Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Обмен пуриновых и пиримидиновых нуклеотидов в тканях птицы

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Обмен пуриновых и пиримидиновых нуклеотидов в тканях птицы"

всесоюзный научно-исслвдватешжий институт физиологии. еиохю1ии и питания сельскохозяйственных швотных

ггг

/у £>

На правах рукописи КОКУНИН Василий Андреевич

удк 577.123.3

овлен пшиовых и тшаддинсвых нуклеотидсв В тканях птиц

03.00.04 - сшохимия

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

¿^ г!. // &

Боровок - 1988

Работа выполнена в ордена Трудового Красного Знамени Инотитуте биохимии им. А.В.Палладина Академии наук Укра-инокой ССР.

Официальные оппоненты: академик АН'УССР, доктор биологических наук, профессор МАЦУКА Г.Х.,

доктор биологических наук, профессор МАЛАХОВ А.Г.р

доктор биологических наук, профессор ЧЕЧЕТКИН A.B.

Ведущая организация: Украинский научно-исследовательский

институт физиологии и биохимии сельскохозяйственна/; животных.

Защита диссертации состоится н_"_198_г.

в___ чао. на заседании специализированного совета

Д 020.17.01 при Всесоюзном научно-исследовательском институте физиологии, биохимии и питания сельскохозяйственных животных по адресу: 249010, Боровск Калужской области, ВШШБиП сельскохозяйственных животных.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке института«

Автореферат разослан "_"_198_г.

Ученый секретарь специализированного совета

ДУДИН В.И.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТШ РАБОТЫ

Актуальность проблемы. В связи с интенсивный развитием биохимии, молекулярной биологии и генетики увеличивается интерес исследователей к нуклеотидам и их производимы, которые, как известно, выполняют в клетке целый ряд важнейших метаболических функций. С одной стороны, это материал для построения высокопшшмерных молекул нуклеиновых кислот, а таюке низкомолекулярных соединений типа b'ad, fad, КоА, а с другой, они участвуют в ферментативных реакциях как субстраты, кофакторы, аллостерические эффекторы и источники энергии. Кроме того, им присуща функция посредников гормонального и медиаторного сигнала.

Образование внутриклеточного фонда нуклеотидов осуществляется путем синтеза d« novo , а такхе по "запасному" пути. Большинство организмов не нуждается в поступлении экзогенных нуклеотидов , так как они могут синтезировать их de novo . Вместе с тем не все ткани многоклеточных используют этот.путь. У некоторых из них более выражена способность к реутилизации готовых азотистых оснований. Тем не менее, в литературе крайне мало сведений о внутриклеточных механизмах, управляющих распределением вновь синтезированных нуклеотидов для выполнения той или иной конкретной функции. Четко не определена роль реутилизационных процессов, как детерминантов скорости синтеза нуклеотидов de novo . Мало внимания уделено тканевым и видовым различиям-во внутриклеточной регуляции обмена нуклеотидов.

Особый интерес представляот исследования обмена нуклеотидов в различных тканях птиц. Отсутствие у них цикла мочевины существенно отразилось на функционировании ключевых метаболических реакций и, в частности, на обмене аминокислот, пуриновых и пирими-циновых нуклеотидов. Несмотря на то, что биосинтез пуринов de novo впервые был изучен у голубя, до сих пор детально не исследованы механизмы регуляции этого сложного процесса, который не только обеспечивает организм птиц пуршшуклеотидами,но и является основным путем удаления избыточшх форм аминного азота в виде синтезируемой мочевой кислоты.

Научная информация о путях обмена нуклеотидов в тканях представляет не только теоретический интерес, но может быть полезна при разработке научно обоснованных рационов кормления сельскохозяйственных животных, питания людей, а также поиска фармакологических средств для устранения различных патологических нарушений.

Список coKpaü¡eui!ü: л;.?, АЕР , AIT - адекозшшоно-, да--и трифос-фаты; cm5, GDP, ¿TP - гуааозинмоно-,.ди- и трк|ссфаты; шр,

UDP, игр - уридшшоно-, íxí:- п три^ссфаты; CUР, сдр , СТР - ци-твдиныоно-, ди- и тр;:.,. саСати, I1.1P - ¡шозшмоноТосфат; Х1.Р - ксан-тозиныоаск*осфат; АР. - амваозин; аа - гуаиозин; иа - уридин; СЕ _ ццтидац; ilî - ксаптозин; IP. - инозин; А - адонин, g -гуанин, С - цитозин, X - ксантин, H г гипоксантин; А!.Р- s - адо-нилосукцинат; КРФ - кислсторастворш.шя йракция.

Цель и задняя работы. Основная цель настоящей работы заключалась в изучении внутриклеточной организации метаболических потоков пуриновых и пиришдинсвых нуклеотидов, синтезируемых по альтернативный путям - de novo и "запасному", а та ¡cíe в определении рола реутшшзащоцных процессов в обеспечении нуклеотидами различных в функциональной отношении тканей цыплят.

Конкретные задачи работы:

1. Определить способность тканей к автономному синтезу нук-леотидов ¿в novo в утилизации готовых азотистых основании и оценить вклад альтернативных путей в обеспечении внутриклеточных процессов нуклеотидами.

2. Определить активности ферментов анаболизма и катаболизма пуриновых и пиримидиновых нуклеотидов и проанализировать корреляционные связи ме.'гду уровнями ферментативной активности и распределением метки низкоиолекулярных предшественников среди нуклео-тидных компонентов.

3. Изучить последовательности реакций, определяющих циклические превращения пуринов и выяснить их роль в осуществлении двух функционально различных процессов - удаление аминного азота и собственно синтеза пуриновых нуклеотидов.

4. В опытах vivo проанализировать кинетику включения '^С-оротовой кислоты в свободные пириыидиновые нуклеотиды и пири-ииданы РНК и изучить потоки ее превращения.

5. Изучить скорости синтеза РНК в различных тканях в зависимости от интенсивности внутриклеточного синтеза нуклеотидов и активности СТР-оинтетазы,

6. Исследовать анаболическую функцию пуриновых и пиримиди-

новых нуклеотидов, оснований в тканях животных в условиях D-ru-повитаминозной экспериментальной модели с целью нормализации минерального обмена и поиска новых антирахитических средств.

Научная новизна. На основании проведенных результатов исследований сформулированы и обоснованы научные положения п области биохимии животных, сущность которых заключается в следующем. Впервые показано, что синтез мочевой кислоты, как конечного продукта экскреции аминного азота, в печени цыплят происходит по гуаниннуклеотидному пути за счет окисления инозинмонофосфата в ксангозинмоноЗюсфат (IMP —AMP —»-(GMP) —ксантин—»-мочевая кислота). Тогда как деградационпый путь (IMP —■«• инозин — гипоксантин —»-ксантин —мочевая кислота) заблокирован па стадии превращения гипоксантила в ксантпн из-за крайне низкой активности ксантиндегвдроганазы и но может обеспечить опчималь-ной скорости удаления аминного азота. Поэтому его следует рассматривать как путь синтеза гипоксантяна, используемого другими тканям для образования пуриннуклеотвдов.

Показана специфическая для тканей роль пуриннуклеозидных циклоп. В печени лноэиновый цикл используется для синтеза гипоксантина, а в селезенке и слизистой тонкого кишечника - для его реутилизации. Для гуанозинового цикла характера деградационная функция. В тканях цыплят и крыс обнаружена мало изученная реакция восстановительного дезамшшрования SMP, определяющая интенсивный процесс взаимопревращения IMP и 0МР. Активность <ЗМР—ре— дуктазы, катализирующей данную реакции, выше в тканях, эффективно использущих роутилизационный путь образования пурипнуклеоти-дов.

Показано, что скорость синтеза FHK прямо коррелирует о уровнем поступления.оротовой кислоты, а также активностью СТР-синте-тазы и обратно - с уровнем митотической активности тканей цыплят. "Запасной" путь, использующий реутилизационные механизмы, более доступен и эффективен в отношении образования фонда нуклеотидов, как предшественников для синтеза РНК.

В ядерной фракции печени и слизистой тонкого кишечника цыплят обнаружена активность СТР-синтетазы, что является новым фактом , свидетельствующим о наличии в ядро локальной системы превращения итРв СТР. На основании экспериментальных данных о включении оротовой кислоты в пиримддиновыа нуклеотидк фонда и РНК

и математического моделирования этого процесса постулируется механизм, согласно которому превращение оротовой кислоты в клетках слизистой гонкого кишечника цыплят происходит по двум разобщенным каналам с образованием локальных фондов нуклеотвдов, обеспечивающих разные метаболические реакции.

Теоретическая и практическая ценность работы. Настоящая работа вносит весомый вклад в развитие существующих представлений об особенностях обмена пуриновых и пиримидиновых нуклеотвдов в тканях урикотелкческих организмов. Новые факты относительно пути удаления белкового азота и важной роли процессов реутилизации в тканях птиц свидетельствуют в пользу существования внутриклеточной компартмвнтализации потоков синтеза и деградации пуринов.

Впервые показаны существенные изменения в обмене пуриновых и пиримвдинових нуклеотидов в различных тканях цыплят и крыс в условиях I) -гиповитаминоза. Полученные результаты являются теоретическим обоснованием для использования предшественников пури-нового и пиримидинового синтеза в качестве компонентов антирахитических препаратов.

