Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Низкомолекулярные БТШ злаков в период действия высокой температуры и водного дефицита

ВАК РФ 03.00.12, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "Низкомолекулярные БТШ злаков в период действия высокой температуры и водного дефицита"

На правах рукописи

Коротаева Наталья Евгеньевна

НИЗКОМОЛЕКУЛЯРНЫЕ БТШ ЗЛАКОВ В ПЕРИОД ДЕЙСТВИЯ ВЫСОКОЙ ТЕМПЕРАТУРЫ И ВОДНОГО ДЕФИЦИТА.

03.00.12 - физиология и биохимия растений

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Иркутск - 2007

003161960

Работа выполнена в Сибирском институте физиологии и биохимии растений (СИФИБР) СО РАН, г Иркутск

Научный руководитель доктор биологических наук, Г.Б. Боровский (СИФИБР СО РАН)

Официальные оппоненты доктор биологических наук,

А.К. Глянько, (СИФИБР СО РАН)

кандидат биологических наук, Л.И. Донская, (Иркутский Государственный Университет)

Ведущая организация Институт цитологии и генетики (ИЦиГ) СО РАН, г Новосибирск

Защита диссертации состоится "12" ноября 2007 г_ в 10 час на заседании совета Д 003.047.01 при Сибирском институте физиологии и биохимии растений СО РАН по адресу 664033, г Иркутск, ул. Лермонотова, 132, а\я317 Факс (3952)510754, E-mail matmod@sifibr irk ru

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Сибирского института физиологии и биохимии растений СО РАН.

Автореферат разослан " S^QtftJbpJ*2007 г

Ученый секретарь диссертационного совета

Д 003 047 01 лМЫУ. 1лг/ г п- Акимова

кандидат биологических наук

oJ/t*JJjifi/^ гп

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Изучение механизмов устойчивости растений к таким неблагоприятным воздействиям, как высокая температура и засуха, остается актуальной задачей, поскольку имеет большое практическое значение

Стрессовые белки-шапероны (белки теплового шока, БТШ) отвечают в клетке за сохранение и восстановление структуры поврежденных полипептидов Одним из важнейших для растительных организмов классов стрессовых белков является класс низкомолекулярных БТШ (нмБТШ). Растения, в отличие от других организмов, обладают выраженным полиморфизмом нмБИП, что позволяет предположить наличие связи между нмБТШ и уникальными для растений адаптациями (Vierling, 1991, Waters, 1995) Функция нмБТШ в клетке — упорядоченное связывание частично поврежденных полипептидов и поддержание их в состоянии, пригодном для восстановления с помощью других шаперонов. Таким образом, нмБТШ являются неотъемлемым участником рабочего механизма "шапероновой машины"

К настоящему времени накоплены достаточно обширные сведения о нмБТШ, локализованных в цитоплазме В то же время сведения о нмБТШ, локализованных в таких важных органеллах клетки, как митохондрии, и о роли этих белков в защите функционирования комплексов дыхательной цепи в стрессовых условиях, довольно противоречивы. Отсутствует информация относительно нмБТШ такой хозяйственно важной культуры как рожь. Не изучен вопрос о синтезе и накоплении нмБТШ в условиях водного дефицита у злаков.

Цель и задачи исследования. Целью исследования было изучение накопления низкомолекулярных БТШ злаков в условиях теплового шока и водного дефицита с помощью антител широкого спектра и установление связи между накоплением низкомолекулярных БТШ и дыхательной активностью митохондрий в стрессовых условиях Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи- 1) сравнить влияние теплового шока на дыхательную активность изолированных митохондрий злаков, отличающихся по термоустойчивости, 2) выявить накопление низкомолекулярных БТШ в суммарной, митохондриальной и цитоплазматической клеточных фракциях в условиях теплового шока; 3) изучить локализацию и прочность связывания низкомолекулярных БТШ в митохондриях злаков, отличающихся по термоустойчивости, 4) выявить индукцию низкомолекулярных БТШ в проростках кукурузы под действием водного дефицита, 5) определить выживаемость и оводненность тканей

проростков кукурузы в условиях водного дефицита, 6) исследовать влияние дефицита влаги на дыхательную и энергетическую активность изолированных митохондрий из проростков кукурузы.

Защищаемые положения.

1. В период действия высокой температуры и водного дефицита в растительных клетках накапливаются низкомолекулярные Б1Ш, которые предположительно оказывают защитное действие на белки митохондрий, функционально связанные с дыханием

2 Под действием высокой температуры в митохондриях кукурузы накапливаются низкомолекулярные БТШ с массами 28,23,22,20 и 19 кД, а в митохондриях пшеницы и ржи обнаружен низкомолекулярный БТШ с массой 20 кД.

3 НмБТШ кукурузных митохондрий с массами 28 и 23 кД находятся внутри органелл и слабо связаны с внутренней мембраной, а нмБТШ с массами 22, 20 и 19 кД локализованы снаружи митохондрий и прочно связаны с интегральными белками наружной мембраны. Низкомолекулярные БТШ пшеницы и ржи с массой 20 кД локализованы как внутри, так и снаружи митохондрий.

Научная новизна. Методом иммунохимии были обнаружены ранее неизвестные митохондриальные нмБТШ у кукурузы, были определены отличия в их локализации и прочности связывания с митохондриями Впервые были выявлены цитоплазматические и митохондриальные нмБТШ у ржи Была показана возможность связи между термоустойчивостью дыхательной активности митохондрий, полиморфизмом митохондриальных нмБТШ и термоустойчивостью исследованных видов злаковых растений У кукурузы впервые были выявлены нмБТШ, синтезирующиеся в ответ на водный дефицит.

Теоретическая и практическая значимость работы. В настоящей работе рассматриваются индукция и накопление нмБТШ в ответ на действие двух стрессов: повышенной температуры или водного дефицита Описывается действие этих стрессоров на процессы окислительного фосфорилирования, протекающие в митохондриях, и на накопление в этих органелл ах нмБТШ.

Впервые показана возможность существования связи между термоустойчивостью вида, термоустойчивостью дыхания и полиморфизмом низкомолекулярных стрессовых белков в митохондриях. Установленная закономерность, при условии дальнейшей разработки этой проблемы, может иметь значение для селекционных работ. Впервые обнаруженное у кукурузы накопление стрессовых белков в ответ на водный дефицит может послужить отправной точкой для дальнейшей разработки ранее неисследованного вопроса накопления низкомолекулярных стрессовых белков злаков в условиях водного дефицита.

Публикации и апробация работы. По материалам диссертации опубликовано 12 работ, в том числе две статьи, опубликованные в рецензируемых журналах Результаты исследований были доложены и обсуждены на международной конференции ХУШ International conference on maize and sorghum genetics and breeding at the end of the 20ft century (Belgrade, Yugoslavia, 2000); Международном симпозиуме "Plant under environmental stress" (Москва, 2001 г ), на VII молодежной конференции ботаников (Санкт-Петербург, 2000 г.); IV съезде общества физиологов растений России и Международной конференции "Физиология растений - наука Ш тысячелетия" (Москва, 1999 г.); V съезде общества физиологов растений России и Международной конференции "Физиология растений - основа фигобиотехнологии" (Пенза, 2003 г), на Всероссийской научной конференции "Структура и экспрессия мигоховдриального генома растений (Иркутск, 2006 г.), на научных сессиях Сибирского института физиологии и биохимии растений.

Структура и объем работы. Диссертация изложена на 153 страницах машинописного текста, содержит 7 рисунков, 5 таблиц и 1 диаграмму, состоит из введения, обзора литературы, методической части, экспериментальной части, заключения, выводов и библиографии. Библиография включает 246 наименований, из них 49 на русском языке

Благодарности. Автор выражает свою искреннюю благодарность А И Антипиной за помощь в проведении всей работы по получению изолированных митохондрий, д-ру Craig A Downs (Университет Чарльстона, США) за предоставленные антитела, а также всему коллективу лаборатории физиологической генетики за помощь и отзывчивое отношение.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В работе использовали этиолированные проростки В качестве термоустойчивого вида была выбрана кукуруза (Zea mays L, сорт Российская 1), в качестве менее термоустойчивых-озимая пшеница (Triticum aesttvum L, сорт Иркутская) и озимая рожь (Secale cereale L, сорт Чулпан) (Коровин, 1984). Семена проращивали при 27°С или 20°С в течение 4 или 5 суток (кукуруза), или при 23°С или 20°С в течение 4 суток (пшеница и рожь) Температуры проращивания были подобраны так, чтобы проростки разных видов к началу эксперимента соответствовали друг другу по росту и этапу развития Температурную обработку проводили со срезанными проростками в воде, нагретой до 42°С, в течение 3 часов Для создания водного дефицита кукурузные проростки оставляли без полива при 27°С на 24, 48 или 72 часа или срезанные проростки погружали в растворы полиэтиленгликоля (химически нейтрального, не проникающего в клетки) осмолярностъю 300, 500 или 700 мОсм/л на 3 часа при 27°С

Выживаемость оценивали как процент проростков, возобновивших рост через трое суток после окончания действия стрессора Для оценки оводненности ростки высушивали до постоянного веса в термостате при 80°С

и вычисляли процент снижения веса к сырому весу побегов Суммарный клеточный и митохондриальный белок выделяли стандартным способом (Ступникова и др, 1998) из термически обработанных, подсушенных или контрольных проростков или изолированных очищенных митохондрий Митохондрии выделяли методом дифференциального центрифугирования по описанной ранее методике (Войннков и др, 1991) при 0-2°С и очищали в ступенчатом градиенте (Douce, 1985), состоящем из 3, 14 и 8 мл 18, 23 и 35% перколла, соответственно Очищенные митохондрии подвергали обработке проназой Е (1 мг/мл, "Serva", Германия) в течение одного часа при 37°С, растворами Triton Х-100 1% ("Merck", Германия), ионного детергента додецилсульфата натрия (1 %) или 0,1 M Tns-HCl буфера фН 7 6), в течение 1 часа при 0°С (тритон и буфер) зли 100°С (ДДС-Na)

Энергетическую активность митохондрий определяли по поглощению кислорода и регистрировали полярографически (дояярограф ОН 105, Венгрия) при 25°С с помощью платинового электрода закрытого типа (электрод Кларка) в ячейке объемом 1,4 мл На основе полярограмм рассчитывали основные параметры окисления и фосфорилирования в митохондриях скорость фосфорилирующего дыхания (состояние 3), скорость нефосфорилирующего дыхания (состояние 4), дыхательный контроль по Чаясу-Вильямсу - V3/V4 (ДК) и отношение АДФ/О - отношение фоефорншрованного АДФ к количеству утилизированного при этом кислорода (Estabrook, 1967) В качестве субстратов дыхания использовали субстрат I комплекса дыхательной цепи малат (ЮмМ) в присутствии глутамата (10 мМ) или субстрат П комплекса сукцинат (8 мМ) в присутствии глутамата (5 мМ) и ротенона (3 мМ)

Электрофорез белков проводили в блоках подиахриламидного геля (ПААГ) с ДДС-Na в модифицированной системе U Laemmli (1970), в приборе rami - Protean ("Bio - Rad", США) до прилагаемой инструкции Концентрацию белка в каждом кармане выравнивали, для этого ее определяли по методу A Esen (1978) Иммуяодетекцию нмБТШ проводили по методике Т Timmons и В Dunbar (1990) с асподьзованием поликлональных антител широкой специфичности (среди разных видов растений и классов нмБТШ), выработанных против характерного для всех изученных нмБТШ растений консервативного а-кристаллинового домена (разведение 1 500) (Heckathorn et al, 1998, Downs et al, 1998) Антитела были любезно предоставлены д-ром Craig A. Downs (США, Университет Чарльстона). Вторичные антитела, конъюгкрованные с щелочной фосфахазой ("Sigma", США) использовали для визуализации первичных антител в системе BCIP/NBT Молекулярные массы полипептидов определяли, используя в качестве стандартов наборы белков ("Sigma", США)

Были рассчитаны средние арифметические, стандартное отклонение и доверительный интервал Все эксперименты проводились в 3-5 биологических повторностях.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Влияние термической обработки проростков кукурузы, пшеницы и ; ржи на дыхательную активность изолированных митохондрий.

У митохондрий всех трех видов из подвергнутых тепловому шоку (42°С, 3 ч) проростков скорость фосфоршшрующего (состояние 3) и нефосфорилирующего (состояние 4) дыхания была значительно ниже контрольной По-видимому, это говорит о повреждениях, полученных органеллами, которые могут касаться растворимых ферментов митохондрий, мембран или мембранносвязанных комплексов электронтранспортной цепи, в первую очередь, наиболее уязвимого из всех I комплекса дыхательной цепи (Мтакаю1 et а1, 1963, '^ап ее а1, 1962, Побежимова, 1997)

Митохондрии кукурузы после теплового шока демонстрировали более высокую скорость дыхания, чем митохондрии пшеницы и ржи (таб 1)

Таблица 1 Влияние теплового шока на скорость дыхания митохондрий кукурузы, пшеницы и ржи Субстрат дыхания—малат в присутствии глутамата

Варианты опыта Скорость поглощения кислорода, нмоль 02 мин1 мг1 белка

состояние 3 состояние 4

Кукуруза контроль 86,6±3,9 29,3±1,4

шок 53,5±1,5 20,4±1,2

Пшеница контроль 81,1±2,3 35,4±1,8

шок 29,9±2,0 14,3±0,8

Рожь контроль 82,9±1,1 37,8±1,1

шок 29,2±3,2 14,9±1,1

Примечание Проростки кукурузы, выращенные при 2 7° С, и проростки пшеницы и ржи, выращенные при 23°С, подвергали тепловому шоку при 42°С в течение 3 часов, как описано в методах, а затем использовали для выделения митохондрий Контрольные митохондрии выделяли из проростков, обработанных тем же способом при температуре выращивания Приведены средние арифметические 3-х биологических повторностей и их доверительные интервалы (М ± от, п =3)

Скорость фосфоршшрующего дыхания митохондрий кукурузы после теплового шока снизилась на 38 %, тогда как у митохондрий пшеницы и ржи это снижение равнялось 63 и 65 % соответственно Нефосфорилирующее дыхание у митохондрий кукурузы снизилось на 30 %, у пшеницы на 60 %, а у ржи - на 61 % (таб 1) Таким образом, кукурузные митохондрии, судя по

