Новые методы получения высокоочищенных нуклеаз и нуклеотидов из животного и микробиального сырья

Бочков, Денис Владимирович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Новые методы получения высокоочищенных нуклеаз и нуклеотидов из животного и микробиального сырья
ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Новые методы получения высокоочищенных нуклеаз и нуклеотидов из животного и микробиального сырья"

На приыах рукописи

Бочков Денис Владимирович

НОВЫЕ МЕТОДЫ ПОЛУЧЕНИЯ ВЫСОКООЧИ1ЦЕННЫХ НУКЛЕАЗ И НУКЛЕОТИДОВ ИЗ ЖИВОТНОГО И МИКРОБИАЛЬНОГО СЫРЬЯ

03.00.04.-био*нмия

Автореферат диссертации на соискание учёной сгепени кандидата Аналогических наук

>фа-200Я

РабоIа выполнена в Новосибирском инсгигу ге органической чимин им ИНВорожцова СО РАН и Новосибирском юсударсгаенноч педагогическом университет

НАУЧНЫ! РУКОВОДИ11ЛИ докюрбноло!ическич на^к

(Хомов Викюр Васильевич док гор биологических нау к ТшКШКОВа ТпЬИНЙ Генрихов!!*

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОНПОНЬНГЫ: док юр биологических наук, профессор

Кашкаюв Сергей .Александрович докгор медицинских наук, профессор Маянская Наиля Нашбовнц

ВЕДУЩАЯ ОР1 АНИШЦШ Инсгшу г биохимии СО РАМН

1ащи1а дмссериции сосюик-я « » 2005 г. в___ часов

на мседании Регионарного диссертационно!о совет КМ 002 131.01 при Ннсшгуге биохимии и I спешки У11Ц РАН но адресу 450054, Республика Ьашкорюоан, I Уфа. нроснек! Окчября. 71

I' днссершцией можно олнакомться в Научной библно1еке Уфимскою научною цстра РАН но адресу 4*0054, Уфа, проспект Октября, 71

Авюрефсрш ра«ослан « »______2005 г

У ченый секретари Ре1 нонадьного _ ^

нк'сершциоиною сонеы, к б.н ф/ЬС^ ~ Ьнкбу да юна С М

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Постоянное расширение исследований в области молекулярной биологии, генной диагностики ставит задачу - создания высокоэффективных методов получения ферментов обмена нуклеиновых кислот.

Анализ литературы, касающейся получения ферментов из биологического сырья, показал, что практически все методы ограничены получением одного, реже двух индивидуальных ферментов из одной партии сырья. Большое количество так называемого "балластного" белка, при этом отбрасывается. Между тем каждый вид биологического сырья содержит целый ряд ферментов, которые при надлежащем технологическом подходе можно извлекать, в том числе и в промышленном масштабе.

В этой связи усовершенствование методов фракционирования клеточных экстрактов, направленных на разработку технологий, позволяющих получать несколько ферментных препаратов из одной партии биоматериапа, приобретает все большее значение.

Однако реальных методов по выделению одновременно нескольких ферментов из одного образца сырья пока очень мало. Их разработка, по сути дела, началась в самое последнее время. Исследования в этом направлении весьма актуальны, поскольку разработка новых методов создаёт основу для организации в конечном итоге производств ферментов современного уровня, отличающихся экономичностью и комплексным использованием биологического сырья.

Интенсивное развитие молекулярной биологии и генной инженерии вызвало возрастающую потребность в нуклеотидах, необходимых как для проведения исследований, так и для разработки медицинских диагностических тест-систем, используемые для диагностики бактериальных, вирусных, онкологических, генетических и других заболеваний.

Поэтому актуальной является разработка новых технологий получения дезокси- и рибонуклеотидов, практическая реализация которых могла бы

обеспечить растущие потребности.

Видимыми путями снижения себестоимости нуклеотидов, а, следовательно, и всемерного расширения диагностических возможностей медицины являются:

- разработка и внедрение доступных ферментных препаратов, например, микробных, способных проводить гидролиз нуклеиновых кислот;

- создание биореакторов на основе иммобилизованных ферментов.

Цель исследования. Разработка нового подхода, позволяющего получить высокоочищенные ферментные препараты рибонуклеазу (РНКазу), дезоксирибонуклеазу {ДНКазу), трипсин и холестеролэстеразу. Создание нового экономичного метода препаративного синтеза нуклеотидов и их полифосфатов.

Задачи исследования:

1. Предложить новый подход и разработать технологичный метод получения высокоочищенных и высокоактивных ферментных препаратов РНКазы, ДНКазы, холестеролэстеразы и трипсина из одной партии животного сырья.

2. Создать базу высокоочищенных субстратов РНК и ДНК для анализа ферментов нуклеазного действия.

3. Создать ферментную базу для получения нуклеотидов: ДНКазы из поджелудочной железы крупного рогатого скота (ПЖ КРС) и Б'-нуклеазы из амилоризина.

4. Получить с использованием собственной субстратной и ферментной базы высокоочищенные дезокси- и рибонуклеозид-5- монофосфаты с высокими выходами.

5. Разработать новые процедуры сопряжённого фосфорилирования продуктов гидролиза РНК и ДНК до дезокси- и рибонуклеозид трифосфатов.

Научная новизна: Найден подход, позволяющий разработать метод одновременного получения РНКазы, ДНКазы, трипсина и холестеролэстеразы высокой чистоты, из одной партии животного сырья.

Впервые, для очистки белков использованы методы ультрафильтрации на установках с полыми волокнами и хроматографической очистки на ДЭАЭ-целлюлозе, позволяющие добиться высокой очистки фермента рибонуклеазы.

Создана ферментная база для получения нуклеотидов на основе доступного сырья: дезоксирибонуклеазы из поджелудочной железы крупного рогатого скота и Б'-нуклеазы из амилоризина.

Впервые показано, что использование проточного биореактора с иммобилизованной Б'-нуклеазой является перспективным общим подходом к получению рибо- и дезоксирибонуклеозид-З'-монофосфатов.

Разработаны новые процедуры сопряжённого фосфорилирования продуктов гидролиза РНК и ДНК до дезокси- и рибонуклеозид-5'-трифосфатов с высокими выходами и высокой чистотой.

Практическая значимость.

Разработан лабораторный регламент получения ферментов РНКазы, ДНКазы, трипсина и холестеролэстеразы, который может быть положен в основу создания промышленной технологии.

С применением метода ковалентной иммобилизации Б'-нуклеазы на силикатных носителях разработан биореактор непрерывного действия, перспективный для реализации экономичной технологии получения дезокси- и рибонуклеозвд-З'-монофосфатов.

Разработана процедура фосфорилирования с помощью суммарного препарата нукпеотидилкиназы с ацетокиназой ("киназная фракция") продуктов гидролиза РНК и ДНК до дезокси- и рибонуклеозид-5'-трифосфатов.

Апробация работы. Основные положения диссертации доложены, обсуждены и опубликованы в материалах конференций «Материалы 1-ого Международного Конгресса по биотехнологии» (Москва, 2002), «Материалы ХЬ международной научной студенческой конференции (Студент и научно-

технический прогресс)» (Новосибирск, 2002), «Материалы 2-ого Международного Конгресса по биотехнологии» (Москва, 2003), «The Second International Conference on Chemical Investigation and Utilization of Natural Resources» (Ulan-Bator (Mongolia), 2003).

Диссертационная работа Бочкова Д.В. выполнена по программе НИР НИОХ СО РАН «Ферментативный синтез биологически активных соединений» в рамках интеграционной программы СО РАН №146 «Разработка <

лекарственных и профилактических препаратов для медицины. Фундаментальные основы и реализация».

Публикации. По теме диссертации опубликовано 10 печатных работ, в том числе 4 статьи в отечественных реферируемых журналах, 2 статьи в сборнике статей аспирантов НГПУ и 4 тезиса докладов на международных конференциях.

Объём и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 130 листах печатного текста и состоит из введения, обзора литературы, результатов и обсуждения, экспериментальной части, заключения и списка литературы. Диссертация иллюстрирована 15 рисунками и 12 таблицами. Список литературы содержит 209 источников, из которых 86 опубликованы в отечественных и 123 в зарубежных изданиях.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В качестве сырья для выделения целевых ферментов использовали поджелудочную железу крупного рогатого скота, амилоризин П10Х (Рассказовский биохимический завод, Россия), биомасса Е. coli В-78 MRE-600, генотип: F-rna (1,2,41,53;37) НИКТИ БАВ ГНЦ ВБ «Вектор» (г. Бердск, Россия).

Холестеролэстераза, маркерные белки (Human albumin 65 кДа, Ovalbumin 45 кДа, Carbonic anhydrase 30 кДа, Tripsin inhibitor 20,1 кДа, a-lactalbumin 14,4 кДа) фирмы Sigma (США); дезоксирибонуклеаза, рибонуклеаза и трипсин фирмы «Самсон-Мед» (Россия). Трис-HCl и ДНК фирмы «SIGMA»; АТР (Reanal. Венгрия), пекарские дрожжи Saccharamyces cerevisiae (Новосибирский дрожжевой завод); сипохром С-80, анионообменная смола DOWEX 1 *2 фирмы

«Serva» (Германия), сефароза 4В фирмы «Pharmacia» (Швеция), хроматографические пластинки Kieselgel 60 F254 фирмы «Merck» (Германия).

Суммарную РНК, для анализа активности фермента рибонуклеазы (РНКазы) и получения рибонуклеозид-5/(3/)-монофосфатов, получали по методу (Дужак А.Б. и др.1982.).

Для выделения смеси целевых ферментов в индивидуальном виде использовали метод осаждения белков сульфатом аммония (Тугунов С.С. и др.

1967).

Получение индивидуального фермента халестеролэстеразы осуществляли следующим образом: осадок, содержащий холестеролэстеразу, собирали, растворяли в 0,1 М калий фосфатном буфере, pH 7,0. Раствор дотитровывали гидроокисью натрия до pH 7,3, добавляли холат натрия до 0,33 М и центрифугировали. Супернатант замораживали в морозильной камере при -18"С.

Содержание трипсина определяли по методу (Фармакопейная статья / ФС 3435, 1997) и проанализированный раствор замораживали в морозильной камере при-18°С.

ДНК получали из молок лососевых рыб с использованием нижеописанной методики: для очистки от примесных веществ измельченные молоки лососевых рыб экстрагировали 0,15 М водным раствором хлорида натрия. Полученный после центрифугирования супернатант насыщали 96% этиловым спиртом в соотношении 1:1 и собирали ДНК, затем её сушили в вакуумном эксикаторе над безводным СаСЬ. Чистоту ДНК определяли спектрофотометрически.

Фермент S'-нуклеазу получали из амилоризина по методу (Vogt V., 1973) с модификацией (Хомов В.В. и др. 1997).

Для выделения суммарного препарата нукпеотидилкиназы с ацетокиназой использовали клетки Е coli В-78 MRE-600, генотип: F-ma. Разрушение клеток проводили по методу (Хомов В.В. и др. 1997).

Фосфорилирование дезокси- и рибонуклеозид-5'-монофосфатов проводили суммарным препаратом нуклеотидилкиназ с ацетокиназой Хроматографическое выделение продуктов фосфорилирования проводили на «Dowex 1.2» в линейном градиенте 0,05-1 М бикарбоната аммония, pH 8,8.

Фракцию, соответствующую трифосфату, собирали, замеряли общий объем, упаривали до концентрации 0,15 M бикарбоната аммония. К упаренному раствору добавляли 1/10 объема 2 M HCl. Трифосфаты осаждали десятикратным объемом этилового спирта. Осадок центрифугировали и сушили в эксикаторе под Р205. Высушенный препарат анализировали на содержание основного вещества и хроматографическую чистоту.