Обнаружение нового пути синтеза мочевой кислоты меняет существующее представление о молекулярных механизмах патогенеза широко распространенного заболевания птиц - мочекислого диатеза (подагры) и открывает перспективу совершенствования существующего и разработки новых способов лечения отого заболевания, в первую очередь обусловленных генетическими аномалиями.

Основные положения диссертации породят применение в материалах спецкурсов по биохимии нуклеотидов и нуклеиновых кислот, читаемых на кафедрах биохимии Московской ветеринарной академии, Киевского государственного университета, Украинской сельскохозяйственной академии, Харьковского зооветшютитута.

Апробация работы и публикации.Основные положения диссертационной работы были положены на I Всесоюзном симпозиуме "Роль углекислоты и аммонийного азота в процессах биосинтеза" (Боровск, 1976), Ш (1977), 1У (1982) и У (1987) Украинских биохимических съездах, Всесоюзной конференции "Актуальные проблемы витаминологии" (Москва, 1978), Республиканской научной конференции "Биохимия медицине" (Одесса, 1981), Всесоюзном ооиегднии по уволк.гиюн~ ной физиологии (Ленинград, 1582), У Гсосоизпом оип: ¡т:"н>ском

съезде (Киев,1986), Всесоюзном симпозиуме "Биохимия с/х животных и Продовольственная программа" (Ташкент, 1Э8о). Всего опубликовано 50 работ.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы (3 главы), экспериментальной части (4 главы), заключения, выводов а списка литературы, содержащего 528 наименований. Объем диссертации 363 страницы машинописного текста, 61 таблица, 5 схем и 33 рисунка.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Эксперименты проводили и условиях'in vivo на одномеоячннх цыплятах породы белый леггорн массой 200-300 г, а также на крысах линии "Вистар" массой 140-160 г. Состав диеты зависел от схемы эксперимрнта. Для создания D -гиловитамянозной модели жнвот-ные с однодневного возраста получали рахятогенную диету (Бауман, 1968). В работе использовала различные радиоактивные соединения фирмы "Изотоп" СССР, которые вводили животным перорально, внут-рибршинно и в просвет кишечника, а также коммерческие реактивы, которые в случае необходимости очищали. В качестве объектов исследования использовали: гомогенаты, ядра, растворимую фракции различных тканей, плазму крови, а также изолированную петлю двенадцатиперстной кипки ( Uorriseey,I978). Выделение ядер проводили модифицированным методом (Георгиев, 1971). О чистоте и гомогенности ядерных фракций судили по величине отношений РНК/ДНК и Белок/ДНК (Tata, 1974). Иэгомогейвтов тканей последовательно выделяли нуклеотиды кислотораотворимий фракция (КРФ), РНК я ДНК. Кислоторастворимые нуклеотиды экстрагировали из гомогенвтов Ъ% охлажденной НСЮ4. Из осадка гоыогенатов тканей выделяли нуклеотиды РНК и ДНК путем последовательного гидролиза в щелочной и кислой среде по методу Шмидта и Тангаузера с некоторой модификацией ( Fillaxessity, Кагазек, 1970). Для выделения индивидуальных РНК использовали фанольный метод термического фракционирования ( biaxkov, Arlon, 1973). Нуклеотиды и азотистые основания делили на катионеобменнике Dot;ох 50x4 (Ef-форма), используя ступенчатую элющш ( Joabida, shibata, 1969). Резфоматографию проводили на анионообменнлке Dowsx 1x8 (Kamnen, Hurlbert , 1959). или на бумаге ( Singer, Ledor,l966). Нуклеотидные компонент?

идентифицировала по хроматографической подвижности на ионообменни-ках по сравнению со стандартами, а также по спектрам поглощения в области 200-300 ни (Векстерн, Баев, 1976), а их количество определяли, используя соответствующие коэффициенты молярной экстин-цил (Калинин, 1971). Радиоактивность определяли на счетчике $1-30 в толуольном сшнтилляторе. Концентрацию нуклеотидов (в мкмолях) и суммарную радиоактивность (в имп/мин) относили к I г сырой ткани, удельную радиоактивность (УР) выражали в имп/мин на мкмоль. Количество нуклеиновых кислот определяли прямым спектрофотометри-рованием (Спирин, 1968). Содержание белка определяли по Лоури и соавт. ( Lov.ry at ai», 1951). Скорость включзния нуклеозидфосфа-тов в РНК рассчитывали согласно формуле ( ¿uchor, 3v.afficid,i966)»

j4 = Радиоактивность АТР-РНК (имп/мин) на мг РНК ^ ГД0 0,5» JP АТР-КРФ (имп/мин на мкмоль)

J*. - наноыоди АТР, включившегося в I мг РНК за шш.

Активнооти ферментов обмена пуриновых и пиримидшовых нуклеотидов, щгклеозидов и оснований определяли, в основном, в надоса-дочпой фракции (105 ООО д), в некоторых сериях экспериментов в гомогенатах и ядрах. Об активности судили либо по изменению экс-тинции в ультрафиолетовой области спектра, либо по превращению радиоактивных субстратов, ферментативную активность выражали в наномолях превратившегося субстрата или образовавшегося продукта на I мг белка за I мин.

Для характеристики D-дефицитных состояний в сыворотке крови определяли Ca (Шшшко, Скварук, 1968) и Pj (Taussky, shorr, 1953). В гоыогенате слизистой тонкой кишки определяли калыдайсвя-8ывающий бедок (Wasaerman, Taylor, 1966). О степени минерализации костной ткани судили do рентгенографическому индексу Гуэрило-Винэ (Paoul at al.f 1956).

Экспериментальный материал обработан статистически (Кокунин, 1975). Коэффициент корреляции (Тху) рассчитан по (Лакин, 1973). Дяя определения содержания вещества в системе (ш) и характеристического времен« обмена (ft) попользовали компартментадизационннй анализ (Ыагаршак, Стефанов,1978). Константы скорости поступления радиоактивных'предшественников (К) рассчитывала, используя кинетические модели (Вигпз, 1970s Snyder, Henderson, 1973). Определение численных значений коэффициентов было выполнено по програм-

мв нелинейной'регрессия методом Гауса-Ньютона (Корн, Корн, 1977). Расчет проводили на ЭВМ СОУ -1М с использованием пакета прикладных программ plus/ЮОО фирмы HEï/UâTT РАС КАР О (США).

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ ИЗСЯЕШАНИЯ ■

I. Пути превращения инозинмонофосфата (IMP) в тканях цыплят

Инозинмонофосфат является первый циклическим продуктом пути синтеза пуринов do novo . Его дальнейшее превращение осуществляется по двум потокам синтеза соответственно AÎJP и GiïP t g также по пути деградации, приводящем к образованию мочевой кислоты. В печени птиц превращение IMP в пшсксаятнн н далее в ксантин рассматривают в качестве основного пути синтеза мочевой кислоты (Нарва, Krebs, 1978). Меэду тем, для образования ксантина есть более короткий путь, а именно: катализируемое IMP-дегндрогеназой превращение IMP в ксантозинмонофосфат (ХМР), а последнего в ксантин (схема I). Мы предположили, что этот путь твкхе моявт быть использован в тканях птиц для выведения амлнного азота в виде ночввой кислота.

Судя по активностям 5'-нуклеотидазы и пуриннуклеозипфосфори-лазы (табл. I) мочно предположить, что основная масса IMP превращается преимущественно по деградационноцу пути и лишь незначительная его часть используется для синтеза AMP и œîp . Эксперименты по включению метки интермедиатсв десятистрднйного пути биосинтеза пуринов do novo (I4C -глиция, ^С-формиег, "^-бикарбонат) не противоречат данному предполояеаию, так как к 60 мин после введения изотопа более половины радиоактивности было локализовано в оксипу-ринах. Утот результат свидетельствовал в пользу известной схемы деградации IMP до мочевой аислоты: IMP — инозин -— гидоксантин —— ксантин —мочевая кислота, которая в 1978 году была подтверждена в лаборатории Кребса для изолированных гепатоцитов цыплят. Вместе с тем в схему не укладывались два результата. С одной стороны, интенсивное включение метки в гуаниннуклеотиды КРФ и РНК, что противоречило данным, подученным для тканей млекопитающих ( Shooiioa i't rd., 1985) и, с другой, накопление метки во фракши ги-поксантинл. При определении активности двух вшючгшх Формантов

I П Ш 1У

Схема I. Циклические превращения пуринсвых оснований и их . производных в тканях цыплят,

I - фонд аденинсодержадах соединений КРФ, П - фонд гипо-ксантинсодержащих соединений КРФ, Ш - фонд ксантинсодер-жащих соединений КРФ, 1У - фонд гуанинеодеркащих соединений КРФ, У - фонд мочевой кислоты. А - цикл аденозина, Б - цикл инозина, В - цикл ксантози-на, Г - цикл гуанозина. I - 5'-нуклеотидаза, 2 - пурин* нуклеозндфосфорилаза, 3 - гипоксантия-гуанинфосфорибо-эилтрайсфераза, 4 - ксантиндегидрогеназа, 5 - 17анинде-заминаза, 6 - агр-редуктаза, 7 - аденозиндезаминаза, 8 - АКР-дезаминаза, 9 - аденозинкиназа, 10 - аденинфосфо-рибвзилтрансфераза, II - ксантинфосфорибозилтрансфераза, 12 - аденилосукцинатсинтетаза, 13 - 1МР-дегидрогеназа, 14 - сШ>-оингетаза,

Таблица I

Активность ферментов взаимопревращения пурняовых яуклеотидоз в тканях цыплят (ншли/мин на мг белка; Ы + а ; п = 5)

Фермент ! ! !Субст-! Т к а Я В

!рат ! ! 1 ; I 1 Печень ! 1 I ! ! Слизистая тонкого кишечника 1 | Селезенка !

