Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Обнаружение капсулы у микоплазмы Acholeplasma Laidlawii

ВАК РФ 03.00.25, Гистология, цитология, клеточная биология

Автореферат диссертации по теме "Обнаружение капсулы у микоплазмы Acholeplasma Laidlawii"

РГ6 СП

институт цитологии российской академии наук

На правах рукописи

шов

Александр Михайлович ОБНАРУЖЕНИЕ КАПСУЛЫ У МИКОПЛАЗМЫ лсно1ер1а$мл ьлюьауп

03. СО. 25 - клеточная биология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

САНКТ-ПЕТЕРБУРГ 1994

Работа выполнена в Отделе клеточных культур и Лаборатории структурной организации генома Института цитологии Российской Академии Наук.

Научные руководители: доктор биологических наук, профессор С.Н.Борхсениус, кандидат биологических наук И. И.Фридлянская.

Официальные оппоненты: член-корр. РАН, д.б.н., проф. Б.В.Громов, д.б.н., проФ. В.И.Воробьев

Защита состоится июня 1994 г. в[3 часов на заседании

Специализированного совета Д.002.73.01 при Институте цитологии РАН по адресу: 194064, Санкт-Петербург, Тихорецкий пр. 4.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института цитологии. РАН.

Ведущее учреждение: защиты растений.

Автореферат разослан " а про ли 1994 года.

Ученый секретарь Специализированного совета, доктор биологических наук

Л.Н.Писарева

Лотуз^ьность_теиь11_ Микоплазмы - широко распространенные паразиты и комменсал! человека, животных и растения. Наличие у микоплазм минимального среди самовоспроизводящихся организмов размера генома и редуцированность метаболитических путей позволили предложить теорию минимальной клетки, которая рассматривает микоплазменную клетку как уникальную по своей

ОТНОСИТРЛЬНОЙ ПрОСТОТе бИОЛОГИЧеСКую СИСТену (MorovlLz. 19 84 ),

Всепзи с этим мккоплззма является интересным объектом не только в узкоспециальном, но и в общебиологическом аспекте. Одно из классических положений современной микоплэзмологии - отсутствие у микоплззм клеточной стенки, вследствие чего микоплэзменнэя клетка считается окруженной только клеточной мембраной. Исходя из этого предпологэется, что микоплазмы должны использовать особую жизненную стратегию для выживания в различных условиях окружающей среды, в том числе - в организмах-хозяевах. Одной из этих стратегии является высоким уровень вариабильности поверхностных молекул, что может предохранять микоплазмы от влияния окружающей среды, в том число от воздействия иммунной системы хозяина (wise е». ..j . iээг). с другой стороны, некоторые микоплазмы экспрессируют дополнительный аморфный поверхностный слой, называемый капсулой. У различных микоплззм толщина этого слоя может варьировать (ОТ 24НМ у Mycoplasma dispar ДО 40 HM У М. hyopneumoniae ) . Зз ИСКЛЮЧвНИеМ М. mycoictes , КОТОрЭЯ ТТрОДуЦИрувТ

неприкрепленный материал, капсула у большинства микоплазм заякорена на клеточной мембране (Tovbin 8. Baseman, 1992). Непосредственный анализ химического состава капсулы позволил обнаружить присутствие в ней полисахаридов и липогликанов

(Rosenbusch & Minion. 1993).

Микоплззменнзя капсула считается полифункциональноя структурой. Капсульный материал принимает участие в развитии патогенного процесса, вызываемого микоплазмами в организме-хозяине (Rosenbusch a Minion. 1992) И М0Ж6Т ВЫЗЫВЗТЬ иммунный ответ последнего (Tryon & Baseman. 1992). ИЗВвСТНО, ЧТО компоненты этой структуры ингибирукгг Фагоцитарную активность макрофагов (Kasper, 1986). Участие НЭПСуЛЫ В Процессе прикрепления к мембране клетки организма-хозяина показано для

ряда ВИДОВ МИКОПЛЗЗМ, включая Н. dispar (Hovard et al., 1974), M.m&leargis (Green & Hanson, 1973), И.pneumoniae (Wilson &

-L-

Coller. 1976).

Большая часть исследований морфологии микоплазменнои капсулы осуществлялась при использовании электронной микроскопии после обработки материала поликатионными соединениями, такими, как рутениевый красный. При использовании этого метода капсула была описана у представителей родов Mycoplasma (».trocoides туе о i des,

И. dispar, M. gal I isept icxim, M. hominis, M. hyopneumonia«?,

M. pneumoniae, M. pulmonis И M. synouiaí) И Ureaplasma (U. wrealit icxim) И H6 Обнаружена у Acholeplasma, Anaeroplasma И других родов Mol I icutes (Rosenbusch & mini on. 1992). ОДНЭКО, возможность применения этого метода для изучения капсулы зависит от состава капсульного материала. Неудачи в исследованиях могут быть следствием нейтрального или положительного заряда молекул этого слоя.

Недавно был предложен другой метод визуализации капсульного материала. Высокогвдратированную капсулу escherichia сои обнаруживали только после обработки бактериальных клеток антителами, специфичными к капсуле (kroncke et ¿i. , iqso). Такая обработка стабилизировала капсулу и делала ее устойчивой к процедурам подготовки препарата к электронной микроскопии. Применение данного метода при изучении микоплазм может помочь выявить поверхностные образования, которые невозможно изучать, используя рутинные методы исследования капсул.

