Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

О путях повышения криорезистентности ооцитов крупного рогатого скота

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "О путях повышения криорезистентности ооцитов крупного рогатого скота"

всероссийский научно-исследовательский институт генетики и разведения

сельскохозяйственных животных

На правах рукописи

ЯСИНСКИЙ Вадим Витальевич

УДК 636.74.612.591

О ПУТЯХ ПОВЫШЕНИЯ КРИОРЕЗИСТЕНТНОСТИ ООЦИТОВ КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА

Специальность: 03.00.15 — Генетика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

САНКТ-ПЕТЕРБУРГ-ПУШКИН .1992

ГОСУ

Работа выполнена в лаборатории криоконсервации ооцитов Всероссийского научно-исследовательского института генетики и разведения сельскохозяйственных животных РАСХН.

Научный руководитель — доктор биологических наук Б. И. Протасов.

Официальные оппоненты — доктор сельскохозяйственных наук, профессор Б. П. Завертяев; доктор биологических наук, профессор А. И. Жи-гачев.

Ведущее учреждение — институт акушерства и гинекологии РАМН им. Отто.

на заседании Специализированного совета Д 020.07.01 по защите докторских диссертаций при Всероссийском научно-исследовательском институте генетики и разведения сельскохозяйственных животных по адресу: Санкт-Петербург—Пушкин, Московское шоссе, 55-А.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Всероссийского научно-исследовательского института генетики и разведения сельскохозяйственных животных РАСХН.

Защита состоится « 7 »

1993 г. в /f \

часов

Автореферат разослан

1992, г.

Ученый секретарь Специализированного совета, доктор сельскохозяйственных наук

Ж. Г. Логинов

Актуальность темы. В нашей стране и за рубежом получены десятки телят из ооцитов, выделенных из яичников,убиваемых на мясокомбинатах коров и телок. Широкое применение этого биотехнологического приема в практике в значительной мере определяется возможностью долговременного хранения таких ооцитов. Если эмбрионы крупного рогатого скота замораживаются без существенной потери жизнеспособности, то об ооци-тах этого пока сказать нельзя. Есть сообщения о первых успехах а этой области ^Зляс//"// & , 19ЬЫ. Выход таких эмбрионов остается крайне низким и требуются дальнейшие исследования с целью разработки более совершенных методических приемов консервации, позволяющих повысить оплодотворяе-мость деконсервированных ооцитов.

Банки ооцитов могли бы стать основой устойчивых и дешевых источников потенциальных эмбрионов, что является, в определенной мере, лимитирующим условием программы их трансплантации. Хранение сравнительно больших количеств однотипных женских гамет создает предпосылки для расширения комбинаторики сочетания родительских.пар при подборе, что имеет немаловажное значение в селекционно-генетической работе. Этот прием создает одно из перспективных направлений в сохранении генетических ресурсов редких, эндемичных и особо ценных животных. Банки ооцитов, наконец, должны будут стать одной из основ для работ в области генной и клеточной инженерии, экспериментальной эмбриологии, физиологии и биохимии воспроизводства. Криорезистентность ооцитов невелика и существует целый ряд нерешенных вопросов в проблеме их замораживания. Один'из них'состоит в том, как снизить потери жизнеспособно-' сти ооцитов уже на первом этапе предконсервационной обработки - экспонировании в растворах криопротекторов в консервирующий среде. Нет ясности и в том, ка'кие сочетания криопротекторов. и их концентрации 'могут достаточно заметно снизить уровень криоповревдений при разных скоростях охлаждения у : ооиптов на различных стадиях развития. Не предпринималось 1 попыток поиска путей искусственного снижения восприимчивости к токсическим факторам консервирующей среды и повышения, та-; ким образом, их крисрсзистеитиости. Наиболее перспективным

4 " ■

представляется ивдуцирование обратимого торможения окислительно-восстановительных реакций, при котором может, снижаться • восприимчивость клеток к экстремальным факторам внешней среды в соответствии с известным биологическим законом.