интенсивности дыхания, обладают большей термоустойчивостью, чем митохондрии пшеницы и ржи Такой результат совпадает с представлением о кукурузе как о более жаростойкой культуре, чем пшеница и рожь (Коротаева и др, 2001)

Возможной причиной большей устойчивости митохондрий кукурузы можно считать тепловую закалку, которую получили кукурузные побеги во время выращивания (семена кукурузы проращивали при 27°С, а семена пшеницы и ржи - при 23°С) Для того чтобы проверить это, семена кукурузы выращивали при температуре 20 или 27°С Срезанные проростки подвергали тепловому шоку, как в предыдущем эксперименте, а затем определяли основные дыхательные параметры у изолированных митохондрий (таб 2)

Таблица 2. Влияние температуры выращивания на скорость дыхания изолированных митохондрий кукурузы Субстрат дыхания — манат в присутствии глутамата

Температура проращивания, °С Скорость поглощения кислорода, нмоль 02 мин1 мг1 белка

состояние 3 состояние 4

20 контроль 24,2 ± 4,8 7,2 ± 1,5

шок 11,1 ±2,5 4 ±1,3

% падения дыхания 54,1 44,9

27 контроль 24 ± 0,7 7 ±0,7

шок 11,7 ±2,1 3,6 ± 1,9

% падения дыхания 51,4 48,2

Примечание Для выделения митохондрий использовали проростки кукурузы, выращенные при 20 или 27°С и термически обработанные (см подпись к таб 1) Процент падения дыхания показывает, на сколько процентов по сравнению с контролем снизилась скорость дыхания Приведены средние арифметические 3-4-х биологических повторностей и их доверительные интервалы (М ±т, п =3-4)

Изменение дыхания после действия гипертермии по сравнению с контролем, выраженное в абсолютных значениях и в процентах (процент падения дыхания), незначительно отличалось у митохондрий из проростков, выращенных при разных температурах

Эти данные позволяют сделать вывод, что температуры 20 и 27°С, использованные для выращивания проростков кукурузы, не оказывали заметного влияния на дыхательную активность изолированных из проростков

митохондрий. Следовательно, это указывает на изначально большую термоустойчивость митохондрий более жаростойког о вида,

2. Накопление нмБ'ГШ во фракциях клеточного белка из проростков кукурузы, пшеницы п ржи, подвергнутых гипертермии.

2.1. Влияние температуры выращивания и последующей термической обработки на накопление нмБТШ в проростках кукурузы, пшеницы и ржи.

Иммуноблоттинг с суммарным клеточным белком показал, что незначительное количество нмБТШ присутствовало в клетках проростков уже в контроле, т.е. при 23°С (пшеница и рожь) и 27ЧС (кукуруза) (рис. 1),

28 кД 23 кД 22-19 кД

Рисунок 1, Накопление низкомолекулярных белкое теплового шока (нмБТШ) в проростках кукурузы, пшеницы и ржи.

Проростки кукурузы, выращенные при 27°С. и проростки пшеницы и ржи. выращенные при 23°С, дел ¡¿ли на две группы. Первую обрабатывали температурами 27 (кукуруза) и 23"С (пшеница и рожь) (коитролъ-к), вторую подвергали действию теплового шока (42°С, 3 ч.: шок-ш). Суммарный белок фракционировали в 14%-ном ПААГ с ДЦС-\'а. НмБТШ выявляли, используя антитела против а-кристал.пшового домена (разведение 1:500). Напротив стрелок указаны молекулярные массы нмБТЩ,

Небольшое количество стрессовых белков накапливалось в тканях кукурузы, несколько больше - у пшеницы и ржи. НмБТШ экспресс и руются в оптимальных условиях на некоторых этапах онтогенеза растения, например, в созреваюших и зрелых зародышах (\УеЬтеуег, У[ег!шо, 2000). Однако в приведенном опыте причиной появления нмБТШ в "контрольных" условиях могла явиться температура проращивания побегов, которая оказалась достаточной для индукции синтеза нмБТШ,

Дня того чтобы убедиться, что именно повышенная температура прорастания стала индуктором экспрессии нмБТШ, и они не накапливаются в клетках конститутивно, проростки пшеницы и ржи были выращены при температуре 20°С (рис. 2). На иммудаграмме видно, что при более низких температурах проращивания семян пшеницы и ржи нмБТШ в спектре суммарного клеточного белка отсутствовали. Вероятно, температура прорастания 23°С превышает температурный оптимум роста побегов пшеницы и ржи, уже в этой температурной зоне начинаются адаптивные изменения. Это совпадает с представлением о низком температурном

кукуруза к ш

пшеница К Ш

рожь к ш

20 кД

оптимуме прорастания этих культур (Коровин, 1984; Реймерс, Илли, 1978). Другим объяснением могут быть особенности генотипов взятых сортов.

20 кД

Рисунок 2. Накопление нмБТШ под действием теплового тока в проростках пшеницы и ржи при разной температуре проращивания.

а-проращиванце при 20°С: б-прораишвание при 23"С. Контроль (к/ -проростки, обработанные температурами 20°С и 23°С. ТЩ-тепловой шок. Условия термической обработки, электрофореза и иммуноблоттинга как в подписи к рис. /. Напротив стрелки указана молекулярная масса иизкомслекулярного стрессового белка.

пшеница к Т Ш

рожь к ТШ

пшеница

к тш

рожь к ТШ

2.2. Накопление нмБТШ в митохондриях кукурузы, пшеницы и ржи, из проростков, обработанных высокой температурой.

Возникает вопрос, происходит ли ассоциация нмБТШ с митохондриями при температуре роста 23 и 27°С, и какие из обнаруженных стрессовых белков накапливаются в митохондриях в условиях теплового шока. Низкомолекулярныё БТШ. гомологичные а-кристаллииам, были обнаружены в митохондриях, выделенных из подвергнутых воздействию высокой температурой проростков (42°С, 3 ч.) у всех трех видов (рис.3).

а о в

сум мл СУМ МХ СУМ мл сум мх сум мх

28 кД_^ __

23 кД__ 22-19 кД—¿Ш ^

Рисунок 3. Накопление нмБТШ в митохочдриальной и суммарной фракции меточного белка из проростков кукурузы, пшеницы к ржи под действием теплового шока и в контроле.

а-суммарные и митохондриальные белки кукурузы из контрольных и стрессированных проростков: б-белки пшеницы и ржи из контрольных проростков: в-белки пшеницы и ржи из стрессированных проростков. Проростки кукурузы, пшеницы и ржи использовали для экстракции суммарного белка и выделения митохондрий. Условия выращивания, обработки, электрофореза и иммуноблоттинга как в подписи к рис. /. К-контроль: ТШ-тепловой шок: сум-су ммарный белок: мх-митохондриальный белок. Напротив стрелок указаны молекулярные массы нмБТШ.

V кукурузы было обнаружено пять белков с мол. массами 28. 23, 22, 20 и 19 кД. а у пшеницы и ржи по одному белку с молекулярной массой 20 кД.

В условиях выращивания проростков при контрольной температуре накопления нмБТШ в митохондриях не наблюдалось (рис 3) Следовательно, нмБТШ пшеницы и ржи 20 кД и кукурузы 22, 20 и 19 кД появляются в клетке при незначительном превышении температурой роста границ температурного оптимума, но не ассоциируют с митохондриями (Korotaeva et al, 2001)

Появление в митохондриях кукурузы при тепловом стрессе пяти нмБТШ оказалось достаточно неожиданным результатом, поскольку согласно данным A Lund с соавторами (1998) в митохондриях кукурузы при ТШ (42°С, 3 ч ) появлялось два низкомолекулярных белка 22 и 30 кД Причем, БТШ 30 присутствовал в митохондриях кукурузы в меньшем количестве, чем БТШ 22 Авторы предположили, что БТШ 30 является белком-предшественником БТШ 22 Мы полагаем, что сходство молекулярных масс указывает на то, что найденные нами БТШ 28 и БТШ 23 являются аналогами нмБТШ, обнаруженных A Lund с соавторами Однако никаких других стрессовых белков, появляющихся в митохондриях кукурузы при ТШ, этими авторами обнаружено не было, тогда как нам удалось идентифицировать еще три белка с молекулярными массами 22, 20 и 19 кД

По нашему мнению, полученные нами данные о пяти белках, локализованных в митохондриях, не противоречат результатам A Lund с соавторами (1989), поскольку для проращивания кукурузы они использовали температуру 29°С, тогда как уже при 27°С нмБТШ, родственные а-кристаллинам, появляются в спектре суммарного кукурузного белка (рис 1) При 29°С часть этих нмБТШ уже может ассоциировать с митохондриями В этом случае при сравнении электрофореграмм контрольных и стрессовых белков не все белки выглядят новосинтезированными, то есть стрессовыми белками Другой возможной причиной расхождения результатов могут быть особенности генотипов использованной кукурузы

С помощью радиоактивных изотопов в митохондриях сои при ТШ (42°С, 30 мин после 38°С, 3 ч ) были обнаружены нмБТШ с молекулярными массами 27, 24, 22 и 15 - 18 кД (Chou et al, 1989) Было показано, что в условиях ТШ (41°С, 3 ч ) с митохондриями кукурузы ассоциирует четыре нмБТШ 25, 22, 20 и 18 кД, выделенных с экстрактом общего клеточного белка из стрессированных проростков (41°С, 3 ч) (Войников и др, 1991, Боровский, Войников, 1993) Эти данные подтверждают наши результаты о появлении при тепловом стрессе в митохондриях кукурузы более чем двух нмБТШ

Сведения о митохондриальном нмБТШ 20 кД у ржи, насколько нам известно, получены впервые (Korotaeva et al, 2001)

2.3 Присутствие нмБТШ в различных клеточных фракциях из проростков злаков, подвергнутых тепловому шоку.

Возникает вопрос, встречаются ли выявленные нмБТШ кукурузы, пшеницы и ржи только в митохондриях или они присутствуют также и в других компартментах клетки Для получения ответа на этот вопрос было

проведено сравнение содержания имБТШ в трех фракциях клеточного белка: м ито хо н др и ал ь но й, "цитогшазматической" и суммарной (рис. 4).

28 кД 23 кД-22-19 кД-

кукуруза пшеница рожь

сум МХ цит сум МХ цит сум МХ цит

.20 кД

Рисунок 4. Распределение в меточных фракциях нмБТШ из стреесированных высокой температурой проростков кукурузы, пшеницы и ржи.

Проростки кукурузы, пшеницы и ржи выращивали и обрабатывали, как описано в подписи к рис. 1. Из проростков получали суммарный (сум) и Митахондриальный (МХ) белок, как описано в методах. Цитоплазматический белок (цит) осаждали из супернатанта, оставшегося после осаждения компонентов клеточной стенки, ядер и митохондрий. Условия электрофореза и иммуноблоттинга как в подписи к рис. 1. Напротив стрелок указаны молекулярные МПГР Ы I' 7 ! I /

НмБТШ кукурузы 28 и 23 кД были обнаружены только среди белков суммарной клеточной и митохондриальной фракций и отсутствовали в "цитоплазматической". ''Цитоплазматическая " фракция состояла нз белков, оставшихся в срезе а г, ¡делен ля после изолирован^ из нее компонентов клеточной стенки, ядер и митохондрий. Белки 22. 20 и 19 кД присутствовали во всех трех фракциях. Таким образом, только белки 28 и 23 кД можно считать уникальными для митохондрий. У пшеницы и ржи низкомолекулярные БТШ с массой 20 кД были найдены во всех трех фракциях. Приведенные данные позволяют сделать вывод, что у кукурузы имеются два "уникальных" для митохондрий нмБТШ - 23 и 28 кД (Кого(аеуа ее а!., 2001).

3. Локализация и прочность связывания с мембранами митохонлриальных нмБТШ кукурузы.

Дтя того чтобы охарактеризовать нмБТШ, была поставлена задача определить места локализации этих стрессовых белков в митохондриях. Для этого изолированные митохондрии кукурузы, пшеницы и ржи были обработаны протеолитическим ферментом проназой Е (рис. 5). После обработки ферментом из спектра нмБТШ исчезли три белка - 22, 20 и 19 кД. два нмБТШ (28 и 23 кД) выявлялись антителами. Интенсивность окраски пятна, соответствующего белку 28 кД, становилась слабее, что говорит о его частичной доступности для фермента. Митохондриальные стрессовые белки пшеницы и ржи 20 кД после обработки органелл проназой выявлялись антителами, что свидетельствует об их в нутримитохо ндриально й локализации. Интенсивность окраски пятна, соответствующего нмБТШ ржи

заметно слабеет в образце, обработанном ферментом, таким образом, этот белок также частично доступен для проназы.

кукуруза пшеница рожь

MX MX- MX МХ+ проназа про н аз а

__________20 кД

Рисунок 5. Локализация нмБТШ внутри и снаружи митохондрий из стрессированных высокой температурой проростков кукурузы, пшеницы и ржи.

Часть митохондрий из стрессированнь1х проростков использовали для экстракции общего митохондриалъного белка, остальные в течение часа инкубировали в растворе проназы Е (1 мг/мя), после чего из этой фракции также осаждали белок, мх-митохондрии без обработки ферментом. Условия проращивания, температурной обработки, электрофореза и иммуноблоттинга как в подписи к рис. 1. Стрелки указывают на нмБТШ соответствующей молекулярной массы.

В соответствии с данными других авторов о стабилизирующем действии низкомолекулярных стрессовых белков на другие полипептиды в условиях повышенной температуры (Боровский, Войников, 1993; Chou et al., 1989; Jinn et al., 1989) можно предположить, что нмБТШ 22-19 кД. вероятно, прочно связываются с частично денатурировавшими белками наружной мембраны митохондрий, стабилизируя их, причем эта связь временная и зависит от конформационного состояния белков митохондрий.

Прочность связывания стрессовых белков с мембранами также может быть связана с их функциями. Чтобы определить прочность связи нмБТШ с мембранами, изолированные митохондрии кукурузы обрабатывали растворами различных по силе детергентов (рис.6). Электрофорез с последующим иммуноблоттингом показал, что ДДС-Na элюирует из органелл все выявленные в митохондриях низкомолекулярные стрессовые белки, включая ''наружные" белки. Значительное количество ''внутреннего" нмБТШ 23 кД переходит в раствор после замораживания-оттаивания в Tris-HCI-буфере и в присутствии Triton Х-100. Частично доступный для проназы ! нмБТШ 28 практически не извлекается при разрушении митохондрий в присутствии буфера, но его количество в растворе значительно увеличивалось после разрушения в присутствии Trition-X-100. Ни Triton, ни Tris-HCI-буфер не способствовали элюции группы "наружных'" нмБТШ 22, 20 и 19 к Д.

