Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Новые продукты липоксигеназного метаболизма в листьях льна

ВАК РФ 03.01.05, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "Новые продукты липоксигеназного метаболизма в листьях льна"

На правах рукописи

Блуфард Александр Сергеевич

НОВЫЕ ПРОДУКТЫ ЛИПОКСИГЕНАЗНОГО МЕТАБОЛИЗМА В ЛИСТЬЯХ ЛЬНА

005005339

03.01.05 - физиология и биохимия растений

- 8 ДЕК 2011

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Казань-2011

005005339

Работа выполнена в лаборатории оксилипинов Учреждения Российской академии наук Казанского института биохимии и биофизики Казанского научного центра РАН

Научный руководитель:

доктор химических наук, академик РАН

Гречкин Александр Николаевич

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Горшкова Татьяна Анатольевна (КИББ КазНЦ РАН, Казань)

доктор биологических наук Соловченко Алексей Евгеньевич (МГУ им. М.В. Ломоносова)

Ведущая организация:

Учреждение Российской академии наук Институт биологии моря им. A.B. Жирмунского ДВО РАН

Защита состоится 26 декабря 2011 года в 10°° часов на заседании диссертационного совета Д 002.005.01 по защите докторских и кандидатских диссертаций при Учреждении Российской академии наук Казанском институте биохимии и биофизики КазНЦ РАН по адресу: 420111, г. Казань, ул. Лобачевского, д. 2/31, а/я 30, тел/факс (843)2927347

С диссертацией можно ознакомиться в Центральной научной библиотеке Казанского научного центра РАН.

Автореферат разослан «25» ноября 2011 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук

■*А.Б. Иванова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Постановка проблемы и ее актуальность. Оксилипины - оксигенированные производные непредельных жирных кислот - играют важную роль в клеточной сигнализации, а также механизмах защиты растений. Исследование этих процессов имеет существенное теоретическое и практическое значение. Липоксигеназный каскад, источник оксилипинов, контролируется липоксигеназами и ферментами метаболизма гидроперекисей жирных кислот. Ключевыми ферментами липоксигеназного пути являются липоксигеназы (ЛОГ), включая 13(5)-липоксигеназу (ЕС 1.13.11.12) и 9(5)-липоксигеназу (ЕС 1.13.11.58). Липоксигеназы животных, водорослей, грибов и микроорганизмов используют в качестве субстрата С2о-жирные кислоты (например, арахидоновую кислоту), в то время как липоксигеназы растений катализируют превращение С^-жирных кислот (линолевой и а-линоленовой кислоты). Продукты первичного действия липоксигеназы - гидроперекиси жирных кислот - являются предшественниками таких важных биорегуляторов, как жасмоновая кислота в растениях [Blee, 2002] и лейкотриены у млекопитающих [Samuelsson,1997],

К ферментам липоксигеназного пути, утилизирующим гидроперекиси жирных кислот, относятся шдропероксидлиаза (ГПЛ), алленоксидсинтаза (АОС) и дивинилэфирсинтаза (ДЭС). Многие продукты действия этих ферментов являются значимыми биорегуляторами. В частности, достаточно хорошо изучена 12-оксо-ФДК -предшественник 7-изожасмоновой кислоты, а также собственно 7-изо-жасмоновая кислота и родственные соединения, «жасмонаты». Эта группа физиологически активных веществ составляет новый класс фитогормонов и играет важную роль в сигнализации, регуляции экспрессии генов и в синтезе «жасмонат-индуцируемых белков» (в том числе ингибиторов протеиназ), регуляции роста и старения [Mathew et al., 1977; Hamberg, Gardner, 1992].

Значение дивиниловых эфиров в эндогенной регуляции у растений не так хорошо изучено, как роль жасмонатов. Впервые дивиниловые эфиры (8£,r£,3'Z)-9-(I',3'-нонадиенилокси)-8-ноненовая (колнелевая) и ßE,VE,VZ,6'Z)-<)-(V,2\6"-нонатриенилокси)-8-ноненовая (колнеленовая) кислоты были открыты Галлиардом с коллегами при экспериментах in vitro с клубнями картофеля [Galliard, Phillips, 1972; Gaillard, Mathew, 1975]. Известно, что колнелевая и этеролевая кислоты ингибируют 9- и 13-липоксигеназы, соответственно [Corey et al., 1987; Weber et al., 1999]. Вебер с соавт. наблюдали специфическую экспрессию гена ДЭС и накопление колнелевой и колнеленовой кислот в листьях картофеля, зараженных патогеном Phytophthora infestons, и в листьях табака, зараженных вирусом табачной мозаики. Данные об ингибировании роста P. infestons колнелевой и колнеленовой кислотами позволили Веберу с соавт. предположить фунгицидную и протекторную роль дивиниловых эфиров и ДЭС [Weber et al., 1999].

До сих пор остается открытым вопрос о биологической роли оксилипинсодержащих сложных липидов. Наиболее изученными представителями этой

группы соединений являются арабидоцсиды. Они представляют собой моно- или дигалактозилдиацилглицерины, содержащие остатки (152)-12-оксо-10,15-фитодиеновой кислоты (12-оксо-ФДК) или динор-12-оксо-ФДК. Обнаружено участие арабидопсидов в механизмах защиты растений от патогенов. Таким образом, сведения о липоксигеназном каскаде в целом и его метаболитах в частности остаются весьма отрывочными. Это касается в первую очередь оксилипинсодержащих сложных липидов, в состав которых входят дивиниловые эфиры.

Цель и задачи исследования. Цель данного исследования: изучить липоксигеназный путь в растениях льна

Для достижения указанной цели были поставлены следующие задачи:

1. Выделить и идентифицировать основные метаболиты а-линоленовой кислоты в растениях льна.

2. Исследовать содержание этерифицированных оксилипинов в липидном составе листьев льна.

3. Изучить состав липидов, образующихся в листьях льна в ответ на дейтсвие экстремальных факторов.

Научная новизна работы. Полученные результаты расширяют представления о таком малоизученном классе соединений, как сложные оксилипины. Впервые показана активность дивинилэфирсинтазы в листьях льна, выделены и охарактеризованы метаболиты дивинилэфирсинтазного пути - (ш52)-этеролевая и (щ52)-этероленовая кислоты.

Впервые обаружена новая группа галактолипидов, содержащих этерифицированные остатки (со52Г)-этероленовой кислоты. Для этой группы соединений предложено тривиальное название линолипины. Были выделены, очищены и охарактеризованы четыре представителя этого семейства - 1-0-а-линоленоил-2-0-(со57)-этероленоил-3-0-(3-0-галактопиранозил-от-глицерин (линолипин А), 1,2-ди-0-(<й52)-этероленоил-З-О-р-В-галактопиранозил-от-глицерин (линолипин В), 1-0-этероленоил-2-0-(ш52)-а-линоленоил-3-0-р-0-дигалактопиранозил-5п-глицерин (линолипин С) и 1,2-ди-0-(<й52)-этероленоил-3-0-р-0-дигалактопиранозил-^л-глицерин (линолипин D).

Показано, что содержание линолипинов зависит от возраста растений. Кроме того, состав и содержание линолипинов претерпевает значительные изменения при инфицировании растений фитопатогенной бактерией Pectobacterium atrosepticum и замораживании-оттаивании.

Научно-практическая значимость работы. Изучение роли окислительного метаболизма С^-полиеновых кислот в жизнедеятельности растений имеет большое значение для понимания фундаментальных основ функционирования живых систем, а также для решения многих прикладных вопросов, связанных с использованием физиологически активных метаболитов как ростовых веществ, фунгицидов и др.

Полученные данные вносят вклад в понимание механизмов функционирования одной из ключевых сигнальных систем растения, способствующей его адаптации к неблагоприятным условиям.

Разработан комплекс подходов для выделения и очистки оксилипинсодержащих сложных липидов - потенциальных физиологически-активных веществ. Экспериментальные данные и методические приемы, изложенные в работе, могут быть использованы в учреждениях медицинского, сельскохозяйственного, биологического и биотехнологического профилей, занимающихся современными проблемами липидологии, изучением защитных и сигнальных систем растений, а также в учебном процессе при чтении курсов лекций по биохимии, физиологии растений и молекулярной биолоши в ВУЗах.

Связь работы с научными программами и собственный вклад автора в исследования. Работа проводилась с 2007 по 2010 гг. в соответствии с планом научных исследований КИББ КазНЦ РАН по теме «Липоксигеназы и цитохромы семейства CYP74: структура и роль в катализе биосинтеза оксидипинов - эндогенных биорегуляторов растений» (гос. регистрационный номер 01200901959). Исследования автора, как исполнителя данной тематики, поддержаны грантами РФФИ, программой «Молекулярная и клеточная биология» Президиума РАН и ВНШ академика А.Н.Гречкина. Научные положения и выводы диссертации базируются на результатах собственных исследований автора.

