Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Новая металлопротеиназа Thermoactinomyces species 27a

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Новая металлопротеиназа Thermoactinomyces species 27a"

На правах рукописи

ЗАБОЛОТСКАЯ Мария Васильевна

НОВАЯ МЕТАЛЛОПРОТЕИНАЗА THERMO ACTINOMYCES SPECIES 27A. СТРУКТУРА И СВОЙСТВА

03.00.23 - биотехнология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Москва - 2004

Работа выполнена в лаборатории белковой инженерии Института молекулярной генетики Российской академии наук.

Научный руководитель:

доктор химических наук, профессор

Костров Сергей Викторович

Официальные оппоненты:

доктор химических наук, профессор

доктор биологических наук, профессор

Каплун Александр Петрович

Честухина Галина Георгиевна

Ведущая организация: Химический факультет

Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова

Защита состоится «¿£»ЛЛ.200 У г. в 45,00 часов на заседании Диссертационного совета Д 212.120.01 при Московской государственной академии тонкой химической технологии им. М.В. Ломоносова по адресу: 119571, Москва, проспект Вернадского, 86.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке МИТХТ им. М.В. Ломоносова по адресу: 119831, Москва, ул. Малая Пироговская, 1.

Автореферат разослан

ъ^исаГйл, 200 3 г.

Учёный секретарь

диссертационного совета Д 212.120.01, кандидат химических наук

А. И. Лютик

20044 1

24716 ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы. Протеолитические ферменты широко используются в современной биотехнологии. При этом физико-химические и энзиматические свойства даже тщательно подобранных биокатализаторов часто не оптимальны для конкретных технологических процессов. Успехи современной белковой инженерии позволяют рассчитывать на то, что в ближайшем будущем стандартным подходом станет конструирование ферментов с направленно модифицированными свойствами. Однако на настоящий момент наши знания о молекулярных механизмах, определяющих структурно-функциональные взаимосвязи в белковых молекулах, явно недостаточны. Для проведения исследований структурно-функциональной организации белков удобно использовать семейства родственных ферментов, обличающихся по своим физико-химическим свойствам. Такие наборы детально охарактеризованных белков с соответствующими клонированными генами позволяют проводить разнообразные эксперименты, направленные на анализ структурно-функциональных взаимосвязей в белковых молекулах. В этом плане актуален поиск новых природных ферментов с заданной специфичностью и конкретными характеристиками. С этой целью в лаборатории белковой инженерии Института молекулярной генетики РАН проводится скрининг коллекций различных микроорганизмов, добытых из необычных природных и промышленных источников. В результате анализа отобран ряд штаммов, которые являются продуцентами ферме1ггов, интересных с научной точки зрения и перспективных для практического использования. Одним из таких штаммов является штамм Thermoactinomyces species 27a, который продуцирует термостабильные секреторные протеиназы, в том числе и металлопротеиназы. На данный момент протеолитические ферменты термоактиномицетов охарактеризованы недостаточно. Всё это определяет актуальность работы по клонированию, экспрессии и детальной характеристике металлопротеиназы Thermoactinomyces species 27a.

Работа поддержана грантами РФФИ № 00-04-48281 и № 03-04-48755.

Цель работы. Целью данной работы является клонирование и экспрессия гена новой металлопротеиназы Thermoactinomyces species 27a, установление нуклеотидной последовательности гена, выделение и очистка рекомбинантного фермента, физико-химическая и энзиматическая характеристика металлопротеиназы Thermoactinomyces species 27a.

Научная новизна.. Клонирован и экспрессирован в клетках Bacillus subtilis ген новой металлопротеиназы Thermoactinomyces species 27a. Установлена нуклеотидная последовательность клонированного гена Thermoactinomyces species 27а. Новая металлопротеиназа Thermoactinomyces species 27а относится к семейству термолизин-подобных протеиназ. При этом фермент Thermoactinomyces species 27а обладает рядом специфических особенностей, таких как наличие уникальной С-концевой аминокислотной последовательности и присутствие

связывания ионов Са2+. Выделена и очищена до электрофоретически гомогенного состояния рекомбинантная металлопротеиназа Thermoactinomyces sp. 27а. Установлены физико-химические и энзиматические характеристики нового фермента Thermoactinomyces sp. 27a.

Показано протекание С-концевого процессинга при созревании металлопротеиназы Thermoactinomyces sp. 27а в клетках Bacillus subtilis.

Практическая значимость. Детально изученная новая металлопротеиназа Thermoactinomyces sp. 27а может быть использована в ряде биотехнологических процессов, например, при получении олигопептидов заданной структуры, а также является удобным объектом для исследования структурно-функциональных взаимосвязей в белковых молекулах. В настоящее время металлопротеиназа Thermoactinomyces sp. 27a применяется в качестве экспериментальной модели для изучения про-зависимого фолдинга термолизин-подобных протеиназ методами белковой инженерии в Институте молекулярной генетики РАН.

Положения, выносимые на защиту.

1. Клонирование и экспрессия гена новой металлопротеиназы Thermoactinomyces sp. 21а, установление его нуклеотидной последовательности.

2. Выделение и очистка рекомбинантной металлопротеиназы Thermoactinomyces sp. 27a.

3. Определение физико-химических и энзиматических характеристик новой металлопротеиназы Thermoactinomyces sp. 27a.

4. Протекание С-концевого процессинга при созревании металлопротеиназы в клетках Bacillus subtilis.

Апробация работы. Материалы диссертационной работы были представлены на школе-конференции «Горизонты физико-химической биологии» (Пущино, 2000), на международной конференции «Biocatalysis-2000: Fundamentals and Application» (Москва, 2000), на международной конференции молодых ученых «От фундаментальной науки- к новым технологиям» (Москва-Тверь, 2001), на V симпозиуме «Химия протеолитических ферментов» (Москва, 2002), на Ш съезде биохимического общества (Санкт-Петербург, 2002), на конкурсе работ научных сотрудников Института молекулярной генетики РАН «Будущее молекулярной генетики» (Москва, 2003), на заседании Ученого совета Института молекулярной генетики РАН (Москва, 2003), на семинаре кафедры биотехнологии Московской государственной академии тонкой химической технологии им. М.В. Ломоносова (2003).

" СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ: sp. - species; TLP(s) -термолизин-подобная(ые) протеиназа(ы); Npr - нейтральная протеин аз а; прг+- ген, кодирующий функционально активный белок; п.н. - пар нуклеотидов; т.п.н. - тысяч пар нуклеотидов; Era - эритромицин; ФМСФ - фенилметилсульфокилфторид; ЭДТА -этилендиаминтетрауксусная кислота; трис - трис-(гидроксиметил)-аминометан; ФАГЛА-3-(2-фурил)акрилоил-глицил-Ь-лейцинамид.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 100 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов и их обсуждения, выводов и списка литературы (207 источников). Работа иллюстрирована 29 рисунками и содержит 7 таблиц.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Клонирование гена металлопротеиназы Thermoactinomyces species 27a.

Штамм Thermoactinomyces sp. 27а ранее был отобран в лаборатории белковой инженерии Института молекулярной генетики РАН в результате скрининга микроорганизмов из коллекции Института микробиологии РАН, как продуцент термостабильных протеолитических ферментов различных групп, в том числе и металлопротеиназ. В связи с тем, что протеиназы микроорганизмов рода Thermoactinomyces на данный момент исследованы недостаточно, были проведены эксперименты, направленные на молекулярное клонирование и экспрессию гена нейтральной протеиназы Thermoactinomyces sp.27a.

Клонирование гена металлопротеиназы Thermoactinomyces sp. 27a проводили следующим образом:

1) выделение бактериальной ДНК Thermoactinomyces sp. 27a;

2) расщепление её на фрагменты со средней протяженностью 2-6 т.п.н. при помощи ограниченного гидролиза рестриктазой Sau3A;

3) конструирование генетической библиотеки Thermoactinomyces sp. 27а на основе двурепликонного плазмидного вектора рСВ22, способного реплицироваться в клетках Bacillus subtilis и Escherichia coli;

4) трансформация полученной генетической библиотекой клеток дефектного по секреторным протеолитическим ферментам штамма Bacillus subtilis AJ73;

5) высев колоний на молочный агар и отбор клонов, формирующих зоны гидролиза казеина;

6) определение групповой принадлежности ферментов - продуктов экспрессии клонированных генов ингибиторным анализом.

Для создания библиотеки генов Thermoactinomyces sp. 27а частично расщепленную эндонуклеазой Sau3A бактериальную ДНК лигировали с плазмидой рСВ22, линеаризованной эндонуклеазой BglII. Лигазной смесью трансформировали клетки штамма Bacillus subtilis AJ73 со сниженным уровнем собственных секреторных протеиназ. Эффективность трансформации составляла 2000-3000 колоний на мкг ДНК вектора. Колонии клеток, проявляющих протеолитическую активность, отбирали по характерному свойству образовывать зоны гидролиза казеина на чашках с молочным агаром в присутствии Em.

Скрининг рекомбинантных клонов, продуцирующих

экстрацеллюлярные протеазы и образующих зоны гидролиза казеина на чашках с молочным агаром в присутствии Em, привел к обнаружению 10

колоний из числа около 45000, полученных в результате трансформации. Из идентифицированных колоний выделили плазмиды, которые обозначили как р1-р10. С целью подтверждения того, что способность отобранных клонов продуцировать протеолитические ферменты действительно связана с полученными рекомбинантными плазмидами, была осуществлена ретрансформация клеток Bacillus subtilis AJ73 выделенными препаратами плазмид р1-р10. При этом было продемонстрировано, что при трансформации плазмидами pl-p10 все образующиеся колонии были способны формировать зоны гидролиза казеина на молочном агаре в присутствии Em.

Размер клонированных в составе плазмидного вектора фрагментов бактериальной ДНК Thermoactinomyces sp. 27а определяли рестрикционным анализом. В результате проведенных экспериментов было продемонстрировано, что плазмиды p1-p 10 содержали чужеродные фрагменты размером около 2,5; 2,0; 5,0; 2,3; 4,5; 3,5; 1,8; 3,0; 1,5; 2,1 т.п.н., соответственно.

Для анализа динамики накопления протеолитических ферментов в культуральной жидкости штаммов Bacillus subtilis AJ73, несущих плазмиды pl-p10, культуры клеток выращивали в L-бульоне в присутствии 1 мМ СаС12 в течение 45 ч при высокой аэрации, отбирая аликвоты на различных стадиях роста для измерения общей протеолитической активности ферментов по гидролизу азоказеина. Добавление Са2+ оказывает стабилизирующее действие на многие белковые молекулы, а в случае протеолитических ферментов, содержащих в своей структуре ионы кальция, способно в значительной степени препятствовать автолитической деградации. Штаммы Bacillus subtilis AJ73, несущие плазмиды р9, р10 и образующие зоны гидролиза казеина на чашках с молочным агаром в присутствии Em, давали лишь незначительное накопление протеолитической активности в культуральной жидкости. Это может свидетельствовать о нестабильности ферментов при их секреции в культуральную жидкость. В то же время штаммы Bacillus subtilis AJ73, несущие плазмиды pl-p8, секретировали в культуральную жидкость ферменты, эффективно гидролизующие азоказеин. Причем накопление протеиназ для штаммов Bacillus subtilis AJ73, несущих плазмиды p1, р2, р5-р8, начиналось в логарифмической фазе роста клеточной культуры и достигало максимума на 25-м ч культивирования (рис. 1А, на рис. представлены данные для штамма Bacillus subtilis AJ73, несущего плазмиду p1). В случае штаммов Bacillus subtilis AJ73, несущих плазмиды рЗ, р4, кривые накопления были близки описанным выше, но при этом максимальный уровень протеолитической активности достигался на более поздних сроках ферментации - 43-м ч (рис. 1Б, на рис. представлены данные для штамма Bacillus subtilis AJ73, несущего плазмиду рЗ).

Для определения типа секретированных в культуральную жидкость ферментов проводили ингибиторный анализ. Были использованы два групповых ингибитора протеиназ - ЭДТА и ФМСФ. В качестве проб для анализа использовали аликвоты культуральной жидкости с максимальным

Рис. 1. Динамика накопления протеолитических ферментов в культуральной жидкости генно-инженерных штаммов Bacillus subtilis AJ73, несущих плазмиды p1 (рис. 1А) и рЗ (рис. 1Б). По оси абсцисс: время инкубации, ч; по осям ординат: слева - оптическая плотность культуры, О.Е. (540 нм), справа - протеолитическая активность по гидролизу азоказеина, О.Е. (450 нм). Кривые 1 и 3 показывают рост клеточной культуры штаммов Bacillus subtilis AJ73, несущих плазмиды p1 и р3, соответственно; кривые 2 и 4 показывают накопление протеолитической активности в культуральной жидкости штаммов Bacillus subtilis AJ73, несущих плазмиды p1 и р3, соответственно. Накопление протеолитической активности в культуральной жидкости штамма Bacillus subtilis AJ73, несущего плазмиду рСВ22, показано пунктирной линией.

