Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Нуклеотид-гидролизующая активность иммуноглобулинов и лактоферрина молока человека

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата химических наук, Семенов, Дмитрий Владимирович, Новосибирск

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК СИБИРСКОЕ ОТДЕЛЕНИЕ НОВОСИБИРСКИЙ ИНСТИТУТ БИООРГАНИЧЕСКОЙ ХИМИИ

на правах рукописи

СЕМЕНОВ ДМИТРИЙ ВЛАДИМИРОВИЧ

НУКЛЕОТИД-ГИДРОЛИЗУЮЩАЯ АКТИВНОСТЬ ИММУНОГЛОБУЛИНОВ И ЛАКТОФЕРРИНА МОЛОКА

ЧЕЛОВЕКА

03.00.04-Биохимия

диссертация на соискание ученой степени кандидата химических наук

Научный руководитель:

д. х. н. профессор Невинский Г. А.

НОВОСИБИРСК, 1998

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК ПРИНЯТЫХ СОКРАЩЕНИЙ 5

ВВЕДЕНИЕ 6

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 8

1.1. Моноклональные абзимы 13

1.2. Природные абзимы 27

1.2.1. Природные абзимы с протеазной активностью 27

1.2.2. Природные абзимы, гидролизующие нуклеиновые кислоты 32

2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ 37

2.1. Реактивы и материалы 37

2.2. Методы 38

2.2.1. Очистка нуклеотидов 38

2.2.2. Определение концентрации нуклеотидов 38

2.2.3. Тестирование нуклеотид-гидролизующей активности белковых препаратов 38

2.2.4. Определение кинетических параметров реакции гидролиза нуклеотидов, катализируемых антителами и лактоферрином 39

2.2.5. Анализ гомогенности белковых препаратов электрофорезом в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата Na 39

2.2.6. Выделение slgA и IgG из человеческого молока 39

2.2.7. Разделение slgA и IgG ионообменной хроматографией 39

2.2.8. Анализ препаратов белков встречной радиальной иммунодиффузией 40

2.2.9. Очистка Ig аффинной хроматографией на сорбентах с иммобилизованными антителами против иммуноглобулинов человека 40

2.2.10. Очистка и тестирование ферментативной чистоты АТР-абзимов гель-фильтрацией в условиях разрушения иммунных комплексов 40

2.2.11. Анализ сродства иммуноглобулинов к АТР с помощью аффинной хроматографии на АТР-сефарозе 40

2.2.12. Анализ сродства АТР-абзимов к ДНК аффинной хроматографией на ДНК-целлюлозе 41

2.2.13. Получение протеолитических фрагментов IgG 41

2.2.14. Определение концентрации белка 41

2.2.15. Модификация IgG и slgA аналогами АТР 41

2.2.16. Тестирование АТР-гидролизующей активности белков после их 42 разделения электрофорезом в полиакриламидном геле

2.2.17. Иммуноферментный анализ взаимодействия антител с белками

Escherichia coli 42

2.2.18. Выделение лактоферрина из человеческого молока 43

2.2.19. Гель-фильтрационный анализ олигомерных форм лактоферрина 43

2.2.20. Аффинная модификация лактоферрина химически активными 43 аналогами АТР

2.2.21. Ограниченный протеолиз лактоферрина трипсином 44

2.2.22. Ограниченный протеолиз лактоферрина бромцианом 44

2.2.23. Флуоресцентные измерения 44

2.2.24. Нумерация аминокислотных остатков в составе полипептида 44

лактоферрина

3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 46

3.1. Нуклеотид-гидролизукпцая активность иммуноглобулинов молока человека 46

3.1.1. Выделение иммуноглобулинов из молока 46

3.1.2. Тестирование АТР-гидролизующей активности препаратов

иммуноглобулинов после электрофореза в полиакриламидном геле 54

3.1.3. Совыделение фосфатазы молока с иммуноглобулинами 54

3.1.4. Анализ иммуноглобулинов аффинной хроматографией 58

3.1.5. Оптимизация условий протекания реакции гидролиза АТР, катализируемой slgA- и IgG-абзимами 62

3.2. Локализация АТР-гидролизующего центра абзимов 63

3.2.1. Аффинная модификация иммуноглобулинов химически активными аналогами АТР 63

3.2.2. Анализ АТР-азной активности Fab- и Fe- фрагментов иммуноглобулинов 65

3.2.3. АТРазная активность L и Н субъединиц иммуноглобулинов 67

3.3. Субстратная специфичность АТР-гидролизующих абзимов 70

3.3.1. Субстратная специфичность абзимов молока в реакции гидролиза

нуклеотидов 70

3.3.2. Взаимодействие NTP-гидролизующих абзимов молока с

нуклеиновыми кислотами 75

3.3.3. Взаимодействие NTP-гидролизующих абзимов с белками 78 3.4. Поиск АТР-гидролизующих ферментов молока человека 82