Апробация работы. Результаты диссертационной работы доложены на IV съезде Российского общества биохимиков и молекулярных биологов (Новосибирск, 2008); на международном симпозиуме «Липиды и оксилипины растений» (Казань, 2008); на Всероссийской научной конференции «Устойчивость организмов к неблагоприятным факторам внешней среды» (Иркутск, 2009); на Международном симпозиуме «Регуляторные оксилипины» (Швейцария, Лозанна, 2009); на III Азиатском симпозиуме по растительным липидам (Япония, Йокогама, 2009); на 13-й международной Пущинской школе-конференции молодых ученых "Биология - наука XXI века" (Пущино, 2009); на Четвертом съезде ВМСО с международным участием (Москва, 2009); на Третьем Европейском симпозиуме по липидным медиаторам (Париж, 2010); на Третьем Международном симпозиуме «Клеточная сигнализация у растений» (Казань 2011).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 11 работ, из них 2 статьи в зарубежных рецензируемых изданиях.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 135 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания объектов и методов исследования, изложения и обсуждения результатов, заключения, выводов и списка литературы. Список литературы включает 219 источников, из них 211 зарубежных. В работе представлено 4 таблицы и 42 рисунка

1. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

1.1 Материалы

В исследовании использовали немеченые линолевую и а-лииоленовую кислоты, a также соевую липоксигеназу тип V производства Sigma; боргидрид натрия и силилирующие реагенты производства Fluka (Букс, Швейцария); липазу Rhizopus arrhizus производства Boehringer (Мангейм, Германия). (9Z,11£,135)-13-гидроперокси-9,11-октадекадиеновую кислоту (13-ГПОД) и (9Z, 11 £, 15Z,13S)-13-гидроперокси-3-окса-9,11,15-октадекатриеновую кислоту (3-окса-13-ГПОТ) получали инкубацией линолевой и 3-окса-а-линоленовой кислот, соответственно, с соевой липоксигеназой при О °С, рН 9,0, при продолжительном барботировании кислородом, за которым следовали экстракция и очистка методом нормально-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии (НФ-ВЭЖХ). Растения льна (Linum usitatissimum L., сорт Новоторжский) вьфащивали в условиях вегетативного опыта в Казани летом 2007 и 2008 года. Для хранения листья льна фиксировали жидким азотом и сохраняли при -85 °С.

1.2 Инкубация бесклеточного препарата листьев и корней льна с линолевой кислотой, 13-ГПОД и с 3-окса-13-ГПОТ

Листья и корни 35-дневных растений льна (навеска массой 5г) измельчали в Tris/HCl буфере (рН 7,5) на гомогенизаторе Ultra-Turrax Т25 при температуре +4 °С. Полученный гомогенат центрифугировали на 15000g в течение 15 мин. Супернатант декантировали и немедленно использовали в качестве ферментного препарата в инкубации. Фементный препарат инкубировали с линолевой кислотой, 13-ГПОД или с 3-окса-13-ГПОТ в течение 40 мин при комнатной температуре.

1.3 Экстракция, предварительная очистка и дериватизация продуктов инкубации

Инкубационную смесь подкисляли уксусной кислотой до рН 6,0 и трижды экстрагировали смесью гексан - этилацетат 1:1 (по объему). Жирные кислоты выделяли из реакционной смеси и очшцали для анализа при помощи LC-NH2 картриджей Supelclean по методике, описанной ранее [Grechkin et al., 2007], и силикагельного картриджа Supelclean. Продукты метилировали диазометаном CH2N2, а также последовательно подвергали восстановлению боргидридом натрия, метилированию диазометаном и обработке силилирующей смесью, состоящей из пиридина -гексаметилдисилазан - триметилхлоросилана 2:1:2 (по объему).

1.4 Анализ и разделение продуктов

Метиловые эфиры продуктов (или восстановленные триметилсилильные производные) после предварительной очистки на картридже и дериватизации исследовали при помощи газовой хромато-масс-спектрометрии (ГХМС). Также, метиловые эфиры продуктов предварительно разделяли при помощи НФ-ВЭЖХ.

1.5 Получение липидного экстракта

Для выделения липидного экстракта листья льна выдерживали в кипящем изопропаноле в течение 10 минут. Затем полученный экстракт гомогенизировали.

Гомогенат центрифугировали в течение 5 минут при 8000 об/мин. Осадок повторно подвергали экстракции смесью гексан/изопропанол 1:1 и центрифугированию в тех же условиях. Надосадочную жидкость упаривали на три четверти по объему и отмывали от водорастворимых белков водой в делительной воронке. Отмытый экстракт усушивали и перерастворяли в смеси гексан/изопропанол 1:1.

1.6 Фракционирование липидного экстракта методом колоночной хроматографии

Липидный экстракт разделяли на фракции, соответствующие разным классам сложных липидов, используя колоночную хроматографию. Фосфолипиды элюировали смесью хлороформ/ацетон 9:1, i-алактолипиды - смесью ацетон/метанол 9:1, нейтральные липиды - этанолом. Для дальнейшего разделения каждую фракцию упаривали на роторном испарителе и перерастворяли в гексане.

1.7 Тонкослойная хроматография

Все фракции, собранные после колоночной хроматографии, прежде чем исследовать при помощи ВЭЖХ, предварительно анализировали методом тонкослойной хроматографии (ТСХ). Для этого использовали пластинки для ТСХ «Merck» (Германия) 20x20 см с концентрационной линией 2,5x20 см, на которую наносили образец.

1.8 Высокоэффективная жидкостная хроматография Галакголипидную фракцию экстракта листьев льна разделяли при помощи

обращенно-фазовой ВЭЖХ. Собранные после ОФ-ВЭЖХ фракции, соответствующие отдельным пикам продуктов с поглощением >-„«* 267 нм, повторно очищали при помощи нормально-фазовой ВЭЖХ. УФ-спектры соединений, очищенных с помощью ВЭЖХ, записывали с помощью диодно-матричного детектора SPD-M20A (Shimadzu).

1.9 Определение положения заместителей в глицериновом остатке молекул линолипинов

Для определения положения заместителей в глицериновом остатке молекул линолипинов проводили ферментативный гидролиз липазой Rhizopus arrhizus. Реакционную смесь экстрагировали смесью гексан/этилацетат 1:1. Продукты реакции разделяли методом твердофазной экстракции на аминном картридже. Экстракт высушивали, перерастворяли в смеси хлороформ/изопропанол 2:1 и пропускали через картридж, отделяя тем самым фракцию лизолинолипина. Затем смесью этилацетат/уксусная кислота 98:2 с картриджа элюировали жирнокислотную фракцию. Остаток жирной кислоты идентифицировали при помощи газовой хромато-масс-спектрометрии. Лизолинолипин определяли при помощи масс-спектрометрии с ионизацией в электроспрее.

1.10 Содержание этерифицированных дившшловых эфиров (ЭДЭ) в листьях льна в зависимости от возраста растений

Галактолипиды выделяли из листьев 14-, 23-, 35-, 63- и 76-дневных растений льна, очищали при помощи колоночной хроматографии, как было описано выше, и повторно очищали с использованием ТСХ. Исследовали широкие зоны с Rf 0,2-0,26 и 0,63-0,77,

содержащие дигалактозилдиацилгрицерины (ДГДГ) и моногалактозилдиацилглицерины (МГДГ), соответственно. Из силикагеля пластинок липиды элюировали метанолом. УФ-спектры ДГДГ и МГДГ записывали с использованием спектрофотометра Сагу 50 Bio. Количество ЭДЭ (галактолипид-связанной (ю52)-этероленовой кислоты) оценивалось по поглощению 267 нм.

1.11 Инфицирование растений льна фитопатогенной бактерией Pectobacterium atrosepticum

Клетки Р. atrosepticum SCRI1043 культивировали на среде LB [Bell et al., 2004]. Титр культуры 2х109 КОЕ/мл. Суспензию бактериальных клеток вводили инъекцией в стебель льна (по 10 мкл на стебель) на высоте 6 см от земли. Контрольным растениям вводили питательную среду. Листья собирали через 4 и 24 часа после инфицирования и фиксировали жидким азотом.

1.12 Влияние метилового эфира (ю5£)-этероленовой кислоты и (2£)-гексеналя на прорастание семян льна

Семена льна стерилизовали 0,05% раствором марганцевокислого калия (30 мин), промывали дистиллированной водой и проращивали в темноте при 23°С. Для определения ростовой функции семена проращивали на растворах (ю52Г)-этероленовой кислоты и (2£)-гексеналя в концентрациях 1 нМ и 1мкМ в течение 20 часов (оптимального интервала времени для регистрации проклюнувшихся семян). Семена льна проращивали в стерильных чашках Петри по сто семян в каждой. Каждый вариант опыта состоял из трех аналитических повторностей. О прорастании семян судили по проклевыванию. Используемые оксилипины растворяли в диметилсульфоксиде (ДМСО) [Takeda et al, 1998]. В контроль добавляли равное опытному варианту количество растворителя.

1.13 Выделение гексеналя листьями льна

Для детектирования выделения гексеналя листьями льна навеску листьев поместили в грушевидную делительную воронку, расположенную горизонтально. С одной стороны через плотно пришлифованную пробку с отводом в течение 20 минут подавали поток воздуха, с другой стороны все летучие соединения выводились в предварительно подготовленный №12-картридж, на который был нанесен 0,2 мМ О-(2,3>4,5,6-пентафторбензил)-гидроксиламин (ПФБ). Затем продукты взаимодействия летучих соединений с ПФБ элюировали с картриджа метанолом, экстрагировали гексаном и анализировали при помощи ГХМС.

1.14 Спектральные исследования УФ-спектры выделенных продуктов записывали на спектрофотометре Perkin Elmer Lambda 25. Также, УФ-спектры оксилипинов записывали с использованием детектора с диодной матрицей SPD-M20A (Shimadzu) в режиме реального времени в ходе разделения на ВЭЖХ. Анализы методом ГХМС проводили при помощи масс-спектрометра Shimadzu QP5050A, соединенного с газовым хроматографом Shimadzu GC-17A. Масс-спектры высокого разрешения очищенных галактолипидов

регистрировали с использованием масс-спектрометра Bruker microTOF-Q с ионизацией в электроспрее (ESI-MS). Спектры 'Н ЯМР и 2D-COSY очищенных соединений записывали на ЯМР-спектрометре Bruker Avance 400, 400 MHz, в растворителе CD3CN при температуре 296 К.

2. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 2.1 Изучение направленности метаболизма линолевой кислоты в листьях

льна

Для предварительного исследования липоксигеназного пути, проводили инкубацию супернатанта гомогената листьев льна с линолевой кислотой [Chechetkin et al., 2008]. Продукты инкубации подвергали метилированию, восстановлению водородом и силанизации. ГХМС анализ дериватизированных продуктов показал, что

Рис.1. Продукты взаимодействия ДЭС льна с Рис.2. ГХМС анализ оксилипинов, выделенных линолевой кислотой, ее 13-гидроперекисью и после инкубации 13-ГПОД с супернатантом аналогом а-линоленовой кислоты - 3-окса-а- гомогената листьев льна, (а) Хроматограмма по линоленовой кислотой полному ионному току; (б), (в), (г) - масс-спектры

и схемы фрагментаций соединенй 1а, 4 и 2а, соответственно

преобладающей гидроксикислотой была 13-гидроксистеариновая кислота Это говорит о том, что основным продуктом липоксигеназного окисления была 13-гидроперекись линолевой кислоты (13-ГПОД). Таким образом, в листьях льна преобладает 13-липоксигеназная активность. Наряду с гидроперекисями жирных кислот, в ходе ГХМС анализа выделенных оксилипинов обнаружены соединения 1а, 2а и За (Рис.1).

Для дальнейшего изучения путей метаболизма проводили инкубацию 13-ГПОД с супернатангом гомогената листьев льна. В результате ГХМС анализа триметилсилильных метиловых эфиров продуктов инкубации обнаружены оксилипины 1а, 2а и За.

2.2 Идентификация соединения 1

Соединение 1а (Рис.2а) являлось основным продуктом превращения линолевой кислоты in vitro. Для изучения его структуры регистрировали масс-спектр электронного удара. Картина масс-спектрометрической фрагментации продукта 1 а (Рис.2б) оказалась идентична описанным ранее фрагмекгациям дивиниловых эфиров (9Z,ll£,r£)-12-(l'-гексенилокси)-9,11-додекадиеновой (этеролевой) [Grechkin et al., 1997] и (w5Z)-этеролевой кислот [Hamberg, 1998].

Каталитическое восстановление водородом соединения 1а привело к образованию продукта 4 с характеристической фрагментацией (Рис. 2в). Эти данные позволили идентифицировать соединение 4 как 13-окса-нонадекановую кислоту.

Очищенное соединение 1а обладает специфическим поглощением в УФ-диапазоне с максимумом при 250 нм, что характерно для этеролевой кислоты [Grechkin et al., 1995; Hamberg; 1998]. Для окончательной идентификации и определения геометрии двойных связей продукта 1а регистрировали спектры 'Н-ЯМР и 2D-COSY. Данные демонстрируют, что в структуре присутствуют три двойные связи с конфигурацией (1 Z,3£,1'Z). Значение константы спин-спинового взаимодействия (6 Гц) показывает, что Г-двойная связь имеет цис-конфигурацию. На основе полученных данных сделан вывод, что соединение 1 является (9Z, 11£,1 'Z)-12-( 1 '-гексенилокси)-9,11 -додекадиеновой, то есть (ш52)-этеролевой кислотой.

2.3 Идентификация соединения 2

Соединение 2 поглощает в УФ-диапазоне с максимумом при 267 нм. Масс-спектр электронного удара метилового эфира продукта 2 показал молекулярный ион с m/z 306 (Рис.2г) и картину фрагментации, схожую с фрагментацией метиловых эфиров этероленовой [Grechkin et al., 1997] и (ш52)-этероленовой кислот [Hamberg, 1998]. Каталитическое восстановление соединения 2а привело к образованию уже описанной выше 13-окса-нонадекановой кислоты. Таким образом, исходя из разницы масс молекулярных ионов соединений 4 и 2а, сделан вывод, что последнее имеет четыре двойные связи. Их положение и геометрию устанавливали на основании спектров 'Н-.ЯМР и 2D-COSY (Рис.Зс!). На основании полученных данных сделан вывод, что соединение 2 является (92,11 £, 1 '2,3 '2)-12-( 1 ',3'-гексадиенилокси)-9,11-додекадиеновой, то есть (о)52)-этероленовой, кислотой. Для дальнейшего подтверждения активности

и

ДЭС in vitro и биосинтеза (со52)-этероленовой кислоты в листьях льна провели инкубацию гомогената листьев льна с 13-гидроперекисью 3-окса-а-линоленовой кислоты. 3 -Окса-а-линоленовая кислота - это недавно синтезированный и охарактеризованный аналог а-линоленовой кислоты, используемый в качестве метки для изучения биосинтеза оксилипинов.

Рис.3. Анализ оксилипинов, выделенных после инкубации 3-окса-13-ГПОТ с супернатантом 15000 g гомогената листьев льна, (а) Хроматограммы продуктов по полному ионному току; (б), (в) - масс-спектры и схемы фрагментации соединений Sa и 7, соответственно; (г) данные 'н ЯМР для соединения 2а (400 MHz, CD3CN, 298 К)

Провели инкубацию супернатанта гомогената с 3-окса-13-ГПОТ. Анализ метиловых эфиров продуктов инкубации методом ГХМС позволил обнаружить (наряду с эндогенным метиловым эфиром (ш5г)-эгеролеиовой кислоты) присутствие новых продуктов 5 и 6 в виде их метиловых эфиров 5а и 6а (Рис.3). По данным масс-спектра электронного удара соединения 5а предложена схема его фрагментации, изображенная на Рис.ЗЬ. Каталитическое восстановление соединения 5а привело к образованию продукта 7, по масс-спектрометрической фрагментации которого установили, что это 3,13-диокса-нонадекановая кислота. Полученные результаты подтверждают идентификацию соединения 5 как 3-окса-(ш52)-этероленовую кислоту.

Эксперимент с 3-окса-13-ГПОТ подтверждает присутствие активности ДЭС и эндогенной (ю52>этероленовой кислоты в листьях льна. Сравнение хроматограмм по полному ионному току показало, что содержание эндогенной (ю52)-этероленовой кислоты в листьях достигает 10% от общего количества свободных жирных кислот.

2.4 Идентификация соединения 3

Масс-спектр метилового эфира соединения 3 выявил характеристическую картину фрагментации, идентичную описанной для метилового эфира уис-12-оксо-10,15-фитодиеновой кислоты (12-оксо-ФДК) [Hamberg, 1998]. Каталитическое восстановление над платиной привело к образованию соединения 8. Его масс-фрагментация (Рис. 4в) свидетельствовала о том, что соединение 8 представляет собой 12-оксо-фитоновую кислоту - полностью восстановленный аналог 12-оксо-ФДК. Таким

образом, полученные данные показали, что соединение За является метиловым эфиром </йс-12-оксо-ФДК.

J11У ЫТх,, х и ,1 „ л... х.......I

«яда»» m/i

W! J

ffcc-

ж\

м*

,?t?.....^„.ЯР,,

Ж

т/г

**L

/^ГГ^^-^О^СООМ«

*И|

мг!

м*

■ж.

эм ж m/i «о m m щ/%

Рис.4. Масс-спектры и схемы фрагментации для соединений За (а); ба (б); 8 (в) и 9 (г). Соединения 8 и 9 являются продуктами каталитического восстановления соединений За и 6а, соответственно

В результате инкубации супернатанта гомогената листьев льна с 3-окса-13-ГПОТ наряду с соединением 3 и дивиниловыми эфирами образовался продукт 6, масс-спектр метилового эфира которого и схема фрагментации представлены на Рис. 4.

Полученные данные позволили установить, что соединение 6 является З-окса-12-оксо-ФДК, то есть производным 12-оксо-ФДК, полученным в результате ферментативного превращения 3-окса-13-ГПОТ. Каталитическое восстановление соединения 6а привело к образованию соединения 9, масс-спектр и схема фрагментации которого позволили идентифицировать вещество как З-окса-12-оксо-фитоновую кислоту. Полученные данные показывают, что добавленная экзогенно 3-окса-13-ГПОТ послужила предшественником циклопентенона 6, З-окса-12-оксо-ФДК.

2.5 Биосинтез оксилипинов in vitro в гомогенате корней льна

Проводили инкубацию супернатанта гомогената корней льна с линолевой кислотой. ГХМС анализ триметилсилильных производных метиловых эфиров продуктов инкубации показал присутствие а-кетола как основного продукта и небольшое количество метилового эфира 12-оксо-ФДК. По характеристической картине фрагментации а-кетола установлена его структура - (92)-12-оксо-13-гидрокси-9-окгадеценовая кислота Дивиниловые эфиры в корнях не обнаружены.

2.6 Изучение состава липидного экстракта листьев льна

Липидный экстракт листьев 35-дневных растений льна разделяли на классы при помощи колоночной хроматографии на силикагеле: нейтральные липиды, галактолипиды, фосфолипиды [Chechetkin et al., 2009]. УФ-спектр фосфолипидной фракции не показал присутствия этерифицированных 12-оксо-ФДК (>^ах 221 нм) и (со57)-этероленовой кислоты (Хт^ 267 нм).

Моногапактозилдиацилглицерин (МГДГ) и дигалакгозилдиацилглицерин (ДГДГ) выделены из галакголипидной фракции при помощи микропрепаративной тонкослойной

хроматографии. УФ-спектр как МГДГ, так и ДГДГ показал сильное поглощение при 267 нм и отсутствие поглощения с максимумом 221 нм, что позволило предположить присутствие дивинилового эфира (о)5/)-этеролеиовой кислоты, связанной с галактолипидами.

Для проверки этой гипотезы, разделяли молекулярные виды галактолипидов при помощи обращенно-фазовой ВЭЖХ, используя запись УФ-спектра в режиме реального времени с помощью диодно-матричного детектора. В гапактолипидной фракции, выделенной из неинфицированных листьев льна, наблюдался только один молекулярный вид, поглощающий при 267 нм. Инфицирование растений клетками фитопатогенной бактерии Рес1оЬас1егшт МгойерИсит привело к изменению галактолипидного профиля. Через 4 часа после инфицирования в липидном профиле появились два новых молекулярных вида

галактолипидов, а через 24 часа наблюдались более значительные изменения. В частности отмечалась депигментация листьев. Кроме того, наряду с молекулярными видами 10 и II, наблюдали появление соединений 12 и 13. Все упомянутые продукты обладали сильным поглощением в УФ-диапазоне с максимумом 267 нм, что свидетельствовало об обнаружении этерифицированных дивиниловых эфиров (Рис.5).

Ни в инфицированных растениях, ни в контрольных не наблюдалось присутствие молекулярных видов галактолипидов с максимумом поглощения 221 нм. Это говорит об отсутствии арабидопсидов или схожих галактолипидов, содержащих этерифицированную 12-оксо-ФДК. ГХМС анализ метиловых эфиров жирных кислот, полученных в результате переэтерификации галактолипидов, не показал присутствия 12-оксо-ФДК. Подробнее инфицирование растений льна клетками Рес1оЬас1епшп сигоьерасит рассматривается в главе 2.13.

Для дальнейшего установления структуры при помощи обращено-фазовой ВЭЖХ выделяли соединения 10, И, 12 и 13 и очищали с использованием нормально-фазовой ВЭЖХ.

г» за ао к до и и

Время удерживания, мин

Рис.5. ОФ-ВЭЖХ профиль молекулярных видов галактолипидов листьев льна. А) неинфицированное растение, В) инфицированное растение (через 4 часа после инфицирования), С) инфицированное растение (через 24 часа после инфицирования)

2.7 Идентификация соединения 10, лииолипина А

УФ-спектр очищенного соединения 10 показал поглощение с максимумом при 267нм и был идентичен вышеописанному дивиниловому эфиру (а)52)-этероленовой кислоте [Hamberg, 1998].

В результате ГМХС анализа метиловых эфиров жирных кислот - полученных переэтерификацией соединения 10 - были выявлены метиловые эфиры а-линоленовой и (м52)-этероленовой кислот. Чтобы подтвердить структуру (<а52)-этероленовой кислоты, мы изучили ее масс-спектр. По данным масс-спектрометрии электронного удара, спектр метилового эфира продукта переэтерификации соединения 10 идентичен спектру ранее описанного метилового эфира (со52)-этероленовой кислоты. Кроме того, по данным ГХМС анализа, каталитически восстановленные метиловые эфиры жирных кислот после переэтерификации представляли собой метилстеарэт и метиловый эфир 13-окса-нонадекановой кислоты. Образование последнего соединения указывает на присутствие (<й57]-зтероленовой кислоты среди продуктов переэтерификации.

3 он л'. ,

ir*

E3I-M& ш1жц2плышх mwi I

¡K-ИТ «Л т.ш

ИГ.Г-.1Г-tt-.u-.ir-.i«-,«- (ЯН)

яксидаг ■лиша

Отщегокнге Ши(а52)-эгероленмой кислот

яЛ mim я/г гния

W „

w и» "» S.

w ipJV

(Щ/

'/I4/

им

11000 10000 <000

Jj+L

4000 .9000 i их» 1100»

ж «o

Я

S00 (000

в

277л 20 2S1.1I«

тмп

не „ пи

ШШ1

Ы 4.D

Химический сдомг.мд.

290 «м мо мо ш в»

Рис.6. Данные масс-спеюрометрии высокого Рис.7. Область низких полей спектра 'Н ЯМР разрешения с ионизацией электроспреем и MS /MS линолипинов. Частичный спеетр для а) для соединения 10. а) Схема фрагментации иона лииолипина А и б) линолипина В. Сигналы [М-Н]\ m/z 787,4909 в режиме отрицательных выше 5,25 м.д. принадлежат олефиновым ионов и MS /MS; б) полный ESI-масс-спектр протонам, а ниже 5,25 м.д. - протонам соединения 10 в режиме отрицательных ионов; в) глицеринового и галактозильного остатков, спектр MS/MS от иона т/г с 787,4909 Отнесение всех сигналов было установлено по

данным 2D-COSY

Масс-спектр соединения 10 с ионизацией в электроспрее в режиме отрицательных ионов (Рис.6) дал квазимолекулярный ион [М-Н]" с miz 787,4909 (С45Н71О11) и аддукт [М+СН3СОО]- с m/z 847,5229 (С47Н75Оп). MS/MS спектр от иона с m/z 787,4909 показал ионы с m/z 291,1954 (С18Н2703, анион («>52)-этероленовой кислоты) и с m/z 277,2120 (С18Н2902, анион а-линоленовой кислоты). В результате съемки в режиме

положительных ионов был обнаружен ион [M+NH4]+ с m/z 806,5418 (C^HjsOhN). MS/MS от иона с m/z 806,5418 привела к образованию характеристического фрагмента с m/z 529,3287 (C27H47O9N, потеря остатка а-линоленовой кислоты). В результате обработки данных МС и ЯМР (Рис.7а) установлено, что соединение 10 представляет собой моногалактозилдиадилглицерин (МГДГ) с брутго-формулой С45Н72О11, содержащий один остаток а-линоленовой кислоты и один - (<o5Z)-этероленовой. Однако, ни данные МС, ни ЯМР не позволяют установить точное положение остатков а-линоленовой и (ш52)-этероленовой кислот в молекуле глицерина.

С тем, чтобы уточнить их расположение, проводили региоспецифичный гидролиз с использованием sn-i-специфичной липазы Rhizopus arrhizus. По данным ГХМС анализа, в результате действия липазы отщеплялась только а-линоленовая кислота. В то же время, при обработке соединения 10 неспецифичной липазой Mucor javanicus высвобождались обе жирные кислоты, и а-линоленовая, и (со52Г)-этероленовая. Полученные данные демонстрируют, что остатки а-линоленовой и (а>52)-этероленовой кислот этерифицированы в положениях sn-1 и sn-2, соотвественно. Полученные для соединения 10 результаты, показывают, что вещество представляет собой 1-О-а-линоленоил-2-0-(а)52)-этероленоил-3-0-р-В-галакгопиранозил-5,«-глицерин. Это

первый представитель нового семейства сложных оксилипинов - гапактолипидов, содержащих этерифицированные дивиниловые эфиры. Нами предложено тривиальное название линолипин А для соединения 10 и общее название линолипины для этого нового семейства сложных оксилипинов.

2.S Идентификация соединения 12, линолипина В

но он " 1

ESl-MS-Режим отрицательных юно* |

(К.(Г tn'i ммт

12"" 1.....

Соеяшм«м12 W

pi+ov^wr

Я1^М14М

Отчеллвя«(в>5г)-этероленс»ов кислот

,1И1 6

иымв

«нлда ■

Рис.8. Данные масс-спеюромегрии высокого разрешения с ионизацией в электроспрее и MS/MS для соединения 12. а) Схема фрагментации иона [М-Н]\ m/z 801,4765 в режиме отрицательных ионов и MS /MS; б) полный ESI-масс-спектр соединения 12 в режиме отрицательных ионов; в) спектр MS/MS от иона m/z с 801,4765

Соединение 12 имело спектр УФ поглощения, идентичный спектру соединения 10. Однако, в отличие от линолипина А, в результате переэтерификации соединения 12, наблюдался только один продукт, а именно метиловый эфир (ö>5Z)-этероленовой кислоты. Его идентификация подтверждена

образованием 13-окса-нонадекановой кислоты в результате каталического восстановления продукта

переэтерификации. Масс-спектр

соединения 12 (электроспрей) в режиме отрицательных ионов (Рис.8) дал квазимолекулярный ион [М-Н]' с m/z 801,4765 (С45Н69012) и ион аддукта (M+CHiCOO] с m/z 861,4909

(С47Н73О14). В режиме MS/MS квазимолекулярный ион m/z 801,4765 диссоциировал с образованием иона при m/z 291,1951 (CieH270j, анион (ю5.2Г)-этероленовой кислоты). При съемке в режиме положительных ионов наблюдался ион [M+NH4]+ с m/z 820,5231 {C45H760,,N). По результатам полученных данных масс-спектрометрии высокого разрешения, а также данных MS и MS/MS, соединение 12 представляет собой моногалактозилдиацилглицерин с бругго-формулой C45H7oOi2, в структуре которого содержится два остатка (ю52)-этероленовой кислоты.

Данные 'Н ЯМР и 2D-COSY для соединения 12 оказались весьма схожими с таковыми для линолипина А (Рис.7б). Во-первых, в спектре присутствовали идентичные сигналы глицерина и ß-D-галактопиранозильного остатка. Во-вторых, присутствовали те же восемь сигналов олефиновых протонов остатка (о)52)-этеролеповой кислоты в области 5,25 - 5,80 м.д. Однако, наблюдались значительные отличия. В частности, в спектре соединения 12 отсутствовал мультиплетный сигнал олефиновых протонов а-линоленовой кислоты. Это указывает на отсутствие а-линолената в составе соединения 12, что полностью согласуется с данными MS и MS/MS. Кроме того, интегральная интенсивность олефиновых сигналов в спектре соединения 12 вдвое выше интенсивности сигналов тех же протонов соединения 10. Это говорит о том, что соединение 12 содержит два остатка (ш52>этероленовой кислоты этерифицированных в положениях sn-! v.sn-2 остатка глицерина.

По результатам полученных данных установлено, что соединение 12 представляет собой МГДГ, содержащий два остатка (ю52)-этероленовой кислоты, то есть 1,2-ди-О-(ю52)-этероленоил-3-0-Р-0-галактопиранозил-5п-глицерин. Мы предложили для этого соединения тривиальное название линолипин В.

2.9 Идентификация соединения 11, линолипина С

Как и первые два линолипина, соединение 11 поглощает в УФ-диапазоне с 267 нм. ГХМС анализ метиловых эфиров продуктов переэтерификации показал наличие в структуре соединения 11 и а-линоленовой, и (<в5Z)- этероленовой кислот.

Масс-спектр соединения 11 с ионизацией в электроспрее в режиме положительных ионов показал пик аддукта молекулярного иона с аммонием (Рис.9) [M+NH4]+ с m/z 968,6018 (Cs,Hg6Ol6N). По данным 'Н ЯМР и 2D-COSY это соединение сходно с линолипином А и имеет идентичные сигналы протонов а-линоленовой и (o5Z)-этероленовой кислот, однако дополнительные сигналы протонов в области от 2,8 до 4,7 м.д. говорят о наличии второго остатка галактозы в молекуле линолипина

На рис.10 приведены спектры 'Н ЯМР линолипинов А и С. Хорошо виден характерный пик сигнала протона при первом атоме углерода второго остатка галактозы HI""'(4,84 м.д.). Сигналы остальных протонов, относящиеся ко второму остатку галактозы, перекрываются с сигналами протонов глицерина и первого остатка галактозы. Благодаря отнесению кросс-пиков спектра 2D-COSY и данных одномерного ЯМР удалось расшифровать этот фрагмент спектра Пики протонов жирнокислотной части соединения 11 идентичны аналогичным пикам линолипина А.

Таким образом, исследуемое соединение представляет собой дигалактозилдиацилглицерин, у которого один заместитель - а-линоленовая кислота, а другой - (о)52)-этероленовая. Для того чтобы установить положение заместителей в молекуле глицерина, проводился ферментативный гидролиз соединения 11 хи-1 специфичной липазой ЯЫгориэ апМтиь. В результате ГХМС анализа метиловых эфиров

1+

шм1 1м+нн,г

1

4МКП-

амто-

30000-2ЯЮ0-2000015000'

1 +

982,6763

Рис.9. Данные масс-спеетрометрии Рис.10. Спектры 'Н ЯМР линолшшнов А (сверху) и С высокого разрешения с ионизацией в (снизу) электроспрее для соединения 11

жирных кислот - продуктов гидролиза - установлено, что из «л-1 положения гидролизуется (ш52)-этероленовая кислота Таким образом, соединение 11 представляет

собой 1-0-((о52)-этероленоил-2-0-а-линоленоил-3-0-р-0-дигалактопиранозил-да-

глицерин.

2.9 Идентификация содинения 13, линолипина Ю

Соединение 13, как и три предыдущих, показало в УФ-спектре максимум поглощения при 267нм. ЕБГ-масс-спектр соединения 13 дал аддукт [М+ЫН4Г с т/2 982,6. По данным масс-спектрометрии высокого разрешения (Рис.11) точная масса иона [М+МН4]+ составила 982,6763, что соответствует брутго-формуле С5,Н840,7К. Таким образом, молекулярный ион соединения 13 имеет брутго-формулу С5)Н8оОп. Олефиновая часть 'Н ЯМР спектра соединения 13 (Рис. 12) подобна той

т/г

Рис.11. Данные масс-спекгрометрии высокого разрешения с ионизацией в элеироспрее для соединения 13

же области спектра ЯМР для линолипина В. Интенсивность сигналов протонов (ш52)-этероленовой, а также отсутствие сигналов а-линоленовой кислот в области спектра, характерной для олефинов, указывает на присутствие двух остатков (а>52)-

этероленовой кислоты. Часть спектра, характерная для сигналов протонов галактозы,

Рис.12. 'НЯМР спектр соединения 13 показывает, что в структуре соединения 13 присутствует два остатка галактозы. В частности, четко виден пик сигнала протона при первом атоме углерода второго остатка галактозы 4,83 м.д. Идентификация сигналов протонов подтверждается данными спектра 2С-С08У. Таким образом, соединение 13 представляет собой дигалактозилдиацилглицерин, содержащий два остатка (ю5г)-этероленовой кислоты, то есть 1,2-ди-0-(ш52)-этероленоил-3-0-р-0-дигалактопиранозил-.?«-глицерин.

2.10 Изменение галактолипидного профиля в результате повреждения листьев льна однократным циклом замораживания-оттаивания

По данным литературы [АпсЬжоп а1., 2006], образование новых сложных оксилипинов, ацилированных по галактозе, происходит в ответ на реакцию сверхчувствительности, вызванной распознаванием ауг-белков микробного происхождения. При этом авторы отмечали, что в их биосинтезе принимает участие фермент МГДГ-ацилтрансфераза. Ранее считалось, что этот фермент не имеет физиологического значения, поскольку он активируется при нефизиологических условиях, такие как низкий рН и незабуференная система. В нашем случае быстрое замораживание в жидком азоте с последующим оттаиванием в течение 30 минут при температуре 23°С позволяет моделировать процесс клеточного повреждения

25.0

50.0

■рам тарншмш, имя

Т5.0

[М*Ш,1* 1094.7179

[мчии- 1«у59>

он он

Рис.13. Галакголипидиый профиль экстракта листьев Рис.14. Масс-спектры высокого разрешения льна после однократного цикла замораживания- соединений 14 (а), 15(6) и 16(в). Лз, Лз -опаивания остатки а-линоленовой или («5/0-

этероленовой кнслогг.

сз ш мдо

[Аг^егеЬасЬ ел а1, 2002]. Проведенный нами ВЭЖХ анализ показал, что в результате повреждения листьев льна в этих условиях происходит как образование уже описанных линолипинов А, В, С и О, так и появление в галакголипидном профиле новых, менее полярных соединений 14, 15 и 16 (Рис.13).

Все эти соединения имеют максимум поглощения в УФ-диалазоне при 267 нм, что говорит о присутствии, по крайней мере, одного остатка (<о52Г)-этероленовой кислоты в их структуре. При помощи масс-спектрометрии высокого разрешения (Рис.14) установлены точные массы этих соединений. На основании данных хроматографии, УФ-спектроскопии и масс-спектрометрии выдвинуто предположение, что соединения 14, 15 и 16 являются ацилированными по галактозе моногалактозилдиацилглицеринами, имеющими в своей структуре три, два и один остатка (о)52)-этероленовой кислоты, соответственно.

2.11 Возрастная зависимость содержания линолипинов в листьях льна

До сих пор малоизученным остается вопрос о физиологической роли сложных оксилипинов, особенно их участие в онтогенезе. Мы изучили содержание линолипинов в листьях льна на различных стадиях развития растения (Рис.15).

В молодых листьях льна (14- и 23-дневных) не наблюдалось присутствие этерифицированных дивиниловых эфиров. Однако, линолипины были обнаружены в листьях льна на более поздних стадиях онтогенеза, включая период быстрого роста (35 дней), бутонизацию (63 дня) и цветение (76 дней). Содержание этерифицированных дивиниловых эфиров (ЭДЭ) в листьях на этих стадиях развития растений составляло 5071 нмоль на грамм сырого веса.

Отсутствие ЭДЭ в молодых листьях согласуется с отсутствием свободной (ю52Г)-этероленовой кислоты. В связи с этой зависимостью содержания ЭДЭ и активности ДЭС нам представлялось интересным изучить влияние метилового эфира (<в57)-этероленовой кислоты и (2£)-гексеналя (продукт деградации (ю52)-этероленовой кислоты) на прорастание семян льна.

2.12 Влияние метилового эфира (и52)-этероленовой кислоты и (2Е)-гексеналя на прорастание семян льна

Степень прорастания семян, замоченных на 20 часов в присутствии метилового эфира (<й520-зтероленовой кислоты (1нМ и 1мкМ), уменьшалась вдвое по сравнению с контролем (Рис.16). (2£)-гексеналь (1нМ и 1мкМ) вызывал 49 и 100% ингибирование прорастания семян, соответственно. Эффекты ингибирования были статистически

Возраст растений льна, дик

Рис.15. Содержание линолипинов в листьях льна. Содержание ЭДЭ оценивалось по УФ-поглощению фракций МГДГ и ДГДГ с Хж 267 нм

достоверными (Р < 0.05). Таким образом, взаимосвязь между онтогенезом и содержанием линолипинов представляется неслучайной.

2.13 Влияние инфицирования на содержание линолипинов

По данным литературы известно, что уровень содержания арабидопсидов увеличивается при инфицировании или поранении растения [Агк!е:^оп е1 а1., 2006]. Это побудило нас исследовать влияние инфицирования на содержание линолипинов в листьях льна. Показано, что инфицирование растений льна бактерией Рес1оЬас1епит атзер^сит индуцирует накопление ЭДЭ в листьях.

Рис.16. Процент прорастания семян льна в Рис.П. Влияние инфицирования растений льна зависимости от воздействия (ш52>этероленовой бактерией Р. аройерЧсшп на содержание кислоты и (2Е)-гексеналя. линолипинов в листьях. Черные столбцы -

инфицированные растения; белые столбцы -контрольные (необработанные) растения; светлосерые столбцы - второй контроль - растения, которым ввели питательную среду.

Через четыре часа после инфицирования, уровень содержания ДГДГ и МГДГ увеличился в 3 и 5,5 раз, соответственно. Через 24 часа после инфицирования содержание ЭДЭ значительно выросло (Рис.17), свыше 800 нмоль на грамм сырого веса. Накопление линолипинов достоверно (Р<0,01) в отношении двух контролей: а) необработанных растений и б) растений, которым введена среда, не содержащая бактериальные клетки. (Рис.П).

2.14 Деградация (ою/)- этероленовой кислоты и линолипинов

Ранее было показано, что дивиниловые эфиры неустойчивы в кислотной области рН (ОаШагё ел а1., 1974). Нами проведён сравнительный анализ степени распада при рН 5,5 линолипинов А и В, (ш52Г)-этероленовой кислоты и ее метилового эфира.

Степень деградации оценивалась при помощи спектрофотометрии при 267 нм, что соответствует максимуму поглощению (а>52)-этероленовой кислоты. Показано, что этерификация карбоксильной группы стабилизирует (т52)-этероленовую кислоту. Исходя из этих соображений, можно предположить, что линолипины более стабильны,

чем (оэ52)-зтероленовая кислота. Однако показано, что линолипин А за 7 минут распадается примерно на 45%, а линолипин В на 80% (Рис.18).

[ зоо-[гзо ! 200 ! 1» | 1» [ 60 ; 0

(йгёД-ттеро.-каоам кнсло-п мелшмйэфмр

кяслст*

3 4» Врми^нн)

Рис.18. Деградация линолипинов А и

Таким образом, можно предположить, что стерическая загруженность окружения (ш52)-этероленовой кислоты оказьшает влияние на стабильность соединения. Установление точного механизма деградации требует проведения дальнейших

исследований.

На основании полученных данных предложена

В, (щ5г)-

этероленовой кислоты и ее метилого эфира при рН 5,5

гипотетическая схема катаболизма линолипинов (Рис.19). Мы предполагаем два

варианта катаболизма линолипинов в живом растении: во-первых, ферментативное

отщепление (ш52)-этероленовой кислоты, выступающей в роли антипатогена; во-

вторых, спонтанный гидролиз распад этерифицированной (о)57)-этероленовой кислоты

с образованием (2£)-гексеналя и этерифицированного остатка травматина. о

но он

~ но

Этерифкцированпый остаток травматина

онс

(22)-ге«ссеналь

мгмг -Л

^ [

(ю525-этерол*яовая кислота

Рис.19. Гипотетическая схема катаболизма линолипинов на примере линолипина А

Таким образом, в результате деградации по второму пути образуется сразу два физиологически активных агента -

(2£)-гексеналь и этерифицированный травматин. В пользу последнего предположения говорит то, что в отсутствие гидропероксидлиазной активности мы установили выделение гексеналя листьями льна Кроме того, по спектру 'Н ЯМР продуктов деградации линолипина Б можно сказать, что в результате катаболизма линолипинов происходит отщепление С6 фрагмента от остатка (<а52)-этероленовой кислоты. На рис.20 видно, что в результате деградации линолипина Б полностью исчезают сигналы протонов НГ", Н2'", НЗ'", Н4'".

6,0

В пользу нашей гипотезы катаболизма линолипинов также свидетельствует исчезновение сигнала протона у двенадцатого атома углерода (т52)-этероленовой кислоты (Н12"). Это наблюдение может быть объяснено гидролизом простой эфирной связи дивинилового эфира с образованием альдокислоты (травматина), по-прежнему связанной с глицерином МГДГ и освобождением гексеналя.

6.0

Хшмшчг гкик сдмг, мд.

.5.5

Рис.20. Спектр 'Н ЯМР линолипина О (сверху) и продуктов его деградации (снизу)

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Впервые обнаружен метаболический путь, контролируемый 13-липоксигеназой и дивинилэфирсинтазой, в листьях льна. Основным продуктом нового пути является дивиниловый эфир (ш52)-этероленовая кислота. Кроме того, в составе сложных липидов была выявлена этерифицированная (ю52)-этероленовая кислота Обнаружена новая группа сложных оксилипинов - моно- или дигалактозилдиацилглицеринов, содержащих один или два остатка (ю52)-этероленовой кислоты. Для этих соединений предложено тривиальное название линолипины. Нами полностью охарактеризованы четыре представителя этой группы сложных оксилипинов - линолипины А, В, С и D.

Содержание линолипинов в листьях льна зависит от возраста растения. Линолипины накапливаются только во взрослых растениях, но не в проростках. Следовательно, их биосинтез и превращение зависит от онтогенеза. Наши данные показывают, что ((о57)-этеролеиовая кислота ингибирует прорастание семян льна и развитие корня.

Наблюдалось образование трех новых, не описанных ранее, соединений при повреждении листьев льна однократным циклом замораживания-оттаивания. На основании данных хроматографии, УФ-спетроскопии и масс-спектрометрии высокого разрешения выдвинуто предположение, что эти соединения представляют собой моногалактозилтриацилглицерины, у которых один из жирнокислотных остатков имеет сложноэфирную связь с остатком галактозы.

Уровень линолипинов в листьях льна значительно увеличивается при инфицировании бактерией Pectobacierium atroseplicum. Эти данные показывают, что накопление этерифицированных оксилипинов (линолипинов) может представлять новый тип стратегии защиты растений. У льна обнаружена специфическая стратегия: дивинилэфирсинтаза экспрессируется конститутивно, но биосинтез линолипинов

стимулируется в ответ на инфицирование. Накопление отдельных линолипинов, таких как линолипины В, С и О в ответ на инфицирование особенно велико. Механизм действия линолипинов остается неустановленным. Нами предложена гипотетическая схема катаболизма линолипинов - распад этерифицированной (ю52)-этероленовой кислоты с образованием этерифицированной альдокислоты (травматина) и (2£)-гексеналя. Таким образом, в отсутствие гидропероксидлиазной активности линолипины могут служить предшественниками продуктов действия гидропероксидлиазы.

Полученные в нашей работе результаты расширяют современное понимание липоксигеназного пути в растениях, а также открывают новые возможности в изучении роли сложных оксилипинов в жизни растений.

ВЫВОДЫ

1. Установлено, что окислительный метаболизм полиеновых жирных кислот в листьях льна контролируется 13-липоксигеназой. Первичными продуктами являются 13(5)-гидроперекиси а-линоленовой и линолевой кислот.

2. Превращения гидроперекисей жирных кислот в листьях льна происходят по двум преобладающим направлениям. Одно контролируется алленоксидсинтазой и алленоксидциклазой, другое - дивинилэфирсинтазой.

3. Циклопентенон (152)-12-оксо-10,15-фитодиеновая кислота и дивиниловый эфир (ш52)-этероленовая кислота являются основными оксилипинами листьев льна.

4. Впервые выделены, очищены и охарактеризованы четыре представителя новой группы сложных липидов, для которой предложено тривиальное название линолипины. Установлена структура линолипинов: 1-0-а-линоленоил-2-О-(а>52)-этсроленоил-3-0-(3-1)-галактопираноза1-^/7-глицерии (линолипин А), 1,2-ди-О-((о52)-этероленоил-3-0-р-В-галактопиранозил-5и-глицерин (линолипин В), 1-0-этероленоил-2-0-(ш52)-а-линоленоил-3-0-р-0-дигалактопиранозил-5я-глицерин (линолипин С) и 1,2-ди-0-(ш52)-этероленоил-3-0-)3-В-дигалактопиранозил-«п-глицерин (линолипин Б).

5. В ответ на инфицирование растений льна фитопатогенной бактерией РесгоЬааепит Шгохерпсит происходит биосинтез новых линолипинов (линолипины В, С и В) и резкое увеличения общего уровня содержания линолипинов.

6. Установлено, что на разных стадиях онтогенеза содержание ЭДЭ в листьях льна неодинаково. У молодых растений льна (14- и 23-дневных) отсутствует липид-связанная (ш5/)-этероленовая кислота, в то время как на более поздних этапах развития растения (35, 63 и 76 дней) уровень содержания линолипинов весьма высок.

7. Обнаружено три новых галактолипида, содержащих остатки (ш52)-этероленовой кислоты. Эти галактолипиды образуются в результате повреждения листьев льна однократным циклом замораживания-оттаивания.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи, опубликованные в журналах, рекомендованных ВАК

1. A lipoxygenase-di vinyl ether synthase pathway in flax {Linum usitatissimum L.) leaves / Chechetkin I.R., Blufard A., Hamberg M., Grechkin A.N. // Phytochemistry. -2008. - Vol. 69, № 10. - P. 2008-2015.

2. Unprecedented pathogen-inducible complex oxylipins from flax: linolipins A and B. / Chechetkin I.R., Mukhitova F.K., Blufard A.S., Yarin A.Y., Antsygina L.L., Grechkin A.N. // FEBS J. - 2009. - Vol. 276, № 16. - P. 4463-4472.

Работы, опубликованные в материалах конференций

3. Обнаружение активности дивинилэфирсингазы в листьях льна / Чечеткин И.Р., .Ярин А.Ю., Блуфард А.С., Гнездилов О.И., Гречкин А.Н. // Сб. трудов / Изд. Арта. - Новосибирск, 2008. - С. 407.

4. Обнаружение дивинилэфирсинтазной активности и новых оксилипинов в листьях льна (Linum usitatissimum) / Чечеткин И.Р., Блуфард А.С., Ярин А.Ю., Анцыгина Л.Л., Мухитова Ф.К. Гнездилов О.И., Хамберг М„ Гречкин А.Н. II Сб. тезисов / Изд. КГУ. - Казань, 2008. - С. 67.

5. Масс-спектрометрия новых оксилипинов из листьев льна / Мухитова Ф.К., Блуфард А.С., Чечеткин И.Р., Гречкин А.Н. // Сб. тезисов / Изд. ВМСО. -Москва, 2009.-С. 77.

6. Биосинтез новых оксилипинов в растениях льна при патогенезе / Чечеткин И.Р., Блуфард А.С., Ярин А.Ю., Анцыгина Л.Л., Мухитова Ф.К., Гречкин А.Н. П Сб. материалов / Изд. НЦ РВХ ВСНЦ СО РАМН. - Иркутск, 2009. - С. 519-521.

7. Листья льна - источник нового семейства сложных оксилипинов / Блуфард А.С., Чечеткин И.Р., Мухитова Ф.К., Ярин А.Ю., Анцыгина Л.Л., Гречкин А.Н. // Сб. тезисов / Изд. Пущинского НЦ РАН. - Пущино, 2009. - С. 62.

8. Linolipins: a new family of complex oxylipins / Chechetkin I.R., Blufard A.S., Mukhitova F.K., Yarin A.Y., Antsygina L.L., Grechkin A.N. // Abstracts / Yokohama (Japan), 2009. - P. 62.

9. Linolipin biosynthesis as a new kind of plant defense strategy / Chechetkin I.R., Blufard A.S., Yarin A. Y„ Antsygina L.L., Mukhitova F.K., Grechkin A.N. // Abstracts / Paris (France), 2010. - P. 15.