уровнем накопления протеиназ. При этом протеиназы, секретируемые в культуральную жидкость штаммами Bacillus subtilis АЛГ3, несущими рекомбинантные плазмиды p1, р2, р5-р8, ингибировались ФМСФ, но не ЭДТА, что позволило их отнести по типу ингибирования к сериновым протеиназам. В то же время протеиназы, секретируемые штаммами Bacillus subtilis AJ73, несущими рекомбинантные плазмиды рЗ, р4, ингибировались ЭДТА, но не ФМСФ, что позволило их отнести по типу ингибирования к металлопротеиназам.

Полученные в ходе описанных выше экспериментов результаты суммированы в табл. 1. Как видно из приведенных данных, были клонированы фрагменты бактериальной ДНК Thermoactinomyces sp. 27a, несущие в своем составе гены как сериновых, так и металлопротеиназ. При этом ген нейтральной протеиназы был клонирован в двух случаях: конструкции рЗ и р4. Однако, у штамма Bacillus subtilis AJ73, несущего рекомбинантную плазмиду рЗ, уровень накопления протеолитической активности был несколько выше, чем у штамма Bacillus subtilis AJ73, несущего рекомбинантную плазмиду р4. Поэтому для дальнейшей работы был выбран штамм Bacillus subtilis AJ73, несущий плазмиду рЗ и обеспечивающий биосинтез металлопротеиназы Thermoactinomyces sp. 27a.

Характеристика клонированного фрагмента бактериальной ДНК Thermoactinomyces species 27а, несущего ген металлопротеиназы.

Рестриктная карта фрагмента ДНК Thermoactinomyces sp. 27a, клонированного в составе плазмиды р3 и определяющего биосинтез

Обозначение плазмиды Размер клонированного фрагмента ДНК, т.п.н. Продукт экспрессии клонированного гена

Pi 2,5 Сериновая протеиназа

р2 2,0 Сериновая протеиназа

рз 5,0 Металлопротеиназа

р4 2,3 Металлопротеипаза

р5 4,5 Сериновая протеиназа

рб 3,5 Сериновая протеиназа

р7 1,8 Сериновая протеиназа

Р8 3,0 Сериновая протеиназа

Табл. 1. Клонированные гены протеолитических ферментов Thermoactinomyces species 27a.

металлопротеиназы, представлена на рис. 2. Как видно из рис. 2, величина вставки бактериальной ДНК в плазмиде рЗ составляет около 5,0 т.п.н.

Для минимизации клонированного фрагмента бактериальной ДНК в составе плазмиды рЗ проводили энзиматическое расщепление плазмиды эндонуклеазой ВатШ, полученные субфрагменты реклонировали в составе плазмидного вектора рСВ22 с последующей трансформацией реципиентных клеток Bacillus subtilis AJ73. Анализ полученных клонов-трансформантов показал, что экспрессия фермента связана с присутствием в составе клонов генетических конструкций, содержащих «левый» ВатHI-BamHl субфрагмент (рис. 2). Полученную конструкцию обозначили как рЗ.1 и использовали в дальнейшем в качестве матрицы для установления нуклеотидной последовательности клонированного фрагмента ДНК Thermoactinomyces sp. 27а. Также конструкция рЗ.1 была использована в качестве исходной для создания дополнительных матриц для секвенирования на основе векторной молекулы pUC19 - конструкции р3.2-р3.5 (рис. 2). Для этого провели энзиматическое расщепление плазмиды рЗ.1 попарно эндонуклеазами ВатШ и KpnI, ВатШ и PvuII, ШМШи Kpril с последующим клонированием полученных субфрагментов в составе плазмидного вектора pUC19, линеаризованного соответствующими эндонуклеазами. Полученные конструкции обозначили как р3.2-р3.5 и использовали в дальнейшем вместе с конструкцией рЗ.1 в качестве матриц для установления нуклеотидной последовательности клонированного фрагмента ДНК

Thermoactinomyces sp. 27a.

Определение и анализ нуклеотидной последовательности гена металлопротепназы Thermoactinomyces species 27a.

Определение нуклеотидной последовательности клонированного фрагмента ДНК Thermoactinomyces sp. 27а проводили автоматическим секвенированием по методу Сенгера с использованием различных

Рис.2. Рестриктная карта клонированного фрагмента бактериальной ДНК Thermoactinomyces species 27а в составе вектора рСВ22 (конструкция рЗ). Конструкции рЗ.1 и р3.2-р3.5, несущие в своем составе фрагмент бактериальной ДНК Thermoactinomyces species 27a, получены на основе векторных молекул рСВ22 и pUC19, соответственно.

олигонуклеотидных праймеров. Обобщенная схема секвенирования на основе полученных матриц р3.1-р3.5 приведена на рис. 3 (на рис. 3 показана только конструкция рЗ.1, поскольку конструкции р3.2-р3.5 были получены на основе рЗ.1 и показаны на рис. 2).

Установлена нуклеотидная последовательность части фрагмента ДНК Thermoactinomyces sp. 27а, клонированного в составе плазмиды рЗ.1, размером 2524 п.н. Полученные результаты представлены в банке нуклеотидных последовательностей NCBI, номер доступа AY280367. Внутри секвенированного фрагмента была обнаружена единственная протяженная открытая рамка считывания, кодирующая аминокислотную последовательность, состоящую из 673 остатков (рис. 4). Сравнение данной аминокислотной последовательности с известными первичными структурами белков выявило, что продукт клонированного гена Thermoactinomyces sp. 27a относится к группе металлопротеиназ, семейству М4, так называемому семейству термолизин-подобных протеиназ (TLPs). При этом наибольший уровень гомологии наблюдался с рядом TLPs микроорганизмов рода Bacillus и составил 50-54%.

Детальный сравнительный анализ аминокислотных

последовательностей термолизин-подобных протеиназ показал, что фермент Thermoactinomyces sp. 27а в значительной степени построен по общему для белков этого семейства плану и синтезируется в виде препробелка. В то же время было продемонстрировано, что в составе металлопротеиназы

Рис.3. Обобщенная схема определения нуклеотидной последовательности клонированного фрагмента бактериальной ДНК Thermoactinomyces species 27а. Серым цветом в конструкции р3.1 выделена отсеквенированная область нуклеотидной последовательности бактериальной ДНК. Секвенирование проводили при помощи «универсальных» праймеров, комплементарных областям плазмиды pUC19 (D, R) и «внутренних» праймеров, комплементарных фрагментам нуклеотидной последовательности бактериальной ДНК Thermoactinomyces species 27a (D1-D7, R1-R9). Полученные при секвенировании фрагменты показаны чёрными стрелками. Белой стрелкой показана открытая рамка считывания.

Thermoactinomyces sp. 27а имеется дополнительная протяженная С-концевая аминокислотная последовательность, нехарактерная для бациллярных протеиназ данного семейства и не имеющая выраженной гомологии ни с одной из известных С-концевых аминокислотных

последовательностей TLPs.

Таким образом, белок-предшественник состоит из четырех областей: лидерного пептида, N-концевой про-части, зрелой части и С-концевой аминокислотной последовательности (рис. 4).

При помощи программы SignalP V2,0 (Center for Biological Sequence Analysis, http://www.cbs.dtu.dk) было установлено, что лидерная последовательность состоит из 26 аминокислотных остатков. На амино-конце пре-последовательности находится остаток метионина. Четвертый и пятый аминокислотные остатки последовательности представлены положительно

-11-241

atg gga gct aag aaa ttt act gct ttc gca gtg MGAKKFTAFAV

-230 -220

gtt tca acc atg gtg ttt act cta gcc acc gcc aat gtg tac gca gcg cca ggg gaa caa VSTMVFTLATANVYA A P G E Q

-210 • -200 ceg cca aag gcg aag aaa atg gcc gtg ttg gag aaa ttg teg aaa caa tec aaa ggg aaa PPKAKKMAVLEKLSKQSKGK

-190 -180

gaa aaa gtc аса tgg aac aag aaa aaa gga gtt ecc acg ttt gtg аса ggc aag ctt teg

К

u

К

-170 -160

gac aaa aag gcc aaa acc ceg gct gat gtg aag aag atc gtg gag gag aac aaa gcg ctc

к

к

E

N

-150 -140

ttc aac atg gat tca gcc tet tcc gaa ctg tcc ctt att teg caa gaa aaa gat tcc ttg

ISQEKDSÎ,

N

M

S

s

-130 -120

gga ttt acg atg tat aaa tac caa caa gtg tat caa gga gtg ccg gta ttt ggc aac gaa G FTMYKYQQVYQG.V PV F G N E

-110 -100 ctg atc gtc cat act gat aaa aac ggc act acc act tcc atc aac ggt tat tat gac ccc LIVHTDKNGTTTSINGYYDP

-90 -80

gag gta aaa age gcc agg cta aac acc aaa gca acg ctg tca ttg gcg caa gca ctc aac EVKSARLNTKATLSLAQALN

-70 -60

aaa gcg aag gcg tcc gtg ggc gta gcc aat gta age aaa ttc gac atc caa aaa ggc aaa KAKASVGVANVSKFDIQKGK

-50 -40

ttg cat gta tat gaa acc caa aaa ggc gac tac ege ttg gtt tat gtg atc аса ctg tet LHVYETQKGBYRLVYVITLS

-30 -20

act ctg gaa ggc aaa cag ccc gtc tat gcc gat gta ttt gtg gat gcg cac aat ggt teg TLEGKQPVYADVFVDAHNGS

-10 -1 1 10 atc ttg cac aaa atc gat aaa gtg aat cat gca gca gcc act ggc аса ggc acg ggc gtg I l H К I DKVNHU AAATGTGTGV

20 30

ctt ggc gac acg aaa acg cta aac acc gat tet tac age ggt ggc tac tat ctg ege gat LGDTKTLNTDSYSGGYYLRD

40 50

atc acc aaa ccg atg tat tcc act ggc ggc aaa att gaa acc tac act gcc aac tat ggc ITKPMYSTGGKIETYTANYG

60 70

аса gcc ttg cca ggc acg ctg tta act gac gcc gac aac gtg tgg act gac ege gca gct TALPGTLLTDADNVWTDRAA

80 90

gta gac gcc cac tac tat gcc ggc aaa acc tac gac ttc tac tac aac aag ctg gga cgt VDAHYYAGKTYDFYYNKLGR

100 110 aac tcc ttt gac aat aga gga gca act ttg aag tcc acc gtt cat tac age aga aat tac

NSFDNRGATLKSTVHYSRNY

Рис 4. Нуклеотидная последовательность гена металлопротеиназы Thermoactinomyces species 27а и первичная структура соответствующего белка. Нумерация приведена по аминокислотной последовательности, за точку «О» принято место N-концевого процессинга. Последовательность лидерного пептида выделена одной чертой, N-концевая про-последовательность фермента - двойной чертой, С-концевая аминокислотная последовательность - жирным шрифтом, сайт N-концевого процессинга указан стрелкой.