Изучение поверхностных структур микоплазм должно помочь ответить на многие нерешенные вопросы взаимодействия микоплазм и клеток высших организмов. Как частный случай такого взаимодействия можно рассматривать часто встречающиеся микоплазменные контаминации клеточных культур. Для выявления микоплазменных заражений клеток используются различные методы идентификации, в том числе - ДНК-зонда, несущие универсальные для многих микоплазм Фрагменты. После установления Факта контаминации часто необходимо выяснить видосшцифичность заражения. Для этого, как правило, используют моноклональные антитела (МКА) к поверхностным антигенам. Acholeplasma laidlawi i входит в число пяти наиболее частых микоплазменных контаминантов клеточных культур и создание тест-систем для выявления заражения этой ахолеплазмой является актуальной задачей.

Цели и задачи исследования. Целью предлагаемой работы являлось изучение поверхностных структур микоплэзмы АсЬо1ер1сизта 1а1(Иаъ>1 i. в связи с этим были поставлены следующие эксперементальныв задачи:

1. Создать панель гибридом против поверхностных антигенов

А. 1акНач>И с по с Л9 ДУЮЩИМ ТвСТИрОВЭНИеМ ЭНТИТВЛ НЭ ВНУТРИВИДОВУЮ

и межвидовую специфичность.

2. С помощью полученных моноклональных антител изучить поверхностные антигены л.ьагсиаыи иммуномикроскопическими и иммунохимическими методами.

3. Изучить внутриштаммовую и межштэммовую вариабильность поверхностных антигенов а. 1ащ1аь>а.

Научная новизна работы. Работа содержит новые данные, касающиеся поверхностных структур микоплэзмы АсЬо1ер1азпа

1а1<Иаь>1 I .

Представители семейства Асьог&рЬазтаюсеае считались неинкапсулированными микоплазмами. Нами была обнаружена и описана капсула у АсЬог&рЬазта laic^lau>ii. Для этого впервые применительно к микоплазмам была использована методика обнаружения капсулы, включавшая обработку клеток антителами. специфичными к поверхностным антигенам и последующее электронномикроскопическое изучение материала.

Капсульная структура, обнаруженная у а. ы^ыгаыи а, по своему распределению на поверхности клетки и по химическому составу сходна с капсулами, ранее описанными у других микоплазм. Иммунохимические исследования капсулы позволили обнаружить в ней присутствие молекул,- сходных по многим параметрам с бактериальными липополисахаридами (ЛПС), являющимися одним из компонентов бактериальной капсулы. Подобные молекулы найдены и у

другого ШТаММа а. 1а1с11аши.

Показано наличие межштаммовоя вариабильности поверхностных антигенов у а.1ас<наъ>и . Уровень внутриштаммовой вариабильности капсульного антигена оказался ниже, чем 5x10"5 на клетку на генерацию.

Можно предположить, что применение подхода, который был использован нами для обнаружении капсулы у л. 1а<<иаыи покажет наличие подобных структур у многих микоплазм. Подтверждение этого

-к-

прздположения может изменить представление о микоплазмах, как о клетках, окруженных только мембраной.

Практическая ценность. На основе гена 16Э рРНК а. 1а1сиаъ>и создан новый универсальный зонд, который можно применять для выявления заражении клеточных культур любыми микоплазмами.

Одна из полученных гибридом продуцирует антитела, специфичные для пяти тестированных штаммов л. ыи не имеющие иммунологического перекреста с несколькими другими тестированными микоплазмами, что делает возможным применение данных антител для идентификации ахолеплазменных контаминации клеточных культур.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на IX международном конгрессе Общества Микоплазмологов (США, 1992), совещании "Биология клетки в культуре" (С Петербург, 1992), докладывались на семинарах в Институте цитологии РАН.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 2 статьи и 2 тезисов.

Объем работы. Диссертация изложена на стр. машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов, обсуждения и выводов. Работа иллюстрирована . рисунками и таблицами.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Микоплазмы. клеточные ^инии и условия щс культивирования. Получение сублиний микоплазм. В данной работе использовали

Acholeplasma laidlauii ШТаММЫ А. В, Av. S-40 И F, Mycoplasma homiriis Н34, Н, gal l is&pt 1С u/n AS969, H.argínim R16. МИКОГЦЮЗМЫ

выращивали, как описано В (Korolev et. al., 1994). Клетки Vero выращивали на dme-fie с 10% сыворотки эмбрионов КРС. Сублинии л. taidtawít А получали, используя стандартную процедуру клонирования, описанную в (Rosengarten el al. . 1991 ).

Получение гибридом и моноклональных антител. Получение гибридом осуществляли, как описано в (Фридлянская, 1988) с

небольшими модификациями. В качестве антигена при иммунизации мышеи BALB'C использовали живые клетки A. laidlawn а. Антигенную специфичность определяли методом твердофазного иммуноФерментного анализа (hl.isa) на микоплазменных клетках. Позитивные гибридомы были клонированы 2-3 раза. Асцитную жидкость получали от предварительно инъецированных пристаном мышей balb--c через две недоли после внутрибрюшиннои инъекции клеток гибридомы. Классы иммуноглобулинов определяли с помощью набора для изотипировэния мышиных гибридом.

elisa для определения специфичности антител. 98-луночные платы предварительно активировали поли-Д лизином. Затем в платы добавляли суспензию микоплэзмы. После инкубации микоплазменные клетки Фиксировали Формалином. Супернатант от каждой гибридомы добавляли в параллельные лунки, содержащие иммобилизованные клетки различных микоплазм. В качестве контроля использовали гибридомную ростовую среду. После промывки в штаты добавляли кроличьи антитела против иммуноглобулинов мыши, конъюгированные с пероксидазой хрена. В качестве субстрата-хромогена использовали раствор ортоФенилондиамина. Количественно результаты определяли на спектрофотометре Muitiskan при длине волны х = 492 нм.