Целью и задачами настоящей работы явилось изучение условий, способствующих повышению жизнеспособности ооцитов и их способности .к экстракорпоральному оплодотворению. При этом особое внимание придавалось поиску путей снижения их потерь на первом этапе предконсервационной подготовки. В связи с этим были поставлены, "следующие задачи:

1. Изучить, как повлияет на жизнеспособность и оплодбтворяе-ыость предконсервационная подготовка ооцитов, а, именно, экспонирование в .различных по содержанию криопротекторов, консервирующих растворах.

2. Выяснить оптимальный состав криопротекторов для программируемого и сверхбыстрого охлаждения ооцитов на разных стадиях развития. • "

3. Изучить эффективность некоторых криофилактиче.с'ких веществ в качестве компонентов консервирующей среды.

4. Определить адекватность отдельных методов.оценки жизнеспособности деконсервированных ооцитов. '

. 5. Изучить возможность повышения криорезистентности- ооцитов . с помощвю предконсервационной обработки их факторами вызывающими обратимое торможение обменных процессов.

Научная новизна: . •

Впервые проанализировано влияние экспонирования ооцитов в •различных растворах эндо- и экзрцелдюлярных криопротекторов на, их жизнеспособность и оплодотворяёмость. Разработан методический подход к подбору комплекса криопротекторов для их замораживания, способного защитить как генетический аппарат клетки, так и ее мембраны. Разработан способ искусственного индуцирования в клетках повышенной устойчивости к токсическим факторам консервирующих сред и получено положительное решение по заявке на патент "Способ низкотемпературной консервации ооцитов крупного рогатого.скота". Сформулирован лринцып подготовки биологических объектов к замораживанию.

Практическая ценность работы. Разработан способ низкотемпературной консервации ооцитов,'обеспечивающий технологическую

основу Для создания их банков. ,

Апробация работы. Основные результаты исследований доложены и обсуждены на отчетах лаборатории криоконеервации ооци-тов крупного рогатого скота в 1990-1991 гг., на аспирантских сессиях 1990-1992 гг.

Публикации. Пр теме исследований опубликовано 3 статьи.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из разделов: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты исследования и их обсуждение, заключение, выводы, практические предложения и списка литературы, включающего " 170 публикаций отечественных и зарубежных авторов. Объем диссертации составляет /// страниц машинописного текста, включает 1£ таблиц и ГО рисунков.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Ооциты выделяли из яичников коров и телок, черно-пестрой породы, убиваемых на Санкт-Петербургском мясокомбинате. Яичники с кистами, наличием гемморагических фолликулов, перерождениями различной природы, свежими желтыми телами отбраковывались на конвейере.

В большинстве случаев использовали яичники на стадии фолликулярного роста, их помещали в среду 199 в термосе при температуре 20-22°С с добавлением в нее антибиотиков» После доставки в лабораторию яичники отмывали от крови стерильным физиологическим раствором при температуре <Ю-25°С. Ооциты извлекались из яичников путем надреза лезвием и промывания средой 199,,содержащей I ед/мл гепарина, антибиотики СЮО ед/ мл пенициллина.и 50 мкг/мл стрептомицина). Клетки отбирались' из чашек Петри пастеровской пипеткой под контролем микроскопа (МВС-9)'. Морфологическую оценку и отбор ооцитов по состоянию клеток кумулюса и ооплазмы проводили непосредственно после их выделения в условиях стерильного бокса. После отбора ооциты 2-3 раза промывались в стерильной культуральной срзде и помещались на культивирование. Культуральная среда включала следующие компоненты: 90% - ТС-199, 10* - феталь-ная сыворотка, гормональные препараты: 10 мкг/мл - ФСГ, . I мкг./мл - 17-эстрадиол, энергетические добавки: 2,92 мМ/л *

б

лактата кальция, 2 мМ/л - пирувата натрия; 33,9 мМ/л -УаНСОо, 4 ,43 мМ/л - Нерех и 40 мкг/мл - гентамицина. Культивирование проводилось в чашках Петри (.0 - 40 мм), в каплях - 100 мкрл, под парафиновым маслом.

После помещения чашек Петри в эксикатор его наполняли соответствующей газовой средой: 90$ - 0р, 5% - С0^.