IМР-дегидр огеназа 1МР 2,39*0,11 2,69*0,19 4,04+0,50

Аде нил осу кцинат-синтетаза 1МР 0,65+0,09 0,86+0,06 0,70+0,09

Аденозиндезаыяназа АН 6,31+0,25 4,31+0,24 22,20+0,76

5'-нуклеотидаза 1ЫР вцр 7,92+0,94 6,16+0,71 19,7+1,30 19,7+1,30 7,68+0,86 11,52+1,09

Пуриннуклеозндфос-форялаза 1В ая 12,13+2,90 15,13+2,53 5,44+0,06 7,66+0,47 2,62+0,57 2,38+0,04

Гилокеантин-гуанин-Фосфорибозилтранс-фераза н в 0,45+0,01 0,87+0,03 1,11+0,06 0,84+0,07 2,43+0,05 0,72+0,03

Адбнянфосфорибозил-трансфераза А 0,17+0,01 0,11+0,003 0,21+0,004

Ксантинфосфорибо-зилтрансфераза X о,1А+0.01 0,13+0,01 0,14+0,003

Ксантиндегидрогеназа н 0,31+0,04 ->.37+0,02 •0,40+0,05

X 2,76+0,15 1,58+0,33 0,62+0,14

Гуанивдезаминаза а 15,33+0,75 4,03+0,20 1,38+0,10

ал>_редуктаза СИЛР 4,96+0,65 19,66+0,44 26,94+2,25

Аденозинкиназа АН 1,45+0,22 0,48+0,07 0,83+0,09

Превращения IIP было показано, что в печени lUP-дегидрогеназа в 3,6 раза активнее аденилосукцинатсинтетазы (табл. I). Следовательно, поток метки радиоактивных предшественников de novo должен был бы направляться преимущественно по пути образования ХМР, а не адеаилосукшната.

Учитывая эти соображения была изучена динамика включения "с-глициаа и '^С-гипоксаатина в пуриновые компоненты фонда, РНК и оксипурины тканей печени, слизистой двенадцатиперстной кишки и селезенки в интервале 1-60 мин.

В печени метка '^С-глищша распределялась по двум путям неравномерно, причем больше метились гуаншшуклеотиды кислотораст-воримой фракции (рис. 1). Константа скорости входа метки в фонд гуавиннуклеотидов била в 2.7 раза больше, чем для адениннуклеоти-дов и составляла 0,21 май . Вместе с теи скорость включения изотопа в нуклеотнды РНК относительно низка. Из оксипуринов быстрее всех обновлялся ксантин, период полураспада которого, равный 4,5 мвд, на порядок меньше такового для гипоксантина и мочевой кислоты. Максимумы включения метки ^-глицина в ксантин гепатоцитов и сыворотки крови совпадали.

Превращение IMP по деградационному пути с образованием инозина и гипоксантина не лимитировалось, из-за относительно высокой активности соответствующих ферментов (табл. I). В то время как окисление гипоксантина в ксантин, до-видимому, является контролируемой стадией деградационного пути, так как осуществляется с меньшей скоростью, чэм предыдущие реакции из-за крайне низкой активности ксантиндегидрогеназы по данному субстрату (табл. I).

Эти результаты свидетельствуют о том, что в печени цыплят синтезируемый de novo IMP, в основном, превращается в ХМР, а затем, из-за низкой активности GUP -синтетазы (Welch at al.,1982), . некоторая его часть используется для синтеза gup, а большая -окисляется в.мочевую кислоту. Тогда как превращение гипоксантина в ксантин блокировано и зта реакция, по-видимому, не может обеспечить оптимальную окорость удаления аминного азота в данной ткани. Для развития данной концепции была изучена кинетика включения 1 ^¡-гипоксантина в нуклеотидные компоненты печени цыплят. Уже на первой минуте после введения изотопа более 95% радиоактивности было обнаружено в оксипуринах, причем радиоактивность мочевой кислоты была в 17 раз выше таковой остальных оксипуринов (рис. I).

Рио.1. Кинетика включения радиоактивных предаественников в пуршю-вые компоненты кислоторастворимой фракция печени цыплят. А - [1-14с]глпцип; Б - [8-14с]гшюкоантип; В - [э-14с] пденин; Г - [8-3Н]гуанш1. I - адениисодержсщпе соединения; 2 - гуанипоо-дерчгпщпв соединения; 3 - гппоксантии; 4 - ксаптин; 5 - мочевая кислстп.

Учитывая низкую активность ксаатиндегвдрогенази по отношении к гапоксаатину, к тому хе в большинстве опытов она вообще не проявлялась, было высказано предположение о том, что превращение * тЗ-гидоксантина в мочевую клсло^У осуществляется по реутилиза-циснноыу пути через IMP и IMP, а не путем прямого окисления в ксантин. В пользу этого свидетельствует динамика мечения гуанин-нуклеотидов фонда, так как уже на первой минуте после введения изотопа удельная радиоактивность С-КРФ была в 7 раз выше, чем А-КРФ, а затем постепенно пониаалась (рис. I). Эти результаты хорошо совпадают с различиями в активности "вилочных" ферментов (табл. I).

Характер распределения матки ^-глицина среди пуриновых компонентов слизистой двенадцатиперстной кишки лишь незначительно отличается от такового для печени. Вместе с тем имеют место различия во вклинении метки х-гилоксантина. Это касается максимума включения в пурвннуклеотиды КРФ,который наступал при большей экспозиции, чей в печева. Выведение метки из оксипуринов было также замедленно. , '

Динамика распределения метки '^С-глицина и ^-гилоксанти-ва среди пуриновых компонентов селезенки (рис. 2) существенно отличается от таковой для печени (рис. I) и слизистой. Независимо от химической природы изотопа более интенсивно метятся гуаниннук-леотиды КРФ. Эти результаты согласуются с соотношением активностей 1ЫР-дегидрогеназы и адендлосукциватсинтетазы (табл. Г). Высокая скорость реутилизации гдпоксантина и низкая скорость его окисления в ксантин, осуществляемая ксантиндегидрогеназой, дают основание предположить, что в селезенке "запасной" путь биосинтеза является основным с точки зрения обеспечения данной ткани пуриновы-1Ш нуклеотидами.

Из представленного экспериментального материала можно сделать вывод, что в печени, а возможно ив других тканях, синтез мочевой кислоты, как конечного продукта удаления аминного азота, на стадия превращения IMP осуществляется по пути окисления последнего в ксантозинмонофосфат, а не аа счет дефосфорилирования в инозин В далее превращения в гипоксантин. Тогда как деградационный путь превращения IMP в печени следует рассматривать как путь синтеза гипоксантша, используемого другими тканями, в частности селезенкой, для образования пуриннуклеотидов.

Рио. 2, Кинетика включения радиоактивных предшественников в пури-новые когшоненты кяслоторяотворимой фракции селезенки цыплят. А - [1-14с]глицин; Б -[8 -14с]гипоксантин; В - [8-14с]пденин; Г - [8-^]гуанин. I - аденлнсодерязщие соединения; 2 - гуанинсо-держащпе соединения; 3 - гипокоантип; 4 - ксантип; 5 - мочовая к-та.

2. Исследование циклических превращений пуриновых нуклеотидов

В клетках животных и человека многие реакции пуринового обмена функционируют как шклы, включающие несколько компонентов.

Сравнительно недавно в клетках человека открыты активные пу-риннуклеозидные циклы: ииозиновый (IWP—инозин—гилоксан-тян —IUP) и 1уанозиновнй ( sup —■»• занозив гуанин — GUP) ( Barankieni.cz et al., 1982), метаболическая роль которых пока не ясна. Аденозин является важным метаболитом "идкла аденози-на", представляющего собой последовательность реакций: АИР —^-ав ——Н —IMP —»-AMP-S—ALP. Превращение аденозина контролируется соотношением активности аценозинкиназы и аденозинде-заминазы. Несмотря на более активную адекозинцезаминазу во всех трех тканях цыплят (табл. I), Х'-адеиозин, в основном, включался в адениннуклеотиды фонда (КРФ) и РНК. Так через 60 мин после введения изотопа около 40-60JS радиоактивности было обнаружено в А-КРФ, тогда как в продуктах деградации только 5-20£. Небольшая часть радиоактивности была локализована в гуаииннуклеотидах фонда и РНК. Такое несоответствие можно попытаться объяснить существованием в клетках тканей пространственно разобщенных ка/лартментов аденозина, при атом, экзогенный аденозин может поступать в тот компартмент, в котором локализованы соответствующие киназы, осуществляющие его превращение в адениннуклеотиды.

Инозиновый и гуанозиновый циклы определяют два процесса: во-первых, реутилизацию пуриновых оснований (гапоксантина, гуанина) и, во-вторых, тонкую регуляцию распределения потоков метаболитов между различными фондами (схема I).

В тканях цыплят обнаружены активности ферментов, катализирующие превращение пуриновых оснований в соответствующие нуклеозид-монофосфаты (табл. I). Однако метаболическая роль каждой реакции неоднозначна. •.