Непрямая иммунофлюоресценшя. Моноклональные антитела (гибридомный супернатант) добавляли к клеткам A.iaidiawít д в разбавлении 1:5 за 1 час (кратковременная инкубация) или за 5 часов (длительная инкубация) перед сбором микоплазменных клеток центрифугированием. В качестве вторых антител применяли свиные антитела против мышиных иммуноглобулинов, конъюгированные с Флуоресцеинизотиоцианатом. Клетки Фиксировали Формалином. Материал, помещенный на предметные стекла, изучали и фотографировали при помощи микроскопа opton icm-405.

Приготовление микоплазм для электронной микроскопии Клетки ахолеплазм, предварительно обработанные в культуре антителами, как описано в предыдущем разделе, подготавливали к электронному микроскопированию, как описано В (Korolev et al.. 1994). Процедуры иммуноэлектронной микроскопии (преимбединг) осуществляли, как описано в той же работе.

ГельэлектроФорез в присутствии sds. ЭлектроФоретиче ское разделение образцов осуществляли по методу Лэмли (Laemmii. 1970) в 4% концентрирующем и 12,Ъ% разделяющем полиакриламидных гелях.

После проведения электрофореза гель окрашивали ccomassie Blue R-250. Молекулярные массы определяли по электроФоретической подвижности белковых маркеров молекулярных весов.

Иммуноблоттинг. Электроперенос с ПААГ на нитроцеллюлозные Фильтры проводили по стандартной методике (То«ып. 1979). в качестве первых антител использовали асцигную жидкость. Применяли вторые антитела, конъюгированные с пероксидазой хрена и З.З'-диаминобензидан в качестве хромогена.

Фазовое Фракционирование Тритоном Х-114. Фракционирование Тритоном Х-114 клеточных ЛИЗЭТОВ A. laidlawii а осуществляли по процедуре, адаптированной к микоплазмам, как описано детально в

(Bricker et ai., 1988). По ОКОНЧЭНИИ фраКЦИОНИрОВаНИЯ

ТХ-содержащую и водную Фракцию анализировали иммуноблоттингом.

Обработка протеазами. Обработка суспензий клеток a. laidiawn А протеиназоа К (ПК) осуществлялась, как описано в (Hitchcock et ai.. i983). Переваривание трипсином суспензий тех же клеток осуществляли, как описано б (Wis& et al.. 1993). Обработанный первым или вторым методами материал использовали для анализа методами гвльэлектрофореза и иммуноблоттингом.

Обработка переиодатом натрия. Данная процедура была применена для определения присутствия в зпитопах углеводного компонента. Раствор NaJo^ добавляли к суспензии микоплазм до концентрации 5 мМ. После 1 часа инкубации при комнатной температур© к образцам добавляли равный объем электрофоретического буфера для нанесения проб и разделяли с

ПОМОЩЬЮ sds-page.

Конкурентная eusa для идентификации углеводного компонента зпитопа МКЛ AL4-1• В качестве антигена использовали клетки a. ictidiawi i а. Перед добавлением МКА в лунки вносили растворы лектинов либо растворы углеводов. Далее elisa проводили, как описано выше. Использованные лекгины, а также их углеводная специфичность представлены в таблице 1. Экстракция горячим Фенолом. Использовали методику экстракции горячим Фенолом, применяемую для получения ЛПС из бактерий (inzana, 1983. ). Полученный материал ресуспензировали в однократном sds-page буфере для нанесения проб и использовали для дальнейшего анализа.

Табл.1. Лектины, использованные в работе и их углеводная, специфичность.

Источники получения лектинов Углеводная специфичность

\.Arac M 5 д-Д-галактоза

Z.Fhyt&lacca americana (Д-гзлактозо nac )3

'3.Ftílotti plumasa а-Д-галактоза

4.Pha^olus vulлаг i 5 олигосахариды

5.Dol iche* Ы / Lor us с-Д-галактозо nac

Q.Сc-naval i а (КОНКЭНЭВаЛИН А) манноза, глюкоза

7. Ricinus communus с-галактозо nac , /î-Д-галактоза

Q.Trilicum vulgaris (Д-ГЛЮК030 NAC)3

' Окраска бромистым этидием. Окраску бромистым зтидием (ЭтБр), предложенную недавно как один из возможных способов обнаружения бактериальных ЛПС в полиакриламидном геле осуществляли, как описано в (Kido et ai. . i9so) с небольшими модификациями. Суспензию ахолеплазм (1 мг белка на мл) обрабатывали ДНказоя i (50 мкг в мл) при 37°С в течение 1 часа и затем ПК, как описано выше. После разделения материала с помощью sds-page, гель помещали на 5 мин в раствор, содержащий 5 мкг в мл ЭтБр. Затем гель отмывали дистиллированной водой 30 мин при мягком качании и смотрели на трансиллюминаторе.

Окраска серебром. Процедуру окраски геля после sds-page осуществляли раствором AgN03, как описано в (Morrisey. J. Н. . 1981) с небольшими модификациями.

Окраска алшановым голубым. Процедуру окраски геля после sds-page раствором алцианового голубого, красителя, специфически выявляющего углеводы, осуществляли, как описано В (Cowman etal..

1984).