В работе было использовано следующее оборудование: спектрофотометр СФ-46 JIOMO (Россия), центрифуга Sigma 6К15 (Германия), ультрафильтрационная установка УПВ-6, укомплектованная разделительными аппаратами типа АР-3-50ПС/15ПА/5ПА производства г. Кириши (Россия), лиофильная сушка LioPro-3000 ГО: 88872244 (HETO-HOLTEN A/S фирма Jouan Nordic); Uvicord S 2 LKB 2238 (Швеция); испаритель ротационный ИР - 1 M 2 (Россия); прибор для вертикального электрофореза (стёкла 13 х 15 см), кондуктометр «Анион-7020» диапазон измерения: 1мкСм/см - 100 мСм/см. (Россия).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 1. Новый подход к получению ферментов: РНК-азы, ДНК-азы, холестеролэстеразы и трипсина высокой очистки из поджелудочной железы

крупного рогатого скота

Главными особенностями нашего подхода к получению ДНКазы, РНКазы, холестеролэстеразы и трипсина являются:

• использование повышающейся концентрации сульфата аммония как приема, обеспечивающего селективное разделение всех четырех ферментов, содержащихся в сернокислотном экстракте поджелудочной железы крупного рогатого скота (ПЖ КРС) после экстракции этанолом при температуре (-18°С);

• применение для тонкой очистки РНКазы ультрафильтрации на полых волокнах и ионообменной хроматографии на колонках с ДЭАЭ-целлюлозой.

На рис. 1. приведена разработанная нами принципиальная схема выделения всех ферментов, начиная со стадии первичной обработки ПЖ. Предложенное нами постадийное увеличение концентрации сульфата аммония обеспечивает четкое разделение всех четырех ферментов. Оптимальные

градиенты концентрации были найдены после изучения поведения упомянутых ферментов по отношению к растворам сульфата аммония.

Павкст.лочнах ясдсза кръ пного рогатого села

- 18 С

Инсу/шнсоперэдший спиритый раегвор Г)салок содсряашш и <{>ер менты (Р1Ж-аза, ДИК-лза, трипсин н Ю;

Очистки шюулшы 11лн;с<ными методам г * А 2.3 мМ Н2Э04

Инолии Шро « о «"КИЯ Расяиор фермет он (РНК-аы. ДНК-аза. фипснн и V))

Г'упсрншаиг» 3

IV 80% (!^Н4)25>04

Ульгрифи-лырзция Суп ериагант - 4

Осадок - з

Конценфироваииий раствор И1 Кчпы

95 % 01Н4)2504

Осадок - 4

Растиор ДНК-алы

ЛНК-ам

Диализ 2,5 мМ Н2Б04

Супернаган I - 5

Хромаюграфия гаДЭАЭ-нел

Рис.1. Схема получения БАВ из поджелудочной железы крупного рогатого скота (общий вид)

•—•—■—• ДмвсицивициЕи я И И щ Хшстсри зстерая «■I» Трипстт

Рис. 2. Изменение активности ферментов (РНКазы, ДНКазы, трипсина и холестеролэстеразы) в растворе при фракционировании клеточного экстракта

сульфатом аммония

Как видно из рис. 2. при доведении концентрации сульфата аммония в сернокислотном экстракте до 45%, в осадок переходит основное количество холестеролэстеразы. Дальнейшее насыщение раствора сульфатом аммония до 60% приводит к выпадению в осадок трипсина. При повышении содержания соли до 80% осаждается основное количество ДНКазы, тогда как РНКаза остается в супернатанте.

Таким образом, простой процедурой обеспечивается селективность разделения всех указанных ферментов.

Учитывая возможность выделения холестеролэстеразы из осадка-1 и трипсина из осадка-2 (рис. 1.) с помощью стандартных методов, главное внимание уделено разработке подходов к получению высокоочищенных ДНКазы к РНКазы.

ДНКаза выделялась последовательным растворением осадка-3 (рис. 1.) в 2,5 мМ серной кислоте, диализом, отделением балластных белков центрифугированием и заключительной очисткой раствора фермента на колонке с активированным углем.

1 1 3 4 s 6

...

Рис. 3. Анализ дезоксирибонуклеазы в 10% Г1ААГ, полученной по предлагаемой технологии (3 и 5 дорожки) и препарата ОАО «Самсон-Мед» (2 и

4 дорожки)

1 и 6 дорожки - маркеры: Human albumin (65 кДа), Ovalbumin (45 кДа) и Carbonic anhydrase (30 кДа)

Как видно из рис. 3, ДНКаза, полученная по предлагаемому методу, является более чистой (дорожки 3 и 5) по сравнению с ферментом, выпускаемым фирмой «Самсон-Мед» (дорожки 2 и 4).

Для выделения РНКазы супернатант-4 (рис. 1.) подвергался последовательной ультрафильтрации на установке УПВ-6 с использованием колонок с полыми волокнами, имеющими размеры пор 50 и 5 кДа. Полученный после ультрафильтрации раствор донасыщали сульфатом аммония до концентрации 95%, в результате чего РНКаза выпадала в осадок (осадок-4), который растворяли в 2,5 мМ серной кислоте, и подвергали диализу. Удельная активность (Ауд) фермента после диализа составила 275000 е.а./мг белка, выход 2,6 г/кг ПЖ КРС. Ионообменной хроматографией этого фермента на колонке с ДЭАЭ-целлюлозой с элюированием градиентом концентрации NaCl (0,0IM и 2 М) растворами показано, что он является смесью белков (Рис. 4).

У(мл)

Рис. 4. Хроматограмма рибонуклеазы, очищенной на колонке с ДЭАЭ-32

целлюлозой

Как видно из рис. 4, этот продукт представляет собой смесь белков с разными молекулярными массами. Были выделены фракции белков с следующими значениями удельной активности (Ауд = е.а./мг): 35000, 110000, 160000 и 600000. Наибольший интерес представляла фракция с Ауд > 600 000 е.а./мг. Методом белкового электрофореза в ПААГ (Остерман Л.А., 1985) установлено, что этот белок имеет молекулярную массу < 14 кДа, соответствующую ферменту рибонуклеаза панкреатическая.

1 И 1

О«т-Ъош. апЬуЛги«

(ЗСкД.)

■иЬниу

Рис. 5. Электрофорез рибонуклеазы

Дорожка 1 - маркеры; дорожка 2 - рибонуклеаза фирмы «Самсон-мед»; дорожка 3 - рибонуклеаза, полученная по нашему методу с использованием диализа против серной кислоты; дорожка 4 - рибонуклеаза, полученная по нашему методу с использованием диализа против №Р-буфера (рН 6,4)

Из рис. 5, видно, что препарат рибоиуклеазы, полученный по нашему методу, по молекулярному весу соответствует препарату ОАО «Самсон-мед» (дорожка 2), но по чистоте превосходит его. Вероятно, что основная примесь в препарате рибоиуклеазы ОАО «Самсон-Мед» является ДНКаза, а также полимеры (димеры, тримеры и тетрамеры) РНКазы. В ферменте РНКаза, которая была получена по нашему способу после очистки на ДЭАЭ-целлюлозе с диализом против серной кислоты основной примесью, вероятно, является димер РНКазы (дорожка 3). Если провести диализ раствора фермента против ЫаР-буфера (рН 6,4) с последующей инкубацией при +44°С, полоса, предполагаемого димера РНКазы, исчезает (дорожка 4). Таким образом, отделив пик, соответствующий белку с молекулярной массой 514 кДа, методом ионообменной хроматографии на колонке с ДЭАЭ-целлюлозой мы получили белок, соответствующий ферменту рибомукпеазе панкреатической с чистотой более 90% с выходом 1,15 г/кг ПЖ КРС (табл. 1).

Таблица 1. Характеристики РНК-азы, ДНК-азы, трипсина и холестеролэстеразы, выделенных по предлагаемому подходу

Фермент Удельная активность Ауд(е.а./мг белка) Выход (г/кг) Суммарная активность ЕА (е.а./кг ПЖ**)

Рибонуклеаза 600000 1,15 6,9x10"

Дезоксирибонуклеаза 2500 2,9 5,45x106

Холестерол эстераза 2420 3,1 7,5х 103

Трипсин 12,0* 1,8 1,2x10'

*- активность в тирозиновых единицах (ТЕ ц/) **- поджелудочная железа крупного рогатого скота

Фракции белка с удельной активностью 35000 до 160000, скорее всего, являются полимерами РНКазы, снижение активности которых можно объяснить наличием примесей белков. В этой связи, следует подчеркнуть, что в работах, (А.М СгезгЯ1с5 сХ а!.,1962; Я.О. РпюЩег, й а1., 1965; в. Оойе, й а1., й а1. 1997; М. УЬопай, ег а!.,1996) при разделении бычьей рибоиуклеазы А,

констатировано образование полимеров, отличающиеся друг от друга не только молекулярной массой, но и активностями по отношению к субстрату РНК.

Возвращаясь к холестеролэстеразе и трипсину, заметим, что, проведя извлечение их из осадка-1 и осадка-2 стандартными методами, мы получили препараты также высокой чистоты (табл. 1).

В таблице 2 приведены сравнительные данные по удельным активностям всех ферментов, полученных по разработанной нами технологии в сравнении с коммерческими препаратами:

Таблица 2 Сравнительные характеристики ферментов полученных по разработанному методу и коммерческих препаратов

Ферменты РНК-аза ДНК-аза Трипсин Холестерол эстераза

Коммерческий препарат 330000* ЕА/мг 1700 ЕА/мг 8,0 ЕА/мг" 1900 ЕА/мг

Препарат, полученный по разработанной технологии 600000* ЕА/мг 2500 ЕА/мг 12,0 ЕА/мг" 2420 ЕА/мг

*- активность проверена на ЕРНК обогащенной высокополимерной фракцией **- активность в тирозиновых единицах (ТЕ?" 35/)■

Как видно из табличных данных, по описанному выше подходу можно получать четыре фермента: РНКазу, ДНКазу, холестеролэстеразу и трипсин с высокими выходами и активностями.

2. Новые подходы к синтезу нуклеотидов (дезокси- и рибонуклеозид-5/-

монофосфатов) и их полифосфатов 2.1. Гидролиз ДНК с получением дезоксирибонуклеозид -51-монофосфатов

Как известно, фермент ДНКаза гидролизует ДНК до олигонуклеотидов, Б'-нуклеаза гидролизует олигонуклеотиды до нуклеозидмонофосфатов. Для гидролиза ДНК, полученной по стандартному методу, использовалось два фермента". ДНКаза, выделенная из ПЖ КРС, по описанному в предыдущем

разделе методу, второй фермент - Э'-нуклеаза, выделенная из амилоризина по модифицированному нами методу и иммобилизованная на силохроме С-80.

Модифицикация метода заключалась в следующем: экстракция амилоризина в течение 12 часов 0,01 М калий фосфатным буфером с рН 7,5 (Буфер А) и диализ раствора белка, содержащего 5'-нуклеазу на колонке (У=100 мл) с ДЭАЭ-целлюлозой. Кроме того, элюцию Б'-иуклеазы проводили раствором хлорида натрия в буфере Б (0,01 М калий фосфатного буфера (рН 7,5) с добавлением 0,1 мМ гп804) с линейным градиентом концентрации хлорида натрия от 0,05 М до 0,4 М. Скорость элюирования 50 мл/час. На выходе в полученных фракциях анализировали активность фермента нуклеазы.

Амилоризин 1

Рис.6. Схема получения 51-нуклеазы

В результате таких операций, можно получать высокоочищенный электрофоретически гомогенный препарат Б'-нукпеазы, со степенью очистки 3000 и выходом фермента по массе белка 27%, обладающей высокой специфичностью к вторичной структуре ДНК Выход Я1 -нуклеазы - 12000

ед.акт./г амилоризина. что составляет 430 мг Б'-нуклеазы из 1 кг амилоризина. Удельная активность Б1-нуклеазы - 28000 ед.акт./мг белка (табл.3).