Так, активность аденинфосфорибозилтрансферазы относительно низка (табл. I), однако *^С-аденин достаточно эффективно использовался для синтеза пуриннуклеотидов в тканях печени, слизистой тонкого кишечника и селезенки, причем большая часть его была локализована во фракции адениннуклеотидов фонда. Небольшая часть превращалась в гуаниннуклеотиды (рис. I и 2).

Кинетика превращения '^С-аденина в оксипурины зависела от тида ткани. В печени .(рис. 1) и слизистой быстрее и в большем объеме синтезировалась мочевая кислота, а в селезенке - ксантин (рис. 2). Предполагается, что в печени и слизистой деградация аде-ниннуклеотидов осуществляется по пути IMP —— ХНР — — I, а не IMP —»-IH --- H - ■ 1. Накопление метки в гипокоантине селезенки mosbt быть обусловлено поглощением данной тканью гияоксан-тина, образовавшегося из ^С-вденияа в печени.

Гилоксантин-гуанинфос^рибознлтрансферазе (ГГЬРТазе) отведена центральная роль в регуляции биосинтеза пуриновых нуклеотидов как ключевому реутилизационному ферменту инозинового и гуанояияо-вого циклов. Активность ГГаРТазы во всех трех тканях по отношению к гувипну как субстрату одинакова, а по отношению к гилоксантину различается, причем в печени она вдвое ниже, чем к гуанину, в слизистой примерно равна, а в селезенке втрое выше (табл. I).

В клетках тканей доязна существовать конкуренция за субстрат между ГПРТазоЯ и ферментами деградации гилокоантина (ксантинде-гидрогеназа) и гуанина (гуаниндезаминаза). В печени активность ксантиндегидрогеназы в 1,5 разаапже активности ГГОРТазы (табл. I). Можно полагать, что болыаая часть гипоксантина должна выводиться из инозинового цикла.

В селезенке активность ГГОРТазы в б раз выше, чем ксантиндегидрогеназы (табл. I).Следовательно, в данной ткани, по сравнению с печенью большая часть гипоксантина должна реутшшзироваться в IMP,

Приведенные рассуждения имеют экспериментальное подтверждение В печени оснозная доля радиоактивности ^-гипоксантина уже на 1-ой мин после введения была локализована в мочевой кислоте, а такяе в фондах ксантинсодераащях я гуанпноодеряащих соединений (рис. 1,Б). По мере увеличения экспозиции изотопа радиоактивность этих фондов резко уменьшалась, в то же время доля метки в фонде аденинсодеряа-щих соединений на 1-ой мин была минимальна, а затем к 5 шш достигала максимального значения.

В селезенке характер мечэнил ^-гидоксантином рассматриваемых фондов оксппуринов близок к таковому в печени, однако уровни поглощения радиоактивного предшественника примерно на порядок больше. Кроме того, кинетика мочения нуклеотидов фонда существенно отличается (рис. 2,Б). С цолью рыясдоняя скорости превращения метаболитов гулноз'.'нсногс -сДкла т> ошгггп; in vive было изучено рас-

дределение матки %-гуанина. В печени (рис. 1,Г) и слизистой метка равномерно распределяется в фондах 1-У, тогда как в селезенке (рис. 2,Г) она накапливается в метаболитах фондов I4D (схема I).

Интенсивное печение адениннуклеотидов фонда (А-КРФ) ®Н-гуа-нияоы - факт особенно интересен. Наиболее вероятный путь превращения гуанина в адеаиннуклеотиды монет выглядеть следующим образ ом: гуанин —-"-(¡¡л» —— IMP —AMP- S ■- AMP. Наименее изученной стадией в приведенной последовательности реакций является превращение в IMP, катализируемое dip -редуктазой. Реакция протекает по типу восстановительного дезаминирования гуанилата в инози-нат, однако активность фермента в тканях млекопитающих, как полагают некоторые авторы, очень низка, а в тканях птиц она совершенно не исследована.

Нами установлено, что в тканях цыплят существует эффективный путь превращения gup в IMP. Активность gup -редуктазы особенно высока в селезенке и превышает таковую в печени и слизистой соответственно в 5,4 и 1,4 раза (табл. I). Кроме того, в селезенке окисление 1уаноэина в ксантин малоэффективно из-за низкой, по сравнению с печенью и слизистой, активности пуриннуклеозидфосфорила-зы и гуаниндезамнназы.

Физиологический смысл высокой активности gu? -редуктазы в селезенке не совсем понятен, однако можно предположить, что данная ткань способна.эффективно поглощать из крови гуанин и гуанозин и, превращая их в gup, использовать последний для синтеза адениннуклеотидов. Высокая активность фермента свидетельствует о том, что <31Р -редуктазная реакция не является скорость-лимитирующей стадией во взаимопревращении пуринов в тканях птиц в отличие от опухолевых клеток ( Crabtree,l97I). Поэтому данную реакцию можно рассматривать также с позиции защитного механизма, позволяющего убирать из системы избыток гуаниянуклеотидов путем деградации образовавшегося IMP и поддерживать таким образом в тканях цыплят стационарные уровни гуавиннуклеотидов.

• На основании изложенных данных предполагается, что в печени более активен гуанозиновый цикл, что определяется более высоким . уровнем активности ГЩРТазы с использованием в качестве субстрата хуанива, а не гипоксантина, и высокой скоростью реутилизации ^Н-гуанина. В селезенке активнее функционирует ияозиновый цикл, что подтверждается высокой активностью ГГФРТазы по отношению к ги-

поксантину, а яе гуанину, а такле высокой сторостью реутилизации гипоксантина.

Необходимо отметить удивильное постоянство накопления метки предшественников в гиаоксаатине, особенно при исаользовании X-аденина и %-1уаняна (рис. I и 2). Это мотет быть в том случае, если активности ферментов, катализирующих реакции, ведущие к образованию гипоксантина, будут выше активности ГГФРТазы и ксан-тидегидрогеназы. Для печени такие соотношения соблюдаются (табл. I). Активность пуриннуклеозидфосфорилазы на два порядка выше, чем ксантиндегидрогеназы. Учитывая низкую активность реутилизацион-ного фермента предполагается, что гипоксантяи накапливается с тем, чтобы затем экскретнроваться и кровоток для использования другими тканями в качестве предшественника синтеза пуринов "запасным" путем. В селезенке активность ферментов образования и реутилизации гипоксантина одинакова, а окисление в ксантин заторможено. Накопление метки в гипоксантина мозно объяснить тем, что данный оксипурин является основным предшественником синтеза IMP.

3. Активность ферментов обмена пиримядиновых нуклеотидов в гкаяях

В связи с отсутствием у птиц митохондриальной карбамоилфос-фатсинтетгзы ( Taalr, 1963) и низкой активностью цитоплазматиче-ского фермента ( Цздпг, 1967) возникли сомнения относительно способности печени цыплят обеспечивать оптимальную скорость синтеза пяри.шдиновых нуклеотидов da novo . В этом случае мозно было ожидать, с одной стороны, активизации запасного пути биосинтеза за счет реутилизации экзогенных предшественников и, с другой, более эффективного использования экзогенной оротовой кислоты - интерме-диатв пути синтеза пяримидияов de novo.

Для выяснения взаимоотношения альтернативных путей образования пиримлдинов была изучена динамика включения в ткани цыплят двух традиционных для пиршлидинового синтеза предшественников -*тЗ-оротатз и '^С-уридина, а такяе определены активности ферментов ях превращения.

Двухотадийный этап превращения ороговоМ кислоты в UUP , катализируемый и-коыплексом, включающим оротптфосфорибозплтрвнефе-разу и орот!1Ш1-5-■Т'осо-агдвкарбоксилязу, рассматривает как вто-

рое звено регуляции синтеза пирнмлдинов (ilisata, Та-ыьада, -1983).

Активность ферментного комплекса била определена в тканях пуплят и млекопитающих. Показано, что в печени крыс и милей она вдвое выше, чем в почках. Тогда как у хомяка - самая низкая и одинакова в обеих тканях (табл. 2).

У цыплят активность ферментного комплекса самая иысокая по сравнению с другими животными (табл. 2), причем в почках выше, чем в печени. Достаточно активен и -комплекс и в других тканях цыплят. Так, в слизистой, поджелудочной железе и селезенке величины активности находятся в пределах 1,01-1,¡¿2 нмодя/мия на мг балка. В тканях костного мозга, легких и головного мозга активность ферментов в 2-3 разе ниже. Несколько неожиданным следует признать факт относительно высокой активности и-ко;шлекса в слизистой Тонкого кишечника, так как в слизистой крыс и мышей его активность Не Обнаружена (Еа1зогш1ег et а1•, 1581).

При сопоставлении уровней активности и-комллекса с интенсивностью включения ^л!-оротовой кислоты в пиримидиновые нуклео-тиды РНК и КРФ обнаружена прямая корреляционная связь между данными параметрами для каэдой ткани цыплят ( г = 0,80-0,88). Полученные результаты свидетельствуют о тканевой и видовой специфичности распределения ферментного комплекса превращения оротата в ШР в животном мире.