Анализ микоплззменных колоний иммуноблотом. Антигенную вариэбилъность колоний по экспрессии антигенов определяли, как

ОПИСаНО В (Rosengarten et al. , 1991). ДЛЯ ДвТеКЦИИ ЭКСПрвССШ

антигенов делали реплики колоний A.iaidiavn а на нитроцеллгалозные Фильтры и обрабатывали антителами как при

иммуноблоттинге. Экспрессию антигена выявляли, сравнивая колонии на чашке с соответствующим сигналом на нитроцеллюлозном Фильтре.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 1. Тестирование панели гибридом позволило обнаружить обшевидовые и штаммоспешфические эпитопы поверхностных антигенов

A. laidlaui i,

Панель MRA против поверхностных антигенов л. laidiawii а была получена иммунизацией мышей целыми клетками. Антитела от 50 гибридом были тестированы при помощи f.lisa на клетках других ВИДОВ микоплазм, включая М. hominis Н34. H. argin im Riß. M. gall i sept 1С um а508э. В рвЗуЛЬТаТб ТвСТЩЮБЗНИЯ бЫЛИ ОТОбрЗНЫ гибридомы, специфичные к A.iaidiawn без перекрестного реагирования с поверхностными антигенами других микоплазм. Две гибридомы, продуцировавшие MRA al.4.i и al3. в, мы использовали в дальнейшей работе. Результаты перекрестного тестирования этих антител иммуноферментным анализом представлены в таблице 2.

Табл.2.( Тестирование межвидовой специфичности MRA ali.i и als. в с

помощью elisa.

A.laidlawii И. fxom. int S M. arginini H. gal Ii sept.

МКА al3. 8 + - - -

МКА al4. 1 + - - -

••_« и обозначают, соответственно, отсутствие или наличие сигнала.

Тестирование специфичности МКА на нескольких штаммах а. 1а1шашс i <табл.3) показало различие этих антител. МКА ¿¡-4.' реагировали только с антигенами л.са(с/1аии штаммов а и а» и не взаимодействовали с поверхностными антигенами а. iatdiau.ii в, б-ю и р, что позволило сделать вывод о наличии эпитопнои вариабильности между этими штаммами (табл.3).

ТабЛ.З. ТССТИрОВЗНИР СПСЦИФИЧНОСТИ МКА AL4.1 и AL? В С ПОМОЩЬЮ гил\ на различных штаммах a. tatdtavi t.

А Av в 5-40 f

мка al3. в 4 + 4 4 4

мка al4. 1 + + - - -

и обозначают, соответственно, отсутствие или наличие сигнала.

МКЛ als. 8 при тестировании были специфичны для всох исследованных штаммов ахолеплазмы. Использование п качестве антигена клеток v»ro, контамииированных различными штаммами A. lmdluui i , подтвердило споцифичность мка al4. 1 исключительно к штаммам а и av и наличие эпитопа als. о во всех тестированных штаммах. Эти результаты делают возможным использование МКА аьз. в для вилоспецифического тестирования ахолеплазменной контаминации клеточных культур.

При анализе принадлежности МКА к классам иммуноглобулинов было обнаружено, ЧТО AL4. I ОТНОСЯТСЯ К IgM, a ALS. 8 - К IgG2».

?,. Эщтопы al4. i и als. 8 локализованы на разных поверхностных анлигошх..

Начальный этап исследовании локализации антигенов al4. i и al:?, й проводили с помошда непрямой иммунофлюоросданиии на клетках л. laidiauñí а. оба МКЛ взаимодействуют с антигенами, имеющими поверхностную локализацию, так как они связываются с живыми, нефиксированными клетками ахоло плазмы. После обработки

a.laidlawii а ЭНТИТеЛаМИ al4.1 В ТОЧвНИв ОДНОГО ЧЭСЭ КЛвТКИ остаются одиночными или оказываются собранными в небольшие группы. Вокруг одиночных клеток видно круговое свечение. Инкубация культуры A. laidlawii а С МКА al4. 1 В ТвЧвНШ ПЯТИ ЧЗСОВ приводит к агглютинации клеток. Фактически все ахолеплазменные частицы оказываются собранными в агрегаты. Одиночные клетки встречаются редко. Исследование этого же материала при помощи Фазово-контрастного микроскопа показало плотный характер упаковки

микоплазменных частиц в агрегатах. Контрольные эксперименты, имевшие целю определить участие в процессе агглютинации вторых (конъюгированных с Флуоресцеинизотиоцианатом) антител осуществляли. окрашивая клетки интеркалирующим красителем

(Hoechst Н-ЗЭ258). П0СЛ8 ПЯТИ ЧЗСОВ ИНКубЭЦИИ С МКА AL4. 1 КЛ6ТКИ

ахолеплазмы образовывали агрегаты. Эти опыты подтвердили Факт агглютинации клеток a. laidiawа а антителами al.4.1 и пассивную роль вторых антител в этом процессе.

МКА al3.e также имеют поверхностную специфичность, так как они взаимодействуют с живыми клетками A.iaidiawn а. Характер окрашивания отдельных ахолеплазменных частиц в этом случае иной: одиночные клетки видны, как светящиеся точки. Длительное культивирование ахолеплазмы с МКА als. в не приводат к агглютинации клеток и изменению характера их окрашивания.

Агглютинацию ахолеплазменных клеток МКА al4.1 и отсутствие таковой при обработке МКА аьз. в можно объяснить различиями в природе антигенов вероятнее, чем принадлежностью антител к разным классам иммуноглобулинов, так как иммуноглобулины класса igeaa также способны агглютинировать микоплазменные клетки.

3. Антиген al4. 1 является компонентом обнаруженной капсулоподобной структуры A. laidlaui 1 .