Культивирование проводилось при температуре ЗЬ,Ь С и рН среды - 7,2, до стадии метафаза I.

Замораживались клетки на двух стадиях мейотического развития:

на стадии диплотвны; на стадии метафаза I. Охлавдение при замораживании осуществлялось двумя путями:

а) в программном замораживателе, при относительно невысоких скоростях охлаждения;

б) методом витрификации.

В качестве криопротекторов использовали глицерин, димё-тилсульфоксид (.даСО;, диметилацетамид ^ДМАА), 1,2-пропанди-ол, полиэтиленгликоль ШЭГ>, поливинилпирролидон (ПВШ, сахарозу. Насыщение криопротекторами проводилось ступенчато. В качестве криостатов использовались приборы: "Хромосома производства Киевского НПО "Сатурн" и ЗЭМ-4 - производства экспериментальных мастерских Харьковского НИИ криобиологии и криомедицины УАН.

Хранились ооциты в жидком азоте, отогревались - в водяной ■ бане при температуре 39-40°С до исчезновения твердой фазы. Отмыв от криопротектора проводился путем ступенчатого раз-.бавления концентрации криопротектора, обычной культуральной средой, или средой с сахарозой в концентрации 0,о М. После деконсервации для культивирования использовались те же среды, что и для интактных ооцитов.

Жизнеспособность клеток оценивали следующими методами:

а) с помощью цитогенетического анализа;

б) оплодотворением ин витро с последующим культивированием;

в) окрашиванием витальными красителями;

г) измерением уровней восстановленных лиридиннукдеотндов

■ сНДЦ-Н; и окисленных флавопротеидов <А>Г\}{) с помощью л ю-

минисцентных микроскопов "Люман-И-2", "Люмам-И-3" с фотометрической насадкой ФМЕЛ-1. '

Для статистической обработки- данных использовали формулу оценки разности генеральных долей;Ь -критерий Стыодента Шлохинский, 1969).

СОБСТВЕННЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Криопротектор, наиболее полно обеспечивающий защиту клеточных c'pnvKPyp от повреждений при криоконсервации, для каждого типа клеток подбирается часто эмпирически или на осно-. ве их применения для других биообъектов. Эффективность действия криопротектора определяется, обычно, уже после процедуры замораживания-оттаивания, по сохранности мембран клеток и способности к дальнейшему развитию. В наших опытах на первом этапе предусматривалось оценить действие самих врио-" протекторов на-клетки без их замораживания. Насыщение раствором до предельных концентраций проводили ступенчато в 4 ступени по общепринятой методике. Отмывались криопротек-торы путем вндезрживания ооцитов в растворах нисходящих концентраций криопротекторов с 0,о М сахарозы или без нее в 4 ступени с 10 мин. эквилибрацией на каждой ступени. После чего их помещали в среду для культивирования, культивировали до стадии метафаза II, с последующим оплодотворением.

Оценка жизнеспособности клеток проводилась с помощью 0,4% трипанового синего и оплодотворением ин витро. Результаты исследовании представлены в табл.Í.

Из данных табл.1 видно, что экспонирование ооцитов в, 'отдельно взятых глицерине, ДМСО и 1,2-пропандиоле по показателям созревания до'стадии метафаза II дало сходные результаты.

Полученные данные показывают, что. только одно экспонирование в криопротекторах,наиболее широко применяемых для консервации репродуктивных клеток сельскохозяйственных животных, оказывает тормозящее влияние на их дальнейшее развитие, и способность к оплодотворению упо сравнению с контрольной группой клеток,- экспонировавшейся в обычной культуральной среде), ото свидетельствует о необходимости поиска путей

Таблица I, Влияние экспонирования в ДМСО, глицерине, 1,2-пропавдиоле и их сочетаниях с сахарозой на способность к созреванию и оплодотворению вне организма ооцитов коров