Таблица 3. Характеристика фермента в'-нуклеазы

Стадии Выход по Мбелка (%) Ауд* (ЕА/мг) Степень очистки Выход из 1 кг амилоризина (мг) Суммарная активность ЕА(ЕА/кг.)

1 .Экстракция калийфосфатным буфером 100 9,8 1 6150 6,03x1 о4

2.Диализ против калийфосфатного буфера с добавле нием гп804 27 28000 3000 430 1,21 х 107

Для иммобилизации Б'-нуклеазы использовали силохром С-80 с удельной поверхностью 80 м2/г и размером пор 700-1000 А. Сорбент получен от к.х.н. В.А.Симакова (Институт катализа им Г.К.Борескова СО РАН).

Модификацию поверхности проводили у-аминопропил-триэтоксисиланом с последующей активацией модифицированного силохрома глутаровым альдегидом

Иммобилизацию нуклеазы проводили в три стадии:

• модификация Силохрома С-80 т-аминопропил-триэтоксисиланом;

• активация аминопропилсилохрома глутаровым альдегидом;

• ковалентное присоединение 8'- нуклеазы к активированному аминопропилсилохрому.

—0-81-(СН2)з-КН-СН2-(СН2)З- С

Н + тм и . с".

+ N Н2 - Б - нуклеаза Количество 81-нуклеазы. связанной с аминопропилсилохромом, определяли по уменьшению активности в прошедшем через колонку растворе. Количество белка ковапентно связанного с аминопропилсилохромом рассчитывали по материальному белковому балансу в исходном растворе и

растворе, прошедшем через колонку с аминопропилсилохромом. Концентрацию белка определяли по методу (СЫвйрИегеоп ИЛ., й а1., 1979).

2.1.1.Гидролиз ДНК, не иммобилизованной 8'-нуклеазой Были исследованы два метода

1. Последовательный гидролиз.

Для последовательного гидролиза ДНК ферментами ДНКазой и не иммобилизованной Б'-нуклеазой использовали ДНК с концентрацией 2 мг/мл в 20 мМ натрий ацетатном буфере (рН 4,6), содержащем 5 мМ Для

получения олигонуклеотидов, к этому раствору ДНК (У=50 мл) прибавляли 20 мл раствора фермента ДНКазы в концентрации 0,3 мг/мл и активностью Ауд = 2500 е.а./мг. Реакционную смесь инкубировали при +37°С в течение полутора часов. Через каждые 5 мин отбирали пробы по 100 мкл для анализа полноты гидролиза. Реакцию в пробах останавливали добавлением охлажденной 1 М хлорной кислоты в соотношении 1:5. Полноту гидролиза анализировали спектрофотометрически на длине волны 260 нм и методом тонкослойной хроматографии.

Для дальнейшего гидролиза полученных олигонуклеотидов, к раствору добавляли гп804 до концентрации 1 мМ и 380 мкл Э'-нуклеазы с активностью Ауд = 28000 е.а./мг и концентрацией 1 мг/мл и инкубировали при +44°С в течение полутора часов. Реакцию останавливали нагреванием до +100"С и полученную смесь центрифугировали при 10000 % в течение 20 мин для отделения белка.

2. Гидролиз ДНК ¡Р-нукпеазой.

Гидролиз ДНК Б'-нуклеазой проводили, используя раствор ДНК с концентрацией 2,5 мг/мл, в 20 мМ натрий ацетатном буфере (рН 4,6), содержащем 1 мМ 2п804. Раствор (У=50 мл) нагревали в течение 10 мин при +100°С, быстро охлаждали, после чего, добавляли раствор фермента с концентрацией 2,5 мг/мл (У=1,4 мл) с активностью Ауд = 28000 е.а./мг. Смесь инкубировали при +44°С, отбирая пробы по 100 мкл для анализа стандартным методом.

В таблице 4 представлены результаты гидролиза ДНК с использованием не иммобилизованной Б'-нуклеазой

Таблица 4. Гидролиз ДНК ферментами ДНКазой и не иммобилизованной

5г-нуклеазой

№ пр. Нагрузка на 1 мг ДНК Содержани е ЦММР, % Содержание олигонуклеотидов, % Время инкубации (мин)

1 64 ЕА ДНК-азы <3 95 90

2 350 ЕА Б'-нуклеазы 35,3 65 90

3 700 ЕА З'-нуклеазы 50 50 140

4 784 ЕА в'-нуклеазы =100 0 210

5 64 ЕА ДНК-азы + 78,4 ЕА Б'-нуклеазы 33 67 120

6 64 ЕА ДНК-азы + 106,4 ЕА Б'-нуклеазы =100 0 170

Как видно, для полного гидролиза ДНК до монофосфатов необходимо проводить процесс в течение 210 мин. Последовательный гидролиз с помошью ДНКазы, а затем Я'-нуклеазы позволяет сократить время процесса и в 7 раз снизить затраты $ -нуклеазы.

2.1.2. Гидролиз ДНК иммобилизованной Б'-нуклеазой Процесс вели в биореакторе, который представлял собой колонку емкостью 100 мл, наполненную силохромом С-80 с иммобилизованной 5'-нуклеазой. Испытан режим прямого и последовательного гидролиза ДНК.

При прямом гидролизе раствора ДНК с концентрацией 2,5 мг/мл производительность биореактора составила 1 г в час дезоксирибонуклеозид-5/-монофосфатов (0,14 г <1СМР, 0,18 г с!ТМР, 0,29 г ¿АМР, 0,34 г сЮМР). При последовательном режиме работы использовался раствор олигонуклеотидов, полученный описанный выше способом. К раствору добавляли гпвОд до концентрации 1 мМ и пропускали через реактор при температуре +44°С в течение одного часа. Каждые 10 мин отбирали пробы, анализировали

стандартным методом. При работе в таком режиме производительность биореактора возрастает в 10 раз.

2.2. Гидролиз РНК с получением рибонуклеозид -5-монофосфатов

2.2.1. Гидролиз РНК не иммобилизованной S'-нуклеазой

Гидролиз РНК не иммобилизованной S'-нуклеазой, проводили ^ дис использованием 12 г дрожжевой суммарной РНК, которую растворяли в 200 мл

ИД* ЦТ*

0,15 М натрий ацетатного буфера (рН 4,6), содержащего ZnS04 в концентрации 0,1 мМ. В раствор РНК добавляли 2 мл S'-нуклеазы с концентрацией 2,5 мг/мл и активностью Ауд = 28000 е.а./мг и инкубировали при температуре +44°С в течение 6 ч. Пробы анализировали стандартным методом. Таким образом, нами из 12 г дрожжевой суммарной РНК было получено 1,7 г СМР, 2,2 г UMP, 3,48 AMP, 4,2 г GMP. Физико-химические характеристики полученных образцов рибонуклеотидов соответствуют лучшим образцам нуклеотидов выпускаемых ведущими зарубежными фирмами.

2.2.2. Гидролиз РНК с участием иммобилизованной S'-нуклеазы

Процесс вели в биореакторе, описанном выше. Испытан режим прямого

гидролиза раствора РНК с концентрацией 20 мг/мл. Производительность биореактора составила 6 г рибонуклеозидмонофосфатов в час. в том числе 0,85 г СМР, 1,1 г UMP, 1,74 г AMP, 2,1 г GMP.

2.3. Получение дезокси- и рибонуклеозид-5-трифосфатов

Было использовано два способа получения трифосфатов: по первому -проводили фосфорилирование индивидуальных монофосфатов; по второму -вели фосфорилирование смесей монофосфатов, полученных ферментативным гидролизом ДНК и РНК с последующим разделением трифосфатов.

Фосфорилирование индивидуальных дезокси- и рибонуклеозид-5;-монофосфатов проводили по стандартной методике с использованием так называемой «киназной фракции», содержащей набор нуклеотидшкиназ с ацетокиназой, способный осуществить фосфорилирование любого нуклеотидмонофосфата. Установлено, что полученные таким способом индивидуальные ATP, СТР, UTP, GTP и dATP, dCTP, dTTP, dGTP по спектральной характеристике и отношениям D280/D260 и D25o/D26o соответствовали спектральным характеристикам трифосфатов,

синтезированных традиционным способом (Бреслер С.У. и др. 1974; Богачёв B.C., 1996; Komberg A., Aposhian H.V., 1962; Warburg G., Christian W., 1941). Основные спектральные характеристики представлены в таблицах 5,6.

Полнота фосфорилирования суммарных NMP и dNMP была не менее 86% для NMP (99% AMP превращается в АТР, 96% СМР превращается в СТР, 86% UMP превращается в UTP, 87% GMP превращается в GTP) и не менее 90% для dNMP (99% dAMP превращается в dATP, 96% dCMP превращается в dCTP, 92% dTMP превращается в dTTP, 90% dGMP превращается в dGTP). Фосфорилирование NMP и dNMP в смеси.

Фосфорилирование NMP и dNMP в смеси проводили с использованием также «киназной фракции», но без выделения из гидролизата РНК и ДНК индивидуальных NMP и dNMP по схеме:

РНК sl'"i"c,,eaM-► NMP «-"""«"* NTP

ДНК SI-иуклема+ДНК-аза ^ ^[NjiyfP Фримия ^ (JNTP

Спектральные характеристики и отношения D280/D260 и D25t/T)26o полученных ATP, СТР, UTP, GTP и dATP, dCTP, dTTP, dGTP идентичны результатам, полученным при фосфорилировании индивидуальных монофосфатов (табл.5,6).

НОМКТ-А ФГЛКЩШ

Рис. 7. Хроматография продуктов реакции фосфоролиза

Из рис. 7 видно, что при фосфорилировании дезокси- и рибонуклеозид-5/-монофосфатов в смеси образуется минимальное количество дезокси- и рибонуклеозид-5'-дифосфатов, которые также подвергаются фосфорилированию до соответствующих трифосфатов.

Таким образом, минуя стадию разделения монофосфатов и стадию получения дифосфатов, мы получаем смесь либо рибонуклеозид-б'-трифосфатов, либо смесь дезоксирибонуклеозид-б'-трифосфатов. В таблицах 5 и 6 приведены основные характеристики сМТР и ЫТР, полученных сопряжённым фосфорштированием в сравнении с аналогичными трифосфатами, синтезированными из индивидуальных монофосфатов.

Таблица 5. Спектральные характеристики рибонуклеозид-5'- трифосфатов

шт АТР СТР итр вТР

Содержание основного вещества в сухом препарате 98,4% (99,4%)* 99,2% (99,2%)* 98,8% (98,8%)* 99,4% (99,4%)*

Хроматограф ическая однородность 98% (98%)* 99% (98%)* 97% (96%)* 99,4% (99,4%)*

Соотношение величин оптических плотностей при рН 2,0 А250/А260 А280/А260 0,85 0,22 0,45 2,12 0,75 0,38 0,96 0,67

Соотношение величин оптических плотностей при рН 7,0 А250/А260 А280/А260

0,80 0,15 0,84 0,97 0,75 0,38 1,17 0,66

* Трифосфаты, полученные из индивидуальных монофосфатов

Таблица 6. Спектральные характеристики дезоксирибонуклеозид-5'-

трифосфатов

<1ЫТР (1АТР ёСТР с1ТТР сЮТР

Содержание основного вещества в сухом препарате 98,5% (99,5%)* 99,4% (99,7%)* 99,6% (98,6%)* 99,2% (98,2%)*

Хромато графическая чистота 96% (96%)* 98% (97%)* 98,8% (98%)* 99% (98 %)*

Соотношение величин Оптических ьплотностей при рН 2,0 А250/А260 А280/А260 0,81 0,22 0,44 2,14 0,63 0,71 1,01 0,71

Соотношение величин оптических плотностей при рН 7,0 А250/А260 А280/А260

0,78 0,15 0,82 0,98 0,65 0,73 1,16 0,66

"Трифосфаты, полученные из индивидуальных монофосфатов

ВЫВОДЫ

1. Разработан новый комплексный подход выделения ферментов из поджелудочной железы крупного рогатого скота, позволяющий получать высокоочищенные и высокоактивные ферментные препараты РНКазы, ДНКазы, холестеролэстеразы и трипсина из одной партии сырья.

