Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Новый аминоксидазный препарат из бактерий METHANOSARCINA BARKERI 27

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Новый аминоксидазный препарат из бактерий METHANOSARCINA BARKERI 27"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК

ИНСТИТУТ ЭВОЛЮЦИОННОЙ ФИЗИОЛОГИИ И БИОХИМИИ им. И. М. СЕЧЕНОВА

На правах рукописи

ДИАНОВА Марина Михайловна

УДК 577.158:576.809.8

НОВЫЙ АМИНОКСИДАЗНЫЙ ПРЕПАРАТ ИЗ БАКТЕРИЙ МЕТНАЫОЗАКСША ВА1*КЕ1и 27

СПЕЦИАЛЬНОСТЬ 03.00.04-БИОХИМИЯ •

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

САНКТ-ПЕТЕРБУРГ -1993

Работа выполнена в лаборатории функциональной биохимии мышц и подвижности клеток (заведующий — доктор биологических наук — В. П. Нестеров) Института эволюционной физиологии и биохимии им. И. М. Сеченова РАН.

Научный руководитель — доктор химических наук, ведущий научный сотрудник Е. Б. НИКОЛЬСКАЯ

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор Е. В. РОЗЕНГАРТ доктор медицинских наук, профессор В. В. РУДАКОВ

Ведущая организация: Казанский Государственный университет.

Защита состоится 199 ^ г. в «/У » часов

на заседании специализированного совета К 002.89.01. в Институте эволюционной физиологии и биохимии им. И. М. Сеченова РАН по адресу: 194223, г. Санкт-Петербург, пр. М. Тореза, 44.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института эволюционной физиологии и биохимии им. И. М. Сеченова.

Автореферат

разослан « ^ » ¿Ьб^сЯО- 1993 г.

Ученый секретарь специализированного совета кандидат биологических наук Л. В. ЗУЕВА

ОБт ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность теми.По современным представлениям процесс» торможения я возбуждения, протекавшие в коре и подкорковых центрах головного мозга, передача нервных импульсов. состояние тонуса кровеносных сосудов, рост н деление клеток. 9 также проницаемость биологических мембран-в значительной степени.обусловлены активностьв протекания окислительного дезаминирования биогенных аминов, катализируемого, аминоксидазами (АО). Аминоксидазн выполняет регуляторные Функции в процессах биосинтеза аминов р их обратного превращения в резервные формы, при свободно радикальном окислении липидов. АО относится к клвчевмм ферментам, нарушение функции которых ведет к растройствц обмена веществ при патологических состояниях.

К числу АО относятся, наряду с мембраносвязанннйа флавиновыми моноамнноксидазами (МАО), растворимые медьсодер7 жащие диаминоксидазы (ДАО), а также аминоксидазн крови я микроорганизмов.

Внимание исследователей к этим ферментам все более возрастает, что объясняется важностью предполагаемых их Функций в организме. Изучение природы аминоксидаз и способов активного воздействия на их функции при помочи ингибиторов особенно важно для разработки методов лечения разнообразных заболеваний. Поиск новых высокоспецифичных ингибиторов аминоксидаз, обладающих высокой активностью, но малотоксичных для организма актуален для клинической медицины. Среди таких ингибиторов, обладающих вироним спектром биологического действия и уже применяемых в ,медицине в качестве лекарственных препаратов * особое внимание исследова-

телей привлекает изатин, явлапщняся нативным ингибитором мо-ноаминоксидази.

В последнее время появилось новое направление в использовании МАО. Моноаминоксидазные препараты применяют для химического, клинического и токсикологического анализа. На основе велатиновых мембран, содервацих МАО. создан ферментный электрод.

Работа выполнялась в соответствии с 1. Общесоюзной программой "Биохимия животных и человека" - вифр 2.28.4.3 [1981— 1990 г.г.]; 2. Планом НИР ИЭФБ АН СССР " Исследования меди-аторных систем фармакологическими и биохимическими методами" [ номер гос. регистрации 018?.00610??].

Цель и задачи исследования ..Целью настоящей диссертации является изучение свойств нового аминоксидазно1*о препарата из бактерий нтамма МеИ1апозагс1па Ьагкег1 27, сравнение его свойств с наиболее полно изученной моноаминокси-сидазой - моноаминоксидазой митохондрий печени свиньи.