Криопрэтектор Число Число кле ток дегенерации • Число Число дро-

¡¡¡Ж*6"»» метафа-зе 11 всего" из 'них на метафазе И В°Р?™ бящихся зкгот

■ иицкхие - штук) п % п % п % ддетик (.штук) п < /о

I . ДМСО 2,0 М 78 40 51,Зхх 29 37,2 6 20,7 50 - -

¿: Глицерин 2,0 М Ь5 46 54,1хх* 36 42,3 5 13,9 ■50 - ■ -

з - 1,^-пропандиол 2,0 М . . 52 28 53,б** 18 34,6 3 16,9 35 ■ - -

4 ' ДМСО 1,5 М,сахароза 0,5' М 70 41" 56,6ХХ 19 27,1 7; 36,8 " 30 4 13,3

о б Глицерин 1,5 М, сахароза 0,5 М 74 44 59,5ХХ 23 31,1 10 ■ 43,4 30 5 16,6

1,2-гшопандиол .1,5 М, сахароза 0,5 Ы 57 37 64,9х 13 22,6 5 38,5 25 6 . 24,0

7 ДМ00 1,5 И + пвп • Эб 66 66,7 30 31,3 12 40,0 28 7 25,0

ь . Контроль 66 52 7 8,8 •9 13,6 6 66,7 ' 38 10 26,3 .

Примечание: х - Р> 0,95; хх - Р>0,99; ххх - Р> 0,599.

защиты клеток от токсического действия таких криопротекторов уже на первом этапе их подготовки к замораживанию, а также' на необходимость поиска других сочетаний криопротекторов, отличающихся меньшей токсичностью. Введение сахарозы - криопро-тектора, снижающего развитие осмотического шока, как показывают данные тао'лицы, способствует повышению выхода зрелых яйцеклеток и сохра*шет у них способность к оплодотворению. Наименее тормозящее действие оказывали ДМСО с ПВП. Это, однако, не дает основания считать, что именно это сочетание криопротекторов автоматически становится оптимальным для заморозки этих клеток. В связи с повреждением мембран у ооцитов после глубокого замораживания, представлялось целесообразным использовать в комплексах криопротекторов, обладающих мемб-раностабилизирующим действием. К таким относится диметилаце-тамид (ДМАА). Однако он один без других криопротекторов бьщ мало эффективен и в высоких концентрациях, как было обнаружено в предварительных опытах, оказывав угнетающее влияние на развитие клеток.

В наших огптах- его использовали в сравнительно низких ■ концентрациях в сочетании с другими криопротекторами. Результаты представлены в табл.2.

Таблица 2. Влияние различных сочетаний криопротекторов на созревание и жизнеспособность деконсервированных ооцитов

Состав и концент- Время Время Созревание Развитие пос-пп. рация криопротек- инку- куль- до метафвзы I ле деконсер-

• (.мин) игас) число клс~ ток (шт;' % число . клеток . . %

I; 1,5М ДЖО Ь% ПВП ^базовый вариант) 30 20 50 34 бь.о ,ьо 42 52,5

2.- 1.371Л глицерина 0,25' М ДМСО 30 ' 30 56 37 66,0 74 37 50,0

3. 1,37 М глицерина • 0,25 м дам ■ 30 го 53 35. 60,0 69 26 37,0:

4. 1,5 М ЖСО 0,25.МдМАА, Ь% ПВП 30 - 20 60 41 №¿3 64 47 55,9

Примечание: х - Р> 0,95.

. Данные табл.2 свидетельствуют, что наиболее высокие показатели развития наблюдались при применении оптимального, по показателям экспонирования, комплекса, состоящего из 1,5 М ДМСО и 5% ПВП в сочетании с 0,25 М ДМАА.

Это позволяет прийти к заключению об оптимальности данного сочетания при такой скорости охлаждения.

Известно, что наиболее перспективным методом замораживания с процедурной стороны является витрификация. Для ооцитов в этом плане не разработаны достаточно эффективные методические подходы, в частности оптимальные составы криопротек-торов. При сверху-быстром замораживании испытано влияние различных составов витрифицирукнцих растворов на сохранность структуры и жизнеспособность ооцитов, находящихся на разных стадиях развития. Данные опыта представлены в табл.3.