мх мх-

проназа

28 кД, 23 кД, 22-19 кД'

28 23 22 -20 19

Рисунок 6. Прочность связывания нмБТШ С митохЩдриями кукурузы.

Очищенные митохондрии из етрессированнцах высокой температурой проростков кукурузы после разрушения трехкратным замораживанием-оттаиванием инкубировали с 0,1 М Tris-HCt - буфером. pH 7.6 (0°С, 30 мин.), 1 %-ным раствором Trition Х-100 (0°С, 30 мин.) или с электрофоретическим оуфером для образца {1% ДДС-Na: 100°С. 5 мин.). После центрифугирования (15000 об/мин, 10 мин.) надосадочную жидкость использовали для электрофореза и последующего иммукоблоттинга. Условия выращивания, обработки проростков, электрофореза и иммуноб.чоттинга как в подписи к рис. 1. Напротив стрелок указаны молехл'лярные массы нмБТШ.

Наши данные косвенно подтверждают предположение A. Lund с соавторами (1998) о том, что больший по массе стрессовый митохондриальный белок является предшественником меньшего белка. Этот больший по массе белок частично доступен для проназы, при этом он не снимается буфером, но элюируется неионным детергентом. По нашему мнению, это может говорить о том, что БТШ 28 был "застигнут" в митохондриях в момент его транспорта через наружную митохондриальную мембрану. Большая масса это следствие прикрепленного к нему аминокислотного участка, необходимого для прохождения через мембрану. Судя по рис. 6. «наружные» белки 22, 20 и 19 кД. которые не удается спять с мембраны неионным детергентом, гидрофобны, прочно связаны с интегральными белками наружной мембраны митохондрий (Helenius, Simons, J 975).

4, Действие водного дефицита и обработки осмотиком на накопление нмБТШ в проростках кукурузы.

По мере усиления водного дефицита как после прекращения полива, так и после инкубирования в растворах ПЭГ, б проростках кукурузы накапливаются нмБТШ с молекулярной массой 28, 22 и 19 кД (рис. 7). Из рисунка 7 видно, что интенсивность окрашивания полос нмБТШ усиливается по мере увеличения продолжительности и интенсивности подсушивания.

ДДС- Tris- Tnton-Na HCl Х-100

подсушивание, ч. ПЭГ. мОсм'ш К 24 48 72 700 500 300

Рисунок 7. Действие водного дефицита на содержание воды и накопление нмБТШ в проростках кукурузы.

Проростки кукурузы оставляли без полива на 24, 48 и 72 к. tun срезали и в течение 3 часов инкубировали в растворах ПЭГ осмолярностью 300. 500 и 700 мОсмя. Контроль (к) - проростки, росшие в условиях нормального увлажнения. Условия проращивания, электрофореза и иммуноблоттинга как в подписи к рис. I. Напротив стрелок указаны молекулярные массы нмБТШ.

Действительно, после суток действия водного дефицита у проростков, оставленных без полива оводненность составляла 87,5% от контроля (оводненность контрольных проростков - 90,5%), через двое суток - 82,7%. Через трое суток содержание воды составляло 78.2%. что на 14.6% меньше по сравнению с контрольным значением, В случае действия на проростки осмотиком оводненность составляла 89,1% (300 мОсм/л), 88,1% (500 мОсм/л) и 86,6% (700 мОсм/л) от контроля. После инкубирования проростков в растворах ПЭГ с осмолярностью 500 и 700 мОсм/л и после суток подсушивания оводненность была почти одинаковой, а в случае инкубирования с раствором ПЭГ 300 мОсм/л была близка к контрольному значению, однако накопление нмБТШ при этом было различным. Разница в накоплении нмБТШ в этих условиях объясняется неодинаковой интенсивностью воздействия: под действием осмотика обезвоживание развивалось гораздо быстрее, чем при медленном подсушивании проростков в термостате, что приводило к более выраженному накоплению нмБТШ.

Инкубирование проростков с раствором ПЭГ 700 мОсм/л приводило к меньшей потере влаги по сравнению с 3-суточным водным дефицитом и соответствовало меньшей экспрессии стрессовых белков. Такие различия в экспрессии могут быть связаны с различной интенсивностью стрессового сигнала. Видимо, в этом случае величина обезвоживания была более сильным сигналом к накоплению нмБТШ, чем интенсивность воздействия.

Данные иммуноблоттинга свидетельствуют о важности присутствия нмБТШ в клетке для адаптации к водному дефициту или зашиты от него, и согласуются с данными о том, что экспрессия нмБТШ является одним из необходимых ответов растительных клеток в период обезвоживания.

Следует отметить большую интенсивность полосы белка 22 кД, по сравнению с белком 19 кД при инкубировании в растворах ПЭГ 500 и 700 мОсм/л. Накопление нмБТШ 22 кД также является более "ранним" явлением, чем накопление нмБТШ 19 кД (уже при 2%-ной потере влаги после

28 Кд

22 Кд 19 Кд

инкубирования в растворе ПЭГ 500 мОсм/л) Судя по молекулярной массе, обнаруженный белок, скорее всего, может быть локализован в митохондриях, хлоропластах или в ЭПР, поскольку только там были обнаружены нмБТШ с такой же или близкой молекулярной массой (Waters et al, 1995, Waters et al, 1996, Lund et al, 1998) Накопление стрессового белка БТП122 кД при потере влаги, соответствующей адаптационному воздействию, говорит о его важной роли в условиях водного дефицита На основании данных других авторов (Taylor et al, 2005) и экспериментов, ранее проведенных в этой работе, можно предположить, что стрессовый белок 22 кД в условиях водного дефицита присутствует в митохондриях для защиты митохондриальных белков от обезвоживания, а также играет важную сигнальную роль в экспрессии стрессовых белков Этим может быть обусловлена необходимость в его ранней экспрессии

Данные о различном количественном накоплении низкомолекулярных стрессовых белков 22 и 19 кД в ответ на подсушивание и о различиях в экспрессии нмБТШ в условиях теплового шока и водного дефицита позволяет сделать предположение о существовании дифференциальной экспрессии генов этих белков

5. Выживаемость проростков кукурузы после воздействия водным дефицитом.

Тест на выживаемость показал, что после суточного и 2-х суточного водного дефицита практически все проростки были способны к восстановлению роста Выживаемость составляла через 24 и 48 часов стресса соответственно 98,7 и 96 % от общего числа тестируемых проростков После 3-х суток водного дефицита выживаемость резко уменьшилась до 57,3 %

Судя по выживаемости, стрессовое воздействие через трое суток после начала засухи было гораздо сильнее (выживаемость - 57,3 %), чем на 1-е и 2-е сутки (выживаемость - 98,7 и 96 % соответственно) По наблюдениям за отрастанием проростков после 3-суточного водного дефицита, возобновление роста у них так и не наступило даже через пять суток после начала полива, что говорит о полученных ими глубоких повреждениях Таким образом, водный дефицит, который испытывали проростки на протяжении 24 и 48 часов (оводненность соответственно 87,5 и 82,7%), можно считать слабым или умеренным, не выходящим за пределы зоны адаптации Водный дефицит, наступивший через трое суток отсутствия полива (оводненность тканей 78,2%), можно считать сильным, соответствующим зоне повреждения Следовательно, накопление стрессовых белков 22 и 19 кД в тканях кукурузных проростков в небольшой степени происходит под действием слабого, адаптационного водного дефицита и резко усиливается, когда водный дефицит приобретает силу повреждающего воздействия (рис 7)

6. Дыхательная активность митохондрий, выделенных из подвергнутых водному дефициту проростков кукурузы.

По мере снижения оводненности проростков происходило постепенное уменьшение скорости потребления кислорода изолированными митохондриями (таб 4, 5) Причем даже незначительное обезвоживание сказывалось на интенсивности дыхания Это касалось как фосфорилирующего (состояние 3), так и нефосфорилирующего дыхания (состояние 4) Так, при использовании субстратов I комплекса дыхательной цепи 24-часовой водный дефицит (3%-ная потеря воды тканями проростков) снижал скорость поглощения кислорода почти на 30%, при продолжительности 48 часов (снижение оводненности на 8%) понижение составило свыше 50%, после трех суток водного дефицита (потеря воды 14%) - более 70% от контроля Значения ДК и АДФ О изменялись не столь существенно, что говорит о сохранении сопряжения процессов окисления и фосфорилирования (таб 4)

Таблица 4 Основные параметры малат-зависимого дыхания (I комплекс) у изолированных митохондрий из проростков кукурузы, подвергнутых водному дефициту различной продолжительности

Варианты опыта Поглощение кислорода, нмоль 02 мин-1 мг-1 белка ДК АДФ О

Состояние 3 Состояние 4

I 37,7 ± 5,5 13,1 ±2,1 2,9 ± 0,3 3±0,1

П 23,9 ± 3,2 9,3 ± 1,8 2,7 ± 0,2 3,1 ±0,1

Ш 16,8 ±2,5 8,04 ± 1,8 2,2 ± 0,2 2,9 ± 0,2

IV 11,2 ±2,5 5,3 ± 0,6 2,2 ± 0,2 2,8 ± 0,4

Примечание Проростки кукурузы оставляли без полива на разные сроки или в условиях нормального увлажнения I — контроль (увлажнение), водный дефицит II — 24 ч, III — 48 ч, IV — 72 ч Субстрат дыхания — малат в присутствии глутамата (I комплекс дыхательной цепи) Приведены средние арифметические из 3-5-ти биологических повторностей и их доверительные интервалы (М ± т, п=3-5) Одна биологическая повторностъ соответствует одному выделению митохондрий На каждое выделение проводили 9-12 измерений

Таким образом, скорость дыхания митохондрий, изолированных из обезвоженных проростков, была подавлена по сравнению со скоростью дыхания контрольных митохондрий Степень подавления активности дыхания зависела от степени обезвоживания проростков Причем на интенсивности дыхания сказывалось даже незначительное обезвоживание По-видимому, наблюдаемое через трое суток воздействия подавление дыхания говорит о значительных повреждениях, полученных митохондриями при

17

действии на проростки водного дефицита Как известно, пониженное количество воды в клетках сказывается на состоянии липидов (Taylor et al, 2002), составе и состоянии мембран (Valentovic et al, 2006) и белковых молекул (Xiong, Zhu, 2002) В пользу этого свидетельствует и низкая выживаемость проростков через 72 часа стресса

Одновременно с низкой интенсивностью дыхания достаточно высокой оставалась сопряженность процессов окисления и фосфорилирования и при небольшой, и при значительной потере влаги кукурузными проростками Похожие результаты были получены D Bell с соавторами (1971) Эти результаты противоречат постулату о разобщении процессов окисления и фосфорилирования у неустойчивых растений на этапе усиления дыхания Возможно, расхождения могли быть связаны с выбором объекта исследования, этапом онтогенеза или процедурой выделения митохондрий Если же нет, то сохранение высокой сопряженности дыхания на этапе глубокого обезвоживания говорит в пользу необходимости высокой эффективности дыхания и интенсивного синтеза АТФ в этих условиях и в какой-то степени компенсирует низкую дыхательную активность

Динамика снижения дыхательной активности изолированных митохондрий отличалась при добавлении субстратов I и II комплексов дыхательной цепи (таб 4, 5) Так, поглощение кислорода митохондриями

Таблица 5 Основные параметры сущинат-зависимого дыхания (II комплекс) у изолированных митохондрий из проростков кукурузы, подвергнутых водному дефициту различной продолжительности

Варианты Поглощение кислорода, нмоль 02 мин-1 мг-1 белка ДК АДФ/О

опыта состояние 3 состояние 4

I 47,04 ± 3,9 29,2 ±6,8 1,7 ±0,3 1,6 ±0,3

II 42,3 ±3,2 27,6 ± 0,5 1,4 ±0,2 1,6 ±0,1

IV 14,5 ± 6,2 11,5 ±2,6 1,2 ±0,3 1,6 ±0,3

Примечание Обработка и обозначения как в подписи к таблице 4 Субстрат дыхания — сукцинат в присутствии глутамата и ротенона (II комплекс дыхательной цепи) Приведены средние арифметические из 3-х биологических повторностей и их доверительные интервалы (М ± т, п=3) Одна биологическая повторность соответствует одному выделению митохондрий На каждое выделение проводили 912 измерений

при фосфорилирующем дыхании с использованием малата (I комплекс, состояние 3) резко уменьшалось уже через сутки воздействия до 63,4% от контроля, а на 2-е и 3-й сутки стресса составляло 44,6 и 29,7% от контроля

соответственно Напротив, фосфорилирующее дыхание с использованием сукцината (П комплекс, состояние 3) через сутки неблагоприятного воздействия снижалось до 90%, проявив большую устойчивость к водному дефициту Однако после 3-х суток обезвоживания поглощение кислорода резко уменьшалось и составляло 30,9% от контрольного значения Сходным образом изменялся уровень поглощения кислорода и при нефосфорилирующем дыхании (состояние 4) (таблица 5) То, что сукцинат-зависимое дыхание (П комплекс) проявляет большую устойчивость к неблагоприятному воздействию по сравнению с дыханием с использованием мапата (I комплекс), согласуется с данными других авторов о большей устойчивости к стрессовым воздействиям сукцинат-зависимого дыхания, чем малат-зависм»юго (Побежимова, 1997) Полученные нами данные таким образом позволяют заключить что сут<тдш*ат-зависимое дыхание более устойчиво к слабому водном) цефишпу, чем дь.хание с использованием субстратов I комплекса (Коротагва и др, 2006) М.'звеиы-о протекторного действия эмБТШ, скорее всего, является I комплекс дыхательной цепи и малат-зависимсе дыхание» при этом на интенсивность дыхания с использованием субстратов Я комплекса они никак не влияют (Downs, Heckathom, 1998) '

Учитывая другие исследования, можно сказать, что наблюдаемое в результате неблагоприятных воздействий снижение скорости поглощения кислорода у двух дыхательных комплексов, возможно, имеет различные причины (Hamilton, Heckatliorn, 2001) К тому же при оценке устойчивости дыхания разными субстратами следует учитывать не только устойчивость самих комплексов, но и устойчивость других ферментов, необходимых для дыхания Для осуществления сукцинат-зависимо! о дыхания необходимы П, Ш и IV дыхательные комплексы В работе малат-зависимого дыхания помимо всех дыхательных комплексов задействованы все ферменты цикла Кребса, и их функциональная стабильность может сильно повлиять на скорость малаг-зависямого дыхания. Это еще раз указывает на необходимость стабилизации ферментов дыхания в стрессовых, условиях