2. Создана база высокоочищенных субстратов РНК и ДНК для анализа активности нуклеаз и получения на их основе (ЮТР и ОТР.

3. Создана ферментная база для получения нуклеотидов на основе доступного сырья ДНК-азы из поджелудочной железы крупного рогатого скота и Б'-нуклеазы из амилоризина.

4. Получены с использованием собственной субстратной и ферментной базы высокоочищенные дезокси- и рибонуклеозид-5'-монофосфаты с высокими выходами.

5. Разработаны новые процедуры сопряжённого фосфорилирования

продуктов гидролиза РНК и ДНК до дезокси- и рибонуклеозид-5-трифосфатов.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Хомов В.В., Рябченко A.B., Бочков Д.В., Боровцова O.A. Гетерогенные катализаторы в процессе биоконверсии нуклеиновых кислот и их предшественников // Материалы 1-ого Международного Конгресса по биотехнологии. - Москва, 2002.- С. 443 - 444.

2. Бочков Д.В., Рябченко A.B. Разработка комплексной технологии получения биологически активных веществ из поджелудочной железы крупного рогатого скота // Материалы XL международной научной студенческой конференции «Студент и научно-технический прогресс». - Новосибирск, 2002,-С. 29-30.

3. Бочков Д.В. Новые подходы к синтезу нуклеотидов (дезокси- и рибонуклеозид - 5/-монофосфатов) и их полифосфатов // Аспирантский сборник статей. - НГПУ (Новосибирск).- № 3 - 2003.- С. 225.

4. Бочков Д.В., Рябченко A.B. Совмещенная технология получение биологически активных веществ из поджелудочной железы крупного рогатого скота и перспективы их использования // Аспирантский сборник статей.- НГПУ (Новосибирск).-№ 3.- 2003.- С. 218.

5. М. Bayaijargal., Khomov V.V., Bochkov D.V., Dolgor D., Gan-Erdene Т., Regdel D. A nev approach in the technology for obtaining pancreatin // The Second International Conference on Chemical Investigation and Utilization of Natural Resources.- Ulan-Bator. (Mongolia).- 2003,- C. 45.

6. Бочков Д.В., |Хомов В В^ Пашковская Н.В. Комплексная технология получения высокоочищенных ферментных препаратов: РНК-азы, ДНК-азы, холестерол эстеразы и трипсина из поджелудочной железы крупного рогатого скота // Наука производству - 2004.- № 5.- С. 56 - 59.

7. Хомов В.В., Бочков Д.В., Боровцова О.Ю. Гетерогенный биокатализ в процессах получения (дезокси) рибонуклеозид-5/-монофосфатов и их

полифосфатов // Материалы 2-ого Международного Конгресса по биотехнологии.- Москва, Часть 2,2003,- С. 192 - 193.

8. [В.В. Хомов|, Д.В.Бочков, Т.Г.Толстикова. Новый подход к получению ДНКазы, РНКазы, холестеролэстеразы и трипсина высокой активности из поджелудочной железы крупного рогатого скота И Доклады академии наук,-2005.- том 400.- №3,- С. 409 - 412.

9. ¡Хомов В.В], Бочков Д.В., Толстикова Т.Г. Новый подход к получению дезоксирибо- и рибонуклеозид-5'-монофосфатов и их трифосфатов // Доклады академии наук,-2005.- том 401.- № 3.-С. 403-405.

10. |В.В. Хомов|, Д.В.Бочков, Т.Г.Толстикова. Гидролитический способ получения дезокси- и рибонуклеозид-5/монофосфатов и ферментативный синтез их полифосфатов // Биохимия,- 2006.- том 71,-№ I,- С. 97 - 102.

i !

I >

! Ï

Лицензия ЛР №020059 от24.03.97

Подписано в печать 7.11 05 Формат бумаги 60x84/8. Печать ИвО. Уч.-щд.л. 1,5. Усл. п.л. 1,4. Тираж 100 экз.

_Заказ № 64.__

Педуниверситег, 630126, Новосибирск, Вилюйская, 28

№25116

РНБ Русский фонд

2006-4 1

28797 V

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Бочков, Денис Владимирович

Список сокращений.

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Ферменты, содержащиеся в поджелудочной железе животных и методы их выделения.

1.1.1. Рибонуклеаза (РНКаза).

1.1.1.1. Получение рибонуклеазы (РНКазы).

1.1.2. Дезоксирибонуклеаза (ДНКаза).

1.1.2.1. Получение дезоксирибонуклеазы (ДНКазы). ф 1.1.3. Фермент холестеролэстераза.

1.1.3.1. Получение холестеролэстеразы.

1.1.4. Фермент трипсин.

1.1.4.1. Получение трипсина.

1 ^.Использование ферментов нуклеазного действия для получения рибо- и дезоксирибонуклеозид-5-монофосфатов и биосинтез их полифосфатов

1.2.1 .Перспективные микробные нуклеазы.

1.2.1.1. Перспективный фермент нуклеазного действия - S'-нуклеаза и ф технология его выделения.

1.2.2. Синтез рибо- и дезоксирибонуклеозид-5 - трифосфатов.

1.2.3. Иммобилизация ферментов.

1.2.4. Методы модификации сорбентов.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

3.1. Разработка методов получения РНКазы, ДНКазы, трипсина и холестеролэстеразы из поджелудочной железы крупного рогатого скота. ф 3.1.1. Получение "грубых" экстрактов ферментов: РНКазы, ДНКазы, трипсина и холестеролэстеразы.

3.1.2. Фракционирование ферментов экстракта поджелудочной железы сульфатом аммония.

3.1.2.1. Выделение и анализ холестеролэстеразы.

3.1.2.2. Выделение и анализ трипсина.

3.1.2.3. Выделение и анализ ДНКазы.

3.1.2.4. Получение РНКазы высокой очистки.

3.1.2.5. Получение субстрата (РНК) для анализа активности фермента рибонуклеазы.

3.1.2.6. Эффективность предлагаемого метода получения ферментов РНКазы, Щ ДНК-азы, трипсина и холестеролэстеразы из поджелудочной железы крупного рогатого скота.

3.2. Новые подходы к синтезу дезоксирибо- и рибонуклеозид-5/-монофосфатов и их трифосфатов.

3.2.1. Получение субстрата ДНК для получения нуклеотидов.

3.2.2. Выделение Б'-нуклеазы из микробиологической субстанции — амилоризина.

3.2.3.Иммобилизация S'-нуклеазы.

3.2.3.1. Адсорбционная иммобилизация S'-нуклеазы на углерод минеральных ф неорганических носителях.

3.2.3.2. Исследование ковалентной иммобилизации S'-нуклеазы на силикатных носителях.

3.2.4. Гидролиз нуклеиновых кислот ферментом Б'-нуклеазой.

3.2.5. Получение и анализ ацетилфосфата лития.

3.2.6. Ферментативное фосфорилирование индивидуальных NMP.

3.2.7. Получение dNTP и NTP сопряжённым фосфорилированием продуктов гидролиза РНК и ДНК.

ГЛАВА 4. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

4.1. Получение ферментов РНКазы, ДНКазы, трипсина и хол естеролэстеразы.

4.1.1. Получение субстрата (РНК) для анализа активности фермента рибонуклеазы.

4.1.2. Очистка ферментов РНКазы, ДНКазы, трипсина и хол естеролэстеразы.

4.1.3. Электрофоретический анализ чистоты ДНКазы и РНКазы.

4.1.4. Определение удельной активности ферментов.

4.1.5. Стерилизация, розлив и лиофильная сушка.

4.2. Новые подходы к синтезу дезоксирибо- и рибонуклеозид-б'-монофосфатов и их трифосфатов.

4.2.1. Получение субстрата (ДНК) для ферментов ДНКазы и S1-нуклеазы.

4.2.2. Выделение ферментного препарата 8!-нуклеазы из амилоризина.

4.2.3. Определение активности З^нуклеазы.

4.2.4. Иммобилизация З'-нуклеазы.

4.2.5. Гидролиз ДНК ферментом Б'-нуклеазой.

4.2.6. Гидролиз РНК Б^нуклеазой в растворе.

4.2.7. Гидролиз РНК иммобилизованной З^нуклеазой.

4.2.8. Последовательный гидролиз ДНК ферментами ДНК-азой и иммобилизованной Б^нуклеазой.

4.2.9. Последовательный гидролиз ДНК ферментами ДНКазой и не иммобилизованной З'-нуклеазой.

4.2.10. Получение и анализ ацетилфосфата лития.

4.2.11. Выделение суммарного препарата нуклеотидилкиназ с ацетокиназой.

4.2.12. Ферментативное фосфорилирование индивидуальных NMP.

4.2.13. Ферментативное фосфорилирование NMP и dNMP в смеси.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Новые методы получения высокоочищенных нуклеаз и нуклеотидов из животного и микробиального сырья"

Постоянное расширение спектра работ по химико-ферментативному синтезу генетического материала, исследований в области молекулярной биологии, генной диагностики ставит задачу создания новых высоко эффективных методов получения ферментов обмена нуклеиновых кислот, предшественников и создание на их основе нуклеотидной базы.

Анализ известных методов получения ферментов вообще, и ферментов биосинтеза нуклеиновых кислот и их предшественников в частности, показал, что практически все методы чаще всего направлены на получение одного реже двух индивидуальных ферментов. Огромные же количества так называемого "балластного" белка или "примесных" активностей, не содержащие целевого фермента отбрасываются. Кроме того, методы очистки ферментов биосинтеза нуклеиновых кислот чрезвычайно разнообразны. Всё это создаёт ряд трудностей при организации производства данных ферментов в промышленных масштабах, приводит к нерациональному использованию материальных и трудовых ресурсов.

Одним из перспективных направлений, позволяющих успешно решить поставленные задачи по созданию экономичного, эффективного и надёжного промышленного подхода к получению ферментных препаратов, является унификация процедур фракционирования клеточных экстрактов и комплексное использование микробиологического и животного сырья, позволяющая получать несколько ферментных препаратов из одного образца биомассы.

Одновременное выделение внутриклеточных ферментов из одного и того же образца сырья осуществляется пока крайне редко, изучение его началось, по сути дела, только в последнее время. Перспективность совмещённых методов выделения ферментных препаратов, позволяющая более рационально использовать сырьё, реагенты и оборудование бесспорна. Бесспорна также необходимость проведения в этом направлении серьёзных и систематических исследований, которые в настоящее время, к сожалению, проводятся недостаточно активно и в России и за рубежом.

В связи с интенсивным развитием молекулярной биологии и генной инженерии, в настоящее время остро возникла проблема получения нуклеотидов, которые являются основными реагентами для проведения исследований в данных областях. Нуклеотиды являются к тому же основными реагентами в медицинских диагностических тест-системах, широко использующихся для диагностики бактериальных, вирусных, онкологических и генетических заболеваний.

В настоящее время производство нуклеотидов в нашей стране практически прекращено, одной из причин этого стала высокая стоимость змеиного яда.

К числу путей снижения себестоимости дезокси- и рибонуклеотидов относится поиск более дешевых и доступных ферментных препаратов, например, микробных, способных осуществлять гидролиз нуклеиновых кислот. Второй путь удешевления производства компонентов биосинтеза нуклеиновых кислот - применение в подходах получения иммобилизованных ферментов и создание на их основе биореакторов.