Таблица 3. Влияние 15 минутной экзилибрацки ооцитов,на рааных стадиях развития, в различных сочетаниях криопротек-торов на результаты их глубокого замораживания методом

1 витрификации

Ж» Состав витрифицирую- Стадия Число Оценка жизнеспособности пп, щеро раствора раэви- ооци-

тия

тов Сшт)

витальное цитогенети-окрашива- ческий ние анализ

п а' /о п % ■

I. I,2-пропандиол глицерин - 20% ПЭГ ^ - Ь% -25% Дп 35 41 30 36 Ь5,7 Ь7,Ь 0 Ь 0 • 22,2

2. I,2-пропандиол Й» • ж ■■ - 5% • Дп. м1 40 . зь 37 36 92,5 94,7 0 6 0. 16,6

3. ДМСО 20.5%' В* :а» Дп ' М1 45 42 39 ЗЬ Ь6,6 .90.-4 0 5 0 13,1 -

Данные табл.3 свидетельствуют о низкой криорезистентно- ■ сти у ооцитов на стадии диплотены. Хотя данная стадия мейо-тического развития наиболее привлекательна для криоконсер-вации методом витрификации в производственных условиях. Сравнение различных составов витрифнцирующих растворов по-

называет, что наивысшая сохранность и способность к развитию получена в средах с 1,2-пропанднолом, глицерином и ПЭГ, в лучшем варианте в культуре развилось 22,2% Таким образом, установлен факт развития деконсервированных ооцитов после нитрификации. Хотя уровень жизнеспособных клеток оота.пч:л невысоким и требуются дальнейшие поиски оптимального состава верифицирующего раствора.

По сохранности плазматических мембран показатели достать, но высокие, но результаты генетического анализа свидетельствуют о том, что метод витального окрашивания является дополнительным критерием жизнеспособности деконсервированных ооцитов.

С целью выяснения влияния отдельных нриофилантическнх веществ на выживаемость ооцитов, в качестве компонента консервирующей средыгбыли использованы спермин, о.пермиднн и унитиол.

Вышеперечисленные вещества но механизму действия о'пм'пп» ся к группе антиоксидантов и стимучяторив мембранной проницаемости. В качестве криопротектопа использовали сочв^-.и-«' - 1,5 М дасо, Ь% ПВП, 0,25 МДМАА. В табл.4 отображенч луч шие результаты опытов с этими веществами.

Таблица 4. Развитие деконсервированных ооцитов корой, после замораживания с добавлением спормчдина, спермина,

унитиола . ...

№ Наименование и пп. концентрация ■•• компонента

Общее Созревание до число метафазы II

Оплодотворение

ооци-всего тов ооци-(шт)тов

Ыт) л

Всего Опло- ■ Дроби-спци- дотво-. лось тов пилось _

~Г! '7 /• Л /«

ШТ )

л

Спеомчцин

(И.10-3 М) 17Ь

?,. Спермин 1,6 мг/мл)

173

104 90

68 49

65,5х

71

9а

3; Унитиол Л

79 65

69,6ХХ 94

2 Я

И, 04

г яд

4. Контроль

Примечание: х - Р>0,95; хх - Р> 0,99)

2, г. ¿,04

¿,1

1ЬЗ Ы 41 Ь0,6 102 I 0,9 I 0,9

Таким образом, включение в качестве дополнительного компонента в консервирующую среду спермидина М), спермина (б мг/мл), унитиола (3,5'М-^ М) не только значительно повышает выход жизнеспособных клеток, но и сохрадает у них способность к экстракорпоральному оплодотворению.

С целью выя-снения адекватности в качестве экспресс-?»етода оценки состояния ооцитов, в частности по показателям уровня окислительно-восстановительных реакций в их цитоплазме, до и после криоконсервации были' определены у -них показатели НАД-Н и ФАД. Результаты предстазлены в табл.5.

Таблица 5. Результаты измерения уровня флюорвсценсии в ооцитах до и после замораживания

№№ Наименование Показа- Ста- Число Интенсивность флюо- НАД-Н ■ пп. криопротек- тели дия. кле- рисценсйи 1усл.ед.)

тора прибора мейр-ток ндц_н . фдд ■ $дц .

Л. Глицерин До за- М1 31 1,Ь6+0,13 0,26+0,012 7,15

2. ДМСО ■ вания"" М1 34 2,Ь0+0,13 0,40+0,Ш15 7,00

3. 1,2-ЦД .Мх 36 1,95+0,11 0,30+0,012 6,50

4. Глицерин После ' М1 36 Г,35+0,0Ь 0,33+0,010 4",09.

5. да.С0 швания М1 22 0,96*0,16 0,25+0,015 3,Ь4 6.. 1,2-ЦД М1 39 0,60+0,04 0,26+0,006 2,31

Данные табл.5 показывают, что применение вышеперечисленных-криопротекторов пс' разное влияет на интенсивность окислитель-ко-восстанозительшх процессов. Наибольшее изменение в обеих 'звеньях дыхательной цепи вызывает ДМСО, как по'показателям НАД-Н, так и по ФДД. Менее значительные изменения наблюдаются при применении глицерина и 1,2-пропандиола, в меньшей степени подавляющих развитие ооцитов.'

Таким образом, показатели НАД-Н и- ФДД, характеризующие уровень окислительно-^восстанозительных реакций могут служить удобным тестом для оценки адекватности отдельных криопротекторов, способных устранить или снизить влияние отдельных негативных сторон их воздействия на жизнеспособность биообъек- • той. Эти тесты могут найти применение также для оценки механизмов криофплактического действия отдельных веществ и их сочетании. • ' '

С целью выяснения восприимчивости ооцитов к токсическому действию криопротекторов применяли факторы, вызывающие искус -ственное обратимое торможение обменных процессов у них. Известно, что ингибитором обменных процессов для ооцитов является фолликулярная жидкость из фолликулов определенного уровни р»1,.< вития. Это послужило основанием для ее использования с этой целью. В данном случае использовали фолликулярную жидкость из развивающихся фолликулов разного диаметра. В пирном варианте - иэ развивающихся, во втором - иа атретических. Время предконсервационного инкубирования составляло 2 часа. Группа ооцитов использованных в контроле в это время культивировалась в обычной культуральной среде. Результаты опыта представлены в табл.6.

Таблица 6. Влияние предконсервационной инкубации ооцитов в фолликулярной жидкости из фолликулов разного функционального состояния на их жизнеспособность и оплодотворяемость после

деконсервации

)с№ Средя для пред- Число Созревание до Оплопотво^пшш___

пп. консервационной ооци- мзтафазц,11-оплодотвори- Дроби-

инкубации тов число лось лось

клеток п %

(щт)

число кле~ п ток у ат >

1.' Контроль 150 75 40 53,3 75 I 1,3 1 1,3

2. ФЖ из развивающихся фолликулов 139 69 44 63,7 70 -2 2,Ь I 1,3

3. ФЖ иэ атретических фолликулов 142 ЬО 39 4Ь,7 62 'I 1,6 -

Данные '"абл.6 свидетельствуют о значительном-повышении выхода жизнеспособных клеток после 2-часоьой инкубации ь фолликулярной жидкости из развивающихся фолликулов. Все зто послужило основанием дня выяснения влияния ФЖ из ргзвивающпхен фолликулов разного размера. Данные опыта представлены в табл.7

Данные табл.7 свидетельствуют, что наиболее адекватным обратимым ингибитором обменных процессов в ооцитах является фолликулярная жидкость ^фЮ из фолликулов малого размера

Таблица 7. Влияние предконсервационного инкубирования ооцитов'в фолликулярной жидкости из развивающихся фолликулов разного размера на их постконсервационное'

развитие ,

пп. Размер фолликулов Активность НДД-Н в Цитогенетичеокий анализ деконсераированных ооцитов _ Подвергалось оплодотворению

(.мм) показаниях микрофлюо-риметра чусл.ед.) число клеток •Нормальное .созревание Дегенерации Число Оплодотв.о-клеток рилось * - Раздробилось

<.шт) п % " п % ^ п % п %

I. 1-5 • ' 4,6+0,20 58 . 38 65,5х 20 34,5 . 45 2 .4,4 1-2 бл. 4,4

2. 6-9 5,13+0,25 62 36 58,0 26 "42,0 . 50 - 1,6 бл. -

3. 10-14 5,4+0,25 "55 30 55,0 25 45,0 59 - ■ - -

4. Контроль 5,56+0,26 ' 66 . 44 51,0 42 49,0 66 - - - . .