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Большая устойчивость к тепловому шоку митохондрий кукурузы, чем митохондрий пшеницы и ржи, и разница в полиморфизме митохондриальных нмБТШ соответствует отличиям в термоустойчивости этих культур Это совпадает с современными представлениями о важной роли митохондриальных стрессовых белков в формировании термоустойчивости целого растения повышение термоустойчивости митохондрий засчет синтеза дополнительных стрессовых белков ведет к повышению устойчивости растительного организма (Sanmiya et al., 2004) Механизм такого влияния пока неясен Но было установлено, что индукция экспрессии генов многих стрессовых белков происходит после введения в геном гена мигохондриального стрессового белка в результате работы

системы митохондриальяой регуляции экспрессии стрессовых белков, причем ключевую роль в этой системе играет митохондриальный нмБТШ 22 кД (Rhoads et al., 2005)

Большая устойчивость к тепловому шоку митохондрий кукурузы и появление в них при стрессе большего набора нмБТШ позволяют предположить, что разнообразие набора нмБТШ играет значительную роль в обеспечении защиты от теплового стресса процессов дыхания, протекающих в митохондриях кукурузы Механизм такого влияния, по-видимому, связан с шапероновой функцией низкомолекулярных стрессовых белков митоховдрий по отношению к дыхательному комплексу I (Downs, Heckathorn, 1998) и другим полипептидам (Liu, Shono, 1999) Исходя го данных литературы и полученных результатов, можно предположил., что различные нмБТШ действуют на разные белки, либо распознают разные переходные состояния частично денатурированных белков. В таком случае митохондрии кукурузы обладают большим набором шаперонов и, соответственно, имеют больше возможностей защиты дыхательных ферментов и других важных структур митохондрий от повреждения

Функционирование митохондрий в период теплового стресса зависело от появления группы нмБТШ с молекулярными массами 18-15 кД, которая прикреплялась снаружи митохондрий, и не зависела от присутствия нмБТШ 23 и 27 кД, расположенных внутри органелл (Chou et al, 1989). На основании этих данных можно предполагать, что обнаруженные нами нмБТШ 22, 20 и 19 кД являются основными участниками защиты дыхательных ферментов от теплового повреждения в митохондриях кукурузы Функция белков, локализованных внутри митохондрий, остается невыясненной. Исходя из общих соображений, можно полагать, что они также принимают участие в качестве шаперонов в защите внутримитохондриальных структур от повреждений в период действия высокой температуры, а нмБТШ23, близкая по массе к нмБТШ22, также играет важную роль сигнальной молекулы (Rhoads et al., 2005).

Накопление нмБТШ в побегах кукурузы под действием водного дефицита связано со степенью обезвоживания и интенсивностью воздействия водного дефицита на проростки Кроме того, усиление действия водного дефицита индуцирует накопление дополнительного нмБТШ 19 кД Это говорит о важности присутствия нмБТШ в клетке для защиты от водного дефицита или адаптации к нему, и согласуется с данными о том, что экспрессия нмБТШ является одним из необходимых ответов растительных клеток в период обезвоживания Роль нмБТШ при этом, вероятно, связана с шапероновыми функциями

Водный дефицит влечет за собой нарастающее по мере усиления потери воды уменьшение интенсивности сукцинат- и малат- зависимого дыхания. Снижение интенсивности дыхания не соответствует потребностям клетки в энергии в условиях водного дефицита хотя в этих условиях обычно подавлен рост, обезвоживание сопровождается интенсивным

энергозависимым накоплением осмолвггов, защитных и стрессовых белков (Ramanjulu, Bartels, 2002; Nakashima, Yamaguchi-Shinozaki, 2006) Значения дыхательного контроля и АДФ О практически не изменяются, особенно в условиях слабого обезвоживания, что говорит о сохранении сопряженности процессов окисления и фосфорилирования. По-видимому, сохранение сопряженности дыхания на этапе глубокого обезвоживания говорит в пользу необходимости его высокой эффективности и интенсивного синтеза АТФ в этих условиях и в какой-то степени компенсирует низкую дыхательную активность.

К сожалению, в данной работе отсутствует прямое доказательство ассоциации нмБТШ с митохондриями в период засухи Такие доказательства были получены D. Taylor с соавторами (2004), которые показали накопление нмБТШ 22 кД в митохондриях из листьев растений гороха, подвергнутых обезвоживанию. Можно предположить, что все или некоторые из обнаруженных нами в проростках кукурузы нмБТШ 28, 22 и 19 кД при обезвоживании также связываются с митохондриями (Downs, Heckathom, 1998) Это предположение, конечно, не заменяет необходимости точной детекции нмБТШ в митохондриях в период действия водного дефицита

ВЫВОДЫ

1. Подавление дыхательной активности изолированных митохондрий тепловым шоком зависит от термоустойчивости вида Интенсивность дыхания митохондрий кукурузы (более термоустойчивый вид) снижается в меньшей степени, чем интенсивность дыхания пшеницы и ржи (менее термоустойчивые виды).

2. Под действием теплового шока в проростках кукурузы, пшеницы и ржи накапливаются низкомолекулярные БТШ с молекулярными массами 2819 кД

3. Под действием теплового шока в митохондриях кукурузы накапливается 5 низкомолекулярных БТШ с молекулярными массами 28, 23, 22, 20 и 19 кД Белки с массами 22, 20 и 19 кД расположены внутри митохондрий, а 28 и 23 кД - снаружи органелл В митохондриях пшеницы и ржи под действием теплового шока накапливаются низкомолекулярные стрессовые белки с массой 20 кД, расположенные снаружи и внутри органелл

4. "Наружные" низкомолекулярные БТШ кукурузы 22, 20 и 19 кД прочно связаны с мембранами митохондрий, "внутренние" низкомолекулярные БТШ 28 и 23 кД слабо связаны с мембранами митохондрий, либо являются белками матрикса

5. Под действием водного дефицита в проростках кукурузы накапливаются низкомолекулярные БТШ 19 и 22 кД. Накопление этих стрессовых белков усиливается по мере увеличения продолжительности и интенсивности воздействия.

6. Водный дефицит, который испытывают проростки, значительно подавляет скорость дыхания изолированных митохондрий, но почти не влияет на их энергетическую активность Снижение активности дыхания соответствует продолжительности стресса и степени обезвоживания проростков.

7. Сукцинат-зависимое дыхание (II комплекс дыхательной цепи) проявляет большую устойчивость к водному дефициту, чем малат-зависимое (I комплекс дыхательной цепи).

8. Вся совокупность полученных данных при сравнении с данными литературы позволяет предположить, что низкомолекулярные белки теплового шока в условиях теплового стресса и водного дефицита накапливаются в клетках растений и играют важную роль в повышении устойчивости процессов дыхания к неблагоприятным факторам внешней среды

Список работ, опубликованных по теме диссертации.

Коротаева (Лузянина), Н.Е. Связь термоустойчивости растений с динамикой синтеза низкомолекулярных белков теплового шока / НЕ Короваева (Лузянина), Г.Б. Боровский, В К Войников // Тезисы докладов IV съезда общества физиологов растений России и Международной конф «Физиология растений - наука Ш тысячелетия», 4-9 окт. 1999 г - Москва, 1999-С 408

Коротаева, Н Е. Суммарные и митохондриальные низкомолекулярные белки теплового шока кукурузы, пшеницы и ржи, иммунохимически родственные а-кристаллину / Н.Е Коротаева, А И Антипина, Г.Б Боровский, В.К. Войников // Тезисы докладов VII молодежной конференции ботаников в Санкт-Петербурге, 15 - 19 мая 2000 г.- Санкт-Петербург, 2000,- С 124

Korotaeva, N Е Maize heat shock proteins nnmunochemically related to a - crystalline / N.E Korotaeva, AI. Antipma, G.B Borovsku, V K. Vonukov // Abstracts of XVin International conference on maize and sorghum genetics and breeding at the end of the 20th century, 4-9 June 2000.- Belgrade, Yugoslavia, 2000.-P. 127.

Korotaeva, N E Mitochondrial low-molecular-weight heat shock proteins and thermotolerance of maize mitochondria / N.E. Korotaeva, AI Antipma, ОI Grabelnych, N N. Varakina, G B. Borovskii ,V.K Voinikov // Maydica - 2001.- V 46-P. 239-244.

Коротаева, H E Митохондриальные низкомолекулярные белки теплового шока и устойчивость митохондрий злаков к гипертермии / НЕ. Коротаева, А.И Антипина, О И Грабельных, Н.Н Варакина, Г.Б Боровский, В.К Войников // Физиология растений - 2001 - Т.48, Ns.6- С.917-922

Korotaeva, N Е Diversity of mitochondrial smHSPs of cereals correlates with tolerance of cereals to heat shock / N.E. Korotaeva, A I. Antipina, O.I

Grabelnych, G B.Borovskn, V К Voimkov // Abstracts of International symposium "Plant under environmental stress", 23 - 28 October 2001 - Moscow, 2001 - P 136

Korotaeva, NE Localization of low-molecular-weight heat shock proteins m cell compartments of maize, wheat and rye / N E Korotaeva, AI Antipina, G В Borovsku, V К Voinikov // Maize Genet Cooperation Newsletter -2001 -V 75-P 26-27

Korotaeva, N E Mitochondrial low-molecular-weight heat shock protems and thermotolerance of crop plant's mitochondria to hyperthermia / NE Korotaeva, AI Antipina, ОI Grabelnych, N N Varakina, G В Borovsku, V К Voinikov // Maize Genet Cooperation Newsletter.- 2001 - V. 75 - P 25-26

Korotaeva, N E. Appearance of HSPs immunochemically related to a-crystallin at the temperature close to optimum in the absence of dehydration in crops / NE Korotaeva, GB Borovsku, V.K Voinikov // Maize Genet Cooperation Newsletter - 2001 - V 75 - P 24-25

Коротаева, HE Различия в накоплении нмБТШ в проростках кукурузы в ответ на окислительный и водный стресс /НЕ Коротаева, Г Б Боровский, В.К Войников // Тезисы докладов V съезда общества физиологов растений России и Международной конф «Физиология растений - основа фитобиотехнологии», 15-21 сент 2003 г.- Пенза, 2003.-С. 291

Voimkov, V К Maize seedlings accumulate smHSPs in response to water stress but not to treatment by an oxygen radical generatmg agent / V К Voinikov, G В Borovskii, N E Korotaeva // Maize Genetics Cooperation Newsletter - 2003 -V 77 - P 34-35

Коротаева, H E Изменения в дыхательной активности митохондрий и накопление нгокомолекулярных стрессовых белков у проростков кукурузы при обезвоживании /НЕ Коротаева, А И Антипина, Г Б. Боровский, В К Войников // Материалы Всероссийской науч. конф. "Структура и экспрессия митохондриального генома растений", 3-7 сент 2006 г - Иркутск, 2006.- С. 62-67

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Коротаева, Наталья Евгеньевна

1. ВВЕДЕНИЕ.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

2.1. ЗОНЫ ФИЗИОЛОГИЧЕСКОГО ДЕЙСТВИЯ НЕБЛАГОПРИЯТНЫХ ФАКТОРОВ.

2.2. БЕЛКИ ТЕПЛОВОГО ШОКА (ШАПЕРОНЫ) КАК ФАКТОРЫ ЗАЩИТЫ ПОЛИПЕПТИДОВ.

2.2.1. Изменения, происходящие с полипептидами в стрессовых условиях.

2.2.2. Высокомолекулярные БТШ и их защитная роль.

2.2.3.Низкомолекулярные стрессовые белки - факторы защиты полипептидов от теплового шока и водного дефицита.

2.2.3.1. Классификация и структурные особенности низкомолекулярных БТШ растений.

2.2.3.2. Регуляция экспрессии генов низкомолекулярных БТШ растений.

2.2.3.3. Функции и механизм действия низкомолекулярных БТШ растений.

2.2.3.4. Синтез низкомолекулярных БТШ в ответ на тепловой стресс.

2.2.3.4. Синтез низкомолекулярных БТШ в ответ на водный дефицит.

2.3. КРАТКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА МИТОХОНДРИЙ РАСТЕНИЙ.

2.3.1. Дыхательная система растительных митохондрий и окислительное фосфорилирование.

2.4. ВЛИЯНИЕ ТЕПЛОВОГО ШОКА И ВОДНОГО ДЕФИЦИТА

НА ДЫХАНИЕ РАСТЕНИЙ.

2.4.1. Влияние температуры на дыхание растений.

2.4.2. Особенности дыхания растений в условиях водного дефицита.

2.4.2.1. Функции и формы воды в растении.

2.4.2.2. Экологические группы растений по отношению к водному режиму.

2.4.2.3. Влияние водного дефицита на дыхание.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Низкомолекулярные БТШ злаков в период действия высокой температуры и водного дефицита"

Понятие "стресс" впервые было применено в медицине канадским эндокринологом Гансом Селье в 30-х годах 20 века. Селье дает следующее определение стрессу: "Стресс есть неспецифический ответ организма на любое предъявляемое ему требование" (Селье, 1972). Комплекс изменений, вызываемых в организме стрессом, Селье назвал "общим адаптационным синдромом".

При действии стрессора происходящие с растением на клеточном уровне изменения можно разделить на специфические и неспецифические. Первые уникальны для каждого вида стресса, их появление продиктовано теми характерными особенностями, которые отличают именно этот вид воздействия. Вторые являются общими для большинства воздействий. Стрессовый ответ направлен на защиту внутриклеточных структур и устранение неблагоприятных изменений в клетках. Активация и синтез стрессовых белков также является частью неспецифического стрессового ответа и характерно для действия любых стрессоров.

Существует несколько биохимических структур и функций, которые абсолютно необходимы для всех живых систем и в то же время весьма чувствительны к изменениям физических или химических особенностей среды. Эти структуры и функции особенно нуждаются в неких адаптивных механизмах, поскольку ухудшение деятельности этих структур и функций или их полное устранение или остановка несовместимы с жизнью клетки. К таким "узким местам" относятся следующие системы, процессы или функции:

1) поддержание структурной целостности макромолекул (ферментов, сократительных белков, нуклеиновых кислот и др.);

2) достаточное снабжение клетки а) «энергетической валютой»— аденозинтрифосфатом (АТФ); б) восстановительными эквивалентами, необходимыми для протекания процессов биосинтеза; в) предшественниками, используемыми при синтезе запасных веществ (гликогена, жиров и т. п.), нуклеиновых кислот и белков;

3) поддержание систем, регулирующих скорости и направления метаболических процессов в соответствии с потребностями организма и их изменениями при изменении условий среды (Хочачка, Сомеро, 1988).