3.4.1. Выделение лактоферрина из молока 73

3.4.2. Взаимодействие лактоферрина с АТР 85

3.4.3. Локализация участка связывания АТР на молекуле лактоферрина 89

3.4.4. Конформационные перестройки лактоферрина 92

3.4.5.Влияние АТР на связывание лактоферрином казеина и гепарина 94

3.4.6. Гидролиз нуклеозидтрифосфатов лактоферрином молока 96

3.4.7. Локализация АТР-гидролизующего центра лактоферрина 97

4. ЗАКЛЮЧЕНИЕ 101

5. ВЫВОДЫ 102

6. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 103

Список принятых сокращений

АГ - антиген АИЗ - аутоиммунные заболевания

АК - аминокислота АПС - аналог переходного состояния

AT - антитела

БСА - бычий сывороточный альбумин

ВИП - вазоактивный интестинальный пептид

ДТТ - дитиотреитол

ДЭАЭ - диэтиламиноэтил

ЛФ - лактоферрин (лактотрансферрин)

Мм - молекулярная масса

НК - нуклеиновые кислоты

ПААГ - полиакриламидный гель

ПЭИ - полиэтиленимин

СКВ - системная красная волчанка

Трис - трисгидроксиметил аминометан

ТСХ - тонкослойная хроматография

ЧСА - человеческий сывороточный альбумин

ЭДТА - этилендиамин тетраацетат

ЭФ - электрофорез

Ig - иммуноглобулин

NaOAc - ацетат натрия

оАТР - 2',3-диальдегидное производное АТР

RC1-ATP - у-[4-]\[-(2-хлорэтил)-М-метиламино] бензил амид АТР

SDS - додецилсульфат натрия

ВВЕДЕНИЕ

Открытие каталитически активных антител (абзимов) является одним из наиболее ярких достижений в молекулярной биологии и биохимии за последнее десятилетие. Несмотря на сравнительно небольшой срок (всего около десяти лет), прошедший с момента получения первых абзимов, в настоящее время достигнут огромный прогресс в этой области исследований. На сегодняшний день получение антител (АТ) к стабильным аналогам переходного состояния (АПС) можно считать универсальным, детально разработанным подходом к генерации биокатализаторов химических превращений. Теоретические основы этого подхода были предложены Л. Полингом в 1948 г., который выявил общие черты в механизмах узнавания гаптена антителом и переходного состояния реакции ферментом. Идея о возможности получения абзимов как АТ к стабильным аналогам переходных состояний впервые была высказана Б. Дженксом [1] и экспериментально подтверждена А. Трамонтано с соавт. [2].

Своим быстрым развитием область исследования каталитических АТ обязана не только огромному практическому потенциалу абзимов. Интерес к каталитической активности АТ обусловлен также возникновением новых подходов к решению фундаментальных задач биохимического и молекулярно-биологического характера. Действительно, абзимы являются мощным инструментом в исследовании механизмов биокатализа, реализуемых белковыми структурами. Кроме того, феномен химического превращения антигена под действием АТ заставляет по новому оценить роль последних в различных иммунологических процессах. Необходимо отметить, что возможность генерации абзимов при иммунизации животных гаптенами-АПС сама по себе не свидетельствовала в пользу наличия естественной каталитической функции у АТ в организме. Достаточным основанием, позволяющим утверждать, что АТ в организме выступают не только в качестве связывающего, но и в качестве химически трансформирующего антиген начала, могло быть обнаружение каталитической активности у «природных» АТ и представление строгих доказательств того, что активность не связана с присутствием в препаратах АТ примеси ферментов. Первым подобным исследованием были работы группы С. Пола, в которых показано, что в крови людей, страдающих астмой присутствуют АТ с протеолитической активностью [3]: они расщепляют вазоактивный интестинальный пептид (ВИП). Затем были обнаружены ДНК- [4 - 6] и РНК-гидролизующие АТ [7 - 9] в крови больных СКВ.

Дальнейшие исследования показали, что абзимы образуются и при других АИЗ: ревматоидном артрите и склеродермии [10], аутоиммунном тиреоидите, полиартрите [11], рассеянном склерозе [12], а также при различных формах вирусного гепатита [13] и при СПИДе [14] - заболеваниях, протекающих с нарушением иммунного статуса пациента.

Недавно нами было показано также, что б^А здоровых по медицинским показаниям рожениц фосфорилируют ряд белков молока [15 - 16]; б^А и ^О-абзимы молока катализируют гидролиз ДНК и РНК [17 - 18]. Следовательно, наработка абзимов возможна и в здоровых организмах в отсутствие аутоиммунных процессов. В ходе исследования активностей АТ молока было отмечено, что пул ^О и э^А обладает не только протеинкиназной и нуклеазной активностями, но и гидролизует АТР до АБР и ортофосфата. Целью настоящей работы является исследование нуклеотид-гидролизующей активности антител человеческого молока, установление субстратной специфичности таких антител, определение роли отдельных субъединиц иммуноглобулинов в связывании и гидролизе нуклеотидов. Для выяснения роли нуклеотид-гидролизующих антител в человеческом молоке актуальным также было выявление других белков молока, способных связывать и гидролизовать АТР.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Фундаментальным и наиболее исследованным свойством иммуноглобулинов является их способность связывать самые разнообразные по структуре соединения. Современным представлениям о связи между структурой иммуноглобулинов и их функциями, специфичностью и механизмами осуществления этих функций посвящен ряд обзоров [19, 20]. В рамках данной работы необходимо, на наш взгляд, рассмотреть строение антиген-связывающих и пространственно близких к ним областей антител, в силу того, что именно они непосредственно участвуют в связывании и химической трансформации субстрата осуществляемых абзимами.

Мономерная молекула иммуноглобулина состоит из четырех субъединиц: двух идентичных "тяжелых" полипептидных цепей (Н) 51-72 кДа, и двух идентичных "легких" (Ь) цепей 20-25 кДа. Цепи соединены межцепочечными дисульфидными связями и нековалентными взаимодействиями (рис. 1, а). Мономеры иммуноглобулинов могут быть объединены в пентамерные комплексы с помощью дисульфидных связей с дополнительным полипептидом - .Г-цепью (^М), или в димерные комплексы дисульфидными связями с 1-цепью и секреторным компонентом (э^А), либо без секреторного компонента (1§А) [19].

Иммуноглобулины - гликопротеины с четко выраженной доменной структурой. Легкие цепи антител образуют два гомологичных домена: вариабельный - Уь; и константный - Сь Структура тяжелой цепи в зависимости от класса иммуноглобулина образована 4-мя или 5-ю гомологичными доменами, один из которых вариабельный - Ун, а остальные константные Сн1-СнЗ/4. Антигенсвязывающий активный центр формируется Уь и Ун доменами (рис. 1, а)[20].

Домен ^ образован приблизительно 107 - 110 АК. Вторичная структура доменов ^ представлена обширными областями, образующими две плоскости антипараллельных Р-складок, и так называемыми петлями, структура которых представлена элементами ос-спиралей и изгибами (поворотами) цепи (рис. 1, б) [19,20].

Такое строение характерно не только для но и для широкого крута других полипептидов, образующих суперсемейство ^-подобных белков. В число последних входят антигены главного комплекса гистосовместимости, дифференцировочные антигены лейкоцитов, ряд клеточных рецепторов и другие белки. Внутри этого

суперсемейства сходство вторичной и третичной структур полипептидов обусловлено существенной гомологией первичных последовательностей белков [20].

Между Сн1 и Сц2 доменами тяжелой цепи имеется так называемый шарнирный участок, который придает молекуле пространственную гибкость. Пептидные связи этого участка наиболее подвержены протеолизу. Так, ограниченный протеолиз папаином происходит с образованием двух идентичных Fab-фрагментов антител (от англ. "Fragment antigen binding") и одного Fc-фрагмента (от. Англ. "Fragment cristalline"). Под действием трипсина и пепсина образуется Р(аЬ)г-фрагмент, состоящий из двух Fab-фрагментов, соединенных в шарнирной области дисульфидными связями (рис. 1, а) [19].

Из рис. 1, б видно, что антиген-связывающие V-домены антител представлены относительно консервативными каркасными участками FR1 - FR4 (от англ. "Framework Region"), образующими Р-складки, и гипервариабельными, областями CDR1-CDR3 (от англ. "Complementarity-Determining Region"). Каркасные участки (FR) формируют структуру доменов цепей и вносят существенный вклад во взаимодействие тяжелых и легких цепей между собой [21]. Таким образом структурообразующая часть, на которую приходится более 80% всего Vl или Ун домена, формируется инвариантными элементами вариабельных регионов цепей. Необходимо отметить, что контактная область между Vl и Vh доменами приблизительно на 40% формируется за счет CDR-областей. Поэтому взаимное расположение V-доменов цепей различно даже для идиотипически родственных иммуноглобулинов. В частности, отмечены вариации угла взаимного поворота Vl и Vh доменов от 165° до 180° [21, 22].