Примечание: х - В>0,95

(I-b км). Результаты опытов дают основание для заключения о том, что предконсервационное инкубирование ооцитов. на стадии метафаза I в фолликулярной жидкости из фолликулов малого диаметра, вызывающее обратимое торможение обменных процессов приводит к повышению их криорезистентности, проявляющееся в увеличении пыхо,да .^консервированных клеток способных к дальнейшему развитию и оплодотворению.

вывода

1. Экспонирование ооцитов в растворах эндоцеллюлярных крио-протекторов приводит к снижению способности к развитию и .утрате оплодотворяемости. Дополнительное введение в такие растворы экзоцеллюлярпых криофйлакти.ков (сахарозы или поливинилпир-ролидонв с мол. массой 40 кДа) увеличивает сохранность и восстанавливает способность к оплодотворению.

2. При замораживании ооцитов на стадии метафаза I с низкими скоровтями охлаждения оптимальным сочетанием криопротекто-роя следует считать 1,5 Ы ДМСО, t>% IiBll и ü,2b к ДМЛд. При этом способность к дальнейшему раавити» сохраняет Солей bUjl декон-сервированных клеток.

3. При спс'рхбыстром охлакдении ооцитов на стадии ыотафияй i Iw.ítüV'M :-iriри'¡.ика^'.и) 1о-минутное экспонирование и коьшлркао icpüoíipo'i" }J, иклычакицеи 2i>,í 1,2-пропандиола, ¿0'!> глицерина и \J¿, ио::;игил<л1гдикйлн позволяет сохранить у Солее чем '¿.'¿'/о клеток способность к дальнейшему развитию,

•i, ¡,,',i: :■ ¡iOliO^ií^lpybndli': С"ц..-.;.е<ЯНЛ, CliupMl'¡.vlHa И

уаити#»л« ¡je—¡itíCx st-.io^ürforcHTHOúTD ооцитов, что проявляется в увеличении выхода развивающихся и способных к оплодотворению декоисорвированиых клеток.

5,' Показатели уровни фшорисценции воеотановлоннич".rai¿.,i— диннуклеотидов СНдД—Н) и оголенных флавопротеи iob (а'ДД) могут использоваться в качестве вспомогательных тестов по оценке состояния ^¡консервированных ооцитов крупного рогатого

с к о ту'.

6. ¡¡редконсервационное инкубирование ооцитов на стадии метафаза I п течений I2C минут в фолликулярной жидкости из развивающихся фолликулов малого диаметра приводит к повышении их криорозостентности о чем свидетельствует увеличение у них жаа-носипсобнос'ш И Oíinul!,OVbOpjiCMOr.TVl PüCn-i ра^морн.шглнип.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ '

Для повышения жизнеспособности и сохранности низкокриоре-эистентных биообъектов рекомендуется применять искусственное индуцирование у них перед переносом в консервирующие среды обратимого торможения обменных процессов.

Список работ, опубликованных по теме диссертации •

1. Ясинский В.В. Влияние времени эквилибрации в Д1ИС0 на f жизнеспособность ооцитов.коров //Бюллетень ВНИИРГЖ, 1991,

№ 129, с.16-18.. ' . о

2. Гуэеватый O.E., Протасов Б,И.,.Зайцев С.Д.»Ясинский В.В. Влияние некоторых йриопротекторбв на выживаемость и развитие ооцитов коров вне .организма //Бюллетень ВНИИРГЖ, 1991, № 131, с. 19-22.

3. Протасов Б.И., IVtkho 3,А., Ясинокий В,В., Зайцев С.Д., Чистяков Ю.В. Перспективы, низкотемпературной консервации ооцитов' крупного рогатого окота. //Научно-производственная конференция "Новые методы селекции и биотехнологии в животноводстве". Киев, 1991| с* 71-72. '