Последующие исследования локализации антигенов al4.i и al-з. в осуществляли с помощью электронной микроскопии. После одночасовой инкубации культуры А. laidlavii А С МКА al4. 1 бЫЛИ ВИДНЫ ОДИНОЧНЫ6 клетки, окруженные только клеточной мембраной. После инкубации с этими же антителами в течение пяти часов большинство клеток агглютинирует в крупные агрегаты. Клетки в этих агрегатах поверх клеточной мембраны покрыты электронноплотным материалом. Толщина этого слоя между соседними клетками составляет от 30 до 50 нм. Этот слой выглядит так же, как капсула у ряда других микоплазм

(Rosenbusch & Minion, 1ÖÖ2). КЭПСУЛЬНЫЙ МЗТврИЭЛ СОХрЭНЯвТСЯ В

основном в местах межклеточных контактов, в то время как внешние поверхности агрегатов покрыты лишь остатками материала или но покрыты им вообще. Редко встречающиеся среди агрегатов одиночные клетки покрыты лишь остатками капсулы.

Неравномерность распределения капсулы нельзя объяснигь ее перераспределением под действием антител, так как при иммунофлюоресцентномя микроскопировании после обработки теми же

МКА видно равномерное положение антигена вокруг одиночных клеток и на поверхностях клеточных агрегатов. Сопоставление этих данных свидетельствует о том, что наружная часть капсулы отмывается во время электронномикроскопических Фиксаций.

Сохранение капсульного материала после обработки клеток МКА А1_4.1 можно объяснить двояко. С одной стороны, клетки ахолеплазмы агглютинируют под действием поливалентного лигандэ и внутри агрегатов слабоприкрепленнын капсульный материал но отмывается во время подготовки образцов к электронной микроскопии. С другой стороны, стабилизацию капсулы может вызывать образование комплекса антиген-антитело, как это описано в аналогичных случаях для бактерий (кг опеке е1 ¿1.. 1990). Возможно, что обе причины вызывают стабилизацию капсулы, однако первая кажется более вероятной, если учесть преимущественное сохранение капсульного материала внутри и почти полное его отсутствие на поверхности агрегатов и одиночных клеток ь противоположность инкапсулированности одиночных клеток бактерии после аналогичных Процедур (кгопеке ей ¿1 . . 1990).

Клетки Л. 1а1<На»1 I А ПОСЛО ОЙрзбОТКИ МКА А1.Э. в в ТвЧОШЛв одного и пяти часов ьыглядят так же, как и поело одною часа обработки аЦ4.1. В обоих случаях видны одиночные метки, покрытые мембраной без какого-либо экстрамембранного слоя.

Специфичность МКА А1.4.1 к капсульнпму материалу определяли методом иммуноэлектроннои микроскопии. После инкубирования клеток А.1а1с11сшч А С МКА АЫ. 1 ИЛИ А!.:*. 8Б ТОЧеНИв ПЯТИ ЧЭСОБ, К НИМ добавляли вторые антитела, кон йотированные с коллоидным золотом (диаметр частиц 10 нм). После обработки МКА аь4. 1 частицы золота были видны в слое злектронноплотного капсульного материала на некотором расстоянии от клеточной мембраны. Характер распределения капсульного материала в этих опытах был аналогичен таковому в отсутствие вторых антител, что подтверждает ключевую роль МКА Д1-.4.1 в процоссе стабилизации капсулы. Метка распределена равномерно по поверхности капсулы, однако она почти отсутствует во внутренних областях клеточных агрегатов несмотря нэ преимущественное сохранение капсульного материала в этих областях. Возможно, проникновению антител, конъюгириванных с коллоидным золотом, внутрь агрегатов мошает большая плотность капсульного материала.

ЧЗСТИШ золота ПОСЛО обработки ICieTCK л. fmJIciuu I А МКЛ л1..Э. в были локализованы на мембране и распределены по пе поверхности, что является свидетельством мембранной локализации соответствующего антигена.

4. ИМмуиохимичеукии знализ эщжыш ai.4. 1 щямяет шмзш ЛИПШ5Ю.ГО и угле вещного компонентов в этрй молекуле._

Последующие исследования антигена ai.4.i были направлены на установление его химического состава. При анализе методом иммуноблоттинт 3 с MRA al4.1 клсточкых лизэт0в А. laidlawii а после разделения в 4% концентрирующем и разделяющем sds-fage были

выявлены множественные полосы, распределенные в виде лестницы <рис.1. ?). Общее количество зон превышало 30, верхняя находилась в стартовой области разделяющего геля, з нижняя в зависимости от условий эксперемента (и, по-видимому, небольших различии в количестве материала) на уровне от 10 до .':Г> кДа. Расстояние между отдельными полосами было одинаково по всей длине лестницы и соответствовало 3, Ь кЛа по белковой шкале. Интенсивность окрашивания отдельных полис уменьшалась от старта к основанию геля, что указывает на уменьшение количества AL4.1 эпитопов в этом направлении. Лестница также выявлялась на иммуноблоте с клеточными лизатями л. i«ti а.-. Характер сигнала (количество отдельных зон, их pnerrus деление. расстояние между ними и местоположение верхних и нижних тлос) полностью соответствовал таковому при анализе клеточных лизатов л. ioijioh» а.