В ходе дальнейшей работы через ЙО мы обозначаем фермент. выделенный из бактерий нтамма МеИ)апо5агс1па Ьагкег! 27, через МАО - фермент, выделенный из митохондрий печени свиньи.

Апя реализации поставленной цели в работе ревены следующие задачи:

- разработан метод выделения Фермента из бактерий втамма Не^апояагс^а Ьагкег1 2?;

- изучена субстратная специфичность нового аминоксидазного препарата и МАО различных степеней очистки;

- разработан метод иммобилизации высокомолекулярной фракции МАО печени свиньи;

- изучено влияние новых ингибиторов изатинового ряда на МАО и АО;

- изучено действие на активность ИАО и АО сульфид-ионов и разработан ферментный метод определения их концентрации в физических средах.

Надчная новизна.Впервые выделена и изучена аыин-оксидаза из бактерий втамма МеШпозагс1па Ьагкег! 27, взятого из коллекции Института никробиологии иы.А.Кирхенштейна

АН Латвийской Республики.

Впервые получен иммобилизованный препарат очищенной высокомолекулярной моноаминоксидазы, изучены его кинетические характеристики с различными субстратами.

Впервые изучено влияние новых производных изатина, содержащих ацетильные и мегнльнае гриппы у гетероциклического атома азота, ацетил- и алкилзамещеннуп оксиминогруппу во втором положении, а также соответствующих производных бензизатинов на ферментные препараты МАО и АО. Установлено, что ингибирувщая активность исследованных соединений зависит от химической структуры ингибитора и от степени очистки фермента.

Практическая значимость.!.Разработан аффективный и простой способ выделения ЙО из нового источника. 2.» Получены ИАО-содержаад'е мембраны, пригодные для создания биологических сенсоров, в том числе и ферментных электродов. 3; Разработан метод определения концентрации сульфид-ионов в различных биологических средах.

Апробация работы.Результаты исследований были доложены на конференции " Методы получения, анализа и применения ферментов" „(Рига, 1390); на " Второй Всесовзной конференции по анализу неорганических газов С Ленинград, 1990); на Международной конференции *' Сенсор/ Техно-93" ( Санкт-Петербург. 1993 г.).

Структура и объем диссертации.Лиссертациа изложена на страницах маиинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, результатов и их обсуждения, заклвчения, выводов и списка использованной литературы. Диссертация содержит^ страниц , 15 рисунков. 12 таблиц и библиографию из 156 работ.

- б -

КРАТКОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Во введении обоснована актуальность работы, ее новизна и практическая значимость, сформулирована цель исследований, основное задачи.

В первой главе 'Обзор литературы" дана характеристика Фермента, подчеркнута значимость его Функций в живых организмах. Обобщен материал об источниках и местах локализации МАО. Отмечено, что недостаточно изучена АО микробных препаратов. Рассмотрены методы выделения и очистки, а также способы иммобилизации аминоксидаз. Особое внимание уделено ингибиторам изучаемого Фермента. В зависимости от характера действия все рассмотренные ингибиторы объединены в две группы - обратимые и необратимые. Отмечено, что изатин является нативным ингибитором МАО и идентичен ранее обнаруженному трибулину, что привлекает особое внимание к изучению ингибиторов данного ряда. Отдельный раздел посвящен практическому применению МАО.

Вторая глава 'Экспериментальная часть" состоит из двух частей. В первой части представлена характеристика исходных материалов, используемых в работе, описаны методики выполненных ексЬериментов.

Выделение моноаминоксидазн вклвчало солвбилизацив метилзтилкетоном и дигитонином, очистку гель-хроиатографией и аффинной хроматографией на колонке с гамма-(Н,Н-бис-кар-боксиметиламино )-бета-оксипропилцеллвлозой хлопковой. Выделение и очистку АО из бактерий жтамма Methanosarcina barker! 27 проводили по разработанной нами иетодике. Для иммобилизации высокомолекулярной фракции моноаминоксидазн нами была разработана новая методика. Все ингибиторы, изученные в работе, синтезированы на кафедре органической химии Латвийского университета.