-12120

aat aac gcc ttc tgg aac gga аса caa atg gtc NNAFWNGTQMV

140

acc teg ttg tcc ggt geg ctg gac gtg gtg gec TSLSGAbDVVA

160

cgt аса get ggc ctg gtt tac gaa tat caa cct RTAGLVYEYQP

180

gtg ctc ggc aac ttg gtg gaa aac aaa aac gac VLGNLVSNKND

200

acc acg cct ggc ate gee ggc gac gca ttg cgt TTFGIAGOALR

220

caa ccg gat cac atg aat gaa tac caa aac ctg QPDHMNEYQNL

240

ggc gtt cac ate aac tcc ggt att ccg aac aaa GVHINSGIPNK

260

ggc ate acc aaa gae aac gee gga aag ate tgg G1TKDNAGKIW

280

tcc tac tcc caa ttc att gac gcg ego aae gee SYSQFIDARNA

300

ggc gca aac teg ctg gaa gcg act gee gta gec GAHSLEATAVA

320

tec age gga aae aac ggt gga age ggc gat get S SGN^GGSSDA

340

gee aaa gee atg age tcc ggt act acc tac aat AKAMS 80TTTN

360

gac tgg ttc aaa ttt acg ccc age аса tea acc DWFKFTFSTST

380

cea gca gac tac gac ctg tat ctg tac aac teg EADTDI.XI.TNS

400

tac gcc ggc ace tct teg gaa tea ata gcg ggc TAGTSSISIAB

420

gtg aaa gtg gtc ggc tac aac ggc gcc atg age VKVVGXHGAXS

433

act tat taa

T T Step

Рис. 4. Продолжение.

tac ggg gat ggc gac ggc agt cag ttc YGDGDG5QF

150

cat gag ate acc cac get gtc acc gag HE ITHAVTE

170

ggt gca ttg aat gag tcc ttc tct gat GALNESFSD

190

cca aaa tgg ctc ctc ggt gaa gac gtc PKWLLGEDV

210

teg atg tcc aat ccg aac gag tat ggt SMSNPNEYG

230

ccc aac acc aga gaa gga gac tgg ggc PNTREGDWG

250

gca ttc tac aac ttc gtc асе аса cct AFYNFVTTP

270

tac cgt gcg ctg acg caa tac ctg act YRALTQYLT

290

acc att caa gcg gca acc gat ctg ttt TIQAATDLF

310

aat get tgg get age gtg ggc gta ggt NAWASVGVG

330

tac gag cea aac gac age atg tcc gca TEVttDSMSA

350

ggt ctg ate age age get acc gat gtg GLXSSATDV

370

tac ctt teg ctc age ttg acc aat ctt YLSLSLTNL

390

gec ggc act ttg ttg get aga teg gaa AGTLLARSE

410

aec ate caa ggc ggc get acc tat tat TZQ6GATXY

430

аса асе aaa ccc tac gcg eta aaa gca TTKPXALKA

заряженными остатками лизина М-в-Л-К-К-, за которыми следует протяженная гидрофобная область Р-Т-Л-Р-Л-У-У-Б-Т-М-У-Р-Т-Ь-Л-Т-Л--М-У-У-Л С-конец лидерного пептида заканчивается остатком аланина.

Подобная организация сигнальных пептидов характерна для секретируемых белков.

Поскольку в дальнейшем был получен гомогенный препарат рекомбинантной металлопротеиназы Thermoactinomyces sp. 27а и определена её N-концевая аминокислотная последовательность (A-A-A-T-G-T-G-T-G-V), удалось локализовать место N-концевого процессинга полипептида при созревании. Про-пептид металлопротеиназы Thermoactinomyces sp. 27a состоит из 215 аминокислотных остатков. Известно, что первичные структуры про-последовательностей TLPs отличаются меньшим консерватизмом по сравнению со зрелыми частями молекул. При этом наибольший уровень гомологии был отмечен с про-последовательностями металлопротеиназ Bacillus amyloliquefaciens и Bacillus subtilis (NprE) и составил 27%.

Зрелая часть вместе с С-концевой последовательностью состоит из 432 аминокислотных остатков и имеет расчетный молекулярный вес 46262 Да. В то же время в дальнейшей работе методом масс-спектрометрического анализа была определена молекулярная масса очищенного зрелого фермента рекомбинантной металлопротеиназы Thermoactinomyces sp. 27a, которая составила 34190+70 Да. Эти данные свидетельствуют о протекании С-концевого процессинга и об отсутствии С-концевой аминокислотной последовательности в составе зрелого белка. Таким образом, зрелый фермент состоит из 317-318 аминокислотных остатков. Сравнение аминокислотных последовательностей металлопротеиназы Thermoactinomyces sp. 27а и TLPs микроорганизмов рода Bacillus продемонстрировало их значительное сходство. При этом значительный консерватизм аминокислотных последовательностей наблюдался в функционально-существенных областях молекул (рис. 5, 6).

Были идентифицированы ключевые позиции в консенсусной последовательности активного центра металлопротеиназы

Thermoactinomyces sp. 21 л - HiSi42 (H1S142), GIU143 (GIU143), HiSj46 (ffisj«) и которые строго консервативны у всех представителей термолизин-подобных протеиназ (здесь и далее по тексту остатки и нумерация приводятся по последовательности металлопротеиназы Thermoactinomyces sp. 27a, в скобках - по последовательности термолизина). К консенсусной последовательности активного центра TLPs относят ещё 5 аминокислотных остатков - Туги7 (Туг^), Asp17o(Aspi7o), Argan (Argau),

которые также были локализованы в анализируемой молекуле. Кроме остатков, образующих активный центр молекулы, анализом аминокислотных последовательностей удалось определить еще несколько высоко консервативных и функционально-существенных остатков, которые образуют область субстрат-связывающсго кармана и сайты связывания ионов Са2+

Так, аминокислотные остатки Phei3o(Pheuo), Leu 133 (Leu 133), Val139 (Уа1ш), Leuige (Ileiss), Gly]g7 (Glyis?), Val^V^) и Leu2oo (Leu^). характерные для всех TLPs, участвуют в организации

14 15 16 17

890123456789012345678901234567690123

20

78901234567

23

67890123456

TIM DWAHEITHAVTERTAGLVYEYQPGALNESFSDVLG GDALRSMSNPN EGDWGGVHINS

Ш ++++++L+++++DY++++I+QNES++I++AI++IF+ ++S+++++D+A TQ+N+++++++

TLP-staS ++++++L+++++DY++++I+QNES++I++AI++IF+ ++S+++++D+A TQ+N+++++++

TLP-steX +++G++L+++++DY++++++QNES++I++AM++IF+ ++++++++D+A TQ+N++++T++

TLP-cal +++G++L+++++DV++++++QUES++I++AM++IF+ ++++++++D+A TQ+N++++T++

TLP-cer ++IG++L++++++NSSN+I+QNES+++++AI++IF+ ++++++++D+T SS+N++++T++

TLP-meg ++IG++L+++L+++SSN+I+Q+ES+++++AI++IF+ ++++++++++A SS+N++++T++

TLP-bre ++++++L+++++++++++++QNES++++++M++IF+ ++++++LQD+A SQ+N++++T++

TLP-pol +++G++L++G+++Y+SN+E+YGES+++++A++++I+ ++++++++++T SS+N++++T++

TLP-subB +I++++++++++QYS+++L+QGE+++++++I++IM+ ++S+++LED+S TE+Y+++++++

TLP-eubE ++T+++M++G++QE++N+I++N++++++++++++F+ —++++L+++T +++Y++++T++

TLP-amy ++T+++M++G++QE++N+N++N++++++++++++F+ —++++L+++T A++Y++++T++

Б

13 14

90123456789012

19

4567890123

20

7890123

TLM QFISLSGALDWAH WLLGEDVTTP GDALRSM

ТЫ» T+IP+++GI+++++ +EX++++Y++ ++S++++

TLP-»toS T+IP+++GI+++++ +EI++++Y++ ++S++++

TLP-etoT T+LPF++GI+++G+ +EI+++IY++ +++++++

TLP-cal T+LPF++GI+++G+ +E1+++IY++ +++++++

TLP-cer T++++++GI++IG+ +EI+++IY++ +++++++

TLP-meg T+VP+++G+++IG+ +EI+++IY++ +++++++

TLP-bre T+LP+++G++++++ ++M+++1Y++ ++++++L

TLP-pol T+IAF++DP+++G+ ++V+D+IY++ +++++++

TLP-aubB K+KP+++S++I+++ +EI++++Y++ ++S+++L

TLP-eubE F+SP+++S+++T++ +DX+++I+VS —++++L

TLP-amy F+SP+++SM++T++ +DI+++I+VS —++++L

Рис.5. Сравнение аминокислотных последовательностей ряда металлопротеиназ в функционально-важных областях молекул. А - область активного центра. Б - область субстрат-связывающего кармана. Функционально-существенные остатки выделены жирным шрифтом. Знаком «+» показаны аминокислотные остатки представителей TLPs (TLN - термолизин, TLP-steS - NprS Bacillus stearothermophilus, TLP-steT - NprT Bacillus stearothermophilus, TLP-cal - Npr Bacillus caldolyticus, TLP-cer - Npr Bacillus cereus, TLP-meg- Npr Bacillus megaterium, TLP-bre - Npr Bacillus brevis, TLP-pol - Npr Bacillus polymyxa, TLP-subB - NprB Bacillus subtilis, TLP-subE - NprE Bacillus subtilis, TLP-amy -Npr Bacillus amyloliquefaciens), идентичные соответствующим остаткам TLM (TLM-металлопротеиназа Thermoactinomyces species 27a). Нумерация остатков приведена по последовательности TLM.

субстрат-связывающего кармана молекулы. Как видно из рис. 5Б, в этой области металлопротеиназы Thermoactinomyces sp. 27а. имеется лишь одна достаточно «мягкая» замена Leuise (Н^ш)-

Также локализованы остатки, формирующие три сайта связывания ионов Са2+: первый сайт - остатки Aspus (Asp^g), Asn^CThr^), Glu177(Gluj77), Asniso (Lysi82), Aspi8i(Asnlg3), Lys183 (Aspi85), Leu185 (Glui87), Glu188(Glul90), Aspi89 (Aspi9i); второй - остатки Aspeo (Asp57), Asp62 (Asp59), Vals4(Gln61); третий - остатки Thrm (Тугш), Thr]92 (Thim), Uei95 (Ilem),

Aspjjg (ASP200). На рис. 6 представлено выравнивание этих областей с соответствующими областями ряда TLPs. Как видно из выравнивания, области связывания ионов Са2+ Npr Thermoactinomyces sp. 27а очень близки

А

14

5678901

тьм САПОТА

ил +С1++++

ТЬР-аЪеБ'

И.Р-в1вТ

ТЬР-са1 +С1+++С

ТЬР-сег

ТЬР-тед

ТЬР-Ьге +5+++++

ГС.Р-ро1 +ОР+++С

ГЬР-виЬВ +Б++1++

ТЬР-аиЬЕ +Э+++Т+

ТЬр-аву +ЭМ++Т+

17 18 19

012345678АВ901234567890123

ОУЬСМЬУЕМ—КЯСРЮаЬСЕОУТТР + 1Р+Т+++гаКЮШ)+Е1++++¥++ + 1Г+Т+++ГГАКЮ»+0+Е1++++У++ +1Г+Т+++ГУАКК11+С+Е1+++1У++ +1Г+Т+++ГУАКМ»+П+ЕИ-++1У++

+1Е+Т+++ПГОММ»+О+Е1+++1У++

+1Г+АМ+0-----1ИЛЗ++М+++1У++

++1++01С!-----ККИ++7+В+1У+ +

+1М+АМАО-----К1ЯНЕ1++++У++

++Г+УП®-----ТЕП+01+++1+У5

++Г+УЕ7ГО-----ТЕС+П1+++1+УЗ

в

19

20

7890123АВСОЕГСН456 890123456789012

Т1М ХЛТОАЮ-)----- —тот им ЕСУТТРС1АО>А1,ЯЗ

тьн +ИА++++----- ---ОГГ ТШ +++Т+Р++3++5+++

Т1,Р-8£еЗ +ИА++++----- —огг TLP-lteS +++У++++Б++3+++

ТЬР-вЪеТ +N++6++----- —сг+ ХЬР-вЪв! ++11+++У+++++++

ТЬР-еа1 ----- ТЬР-са1 ++И+++У+++++++

ГЬР-свг +ИА++++----- ТЬР-свг ++И+++К+++++++

ТЬР-твд +КА+Т++----- ---ТУЫ ТЬР-швд ++1*+++тз++++++

ю-Ьм ЧМ++Э++----- ---Х++ ТЬР-Ьгв ++и+++кз++++++

ТЬР-ро1 +++++++----- ---+4-Ц ТЬР-ро1

тьр-виЬв +50ЫСУТСКЕ1УЗСТЗУ ТЬР-виЬВ +++У++4++++3+++

ТЬР-виЬЕ +'/БЗТТК----- ---ТГ+ ХЬР-«иЬЕ ++1+---УБ0Р++++

ТЬР-алу +УЗЭТТ+----- —а=ч ТЬР-аау ++1+---

Рис.6. Сравнение аминокислотных последовательностей ряда металлопротеиназ в областях, формирующих сайты связывания ионов Са . А - первый сайт связывания ионов Са2+. Б — второй сайт связывания ионов Са2+. В - третий сайт связывания ионов Са2+. Расшифровку сокращений и обозначений см. на рис. 5.

соответствующим областям ТЬР8, хотя здесь наблюдается большее число замен функционально--существенных остатков по сравнению с рассмотренными выше областями: в первом сайте - пять замен, во втором и третьем - по одной.

Детальный анализ пространственной структуры сайтов связывания ионов Са2+ молекулы термолизина показал, что остатки первого сайта -Авпио (Ьувш), АэриКАзпш), Ьеи^ (01и187); второго - Уа1м(С1пм) и третьего - ТЬгщ (Туг^з) взаимодействуют с ионами Са через кислород карбонильной группы и, по-видимому, эти позиции могут являться достаточно толерантными по отношению к аминокислотным заменам. В случае остатка АвПшСТЬт^), участвующего в формировании первого сайта связывания ионов Са""", взаимодействие происходит через поляризовашгую молекулу воды, с которой связывается боковая цепь остатка. Наибольший интерес представляет замена Ьувш (АБриз), локализованная в первом сайте связывания ионов Са2+ Крг ТНвгтоасйпотусвз 8р. 27а. Отметим, что остаток А8р185 в молекуле термолизина непосредственно взаимодействует боковой цепью с ионами Са2+. Вероятно, что эта замена существенна и, по-видимому,

требует изменений в организации структуры кальций-связывающей области, что в свою очередь может сказаться на термостабильности фермента.

Как отмечалось ранее, фермент Thermoactinomyces sp. 27а содержит уникальную С-концевую аминокислотную последовательность, отсутствующую в составе зрелого белка и состоящую из 114-115 остатков. Отметим, что наличие С-концевой аминокислотной последовательности для бациллярных белков этого семейства не характерно. На данный момент известно, что только TLPs микроорганизмов рода Vibrios содержат в своем составе С-концевые аминокислотные последовательности, размером около ПО остатков. Функциональная роль С-концевых аминокислотных последовательностей в составе TLPs не ясна. Возможно, в случае металлопротеиназ микроорганизмов рода Vibrios С-концевые аминокислотные последовательности могут быть вовлечены в процесс секреции протеиназ через внешнюю мембрану, хотя четких экспериментальных подтверждений этому нет. В то же время, в случае С-концевой аминокислотной последовательности металлопротеиназы Thermoactinomyces sp. 27a, данное предположение маловероятно, поскольку Thermoactinomyces sр. 27а является представителем грамм-положительных бактерий, у которых большинство протеиназ секретируется при участии лидерного пептида. Необходимо также отметить, что С-концевая аминокислотная последовательность нейтральной протеиназы Thermoactinomyces sp. 21а не имеет выраженной гомологии с соответствующими последовательностями TLPs микроорганизмов рода Vibrios.

Таким образом, фермент Thermoactinomyces sp. 27а, кодируемый клонированным геном, с одной стороны является представителем термолизин-подобных протеиназ, но в то же время обладает рядом особенностей, таких как наличие уникальной С-концевой аминокислотной последовательности и присутствие ряда аминокислотных замен в сайтах связывания ионов Все это делает металлопротеиназу

Thermoactinomyces sp. 27а перспективной моделью для изучения особенностей структурно-функциональной организации TLPs.

Очистка рекомбинантной металлопротеиназы Thermoactinomyces species 27a.

Для физико-химической и энзиматической характеристики фермента были проведены выделение и очистка рекомбинантной металлопротеиназы Thermoactinomyces sp. 27а. В качестве генно-инженерного продуцента был использован штамм Bacillus subtilis AJ73, несущий геи металлопротеиназы Thermoactinomyces sp. 27а в составе рекомбинантной плазмиды рЗ. При этом биосинтез металлопротеиназы протекает под контролем собственных регуляторных элементов. Динамика накопления металлопротеиназы в культуральной жидкости рекомбинантного штамма Bacillus subtilis AJ73 представлена на рис. 1Б. Максимальное накопление фермента происходило в стационарной фазе роста клеточной культуры на 43-м ч культивирования.

Стадии очистки Общий Активность Выход по Степень очистки

белок, мг Общая, ед Удельная, ед/мг активности, %

Культуральная жидкость (0,8 л) 45,6 187,0 4,1 100,0 1,0

Фракционирование (NILO2SO4 14,9 167,2 11,2 89,4 2,7

Диализ 12,6 162,7 12,9 87,0 3,1

Анионообменная хроматография на колонке Econo-Pac High Q 0,72 81,5 112,9 43,6 27,5

Анионообменная хроматография на колонке Bio Scale Q2 0,27 43,0 155,0 23,0 37,8

Табл. 2. Очистка рекомбинантной металлопротеиназы Thermoactinomyces species 27a.

Измерение протеолитической активности проводили по гидролизу азоказеина.

Для выделения и очистки нейтральных протеиназ бацилл, представителем которых является исследуемый фермент, наиболее часто используются комбинации таких методов, как: фракционирование сульфатом аммония, осаждение органическими растворителями, диализ, ультрафильтрация, гель-фильтрация, катионо- и анионообменная хроматография, аффинная хроматография. Процедура очистки обычно включает ионообменную или аффинную хроматографию как основной метод. Оба метода исключительно эффективны. В соответствии с этим для получения гомогенного препарата металлопротеиназы

Thermoactinomyces sp. 27а была разработана схема очистки, включающая три стадии: фракционирование сульфатом аммония с последующим диализом, анионообменную хроматографию на колонке низкого давления Econo-Pac High Q и анионообменную хроматографию на колонке среднего давления Bio Scale Q2.

В табл. 2 представлен ход очистки металлопротеиназы Thermoactinomyces sp. 27а из культуральной жидкости штамма-продуцента Bacillus subtilis AJ73, несущего плазмиду рЗ. Чистота белковых препаратов на различных стадиях очистки анализировалась электрофорезом по методу Лэммли в 12,5%-ном полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия. Результаты электрофореза представлены на рис. 7.

На первой стадии культуральную суспензию штамма Bacillus .subtilis AJ73 (рЗ) центрифугировали и проводили фракционирование белков из супернатанта, добавляя сульфат аммония до 70% от насыщения. Концентрация сульфата аммония была выбрана по полученной зависимости суммарной активности белка, находящегося в осадке, от концентрации соли. Образовавшийся осадок растворяли в 20 мМ трис-HCl буфере pH 8,3, содержащем 5 мМ СаСЬ, и диализовали для удаления сульфата аммония. Выход белка по активности после первой стадии составил 87,0%, степень

1, 7 - стандарты молекулярных весов, 2 -культуральная жидкость штамма Bacillus subtilisPJTS, несущего плазмиду рЗ; 3 - препарат белка после фракционирования (NH^SCb; 4-препарат фермента после диализа; 5 - препарат белка после анионообменной хроматографии на колонке Econo-Pac High Q; 6- препарат белка после анионообменной хроматографии на колонке Bio Scale Q2.

Рис. 7. Электрофоретический анализ белковых препаратов на различных стадиях очистки рекомбинантной металлопротеиназы Thermoactinomyces species 27a.

Рис. 8. Профили элюирования при анионообменной хроматографии на колонках Econo-Pac High Q (А) и Bio Scale Q2 (Б). Элюирование проводили линейным градиентом NaCl: 0-0,25 М (А) и 0-0,15 М (Б), что показано пунктирными линиями. По оси абсцисс: время, мин; по осям ординат: слева - светопоглошение элюата, О Е. (280 нм), справа - протеолитическая активность по гидролизу азоказеина, О Е. (450 нм). Протеолитическая активность показана (-х-) линией.

очистки - 3,1 (табл. 2). Фракционирование позволяет, наряду с первичной очисткой, сконцентрировать фермент для последующей хроматографии.

На второй стадии полученный диализат наносили на анионообмеиную колонку низкого давления Econo-Pac High Q, уравновешенную 20 мМ трис-HCl буфером рН 8,3, содержащим 5 мМ СаСЬ, и элюировали градиентом 0-0,25 М NaCl в том же буфере. Отметим, что целевой белок достаточно слабо связывается с сорбентом и элюируется при низком значении ионной силы. Хроматографические фракции, обладающие наибольшей протеолитической активностью, объединяли и диализовали против 20 мМ трис-HCl буфера рН 8,3, содержащего 5 мМ СаСЬ-Полученный диализат концентрировали ультрафильтрацией. Выход белка по активности составил 43,6%, степень очистки - 27,5. На рис. 8А приведен профиль элюирования при хроматографии на колонке Econo-Pac High Q, которая позволила отделить пигменты и основную массу примесных белков, присутствующих в культуральной жидкости (рис. 7).

На третьей стадии полученный концентрат наносили на анионообменную колонку среднего давления Bio Scale Q2, уравновешенную 20 мМ трис-HCl буфером рН 8,3, содержащим 5 мМ СаС12. Элюцию осуществляли линейным градиентом NaCl 0-0,15 М в том же буфере. Выход белка по активности составил 23,0%, степень очистки-37,8. На рис. 8Б приведен профиль элюирования при хроматографии на колонке Bio Scale Q2, которая позволила очистить препарат от оставшихся примесей (рис. 7).

Разработанная схема очистки позволяет в три стадии получить электрофоретически гомогенный препарат металлопротеиназы Thermoactinomyces sp. 27а из культуральной жидкости штамма-продуцента Bacillus subtilis AJ73 с выходом 23%.

Характеристика рекомбинантной металлопротеиназы Thermoactinomyces species 27a.

• Молекулярная масса фермента.

Выделенная металлопротеиназа при электрофорезе в 12,5%-ном полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия дает одну полосу (рис. 7), соответствующую белку с молекулярной массой 34 кДа. При масс-спектрометрическом анализе рекомбинантного фермента было установлено, что молекулярная масса равна 34190±70Да. Таким образом, полученные в результате двух способов анализа величины молекулярной массы металлопротеиназы Thermoactinomyces sp. 27а близки между собой и согласуются с литературными данными для молекулярных масс других представителей TLPs.

Как отмечалось ранее, данные о молекулярной массе очищенного зрелого фермента в сочетании с установленной N-концевой аминокислотной последовательностью рекомбинантной металлопротеиназы указывают на протекание С-концевого процессинга, приводящего к удалению С-концевой части из состава зрелого белка.

• N-Концевая аминокислотная последовательность рекомбинантной

металлопротеиназы.

Амино-концевая последовательность рекомбинантной

металлопротеиназы Thermoactinomyces sp. 27а, определенная

автоматической деградацией по методу Эдмана, была идентифицирована как A-A-A-T-G-T-G-T-G-V. Наличие данной последовательности позволило локализовать место N-концевого процессинга полипептида при созревании. Установленная N-концевая аминокислотная последовательность имела выраженную гомологию с соответствующими последовательностями ряда TLPs микроорганизмов рода Bacillus, при этом наибольший уровень идентичности был отмечен с N-концевыми аминокислотными последовательностями металлопротеиназ Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus subtilis (NprE, NprB) и Bacillus brevis (рис.9). Это совпадает с полученными ранее результатами сравнения зрелых последовательностей металлопротеиназы Thermoactinomyces sp. 27а и TLPs.

TIM

TLP-amy TLP-»ubE TLP-eubB TLP-bre

1234567890

AAATGTGTGV ++T+++++TL +++++S++TL —+A+++I++ —V+A++K++

Рис 9. Сравнение амино-концевых последовательностей ряда термолизин-подобных протеиназ. Знаком «+» показаны аминокислотные остатки представителей TLPs (TLP-amy - Npr Bacillus amyloliquefaciens, TLP-subE - NprE Bacillus subtilis, TLP-subB -NprB Bacillus subtilis, TLP-bre - Npr Bacillus brevis), идентичные соответствующим остаткам TLM (TLM - металлопротеиназа Thermoactinomyces species 27a).

• Изучение энзиматических констант фермента.

Для энзиматической характеристики рекомбинантной металлопротеиназы Thermoactinomyces 8р. 27а была изучена кинетика гидролиза стандартного субстрата термолизин-подобных протеиназ (ФАГЛА) и определено отношение констант гидролиза

Необходимо отметить, что данный субстрат обладает низкой растворимостью, поэтому уравнение для скорости превращения субстрата, уравнение Михаэлиса-Ментена, имеет вид:

где V - скорость гидролиза, [Е] - концентрация фермента. Таким образом, гидролиз субстрата протекал в условиях кинетики псевдо -первого порядка и характеризовался отношением констант к^Кт, поскольку определить раздельно к^ и Кт в данных условиях не представлялось возможным.

При этом было определено, что отношение констант гидролиза

ФАГЛА металлопротеиназой Ткегтоасйпотусев ер. 27а составляет (2,8±0,1),103М*1,с"1. Для сравнения укажем, что соответствующее отношение для термолизина равно

• Физико-химические характеристики белка.

Фермент не терял активности при рН 6,5-9,0 в течение 24 ч при 4° и утрачивал способность гидролизовать азоказеин при понижении рН, что характерно для большинства ТЬР8. Фермент имел рН-оптимум гидролиза азоказеина, соответствующий 7,0-7,5, что также хорошо согласуется с литературными данными для ТЬР8.

Температурный оптимум протеолитической активности рекомбинантной металлопротеиназы Ткегтоасйпотусев ер. 27а,

определенный при рН 7,5 в присутствии 5 мМ СаС1г, составил 55-60°. При рН 7,5 в присутствии 5 мМ и температуре 50° протеиназа не теряла своей активности в течение 2 ч. В интервале температур 60-70° потеря активности становилась заметной и составила 30-70% от начальной активности фермента после инкубирования в течение 2 ч, а при температуре 80° фермент за 30 мин терял активность практически полностью.

Добавление ионов кальция оказывало стабилизирующее действие на металлопротеииазу. При этом после инкубирования аликвоты фермента в течение 10 мин при 80° в отсутствии ионовй^аллопротеиназа практически полностью теряла первоначальную активность, в то же время после инкубирования в присутствии 5-30 мМ СаС1г фермент сохранял 40-55% от первоначальной активности.

Металлопротеиназа Thermoactinomyces sp. 27а по уровню термостабилыюсти наиболее близка к Npr Bacillus cereus.

• Влияние ингибиторов на активность фермента.

Обработка рекомбинантной протеиназы Thermoactinomyces sp. 27a ФМСФ не приводила к потере активности фермента, в то же время ЭДТА и о-фенантролин полностью инактивировали протеиназу. Подобный тип ингибирования свидетельствует о принадлежности фермента к группе металлопротеиназ и служит дополнительным подтверждением вывода, сделанного ранее. Это также полностью совпадает с полученными ранее результатами ингибиторного анализа протеолитических ферментов, секретируемых в культуралыгую жидкость штаммом Bacillus subtilis AJ73, несушим плазмиду рЗ.

Таким образом, была выделена и охарактеризована новая металлопротеиназа Thermoactinomyces sp. 27а, которая является представителем семейства термолизин-подобных протеиназ. Протеиназа данного семейства у термоактиномицетов обнаружена впервые.

ВЫВОДЫ

1. Клонирован и экспрессирован в клетках бацилл ген новой металлопротеиназы Thermoactinomyces sp. 27а, а также ряд генов сериновых протеиназ.

2. Определена нуклеотидная последовательность гена металлопротеиназы Thermoactinomyces sp. 27а и проведен анализ соответствующего белка. Показано, что фермент относится к семейству термолизин-подобных протеиназ, синтезируется в виде препробелка и состоит из лидерного пептида, N-концевой про-последовательности, зрелой части и дополнительной С-концевой аминокислотной последовательности. Локализован сайт N-концевого процессинга при созревании фермента.

3. Показано протекание С-концевого процессинга при созревании металлопротеиназы Thermoactinomyces sp. 27а в клетках бацилл.

4. Получен высокоочищенный препарат рекомбинантной металлопротеиназы Thermoactinomyces sp. 27a. Установлены молекулярная масса, N-концевая аминокислотная последовательность, рН- и температурный оптимумы активности, рН- и температурная стабильности фермента, отношение констант kaiJKm по гидролизу субстрата ФАГЛА. Показано стабилизирующее действие ионов Ca на металлопротеиназу Thermoactinomyces sp. 27a.

ПУБЛИКАЦИИ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИОННОЙ РАБОТЫ

1. Заболотская М.В., Носовская ЕА, Каплун М.А., Акимкина Т.В. Новая термостабильная протеиназа Thermoactinomyces sp. 27а. Клонирование и экспрессия гена. // Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. - 2001. - № 1. - С. 32-34.

2. ДемидюкИ.В., Заболотская М.В., СафинаД.Р., Костров СВ. Молекулярные механизмы стабилизации протеолитических ферментов. Модель термолизин-подобных микробных металлопротеиназ. // Биоорганическая химия. - 2003. - Т. 29. - № 5. - С. 418-426.

3. Демидюк И.В., Заболотская М.В., Велишаева Н.С., Сафина Д.Р., Костров СВ. Про-зависимый фолдинг микробных протеолитических ферментов. // Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. -2003.-№4.-С. 11-15.

4. Заболотская М.В., Акимкина Т.В., Носовская Е.А., Цаплина И.А., Ретунская Е.В., Костров СВ. Thermoactinomyces sp. - продуцент новых протеолитических ферментов. // Школа-конференция «Горизонты физико-химической биологии». - Пущино. - 2000. - Тезисы сообщений. - С 197.

5. Zabolotskaya M.V., Akimkina T.V., Nosovskaya E.N., Retunskaya E.V., Tsaplina I.A., KostrovS.V. Novel thermostable proteases from Thermoactinomyces sp. Protein characterization. Cloning and expression of corresponding genes. // International conference «Biocatalysis-2000: Fundamentals and Application». - Moscow. - 2000. - Books of Abstracts. -P. 178.

6. Заболотская М.В., Акимкина Т.В., Каплун М.А., СафинаД.Р., Носовская Е.А., Демидюк И.В., Костров С.В. Новый протеолитический фермент Thermoactinomyces sp. Структура и свойства. // Международная конференция молодых ученых «От фундаментальной науки - к новым технологиям». - Москва-Тверь. - 2001. - Тезисы сообщений. - С. 36.

7. Заболотская М.В., Акимкина Т.В., СафинаД.Р., Носовская ЕА, Шевелев А.Б., Демидюк И.В., Костров С.В. Новая металлопротеиназа Thermoactinomyces sp. Идентификация, структура и свойства. // V симпозиум «Химия протеолитических ферментов». - Москва. - 2002. -Тезисы сообщений. - С 46.

8. Заболотская М.В., Акимкина Т.В., Сафина Д.Р., Носовская Е.А., Новикова С.И., Демидюк И.В., Костров СВ. Новая металлопротеиназа Thermoactinomyces sp. Структура и свойства. // III съезд биохимического общества. - Санкт-Петербург. - 2002. - Тезисы сообщений. - С. 491.

Подписано к печати 16/12/2003 Заказ № 471

Принято к исполнению 18/12/2003 Тираж 100 экз.

Исполнено 19/12/2003

ООО «НАКРА ПРИНТ» ИНН 7727185283 Москва, Балаклавский пр-т, 20-2-93 (095)318-40-68 www.autoreferat.ru

«.-36 4

РНБ Русский фонд

2004-4 24716

Содержание диссертации, кандидата химических наук, Заболотская, Мария Васильевна

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Структурно-функциональная организация термолизин-подобных протеиназ.

1.1.1. Общая характеристика молекул термолизин-подобных протеиназ.

1.1.2. Организация активного центра.

1.1.3. Организация субстрат-связывающего кармана.

1.1.4. Организация сайтов связывания ионов Са2+.

1.2. Про-зависимый фолдинг термолизин-подобных протеиназ.

1.3. Молекулярные основы стабилизации термолизин-подобных протеиназ.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

2.1. Микробные штаммы и плазмиды.

2.2. Культивирование микроорганизмов.

2.3. Выделение плазмидной ДНК.

2.4. Выделение бактериальной ДНК Thermoactinomyces species 27а.

2.5. Электрофоретический анализ нуклеиновых кислот.

2.6. Ферментативный гидролиз ДНК.

2.7. Конструирование библиотеки генов Thermoactinomyces species 27а.

2.8. Трансформация клеток Bacillus subtilis AJ73.

2.9. Трансформация клеток Escherichia coli TGI.

2.10. По л имеразная цепная реакция.

2.11. Определение нуклеотидной последовательности ДНК.

2.12. Анализ динамики накопления протеолитических ферментов в культуральной жидкости штаммов-продуцентов.

2.13. Выделение рекомбинантной металлопротеиназы Thermoactinomyces species 27а

2.14. Электрофоретический анализ белков.

2.15. Количественное определение белка.

2.16. Определение молекулярной массы белка.

2.17. Определение N-концевой аминокислотной последовательности.

2.18. Определение протеолитической активности ферментов.

2.19. Влияние рН на стабильность фермента.

2.20. рН-Оптимум протеолитической активности.

2.21. Влияние температуры на стабильность фермента.

2.22. Температурный оптимум протеолитической активности.

2.23. Влияние ионов кальция на стабильность фермента.

2.24. Влияние ингибиторов.

2.25. Определение энзиматических констант фермента.

2.26. Локализация лидерного пептида.

2.27. Статистическая обработка данных.

2.28. Представление молекул.

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

3.1. Клонирование гена металлопротеиназы Thermoactinomyces species 27а.

3.2. Характеристика клонированного фрагмента бактериальной ДНК Thermoactinomyces species 27а, несущего ген металлопротеиназы.

3.3. Определение и анализ нуклеотидной последовательности гена металлопротеиназы Thermoactinomyces species 27а.

3.4. Очистка рекомбинантной металлопротеиназы Thermoactinomyces species 27а.

3.5. Характеристика рекомбинантной металлопротеиназы Thermoactinomyces species 27а.

ВЫВОДЫ.

БЛАГОДАРНОСТИ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Новая металлопротеиназа Thermoactinomyces species 27a"

Актуальность работы.

Протеолитические ферменты широко используются в современной биотехнологии. При этом физико-химические и энзиматические свойства даже тщательно подобранных биокатализаторов часто не оптимальны для конкретных технологических процессов. Успехи современной белковой инженерии позволяют рассчитывать на то, что в ближайшем будущем стандартным подходом станет конструирование ферментов с направленно модифицированными свойствами. Однако на настоящий момент наши знания о молекулярных механизмах, определяющих структурно-функциональные взаимосвязи в белковых молекулах, явно недостаточны. Для проведения исследований структурно-функциональной организации белков удобно использовать семейства родственных ферментов, отличающихся по своим физико-химическим свойствам. Такие наборы детально охарактеризованных белков с соответствующими клонированными генами позволяют проводить разнообразные эксперименты, направленные на анализ структурно-функциональных взаимосвязей в белковых молекулах. В этом плане актуален поиск новых природных ферментов с заданной специфичностью и конкретными характеристиками. С этой целью в лаборатории белковой инженерии Института молекулярной генетики РАН проводится скрининг коллекций различных микроорганизмов, добытых из необычных природных и промышленных источников. В результате анализа отобран ряд штаммов, которые являются продуцентами ферментов, интересных с научной точки зрения и перспективных для практического использования. Одним из таких штаммов является штамм Thermoactinomyces species 27а, который продуцирует термостабильные секреторные протеиназы, в том числе и металлопротеиназы. На данный момент протеолитические ферменты термоактиномицетов охарактеризованы недостаточно. Всё это определяет актуальность работы по клонированию, экспрессии и детальной характеристике металлопротеиназы Thermoactinomyces species 27а.

Работа поддержана грантами РФФИ № 00-04-48281 и № 03-04-48755.

Цель работы.

Целью данной работы является клонирование и экспрессия гена новой металлопротеиназы Thermoactinomyces species 27а, установление нуклеотидной последовательности гена, выделение и очистка рекомбинантного фермента, физико-химическая и энзиматическая характеристика металлопротеиназы Thermoactinomyces sp. 27а.

Научная новизна.

Клонирован и экспрессирован в клетках Bacillus subtilis ген новой металлопротеиназы Thermoactinomyces sp. 27а. Установлена нуклеотидная последовательность клонированного гена Thermoactinomyces sp. 27а. Новая металлопротеиназа Thermoactinomyces sp. 27а относится к семейству термолизин-подобных протеиназ. При этом фермент Thermoactinomyces sp. 27а обладает рядом специфических особенностей, таких как наличие уникальной протяженной

С-концевой аминокислотной последовательности и присутствие аминокислотных замен в

2+ сайтах связывания ионов Са . Выделена и очищена до электрофоретически гомогенного состояния рекомбинантная металлопротеиназа Thermoactinomyces sp. 27а. Установлены физико-химические и энзиматические характеристики нового фермента Thermoactinomyces sp. 27а.

Показано протекание С-концевого процессинга при созревании металлопротеиназы Thermoactinomyces sp. 27а в клетках Bacillus subtilis.

Практическая значимость.

Детально изученная новая металлопротеиназа Thermoactinomyces sp. 27а может быть использована в ряде биотехнологических процессов, например, при получении олигопептидов заданной структуры, а также является удобным объектом для исследования структурно-функциональных взаимосвязей в белковых молекулах. В настоящее время металлопротеиназа Thermoactinomyces sp. 27а применяется в качестве экспериментальной модели для изучения про-зависимого фолдинга термолизин-подобных протеиназ методами белковой инженерии в Институте молекулярной генетики РАН.

Положения, выносимые на защиту.

1. Клонирование и экспрессия гена новой металлопротеиназы Thermoactinomyces sp. 27а, установление его нуклеотидной последовательности.

2. Выделение и очистка рекомбинантной металлопротеиназы Thermoactinomyces sp. 27а.

3. Определение физико-химических и энзиматических характеристик новой металлопротеиназы Thermoactinomyces sp. 27а.

4. Протекание С-концевого процессинга при созревании металлопротеиназы в клетках Bacillus subtilis.

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология", Заболотская, Мария Васильевна

-83 -ВЫВОДЫ

1. Клонирован и экспрессирован в клетках бацилл ген новой металлопротеиназы Thermoactinomyces sp. 27а, а также ряд генов сериновых протеиназ.

2. Определена нуклеотидная последовательность гена металлопротеиназы Thermoactinomyces sp. 27а и проведен анализ соответствующего белка. Показано, что фермент относится к семейству термолизин-подобных протеиназ, синтезируется в виде препробелка и состоит из лидерного пептида, N-концевой про-последовательности, зрелой части и дополнительной С-концевой аминокислотной последовательности. Локализован сайт N-концевого процессинга при созревании фермента.

3. Показано протекание С-концевого процессинга при созревании металлопротеиназы Thermoactinomyces sp. 27а в клетках бацилл.

4. Получен высокоочшценный препарат рекомбинантной металлопротеиназы Thermoactinomyces sp. 27а. Установлены молекулярная масса, N-концевая аминокислотная последовательность, рН- и температурный оптимумы активности, рНи температурная стабильности фермента, отношение констант кса,/Кт по гидролизу

2+ субстрата ФАГЛА. Показано стабилизирующее действие ионов Са на металлопротеиназу Thermoactinomyces sp. 27а.

БЛАГОДАРНОСТИ

Автор выражает глубокую признательность своему научному руководителю доктору химических наук, профессору Кострову Сергею Викторовичу, за поддержку и внимание, оказанные в ходе выполнения работы. Автор выражает благодарность кандидату химических наук Акимкиной Татьяне Викторовне, кандидату химических наук Демидюку Илье Валерьевичу, кандидату биологических наук Носовской Елене Николаевне за помощь в работе и за участие в обсуждении полученных результатов, всем сотрудникам лаборатории белковой инженерии Института молекулярной генетики РАН за поддержку и дружеское отношение, а также своим родителям за всестороннюю помощь и понимание.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата химических наук, Заболотская, Мария Васильевна, Москва

1. Webb Е.С. // 1992. Enzyme nomenclature. 1st, 1 -862.

2. Hartley B.S. Proteolytic enzymes. // 1960. Annu. Rev. Biochem. 29: 45-72.

3. Matsubara H., Feder J. Other bacterial, mold, and yeast proteases. // 1971. The Enzymes. 3rd ed. (Boyer P.D., eds.) Academic Press. New York. 3: 721-792.

4. Barret A.J., Rawlings N.D., Woessner J.F. // 1998. Handbook of Proteolytic Enzymes. Academic Press. Inc. New York. 1033-1064.

5. Latt S.A.,Holmquist В., Vallee B.L. Thermolysin: a zinc metalloenzyme. // 1969. Biochem. Biophys. Res. Comm. 37: 333-339.

6. Feder J., Garrett L.R., Wildi B.S. Studies on the role of calcium in thermolysin. // 1971. Biochemistry. 10: 4552-4556.

7. Veltman O.R., Vriend G., van den Burg В., Hardy F., Venema G., Eijsink V.G. Engineering thermolysin-like proteases whose stability is largely independent of calcium. // 1997. FEBSLett. 405(2): 241-244.

8. Feder J., Keay L., Garrett L.R., Cirulis N., Moseley M.H., Wildi B.S. Bacillus cereus neutral protease. //1971. Biochim. Biophys. Acta. 251(1): 74-78.

9. Feder J. Studies on the specificity of Bacillus subtilis neutral protease with synthetic substrates. // 1967. Biochemistry. 6(7): 2088-2093.

10. Feder J., Schuck J.M. Studies on the Bacillus subtilis neutral-protease- and Bacillus thermoproteolyticus thermolysin-catalyzed hydrolysis of dipeptide substrates. // 1970. Biochemistry. 9(14): 2784-2791.

11. O'Donohue M.J., Roques B.P., Beaumont A. Cloning and expression in Bacillus subtilis of the npr gene from Bacillus thermoproteolyticus Rokko coding for the thermostable metalloprotease thermolysin. // 1994. Biochem. J. 300: 599-603.

12. Titani K., Hermodson M.A., Ericsson L.H., Walsh K.A., Neurath H. Amino-acid sequence of thermolysin. // 1972. Nature New Biol. 238: 35-37.

13. Wetmore D.R., Wong S.L., Roche R.S. The role of the pro-sequence in the processing and secretion of the thermolysin-like neutral protease from Bacillus cereus. II 1992. Mol. Microbiol. 6(12): 1593-1604.

14. Kuhn S., Fortnagel P. Molecular cloning and nucleotide sequence of the gene encoding a calcium-dependent exoproteinase from Bacillus megaterium ATCC 14581. // 1993. J. Gen. Microbiol. 139(1): 39-47.

15. Abakov A.S., Bolotin A.P., Sorokin A.V. Structure of the Bacillus brevis metalloprotease gene. // 1990. Mol. Biol. (Mosk). 24(5): 1363-1372.

16. Takekawa S., Uozumi N., Tsukagoshi N., Udaka S. Proteases involved in generation of beta- and alpha-amylases from a large amylase precursor in Bacillus polymyxa. // 1991. J. Bacteriol. 173(21): 6820-6825.

17. Tran L., Wu X.C., Wong S.L. Cloning and expression of a novel protease gene encoding an extracellular neutral protease from Bacillus subtilis. II 1991. J. Bacteriol. 173(20): 6364-6372.

18. Yang M.Y., Ferrari E., Henner D.J. Cloning of the neutral protease gene of Bacillus subtilis and the use of the cloned gene to create an in vitro-derived deletion mutation. II 1984. J. Bacteriol. 160(1): 15-21.

19. Weaver L.H., Kester W.R., Matthews B.W. A crystallographic study of the complex of phosphoramidon with thermolysin. A model for the presumed catalytic transition state and for the binding of extended substrates. // 1977. J. Mol. Biol. 114: 119-132.

20. Holmes M.A., Matthews B.W. Structure of thermolysin refined at 1.6 A resolution. // 1982. J. Mol. Biol. 160: 623-639.

21. Stark W., Pauptit R.A., Wilson K.S., Jansonius J.N. The structure of neutral protease from Bacillus cereus at 0.2-nm resolution. // 1992. Eur. J. Biochem. 207(2): 781-791.

22. Thayer M.M., Flaherty K.M., McKay D.B. Three-dimensional structure of the elastase of Pseudomonas aeruginosa at 1.5 A resolution. // 1991. J. Biol. Chem. 266: 2864-2871.

23. Banbula A., Potempa J., Travis J., Fernandez-Catalan C., Mann K., Huber R., Bode W., Medrano F.J. Amino-acid sequence and three-dimensional structure of the Staphylococcus aureus metalloproteinase at 1.72 A resolution. // 1998. Structure. 6:1185-1193.

24. Vriend G., Eijsink V. Prediction and analysis of structure, stability and unfolding ofthermolysin-like proteases. // 1993. J. Comput. Aided Mol. Des. 7(4): 367-396.

25. Eijsink V.G., Vriend G., van den Burg В., Venema G., Stulp B.K. Contribution of the C-terminal amino acid to the stability of Bacillus subtilis neutral protease. // 1990. Protein Eng. 4(1): 99-104.

26. Tsuru D., Imajo S., Morikawa S., Yoshimoto Т., Ishiguro M. Zinc protease of Bacillus subtilis var. amylosacchariticus: construction of a three-dimensional model and comparison with thermolysin.// 1993. J. Biochem. (Tokyo). 113(1): 101-105.

27. Jin Y., Kim D.H. Inhibition stereochemistry of hydroxamate inhibitors for thermolysin. // 1998. Bioorg. Med. Chem. Lett. 8(24): 3515-3518.

28. Kester W.R., Matthews B.W. Crystallographic study of the binding of dipeptide inhibitors to thermolysin: implications for the mechanism of catalysis. // 1977. Biochemistry. 16(11): 2506-2516.

29. Monzingo A.F., Matthews B.W. Structure of a mercaptan-thermolysin complex illustrates mode of inhibition of zinc proteases by substrate-analogue mercaptans. // 1982. Biochemistry. 21(14): 3390-3394.

30. Argos P., Garavito R.M., Eventoff W., Rossmann M.G., Branden C.I. Similarities in active center geometries of zinc-containing enzymes, proteases and dehydrogenases. // 1978. J. Mol. Biol. Dec. 126(2): 141-158.

31. Vallee B.L., Auld D.S. Zinc coordination, function, and structure of zinc enzymes and other proteins. //1990. Biochemistry. 29(24): 5647-5659.

32. Hausrath A.C., Matthews B.W. Redetermination and refinement of the complex of benzylsuccinic acid with thermolysin and its relation to the complex with carboxypeptidase A. // 1994.J.Biol. Chem. 269(29): 18839-18842.

33. Антонов B.K. Химия протеолиза. //1991. Москва. "Наука"

34. Beaumont A., O'Donohue M.J., Paredes N., Rousselet N., Assicot M., Bohuon C., Fournie-Zaluski M.C., Roques B.P. The role of histidine 231 in thermolysin-like enzymes. A site-directed mutagenesis study. // 1995. J. Biol. Chem. 270(28): 16803-16808.

35. Toma S., Campagnoli S., De Gregoriis E., Gianna R., Margarit I., Zamai M., Grandi G. Effect of Glu-143 and His-231 substitutions on the catalytic activity and secretion of Bacillus subtilis neutral protease. // 1989. Protein Eng. 2(5): 359-364.

36. Matthews B.W. Structural basis of the action of thermolysin and related zinc peptidases. // 1988. Acc. Chem. Res. 21: 333-340.

37. Hangauer D.G., Monzingo A.F., Matthews B.W. An interactive computer graphics study of thermolysin-catalyzed peptide cleavage and inhibition by N-carboxymethyl dipeptides. // 1984. Biochemistry. 23(24): 5730-5741.

38. Степанов И.М. Структура и функции белков. // 1996. Москва. "Высшая школа"

39. Voordouw G., Milo C., Roche R.S. Role of bound calcium ions in thermostable, proteolytic enzymes. Separation of intrinsic and calcium ion contributions to the kinetic thermal stability. //1976. Biochemistry. 15(17): 3716-3724.

40. Corbett R.J., Ahmad F., Roche R.S. Domain unfolding and the stability of thermolysin in guanidine hydrochloride. // 1986. Biochem. Cell. Biol. 64(10): 953-961.

41. СеркинаА.В., Шевелев А.Б., Честухина Г.Г. Структура и функции предшественников бактериаьных протеиназ. // 2001. Биоорг. хим. 27(5): 323-346.

42. Shinde U., Inouye М. Intramolecular chaperones: polypeptide extensions that modulate protein folding. // 2000. Semin. Cell Dev. Biol. 11(1): 35-44.

43. Eder J., Fersht A.R. Pro-sequence-assisted protein folding. // 1995. Mol. Microbiol. 16(4): 609-614.

44. Ikemura H., Takagi H., Inouye M. Requirement of pro-sequence for the production ofactive subtilisin E in Escherichia coli. II 1987. J. Biol. Chem. 262(16): 7859-7864.

45. Shinde U., Inouye M. Propeptide-mediated folding in subtilisin: the intramolecular chaperone concept. // 1996. Adv. Exp. Med. Biol. 379: 147-154.

46. Baardsnes J., Sidhu S., MacLeod A., Elliott J., Morden D., Watson J., Borgford T. Streptomyces griseus protease B: secretion correlates with the length of the propeptide. // 1998. J. Bacteriol. 180(12): 3241-3244.

47. Braun P., Tommassen J., Filloux A. Role of the propeptide in folding and secretion of elastase of Pseudomonas aeruginosa. II 1996. Mol. Microbiol. 19(2): 297-306.

48. Silen J.L., Agard D.A. The alpha-lytic protease pro-region does not require a physical linkage to activate the protease domain in vivo. II 1989. Nature. 341(6241): 462-464.

49. Takagi H., Koga M., Katsurada S., Yabuta Y., Shinde U., Inouye M., Nakamori S. Functional analysis of the propeptides of subtilisin E and aqualysin I as intramolecular chaperones. // 2001. FEBS Lett. 508(2): 210-214.

50. Winther J.R., Sorensen P. Propeptide of carboxypeptidase Y provides a chaperone-like function as well as inhibition of the enzymatic activity. //1991. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 88(20): 9330-9334.

51. Koelsch G., Mares M., Metcalf P., Fusek M. Multiple functions of pro-parts of aspartic proteinase zymogens. // 1994. FEBS Lett. 343(1): 6-10.

52. Van den Hazel H.B., Kielland-Brandt M.C., Winther J.R. The propeptide is required for in vivo formation of stable active yeast proteinase A and can function even when not covalently linked to the mature region. // 1993. 268(24): 18002-18007.

53. Zhu X.L., Ohta Y., Jordan F., Inouye M. Pro-sequence of subtilisin can guide the refolding of denatured subtilisin in an intermolecular process. // 1989. Nature. 339(6224): 483-484.

54. Li Y., Hu Z., Jordan F., Inouye M. Functional analysis of the propeptide of subtilisin E as an intramolecular chaperone for protein folding. Refolding and inhibitory abilities of propeptide mutants. // 1995. J. Biol. Chem. 270(42): 25127-25132.

55. Ruan В., Hoskins J., Bryan P.N. Rapid folding of calcium-free subtilisin by a stabilized pro-domain mutant. // 1999. Biochemistry. 38(26): 8562-8571.

56. Shinde U.P., Liu J.J., Inouye M. Protein memory through altered folding mediated by intramolecular chaperones. //1997. Nature. 389(6650): 520-522.

57. Wang L., Ruan В., Ruvinov S., Bryan P.N. Engineering the independent folding of the subtilisin BPN' pro-domain: correlation of pro-domain stability with the rate of subtilisin folding. // 1998. Biochemistry. 37(9): 3165-3171.

58. Buevich A.V., Shinde U.P., Inouye M., Baum J. Backbone dynamics of the natively unfolded pro-peptide of subtilisin by heteronuclear NMR relaxation studies. // 2001. J. Biomol. NMR. 20(3): 233-249.

59. Strausberg S., Alexander P., Wang L., Schwarz F., Bryan P. Catalysis of a protein folding reaction: thermodynamic and kinetic analysis of subtilisin BPN' interactions with its propeptide fragment. // 1993. Biochemistry. 32(32): 8112-8119.

60. Bryan P., Alexander P., Strausberg S., Schwarz F., Lan W., Gilliland G., Gallagher D.T. Energetics of folding subtilisin BPN'. // 1992. Biochemistry. 31(21): 4937-4945.

61. Ваганова Т.И., Медведева Н.П., Степанов В.М. Ренатурация бактериальных металлопротеиназ. // 1993. Биохимия. 58(6): 913-920.

62. Matsubara М., Kurimoto Е., Kojima S., Miura К., Sakai Т. Achievement of renaturation of subtilisin BPN' by a novel procedure using organic salts and a digestible mutant of Streptomyces subtilisin inhibitor. // 1994. FEBS Lett. 342(2): 193-196.

63. Ohta Y., Hojo H., Aimoto S., Kobayashi Т., Zhu X., Jordan F., Inouye M. Pro-peptide as an intramolecular chaperone: renaturation of denatured subtilisin E with a synthetic pro-peptide. //1991. Mol. Microbiol. 5(6): 1507-1510.

64. Птицын О.Б. Сворачивание белков: нуклеация и компактные интермедиаты. // 1998. Биохимия. 63(4): 435-443.

65. Egnell P., Flock J.I. The autocatalytic processing of the subtilisin Carlsberg pro-region is independent of the primary structure of the cleavage site. // 1992. Mol. Microbiol. 6(9): 1115-1119.

66. Kobayashi Т., Inouye M. Functional analysis of the intramolecular chaperone. Mutational hot spots in the subtilisin pro-peptide and a second-site suppressor mutation within the subtilisin molecule. //1992. J. Mol. Biol. 226(4): 931-933.

67. Shinde U., Fu X., Inouye M. A pathway for conformational diversity in proteins mediated by intramolecular chaperones.// 1999. J. Biol. Chem. 274(22): 15615-15621.

68. Agard D. To fold or not to fold. // 1993. Science. 260(5116): 1903-1904.

69. Wandersman C. Secretion, processing and activation of bacterial extracellular proteases. // 1989. Mol. Microbiol. 3(12): 1825-1831.

70. Gallagher Т., Gilliland G., Wang L., Bryan P. The prosegment-subtilisin BPN' complex: crystal structure of a specific "foldase". // 1995. Structure. 3(9): 907-914.

71. Jain S.C., Shinde U., Li Y., Inouye M., Berman H.M. The crystal structure of an autoprocessed Ser221 Cys-subtilisin E-propeptide complex at 2.0 A resolution. // 1998. J. Mol. Biol. 284(1): 137-144.

72. Power S.D., Adams R.M., Wells J.A. Secretion and autoproteolytic maturation of subtilisin. // 1986. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 83(10): 3096-3100.

73. Серкина A.B., Бушуева A.M., Честухина Г.Г., Гумперт Й., Хойшен К., Куяу М., Шевелев А.Б. Получение предшественника глутамилэндопептидазы В. licheniformis и изучение его процессинга in vitro. II2001. Вопр. мед. хим. 47(1): 111-122.

74. Chang S.C., Chang P.C., Lee Y.H. The roles of propeptide in maturation and secretion of Npr protease from Streptomyces. II1994. J. Biol. Chem. 269(5): 3548-3554.

75. Takagi M., Imanaka T. Role of the pre-pro-region of neutral protease for the secretion in Bacillus subtilis. И 1989. J. Ferment. Bioeng. 67(2): 71-76.

76. O'Donohue M.J., Beaumont A. The role of the prosequense of thermolysin in enzyme inhibition and folding in vitro. II1996. J. Biol. Chem. 271(43): 26477-26481.

77. Marie-Claire C., Roques B.R., Beaumont A. Intramolecular processing of prothermolysin. //1998. J. Biol.Chem. 273(10): 5697-5701.

78. Schlechter Т., Berger A. On the size of the active site in proteases. // 1967. Biochem. Biophys. Res. Commun. 27(2): 157-162.

79. Nosoh Y., Sekiguchi T. Protein engineering for thermostability. // 1990. Trends Biotechnol. 8(1): 16-20.

80. Branden C., Tooze J. Introduction to Protein Structure. // 1999. 2nd Edition. Garland Publishing. Inc. New York.

81. Tucker P.W., Perutz M.F. Mechanism of charge compensation and impairment of co-operative functions in haemoglobin Tacoma (Arg B12(30)beta leads to Ser). // 1977. J. Mol. Biol. 114(3): 415-420.

82. Serrano L., FershtA.R. Capping and alpha-helix stability. // 1989. Nature. 342(6247): 296-299.

83. Matthews B.W., Nicholson H., Becktel W.J. Enhanced protein thermostability from site-directed mutations that decrease the entropy of unfolding. // 1987. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 84(19): 6663-6667.

84. Matsumura M., Signor G., Matthews B.W. Substantial increase of protein stability by multiple disulphide bonds. // 1989. Nature. 342(6247): 291-293.

85. Matsumura M., Becktel W.J., Levitt M., Matthews B.W. Stabilization of phage T4 lysozyme by engineered disulfide bonds. // 1989. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 86(17): 6562-6566.

86. Mitchinson C., Wells J.A. Protein engineering of disulfide bonds in subtilisin BPN'. // 1989. Biochemistry. 28(11): 4807-4815.

87. Cunningham B.C., Wells J.A. Improvement in the alkaline stability of subtilisin using an efficient random mutagenesis and screening procedure. // 1987. Protein Eng. 1(4): 319-325.

88. Pantoliano M.W., Whitlow M., Wood J.F., Dodd S.W., Hardman K.D., Rollence M.L., Bryan P.N. Large increases in general stability for subtilisin BPN' through incremental changes in the free energy of unfolding. // 1989. Biochemistry. 28(18): 7205-7213.

89. Argos P., Rossman M.G., Grau U.M., Zuber H., Frank G., Tratschin J.D. Thermal stability and protein structure. // 1979. Biochemistry. 18(25): 5698-5703.

90. Olsen K.W. Structural basis for the thermal stability of glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenases. // 1983. Int. J. Pept. Protein Res. 22(4): 469-475.

91. Imanaka Т., Shibazaki M., Takagi M. A new way of enhancing the thermostability of proteases. // 1986. Nature. 324(6098): 695-697.

92. Menendez-Arias L., Argos P. Engineering protein thermal stability. Sequence statistics point to residue substitutions in alpha-helices. // 1989. J. Mol. Biol. 206(2): 397-406.

93. Mrabet N.T., van den Broeck A., van den Brande I., Stanssens P., Laroche Y., Lambeir A.M., Matthijssens G., Jenkins J., Chiadmi M., van Tilbeurgh H., et al. Arginine residues as stabilizing elements in proteins. //1992. Biochemistry. 31(8): 2239-2253.

94. Perutz M.F., Raidt H. Stereochemical basis of heat stability in bacterial ferredoxins and in haemoglobin A2. // 1975. Nature. 255(5505): 256-259.

95. Ruegg C., Ammer D., Lerch K. Comparison of amino acid sequence and thermostability of tyrosinase from three wild type strains of Neurospora crassa. II 1982. J. Biol. Chem. 257(11): 6420-6426.

96. Zuber H. Temperature adaptation of lactate dehydrogenase. Structural, functional and genetic aspects. // 1988. Biophys. Chem. 29(1-2): 171-179.

97. Fontana A. Structure and stability of thermophilic enzymes. Studies on thermolysin. // 1988. Biophys. Chem. 29(1-2): 181-193.

98. Marino G., Nitti G., Arnone M.I., Sannia G., Gambacorta A., DeRosaM. Purification and characterization of aspartate aminotransferase from the thermoacidophilic archaebacterium Sulfolobus solfataricus. // 1988. J. Biol. Chem. 263(25): 12305-12309.

99. Querol E., Perez-Pons J.A., Mozo-Villarias A. Analysis of protein conformational characteristics related to thermostability. // 1996. Protein Eng. 9(3): 265-271.

100. Leatherbarrow R.J., Fersht A.R. Protein engineering. // 1986. Protein Eng. 1(1): 7-16.

101. Knowles J.R. Tinkering with enzymes: what are we learning? // 1987. Science. 236(4806): 1252-1258.

102. Ohmura Т., Ueda Т., Ootsuka K., Saito M., Imoto T. Stabilization of hen egg white lysozyme by a cavity-filling mutation. // 2001. Protein Sci. 10(2): 313-320.

103. Mark A.E., van Gunsteren W.F. Simulation of the thermal denaturation of hen egg white lysozyme: trapping the molten globule state. // 1992. Biochemistry. 31(34): 7745-7748.

104. Caflisch A., Karplus M. Molecular dynamics simulation of protein denaturation: solvation of the hydrophobic cores and secondary structure of barnase. // 1994. Pro. Natl. Acad. Sci. USA. 91(5): 1746-1750.

105. Schwartz R.M., Dayhoff M.O. Matrices for detecting distant relationships. // 1978. Atlas of Protein Sequence and Structure. Ed. M.O. Dayhoff. Natl. Biomed. Res. Found. Washington. DC. 5(3): 353-358.

106. Arnold F.H., Zhang J.H. Metal-mediated protein stabilization. // 1994. Trends Biotechnol. 12(5): 189-192.

107. Dahlquist F.W., Long J.W., Bigbee W.L. Role of Calcium in the thermal stability of thermolysin. //1976. Biochemistry. 15(5): 1103-1 111.

108. Wells J.A., Powers D.B. In vivo formation and stability of engineered disulfide bonds in subtilisin. // 1986. J. Biol. Chem. 261(14): 6564-6570.

109. Van den Burg В., Eijsink V.G., Stulp B.K., Venema G. Identification of autodigestion target sites in Bacillus subtilis neutral proteinase. // 1990. Biochem. J. 272(1): 93-97.

110. Eijsink V.G., van den Burg В., Vriend G., Berendsen H.J., Venema G. Thermostability of Bacillus subtilis neutral protease. //1991. Biochem Int. 24(3): 517-525.

111. Pace C.N., Shaw K.L. Linear extrapolation method of analyzing solvent denaturation curves. // 2000. Proteins. 4: 1-7.

112. Creighton Т.Е. Protein folding. // 1990. Biochem J. 270(1): 1-16.

113. Pace C.N. Determination and analysis of urea and guanidine hydrochloride denaturation curves. // 1986. Methods Enzymol. 131: 266-280.

114. Pace C.N. Measuring and increasing protein stability. // 1990. Trends Biotechnol. 8(4): 93-98.-95138. Becktel W.J., Baase W.A. Thermal denaturation of bacteriophage T4 lysozyme at neutral pH. // 1987. Biopolymers. 26(5): 619-623.