Отсутствие эпитопз к мк\ al.-l. 1 у итамма А. Imc/tav ii f>, показанное при тестировании с помощью пл . подтверждает данные иммуноблоггингз. Несмотря на сходство пептидных компонентов у штаммов а и в (рис.1, ' ■ .'), лы i антиген отсутствует у последнего' (рис. 1, -О. Эгогтоп al-i. 1 также отсутствует у штаммов s-40 и г. Антиген к МКА al3. в, обнаруженный методом Elisa у всех тестированных штаммов л. iaidia»n, выявляется на иммуноблоте клеточных лизатов штаммов а и в в виде одной зоны приблизительно 60 кДз (рис.3, г..е.). Полоса на таком же уровне обнаружена при анализе штаммов av.s-4o и f.

)

kDa 94 67

43 30

20 14

Рис.1. sds-page И иммуноблот КЛетОЧНЫХ ЛИЗЭГОВ Л luiUiLtwi i . Клеточные лизаты штаммов а (А) и в (b) разделяли sds-page и анализировали иммуноблотом с МКА al.4 i (дорожки -'.-о и МКА al.s.8 (дорожки s.fi) или окрашивали cocimbsi е ы uc £-£50 (дорожки ¡.г). Дорожка м - белковые маркеры молекулярных весов.

Целью следующего этапа анализа природы антигенов ai.4.i al .v в было выяснение наличия в этих молекулах белкового компонента. Клеточные лизаты a. taidtuvi t а обрабатывали протеинэзои К (ПК) или трипсином, как описан;: б раздело "Материалы и метода" и. после разделения в sds-раое.. анализировали иммуноблотом с МКА AL4.1 или al3. 8. Контроль эффективности обработки протеэзэми осуществлялся путем окрашивания образцов после sos-расе Cuohüííió ыие r-250. Отсутствие пепгидных зон. окрашиваемых .у клеточных лизатов в норме, было подтверждением эффективности де ¡троте инизэции.

Обработка ПК не приводила к изменению лестничного сигнала на иммуноблоте с МКА AL4.i ни по интенсивности окрашивания, ни по характеру расположения зон. Те же результаты были получены при

ABA В А В

М 1 2 3 4 5 6

обработке клеточных лиззтов трипсином. Из основании этих данных был сделан вывод о небелковой природе эгатопз AL4.1 и всей молекулы этого антигена.

Имм.уноблот- Анализ с МКА al?. r обработанного протеиназами материала не обнаруживал сигнала, что является доказательством полипептидной ггрироды соответствующего антигена.

Анализ пщроФильности-гидроФобности антигенов осуществляли Фракционированием клеточных лиззтов Тритоном Х-114 (ТХ) с последующим разделением материала на sds- газе и имм.уноблотом с соответствующими антителами. Контроль Фракционирования осуществляли, окрашивая образцы после sds-pagf. Coomassie blue р-гт-о. При этом наблюдали неравномерное распределение материала между ТХ-содержащей и водной Фракциями. Антиген al4.i полностью распределялся в ГХ-Фракцию, сохраняя лестничный характер сигнала на иммуноблоте, что является свидетельством ого гидрофобной природы. ГилроФобность антигена al4.i является, по-видимому, следствием липидной модификации этой молекулы.

Одним из способов доказательства углеводной природы эпитопов является обработка материала перойодэтом натрия которая, модифицируя углеводные остатки, изменяет характер взаимодействия между антигеном и антителом. Иммуноблот-знзлиз с МКА al4. 1 клеточных лизатов A.i.nciiab i .• а, предварительно обработанных раствором шрешдатз натрия, обнаруживал отсутствие эпитопов связывания с антителами. Аналогичная процедура обработки клеточных лиззтов с последующим иммуноблот-знализом с МКА als. е не изменяла характера взаимодействия соответствующего антигена с антителами. ;гги данные полтвертдют различие между ai.4. i и диз. 8 антигенами и демонстрирует присутствие углеводного компонента в Ai.4.1 эпитопе.

После обнаружения кэрбогидратной природы al4. 1 эгштопа были проведены эксперименты по определению конкретного углеводного состава этой части молекулы. Сумма данных о липил-модиФицированности антигена и наличии углеводной части в эпитопе AL4.1 позволяет считать эту молекулу липогликаном. Ранее у a. luic/iawc i было показано наличие липогликэнов, карбогидратная часть которых состоит из глюкозы, маннозы, Фукозамина и 2-амино-6-дезоксиглюкозы в соотношении 66: 1: 14: 7 (Smith, 1992). Исходя га этих данных мы проверили наличие вышеупомянутых

сахаров в составе А1.4.1 эпитопэ. Для этого проводили конкурентную Е1лг.А с лектинами - белками растительного или животного происхождения, каждьш из которых, в зависимости от источника получения, обладает высокой специфичностью связывания определенной группы углеводов.

Оптическая плотность (4 92 нм)

— , г -*- i » 5 6 7 8

Рис.2. Конкурентная Elisa (мк.а ala.i и лектины) на клетках л. laidiawii а. На оси X концентрации лектинов (мг в мл). На оси У - оптическая плотность <492 нм). Порядковые номера соответствуют номерам лектинов в табл.1.

Использованные лектины, а также углеводы, специфически взаимодействующие с каждым из них, представлены в тзблице 1. Ни один из восьми лектинов не ингибировал связывания МКА ai.4.i с клетками л. laidiaun (рис.2). Напротив, конканэвалин А и лектин из rnt¿сum vulgaris вызывали увеличение сигнала (рис.й).