Эти фундаментальные функции необходимы всем живым системам, в каких бы условиях они ни находились. Адаптации на биохимическом уровне производятся с помощью небольшого числа фундаментальных механизмов. Среди способов биохимической адаптации существуют следующие три типа адаптивных механизмов или "стратегий":

1. Приспособление макромолекулярных компонентов клеток или жидкостей организма. При этом либо изменяются количества (концентрации) уже имеющихся типов макромолекул, например ферментов ("количественная" стратегия), либо образуются макромолекулы новых типов (изозимы или аллозимы), которыми замещаются макромолекулы, ставшие не вполне пригодными для работы в изменившихся условиях ("качественная" стратегия).

2. Приспособление микросреды, в которой функционируют макромолекулы. Адаптивное изменение структурных и функциональных свойств макромолекул достигается путем видоизменения качественного или количественного состава окружающей их среды (например, ее осмотической концентрации или состава растворенных веществ).

3. Приспособление на функциональном уровне. Адаптацию в этом случае обеспечивает изменение в использовании уже существующих макромолекулярных систем — в соответствии с текущими локальными потребностями в той или иной метаболической активности. Таким образом, из этих адаптаций складывается важное явление метаболической регуляции— надлежащее увеличение или уменьшение активности ферментов в связи с воздействием стресса, такими процессами, как локомоция, рост, переход к анаэробиозу и др. (Хочачка, Сомеро, 1988).

Деятельность низкомолекулярных стрессовых белков или белков теплового шока (сокращенно БТШ) является важной частью метаболической регуляции клетки. В условиях стресса высокомолекулярные БТШ, к которым относятся БТШ100, БТШ70, БТШ60 и БТШ40 придают полипептидам устойчивость и восстанавливают уже поврежденные белки. Однако эта функция высокомолекулярных БТШ осуществляется, как правило, только при участии низкомолекулярных БТШ (нмБТШ). В отличие от высокомолекулярных, нмБТШ за редким исключением появляются в клетке только с наступлением стрессовых условий.

В настоящей работе рассматриваются индукция и накопление низкомолекулярных БТШ в ответ на действие двух стрессов: повышенной температуры или обезвоживания. Описывается действие этих стрессоров на процессы окислительного фосфорилирования, протекающие в митохондриях, и на накопление в этих органеллах нмБТШ.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение Диссертация по теме "Физиология и биохимия растений", Коротаева, Наталья Евгеньевна

7. ВЫВОДЫ

1. Подавление дыхательной активности изолированных митохондрий тепловым шоком зависит от термоустойчивости вида. Интенсивность дыхания митохондрий кукурузы (более термоустойчивый вид) снижается в меньшей степени, чем интенсивность дыхания пшеницы и ржи (менее термоустойчивые виды).

2. Под действием теплового шока в проростках кукурузы, пшеницы и ржи накапливаются низкомолекулярные БТШ с молекулярными массами 28-19 кД.

3. Под действием теплового шока в митохондриях кукурузы накапливается 5 низкомолекулярных БТШ с молекулярными массами 28, 23, 22, 20 и 19 кД. Белки с массами 22, 20 и 19 кД расположены внутри митохондрий, а 28 и 23 кД - снаружи органелл. В митохондриях пшеницы и ржи под действием теплового шока накапливаются низкомолекулярные стрессовые белки с массами 20 кД, расположенные снаружи и внутри органелл.

4. "Наружные" низкомолекулярные БТШ кукурузы 22, 20 и 19 кД прочно связаны с мембранами митохондрий, "внутренние" низкомолекулярные БТШ 28 и 23 кД слабо связаны с мембранами митохондрий, либо являются белками матрикса.

5. Под действием водного дефицита в проростках кукурузы накапливаются низкомолекулярные БТШ 19 и 22 кД. Накопление этих стрессовых белков усиливается по мере увеличения продолжительности и интенсивности воздействия.

6. Водный дефицит, который испытывают проростки, значительно подавляет скорость дыхания изолированных митохондрий, но почти не влияет на их энергетическую активность. Снижение активности дыхания соответствует продолжительности стресса и степени обезвоживания проростков.

7. Сукцинат-зависимое дыхание (II комплекс дыхательной цепи) проявляет большую устойчивость к водному дефициту, чем малат-зависимое (I комплекс дыхательной цепи).

8. Вся совокупность полученных данных при сравнении с данными литературы позволяет предположить, что низкомолекулярные белки теплового шока в условиях теплового стресса и водного дефицита накапливаются в клетках растений и играют важную роль в повышении устойчивости процессов дыхания к неблагоприятным условиям внешней среды.

6. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Проблема устойчивости растительного организма к действию неблагоприятных факторов внешней среды давно привлекает к себе внимание физиологов растений. Этот вопрос не теряет актуальности и в настоящее время. В понимании защитных механизмов растений на сегодняшний день достигнуты значительные успехи. Одним из них с полным основанием можно считать открытие шаперонов, как природных молекулярных протекторов повреждения полипептидов. При нарушении структуры белков выживание клетки (и всего организма) ставится под сомнение, поэтому углубление знаний по этому вопросу имеет большое теоретическое и практическое значение.

Ранее было показано, что пул БТШ ассоциирует с растительными митохондриями в условиях теплового шока (Войников, Рудиковский, 1988). М. Chou с соавторами (1989) показали, что митохондрии из закаленных при тепловом шоке проростков сои сохраняют высокие дыхательные параметры по сравнению с митохондриями из незакаленных проростков даже в условиях инкубирования при высокой температуре. При этом в "закаленных" митохондриях накапливались нмБТШ. Исследованиями С. Downs и S. Heckathorn (1998) была доказана протекторная роль нмБТШ с молекулярной массой 24 кД по отношению к I комплексу электрон-транспортной цепи митохондрий животных (Downs et al., 1999) и растительных митохондрий (Downs, Heckathorn, 1998) в условиях теплового шока и окислительного стресса. Кроме того, имеются доказательства защитной роли стрессовых белков с молекулярной массой 25 кД по отношению к фотосистеме II в условиях окислительного стресса и фотоингибирования (Heckathorn et al., 1998). Все эти данные говорят в пользу того, что нмБТШ имеют непосредственное отношение к стабилизации процессов дыхания при неблагоприятных воздействиях.

Нами было установлено, что митохондрии из стрессированных проростков кукурузы демонстрируют более высокую интенсивность дыхания, чем митохондрии из стрессированных высокой температурой проростков менее жаростойких культур пшеницы и ржи (Коротаева и др., 2001). Мы полагаем, что более высокая интенсивность дыхания кукурузных митохондрий по сравнению с митохондриями пшеницы и ржи говорит об их большей устойчивости к тепловому шоку. Эти результаты согласуются с данными (Башшуа й а1., 2004) о том, что термоустойчивость митохондрий соответствует термоустойчивости данного растения.

Как было показано нами, нмБТШ с массами 28-19 кД и 20 кД при тепловом стрессе связываются с митохондриями кукурузы, пшеницы и ржи, оказывая, вероятно, защитное действие по типу шаперонов на белки этих органелл. При этом митохондрии кукурузы превосходят митохондрии пшеницы и ржи по количеству связывающихся с ними стрессовых белков: с митохондриями кукурузы связывается пять нмБТШ, а с митохондриями пшеницы и ржи - по одному белку (Когс^аеуа сЧ а1., 2001). Превосходство митохондрий кукурузы по количеству нмБТШ соответствует их большей устойчивости к тепловому шоку. Это согласуется с выводами С. .ТобЫ с соавторами (1997), о том, что хлоропласты из растений пшеницы разных сортов, отличающихся по термоустойчивости, содержат различное количество нмБТШ, которое коррелирует с термоустойчивостью сортов. Отличия в термоустойчивости дыхания митохондрий, вероятно, связаны с протекторным действием обнаруженных низкомолекулярных стрессовых белков.

Более подробное изучение митохондриальных нмБТШ кукурузы выявило некоторые особенности связывания этих белков с митохондриями. Белки 28 и 23 кД располагаются внутри органелл, где слабо связываются с мембранами, либо локализованы в матриксе. Стрессовые белки 22, 20 и 19 кД локализованы на поверхности органелл и прочно связаны с наружной мембраной митохондрий. Кроме того, "наружные" нмБТШ обнаружены в "цитоплазматической" фракции белков (Когс^аеуа а1., 2001). Вероятно, различия в размещении и прочности связи нмБТШ с митохондриями обусловлены различными функциями, которые эти белки выполняют в митохондриях. связи нмБТШ с митохондриями обусловлены различными функциями, которые эти белки выполняют в митохондриях.

Под действием водного дефицита, вызванного подсушиванием или обработкой осмотиком, в побегах кукурузы также происходит увеличение количества нмБТШ 28, 22 и 19 кД, которое коррелирует со степенью обезвоживания проростков (Уошкоу а!., 2003). Белок с молекулярной массой 22 кД начинает накапливаться раньше двух других обнаруженных нмБТШ, что может говорить о еш особой роли в период водного дефицита.

В результате воздействия водным дефицитом на проростки кукурузы происходит снижение оводненности тканей проростков. На протяжении 48 часов стресса теряется до 8% воды, при этом выживаемость остается высокой, что говорит о неглубоких повреждениях. Сильные повреждения происходят после 72 часов стресса, когда теряется до 14% влаги. Водный дефицит влечет за собой нарастающее по мере усиления потери воды уменьшение интенсивности сукцинат- и малат- зависимого дыхания. При этом значения дыхательного контроля и АДФ:0 остаются прежними, особенно в условиях слабого обезвоживания, что говорит о сохранении сопряженности процессов окисления и фосфорилирования. Сильный водный дефицит приводит к незначительному снижению значения дыхательного контроля. Возможно, сохранение высокой сопряженности дыхания на этапе глубокого обезвоживания говорит в пользу необходимости высокой эффективности дыхания и интенсивного синтеза АТФ в этих условиях и в какой-то степени компенсирует низкую дыхательную активность.

Сукцинат-зависимое дыхание проявляет большую устойчивость к слабому обезвоживанию, чем малат-зависимое, что совпадает с представлениями о большей устойчивости II комплекса к неблагоприятным воздействиям по сравнению с I комплексом и сопряженным с ним дыханием.

К сожалению, в данной работе отсутствует прямое доказательство ассоциации нмБТШ с митохондриями в период засухи. Однако такие доказательства были получены D. Taylor с соавторами (2004), которые показали накопление нмБТШ 22 кД в митохондриях из листьев растений гороха, подвергнутых обезвоживанию. Можно предположить, что обнаруженные нами в проростках кукурузы нмБТШ 28, 22 и 19 кД после воздействия водным дефицитом также связываются с митохондриями для защиты полипептидов от повреждений, происходящих в результате обезвоживания. Это предположение, конечно, не заменяет необходимости точной детекции нмБТШ в митохондриях кукурузы в период действия водного дефицита. Вообще о накоплении нмБТШ в митохондриях под действием обезвоживания информации крайне мало, в этой области остается еще много белых пятен.

Согласно последним исследованиям митохондриальным нмБТШ помимо защиты митохондриальных белков, в частности, дыхательных комплексов, от вызванных стрессом повреждений, принадлежит важная роль в стрессовой сигнальной системе (Rhoads et al., 2005; Sanmiya et al., 2004). Как оказалось, экспрессия митохондриальных низкомолекулярных стрессовых белков имеет следствием экспрессию других БТШ (Rhoads et al., 2005). Растения с нарушенной экспрессией митохондриальных нмБТШ оказываются менее устойчивыми к тепловому шоку. В частности, это показано на примере митохондриального нмБТШ 22 кД (Sanmiya et al., 2004). Всвязи с этим было бы интересным выяснить, как могут отличаться по набору митохондриальных нмБТШ разные сорта злаков, и существует ли количественная или качественная корреляция между набором нмБТШ в митохондриях и сортовой устойчивостью. Другой вопрос, обладают ли регуляторными функциями обнаруженные нами пять нмБТШ кукурузы, все ли они могут играть роль регуляторов экспрессии генов стрессовых белков, или только некоторые из них. По-прежнему остается неизвестным, каким образом эти белки осуществляют защитные функции по отношению к дыхательной системе митохондрий, на каком этапе и с какими белками митохондрий они работают. Все это может стать целью дальнейших исследований.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Коротаева, Наталья Евгеньевна, Иркутск

1. Албертс, Б. Молекулярная биология клетки: В 5-ти т. / Б. Альберте и др..- М.: Мир, 1987.- Т.З.- 296 с.

2. Александров, В.Я. Клетки, макромолекулы, температура / В.Я. Александров,- Ленинград.: "Наука", 1975.- 330 с.

3. Александров, В.Я. Реактивность клеток и белки / В.Я. Александров.- Л.: Наука, 1985.-318 с.

4. Алексеев, A.M. О молекулярной структуре внутриклеточной воды и о ее возможном физиологическом значении / A.M. Алексеев // Состояние воды и водный обмен у культурных растений.- М.: Наука, 1971,- С. 11-23.

5. Антипов, Н.И. К вопросу об эволюции мезофитов, гигрофитов и ксерофитов / Н.И. Антипов // Физиология засухоустойчивости растений,- М.: Наука, 1971,-С. 247-279.

6. Боровский Г.Б., Войников В.К. Локализация низкомолекулярных белков теплового шока на поверхностьи и внутри митохондрий кукурузы // Физиология растений.- 1993,- Т.40, №4.- С. 596-598.

7. Быков О.Д. Кинетика С02-темнового дыхания пшеницы в процессе обезвоживания растений // Физиология растений.- 1997,- Т. 44. № 3.- С. 373-378.

8. Веретенников, A.B. Физиология растений: Учебник.- 2-е изд., перераб. / A.B. Веретенников.- Воронеж: Воронеж, гос. лесотехн. акад., 2002.- 272 с.

9. Войников В.К., Рудиковский A.B. Ассоциация белков теплового шока кукурузы с митохондриями in vivo и in vitro // Физиология растений.- 1988.-N.35,№3.- С.542-547.