115. Becktel W.J., Schellman J.A. Protein stability curves. // 1987. Biopolymers. 26(11): 1859-1877.

116. Kidokoro S., Miki Y., Endo K., Wada A., Nagao H., Miyake Т., Aoyama A., YoneyaT., Kai K., Ooe S. Remarkable activity enhancement of thermolysin mutants. // 1995. FEBSLett. 367(1): 73-76.

117. Braxton S., Wells J.A. Incorporation of a stabilizing Ca(2+)-binding loop into subtilisin BPN'. // 1992. Biochemistry. 31(34): 7796-7801.

118. Eijsink V.G., Vriend G., van der Vinne В., Hazes В., van den Burg В., Venema G. Effects of changing the interaction between subdomains on the thermostability of Bacillus neutral proteases. //1992. Proteins. 14(2): 224-236.

119. Rashin A.A., Iofin M., Honig B. Internal cavities and buried waters in globular proteins. // 1986. Biochemistry. 25(12): 3619-3625.

120. Voorintholt R., Kosters M.T., Vegter G., Vriend G., Hoi W.G. A very fast program for visualizing protein surfaces, channels and cavities. //1989. J. Mol. Graph. 7(4): 243-245.

121. Shortle D., Stites W.E., Meeker A.K. Contributions of the large hydrophobic amino acids to the stability of staphylococcal nuclease. // 1990. Biochemistry. 29(35): 8033-8041.

122. Kellis J.T. Jr., Nyberg K., Sali D., Fersht A.R. Contribution of hydrophobic interactions to protein stability. // 1988. Nature. 333(6175): 784-786.

123. Eriksson A.E., Baase W.A., Zhang X.J., Heinz D.W., Blaber M., Baldwin E.P., Matthews B.W. Response of a protein structure to cavity-creating mutations and its relation to the hydrophobic effect. // 1992. Science. 255(5041): 178-183.

124. Karpusas M., Baase W.A., Matsumura M., Matthews B.W. Hydrophobic packing in T4 lysozyme probed by cavity-filling mutants. // 1989. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 86(21): 8237-8241.

125. Matsumura M., Becktel W.J., Matthews B.W. Hydrophobic stabilization in T4 lysozyme determined directly by multiple substitutions of Ile3. // 1988. Nature. 334(6181): 406-410.

126. Eijsink V.G., van der Zee J.R., van den Burg В., Vriend G., Venema G. Improving the thermostability of the neutral protease of Bacillus stearothermophilus by replacing a buried asparagine by leucine. //1991. FEBS Lett. 282(1): 13-16.

127. Vriend G., Berendsen H.J., van der Zee J.R., van den Burg В., Venema G., Eijsink V.G. Stabilization of the neutral protease of Bacillus stearothermophilus by removal of a buried water molecule. //1991. Protein Eng. 4(8): 941-945.

128. Eijsink V.G., Vriend G., van der Zee J.R., van den Burg В., Venema G. Increasing the thermostability of the neutral proteinase of Bacillus stearothermophilus by improvement of internal hydrogen-bonding. // 1992. Biochem. J. 285(2): 625-628.

129. Margarit I., Campagnoli S., Frigerio F., Grandi G., De Filippis V., Fontana A. Cumulative stabilizing effects of glycine to alanine substitutions in Bacillus subtilis neutral protease. //1992. Protein Eng. 5(6): 543-550.

130. Hardy F., Vriend G., Veltman O.R., van der Vinne В., Venema G., Eijsink V.G. Stabilization of Bacillus stearothermophilus neutral protease by introduction of prolines. //1993. FEBS Lett. 317(1-2): 89-92.

131. Nakamura S., Tanaka Т., Yada R.Y., Nakai S. Improving the thermostability of Bacillus stearothermophilus neutral protease by introducing proline into the active site helix. // 1997. Protein Eng. 10(11): 1263-1269.

132. Hardy F., Vriend G., van der Vinne В., Frigerio F., Grandi G., Venema G., Eijsink V.G. The effect of engineering surface loops on the thermal stability of Bacillus subtilis neutral protease. // 1994. Protein Eng. 7(3): 425-430.

133. Eijsink V.G., Vriend G., van den Burg В., van der Zee J.R., Veltman O.R., Stulp B.K., Venema G. Introduction of a stabilizing 10 residue beta-hairpin in Bacillus subtilis neutral protease. // 1992. Protein Eng. 5(2): 157-163.

134. Van den Burg В., Dijkstra B.W., Vriend G., van der Vinne В., Venema G., Eijsink V.G. Protein stabilization by hydrophobic interactions at the surface. // 1994. Eur. J. Biochem. 220(3): 981-985.

135. Van den Burg В., Dijkstra B.W., van der Vinne В., Stulp B.K., Eijsink V.G., Venema G. Introduction of disulfide bonds into Bacillus subtilis neutral protease. // 1993. Protein Eng. 6(5): 521-527.

136. Van den Burg В., Eijsink V.G., Vriend G., Veltman O.R., Venema G. Rendering one autolysis site in Bacillus subtilis neutral protease resistant to cleavage reveals a new fission. // 1998. Biotechnol. Appl. Biochem. 27(2): 125-132.

137. Veltman O.R., Vriend G., Hardy F., Mansfeld J., van den Burg В., Venema G., Eijsink V.G. Mutational analysis of a surface area that is critical for the thermal stability of thermolysin-like proteases. // 1997. Eur. J. Biochem. 248(2): 433-440.

138. Mansfeld J., Vriend G., Dijkstra B.W., Veltman O.R., van den Burg В., Venema G., Ulbrich-Hofmann R., Eijsink V.G. Extreme stabilization of a thermolysin-like protease by an engineered disulfide bond. // 1997. J. Biol. Chem. 272(17): 11152-11156.

139. Vriend G., Berendsen H.J., van den Burg В., Venema G., Eijsink V.G. Early steps in the unfolding of thermolysin-like proteases. // 1998. J. Biol. Chem. 273(52): 35074-35077.

140. Van den Burg В., Vriend G., Veltman O.R., Venema G., Eijsink V.G. Engineering an enzyme to resist boiling. // 1998. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 95(5): 2056-2060.

141. Eijsink V.G., Veltman O.R., Aukema W., Vriend G., Venema G. Structural determinants of the stability of thermolysin-like proteinases. // 1995. Nat. Struct. Biol. 2(5): 374-379.

142. Marshall C.J. Cold-adapted enzymes. // 1997. Trends Biotechnol. 15(9): 359-364.

143. Danson M.J., Hough D.W., Russell R.J., Taylor G.L., Pearl L. Enzyme thermostability and thermoactivity. // 1996. Protein Eng. 9(8): 629-630.

144. Сорокин A.B., Хазак В.Э. Экспрессионная единица в области инициации репликации плазмиды pSM19035 стрептококков. // 1990. Молекулярная биология. 24(4): 993-999.

145. MBI Fermentas. Catalog and product application guide. // 1996-1997.-98177. Anagnostopoulos С., Spizizen J. Requirements for transformation in Bacillus subtilis. II 1961 .J. Bacteriol. 81: 741-746.

146. Маниатис Т., Фрич Э. Методы генной инженерии. Молекулярное клонирование. // 1984. Москва. Мир.

147. Dagert М., Ehrlich S.D. Prolonged incubation in calcium chloride improves the competence of Escherichia coli cells. // 1979. Gene. 6(1): 23-28.

148. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head bacteriophage T4. // 1970. Nature. 227(5259): 680-685.

149. Bredford M.M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein dye binding. // 1976. Anal. Biochem. 72(1-2): 248-254.

150. Гаспаров B.C., Дягтярь В.Г. Определение белка по связыванию с красителем кумасси бриллиантовым голубым G-250. //1994. Биохимия. 59(6): 763-777.

151. Charney J., Tomarelli R.M. Determination of the proteolytic activity of duodenal juice. // 1947. J. Biochem. 177: 501-505.

152. Feder J. A spectrophotometry assay for neutral protease. // 1968. Biochem. Biophys. Res. Commun. 32(2): 326-332.

153. Khan S.M, Darnall D.W. The hydrolysis of 3-(2-furylacryloyl)-glycyl-l-leucine amide by thermolysin. // 1978. Anal. Biochem. 86(1): 332-336.

154. Inouye K. Effects of salts on thermolysin: activation of hydrolysis and synthesis of N-carbobenzoxy-L-aspartyl-L-phenylalanine methyl ester, and a unique change in the absorption spectrum of thermolysin. // 1992. J. Biochem. (Tokyo). 112(3): 335-340.

155. Nielsen H., Engelbrecht J., Brunak S., von Heijne G. Identification of prokaryotic and eukaryotic signal peptides and prediction of their cleavage sites. // 1997. Protein Eng. 10(1): 1-6.

156. Watson M.E. Compilation of published signal sequences. // 1984. Nucleic Acids Res. 12(13): 5145-5164.

157. Smith H., de Jong A., Bron S., Venema G. Characterization of signal-sequence-coding regions selected from the Bacillus subtilis chromosome. // 1988. Gene. 70(2): 351-361.

158. David V.A., Deutch A.H., Sloma A., Pawlyk D., Ally A., Durham D.R. Cloning, sequencing and expression of the gene encoding the extracellular neutral protease, vibriolysin, of Vibrioproteolyticus. II 1992. Gene. 112(1): 107-112.

159. Miyoshi S., Sonoda Y., Wakiyama H., Rahman M.M., Tomochika K., Shinoda S., Yamamoto S., Tobe K. An exocellular thermolysin-like metalloprotease produced by

160. Vibrio fluvialis: purification, characterization, and gene cloning. // 2002. Microb. Pathog. 33(3): 127-134.

161. Hase C.C., Finkelstein R.A. Cloning and nucleotide sequence of the Vibrio cholerae hemagglutinin/protease (HA/protease) gene and construction of an HA/protease-negative strain. //1991./. Bacteriol. 173(11): 3311-3317.

162. Norqvist A., Norrman В., Wolf-Watz H. Identification and characterization of a zinc metalloprotease associated with invasion by the fish pathogen Vibrio anguillarum. II 1990. Infect. Immun. 58(11): 3731-3736.

163. Miyoshi S., Wakae H., Tomochika K., Shinoda S. Functional domains of a zinc metalloprotease from Vibrio vulnificus. II 1997. J. Bacteriol. 179(23): 7606-7609.

164. Pohlner J., Halter R., Beyreuther K., Meyer T.F. Gene structure and extracellular secretion of Neisseria gonorrhoeae IgA protease. // 1987. Nature. 325(6103): 458-462.

165. Yanagida N., Uozumi Т., Beppu T. Specific excretion of Serratia marcescens protease through the outer membrane of Escherichia coli. II1986. J. Bacteriol. 166(3): 937-944.

166. Gray L., Mackman N., Nicaud J.M., Holland I.B. The carboxy-terminal region of haemolysin 2001 is required for secretion of the toxin from Escherichia coli. II 1986. Mol. Gen. Genet. 205(1): 127-133.

167. Pugsley A.P. // 1988. Protein transfer and Organelle Biogenesis. (Das R.A., Robins P.W., eds). Academic Press. Orlando. FL. 607-652.

168. Шагинян К.А., Изотова JI.С., Йомантас Ю.В., Стронгин А.Я., Степанов В.М. Металлопротеиназа из Bacillus subtilis внеклеточный и внутриклеточный ферменты. // 1980. Биохимия. 45(11): 2083-2095.

169. Takii Y., Tagushi Н., Shimoto Н., Suzuki Y. Bacillus stearothermophilus KP 1236 neutral protease with strong thermostability comparable to thermolysin. // 1987. Appl. Microbiol, and Biotechnol. 27(2): 186-191.

170. Паберит Н.Ю., Панк M.C., Лийдере M.A., Ванаталу К.П. Очистка и свойства нейтральной мтеллопротеиназы из термофильной бактерии Bacillus brevis. II 1984. Биохимия. 49(2): 275-284.

171. Sidler W., Kumpf В., Peterhaus В., Zuber H. A neutral proteinase produced by Bacillus cereus with high sequence homology to thermolysin: production, isolation and characterization. // 1986. Appl. Microbiol, and Biotechnol. 25(1): 18-24.

172. Sohoni S.S., Joshi P.N. Isolation fnd characterization of a protease from Bacillus subtilis. II 1982. Indian J. Biochem. Biophys. 19(6): 399-402.

173. Морозова И.П., Юсупова М.П., Гололобов М.Ю., Королькова Н.К., Ходова О.М., Степанов В.М. Металлопротеиназа Bacillus mesentericus штамм В-313. // 1993. Биохимия. 58(9): 1420-1429.

174. Inouye К., Lee S.B, Tonomura В. Effect of amino acid residues at the cleavable site of substrates on the remarkable activation of thermolysin by salts. // 1996. Biochem. J. 315(1): 133-138.