Во второй части представлены и обсуждены результаты экспериментальных исследований. Кинетические свойства очищенной высокомолекулярной фракции МАО не изучены. Поэтому нами по различным методикам была выделена и изучена высокоыоле-

куларная Фракция ИЙО. Использование в качестве детергента дигитонина позволило получить солвбилизировакнуи МАО, обла-даищу» удельной активностью в 3-5 раз воте удельной активности N00, выделенной с помощью метилэтилиетона (Табл. 1),

Таблица 1

Характеристика ионоаииноксидазн, выделенной иэ иитохондрий печени свиньи, и аниноксидазы, выделенной из бактерий «тамиа МеЫ1апозагс1па Ьагкег! 27 ( субстрат - гидрохлорид тирамина 1.10" М; рН 7.4: п=10; Р=0,95;Д =8*)

Наииенова- Объем, Активность. Обчая Общее Удельная

ние пре- ил ед/ка актив- содержа- активность,

парата ность, ние бел- ед/мг

ед ка, иг белка

Солвбилизиро-ванная ионо-аииноксидаза

35 ООО 380 ООО

240

1 800

Очищенная

ионоаминокси-

даза

35 000 220 ООО

1,9 115 000

Солвбилизиро-ванная анин-оксидаза

85 ООО 340 000

20 17 000

Очищенная аминоксидаза

28 000 110 000

3.4 32 000

- 8 -

С целью увеличения Живности фермента и его стабильности. полученная таким образом солвбилизированна'й MftC подвергалась дальнейшей очистке на колонке с гамма-(Н.Н -бис-карбоксиметиламино)-бета оксипропилцеллвлозой хлопковой. Молекулярная касса очищенного таким образом фермента составляет 1 200 ООО дальтон, его характеристика представлена в таблице. 1.

Нами был исследован новый источник аминоксидазы -бактерии мтамма Hethanosarcina barker 1 27. Применение этого источника фермента исключает использование пищевых продуктов, а выход, биомассы составляет 10-12 г/л культуральной «идкости. Значительное упрощение методики по сравнению с методикой выделения МАО из печени свиньи достигается за счет исключения ряда стадий. Это обусловлено тем. что разрумение клеточных оболочек.достигнутое механическим растиранием, является до-статочнми для выделения Фермента. После очистки фермента ультрафильтрацией через нуклеопорнуп мембрану с номинальным размером пор 100 000 дальтон под давлением 2 атмосферы мы получали фермент, который в далънейкем называем аминоксида-зой и характеристика которого представлена в таблице 1.

Из результатов, представленных в таблице 1. видно, что удельная активность солюбилизированной аминоксидазы в 10 раз вине удельной активности солюбилизированной №0. Однако, в ходе дальнейшей очистки и выделения высокомолекулярной фракции активность МАО возрастает в OS раз в отличие от 00, для которой активность увеличивается линь в два раза. Эти результаты подтвермдавт литературные данные об усложнении изофериентного состава МАО в эволюционном ряду [Третьяков A.B., 1988г.}.

Обработка МАО дигитонином является мягкой и в ыень-мей степени затрагивает липидное окружение активного центра А, более чувствительного к различным изменениям стабильности белковой молекулы, чем и объясняется сохранение соотношения скоростей дезаминирования [табл.2, поз.41: Дальнейшая очистка фермента приводит к увеличению активности по всей трем субстратам приблизительно в 85 раз. В отличие от моно-

Таблица 2

дезаминирование ионоаиинов Ферментными препаратами моноаминоксидазы и аминоксидазы (концентрация субстратов 1.10"2М; п=7; Р=0,95:4=9%)

N Наименование ферментного препарата

Дезаминирование, рхояь Ш/мг белка/30 мин

Тирамин

Серотонин

бензиламин

1. Фракция мито-хондриальных фрагментов

42(100%)

25(59%)

10(232)

2. Моноаминоксида-за, солвбилизи-рованная метил-зтилкетоноы

500(1002)

650(1322)

5С0(102%)

3. Моноаминоксида-за, солвбилизит рованная диги-тонином

1800(100%) 1800(100%)

400(24%)

4. Очинённая моно-аминоксидаза

215000(100%) 117000(105%) 27000(24%)

5. Солвбилизиро-ванная анинок-оксидаза

17000(100%) 17000(102%) 20000(116%)

.6. Очищенная амин-

оксидаза 32000(100%) 30000(94%) 3.5000( 107%)

аминоксидазы, выделенной из печени свиньи, аминоксидаза, выделенная из бактерий итамма МеМ1апозагс!па Ьагк'ег! 27, С табл.