10. Войников, В.К. Генетические функции митохондрий растений / В.К. Войников, Ю.М. Константинов, В.И. Негрук.- Новосибирск.: Наука, Сиб. отд-ние, 1991,- 183 с.

11. Войников, В.К. Температурный стресс и митохондрии растений / В.К. Войников.- Новосибирск: Наука, 1987.

12. Генкель, П.А. Проблемы засухоустойчивости растений / П.А. Генкель.-М.:Наука.-1978.- 235 с.

13. Генкель, П.А. Физиология жаро- и засухоустойчивости растений / П.А. Генкель.-М.: Наука,-1982.- 280 с.

14. Геннис, Р. Биомембраны: Молекулярная структура и функции / Р. Теннис,- М.: Мир, 1997,- 624 с.

15. Головко, Т.К. Дыхание растений (физиологические аспекты) / Т.К. Головко.- СПб.: Наука, 1999.- 204 с.

16. Дроздов, С.Н. Терморезистентность активно вегетируюгцих растений / С.Н. Дроздов, В.К. Курец, А.Ф. Титов.- Л.: Наука, 1984.- 168 с.

17. Жолкевич, В.Н. Водный обмен растений / В.Н. Жолкевич и др.; под ред. М.Д. Кушниренко, А.Ф. Клешнина.- М.: Наука, 1989.- 256 с.

18. Жолкевич, В.Н. Энергетика дыхания высших растений в условиях водного дефицита / В.Н. Жолкевич,- М.: Наука, 1968.- 230 с.

19. Зенков Н.К., Меныцикова Е.Б., Вольский H.H., Козлов В.А. Внутриклеточный окислительный стресс и апоптоз // Успехи современной биологии.- 1999,- Т. 119, N5.- С. 440-450.

20. Иванова Т.И., Семихатова O.A. Действие замораживания на окислительное фосфорилирование митохондрий проростков гороха // Ботан. Журн,- 1966,- Т.51.- С.1266-1275.

21. Коровин, А.И. Растения и экстремальные температуры / А. И. Коровин.-Ленинград, Гидрометеоиздат, 1984.- 272 с.

22. Коротаева, Н.Е. Митохондриальные низкомолекулярные белки теплового шока и устойчивость митохондрий злаков к гипертермии / Н.Е. Коротаева, А.И. Антипина, О.И. Грабельных, H.H. Варакина, В.К. Войников // Физиология растений.- 2001.- Т.48, №.6- С.917-922.

23. Кумаков, В.А. Физиология яровой пшеницы / В.А. Кумаков.- М.: Колос, 1980,- 207 С.

24. Куперман, И.А. Дыхательный газообмен как элемент продукционного процесса растений / И. А.Куперман, Е.В.Хитрово.- Новосибирск, 1977,- 183 с.

25. Куций М.П., Кузнецова Е.А, Газиев А.И. Участие протеаз в апоптозе // Биохимия,- 1999,- Т.64, вып. 2.- С. 149-163.

26. Кушниренко, М.Д. Физиология водообмена и засухоустойчивости растений / М.Д. Кушниренко, С.Н. Печерская; под ред. С.И. Тома.- Кишинев: Штиинца, 1991.-308 с.

27. Лакин, Г.Ф. Биометрия: Учеб. пособие для биологич. спец. вузов.- 3-е изд. перераб. и доп. / Г.Ф. Лакин,- М.: Высш. школа, 1980.- 293 с.

28. Меденцев И.Г., Аринбасарова А.Ю., Акименко В.К. Регуляция и физиологическая роль цианидрезистентной оксидазы у грибов и растений // Биохимия,- 1999.- Т. 64,вып. 2.- С. 1457-1472.

29. Побежимова Т.П., Войников В.К. Биологические и физиологические аспекты функционирования убихинона // Биологические мембраны,- 1999.-Т.16, N5.- С. 485-490.

30. Побежимова, Т.П. Импортбелков в митохондрии / Т.П. Побежимова, В.К. Войников // Физиология растений.- 2000.- Т.47, №1.- С. 129-136.

31. Побежимова, Т. П. Последействие температуры на энергетическую активность митохондрий злаков : автореф. дис. . канд. биол. наук / Т.П. Побежимова.- Иркутск, 1988. 24 с.

32. Побежимова, Т. П. Функционирование дыхательной цепи растительных митохондрий при температурных стрессах : автореф. дис. . докт. биол. наук / Т.П. Побежимова.- Иркутск, 1997. 42 с.

33. Полевой, В.В. Физиология растений: Учеб. для биол. спец. вузов / В.В. Полевой,- М.: Высш. Шк, 1989.- 464 с.

34. Реймерс, Ф.Э. Прорастание семян и температура (справочные данные по растениям полевой культуры Сибири и Дальнего Востока) / Ф.Э. Реймерс, Н.Э. Илли,- Новосибирск.: Наука, Сиб. отд-ние, 1978.- 168 с.

35. Селье, Г. На уровне целого организма / Г. Селье.- М.:Наука, 1972,- 254 с.

36. Семихатова O.A. Оценка адаптационной способности растения на основании исследований темнового дыхания // Физиология растений,- 1998.- Т. 45. № 1.-С. 142-148.

37. Семихатова O.A. Показатели, характеризующие дыхательный газообмен растений//Ботан. Журн,- 1968.- Т.53, № 8,- С.1069-1084.

38. Семихатова O.A., Денько Е.И. О воздействии температуры на дыхание листьев растений // Тр. Ботан. ин-та им. B.JI. Комарова АН СССР.- I960.- Сер.4, вып. 14.- С. 113-137.

39. Семихатова O.A., Николаева М.Г. Дыхательная способность высших растений. Таксономический обзор // Физиология растений,- 1996.- Т.43, №3.-С.450-462.

40. Семихатова, O.A. Влияние температуры на дыхание растений / O.A. Семихатова // Дыхание растений: физиологические и экологические аспекты,-Сыктывкар, 1995,- С. 123-125.

41. Семихатова, O.A. Физиология дыхания растений: Учеб. пособие / O.A. Семихатова, Т.В. Чиркова.- СПб.: Изд-во С.-Петерб. Ун-та, 2001.- 224 с.

42. Сечняк, Л.К. Экология семян пшеницы / Л.К. Сечняк, H.A. Киндрук, O.K. Слюсаренко, В.Г. Иващенко, Е.Д. Кузнецов.- М.: Колос, 1981.- 349 с.

43. Скулачев В.П. В своем межмембранном пространстве митохондрия таит "белок самоубийства", который, выйдя в цитозоль, вызывает апоптоз // Биохимия.- 1996.- Т. 61, вып. 1.- С. 2060-2063.

44. Скулачев В.П. Явления запрограммированной смерти. Митохондрии, клетки и органы: роль активных форм кислорода // СОЖ,- 2001.- № 6.- С. 4-10.

45. Хитрово, Е.В. Влияние водного дефицита при прогрессирующей почвенной засухе на дыхательный газообмен пшеницы / Е.В. Хитрово, H.A. Куперман // Физиология приспособления растений к почвенным условиям.-Новосибирск, 1973.- С. 62-77.

46. Хочачка, П. Биохимическая адаптация: Пер. с англ. / П. Хочачка, Дж. Сомеро.- М.: Мир, 1988.- 568 с.

47. Хочачка, П. Стратегия биохимической адаптации: Пер. с англ. / П. Хочачка, Дж. Сомеро,- М.: Мир, 1977.- 400 с.

48. Шматько, И.Г. Устойчивость растений к водному и температурному стрессам / И.Г. Шматько, И.А. Григорюк, О.Е. Шведова ; под ред. И.Д. Шматько; Ин-т физиологии растений и генетики.- Киев: Наук. Думка, 1989.224 с.

49. Шугаев А.Г. Некоторые особенности структурной организации и окислительной активности дыхательной цепи митохондрий растений // Успехи современной биологии.-1991.-Т. 111, вып. 2.-С. 178-191.

50. Юдина О.С., Леина Г.Д., Березин Б.В. Температурная зависимость дыхания некоторых сортов яровой пшеницы среднего Поволжья // Физиология и биохимия культ, растений.- 1983.- Т.15, №4.- С.315-321.

51. Adamska, I. Kloppstech К. Evidence for the localization of the nuclear-coded 22-kDa heat-shock protein in a subfraction of thylacoid membranes /1. Adamska, K. Kloppstech//Eur. J. Biochem.- 1991.-V. 198,-P. 375-381.

52. Alamillo, J. Constitutive expression of small heat shock proteins in vegetative tissues of the resurrection plant Craterostigma plantagineum / J. Alamillo, C. Almoguera, D. Bartels, J. Jordano // Plant Mol. Biol.- 1995.-V. 29.- P.1093-1099.

53. Allison, S.D. Counteraction effects of thiocyanate and sucrose on secondary structure and aggregation of chymotrypsinogen during freezing, drying and rehydration / S.D. Allison, A.Dong, J.F. Carpenter // Biophys. J.-1996.- V. 71.-P.2022-2032.

54. Almoguera C. Tissue-specific expression of sunflower heat shock proteins in response to water stress / C.Almoguera, M.A. Coca, J. Jordano // Plant J.- 1993.- V. 4,-P. 947-958.

55. Almoguera, C. Developmental and environmental concurrent expression of sunflower dry-seed-stored low-molecular-weight heat-shock protein and Lea mRNAs / C. Almoguera, J. Jordano // Plant Mol. Biol.- 1992.- V. 19.- P. 781-792.

56. Almoguera, C. Dual regulation of a heat shock promoter during embryogenesis: stage dependent role of heat shock elements / C. Almoguera, P. Prieto-Dapena, J. Jordano // Plant J. 1998,- V. 13.- P. 437-446.

57. Amin, J. Key features of heat shock regulatory elements / J. Amin, J. Ananthan, R. Voellmy // Mol.Cell Biol.- 1988,- V. 8.- P. 3761-3769.

58. Amy, E. Developmental control of small heat shock protein expression during pea seed maturation / E. Amy, E. DeRocher, E. Vierling // Plant J.- 1994.- V. 5.- P. 93 -97.

59. Barros, M.D. Mutational analysis of a plant heat shock element / M.D. Barros, E. Czamecka, W.B. Gurley // Plant Mol.Biol.- 1992,- V. 19,- P.665-675.

60. Bartoli, C.G. Mitochondria are the main target for oxidative damage in leaves of wheat (triticum aestivum L.) / C.G. Bartoli, F. Gomes, D.E. Martinez, J.J. Guiamet // J. Exp. Bot.- 2004.- V. 55.- P.1663-1669.

61. Basha, E.M. Triticum aestivum cDNAs Homologous to Nuclear-Encoded Mitochondrion-Localized Small Heat Shock Proteins/ E.M. Basha, E.R. Waters, E. Vierling//Plant Sci.- 1999.-V. 141. P.93-103.

62. Basha, E.M. Triticum aestivum cDNAs Homologous to Nuclear-Encoded Mitochondrion-Localized Small Heat Shock Proteins / E. M. Basha, E. R. Waters, E. Vierling//Plant Sci.- 1999,- V. 141.-P. 93-103.

63. Bell, D. T. The Effects of Drought Stress on Respiration of Isolated Corn Mitochondria / D. T. Bell, D. E. Koeppe, R. J. Miller // Plant Physiol.- 1971,- V. 48.-P. 413-415.

64. Boston, R.S. Molecular chaperones and protein folding in plants / R.S. Boston, P.V. Viitanen, E. Vierling//Plant Mol. Biol.- 1996,- V. 32,- P. 191-222.

65. Buchner, J. Hsp90 & Co. a holding for folding / J. Buchner // Trends Biochem. Sci.- 1999,- V. 24,-P. 136-141.

66. Bukau, B. The Hsp70 and Hsp60 chaperone machines / B. Bukau, A.L. Horwich // Cell.- 1998,- V. 92.- P. 351-366.

67. Burke, J.J. Crop-specific thermal kinetic windows in relation to wheat and cotton biomass production / J.J. Burke, J.R. Mahan, J.L. Hatfield // Agron. J.- 1998.-V. 80.- P.553-556.

68. Carranco, R. A Plant Small Heat Shock Protein Gene Expressed during Zygotic Embryogenesis but Noninducible by Heat Stress / R. Carranco, C. Almoguera, J. Jordano // J. Biol. Chem.- 1997.- V. 212.- P. 27470-27475.

69. Carranco, R. An Imperfect Heat Shock Element and Different Upstream Sequences Are Required for the Seed-Specific Expression of a Small Heat Shock Protein Gene / R. Carranco, C. Almoguera, J. Jordano // Plant Physiol.- 1999.- V. 121.- P.723-730.

70. Chen, Q. A 21-kDa chloroplast heat shock protein assembles into high molecular weight complexes in vivo and in Organelle / Q. Chen, K. Osteryoung, E. Vierling // J. Biol. Chem.- 1994,- V. 269,- P. 13216-13223.

71. Chou, M. Thermotolerance of Isolated Mitochondria Associated with Heat Shock Proteins / M. Chou, Y.-M. Chen, C.-Y. Lin // Plant Physiol.- 1989.- V. 89,- P. 617-621.

72. Collada, C. Purification and in vitro chaperone activity of a class I small heat-shock protein abundant in recalcitrant chestnut seeds / C. Collada, L. Gomez, R. Casado, C. Aragoncillo // Plant Physiol.- 1997.- V. 15.- P.71-77.

73. Collier, D.E. Effect of osmotic stress on the respiratory properties of shoots and roots of Arnica alpine/ D.E. Collier, W.R. Cummins // Can. J.Bot.- 1993,- V.71.-P.l 102-1108 6.

74. Collier, D.E. Sensitivity of the cytochrome and alternative pathways to osmotic stress in leaf-slices of Saxifraga cernua L. / D.E. Collier, W.R. Cummins // J. Plant Physiol.- 1993 .-V. 141.- P.745-749a.

75. Collier, D.E. The rate of development of water deficits affects Saxifraga cernua leaf respiration / D.E. Collier, W.R. Cummins // Physiol. Plant.- 1996.- V.96.- P.291-297.

76. Cooper, P. Intracellular localization of heat shock proteins in maize / P. Cooper, T.H.D. Ho // Plant Physiol.- 1987,- V.84.- P. 1197-1203.

77. Cunniugham, W.P. Oxidation of externally added NAD H by isolated corn root mitochondria / W.P. Cunniugham // Plant Physiol.- 1964,- V.39.- P.699-703.

78. De Virville, D.J. Isolation and Properties of Mitochondria from Arabidopsis thaliana Cell Suspension Culture / D.J. De Virville, I. Aaron, M.F. Alin, F. Moreau // Plant Physiol. Biochem.- 1994,- V.32.- P. 1-4.

79. Debel, K. Accumulation of plastid HSP 23 of Chenopodium rubrum is controlled post-translationally by light / K. Debel, G. Knack, K. Kloppstech // Plant Journal.- 1994,- V. 6,- P. 79-85.

80. Dekánková, K. Response of maize plants to water stress/ K. Dekánková, M. Luxová, O. Gaspariková, L. Kolarovic // Biol Bratisl.- 2004,- V.13.- P.151-155.

81. DeRocher, A.E. Developmental control of small heat shock protein expression during pea seed maturation / A.E. DeRocher, E. Vierling // Plant J.- 1994,- V.5.- P.93-102.

82. DeRocher, A.E. Expression of a Conserved Family of Cytoplasmic Low Molecular Weight Heat Shock Proteins during Heat Stress and Recovery / A.E. DeRocher, K.W. Helm, L.M. Lauzon, E. Vierling // Plant Physiol.- 1991.- V.96.-P.1038-1047.

83. Dinkova, T.D. Cap-independent translation of maize HsplOl / T.D. Dinkova, H. Zepeda, E. Martínez-Salas, L.M. Martínez, J. Nieto-Sotelo, E.S. de Jiménez // Plant J.- 2005,- V.4L- P.722-731.

84. Dong, A. C. Infrared spectroscopic studies of lyophilization-induced and temperature-induced protein aggregation / A. C. Dong, S. J. Prestrelski, S. D. Allison, J. F. Carpenter//J. Pharm. Sci.- 1995.- V. 84.- P.415^24.

85. Dong, J.-Z. Expression of abundant mRNAs during somatic embryogenesis of white spruce Picea glauca (Moench) Voss. / J.-Z. Dong, D. I. Dunstan // Planta.-1996,- V. 199,-P. 459-466.

86. Dong, J.Z. Characterization of three heat-shock-protein genes and their developmental regulation during somatic embryogenesis in white spruce Picea glauca (Moench) Voss. / J.Z. Dong, D. I. Dunstan // Planta.- 1996.- V. 200,- P.85-91.

87. Douce, R. Mitochondria in higher plants: structure, function and biogenesis / R. Douce.- London: Acad. Press, 1985.- 327 p.

88. Dougan, D. A. AAA+ proteins and substrate recognition, it all depends on their partner in crime / D. A.Dougan, A. Mogk, K. Zeth, K. Turgay, B. Bukau // FEBS Lett.-2002.-V.529.- P.6-10.

89. Downs, C. Preliminary Examination of Short-Term Cellular Toxicological Responses of the Coral Madracis mirabilis to Acute Irgarol 1051 Exposure / C. Downs, A. Downs //Arch. Env. Contam. Toxicology.- 2007,- V. 52,- P. 47-57.

90. Eckey-Kaltenbach, H. Differential transcript induction of parsley pathogenesis-related proteins and of a small heat shock protein by ozone and heat shock / H. Eckey

91. Kaltenbach, E. Kiefer, E. Grosskopf, D. Ernst, H. Sandermann // Plant Mol. Biol.-1997.-V. 33.-P. 343-350.

92. Ehrnsperger M. Binding of non-native protein to Hsp25 during heat shock creates a reservoir of folding intermediates for reactivation / M. Ehrnsperger, S. Gräber, M. Gaestel, J. Büchner // EMBO J.- 1997,- V. 16.- P. 221-229.

93. Esen, A. A Simple Method for Quantitative, Semiquantitative and Qualitative Assay of Protein / A. Esen // Anal. Biochem.- 1978,- V. 89,- P. 264-273.

94. Estabrook, R.W. Mitochondrial Respiratory Control and the Polarographic Measurement of ADF:0 Ratio / R.W. Estabrook // Methods Enzymology / Eds. Sidney P. et al.- N. Y.: Acad. Press, 1967.-V. 10.-P. 41-47.

95. Feller U. Moderately high temperatures inhibit ribulose-l,5-bisphosphate carboxylase/ oxygenase (Rubisco) activase-mediated activation of Rubisco / U. Feller, S.J. Crafts-Brandner, M.J. Salvucci // Plant Physiol.- 1998,- V. 116,- P. 539-546.

96. Fink, A. L. Protein aggregation: Folding aggregates, inclusion bodies and amyloid / A. L. Fink // Folding Des.- 1998,- V. 3.- P. 9-23.

97. Frydman, J. Folding of newly translated proteins in vivo: the role of molecular chaperones / J. Frydman // Annu. Rev. Biochem.- 2001,- V. 70,- P. 603-647.

98. Giese, K.C. Changes in Oligomerization Are Essential for the Chaperone Activity of a Small Heat Shock Protein in Vivo and in Vitro / K.C. Giese, E. Vierling // J. Biol. Chem.- 2002.- V.277.- P.46310-46318.

99. Giraudat, J. Isolation of the Arabidopsis AJ3I3 Gene by Positional Cloning / J. Giraudat, B.M. Hauge, C. Valon, J. Sraalle, F. Parcy, H.M. Goodman // Plant Cell.-1992,- V. 4,- P. 1251-1261.

100. Goyal, K. LEA proteins prevent protein aggregation due to water stress / K. Goyal, L. J. Walton, A. Tunnacliffe // Biochem. J.- 2005.- V. 388,- P. 151-157.

101. Guillot-Salomon, T. Phosphlipids and polypeptides in the outer membrane of maize mitochondria / T. Guillot-Salomon, R. Remy, C. Cantrel, C. Demandre, F. Moreau // Phytochemistry.- 1997,- V44.- P.29-43.

102. Guo, S.J. Overexpression of CaHSP26 in transgenic tobacco alleviates photoinhibition of PSII and PSI during chilling stress under low irradiance / S.J. Guo, H.Y. Zhou, X.S. Zhang, X.G. Li, Q.W. Meng // J. Plant Physiol.- 2007,- V. 164,- P. 126-136.

103. Guo, S.J. Overexpression of CaHSP26 in transgenic tobacco alleviates photoinhibition of PSII and PSI during chilling stress under low irradiance / S.J. Guo, H.Y. Zhou, X.S. Zhang, X.G. Li, Q.W. Meng // J. Plant Physiol.- 2007,- V. 164,- P. 126-136.

104. Gustavsson, N. Methionine sulfoxidation of the chloroplast small heat shock protein and conformational changes in the oligomer / N. Gustavsson, U. Harndahl, A. Emanuelsson, P. Roepstorff, C. Sundby // Protein Sci.- 1999.- V. 8,- P. 2506-2512.

105. Gyorgyey, J. Alfalfa heat shock genes are differentially expressed during somatic embryogenesis / J. Gyorgyey, A. Gartner, K. Nemeth, Z. Magyar, H. Hirt, E. Heberle-Bors, D. Dudits // Plant Mol. Biol.- 1991,- V. 16,- P. 999-1007.

106. Hajek, T. Identification of stress-induced mitochondrial proteins in cultured tobacco cells / T. Hajek, D. Honys, E. Witters, V. Capkova // Physiol. Plant.- 2005.-V. 124,-P. 12-24.

107. Hancock, J.T. Cell signalling following plant/pathogen interactions involves the generation of reactive oxygen and nitrogen species / J.T. Hancock, R. Desikan, A. Clarke, R.D. Hurst, S.J. Neill // Plant Physiol. Biochem. 2002,- V. 40,- P. 611-617.

108. Hartl, F.U. Molecular chaperones in cellular protein folding / F.U. Hartl // Nature.- 1996.- V. 381,- P. 571-580.

109. Hartman, D. J. Heat shock proteins of barley mitochondria and chloroplasts Identification of organellar hsp 10 and 12: putative chaperonin 10 homologues / D. J. Hartman, D. Dougan, N. J. Hoogenraad, P.B. Hoj // FEBS Lett.- 1992,- V. 29,- P. 147-150

110. Haslbeck, M. Hsp26: a temperature-regulated chaperone / M. Haslbeck, S. Walke, T. Stromer, M. Ehmsperger, H.E. White, S. Chen, H.R. Saibil, J. Buchner // EMBO J.- 1999,- V. 18,-P. 6744-6751.

111. Hatsugai, N. A plant vacuolar protease, VPE, mediates viruses-induced hypersensitive cell death / N. Hatsugai, M. Kuroyanagi, K. Yamada, T. Meshi, S. Tsuda, M. Kondo, M. Nishimura, I. Hara-Nishimura // Science.- 2004.- V. 305.- P. 855-858.

112. He, J.X. Effects of water stress on the cyanide-resistant respiration and expression of the alternative oxidase gene in wheat seedlings / J.X. He, Z. Q. Wei, H.H. Lin, H. G. Liang//ActaBot Sin.- 1999,- V. 41,- P. 340-342.

113. Heber, U. Effect of freezing of biological membranes in vivo and in vitro / U. Heber, L. Tyankova, K.A. Santarius // Biochem. Biophys. Acta.- 1973,- V.291.- P.23-37.

114. Heckathorn, S.A. Chloroplast small heat-shock proteins protect photosynthesis during heavy metal stress / S. A. Heckathorn, J. K. Mueller, S. LaGuidice, B. Zhu, T. Barrett, B. Blair, Y. Dong // Am. J. Botany.- 2004.- V. 91.- P. 1312 -1318.

115. Heckathorn, S.A. The Small, Methionine-Rich Chloroplast Heat-Shock Protein Protects Photosystem II Electron Transport during Heat Stress / S.A. Heckathorn, C.A. Downs, T.D. Sharkey, J.S. Coleman // Plant Physiol.- 1998,- V. 116,- P. 439444.

116. Helenius, A. Solubilization of membranes by detergents / A. Helenius, K. Simons // Biochem. Biophys. Acta.- 1975.- V. 41.- P. 29-79.

117. Helm, K.W. An Endomembrane-Localized Small Heat-Shock Protein from Arabidopsis thaliana / K.W. Helm, J. Schmeits, E. Vierling // Plant Physiol.- 1995.-V. 107.- P.287-288.

118. Helm, K.W. Expression and Native Structure of Cytosolic Class II Small Heat-Shock Proteins / K.W. Helm, G.J. Lee, E. Vierling // Plant Physiol.- 1997,- V. 114,- P. 1477-1485.

119. Helm, K.W. Localization of small heat shock proteins to the higher plant endomembrane system / K.W. Helm, P.R. LaFayette, R.T. Nagao, J.L. Key, E. Vierling//Mol. Cell Biol.- 1993.-V. 13.-P.238-247.

120. Hendrick, J.P. The role of molecular chaperones in protein folding / J.P. Hendrick, F.-U. Hartl // FASEB J.- 1995,- V. 9,- P. 1559-1569.

121. Howarth, C.J. Molecular responses of plants to an increased incidence of heat shock/C.J. Howarth//Plant Cell Environ.-1991,-V. 14,-P. 831-841.

122. Hsieh, M.-H. Class of Soybean Low Molecular Weight Heat Shock Proteins : Immunological Study and Quantitation / M.-H. Hsieh, J.-T. Chen, T.-L. Jinn, Y.-M. Chen, C.-Y. Lin // Plant Physiol.- 1992,- V. 99,- P. 1279-1284.

123. Jagtap, V. Comparative effect of water, heat and light stresses on photosynthetic reactions in Sorghum bicolor (L.) Moench. / V. Jagtap, S. Bhargava, P. Streb, J. Feierabend//J. Exp. Bot.- 1998,- V. 49.- P. 1715-1721.

124. Jiao, W. Small heat-shock proteins function in the insoluble protein complex / W. Jiao, P. Li, J. Zhang, H. Zhang, Z. Chang // Biochem. Biophys. Res. Commun.-2005.- V. 335,- P. :227-231.

125. Jinn, T. L. Stabilization of Soluble Proteins in Vitro by Heat Shock Proteins-Enriched Ammonium Sulfate Fraction from Soybean Seedlings / T. L. Jinn, Y. C. Yeh, Y. M. Chen, C. Y. Lin // Plant Cell Physiol.- 1989.- V. 30.- P. 463-469.

126. Joshi, C.P. Expression of a Unique Plastid-Localized Heat-Shock Protein Is Genetically Linked to Acquired Thermotolerance in Wheat / C.P. Joshi, N.Y. Klueva, K.J. Morrow, H.T. Nguyen // TAG.- 1997,- V.95.- P.834-841.

127. Kim, R. Small heat shock protein of Methanococcus jannaschii, a hyperthermophile / R. Kim, K.K. Kim, H. Yokota, S.-H. Kim // Proc. Natl. Acad. Sci.U. S. A.- 1998,- V. 95,- P. 9129-9133.

128. Kirschner, M. Transient expression and heat-stress-inducedco-aggregation of endogenous and heterologous small heat-stress proteins in tobacco protoplasts / M. Kirschner, S. Winkelhaus, J.M. Thierfelder, L. Nover // Plant J.- 2000.- V. 24.- P. 397-411.

129. Korotaeva, N.E. Mitochondrial low-molecular-weight heat shock proteins and thermotolerance of maize mitochondria / N.E. Korotaeva, A.I. Antipina, O.I. Grabelnych, N.N. Varakina, V.K. Voinikov // Maydica.- 2001,- V. 46.- P. 239-244.

130. Maestri, E. Molecular genetics of heat tolerance and heat shock proteins in cereals / E. Maestri, N. Klueva, C. Perrotta, M. Gulli, H.T. Nguyen, N. Marmiroli // Plant Mol. Biol.- 2002.- V. 48,- P. 667-681.

131. Malik, M.K. Modified expression of a carrot small heat shock protein gene, Hspl7.7, results in increased or decreased thermotolerance / M.K. Malik, J.P. Slovin, C.H. Hwang, J.L. Zimmerman // Plant J.- 1999.- V. 20,- P. 89-99.

132. Miernyk, J.A. The 70kDa stress-related proteins as molecular chaperones / J.A. Miernyk // Trends Plant Sci.- 1997.- V. 2, P. 180-187.

133. Moller, I.M. Plant mitochondria and oxidative stress: electron transport, NADPH turnover, and metabolism of reactive oxygen species / I.M. Moller // Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol.- 2001,- V. 52,- p. 561-591.