В связи с этим целью настоящей работы является получение высокоочищенных ферментных препаратов: РНКазы, ДНКазы, трипсина и холестеролэстеразы, а также создание нового простого и экономичного подхода к препаративному синтезу нуклеотидов и их полифосфатов.

Научная новизна.

1. Найден подход, позволяющий разработать метод одновременного получения РНКазы, ДНКазы, трипсина и холестеролэстеразы высокой чистоты, из одной животного партии сырья.

2. Впервые, для очистки белков использованы методы ультрафильтрации на установках с полыми волокнами и хроматографической очистки на ДЭАЭ-целлюлозе, позволяющие добиться высокой очистки фермента рибонуклеазы.

3. Создана ферментная база для получения нуклеотидов на основе доступного сырья: дезоксирибонуклеазы из поджелудочной железы крупного рогатого скота и S!-Hyjaiea3bi из амилоризина.

4. Впервые показано, что использование проточного биореактора с иммобилизованной S1-нуклеазой является перспективным общим подходом к получению рибо- и дезоксирибонуклеозид-З'-монофосфатов.

5. Разработаны новые процедуры сопряжённого фосфорилирования продуктов гидролиза РНК и ДНК до дезокси- и рибонуклеозид-б'-трифосфатов с высокими выходами и высокой чистотой.

Цель исследования.

Разработка нового подхода, позволяющего получать высокоочищенные ферментные препараты: РНКазы, ДНКазы, трипсина и холестеролэстеразы.

Создание нового экономичного метода препаративного синтеза нуклеотидов и их полифосфатов.

Основные задачи исследования.

2. Создать базу высокоочищенных субстратов РНК и ДНК для анализа ферментов нуклеазного действия.

3. Создать ферментную базу для получения нуклеотидов: ДНКазы из поджелудочной железы крупного рогатого скота (ПЖ КРС ) и S1 -нуклеазы из амилоризина.

4. Получить с использованием собственной субстратной и ферментной базы высокоочищенные дезокси- и рибонуклеозид-57- монофосфаты с высокими выходами.

Практическая значимость работы.

Разработанный подход получения ферментов (РНКазы, ДНКазы, трипсина и холестеролэстеразы) можно использовать в промышленном получении данных ферментов.

Разработанная процедура фосфорилирования продуктов гидролиза РНК и ДНК иммобилизованной Б'-нуклеазой до дезокси- и рибонуклеозид-57-трифосфатов может быть использована в процессах промышленного производства данных веществ.

Разработанный эффективный метод ковалентной иммобилизации S1-нуклеазы на силикатных носителях и создание биореактора непрерывного действия на его основе позволяет упростить получение дезокси- и рибонуклеозид-5/-монофосфатов.

Объём и структура диссертации.

Диссертационная работа изложена на 130 листах печатного текста и состоит из введения, обзора литературы, результатов и обсуждения, экспериментальной части, заключения и списка литературы. Диссертация иллюстрирована 15 рисунками и 12 таблицами. Список литературы содержит 209 источников, из которых 86 опубликованы в отечественных и 123 в зарубежных изданиях.

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Бочков, Денис Владимирович

выводы

2. Создана база высокоочищенных субстратов (РНК и ДНК) для анализа ферментов нуклеазного действия.

3. Создана собственная ферментная база для получения нуклеотидов на основе доступного сырья {ДНКазы из поджелудочной железы КРС и S1-нуклеазы из амилоризина).

4. Получены с использованием собственной субстратной и ферментной базы высокоочищенные дезокси- и рибонуклеозид-З7- монофосфаты с высокими выходами.

5. Разработаны новые процедуры сопряжённого фосфорилирования продуктов гидролиза РНК и ДНК до дезокси- и рибонуклеозид трифосфатов.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Анализ литературы, освещающей вопрос о получении ферментов из биологического сырья, показал, что практически все методы ограничены получением одного, реже двух индивидуальных ферментов. Большое количество так называемого "балластного" белка, не содержащего целевого фермента, отбрасываются. Между тем каждый вид биологического сырья содержит целый ряд ферментов, которые при надлежащем технологическом подходе можно извлекать, в том числе и промышленном масштабе.

В настоящей работе изучена возможность совместного получения четырёх высокоочищенных ферментов: рибонуклеазы {РНКазы), дезоксирибонуклеазы {ДНКазы), трипсина и холестеролэстеразы из одной партии поджелудочной железы крупного рогатого скота (ПЖ КРС).

На основе полученных данных разработан лабораторный регламент получения вышеупомянутых ферментов из поджелудочной железы, который может быть положен в основу создания промышленной технологии.

Интенсивное развитие молекулярной биологии и генной инженерии вызвало возрастающую потребность в нуклеотидах, необходимых как для проведения исследований, так и для разработки медицинских диагностических тест-систем, используемых для диагностики бактериальных, вирусных, онкологических, генетических и других заболеваний.

Поэтому актуальной является разработка новых технологий получения дезокси- и рибонуклеотидов, которые смогли бы обеспечить растущие потребности.

Известная промышленная технология получения дезокси- и рибонуклеотидов, основанная на ферментативном гидролизе нуклеиновых кислот (ДНК, РНК соответственно) панкреатической дезоксирибонуклеазой

ДНКазой) (источник Ser. marcesens) и фосфодиэстеразой (источник змеиный яд), в настоящее время стала весьма неэкономичной из-за высокой стоимости ферментной базы.

Видимыми путями снижения себестоимости нуклеотидов являются:

- создание биореакторов на основе иммобилизованных ферментов.

В настоящей работе найден путь снижения себестоимости нуклеотидов за счёт использования доступных ферментов нуклеазного действия, а именно панкреатической дезоксирибонуклеазы из поджелудочной железы крупного рогатого скота и S1-нуклеазы из амилоризина.

В данной работе изучена возможность использования панкреатической дезоксирибонуклеазы (ДНКазы) в качестве реагента для получения олигонуклеотидов ДНК. Кроме того, отражён новый подход к получению дезоксирибонуклеозид-б'-монофосфатов с использованием предгидролиза ДНК ДНКазой с последующим гидролизом полученных олигонуклеотидов ферментом S1 -нуклеазой.

Так же найдены оптимальные условия для иммобилизации фермента S1-нуклеазы на модифицированных силикатных носителях и возможность гидролиза нуклеиновых кислот (ДНК и РНК) иммобилизованной S1-нуклеазой с образованием соответственно дезокси- и рибонуклеозид-5/-монофосфатов. В связи с этим, с применением метода ковалентной иммобилизации S1 -нуклеазы на силикатных носителях разработан биореактор непрерывного действия, перспективный для реализации экономичной технологии получения дезокси- и рибонуклеозид-5/-монофосфатов.

Разработаны две процедуры фосфорилирования с помощью суммарного препарата нуклеотидилкиназы с ацетокиназой ("киназная фракция") продуктов гидролиза ДНК и РНК до соответствующих дезокси- и рибонуклеозид-57-трифосфатов, а именно, фосфорилирование индивидуальных дезокси- и рибонуклеозид-5/-монофосфатов, так и в их смеси.

Было установлено, что совместное фосфорилирование продуктов гидролиза РНК или ДНК "киназной фракцией" приводит к уменьшению стадий, времени и экономии ферментов в проведения технологического процесса. Положительным моментом данного подхода является о бразование минимального количества дезокси- и рибонуклеозид-5/-дифосфатов, которые в свою очередь также подвергаются фосфорилированию до соответствующих трифосфатов.

Разработанные схемы получения ферментов нуклеазного действия и нуклеотидов можно рекомендовать для использования в промышленных технологиях.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Бочков, Денис Владимирович, Уфа

1. Кольман Я., Рем К. Г. Наглядная биохимия изд. Москва: Мир, 2000.- 469 с.

2. G. D'Alessio, J.F. Riordan. Ribonucleases. Structures and Functions. // Academic Press, New York.-1997.-450 p.

3. T.N. Plummer Jr, C.H.W. Hirs. On the structure of bovine pancreatic ribonuclease b. isolation of a glycopeptide. // J. Biol.Chem.-1964.-vol. 239.- P. 2530 2536.

4. C.J. Liang, K. Yamashita, A. Kobata. Structural study of the carbohydrate moiety of bovine pancreatic ribonuclease B. // J. Biochem (Tokyo).-1980.- vol. 88.- P. 51 58.

5. R.L. Williams, S.M. Greene, A. McPherson. The crystal structure of ribonuclease В at 2.5-A resolution. // J. Biol. Chem.-1987.- vol. 262.- P. 1602 -1610.

6. Giancola C., Del Vecchio P., De Lorenzo C., Barone R., Piccoli R., D'Alessio G., Barone G. Thermodynamic stability of the two isoforms of bovine seminal ribonuclease. // Biochemistry.- 2000,- vol. 39.- P. 7964-7972.

7. Гауровиц Ф. // Химия и функция белков. М: Мир, 1979.-360 с.

8. Blackburn Р, Wilson G, Moore S. Ribonuclease inhibitor from human placenta. Purification and properties. // J Biol Chem. -1977,- vol. 252,- P. 5904-5910.

9. Di Donato A., Cafaro V., D'Alessio G. Ribonuclease A can be transformed into a dimeric ribonuclease with antitumor activity. // J. Biol. Chem.-1994.- vol. 269.- P. 17394 17396.

10. Di Donato A., Cafaro V., Romeo I., D'Alessio G. Hints on the evolutionary design of a dimeric RNase with special bioactions. // Protein Sci.-1995.- vol. 4.- P. 1470 1477.

11. Kim J.-S., Soucek J., Matousek J., Raines R.T. Mechanism of ribonuclease cytotoxicity. // J. Biol. Chem.-1995.-vol. 270,-P. 31097-31102.

12. Безбородова С. И., Васильева-Танкова Е. С. // Прикладная биохимия и микробиология,-1986,- т 22.- №4.- С. 117-121.

13. Салганик Р. И., Трухачёв А.А., Баталина Т.А. Ингибиторы вирусной активности. Рига Зинатне, 1972,- С. 147 - 152.

14. Михайлов А. М., Серебренников В. М., Кабаева Н. Я. // Прикладная биохимия и микробиология.-1993.- Т. 29.-№2.-С.198-201.

15. Банников Г. Е., Варламов В. П. // Прикладная биохимия и микробиология.- 1994.- Т. 30,- №3.-С. 379-384.

16. Безбородова С. И., Ермекбаева А. А., Шляпников С. В., Поляков К.М., Безбородое A.M. Рибонуклеаза Ар1 из Aspergillus pallidus. Очистка, первичная структура и кристаллизация. // Биохимия.-1988.- Т. 53.- №6.- С. 965-973.

17. Паолетти С.Н., Гросс С., Де Пек Н.Б. // Биохимия,- 1963.- Т. 4,- №3,- С. 647 652.

18. Herriot R.M., Connrlly J.H., Esupta S. //Nature.- 1961,- № 189.- P. 817- 820.

19. Глухов Б.М. // Вопросы патогенеза и терапии органосклерозов.- Новосибирск, 1967.1. C. 282-289.

20. Максимович М.Б., Лисовская С.П., Парфёнова М.С. // Журнал микробиологии эпидимиологии и иммунологии.- 1974.- № 11.- С. 58 63.

21. Liu Y.-Y., Liu Н.-С. Studies on infectious RNA of Japanese b encephalitis virus. II. Change of RNAse activity in mouse brains during virus and RNA infections. // Sci Sin.- 1963- P. 1553-1561.

22. Williams M.V., Ablashi D.V., Salahuddin S.Z., Glaser K. Demonstration of the human herpesvirus 6-induced DNA polymerase and DNase. // AIDS Rts. And Hum. Retrovirus es.-1990.- vol. 6.-№1.-P. 151-155.