2,поз.5,б] обладает приблизительно одинаковой активностью по отношению ко всем трем субстратам.

Зти особенности аминоксидазн позволяют использовать фермент в аналитических целях для определения суммы моноаминов.

С целью повышения стабильности, а также для удобства использования фермента была проведена работа по иммобилизации митохондрий печени свиньи, содержащих МАО, в желатине. Графики стабильности иммобилизованных в желатине препаратов представлены на рис.1. Отмечено, что при использовании в качестве носителя желатина срок хранения при 4 °С увеличивается в 8 раз по сравнению с нативными митохондриями.

График зависимости сохранения активности ферментных препаратов от времени

Рис. 1

1,2,3 - нативные митохондрии

4,5,6 - митохондрии, иммобилизованные в желатине

1,4 - субстрат - тирамин

-11 -

2.5 - субстрат - серотонин

3.6 - субстрат - бензиламин

Определены значения рН и температуры , при которых активность иммобилизованной моноаминоксидазы максимальна. Установлено, что значение оптимума рН меняется на 0,5 единицы, а температурный оптимум резко повымается от 20 до 50 °С (рис. 2). Это позволяет проводить исследования с иммобилизованным ферментным препартом при высоких температурах, что крайне важно для применения его в аналитических целях.

Зависимость активности препарата иммобилизованной моноаминоксидазы от температуры

АЛ 100

ГО

6 О ■

чо • 20

10 40 60

Рис. 2

80 Т . РС

1 - нативные митохондрии

- 12 -

2 - митохондрии, иммобилизованные в желатине

В ходе исследований наии была разработана методика иммобилизации очищенной высокомолекулярной моноаминок-сидазы в желатине с последующим связыванием глутаройм альдегидом. Получено положительное режение на изобретение "Способ получения ферментсодержащих пленок" Кг 4934132 от 10.01.1992 г.

Изучена субстратная специфичность иммобилизованных препаратов моноаминоксидазы. Активность препаратов определяли с субстратами - тирамином, серотонином, ббнзиламинок в конечной концентрации 1.10~А 11. Установлено, что при иммобилизации очищенной МАО соотношение скоростей дезаминирования по всей треи субстратам не меняется, а значения активностей меняется ли!ь в пределах погрешности эксперимента. Для мито-хоящриального препарата ссотномение скоростей дезаминирования меняется, активность по тирамину уменыается в 1.5 раза, а по бензиламину возрастает в 2 раза. Видимо, в ходе иммобилизации иитохондриальной МАО изменяется доступность активного центра связывания фермента. Иммобилизация в желатине меняет для митохондриального препарата и значения Км, представленные в таблице 3. Причем для реакции дезаминирования тирамина Км уменыается, а для серотонина и бензиламина возрастает. Однако, эти изменения незначительны. Для очищенной АО Км в два раза ниже, чем для очищенной МАО, что, вероятно, объясняется болыей доступностью центра связывания АО по сравнению с МАО.

Мы изучили влияние 13 новых производных изатина, содержащих ацетильные и метильные группы у гетероциклического атома азота, ацетил- и алкилзамещеннуи оксиминогруппу во втором положении на нативные митохондрии, солюбилизиро-ваннув и очищенную ионоаминоксидазы, а также на очищенную аминоксидазу .

Таблица 3

Характеристика кинетических параметров для моно-амкноксидазы и аминоксидаэн ( п=8; Р=0,95; Д =18%)

N Ферментный препарат

Км. МЛО

ииах, ыМ/мин.Ю"

Тира- Серо- Бен- Тира- Серо- Бен-мин то- зил- мин то- зил нин аиии нин амин

1. Митохондриаль-

ный препарат 20 1

1 1.5 0,8 0.3

2. Иммобилизованный ыитохонд- 15 5 риальннй препарат

2 1 0,9 0,7

Очинённая высокомолекулярная ыоно-аыиноксидаза

11

3900 3900 900

4. Иммобилизованная

высокоыолекуляр- 11 5

ная моноаминокси-

даза

3800 4000 900

5. Очищенная аминок-сидаза 6

0

5

Все рассмотренние соединения [табл.4] являются обратимыми ингибиторами. Причем для ионоаминоксидазы производные изатина [соедЛ-ШТ являются конкурентными ингибиторами, а производные бенэизатина [соед.УШ-ХПП - неконкурентными ингибиторами. Для аминоксидазы механизм действия производных бензизатина отличен - ингибиторы данной группы выступают как конкурентные, что е«е раз говорит о больней доступности активного центру связывания АО по сравнению с МАО.