Изменения в активности антител можно также оценить конкурентной elisa с углеводами. Были тестированы следующие сахара: глюкоза, манноза, Фукозэ, метил-^-о-мэннонираноза, n-ацотил-г'-глюкозамин. галактоза, Фруктоза, лэктоза, зрабинозэ. Первые пять углеводов (или их аналоги) присутствуют в молокуле

липогликанз, описанного у л. fm .-¡„ч s (г«,-.'л,. гээг). Галактоза была выбрана в связи с частой встречаемостью в составе углеводной части липог.тлканог» микоплэзч (s™ <. 1 •"••'•<•-). При проведении ил г-,\ уроиень сигнала с растворами уг.леь\дов был равен контрольному.

Результаты конкурентного ингибирсвания лектинзми и углеводами взаимодействия VKA al4. i с соответствующим антигеном, полученные метилом ei. гол, убедительно демс.нотрирукгг отсутствие углеводов, специфичных к использованным нами лектинэм, э также тестированных углеводов в эпитопе ai.4. i . отсутствие в эпигоне антигена al4. i всех углеводов, входяаих ь состав липогликанов л. luftutvi I , указывает на различия этих молекул.

Для установления причины повышения сигнала на elisa при тестировании некоторых лективов была проведена elisa без добавления МКЛ. В этом случае конкэнэвзлин А и лектин из гппсш nut ¡fir t * также вызывали повышение сигнала. Добавление остальных шести тестированных лектинов не выявляло изменения сигнала по сравнению с контрольным. Проверку специфичности взаимодействия конканзвзлинэ А с л. I проводили методом иммуноблоттинга,

используя раствор этого лектин э вместо МКА. Конканавалин А взаимодействовал в иммуноблотр с большим количеством разноразмерных молекул. Сходная картина наблюдалась при анализе клеточных лизатов a. Nno'Mw > а и в, однако характер распределения бандов в обоих случаях был не лестничный. Обработка клеточных лизатов ПК полностью элиминирует сигнал.

Па основании этих данных можно сделать вывод, что конкэнавалии А (и, по-вилимому, лектин из Vriticum vulgaris) взаимодействует с углеводами, расположенными преимущественно на полипептидных молекулах. Отсутствие лестничного сигнала на иммуноблоте клеточных лизатов (обработанных и не обработанных ПК) с конканавалином А, имеющим специфичность к маннозо и глюкозе, позволяет говорить об отсутствии этих углеводов в составе al4.i антигена.

5. Антиген al4.i является ЛПС-подобной молекулой.

Лестница, выявляемая на иммуноблотте, сходна с таковой у бактериальных ЛПС (sidberry.H..1985). Бактериальные УШС обычно получают обработкой клеток ПК или экстракцией горячим Фенолом. Обработка клеток л. i л •;.'!<■: vi i а ПК с последующим иммуноблотом с МКА AL4.1 выявляет лестницу. Экстракция горячим Фенолом с

последующим иммуноблотом приводит к тому же результату. Лестница, выявляемая на иммуноблоте выделенного этим способом материала, аналогична сигналу при анализе обработанных ПК и необработанных клеточных лизатов.

Окраску бактериальных ЛПС в геле поело злвктрофорозз осуществляют несколькими способами. Наиболее часто используемым •окраска солями серебра. Кроме того, применяют окраску специфическими красителями на углеводы, и в том число -алциэноБым синим. Недавно был предложен еще спин метод окраски ЛИС бромистым атидием (ЭтКр) я. . юл-»), все три

перечисленных метода были использованы нами при окрзшиьзнии клеточных лизатов л. 1. 1.1 качестве контроля использовали

коммерческие препараты бактериальных ЛШ.

Наиболее успешным г> нашем случае йьдо окрашивание ЭгПр. Клеточные лизаты а. 1 л и ь оорабчпдош ДМкчзои и ПК.

'!-;>сле окраски геля СП ¡¡и било видно, чти сходный лестничныи сигнал имеются у обоих итзммов. ¡шкгге с тем имекггеи различии б расстоянии между отдельными зонами: у штамма л это расстояние больше, чем у штамма в. Лестница, выявляемая 1фи окрашивании ЭтБр у штамма а, аналогична такоьои, ьыньляомиИ ь иммуноблоте с МКЛ 1. Лестничный сигнал виден у обоих штаммов и при окрашивании теля алцизновым синим, но наблюдался ьксикии уровень фонового окрашивания. При окрашивании солями соросра отдельные ступени лестницы сливались друг с другим, что сильно затрудняла интерпретации результатов.

Наличие лестничного сигнала на иммуиг-блкге и при окраске материала л. .'.пои«**! ( л ь геле яо-видимому отражает различия в уровне полимеризации углеводных павтироь, кш это показано для ЛПС 1У87). в случае последних степень полимеризации,

соответствующая количеству видимых ь лестнице зон, может варьировать от О до ■Ю, ш этом на поверхности одной бактериальной клетки представлены молекулы с разным числом углеводных повторо в.

Итак, входящим в состав капсулы ¡идобнои структуры л. ;шЛашЧ а антиген ¿1-1.1: I. Является небелковой молекулой; п. липидмодифицирюван; 1:1. Содержит углевидный компонент;

iv. отличается по углеводному составу от липогликанов, описанных ране у этой эхолеплэзмы;

v. Виден как лестница на иммуноблоте и при окрашивании красителями, применяемыми для выявления бактериальных ЛПС в геле. Эти данные позволяет сметать, что антиген дЬ4.1 является ЛПС-подобнои молекулой. Таким образом, в состав капсулы а. гшсЛаши а входят ЛПС-подобные молекулы.

6. Межштаммовая и Бнутри1!хаммпвая вариабельность ли«. 1 антигена..

Лестничный сигнал, выявляемый на икмукоблоте, является одной из спетч'ических особенностей варизбильных поверхностных антигенов у некоторых видов микоглззм (суь^д.к. , юто. ). Эти антигены обладают моашггаммрвой и внутриштаммовои вариабельностью. Частота ьн.утрттаммовой варичбильности в экспрессии поверхностных антигенов, часто кореллируюшио с и?ленением морФотипэ колонии (напшмер, от непрозрачного к прозрачному) могут быть от 10"4 до

• У ' о

И) " и в некоторых случаях доостигать 2x10 " на клетку на поколение (»')-« «ч ¿1.. 1эу2). Для некоторых бактерий к подобному высокому уровню приближается частота возникновения неинкапсулированных клеток, образующих прозрачные колонии в ОТЛИЧИе ОТ ИНКаНСуЛИрОВаННЫХ и ПрОЗраЧНЫХ («п^ьь е1 . , 1990). Чтобы оценить уровень этом вариабильности для аь4. 1 антигена, клетки культуры а. 1аклаь/ч а клонировали и индивидуальные колонии тестировали на наличие экспрессии антигена аь4. 1, делая с них отпечатки на нитроцеллюлозный Фильтр и сравнивая сигналы иммуноблота с соответствующими колониями на чашках. Этим способом было исследовано 5 х 10е колоний и все они экспрессировали а1.4.1 антиген. Изучение морфологических различий такого же числа колонии не обнаружило измененных Фенотипов. Анализ пятнадцати

ПОЛУЧеННЫХ ИЗ ОТДеЛЬНЫХ КОЛОНИЙ СУ б ЛИНИЙ а. laidiau.lt А

иммуноблотом ■ с А1_4.1 выявлял наличие лестничного сигнала, идентичного лестнице родительского штамма. Низкая частота внутриштаммовои вариабильности в экспрессии аь4.1 антигена может быть объяснена различиями в генетических механизмах, контролирующих изменчивость капсульных структур у а. 1а1сиамч I и изменчивость вэриэбильных антигенов у некоторых других микоплазм. Другое возможное объяснение - консервативность конкретного а!_4. 1 эпитопэ в ЛПС-подобнои молекуле.

Антиген, выявляемый на иммуноблотте с МКА аЬ4.1 обладает межштаммовои вариабильностью. Из пяти исследованных штаммов А. 1а1сНаъ/1 I два ЭКСПреССИруЮТ а1-4.1 эпитоп, а три - нет. ЛПС-подобная молекулы зкспрессирукггся штаммами айв, но размер углеводных повторов у этих молекул разный. Расстояние между лестничными зонами у штамма в меньше, чем у а, что, по-видимому,' отражает различия в составе углеводных повторов. В пользу этого предположения свидетельствует и факт отсутствия эпитопэ А1.4.1 у штамма в. Возможно, ЛПС-подобные молекулы Формируют капсульную структуру и у клеток штамма в. Не исключено, что наличие экстрамембранного слон является общим свойством многих микоплазм, однако для подтверждения этого предположения необход/мы специфичные антитела.

ВЫВОДЫ

1. Клетки a. laidiavii а кроме лимитирующей мембраны окружены капсулой. Эта структура обнаружена электронномикроскопически после обработки клеток поверхноспюслешФичоскими моноклоналъными антителами.

2. В состав капсулы миколлэзмы A^h^U-f-laitua laidlaioLi входят ■ЛПС-подобные молекулы. Липополисахаридная природа капсульного материала выявлена иммунохимичоски и с помощью методов, используемых для идентификации бактериальных ЛИС.

3. ЛПС-подобные молекулы вариэбильны среди штаммов

A. Laidl au»L i .

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛЖОВАНШХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Фридлянская.И.И., А.М.Ишов, Ф.М.Летучая, Я.Ю.Комиссарчик, М.С.Брудная, Т.Н.Ефремова, С. Н.Борхсениус. 1G9-1. Обнаружение капсулы у МИКОЛЛЭЗМЫ Acholef-los»<a lai,Jiuwi i . ДОКЛЭДЫ РОССИЙСКОЙ Академии Наук, т.334, стр.375-377.

2. Калачиков,С.М., Г.М.Дымшиц, ф.э.Кель, А.М.Ишов, С.Н.Борхсениус. 19У4. Клонирование у ши>е реальных зондов для выявления микоплазменных заражении клеточных культур. Молекулярная биология, т.28 стр.444-4b;;.

i"1,. г11 ЧГ,Г.1 I , Г ..I. A- M. I vhov.

Г. N. fíi-r. h- "Ill IR. Г'1'1 -n ;! ,4o". '.iî-vï '■-:•.■!!■ Ii/'i : i r,t f

ilri-p í i V --• -il! 1|.-» i!r •?> I I и. !• r **< í hvl .'.O ll'-.M- l ■ :.Л1 П» 1 l " íj V t '. hf

i-urf .i'.e ^ i: i. i i*-. I 11 : ¡OH líM.r I Thor, i -.'»г. i'I 'Л i h I ni er п.«' i '"-пд i .V.rujr •»-, т <--t 'he ТОМ.

i. Фоиллянскап.и.и., А.М.йшсв. I.H.Et-роупва, С.Н.Борхеениус.

W.Ü.. ОбЧеКШеНИС Ч.ЗСТИ:Х МИКОПЛЗЗМ!» latdlavt t PC- V И

шарообразные структуры, индуцированное мсниклоняльными антителами к поверхностному антигену этой мик^агззма. Тезисы совещания "Пи(>.:угия ¡слетки в культуре" Глтилогия. ;'■■!: '.'.-1.