В формировании антиген-связывающих активных центров в основном участвуют АК CDR областей антител, однако далеко не все АК остатки гипервариабельных областей непосредственно контактируют с лигандом. Большинство из них предназначено для придания активному центру уникальной конформации, необходимой для связывания лиганда. Аминокислотные остатки каркасных областей так же принимают участие в формировании активного центра и могут непосредственно контактировать с антигеном [19].

Недавно были установлены некоторые закономерности, касающиеся аминокислотной композиции антиген-связывающих регионов антител. Согласно данным различных авторов, остатки аспарагина и гистидина встречаются от двух до восьми раз

Место гидролиза

Место гидролиза пепсином

б)

РН1 °Ш1 ГР2 °Ш2 РПЗ С0ЯЗГП4

0 25 50 75 100

/V, оо-□—□-[О—МП—□ С108

Рис. 1. а) Схематическое строение молекулы ^01 человека с легкой цепью ж-типа. Утолщенные линии с цифрами на границах обозначают гипервариабельные участки СБШ - СЭКЗ (схема приведена согласно [23]). б) Взаимное расположение константных ИИ-РИЛ, вариабельных СОШ-СЭКЗ регионов (сверху) и элементов вторичной структуры □ - (3-складок, ¡\]\ - а-спиралей (снизу) в Уь-домене легкой цепи ж-типа человека (схема составлена по данным [19, 24]).

чаще в CDR, чем в FR областях [25]. В непосредственной близости с антигеном отмечена высокая частота встречаемости остатков тирозина и триптофана [22].

Результаты многочисленных исследований комплексов антиген-антитело, позволяют выделить три различных типа структуры антиген-связывающих активных центров иммуноглобулина:

1. Полости (cavity) характерны для активных центров, связывающих низкомолекулярные лиганды (гаптены);

2. Выемки или бороздки (groove) образуют пептид-, ДНК-, полисахарид-связывающие активные центры;

3. Плоские (planar) области формируются активными центрами антител, взаимодействующих с белками [21].

Отмечены исключения из приведенной закономерности строения антиген связывающих активных центров: так активный центр антител к низкомолекулярным гаптенам может иметь форму бороздки, характерной для пептид- и ДНК- связывающих центров AT [26].

Активный центр антител является конформационно-лабильной структурой. Взаимодействие антител с лигандами может сопровождаться конформационными перестройками, которые варьируют от небольших сдвигов боковых цепей АК остатков до глобальных перестроек в третичной и четвертичной структуре Fab-фрагментов молекулы иммуноглобулина [21, 22, 27]. В тех случаях, когда в качестве лиганда выступает антиген, антитела меняют конформацию не существенно. То есть взаимодействие с антигеном в большинстве случаев соответствует механизму "ключа и замка". Однако при взаимодействии с соединениями структурно родственными антигену (перекрестная реактивность антител) или с соединениями существенно отличающимися от антигена (полиреактивность антител) структурная комплементарность может быть достигнута благодаря конформационным изменениям как антител, так и лиганда [28]. Таким образом, взаимодействие антител с лигандами может характеризоваться элементами механизмов индуцированного соответствия и деформации субстрата, характерных для взаимодействия ферментов с субстратами [29].

В образовании комплексов АТ-АГ важную роль играют молекулы воды. Так показано, что в случае комплексов AT с белковыми антигенами молекулы воды могут располагаться не только на периферии, но и в области непосредственно образующей плоский контакт АТ-АГ [30]. Молекулы воды обнаружены в областях контактов с

антигеном антипептидных, анти-ДНК и антигаптеновых антител. При этом, молекулы воды могут выступать в качестве необходимого элемента, формирующего структурную комплементарность АТ и АГ [31].

Приведенные выше сведения о конформационной лабильности активного центра антител, возможности изменений в структуре антигена под действием антител, а также данные о доступности антигена для молекул воды позволяют говорить о элементах функционального сходства антител и ферментов.

Впервые гипотеза о возможности проявления антителами каталитических свойств была высказана Б. Дженксом [1, 32] в 1969 г. Гипотеза базировалась, с одной стороны, на концепции ферментативного катализа о комплементарности фермента переходному состоянию реакции, и, с другой - на возможности получения антител к широкому кругу стабильных аналогов переходных состояний. Таким образом Б. Дженкс предположил, что с помощью иммунизации гаптенами - стабильным