10. Структура и возможные функции линолипинов - новой , группы сложных оксилипинов в листьях льна / Блуфард А.С., Чечеткин И.Р., Мухитова Ф.К., Ярин А.Ю., Анцыгина Л.Л., Гречкин А.Н. // Тез. докл. / Изд. Казанского университета. -Казань, 2010.-С. 14.

11. Новые метаболиты липоксигеназной сигнальной системы / Чечеткин И.Р., Блуфард А.С., Ярин А.Ю., Анцыгина Л.Л., Мухитова Ф.К., Гречкин А.Н. // Тез. докл./ Изд. «ФизтехПресс» КФТИ КазНЦ РАН. - Казань, 2011. - С. 211 -212.

Отпечатано в ООО «Печатный двор». г. Казань,ул. Журналистов, 2 А, оф.022

Тел: 295-30-36, 541-76-41, 541-76-51. Лицензия ПД№7-0215 от 01.11.2001 г. Выдана Поволжским межрегиональным территориальным управлением МПТР РФ. Подписано в печать 24.11.2011 г Печ.л.1,5 Заказ М К-7089. Тираж 130 экз. Формат 60х$4 1/16. Бумага офсетная. Печать - ризография.

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Блуфард, Александр Сергеевич, Казань

УЧРЕЖДЕНИЕ РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ НАУК КАЗАНСКИЙ ИНСТИТУТ БИОХИМИИ И БИОФИЗИКИ КАЗАНСКОГО НАУЧНОГО ЦЕНТРА РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ НАУК

04201253281 Блуфард Александр Сергеевич

Новые продукты липоксигеназного метаболизма

в листьях льна

Специальность 03.01.05 -физиология и биохимия растений

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель: академик РАН А.Н. Гречкин

правах рукописи

Казань 2011

3.1.1 Изучение направленности метаболизма линолевой кислоты в листьях льна 68

3.1.2 Идентификация соединения 1 68

3.1.3 Идентификация соединения 2 69

3.1.4 Идентификация соединения 3 74

3.2 Биосинтез оксилпинов in vitro в гомогенате корней льна 76

3.3 Обнаружение линолипинов 76

3.3.1 Изучение состава липидного экстракта листьев льна 76

3.3.2 Идентификация соединения 10, линолипина А 79

3.3.3 Идентификация соединения 12, линолипина В 90

3.3.4 Идентификация соединения 11, линолипина С 92

3.3.5 Идентификация содинения 13, линолипина D 94 3.4. Влияние однократного цикла замораживания - оттаивания на галактолипидный профиль листьев льна 96

3.5 Возрастная зависимость содержания линолипинов в листьях льна 98

3.6 Влияние метилового эфира (со52)-этероленовой кислоты и (2Е)-гексеналя на прорастание семян льна 99

3.7 Влияние инфицирования на содержание линолипинов 100

3.8 Деградация (co5Z)-этероленовой кислоты и линолипинов 100 ЗАКЛЮЧЕНИЕ 108 ВЫВОДЫ 110 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 112

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

1. 9-ГПОД - (10£'Д22)-9-гидроперокси-10,12-октадекадиеновая кислота.

2. 9-ГП0Т-( 1ОЕ, 12г, 152)-9-гидроперокси-10,12,15-октадекадиеновая кислота,

3. 13-ГПОД- (92,11£)-13-гидроперокси-9,11-октадекадиеновая кислота,

4. 13-ГПОТ-(97,1 1£,152)-13-гидроперокси-9,11,15-октадекадиеновая кислота,

5. 13-ГОД - 13-гидрокси-9,11-октадекадиеновая кислота,

6. 13-ГОТ - 13-гидрокси-9,11,15-октадекатриеновая кислота,

7. 9,16-диГПОТ - 9,16-дигидропероксиоктадекатриеновая кислота,

8. 9,10-а-кетол - (122Г)-9-гидрокси-10-оксо-12-октадеценовая кислота или (122,15£)-9-гидрокси-10-оксо-12-октадекадиеновая кислота,

9. 11,12-кетол-(92,152Г)-11-гидрокси-12-оксо-9,15-октадекадиеновая кислота,

10.12,13-а-кетол - (92)-12-оксо-13-гидрокси-9-октадеценовая кислота или (92,152)-12-оксо-13-гидрокси-9,15-октедекадиеновая кислота,

11.10-оксо-ФДК - (62)-10-оксо-6,11-фитодиеновая кислота,

12.12-оксо-ФДК - (152)-12-оксо-10,15-фитодиеновая кислота,

13.18:2 - (97,122)-октадекадиеновая (линолевая) кислота,

14.18:3 -(92,127,152)-октадекатриеновая (а-линоленовая) кислота,

15.АОС - алленоксидсинтаза,

16.ВЭЖХ - высокоэффективная жидкостная хроматография,

17.ГП - гидроперекись,

18.ГПЛ - гидропероксидлиаза,

19.ГХМС — газовая хромато-масс-спектрометрия,

20.ДГДГ - дигалактозилдиацилглицерин, 21 .ДЭС - дивинилэфирсинтаза,

22. ЛОГ - липоксигеназа,

23.МГДГ - моногалактозилдиацилглицерин,

24.НФ-ВЭЖХ - нормально-фазовая высокоэффективная жидкостная хроматография,

25.0Ф-ВЭЖХ - обращено-фазовая высокоэффективная жидкостная

хроматография, 26.ТСХ - тонкослойная хроматография, 27.ЭДЭ - этерифицированные дивиниловые эфиры, 28.ЭПР - электронный парамагнитный резонанс,

29.ЯМР - ядерно-магнитный резонанс,

30.Е81-М8 - масс-спектрометрия с ионизацией в электроспрее.

Значение дивиниловых эфиров в эндогенной регуляции у растений не так хорошо изучено, как роль жасмонатов. Впервые дивиниловые эфиры 9-[Г(^),3'(^)-нонаДиенилокси]"8(^)-ноненовая (колнелевая) и 9-[1 ,(^,3'(2^)»6'(2)-нонатриенилокси]-8(£)-ноненовая (колнеленовая) кислоты были открыты Галлиардом с коллегами при экспериментах in vitro с клубнями картофеля [Galliard, Phillips, 1972; Galliard, Mathew, 1975]. Известно, что колнелевая и этеролевая кислоты ингибируют 9- и 13-липоксигеназы, соответственно [Corey et al., 1987; Weber et al., 1999]. Вебер с соавт. наблюдали специфическую экспрессию гена ДЭС и накопление колнелевой и колнеленовой кислот в листьях картофеля, зараженных патогеном Phytophthora infestons, и в листьях табака, зараженных вирусом табачной мозаики. Данные об ингибировании роста P. infestans колнелевой и колнеленовой кислотами позволили Веберу с соавт. предположить фунгицидную и протекторную роль дивиниловых эфиров и ДЭС [Weber et al, 1999].

До сих пор остается открытым вопрос о биологической роли оксилипинсодержащих сложных липидов. Наиболее изученными представителями этой группы соединений являются арабидопсиды. Они представляют собой моно- или дигалактозилдиацилглицерины, содержащие остатки 12-оксо-ФДК или динор-12-оксо-ФДК. Обнаружено участие арабидопсидов в механизмах защиты растений от патогенов. Таким образом, сведения о липоксигеназном каскаде в целом и его метаболитах в частности остаются весьма отрывочными. Это касается в первую очередь оксилипинсодержащих сложных липидов, в состав которых входят дивиниловые эфиры.

Цель и задачи исследования. Целью данного исследования: изучить липоксигеназный путь в растениях льна.

Для достижения указанной цели были поставлены следующие задачи: 1. Выделить и идентифицировать основные метаболиты а-линоленовой кислоты в растениях льна.

2. Исследовать содержание этерифицированных оксилипинов в липидном составе листьев льна.

3. Изучить состав липидов, образующихся в листьях льна в ответ на дейтсвие экстремальных факторов.

Научная новизна работы. Полученные результаты расширяют представления о таком малоизученном классе соединений, как сложные оксилипины. Впервые показана активность дивинилэфирсинтазы в листьях льна, выделены и охарактеризованы метаболиты дивинилэфирсинтазного пути - (а>5.2Г)-этеролевая и (со52)-этероленовая кислоты.

Впервые обаружена новая группа галактолипидов, содержащих этерифицированные остатки (со52)-этероленовой кислоты. Для этой группы соединений предложено тривиальное название линолипины. Были выделены, очищены и охарактеризованы четыре представителя этого семейства - 1-О-а-линоленоил-2-0-(со52)-этероленоил-3-0-Р-В-галактопиранозил-5«-глицерин (линолипин А), 1,2-ди-0-(со52)-этероленоил-3-0-Р-Б-галактопиранозил-5и-глицерин (линолипин В), 1-0-этероленоил-2-0-(оо52)-а-линоленоил-3-0-р-0-дигалактопиранозил-5и-глицерин (линолипин С) и 1,2-ди-0-(со52)-этероленоил-З-О-Р-Б-дигалактопиранозил-^и-глицерин (линолипин В).

Показано, что содержание линолипинов зависит от возраста растений. Кроме того, состав и содержание линолипинов претерпевает значительные изменения при инфицировании растений фитопатогенной бактерией Ре&оЬас1егшт аКозерИсит и замораживании-оттаивании.

Научно-практическая значимость работы. Изучение роли окислительного метаболизма С^-полиеновых кислот в жизнедеятельности растений имеет большое значение для понимания фундаментальных основ функционирования живых систем, а также для решения многих прикладных вопросов, связанных с использованием физиологически активных метаболитов как ростовых веществ, фунгицидов и др.

Полученные данные вносят вклад в понимание функционирования одной из ключевых сигнальных систем растения, способствующей его адаптации к неблагоприятным условиям.

Разработан комплекс подходов для выделения и очистки оксилипинсодержащих сложных липидов - потенциальных физиологически-активных веществ. Экспериментальные данные и методические приемы, изложенные в работе, могут быть использованы в учреждениях медицинского, сельскохозяйственного, биологического и

биотехнологического профилей, занимающихся современными проблемами липидологии, изучением защитных и сигнальных систем растений, а также в учебном процессе при чтении курсов лекций по биохимии, физиологии растений и молекулярной биологии в ВУЗах.

Связь работы с научными программами и собственный вклад автора в исследования. Работа проводилась с 2007 по 2010 гг. в соответствии с планом научных исследований Учреждения РАН КИББ КазНЦ РАН по теме «Липоксигеназы и цитохромы семейства СУР74: структура и роль в катализе биосинтеза оксилипинов - эндогенных биорегуляторов растений» (гос. регистрационный номер 01200901959). Исследования автора, как исполнителя данной тематики, поддержаны грантами РФФИ, программой «Молекулярная и клеточная биология» Президиума РАН и ВНШ академика А.Н.Гречкина. Научные положения и выводы диссертации базируются на результатах собственных исследований автора.

Апробация работы. Результаты диссертационной работы доложены на IV съезде Российского общества биохимиков и молекулярных биологов (Новосибирск, 2008); на международном симпозиуме «Липиды и оксилипины растений» (Казань, 2008); на Всероссийской научной конференции «Устойчивость организмов к неблагоприятным факторам внешней среды» (Иркутск, 2009); на Международном симпозиуме «Регуляторные оксилипины» (Швейцария, Лозанна, 2009); на III Азиатском

симпозиуме по растительным липидам (Япония, Йокогама, 2009); на 13-й международной Пущинской школе-конференции молодых ученых "Биология - наука XXI века" (Пущино, 2009); на Четвертом съезде ВМСО с международным участием (Москва, 2009); на Третьем Европейском симпозиуме по липидным медиаторам (Париж, 2010); на Третьем Международном симпозиуме «Клеточная сигнализация у растений» (Казань, 2011).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 11 работ, из них 2 статьи в зарубежных рецензируемых изданиях.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 134 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания объектов и методов исследования, изложения и обсуждения результатов, заключения, выводов и списка литературы. Список литературы включает 219 источников, из них 211 зарубежных. В работе представлено 4 таблицы и 42 рисунка.

Благодарности. Автор считает своим долгом выразить глубокую признательность научному руководителю - Александру Николаевичу Гречкину. Автор выражает благодарность сотрудникам лаборатории оксилипинов КИББ КазНЦ РАН: Ивану Руслановичу Чечеткину, Андрею Юрьевичу Ярину, Ларисе Леонидовне Анцыгиной за помощь в проведении эксперимента и моральную поддержку, Фаиме Киямовне Мухитовой за анализ масс-спектров. Автор также благодарит Олега Ивановича Гнездилова (КФТИ КазНЦ РАН) за исследование пространственной структуры соединении ('НЯМР и 2Б-С08У) и Булата Имамутдиновича Хайрутдинова за помощь в расшифровке ЯМР-спектров.

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Многие процессы, происходящие в растительной клетке, контролируются действием ферментов липоксигеназного каскада. Свое название этот каскад получил в связи с тем, что в его основе лежит окисление жирных кислот липоксигеназами. Образуемые в результате липоксигеназного окисления гидроперекиси жирных кислот являются чрезвычайно реакционноспособными соединениями, вследствие чего легко подвергаются дальнейшим превращениям по алленоксидсинтазному, дивинилэфирсинтазному, гидропероксидлиазному, пероксигеназному и другим (малоизученным) направлениям липоксигеназного каскада. В результате образуется большое число разнообразных по структуре и биологическому действию физиологически активных соединений, получивших общее название оксилипины.

1.1 ЛИПОКСИГЕНАЗНОЕ ОКИСЛЕНИЕ ЖИРНЫХ КИСЛОТ

Липоксигеназное окисление жирных кислот широко распространено в живой природе, за исключением анаэробных прокариот. С эволюционной точки зрения, это говорит о том, что оно появилось уже на ранних этапах эволюции живых организмов и, по-видимому, имело для них большое адаптивное значение.

Тем не менее, несмотря на существенные различия в обмене веществ у растений и животных, липоксигеназное окисление жирных кислот у представителей обоих таксонов имеет много общего и принципиально различается лишь в отношении субстрата, используемого липоксигеназами. Так, субстратами растительных липоксигеназ служат, главным образом, С18 ненасыщенные жирные кислоты (линолевая и а-линоленовая кислоты), а субстратами липоксигеназ животных - двадцатиуглеродные полиеновые жирные кислоты (преимущественно, арахидоновая и эйкозапентаеновая кислоты). Продукты первичного действия липоксигеназы - гидроперекиси жирных кислот - являются предшественниками таких биологически

активных соединений, как жасмоновая кислота в растениях [Blee, 2002] и лейкотриены у млекопитающих [Samuelsson,1997],

1.1.1 Липоксигеназы

Липоксигеназы (линолеатжислород оксидоредуктаза, К.Ф. 1.13.11.12) — ферменты, катализирующие регио- и стереоспецифичное окисление полиненасыщенных жирных кислот, содержащих 1,4-7,2-пентадиенильный фрагмент, приводящее к образованию гидроперекисей жирных кислот. В растениях первичным субстратом липоксигеназы служат, в основном, линолевая и а-линоленовая кислоты [Gardner, 1991; Siedow, 1991]. Первичные продукты растительных липоксигеназ в дальнейшем подвергаются действию других ферментов липоксигеназного каскада. В результате образуется широкий спектр физиологически активных соединений, играющих важную роль в росте и развитии растений, старении и защите от поранения и действия патогенов.

1.1.2 Структурные особенности липоксигеназ Механизм автоактивации

По своей природе липоксигеназы являются белками, состоящими из одной полипептидной цепи с молекулярным весом -75-80 кДа у животных и ~94-104 кДа у растений. Кроме того, за исключением марганцевой липоксигеназы, они содержат один атом негемового железа, входящий в состав активного центра [Brash, 1999]. Согласно рентгеноструктурному анализу и данным по первичной структуре липоксигеназ, железо связано в активном центре с тремя остатками гистидина, С-терминальным изолейцином, водой и вариабельным шестым лигандом, в качестве которого у растительных липоксигеназ выступает остаток аспарагина [Su, Oliw, 1998].

При исследовании соевой липоксигеназы-1 методом ЭПР было выяснено, что в очищенном ферменте железо находится, преимущественно, в двухвалентном состоянии [Slappendel et aL, 1981; Slappendel et al., 1982]. Однако, дальнейшие исследования [Feiters et al., 1985] показали, что Fe(II)-

липоксигеназа не способна связывать молекулярный кислород, вследствие чего не может участвовать в гидропероксидировании линолеата. Оказалось, что для осуществления липоксигеназного катализа необходимо окисление неактивной Ре(П)-формы липоксигеназы в активную Ре(Ш)-липоксигеназу [Schilstra et al., 1994, Kuhn et al., 2005]. Образуемые активной формой фермента гидроперекиси далее способны реагировать с Fe(II)-липоксигеназой, окисляя ее в фермент, содержащий трехвалентное железо [Kuhn et al., 1986]. Чем больше образуется активной формы фермента, тем быстрее идет реакция. Согласно некоторым данным [Kuhn et al., 1986; Smith, Lands, 1972], после первоначальной активации липоксигеназа способна совершить ограниченное количество оборотов в цикле диоксигенирования, после чего она переходит в неактивную форму.

Рассмотренный механизм автоактивации может быть опосредован и другими переходными элементами. Так, марганцевая липоксигеназа из фитопатогенного гриба Gäumannomyces graminis, содержащая в своем активном центре марганец вместо железа, участвует в катализе лишь при валентном переходе из своей неактивной Мп(И)-формы в активную форму, содержащую Mn(III) [Su et al., 2000].

1.1.3 Основные свойства липоксигеназ

1.1.3.1 Региоспецифичностъ

Большинство известных растительных липоксигеназ проявляет высокую позиционную специфичность (региоспецифичность) и превращает линолевую и линоленовую кислоты либо в 9-, либо в 13-гидроперекиси. Интересно, что образование этих региоизомеров происходит, как правило, в функционально различных тканях. Так, наибольшей 13-липоксигеназной активностью обладают, преимущественно, зеленые ткани растений, участвующие в ассимиляции СОг, а активность 9-липоксигеназы свойственна, главным образом, запасающим тканям и органам растений [Grechkin, 1998].

Однако региоспецифичность липоксигеназного окисления жирных кислот может изменяться под влиянием в зависимости от кислотности среды. Например, соевая липоксигеназа-1 при значениях рН выше 8,5 катализирует превращение линолевой кислоты только в 13(£)-ГПОД, а при понижении рН с 8,5 до 6,0 способна к образованию как 13(5)-, так и 9(5)-гидроперекиси, причем доля последней прямо пропорционально возрастает до 25% при рН 6,0. На этом основании было сделано два вывода:

1) 9(5)-гидроперекись образуется только из недиссоциированной формы линолевой кислоты;

2) субстрат, находящийся в недиссоциированной форме, может входить в активный центр в любой ориентации, а карбоксилатный анион узнается ферментом только с метального конца [Gardner, 1989].

Кроме того, Чечеткин с соавт. показали, что рекомбинантная соевая липоксигеназа-2 при рН 6,6 превращает линолевую кислоту в 9- и 13-гидроперекиси в соотношении 9:91, тогда как при рН 9,0 это соотношение составляло 13:87 [Chechetkin et al., 2007]. При этом рН никак не влиял на стереоспецифичность действия липоксигеназы.

Следует отметить, что рН-зависимое изменение региоспецифичности липоксигеназного катализа может быть опосредовано конформационными изменениями контактного (субстратсвязывающего) участка липоксигеназы. В пользу этого говорят данные, указывающие на то, что позиционная специфичность липоксигеназы зависит от объема контактного участка фермента [Borngraber et al., 1999; Shimizu et al., 1984].

Еще одним фактором, влияющим на региоспецифично