 7,5 and 9,5 respectivelly. A more purified fraction "TAU-Tortesine" was obtained from "Tortesine" by means of column cinematography. "TAU-Tortesine" contains 300 times the concentration of biologically active components by volume and produced 100 times the eifect. "TAU-Tortesine" contains about 10 peptides have free amino acid groups and lEP's of 5,2+0,2 and 8,0+0,2 respectivelly. All of peptides in 'TAU-Tortesine" are composed from among 16 amino acids.

Александров В.В;нииг номзодлик диссерганияси хулосасн "Урта Оспе тошбац'асн гуцим-дларидан олипган сутэмнзувчцлар гемопоэзи стимуллторшш тозалаш ва ушшг тасинфн".

Тошба^а тукималаридан радиотерапевтик активликка эга булгаи препаратларнинг скрининги утказилди. Улардан энг активинн ь;оп ^ужайраларинпнг цитозолн экани ашщланди ("Тортезин" препарата). Ушшг даволаш ^усусияти пликда ДНК ва РНК синтезшш ва иммунетегик жараёнларининг стимуляцияснда намо'ен булади. Бунда нурлантирилган жониворларнинг яшаш 1$обилняти 50-70%-га ортади. Препарат таркнбига куп-цпсмн гемоглобин булгаи о^силлар (Я7%), кандлар (5% атрофида), липидлар (0,74%) кнради. Гемоглобин ИЭН-си 7,5 ва 9,5 булган икки шащтда кнрган. "Тортезин" препарагндан колонкали хроматография усуллари асосида уч босцичли тоштш ерзали "ТАУ-Торгезин" деб аталган янги радиотерапевтик ва пммуностимуляция хусусиягларига эга булган янги препарат олинди. Бунда моддалар буйича тозалаш даражаси 300-га, активлнк буйича -100-га теш булли. Препарат М м.-лари 2400*400 Да булган 101агача пепшдларга на. Пккша пегпидда эркии амнногруппалар бор. уларнннг ПЭН-ларн 5,2*0,2 ва 8.0*0,2 ia зенг. Препарат шркпбша 161 а аминокйсшма кирши