23. Burke D.C. The mechanism of interferon production. // Tex. Repts. Biol. Med.- 1982.- vol. 42,- P. 13-18.

24. Baron S., Howie V., Langford M., Macdonald E. M., Stanton G.L., Reitmeyer J., Weigent

25. D.A. Induction of interferon by bacteria, protozoa, and viruses: defensive role. // Tex. Repts. Biol.Mrd.- 1982,-vol. 41.-P. 150- 157.

26. Baglioni C., Maroney P., Nilsen T.W. Assay for (2'-5')-oligo(A)-dependent endonuclease activity. // Methods Enzymol.-1981,- vol. 79.- PtB.- P. 249 257.

27. Colonno R.J., Pang R.H.L. Induction of unique mRNAs by human interferons. // J. Biol. Chem.- 1982,- vol. 257.- № 16.- P. 9234 9237.

28. Lewis J.A., Falkoff R. Assay of double-stranded RNA-dependent endonuclease activity. // Methods Enzymol.-1981,- vol. 79.- P. 265.- 273.

29. Салганик P. И., Баталина Т. А. Изучение механизмов действия рибонуклеазы на размножение вируса ящура. // Изв. СО АН СССР.- 1968- С. 71-75.

30. Полтьев В.И., Салганик Р.И., Талпацкий П.Л. Действие рибонуклеазы на вирус паралича пчёл. // Известия сибирского отделения академии наук СССР.- 1971.- С. 149 -152.

31. Губенко И. С. // Изв. СО АН СССР. Серия биол.-мед наук. 1966,- №4,- С. 78-81.

32. Кассиль Г. Н. Гемато-энцефалический барьер,- М.: Мир.- 1963.- 68 с.

33. Шамбуров Д. А. Спинномозговая жидкость.- М.: Мир.- 1954.- 47 с.

34. Штерн Л. С. Гематоэнцефалический барьер.- М.: Мир. 1935.- 25 с.

35. Салганик Р. И., Ятель Т. П., Томсон В. М. // Изв. СОАН СССР.- 1961.- №12.- С. 78 -80.

36. Лобзин В. С., Сичко Ж. В. // Лечение рибонуклеазой больных серозными менингитами. Ленинград: врачебное дело. -1969.- С.69.

37. Машковский М.Д. Лекарственные средства. Том 2. Издание 14 переработанное.-М: Медицина, 2001.- 608 с.

38. McDonald M.R. Specificity of ribonuclease in hydrolyzing cytidine-2':3'-phosphate. // Biochim Biophys Acta. 1955,- vol. 18. - P. 138 - 139.

39. Заявка 2000116984/13 RU С12№9/22. Способ получения панкреатической рибонуклеазы / Красноштанова А.А., Баурина М.М., Кашкина Е.А., Крылов М.М Опубл. 03.27 2002; Бюл. № 7. Приоритет 2000.06.30, № 2180918 (RU).

40. N. Nomura, N. Inokuchi, Н. Kobayashi, Т. Koyama, М. Iwama, К. Ohgi, М. Irie. Purification and primary structure of a new guanylic ribonuclease from Pleurotus ostreatus. II J. Biochem. (Tokyo).- 1994.- vol. 116.- C. 26 33.

41. H.X. Wang, T.B. Ng, V.E.C. Ooi. A ribonuclease from sclerotia of the edible mushroom Pleurotus tuber-regium. II Biochem. Biophys. Res. Commun.- 1998.- vol. 250.- C. 544 -546.

42. H. Shimade, N. Inokuchi, H. Okugawa, T. Koyama, M. Irie. Purification and characterization of a base nonspecific and adenylic acid prefential ribonuclease from fruit bodi of Lentinus edodes. II Agr. Biol. Chem.- 1991.- vol. 55.- С. 1167 1169.

43. H. Watanabe, F. Hamid, M. Iwami, T. Onda, K. Ohgi, M. Irie. Primary structure of RNase from Irpex lacteus. // Biosci. Biotechnol. Biochem.- 1995.- vol. 59,- P. 2092 2103.

44. H.X. Wang, T.B. Ng. Isolation of a new ribonuclease from fresh fruiting bodies of the straw mushroom. // Biochem. Biophys. Res. Commun.- 1999.- vol. 264.- P. 714 718.

45. H.X. Wang, T.B. Ng. Purification and characterization of a potent homodimeric guanine-specific ribonuclease from fresh mushroom (pleurotus tuber-regium) sclerotia. // Biochemistri Cell. Biol.- 2001.- vol. 33,- P. 483 490.

46. Hascovsci M. // Arch. Biochem.- 1946,- vol 2,- P. 41-43.

47. McCarty M. The inhibition of streptococcal desoxyribonuclease by rabbit and human antisera. // J. Exp Med.- 1949.- vol. 90.- P 543-553.

48. Kunitz M. Crystalline desoxyribonuclease; isolation and general properties; spectrophotometric method for the measurement of desoxyribonuclease activity. // J. Gen Physiol.- 1950.- vol. 33.- P. 349 362.

49. Коваленко Г.А. // Изв. Сиб. отд. АН СССР.- 1982,-Вып. 1.- № 5,- С.116 120.

50. Дёмин А.А., Браун J1.A. // Научные труды Новосиб. мед. ин-та.-1976.- Т.83.- С. 112 -117.

51. Машковский М. Д. Лекарственные средства. 1998.- изд. 13.- т.2 - С 116-117.

52. Коваленко Г.А., Лапик А.С., Павлова М.П., Салганик Р.И. // Изв. СО АН СССР,-1976.- вып. 2.- № 10,- С. 117-121.

53. Коваленко Г.А., Саблина О.В., Тимина Н.Ю. // Изв. СО АН СССР.- 1982,- вып. 1.- № 5.- С. 116-121.

54. Коваленко Г.А. // Изв. СО АН СССР,- 1984.- вып. 1.- № 6.- С. 114 117.

55. Лапик А.С., Павлова М.П., Коваленко Г.А., Салганик Р.И. // Фармакология и токсикология.- 1974.- Т.37,- № 1,- С. 54 57.

56. Болдырев Л.П., Салганик Р.И. // Журнал невропатол. и психиатр.-1969.-№ 4.- С. 525 -529.

57. Гацалова Е.М. // Вопросы теоретической и клинической медицины.-Нальчик, 1973.-Вып.З.-С. 156-157.

58. Дёмин А.А., Салганик Р.И. // Изв. Сиб. отд. АН СССР.-1972.- № 5,- С. 151 152.

59. Дёмин А.А., Салганик Р.И. Терапевтический эффект дезоксирибонуклеазы при инфкции mononucleosis // Сов.мед.-1983.- № 8.- С. 91 92.

60. Худякова Н.М. // Съезд офтальмологов, 4-ый.- Киев, 1973.- С. 140 142.

61. Маниатис Т., Фрич Э., Дж. Сэмбрук. Молекулярное клонирование. М.: Мир. -1986.390 с.

62. Хомов В.В.|, Бочков Д.В., Толстикова Т.Г. // Новый подход к получению дезоксирибо-и рибонуклеозид-5/-монофосфатов и их трифосфатов. Доклады академии наук.- 2005.-Т.401.-№3.

63. Baumgaarten W, Johnson R. F., Finger R. F., et. Al. The isolation and purification of pancreatic deoxyribonuclease. // Arch Biochem.- 1958.- vol. 77.- P. 206-208.

64. Trinder P. The improved determination of iron in serum. // J. Clin Pathol.- 1956.- vol. 9.-P.170- 172.

65. Trinder P. Determination of blood glucose using an oxidase-peroxidase system with a non-carcinogenic chromogen. // Annclin Biochem.- 1969.- P.320-323.

66. Edvin A. Rudd, Nancy K.Mizuno, Howard L. Brockman. Isolation of two forms of carboxylester lipase (cholesterol esterase) from porcine pancreas. // Biochem. et Biophys. Acta.- 1987.-vol. 918.-P. 106-114.

67. Chapus, C., Desneulle, P., Foglizzo, E. Stabilization of the C-terminal part of pig and horse colipase by carboxypeptidase and trypsin inhibitors. // Eur. J. Biochem.-1981.- vol. 115.- P. 99- 105.

68. Мосолов B.B. Протеолитические ферменты.- M.: Наука.-1971.- 414 с.

69. Keil В. Tripsin // Enzymes. N. Y.; L.: Acad. Press. -1971. vol. 3.- P. 250-273.

70. Walch K. A., Wilcox P. E. Serine proteases. // Methods in enzymol. -1970.- vol. 19.- P. 31109.

71. Zeindzain E.N., Barnard E.A. Distributions of pancreatic ribonuclease, chimotrypsin and trypsin in vertrbrates. // arch. Biochem. And Biophis.- 1967.- vol. 122.- № 3.- P. 699-713.

72. Reek J. R., Winter W. P., Neurath H. Pancreatic enzymes of African lingfish Protopterus aethiopicus // Biochimistri.- 1970.- vol. 9.- № 6,- P. 1398-1403.

73. Заявка 4602934/14 SU. C12N9/76. Способ получения трипсина / Ночевный В.Т. Осидзе Д.Ф. (SU). Опубл. 1994.06.30; Приоритет 1988.07.29., № 16285226 (SU).

74. А.с.СССР N 336989, МКИ С 07 F51/50,1970.

75. Лещинская И.В. Бактериальные нуклеазы.- Казань: ЮГУ. 1964. - С. 39-47.

76. Лещинская И.В. Методы и некоторые результаты изучения нуклеиновых кислот и ферментов нуклеинового обмена. Казань: КГУ. - 1967. - С. 47-52.

77. Sato N., Egami F. The specificity of T1 ribonuclease. // J. Biochem.- 1957. vol. 44. - P. 1144-1150.

78. Заика А.И., Тяглов B.B. // Биотехнология. 1996. - №1. - С. - 23-27.

79. Tanaka К, Cantoni G.L. On the specificity of RNAse from streptomyces erythreus. // Biochem. Biophys. Acta. 1963. - vol. 72. - P. 641-650.

80. Львова Т.Н., Амбросимова-Амельянчук H.M., Татарская Р.И. // Междунар. Симпоз. По молек. Биол., вирус. И генетике. М., 1972. - С. 14.

81. А. с. СССР N1321065, МКИ с 12 Р 19/38,1987.

82. А. с. СССР N1552652, МКИ с 12 Р 19/40 А61 К 37/10 // (с 12 Р 19/34 с RI:645), 1990.

83. Баскакова А.А., Балдина А.В., Безбородов A.M. // Микробиология. 1967.- Т. 36. - С. 19-24.

84. Ando Т. Nuclease specific for heat-denatured DNA isolated from a product of Aspergillus oryzae. // Biochim et Biophys. Acta. 1966. - vol. 144. - P. 158-163.

85. Vogt V.M. Purification and further properties of single-strand-specific nuclease a product Aspergillus oryzae. // Eur. J. Biochem.- 1973.- vol. 33,- P. 192-200.

86. Загребельный С.Н., Камынина Т.П., Пустошилова Н.М., Ривкин М.Е. // Прикл. биохимия и микробиология.-1981.-Т. 17.- вып.1.-С.113-120

87. Rashizky G.W., Shaternikov V.A., Mozejko J.H., Sober Н.A. S'-nuclease hydrolysis of zingle-stranded nucleic acids with partial double-stranded configuration. // Biochemistri.-1975,-vol. 14.-№ 19.-P. 4221.

88. Slor H. Purification of S'-nuclease from tanadiastase by affinity chromatography on single-stranded DNA-acrylamide columns. // Nucl. Acids Res.- 1976.- vol. 2.- № 4.- P. 587.

89. Hahn E.W., Jeffrey Van Ness. Elimentation of Double Strand Nuclease activity from S1-nuclease prepared from crude a-amylase. //Nucl. Acids Res.- 1976.- vol. 3,- № 5.- P. 1419.