Выявлено, что введение полярных заместителей в 3 положение изатина приводит к увеличению значения рК1 и возрастанию анти-КАО активности соответствующих соединений [соед.П.М1 табл.4].

Увеличение пленарного ароматического фрагмента в соединениях I и IX, II и К приводит к усилению Ш-ингибнру-ющего эффекта. Можно полагать, что повшение анти-КАО активности вызвано увеличением "гидрофобного взаимодействия" данных соединений с простетической группой фермента.

Установлено, что ингибирувщая способность исследованных соединений зависит не только от природы заместителей, но и от степени очистки фермента. Видимо, при очистке нарушается структура участков, окружающих активный центр и влияющих ка связь с полярными радикалами. Резкое увеличение ингибиторного действия изученных соединений на аминоксидазу еще раз говорит в пользу гипотезы о больвей доступности активного центра связывания фермента, что подтверждает также одинаковая скорость дезаминирования всех трех субстратов.

Таблица 4

Значение констаытм ингибирования (XI) для реакции деааммнировния гидрохлорида тирамина (1.10"* М) аминоксидазннми препаратами ацетил- и метил- ^

яроизводными изатина и их оксимов

К

N Химическая

стрнктдра инги- рК1

битора

Моноаминоксидаза Аминокси-

даза

Я , X -:-

нативнне сслвбили- очищенная очищен-ммтохонд- зирован- ная

рии ная

I Н МОСНз 2.7 2.5 2,3 3,9

II сн3 носна 2.5 2.5 1.7 -

III сосн3 носн3 2.3 2.0 - -

11} СНаСОШуОСНз 3.0 2.7 - -

и СН, ЯОСОСНз 3.5 2.8 1,3 -

VI С0СНА ЯОСОСНэ 2.7 2.7 1.5 4,3

ип СН3 ННдНС! 3.7 2.4 1.5 -

иш сн5 0 3,5 3,3 3,0 -

IX И нос н3 4,0 2.5 2,0 3,4

X сн3 НОСНз 3,1 2.5 - -

XI СОСНз ноенз 2,3 2.0 - -

XII сн3 НОСОСНз 3.3 3,0 2.5 -

XIII сосна насоснз 3.0 2,7 2,5 3.6

Изучено влияние сульфид-ионов на активность МАО и АО. Установлено, что сероводород и сульфид-ионы являются необратимыми ингибиторами изучаемых ферментов.

Расчитана бимолекулярная константа скорости взаимодействия (Кц ) фермента с необратимым ингибитором: Для МАО Кц - 4.101 моль ' .л.мин*' Для АО Кл - 2,5.10е моль"'.л.мин"1 Таким образом действие обратимых и необратимых ингибиторов на АО оказалось значительно более сильным, чем на МАО.

Нами разработан способ определения количеств сероводорода и сульфид-ионов в воздухе или другой анализируемой среде с применением Ферментного электрода. Получено лолоки-тельное ремение на изобретение "Способ определения концентрации сульфидов в физических средах" Иг 1146322 от 03.05. 1989 г. При использовании моноаыиноксидазных пленок предел обнаружения составляет 1.10* М. Применение аминоксидазных препаратов позволяет снизить предел обнаружения до 1.10~9 К.

В1В0Д1

1. Впервые выделен и очищен фермент аминоксидаза из бактерий итамма Kethanosflrclna barker 1 27. Активность выделенного фериента составляет 17 ООО ед/мг белка, при очистке активность возрастает в 2 раза и составляет 32 ООО ед/мг белка. В отличие от ранее известных бактериальных аминоксидаз, исследуемый фермент дезаминирует не только тирании, но и серотонин и бензиламин с одинаковыми скоростями.

2. В результате очистки выделена устойчивая высокомолекулярная Фракция щвноаминоксидази с молекулярной массой

1 200 ООО дальтон. Исследована субстратная специфичность МАО на разных стадиях очистки. Остановлено, что солвбилизация Фермента изменяет его субстратнув специфичность. Дальнейжая счистка фермента аффинной хроматографией не влияет на субстратнув специфичность моноаминоксидазы.