В тканях цыплят определены активности двух ферментоь запас- ■ ного пути - уридинкиназы и уридинфосфорилазы, которые также проявляют тканевую специфичность (табл. 3). К тканям с высокой активностью уридинкиназы относятся: слизистая тонкого кишечника, селезенка и головной мозг. В остальных - активность в 2 и более раза ниже. Распределение уридинфосфорилазной активности примерно такое же, за исключением селезенки, в которой этот показатель в 4,3 раза ниже, и почек, в которых он в 3,4 раза выше. Следовательно, в первой .ткани процесс деградации уридина до урацила незначителен, а во второй - достаточно интенсивен. Уридинкиназа и ури-динфосфорилаза могут конкурировать за субстрат при условии, что . они пространственно не разобщены, В таком случае величина отношения активности одного фермента ко второму моиет быть полезна с "точки зрения характеристики тканей по способности превращать ури-дин по пути синтеза или деградации. По этому показателю мо'гно выделить .три группы тканей (табл. 3). В одну из них входят ткани

Таблица 2

Активность ферментного комплекса (оротатфосфорибозил-трансфераза + оротодин-5-фосфатдекарбокеплаза), катализирующего превращение оротовой кислоты в Ш£Р (нмоли/мив на мг белка; М + п ; п =. 5 + 8)

1 Ппчки животного 1 110ЧКЛ

Печень

! Слизистая

I

Крыса Мышь Хомяк Цыпленок

0,75+0,09 0,59+0,03 0,25+0,03 2,51+0,10

1,39+0,07 1,12+0,10 0,28+0,04 1,62+0,09

нет активности нет активности

1,22+0,09

Таблица 3

Активность ферментов превращения урадина в тканях цыплят (нмшш/шш на мг белка; М + п ; п = 4 + 6)

I ' /ридиикиназа ! Уридинфосфорплаэа ! Отноше-

! м + п ! % ! И + м 1 с" ! нне

Почки I,01+0,08 9,7 3,44+0,57 30,7 0,29

Печень 0,61+0,08 5,8 0,70+0,10 6,3 0,87

Слизистая 2,3&+0,18 22,6 1,90+0,27 17,0 1,24

Поджелудочная 0,39+0,04 5,3

аэлоза 3,7 4.1,50+0,20 0,65

Селезенка 2,06+0,15 19,8 0,48+0,09 4,3 4,30

Костный мозг 1,13+0,16 10,8 1,65+0,05 14,7 0,69

Легкие 0,58+0,01 5,6 0,55К),06 5,5 1,05

Головной мозг 2,27+0,19 21,6 1,9^0,37 17,1 1,18

* Отношение активностей ферментов Суридинкляоэа/урпдинфосфорилаза)

легких, головного мозга и слизистой, в которых равные возможнос-т* превращения уридина но двум путям. В тканях печени, поджелудочное железы, костного мозга и особенно почек ситуация более благоприятна для катаболизма урпдина. И лишь в селезенке превращение уридина направлено, в основном, по пути образования ш?,то есть по пути реутилизации нукдеозида.

4. Динамика обмена оротовоц кислоты в тканях печени и слизистой тонкого кишечника цыплят

Ори использовании оротовоа кислоты в качества предшественника биосинтеза пиримидиновых нуклеотидов в тканях цыплят обнаружен ряд интересных г новых фактов. При пероральноы введении ^-оро-тата в дозе 1,3 мкг на иг ДНК радиоактивность пиримидинов фонда я РНК слизистой двенадцатиперстной кишки была на два порядка выше, чем в печени я в течение 120 мин линейно повышалась, В то время как скорость поступления метка в пиримидшш РНК, рассчитанная по ( Bûcher, 1969), была выше в печени. Оказалось, что в каждой из тканей, в зависимости от выбора нуклеотида ( ШР или СЫР) дня расчета скорости поступления метки в РНК, имеют место значительные различия. Последнее можно объяснить некорректной оценкой удельной радиоактивности фонда нуклеотидов, из которого идет синтез РНК. Кроме того, было установлено, что в печени и слизистой величина отношения радиоактивности СМР-РНК к таковой и^-РНК (СЫР-РНК/ ump-PHK = í(t)) в зависимости от времени имеет разнонаправленный характер. В интервале 0-120 мин для печени функция понижалась, а доя сишзистой - повышалась.

При использовании изолированной петли слизистой двенадцатиперстной кишки в качестве более корректной экспериментальной модели было обнаружено, что при той же дозе изотопа характер изменения функции fit) сохранялся таким же, как и в случае перорального введения (рис. 3,. фивая I). Однако при увеличении- дозы оротовоа кислоты на 2 порядка ход функции £(t) изменялся на обратный (рис, 3, кривая 2).

Принимая во вщилание сведения о наличии в слизистой тонкого •кишечника кролика двух систем трансмембранного переноса нуклеотидов ( Harms et al., 1977) мы предположили, что в клетках слизистой цыплят также могут существовать компартментализованные потоки

Рис. 3. Зависимость величины отношения СМР-РНК/шр -РНК от времени введения изотопа в изолированную петлю двенадцатиперстной кишки. 1-1,3 ыкг '^С-оротовой кислоты на мг ДНК; 2 - 130 мкг '^С-орото-вой кислоты на мг ДНК; 3 - теоретически рассчитанная кривая на основании двухканальной модели (схема 2) с использованием групп констант I + 5 (табл. 4).

3С1.1Р-рнк ' ССЫР-РНК

Схема 2. Двухканальное превращение -оротовой кислоты в клетках слизистой двенадцатиперстной кишки.

С0 - концентрация оротата в просвете кишечника; С| - концентрация оротата в энтероцитах; С2 - концентрация метки, поступившей в кровь; Су и С0 - концентрация метки соответственно в уридин- и цитидин-нуклеотидах фонда. С щр_рщ и ссмр_р{щ ~ КОН1#нтрация метки в гар и СМР РНК; - константы скорости процессов.

биосинтеза пиримидинов, возможно на этапе превращения оротата в шр, характеризующиеся разными скоростями. Для количественной оценки скорости превращения оротовой кислоты в пиримидиноные нук-леотиды фонда и РНК была использована последовательно-параллельная схема метаболизма с двумя точками ветвления С| и (схема 2, канал А).

Процессы необратимого превращения оротата были описаны при помощи системы дифференциальных уравнений первого порядка:

йс„ ¿С,,

-НГ- - (1) -ЗГ- = к2°и-кЗ°о !

__V Л Л -V П . ^С1|1Р-РНК

ЗГ- = ко°о-к1с1-к5С1» ¿Г = k3C0 « (5)

■ЯР- = k^-^Cy-k^,; (3) —= '4GlT '

Решение этой системы было осуществлено при помощи операторного метода, разработанного Родигиным Н.11. й Родигиной Э.И. (Роди-гин, I960). Для этого были использованы данные по импульсному (лечению пиримидинов чЗ-оротатом (рис. 4). Были рассчитаны значения трех первых констант: к0 - константы скорости транспорта оротовой кислоты из просвета тонкой кишки в клетки слизистой, равной 0,0186 мин"* (рис. 5), к», - константы скорости превращения оротовой кислоты в'уридиновые нуклеотиды (0,178 шн"') и к^ - константы скорости поступления оротовой кислоты в кровь (0,681 мин-^). Среднее время жизни оротовой кислоты в просвете двенадцатиперстной кишки ( 1/к0 ) разно 54 мин. Время жизни меченой оротовой кислоты в клетках слизистой составляло около 1,2мин. Затем около 21$ оротата превращалось в уридиновые нуклеотиды КРФ и РЖ энтероштов, а около 79$ поступало в кровяное русло. Значение суммы констант /в = определяющих скорости превращения уридшовых нуклеотидов в -РНК, а также в цитидпиовые нуклоотмцы и СМР-РНК, равно 0,011 мин" . Следовательно, метка задерживается в уридиновом фонде довольно долго (l/Jt =90 мин), что мозот быть связано с накоплением ее в UbP-oaxapax. Из-за отсутствия стационарности для Сс в исследуемый период времени (рис. 4) кояотомта Ц по определялась.

LO

'о

«

£ &

а

ч с

мин

Рис. 4. Кинетическая крипая накопления метки в клетках слизистой после введения оротонси кислоты (1,3 мкг на I от ДНК) в

изолированную иетли тонкого кишечника цшишт. I - оротовая кислота; 2 - и -KPi; 3 - С-КРФ; 4 - ШР-РНК; 5 _ CI.1P-PHK.

Рис, 5. Кинетическая крирая убывания [2-'^с]оротовой кислоты (0о) из просвета тонкого -ише-итка цыплят (I) и зависимости lgC0 от времени (2).

На основания экспериментальных ( к0, сС j3 = к2+к^)

и Подобранных эмпирически констант (табл. 4) были проведены кинетические расчеты для различных вариантов одноканального превращения оротовой кислоты (группы констант 1-5). Показано, что графическое изображение функции f(t) , имеющее восходящий характер (рис. 6) соответствует только одноканальной модели (схема 2, канал А).

Таким образом, включение л! в пиримидиновые нуклеотиды КРФ и РНК в случае введения в изолированную петлю двенадцатиперстной кишки высоких концентраций ^-оротовой кислоты не описывается системой уравнений первого порядка, составленных на основании модели с одноканальной метаболизацией.

Этот вывод согласуется с данными Бернса (Burns, 1970) в том, что включение уридина в кислотораствориыый фонд и РНК не подчиняется кинетике первого порядка. Развивая идею о существования в клетках слизистой раздельных потоков сптеза цирпмндинов, отличающихся по скорости превращения метаболитов в качдом из них, была промоделирована схема двухканального превращения оротовой кислоты (схема 2, каналы А и Б). В этом случае решение системы дифференциальных уравнений зависит от 8 параметров: k2, к^, k'.-j, к*2> J* и fi* значения которых определят величину отношения СЫР-РНК/M-if -РНК = f(t). Определение числовых значений констант было выполнено по программе нелинейной регрессии методом Га-уса-Ньюгона. При этом ставилась задача получить такие значения, которые бы обеспечивали достаточно высокую точность описания экспериментальных данных с суммой квадратичных отклонений Q.< 0,0023 ("невязка"), а такяе провести минишзацию Функций отклонения экспериментальных точек от теоретической кривой по ьчбранному набору параметров, фиксируя значения остальных. Теоретическая кривая (рис. 6, кривая 3), соответствующая экспериментальной (рис. 6, кривая 2), может бить- получена только при суширсвання двух групп констант КБ) и 5(A) (табл. 4), со следующими значениями: к1= 0,012; к2 =0,94; к3 =1,08; к',, =0,166; к«2 =0,000э; к',, =0,05; >5=1,74; ,£'=0,011. Любая попытка изменения значений одного лз параметров (констант), участвующих в неравенствах., таким образом, чтобы неравенство нарушалось, приводило к существенному увеличе-1шю "невязки" (<4), характеризующей соответствие теоретической кривой по отношения к экспериментальной, и к иег.озчо-.спостл приблизиться к экспериментальная экт-элши.

Таблица 4

Варианты групп констант, используемых для различных моделей оцноканального обмена оротовои кислоты в слизистой двенадцатиперстной кишки цыплят

Группы! кон- ! Константы (глин

стант ! ! 1:о | А | ! к ! к 11! 2 ! кз V

I (Б)* 0,0186 0,859 0,011 0,166 0,0009 0,05 0,0101

2 0,0186 0,130 0,0^2 0,040 0,0020 0,06 0,0200

3 0,0186 0,130 0,040 0,030 0,0100 0,05 0,0300

4 0,0186 0,130 0,С60 0,008 0,2400 0,42 0,3200

5 (А)34 0,0186 0,859 1,740 0,012 0,9400 1,08 0,8000

КА и Б - каналы превращения оротовой кислоты (схема 2).

Рис. 6. Графическое изображение величин отношений СМР-РИК/ шр_рнк в зависимости от времени для групп констант 1-5, приведенных в табл. 4.

Итак, обратный ход зависимости СС|.р_рЖ/Сицр от време-ри, возмолен только в случав двухканального превращения ^-оро-тата, прячем, ари соблюдении приведенных ниже соотношений между константами скоростей реакций каналов А и Б: k14k,1s k^k'gj k^k i k^k'^. Следовательно, скорость превращения оротата в каждой канале существенно различается. Один из них, определяемый константами по объему фонда метаболитов небольшой, Во быотрообменивающийся (канал А), а другой ( '-''i"1^ ) - большой, во медленнообменпвающийся (канал Б). Вполне возможно, что при низкой концентрации оротата функционирует медленнообменяваю-щийоя канал Б, тогда как при увеличении дозы оротата включается в работу бызтрообменивающийся канал А. Можно думать, что последний используется в ядре для оперативного обеспечения биосинтеза РНК цитидинтрифосфатом.

5. Исследование активности СТР-с.лтетазы • , в тканях животных

Свободный фонд цитидиннуклеотидов в тканях цыплят относительно небольшой (0,13-0,52 мкмоля на I г сырой ткани). СТР-син-.тетазу относят к ключевым ферментам, регулирующим скорость метаболических процессов и, в частности, к факторам, вовлеченным во внутриклеточный контроль синтеза РНК.

СТР-синтетазная активность была определена в тканях животных in vitro модифицированным нами методом. Величины активности фермента в тканях печени и почек крыс хорошо совпадали с известными в литературе. Однако в слизистой тонкого кишечника крыс активность СТР-синтетазы не была обнарукена (табл. 5), что согласуется с данными других исследователей. Тем не менее, при использовании тЗ-оротовой кислоты in vivo в цитидинкуклеотндах КР5 ели зистой тонкого кишечника крыс било определено ощутимое количество радиоактивности. Это добудило нас к поиску способа расчета активности СТР-синтетазы в опытах in vivo, основанного на интенсивности включения оротата в уридиновыо и цитпдиновые нуклеотада фонда и в СМР-РНК.

Для этой цели использовали формулу, проruiOKOíuiyia для определения скорости синтеза РНК ( Ba.-her, НХЗб), которая п наизм случае принимает вид:

Таблица 5

Активность СТР-оинтетазы в тканях крыс и цыплят (нмоли/час на I глг белка; М + ш; п = 7)

Ткань

Крысы

in vitro

Шплята

!in vitroj

1П ViV° ! Надоса- ! ттная ! vivo ! дочная ! _

Почки 1,45+0,16 1,50+0,12 1,86+0,15 О 1,92+0,14 Печень 0,G2+0,05 0,92+0,08 0,89+0,07 0,80+0,09 0,98+0,10 Слизистая 0 1,28+0,14 1,28+0,11 1,04+0,11 1,22+0,13

РАСС-КРФ + СМР-РПК)/мг белка ~ 0,5-УР итр

где f. - нмоли ь"-?р , превратхшшегося в СТР в расчете на иг белка за определенное время. РА(С-КРФ + СЫР-РНК) - сумма радиоактивности цитидиннуклеотидов КРФ и РНК, Л? итр - удельная радиоактивность UHP в имп/мин на мкмоль.

Ферментативная активность СТР-синтетазы в почках и печени крыс, рассчитанная in vivo , очень близка к, таковой, рассчитанной in vitro (табл. 5). Более того, таким путем удалось определить скорость образования цитидиннуклеотидов слизистой тонкого кишечника крыс, которая по существу отражает активность ОТР-синтетазы. В тканях цыплят активность СТР-синтетазы определяли не только в наДосадочной, но и в ядерной фракции. Это вытекало из концепции двухканального обмена оротата, предполагающей существование компартментализованного фонда цитидиннуклеотидов, используемых для синтеза РНК. В печени и слизистой активность СТР-син-тетазы была обнаружена как в надосадочной, так и в ядерной фракциях, причем примерно одного уровня (табл. 5). Однако, в почках она обнаружена лишь в цитоплазматической фракции и ее величина вдвое выше, чем в печени. Различная субклеточная локализация СТР-синтетазы свидетельствует в пользу идеи о существовании в тканях печени и слизистой разобщенных каналов синтеза пирщ,«типовых нуклеотидов.а таете о компартментализации конечных продуктов этих метаболических путей.

6. Синтез РНК в тканях цыплят

Для расчета скорости синтеза суммарной и индивидуальных РНК была использована формула Бюхера ( Bûcher, 1969), а также резуль-. тэты по импульсному мечению тканей -оротовой кислотой и чЗ-уридияом. Самая высокая скорость синтеза суммарной РНК была обнаружена в почках (4,73+0,09 нмолл/шш на мг РНК). Вдвое ниже в печени и самая низкая в слизистой двенадцатиперстной кишки. Установлено, что во всех трех тканях с наибольшей скоростью синтезируется предшественник МРНК. Для почек эта величина составляет 27,9+3,1, для печени 11,7+2,9 и для слизистой 4,6+0,7 нмоля/мин На мг РНК. Скорость синтеза предшественника рРНК и цитоолазмати-ческой РНК соответственно в 5 и в 20 раз ниже. Однако соотношения между величинами скоростей синтеза в трех тканях сохраняются примерно те же, что и для предшественника МРНК. При использовавши ДЗ-уридина скорость синтеза предшественника мРНК в почках и печени г<ыла вдвое ниже, а в слизистой в 1,6 раза выше, чем в случав введения ^-оротовой кислоты. Последнее можно объяснить различной эффективностью использования тканями альтернативных путей образования пиримидиновых нуклеотидов. Скорость синтеза суммарной РНК в тканях печени и почек прямо коррелирует с активностью СТР-синтетазы, тогда как в слизистой такая зависимость не обнаружена.

При использовании радиоактивных предшественников альтернативных путей синтеза пуриннуклеотидов, каждый из которых, превращаясь в нуклеотиды, проходит стадию образования IMP, было установлено следующее:

1. Метка тЗ-глицина включалась в аденин- и 1уапиннуклеоти-ды фонда тканей с различной скоростью (рис. I и 2), однако кинетика меченая пуринов РНК (рис. 7), а также величина констант окорости входа метки в РНК печени, слизистой двенадцатиперстной кшки и селезенки практически не различались.

2. Распределение метки '^С-гицоксантина среди пуриннуклеотидов фонда для каждой из трех тканей существенно различалось (рис. 1 и 2). Тем не менее, кинетика включения гипоксаятина в пурины РНК Для печени и слизистой совпадала, а для селезенки различия наступали лишь к 30 мин после введения изотопа (рис. 7).

3. Скорость синтеза PI1K во всех трех тканях йьая намного выше при использовании 14С-гипокса;1тике (рис, V).

[1-14с] глицин [8-^ ^с]гипоксантин

А I ¿г 0,8 Г" ™

егсг < (

В II Г' I. 1 1_____

О Ю 30 0 10 30

минуты

Рис. 7. Кинетика включения метки [[-1 ^глицина и [8-14о]гипокеан-тина в пуриновые нуклеотиды РНК тканей печени (А), слизистой двенадцатиперстной кишки (Б) и селезенки (В).

I - АМР-РНК; 2 -_ <&п> -РНК. По вертикали - (имп/мин на мкмоль)«10~3,

На основании различий кинетики мочения пуринов фонда (КРФ) и подобия мечения пуринов РНК мояно предположить, что синтез РНК осуществляется за счет компартментализованного ядерного фонда пуриновых предшественников, медленно уравновешивающегося о цито-плазматичеоким фондом. Более того, фонд пуриновых нуклеотидов, образующийся за счет реутилизации азотистых оснований, более доступен для синтеза РНК.

Подобные результаты были получены и при исследовании включения предшественников пиримидинового синтеза в нуклеотиды фонда и РНК. Показано, что радиоактивный уридин включается в пиримиди-ны РНК эффективнее чем оротат, причем и тот и другой предшественник проходит общую стадию - синтез уридинмонофосфата (рис. 8, схема А). Об этш судили по величине отношения РА РНК/РА (КРФ+РНК), которая отражает долю радиоактивности, поступившей в РНК по отношению ко всей радиоактивности, обнаруженной в кислоторастгоримой фракции и РНК (рис. 8). Исключение составляв"; только ткань почек. Из этого следует, что в тканях костного мозга, селезенки, поджелудочной железы, слизистой двенадцатиперстной кишки и, в меньшей степени, в печени запасной путь, использующий реутилизационный механизм, более доступен и эффективен с точки зрения образования фонда нуклеотидов, используемых для синтеза РНК. Более того, во всех тканях запаоной путь значительно эффективнее используется для образования цитидиннуклеотидов и, в частности, СМР РНК (рис. 8, отношение C/U). Расчеты показывают, что около 80£ СТР, включающегося в РНК, образуются по запасному пути. А если учесть,что рибосомальная РНК, составляющая около 80$ от суммарного количества РНК, относится к go —типу, то становится понятным, что для синтеза РНК в ядерной фракции необходима надежная система обеспечения етого процесса цитидинтрифосфатом.

Основываясь на полученных результатах нами предложена схема обмена оротота и уридина, превращение которых в урициннуклеоги-ды приводит к образованию как минимум трех компартментализованных фондов UTP , обеспечивающих синтез СТР, РНК, а также используемых для выполнения коферментной функции (рис. 8, схема Б). Таким образом, полученные экспериментальные данные свидетельствуют в пользу существования в ядрах клеток компартыенгплизовапчых фондов пуриновых и пиркмидиновых прелнествепниксз, используемых для синтеза различных типов РНК. Крогю того, зчпган»; путь более

Схема А

СТР,

ч

РНК

"итр

II

ипр

н

тар

УРИДИН

ОРОТАТ

Ткань

Почки

Печень

Слизистая

П.железа

Селезенка

Кост.мозг

РА РНК

РА (КРФ+РНК)

Оротат Урлдан

0,2 0 0,2 0,4

_1 _с_I

-О

-о

-о

С-КРФ Ц-КРФ

Оротат Уридин

0,1 О

о©

о о-

0Л

-о -о

-о —о

Схема Б

ФЛ-«— СТР^

| ^РНК

.СТР

лг-з—итр-1 ** - итр-2

♦I

ипр

(I

\\ ♦I

огл>

\ ОРОТАТ /

УРИДИН

со

Рис. 8. Зависимость величин отношений радиоактивностей (РНК/КРФ+РНК) и (С-КРФ/ и-КРФ) от вводимого изотопа (оротат, уридин) для различных тканей шплят.

доступен в эффективен для образования фонда нуклеотидов, как предшественников синтеза РНК и, в частности, 1уанин- и цитидин-нуклеотидов.

7. Исследование анаболической функции гуанина и оротата в тканях животных в норме и в условиях D-гиповитамияозной экспериментальной модели

Согласно современным представлениям физиологическая функция витамина Dj в клетках слизистой тонкого кишечника животных и человека реализуется посредством образования системы переноса ионов кальция, причем действие витамина связывают с индукцией синтеза специфических белков. В качестве стимуляторов биосинтетиче-сккх процеооов были выЗралы оротат и гуанин. И если первый, как анаболик, известен давно, то выбор гуанина был сделан на основа-Вии предварительных экспериментов. Оказал ос*, что добавление экзогенного гуанина к рахитогеиноВ диете цыплят приводило к стабилизации банкового синтеза в слизистой тонкого кишечника. Для вы-яонения адаптационных изменений в пуриновом обмене в условиях D-гиловитаминозной экспериментальной модели в печени и слизистой двенадцатиперстной кишки крыс были определены стационарные фонды пуринов и активности ферментов их взаимопревращения. В обеих тканях фонда аденин- и гуаниннуклеотидов были устойчивыми по отношению к уровням обеспеченности животных витамином и лишь в печени фонд адениннуклеотидов на 28? уменьшался у тех животных, которые не поучали витамина. В условиях D -гиповитаминоза в печени крыс происходят глубокие нарушения обмена адениннуклеотидов. В ходе адаптации активности ферментов аденозинового и гуанозино-вого цикла изменяются таким образом, чтобы фонд гппоксантина был стабилизирован (табл. 6). При этом происходит перераспределение потоков предшественников. Гипоксантии образуется, в основном, за счет IMP, а не аденозина, так как активность пути превращения IMP —- — II при D -гиповитаминозе мало поменяется, а скорость образования инозина из аденозина из-за низкой активности аденозиндезаминазы сильно снижается. Окисление гяпоксянтина в ксантин (Н —«—X) практически не осуществляется, ток кок активность ксантинокоидазы снижается п 16 раз. В слизитгой образование гипоксантинв осуществляется, в основном, T 'tv:c> з-ч счет II,Р,

•зз

Таблица 6

Активность ферментов пуринового обмена в печени крыо в условиях 0-гиповитамипозной модели

(+0- ) - контроль; (- с^) - О-гиповитаминоз; (М + т ; а =4)

I

Фермент

I

]

| Суб- ¡ —-\ страт| +

шлоли/мин на мг балка

±

- в,

1МР-дегидрогеназа

Адвнилосукцинатсинтетаза

5'-нуклеотидаза

Пуриннуклеозидфосфорилаза

Аденозиндезаминаза

Ксантиноксидаза

сидр -редуктаза

1МР 1МР 1МР

1Н ан

н

ая»

2,02+0,22

0,15+0,01

4,28+0,38

15,32+1,04

12,17+0,60

I,62+0,20

29,05+4,90

3,5СЦ;0,46 0,03+0,01 5,3310,46 7,66+1,56 0,99+0,08 0,09+0,01 70,43+16,44

однако его реутилизация незначительна, а окисление в ксантин происходит довольно интенсивно. В печени (табл. 6) и слизистой тонкого кишечника била обнаружена высокая активность ШР -редуктазн, которая увеличивалась в условиях дефицита витамина. Эти данные получены впервые и свидетельствуют о том, что в условиях патологии часть гуаниннуклеотидов может использоваться для пополнения фонда адениннуклеотядов, обмен которых при I) -гиповитаминозе существенно нарушен. Включение гуанина в состав рахитогенной диеты вместе с витамином о. (500 МЕ) и оротатом приводило к нормализации процессов минерализации костной ткани, повышению интенсивности роста цыплят, стимулированию всасывания кальция в двэНадцатяперстной кишке, повцаени».содержания кальцийсвязывающего белка в слизистой оболочке кишечника и изменению активности щелочной фосфатазы. Влияние гуанина на всасывание кальция более эффективно* чем оро-тата.

В "лечебной" серии эксперимента на фона действия различных доз витамина показано положительное влияние оротата калия На процессы роста у цыплят, кальцификация коотйой ткани и содержания в сыворотке крови ионов качьция и фосфора. В конце курса лечения живой вес цыплят превышал уровень отрицательного контроля, которым служила группа, получавшая рахптогенную диету. Максимальный

стимулирующий эффект оротата на рост цыплят птиц наблюдали в первые 10 суток. Добавление оротата к диете приводило к снятию явления гшерфосфатемии, которая наблюдалась при использовании витамина в дозах 40 и 80 Ж.

Проведенные исследования показали, что эффективность совместного применения 40 № витамина Dj и 20 мг оротата калия при лечении рахита равна эффективности вдвое большей дозы витамина (80 ME). Это Дало основание рекомендовать оротат калия в качестве компонента антирахитического препарата, позволяющего снизить лечебные дозы витамина без изменения его терапевтического эффекта. Данные рекомендация были использованы в клинических условиях для проведения комплексной терапии и профилактики рахита у детей раннего возраста.

ВЫВОДЫ

I. Впервые сформулировано четкое представление о физиологической роли каждого их трех путей превращения инозинмонофосфата (IMP) в печени цыплят. Превращение IMP по адениннуклеотидному пути протекает с относительно небольшой скоростью и обеспечивает лишь синтез аденяннуклеотидов. Деградационный путь заблокирован на стадии окисления гипокоантина в ксантин из-за крайне низкой активности ксантиндегидрогеназы и не монет обеспечить оптимальную окорооть синтеза мочевой кислоты - конечного продукта экскреции аминного азота. Его следует рассматривать как путь синтеза гипокоантина, используемого другими тканями в качестве предшественника для образования пуриняуклеотидов. Синтез мочевой кислоты на уровне превращения IMP осуществляется по гуаниннуклеотядному пути через коантвзиямонофосфат.Об этом свидетельствует более высокая активность IMP-деглдрогенаэы по сравнению с токовой оденилосукци-натсйнтетазы,высокая скорость включения роциоактявн\*х предиествен-Биков в фонд гуаниннуклеотидов и кииетика синтеза оксипуркнов.

2* В тканях цыплят обнарукена активность пурлнфосфорибозил-трансфераз, катализирующих реутилизацию пуриноных оснований, кз которых наиболее активна гипоксантин-гуанинфос^орибозллтрансфера-за. Несмотря на относительно низкую активность пдешшуоофорибо-аилтрансферазы ^С-одениц достаточно э-У/Ьектипко жмплъзуется пдя образования япепиинуглеотидоБ уоляо и PIK. il-'Kivionn тконплоя специфичность процесса реутшадзяшш '•Ц-гупндня. 7е«, v ир.чснг. 1/3

его окисляется в ксантин и мочевую кислоту, около половины превращается в гипоксантин и лишь небольшая часть обнаружена в гуанин-и адениннуклеотидах фонда. В селезенке большая часть ^Н-гуанина превращается в адениннуклеотиды фонда и гипоксантин и лишь небольшое количество превращается в ксантин и мочевую кислоту. Эти результаты свидетельствуют о существовании в тканях цыплят достаточно эффективной системы взаимопревращения пуринов о использованием IMP в качестве ключевого интермедиата.

3. Показано специфическая для тканей роль пуриннуклвозид-ных циклов. В печени инозиновый цикл (IMP —инозин —гипоксантин —IMP) используется, главным образом, для синтеза ги-поксантина, а в селезенке и слизистой тонкого кишечника для его

реутилизации. Для гуанозинового цикла (оы^ —гуанозин-

гуанин —gup ) характерна деградационяая функция, причем в печени она проявляется с наибольшей эффективностью.

Анализ полученных данных свидетельствует о том, что для обеспечения стационарных фондов пуриновых и пиримвдиновцх нуклеоти-дов в тканях слизистой двенадцатиперстной кишки, поджелудочной железы и костного мозга используются оба пути синтеза - de novo и реутилизационный. В почках и печени превалирует путь de novo, а в селезенке - реутилизационный.

4. В тканях цыплят и крыс обнаружена до сих пор Мало исследованная реакция восстановительного дезаминирования GUP , определяющая интенсивный процесс взаимопревращения IMP л Oils. Активность ^ -редуктазы, катализирующей данную реакцию, выше в Тех тканях, которые эффективнее испольвуют реутилизационный путь образования нуклеотидов. Метаболическая роль данное реакции ваяна не только с точки зрения переброски нуклвотидного материала через IMP на синтез адениннуклвотидов, но и как путь устранения избытка гуаниннуклеотндов, В условиях адаптации к дефициту витамина активность фермента существенно увалйчивалаоь.

5. На сюнованни экспериментальных данных о включения орото-вой кислоты в пиримидины фонда и РНК В математического ыодеЛиро-

. вания этого процесса постулируется механизм согласно котррбцу превращение оротовой кислоты в клетках слизистой тонкого кишечника происходит по двум разобщенным каналам о образованием локальных фондов нуклеотидов, обеспечивающих разные метаболические реакции.

6. Показано, что скорость синтеза РНК прямо коррелирует с уровнем поступления оротовой кислоты в ткани, а также активностью СТ^-синтетазы и обратно - о величиной митотического индекса тканей цыплят. Запасной путь, использующий реутилязационный механизм, более доступен и эффективен в отношении образования фонда нуклеотидов, как предшественников для синтеза РНК. Используемый для синтеза РНК СТР образуется, в основном, за счет реутилива-цяониого пути.

7. В ядерной фракции печени и слизистой тонкого ккшвчника обнаружена активность СТР-синтезы , которая по уровню не отличается от таковой, определяемой в надосадочной. Этот факт является новом я.может свидетельствовать о наличии в ядрах данных тканей локальной системы превращения итр в СТР и, как следствие, о существовании компартыентализованного фонда цитидиняук-леотидных предшественников для синтеза нуклеиновых кислот.

. 8. Показано положительное клиянез гуан'ша и оротата калия на дроцеооы роота, кальцификацюо костной ткани и содержание в сыворотке крови ионов кальция и фосфоре в условиях о -гиповитамх-ноаной модели у цыплят. Эффективность совместного применения 40 МЕ витамина в^ и оротага калия при лечении рахита равна эффективности вдвое большей дозы витамина, ?го дает основание рекомендовать оротат калия в качеотве компонента антирахитических препаратов, позволяющего снизить лечебные дозы витамина без изменения его терапевтического эффекта.

^вДтдад

ти я

JO

• Ъяыа M ф - /976. - Пл Кя "razia п/а ' Колла«яяя

zî? "

"POTars „„ ■ ^ВДмя J , Г" »пвогящ „ ,

0цх>РУба А.в ¿- - С. 85-S6. ВДТаМй^огяй°,, 7/ Теэ-50, № 5. ^ a !RTamao» » у/,Шалят "PZ pain

ттшина и

— «»mue и „ Л.в. Мп

"РОТОЯОЯ К.ОЛОГН

д0*Уядя в.л.

// Укр-

38

вдохи*. »УРН*

_ - §1. * Ь -

Влияние

В тканях птид

19 \ ГМ.. У/ укр. бйохйй. *УР*

520-524. внооКоГ ДокЛ

Кокунаи в.А» , иидлят //

13.

НОВЫХ

К> 5.

- С.

АН

152. «ош>И<5а '■■ . мет > 1901 г..

к. КОИ»«» 1^дашше-. ^ "" '

с^ГГ- 1«- - ^11

ппост® синтеза

Иссдедова^е^ор^^^ ^ -

17

крас » "

с . 54-5*7-

- »6* Исследован»® Ляояю». съвз

1982. -

1Й. К^^ рФ У

«оотв О»»"4""

^ реаР°оетрОВ

да,

Ткаяук д.»« .. Т0засы 1У //„ г 40.

1982' " савШЙ^ОСТЬ

Коку»®11

вввь»

в.ь

- С. 40.

Видовая

аивотвы*

бвохим. с-ьез-накоил0йЛЯ

// Тов.

Всесоюз-

докл«

ЯЩ9ННО0 100

2о. Золоти в »«ада»««яда. п""Г7эв2

зото» в авододацно"" ПобвЛЙ, НО»^"'

и по эводода""""" №бвлй,

ор

Й0Г0 О«-— ОЛД0ЙИЯ левя» оо дня ^ Ленинград*_ КодарУба

Двнйнгр^. КодарУба № в пур

■ ВИЯ рай»оага

Тканевая с^--

цыплят // Тезисы 1У Укр. биохим. съезда, Днепропетровск, 1982. - С. 39.

22. Кокунян В.А. О компартментализации кислоторастворимых нук-леотидов, используемых для синтеза РНК // Тезисы 1У Укр. биохим. съезда, Днепропетровск, 1982. - С. 61-62.

23. Лукьянова Е.М., Апуховская Л.И., Ивашкевич С,П., Кокунян

B.А., Коцюруба A.B., Омельченко Л.И. Эффективность применения витамина-Ду, оротата калия и глицерофосфата кальция для лечения рахита // Вестник АН УССР. - 1985. - И 6. -

C. 33-38.

24. Кокунин В.а., Кощоруба A.B., Апуховская Л,И., Ивашкевич C.1J. Роль гуаниннуклеотидов в реализации гормонального действия витамина Дд // Тезисы У Всесоюзного биохим. съезда. Киев, 1986. - Т. 2. - С. 93-94.

i*25. Кокунин В.А., Коцюруба A.B. Ключзвая роль пути биосинтеза гуаниннуклеотидов в удалении белкового аэота у птиц Ц Тезисы Всесоюзного симпозиума "Биохншя с/х животных и Продовольственная программа", Ташкент, 1986. - С. 80-81.

26. Кокунин В.А., Коиюруба A.B., Тараканов С.С. Процессы реутилизации пуриновых оснований в тканях цыплят // ДокдаДы АН УССР. - 1987. - Сер. Б, № 4. - С. 67-70.

27. Кокунин В.Д., Коцюруба A.B., Тараканов С.С., Костычев Ю.Н. Особенности обмена пуриновых нуклеотидов и активность gmp-редуктазы в тканях птиц // Укр. биохим. жу^н. - 1987. - 59, № 4. - С. 47-52.

28. Кокунин В.А., Коцюруба A.B., Тараканов С.С., Костычев Ю.Н., йнчук Г.В. Пуриннуклеозидные циклы в тканях цыплят }} Укр. биохим. курн. - 1987. - 59, № 4. - С. 41-47.

29. Кокунин В.А., Кодоруба A.B., Тараканов С.С. Активн1сть ферментов обм!ну пуриннуклеотид!в у тканинах щур!а прн D-rl^-пов1ташноз! // Тези доп. У Укра!нського б!ох1м1чного за!з-ду, 1вано-Франк!вськ, 1987, ч.2. - С. 3.

30. Кокунин В.А., Коцюруба A.B. Изучение путей превращения ино~ эинмонофосфата в печени цыплят }) Биохимия, - I988.-53, вып. 2. - С. 182-187.