90. Gannon F., Jrltsch J.M., Perrin F. A detailed comparison of the 5'-end of the ovalbumin gene cloned from chicken oviduct and erythrocyte DNA. // Nucleic Acids Res.- 1980.- vol. 8,-P. 4405-4421.

91. Burdon M.G., Lees J.H. Double-strand cleavage at a two-base deletion mismatch in a DNA heteroduplex by nuclease SI. // Biosci Rep.- 1985.- vol. 5.- P. 627 632.

92. Silber J.R., Loeb L.A. SI nuclease does not cleave DNA at single-base mis-matches. // Biochim Biophys Acta.- 1981.- vol. 654.- P. 256 264.

93. Serror P., Hetraud F., Heizmann P. Chloroplast DNA variability in the genus Helianthus: restriction analysis and SI nuclease mapping of DNA-DNA heteroduplexes. // Plant Mol. Biol.- 1990.-vol. 15.-P. 269 280.

94. Barnes W.M. PCR amplification of up to 35-kb DNA with high fidelity and high yield from lambda bacteriophage templates. // Proc. Natl. Acad Sci USA.- 1994.- vol. 91.- P. 2216 -2220.

95. Cheng S., Fockler C., Barnes W.M., Higouchi R. Effective amplification of long targets from cloned inserts and human genomic DNA. // Proc. Natl. Acad Sci USA.- 1994.- vol. 91.-P. 5695-5699.

96. Lin J., Davis T.M. // Theor Appi Genet.- 2000.- vol. 101.- P. 415 420.

97. Davidson J.N. Progress in nucleic acids // Cohn W.E.N.Y.: Acad. Press, 1963,- vol. 1.- P. 280.

98. Maniatis Т., Kee S.G., Efstratiadis A., Kafatos F.C. Amplification and characterization of a p-globin gene synthesized in vitro. // Cell.- 1976.- vol. 8.- № 2,- P. 163.

99. Crestfield A.M., Stein W.H. On the aggregation of bovine pancreatic ribonuclease. // J. Biol.Chem. -1962.- vol. 238.- P. 618.

100. Nirenberg M.W., Matthaei J.N. The dependence of cell-free protein synthesis in E. coli upon naturally occurring or synthetic polyribonucleotides. // Proc. Nat. Acad. Sci. USA.-1961.-vol. 47.-P. 1588-1694.

101. Hoard D.E., Ott D.G. Conversion of mono- and oligodeoxyribonucleotides to 5;-triphosphates. // J. Amer. Chem. Soc.- 1965.- vol. 8.- №. 8,- P. 1785 1788.

102. Mullis K.B., Faloona F.A. Specific synthesis of DNA in vitro via a polymerase-catalyzed chain reaction. // Methods. Enzymol.- 1987.- vol. 155.- P. 335-350.

103. A. c. 395082 опубл. Б.И. 1973. No 35.

104. Японский патент No 17634. 1966.

105. Leloir L., Olavarria J. Biosynthesis of glycogen from uridine diphosphate glucose. // Arch. Biochem. Biophys.- 1952.- vol. 81.- P. 508 520.

106. Kalkar H.M. The biological incorporation of purines and pyrimidines into nucleosides and nucleic acid. //J. Biol. Chem.- 1943.-vol. 142.-P. 127 137.

107. Любимов M.H., Певзнер Д.О. // Биохимия.-1941.- Т. 6.- С. 178 183.

108. Бреслер С.У., Фирсов JI.M., Чернаенко В.М. // Прикл. Биохим. и микробиол.- 1974.Т. 10.- С. 80-85

109. Заключительный отчет по теме БАВ 0274 / Разработка технологии получения рибонуклеозидполифосфатов. Новосибирск СКТБ БАВ. - 1978. - Т. 1.

110. Michelson A.M., Todd A.R. // J. Chem Soc.- 1949.- P. 2487-2490.

111. Kenner G., Todd A.R., Webb R.F., Weymouth F.J. // J. Chem Soc.- 1954,- P. 2288-2294.

112. Khorana H.G. Pyrophosphorylation of ribose 5-phosphate in the enzymatic synthesis of 5-phosphorylribose 1-pyrophosphate. // J. Am. Chem. Soc.- 1954.- vol. 76.- P. 3517-3522.

113. Ralph R.K., Smith R.A., Khorana H.G. Studies on polynucleotides. XV. Enzymic degradation. The mode of action of pancreatic deoxyribonuclease on thymidine, deoxycytidine, and deoxyadenosine polynucleotides. // Biochemistry. 1962.- vol. 1.- P. 131-137.

114. Reiss J.R., Moffatt J.G. Dismutation reactions of nucleoside polyphosphates. 3. Thesynthesis of alpha, omega-dinucleoside 5'-polyphosphates. // J Org Chem.- 1965.- vol.30,-P. 3381-3387.

115. Adam.A., Moffatt J.G. Dismutation reactions of nucleoside polyphosphates. VI. Chemicalsynthesis of gamma-32P.nucleoside 5'-triphosphates. // Biochemistry.- 1968.- vol. 7.- P.875.881.

116. Michelson A.M. Synthesis of nucleotide anhydride by anion exchange. // Biochim. Biophys. Acta.-1964.- vol. 91.- P. 1-13.

117. Cramer F., Fittler F., Kuentzel H., Schaefer E.A. The effect of ribonuclease andpolynucleotide phosporylase on cytidine-l-n-oxide derivative. //Naturforsch В.- 1963.-vol. 18.- P. 668-669.

118. Hoard D.E., Ott D.G. Conversion of mono- and oligodeoxyribonucleotides to 5'-triphosphates. // J. Am. Chem. Soc.- 1965.- vol. 87.- P. 1785-1788.

119. Symons R.H. Practical methods for the routine chemical synthesis of 32P-labellednucleoside di- and triphosphates. // Biochim. Biophys. Acta.- 1970.- vol. 209.- P. 296305.

120. Hata Т., Furusawa K.,Sekine M. Studies on pyrophosphates. Part III. A new method forthe synthesis of nucleotide coenzymes by means of di-n-butylphosphiothioyl bromide. // J. Chem. Soc. Chem. Commun.- 1975.- P. 196-197.

121. Загребельный C.H., Зарытова В.Ф., Левина A.C., Позднякович С.А., Ярмолинская

122. Е.В., Вершинина С.И., Рыбак В.К. // Изв. СО АН СССР. Сер. Хим. Наук.- 1978,-вып. 1.-С. 136-142.

123. Загребельный С.Н., Зарытова В.Ф., Левина А.С., Лубенец Э.Г., Хмельницкий А.Г.,

124. Яснецкая С.М. // Изв. СО АН СССР. Сер. Хим. Наук.- 1978,- вып.2.- С. 143-147.

125. Doombos J., den Hartog J.A., van. Boom J.H., Altona C. Conformational analysis of thenucleotides A2'-5'A, A2'-5'A2'-5IA and A2'-5'U from nuclear magnetic resonance and circular dichroism studies. // Eur J Biochem. -1981.- vol. 116.- P. 403-412.

126. Bartlett D.L., King C.H., Poulter C.D. Purification of farnesylpyrophosphate synthetase byaffinity chromatography. // Methods Enzymol.- 1985.- vol. 110.- P. 171-184.

127. Зайцева B.E., Дяткина H.B., Краевский A.A., Турина О.В., Готтих В.П., Ажаев А.В.

128. Биоорган, химия,- 1984.- Т. 10.- С. 670-680.

129. Гришаев М.П., Рукавишников М.Ю., Самуков В.В., Аммосов А.Д., Портнянко А.П.,

130. Сидоров В.Н. // I Всесоюз. совещ. "Биологически-активные соединения, меченные радиоактивными изотопами". Тез. докл. М., 1985.- С.56.

131. Богачёв B.C. Синтез дезоксинуклеозид-5/-трифосфатов с использованием в качествеактивирующего реагента трифторуксусного ангидрида. // Биоорган, химия.- 1996.Т. 22.- № 9.- С. 699-705.

132. Miyamoto N., Fujii Т., Minra Y. // J. Ferment Technol. 1971. - vol. 49. - P. 1310.

133. Черкасова T.A., Вонский B.E., Лейкин Ю.А. // Прикл. Биохимия и микробиология.-1991.- Т. 27.- вып. 6.- С. 809- 813.

134. Николаев АЛ., Бенько Е.М., Вовченко Г.Д. // Журн. Физ. и химии.- 1973.- Т. 47.- С. 1310.

135. Maeda Н., Suzuki Н., Sakimae A. Preparation of immobilized enzymes by N-vinylpyrrolidone and the general properties of the glucoamylase gel. // Biotechnol. Bioeng.-1974.-vol. 16.-P. 1517-1528.

136. Николаев А.Л., Мардашев C.P. // Биохимия.-1961.- Т. 26.- С. 641 648.

137. Sauerman G. Continuous flow system with immobilized nuclei. A method for kinetic studies on RNA metabolism. // Biochem. Biophys. Res. Comm.- 1970.- vol. 39.- P. 738 -742.

138. Thang M.N., Graffe M., Grunberg-Manago M. Observations on the activity of enzymes after filtration on (and through) a nitrocellulose membrane. // Biochem. Biophys. Res. Comm.- 1968.-vol. 31.-P. 1 8.

139. Kabamoto N., Lofroth G., Camp P., VanAmburg G., Augenstein L. Specificity of trypsin adsorption onto cellulose, glass, and quartz. // Biochem. Biophys. Res. Comm.- 1966.- vol. 22,- P. 622 627.

140. Goldman R., Lenhoff H. Glucose-6-phosphate dehydrogenase adsorbed on collodion membranes // Biochemistry.-1971.- vol. 242.- P. 514-518.

141. Березин В.Б., Лахтин B.M., Ямсков И.А. // Прикл. Биохимия и микробиология.-1995.-Т. 31.-№ 4.-С. 400 405.

142. Axen R., Porath J., Eruback S. Chemical coupling of peptides and proteins to polysaccharides by means of cyanogen halides. // Nature.- 1967.- vol. 214.- P. 1302 1304.

143. Porath J., Axen R., Eruback S. Chemical coupling of proteins to agarose. // Nature.- 1967.-vol.215.-P. 1491-1492.

144. Hoffman C.N., Harris Т., Chrodroff J. Polynucleotide phosphorylase covalently bound to cellulose and its use in the preparation of homopolynucleotides. // Biochim. Biophys. Res. Comm.-1970.- vol. 41.- P. 710 714.

145. Smith J.C., Strafford I.J. Flexural fatigue tests of some denture base polymers. // FEBS Lett.- 1973.- vol. 30.- P. 246 248.

146. Суходольская Г.В., Амгелова B.A., Кощеенко K.A. // Прикл. Биохимия и микробиология.-1991.- вып. 5,- №. 27.- С. 701 711.

147. Glassmeyer С.К., Ogle J.D. Properties of an insoluble form of trypsin. // Biochemistry.-1971.-vol. 10.-P. 784-792.

148. Van-Leemputten E., Horisberger M. Letter: Immobilization of trypsin on partially oxidized cellulose. // Biotechnol. And BI-oeng.- 1974.- vol. 16.- P. 997 1003.

149. Модифицированные кремнеземы в сорбции, катализе и хроматографии. / Под ред. Г.В. Лисичкина.- М.: Химия, 1986.- 248 с.

150. Unger К.К. Porous silica, its properties and use as support in column liguid chromatography. // J. Cromatogr. Librari. Amsterdam: Elservier. 1979.- vol.16.- 336 p.

151. Энгельгардт X. Жидкостная хроматография при высоких давлениях.- М.: Мир, 1980.-С. 83-216.