134. Moore, A.L. The regulation and nature of the cyanide-resistant alternative oxidase of plant mitochondria / A.L. Moore, J.N. Siedow // Biochim. Biophys. Acta.-1991,-V. 1059.-P. 121-140.

135. Morimoto, R.I. Regulation of the heat shook transcriptional response: cross talk between a family of heat shock factors, molecular chaperones, and negative regulators / R.I. Morimoto // Genes Dev.- 1998,- V. 12,- P. 3788-3796.

136. Morrow, G. Differences in the chaperone-like activities of the four main small heat shock proteins of Drosophila melanogaster / G. Morrow, J.J. Heikkila, R.M. Tanguay // Cell, Stress Chaperones.- 2006.- V.l 1.- P. 51-60.

137. Nakashima, K. Régulons involved in osmotic stress-responsive and cold stress-responsive gene expression in plants / K. Nakashima, K. Yamaguchi-Shinozaki // Physiol. Plant.- 2006.- V. 126.- P. 62-71.

138. Neuwald, A.F. AAA+: a class of chaperone-like ATPases associated with the assembly, operation and disassembly of protein complexes / A.F. Neuwald, L. Aravind, J.L. Spouge, E.V. Koonin // Genome Res.- 1999.- V. 9,- P. 27^13.

139. Nicholls, D. Some recent advances in mitochondrial calcium transport / D. Nicholls // Trends Biochem. Sci.- 1981,- V.6.-P. 36-38.

140. Nieto-Sotelo, J. Absence of heat shock protein synthesis in isolated mitochondria and plastids from maize / J. Nieto-Sotelo, T.H. Ho // J. Biol. Chem.-1987.-V. 262,-P. 12288-12292.

141. No ver, L. Arabidopsis and the heat stress transcription factor world: how many heat stress transcription factors do we need? / L. No ver, K. Bharti, P. Doring, S.K. Mishra, A. Ganguli, K.D. Scharf// Cell Stress Chaperones.- 2001.- V. 6,- P. 177-89.

142. Nover, L. Cytoplasmic heat shock granules are formed from precursor particles and are associated with a specific set of mRNAs / L. Nover, K.-D. Scharf, D. Neumann//Mol. Cell Biol.- 1989,- V. 9.-P. 1298-1308.

143. Ogura, T. AAA+ superfamily ATPases: common structure-diverse function / T. Ogura, A.J. Wilkinson // Genes Cells.- 2001,- V. 6.- P. 575-597.

144. Orvar, B.L. Early steps in cold sensing in plant cells: the role of actin cytoskeleton and membrane fluidity / B.L. Orvar, V. Sangwan, F. Omann, R.S. Dhindsa // Plant J.- 2000,- V. 23,- P. 785-794.

145. Papa S. Reactive oxygen species, mitochondria, apoptosis and aging / S. Papa, V. Skulachev //Mol. Cel. Biochem.- 1997.- V.174.- P. 305-319.

146. Park, S.-Y. Heat-Shock Response in Heat-Tolerant and Nontolerant Variants of Agrostis palustris Huds / S.-Y. Park, R. Shivaji, J.V. Krans, D.S. Luthe // Plant Physiol.-1996.-V. 111.- P. 515-524.

147. Peres Ben-Zvi, A. Mechanisms of disaggregation and refolding of stable protein aggregates by molecular chaperones / A. Peres Ben-Zvi, P. Goloubinoff // J. Biol. Chem.- 2001,- V.135.- P.84-93.

148. Pla, M. Stress proteins co-expressed in suberized and lignified cells and in apical meristems / M. Pla, G. Huguet, D. Verdaguer, P. Puigderrajols, B. Lompart, A. Nadal, M. Molinas // Plant Sci.- 1998,- V. 139,- P. 49-57.

149. Plater, M.X. Effects of Site-directed Mutations on the Chaperone-like Activity of aB-Crystallin / M.X. Plater, D. Goode, M.J.C. Crabbe // J. Biol. Chem.- 1996.- V. 271,- P. 28558-28566.

150. Pratt, W.B. Hsp90-binding immunophilins in plants: the protein mover / W.B. Pratt, P. Krishna, L.J. Olsen //. Trends Plant Sci.- 2001,- V. 6,- P. 54-58.

151. Puigderrajols, P. Developmentally and stress-induced small heat shock proteins in cork oak somatic embryos / P. Puigderrajols, A. Jofre, G. Mir, M. Pla, D. Verdaguer, G. Huguet, M. Molinas // J. Exp. Bot.- 2002,- V. 53,- P. 1445 1452.

152. Ramanjulu, S. Drought- and desiccation-induced modulation of gene expression in plants / S. Ramanjulu, D. Bartels // Plant, Cell Environ.- 2002.- V. 25.-P. 141-151.

153. Ribas-Carbo, M. Effects of Water Stress on Respiration in Soybean Leaves / M. Ribas-Carbo, N. L. Taylor, L. Giles, S. Busquets, P. M. Finnegan, D. A. Day, H. Lambers, H. Medrano, J. A. Berry, J. Flexas // Plant Physiol.- 2005,- V. 139.- P. 466 -473.

154. Richter, K. Hsp90: chaperoning signal transduction / K. Richter, J. Buchner // J. Cell. Physiol.- 2001,- V. 188.- P. 281-290.

155. Roberts, T.H. Direct evidence for the presence of two external NAD(P)H-dehydrogenases coupled to the electron transport chain in plant mitochondria / T.H. Roberts, K.M. Fredlund, I.M. Moller // FEBS Lett.- 1995,- V. 373,- P. 307-309.

156. Rojas, A. Transcriptional activation of a heat shock gene promoter in sunflower embryos: synergism between ABI3 and heat shock factors / A. Rojas, C. Almoguera, J. Jordano // Plant J.- 2002,- V.20.- P.601-610.

157. Ronde, J.A.D. Effect of antisense L--pyrroline-5-5 carboxylate reductase transgenic soybean plants subjected to osmotic and drought stress / J.A.D. Ronde, M.H. Spreeth, W.A. Cress // Plant Growth Reg.- 2000,- V.25.- P. 13-26.

158. Sabehat, A. Expression of Small Heat-Shock Proteins at Low Temperatures. A Possible Role in Protecting against Chilling Injuries / A. Sabehat, S. Lurie, D. Weiss // Plant Physiol.- 19%.- V. 117,-P. 651 -658.

159. Sangwan, V. Cold-induction of Brassica napus gene, BN115, is mediated by structural changes in the membrane and cytoskeleton and requires Ca2+ influx / V. Sangwan, I. Foulds, J. Singh, R.S. Dhindsa // Plant J.- 2001.-V. 21.- P. 1-12.

160. Schmidt, A. Signaling to the actin cytoskeleton / A. Schmidt, M.N. Hall // Annu. Rev. Cell Dev. Biol.- 1998.- V. 14,- P. 305-338.

161. Schoffl, F. Regulation of the Heat-Shock Response / F. Schoffl, R. Prandl, A. Reindl // Plant Physiol.- 1998,- V. 117,- P. 1135-1141.

162. Skulachev, V. Cytochrome c in the apoptic and antioxidant cascades / V. Skulachev // FEBS Lett.- 1998,- V. 423.- P.275-280.

163. Smykal, P. Chaperone activity of tobacco HSP18, a small heat-shock protein, is inhibited by ATP / P. Smykal, J. Malin, I. Hrdy, I. Konopasek, V. Zarsky // Plant J.-2000,- V. 23,- P.703-713.

164. Soole, K.L. Functional molecular aspects for the NADH dehydrogenases of plant mitochondria / K.L. Soole, R.I. Menz // J. Bioenerg. Biomembr.- 1995.- V.27.-P. 397-406.

165. Sticher, L. Heat shock inhibits a-amylase synthesis in barley aleurone without inhibiting the activity of endoplasmic reticulum marker enzymes / L. Sticher, A.K. Biswas, D.S. Bush, R.L. Jones // Plant Physiol.- 1990,- V.92.- P.506-513.

166. Sun, W. At-HSP17.6A, encoding a small heat-shock protein in Arabidopsis, can enhance osmotolerance upon overexpression / W. Sun, C. Bernard, B. van de Cotte, M. Van Montagu, N. Verbruggen // Plant J.- 2001,- V.27.-P.407-415.

167. Sun, W. Small heat shock proteins and stress tolerance at plants / W. Sun, M. Van Montagu, N. Verbruggen // Biochim. Biophys. Acta.- 2002.- V.1577.- P. 1-9.

168. Suzuki, K. Mitochondrial small heat-shock protein enhances thermotolerance in tobacco plants / K. Suzuki, M. Shono, Y. Egawa, K. Sanmiya // FEBS Letters.-2004.- V.557.- P.265-268.

169. Suzuki, K., Mitochondrial small heat-shock protein enhances thermotolerance in tobacco plants / Suzuki, K., Shono, M., Egawa, Y., Sanmiya, K. // FEBS Letters.-2004.- V. 551.- P. 265-268.

170. Taylor N. L. Environmental Stress Causes Oxidative Damage to Plant Mitochondria Leading to Inhibition of Glycine Decarboxylase / N. L. Taylor, D. A. Day, A. Millar // J. Biol. Chem.- 2002,- V. 211.- P. 42663-42668.

171. Taylor, N. L. Differential Impact of Environmental Stresses on the Pea Mitochondrial Proteome / N. L. Taylor, J. L. Heazlewood, D. A. Day, A. H. Millar // Mol. Cellular Proteom.- 2005.- V. 4:- P. 1122-1133.

172. Timmons, T.M. Protein Blotting and Immunodetection / T.M. Timmons, B.S. Dunbar//Meth. inEnzymol.- 1990,- V. 182,- P. 679-688.

173. Tolbert, N.E. Isolation of Sub-cellular Organelles of Metabolism on Isopicnic Sucrose Gradients / N.E. Tolbert // Methods Enzymol.- 1974,- V. 31,- P. 734-746.

174. Vianello, A. Plant mitochondrial pathway leading to programmed cell death / A. Vianello, M. Zancani, C. Peresson, E. Petrussa, V. Casolo, J. Krajnakova, S. Patui, E. Braidot, F. Macri // Physiol. Plant.- 2007.- V.129.- P.242-252.

175. Vierling, E. The roles of heat shock proteins in plant / E. Vierling // Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol.-1991,- V. 42,-P. 579-620.

176. Vigh, L. Membrane-regulated stress response: a theoretical and practical approach / L. Vigh, Z. Torok, G. Balogh, A. Glatz, S. Piotto, I. Horvath // Adv. Exp. Med. Biol.- 2007,- V.594.- P. 114-131.

177. Voinikov, V.K. Maize seedlings accumulate smHSPs in response to water stress but not to treatment by an oxygen radical generating agent / V.K. Voinikov, G.B. Borovskii, N.E. Korotaeva // Maize Genetics Cooperation Newsletter.- 2003.-V.77.- P.34-35.

178. Volkov, R.A. Heat stress-induced H202 is required for effective expression of heat shock genes in Arabidopsis / R.A. Volkov, I.I. Panchuk, P.M. Mullineaux, F. Schoffl // Plant Mol. Biol.- 2006,- V.61.- P.733-746.

179. Volkov, R.A. Small heat shock proteins are differentially regulated during pollen development and following heat stress in tobacco / R.A. Volkov, I.I. Panchuk, F. Schoffl // Plant Mol. Biol.- 2005,- V.57.- P.487-502.

180. Wang W. Role of plant heat-shock proteins and molecular chaperones in the abiotic stress response / W. Wang, B. Vinocur, O. Shoseyov, A. Altman // TRENDS in Plant Science.- 2004.- V. 9.- P. 244-252.

181. Waters, E.R. Evolution, structure and function of the small heat shock proteins in plants / E.R. Waters, G.J. Lee, E. Vierling // J. Exp. Bot.- 1996.- V.47.- P.325-338.

182. Waters, E.R. The Molecular Evolution of the Small Heat-Shock Proteins in Plants / E.R. Waters // Genetics.- 1995.- V.141.- P.785-795.

183. Wehmeyer, N. Synthesis of Small Heat-Shock Proteins Is Part of the Developmental Program of Late Seed Maturation / N. Wehmeyer, L.D. Hernandez, R.R. Finkelstein, E. Vierling // Plant Physiol.- 1996,- V.l 12,- P.747-757.

184. Wehmeyer, N. The Expression of Small Heat Shock Proteins in Seeds Responds to Discrete Developmental Signals and Suggests a General Protective Role in Desiccation Tolerance /N. Wehmeyer, E. Vierling //Plant Physiol.- 2000.- V.122.-P. 1099-1108.

185. Whelan, J. Sorting of precursor protein between isolated spinach leaf mitochondria and chloroplasts / J. Whelan, C. Knorpp, E. Glaser // Plant Mol. Biol-1990.-V. 14,-P. 977-982.

186. Wu, C. Heat Shock Transcription Factors: Structure and Regulation / C. Wu // Annu. Rev. Cell Dev. Biol.- 1995.- V.l 1,- P.441-469.

187. Xiao, H. Germline transformation used to define key features of heat-shock response elements / H. Xiao, J.T. Lis // Science.- 1988,- V.239.- P. 1139-1142.

188. Xiong, L. Molecular and genetic aspects of plant responses to osmotic stress / L. Xiong, J.-K. Zhu // Plant, Cell Environ.- 2002,- V.25.- P. 131-139.

189. Yoneda, T. Compartment-specific perturbation of protein handling activates genes encoding mitochondrial chaperones / T. Yoneda, C. Benedetti, F. Urano, S.G. Clark, H.P. Harding, D. Ron // J. Cell Science.- 2004,- V.l 17.- P.4055-4066.

190. Young, J.C. Hsp90: a specialized but essential proteinfolding tool / J.C. Young, I. Moarefi, F. U. Hartl // J. Cell Biol.- 2001.- V. 154,- P. 267-273.

191. Zhang, X.-P. Interaction of plant mitochondrial and chloroplast signal peptides with Hsp70 molecular haperone / X.-P. Zhang, E. Glaser // Trends Plant Sci.- 2002.-V. 7,-P. 14-21.

192. Zhang, C. Co-immunoprecipitation of HsplOl with cytosolic Hsc70 / C. Zhang, C. Guy// Plantphysiol. biochem.- 2005,- V. 43,- P.13-18.

193. Zietkiewicz, S. Successive and synergistic action of the Hsp70 and HsplOO chaperones in protein disaggregation / S. Zietkiewicz, J. Krzewska, K. Liberek // J. Biol. Chem.- 2004,- V.279.- P.44376^4383.