3. Проведена иммобилизация моноаминоксидазных препаратов в желатине. Показано,что при иммобилизации срок хранения при 4 °С увеличивается в 8 раз по сравнении с нативны-ми митохондриями. Значение температурного оптимума повивается от 20 до 50 0С. Оптимум рН меняется на 0,5. Впервые ни-мобилизована в желатине высокомолекулярная фракция моноаминоксидазы. Субстратная специфичность очищенной моноаминоксидазы при иммобилизации не меняется в отличие от нитохондри-альных препаратов.

4. Впервые исследовано ингийирувщее действие 13 производных изатина на реакцив дезаминирования тирамина под действием моноаминоксидазы различных степеней очистки и очищенной аминоксидазы. Показано, что все изученные соединения

- 18 -

являются обратимыми ингибиторами ферментов. При атом для производных изатина тип ингибирования конкурентный . а для производных бензизатина - неконкурентный I в случае использования моноаминоксидазы 1. Для аминоксидазн производные бензизатина выступают как конкурентные. Установлено, что при очистке МАО ингибирувщее действие исследованных соединений уменьшается.

5. Установлено, что сульфиды является необратимыми ингибиторами моноаминоксидазы и аминоксидазы [ бимолекулярная константа скорости взаимодействия^ необратимого ингибитора с ферментом - 4.103 моль'.л.мин и 2.5Л0* моль"1 .л мин"' для МАО и АО соответственно]. Разработан метод определения сероводорода и сульфидов в объектах окружающей среды с помощью ферментного электрода на основе моноаМиноксидазных и аминоксидазннх пленок. Предел обнаружения 1.10' М.

По материалам диссертации опубликованы следующие работы:

1. Гринберг Б.А.. Иедере Д.Г.. Лякса З.В., Дианова М.М., Прикрис A.A.. Гринмтёйн В.Я. Синтез некоторых оксин-долов и изучение их антимоноаминоксидазной активности. -Изв. АН ЛССР. Сер.Хим.. 1982. Nr 2. с. 223-226.

2. Гринберг 5.А.. Дианова М.М.. Цедере Д.Г. Изыскание новых ингибиторов моноаминоксидазы (МАО) модифицирование пятичленного кольца индола. - VI конференция биохимиков прибалтийских республик. Беларусской ССР и Ленинграда. Тезисы докладов. Рига. 1981.

3. Балцере Д.В.. Гринберг 5.А., Никольская Е.Б., Ягодина О .В., Святковский A.B.. Дианова K.M. Возможности применения мембран, содержащих моноаминоксидазу, для исследований в экологии и медицине.- Методы получения, анализа и применения

- 19 -

Ферментов. Тезисы докладов. Рига. 1990 г. с. 204.

4. Дианова М.М., Никольская Е.Б.. Ягодина О.В., Гринберг Б. А. Применение ферментного газочувствительного электрода для определения H^S в сточных водах. - Вторая Всесоюзная конференция по анализу неорганический газов. Тезисы докладов. Ленинград, 1990 г, с. 2?4.

5. E.B.Nlkolskaya, L.I.Kueusheva, O.U.Yagodlna. К.И. Dlanova, G.A.Evtugyn, R.R.Iskanderov, U.Z.Latypova. Directional »odiflcatlon of biosensor selectivity and sensitivity ior the solvation of particular analytical probleis. - Международная конференция " Сенсор/ Техно-93", Санкт-Петербург, 1993 г.

6. Балцере Д.П., Гринберг Б.А.. Гринберг А.А.. Дианова М.М., Никольская Е.Б.- Положительное ренение на изобретение "Способ определения концентрации сульфидов в физических средах" Нг 11463225 от 03.05.1989."

7. Гринберг Б.А.. Дианова М.М., Никольская Е.Б., Прикаане Э.А., Ягодина О.В. - Положительное ренение на изобретение "Способ получения Ферментсодержащих пленок" Нг 4934132 от 10.01.1992.

Подписано к печати № . Заказ J . Тирад ¿О Формат бумаги 60x84 I/IS, печ. л. Бесплатно,

й0-3. I9II04 С.-Петербург, Литейный пр., дом № 55.