152. Хохлова Е.Д., Никитин Ю.О., Ворошилова О.И. Макропористые кремнеземы в иммобилизации и хроматографий биополимеров. // Журнал Всесоюз. Хим. общ.-1989.-Т. 34,-№ 3.-С. 366 377.

153. Химическая энциклопедия. М.: Советская энциклопедия, 1990.- Т. 2.- С. 443-444.

154. Petro М., Berek D. Polymers immobilized on silica gels as stationary phases for liquid chromatography Review., // Chromatographia.- 1993.- vol. 37.- № 9 10.- P. 549 - 561.

155. Leonard. M. New packing materials for protein chromatography. // J. Chromatogr. B: Biomed. Applicat.- 1997.- vol. 699,- № l 2.- P. 3 - 27.

156. Mohr P., Pommtrening K. In: Affinity chromatography: Practical and Teoretical aspect. / Ed. Cazes J.N.Y.: Marcel Dekker, 1985.

157. Mingalyov, P.G.; Fadeev, A.Y. Activated silica supports forpreparation of chromatographic sorbents. A comparative study of silicas containing attached epoxy, tosyloxy and halogen groups. //J. Chromatogr, A 1996.- vol. 719.-№ 2.- P. 291 -297.

158. Ernst-Cabrera K., Wilchek M. Silica containing hydroxyl groups for Highperformance affinity chromatography. // Analit. Biochem.- 1986.- vol. 159.- № 2.- P. 267 272.

159. Kinkel J.N.,Anspach В., Unger K.K. Separation of plasma proteins of cultured human fibroplasts by affinity chromatography on bonded microparticulate silicas. // J. Chromatogr.-1984,-vol. 297.-№ 1.-P. 167-177.

160. Jonsson U., Malmqvist N., Ronberg I. Immobilization of immunoglobulins on silica surface. I. Stability. // Biochem. J.- 1985.- vol. 227.- № 2.- P. 363 371.

161. Jarret H.W. Development of n-hidroxysuccinimide ester silica, novel support for high-performance affinity chromatography. // J. Chromatogr.- 1987.- vol. 405.- № 1.- P. 179 — 189.

162. Toyot J.-L., Holgrem L., Svennerholm L., Lindblad M., Tardy M. Receptot Specific large-scale purification of cholera toxin on silica beds derivatized with LysoGMi ganglioside. // Eur. J. Biochem.-1981,- vol. 113.- № 2.- P. 249 258.

163. Иванов A.E., Жигис Л.С., Чеховский E.A., Решетов П.Д., Зубов В.П. Хлорангидрид содержащие композиционные носители для иммобилизации биоспецифических лигандов. // Биоорган. Химия.- 1986.- Т. 11,- № 11.- С. 1527 1532.

164. Козлов JI.B., Сизой М.Н., Зинченко А.А., Иванов А.Е., Зубов В.П. Связывание и активация первого компонента комплемента человека на искусственных матрицах. // Биоорган, химия.- 1985.- Т. 10.- № 12.- С. 1629 1639.

165. Иванов А.Е., Грин М.А., Жильцов В.В., Кизюн С.М., Афанасенко Г.А., Зубов В.П. Полимерно-модифицированные твердокаркасные носители для аффинной хроматографии. // Прикл. биохим. и микробиол.- 1990.- Т. 26.- вып. 6.- С. 840 847.

166. Royer G.P., Green G.M., Sinka D.K. Rigid support materials for immobilization of enzymes. // J. Macromol. Sci. Chem.- 1976.- vol. A-10.- №1 2.- P. 289 - 307.

167. А. с. СССР Ns 1061828. Способ получения сорбентов для очистки белков / Кадушявичюс В.А., Суджювене О.Ф., Песлякас И.-Г.И. (СССР). Бюл. № 47., 1983.26 с.

168. Бахвалов О.В., Ливанов В.А. Получение препарата дезоксирибонуклеазы // Медицинская промышленность СССР. М.: Медицина.-1965.- №8.- С. 22-26.

169. Грачева И.М.Технология ферментных препаратов.- М.:Элевар., 3-е изд., 2000.- 512 с.

170. Заявка 5046854/14 СССР. Способ получения инсулина / Катруха С.П., Дебабов В.Г. Опубл. 08.05.95., бюл. № 3; Приоритет 08.05.92. № 2027444 (СССР).

171. Патент 2027444 РФ, Способ получения инсулина / Катруха С.П., Дебабов В.Г. (СССР). Опубл. БИ № 3,1995.

172. Фармакопейная статья /Рибонуклеаза аморфная / ФС 42-2673-89 от 27.04.2003.

173. Досон Р., Эллиот Д., Джонс К. Справочник биохимика. М.: Мир., 1991.- С. 464467.

174. Н.И. Портяная, В.Г. Оситенко. Биохимические исследования в токсикологическом эксперименте. / Под ред. М.Ф. Савченкова. Иркутск: иркутский ун-т, 1990.

175. Хроматография. Практическое приложение метода. Под ред. Э.Хефтмана. М.: Мир., 1986.

176. Hyun, J., Kolthari, И., Herm, Е., Vortenson, J., Treadwell, C.R, Vahouny, G.V. Purification and properties of pancreatic juice cholesterol esterase. // J. Biol. Chem.- 1969.-vol. 244,- C. 1937-1945.

177. Кочетов Г.А. Практическое руководство по энзимологии.- М.: Наука., 1989.

178. Патент 2090195. РФ. Способ получения рибонуклеазы панкреатической / Хомов В. В., Сизов А.А., (СССР). Опубл. БИ № 26,1997.

179. Фармакопейная статья / Трипсин кристаллический / ФС 3435 97 от 31.12.02.

180. Фармакопейная статья / Дезоксирибонуклеаза / ФС 3452 97 от 31.12.02.

181. Hirs С. Н., Moor S., Stein W. Н. A chromatographic investigation of pancreatic ribonuclease. // J. Biol. Chem. 1953. - vol. 200.- P. 493 - 506.

182. Taborsky G. Inactivation of ribonuclease by phosphorylation. // J. Biol. Chem. 1959.-vol. 234,-P. 2915-2920.

183. A.M. Crestfild, W.H. Stein, S. Moore. On the aggregation of bovine pancreatic ribonuclease. //Arch. Biochem. Biopfys. Suppl.- 1962.- vol. 1.- P. 217-222.

184. R.G. Fruchter, A.M. Crestfild. Preparation and properties of two active forms of ribonuclease dimer. //J. Biol. Chem.- 1965.- vol. 240,- P. 3868 3874.

185. R.G. Fruchter, A.M. Crestfild. On the structure of ribonuclease dimer. Isolation and identification of monomers derived from inactive carboxymethyl dimers. // J. Biol. Chem.-1965.-vol. 240.-P. 3875-3882.

186. G. Gotte, L. Testolin, C. Costanzo, S. Sorrentino, U. Armato, M. Libonati. Cross-linked trimers of bovine ribonuclease A: activity on double-stranded RNA and antitumor action. // FEBSLett.- 1997.-vol.415.-P. 308-312.

187. G. Gotte, M. Libonati. Two different forms of aggregated dimers of ribonuclease A. // Biochemica et Biophys. Acta.- 1998,- vol. 1386.- P. 106 112.

188. M. Libonati, M. Bertoldi, S. Sorrentino. The activity on double-stranded RNA of aggregates of ribonuclease A higher than dimers increases as a function of the size of the aggregates. // Biochem. J.- 1996.- vol. 318.- P. 287 290.

189. A. Nenci, G. Gotte, M. Bertoldi, M. Libonati. Structural properties of trimers and tetramers of ribonuclease A. // Protein Science.- 2001.- vol. 10.- P. 2017 2027.

190. Rothwarf, D.M., Li, Y.-J., Scheraga, H. A. Regeneration of bovine pancreatic ribonuclease A: detailed kinetic analysis of two independent folding pathways. // Biochemistry.- 1998-vol. 37.-P. 3767-3776.

191. Low, L. K., Shin H.-C., Scheraga, H.A. Oxidative folding of bovine pancreatic ribonuclease A: insight into the overall catalysis of the refolding pathway by phosphate // Journal of Protein Chemistry.- 2002.- vol. 21.- № 1.- P. 19 27.

192. Crestfield A.M., Smith K.C., Allen F.W. The preparation and characterization of ribonucleic acids from yeast. // Biol. Chem.- 1955.- vol. 216.- P. 185-193.

193. A. c. 1197462 СССР. Дужак А.Б., Подгорный В.Ф., Банина Л.И., Штань А.В., Пупкова В.И., Лобова Н.Н., Загребельный С.Н. (СССР). 1982.

194. Lipman F., Tuttie L.C. //J.Biol.Chem.- 1944.- vol.153.- P.571.

195. Lipmann F., Tuttie L.C. Lipase-catalysed condensation of fatty acids with hydroxylamine. // Biochim Biophys Acta. 1950.- vol.4.- P. 301-309.

196. Hoard D.E., Ott D.G. Conversion of mono- and oligodeoxyribonucleotides to 5'-triphosphates. // J. Amer. Chem. Soc.- 1965.- vol. 8.- №. 8.- P. 1785 1788.

197. Kornberg A., Aposhian H.V. Enzymatic synthesis of deoxyribonucleic acid. IX. The polymerase formed after T2 bacteriophage infection of Escherichia coli: a new enzyme. // J. Biol. Chem.- 1962.-vol.237.-№.2.-P.519-526.

198. Warburg G., Christian W. // Biochem. Z.-1941.- vol. 310.- P. 384-392.

199. Ямковая T.B., Хомов B.B., Загребельный C.H., Ямковой В.И. Выделение суммарной РНК из пекарских дрожжей. // Прикл. биохимия и микробиология — принята в печать в 2004 г.

200. Остерман JI.A. Хроматография белков и нуклеиновых кислот.- М.: Наука, 1985.- С. 109-145.

201. U.K. Laemmli, М. Favre. Maturation of the head of bacteriophage T4.1. DNA packaging events. // J. Mol. Biol.- 1970.- vol. 80.- P. 575-599.

202. C.Lee, A.Levin, D.Branton. Copper staining: a five-minute protein stain for sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gels. // A. Biochem.- 1987.- vol.166.- P.308-312.

203. Загребельный C.H., Камынина Т.П., Пустошилова Н.М., Ривкин М.Е. // Прикл. биохимия и микробиология.-1981.- Т.17.- вып.1.- С.113-120

204. Christopherson R.I., Jones М.Е., Fich L.R. A simple centrifuge column for desalting protein solutions. // Anal. Biochem.- 1979,- vol. 100.- P. 184 187.

205. Хомов B.B., Сизов A.A., Масычева В.И., Загребельный C.H. // Биотехнология.-1997.-вып. 3.-С. 29-34.

206. Заключительный отчет по теме БАВ 0274 / Разработка технологии получения рибонуклеозидполифосфатов.- Новосибирск: СКТБ БАВ. - 1978. - Т. 1.

207. Liberman J., Korncberg A., Simms Е. Enzymatic synthesis of pyrimidine nucleotides; orotidine-5'-phosphate and uridine-5'-phosphate. //J Biol Chem. 1955.- vol. 215.- P. 403451.

208. Florid A., Palmarini C.A., Fini C. Simultaneous analysis of bases, nucleosides and nucleoside mono- and polyphosphates by high-performance liquid chromatography. // J. Chromatogr.- 1977.- vol. 138.- P. 203 212.

209. Hulbert R., Schmitz H., Brumm A. Nucleotide metabolism. II. Chromatographic separation of acid-soluble nucleotides. // J. Biol. Chem.- 1954.- vol. 209.- P. 23 39.1. Благодарности

Информация о работе

Бочков, Денис Владимирович
кандидата биологических наук
Уфа, 2005
ВАК 03.00.04

Диссертация

Новые методы получения высокоочищенных нуклеаз и нуклеотидов из животного и микробиального сырья - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы