Нитритрезистентные бактерии рода Halomonas в процессах аноксического культивирования

Семенова, Екатерина Александровна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Нитритрезистентные бактерии рода Halomonas в процессах аноксического культивирования
ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Нитритрезистентные бактерии рода Halomonas в процессах аноксического культивирования"

На правах рукописи

СЕМЕНОВА ЕКАТЕРИНА АЛЕКСАНДРОВНА

НИТРИТРЕЗИСТЕНТНЫЕ БАКТЕРИИ РОДА НАЬОМОМАБ В ПРОЦЕССАХ АНОКСИЧЕСКОГО КУЛЬТИВИРОВАНИЯ

03.00.23 - биотехнология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

П2/ХР2С:3

Уфа-2009

003466228

Работа выполнена в лаборатории прикладной микробиологии Учреждения Российской академии наук Института биологии Уфимского научного центра РАН (ИБ УНЦ РАН)

Научный руководитель: кандидат биологических наук, доцент

Усанов Николай Глебович

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Киреева Наиля Ахняфовна

доктор биологических наук, профессор Чернов Владислав Моисеевич

Ведущая организация: Учреяедение Российской академии

наук Институт экологии и генетики микроорганизмов Уральского отделения РАН (г. Пермь)

Защита диссертации состоится 24 апреля 2009 года в 14.00 часов на заседании Объединенного диссертационного совета ДМ 002.136.01 при Учреждении Российской академии наук Институте биологии Уфимского научного центра РАН по адресу: 450054, г. Уфа, проспект Октября, д. 69. Тел. (347) 235-62-47 E-mail: ib@anrb.ru

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Учреждения Российской академии наук Института биологии Уфимского научного центра РАН и на официальном сайте http://www.anrb.ru/inbio/sovet.html

Автореферат разослан 20 марта 2009 г.

Ученый секретарь Объединенного диссертационного совета, кандидат биологических наук, доцент

Р.В.Уразгильдин

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Промышленные биотехнологические процессы, основанные на использовании микроорганизмов, практически всегда связаны с их культивированием, осуществляемым различными способами. Одним из основных требований, предъявляемых к микробным технологиям, является создание асептических условий, при одновременной подаче и диспергировании в питательной среде свежих порций стерильного кислорода (воздуха) в сочетании с отводом отработанного газа (Капе, 1993; McNeil and Harvey, 2008; Schallmey et al., 2004). Реализация этого требования возможна лишь при использовании сложного технологического оборудования и сопряжена с высокими энергетическими и экономическими затратами. Одним из путей их снижения является использование методов анаэробного культивирования, осуществляемых, например, при ферментации облигатно анаэробных бактерий или микроорганизмов, обладающих бродильным типом метаболизма, архей, дрожжей (Morris, 1994; Stal and Moezelaar, 1997). Недостатком биотехнологий данного типа являются их сравнительно низкие скорость и эффективность. Вместе с тем, известны микроорганизмы, обладающие аэробным типом дыхания, и, одновременно, способные к энергетическому метаболизму при наличии в питательной среде других окислителей, например, нитратов, перхлоратов (Stal and Moezelaar, 1997; Straub et al., 2000; Zumft, 1992). Процессы их ферментации относятся к аноксическим и применяются, главным образом, в технологии очистки сточных вод, при этом скорость деления клеток приближается к уровню аэрируемого культивирования (Casella and Payne, 1996; Stepanov and Korpela, 1997). Присутствие NaNOs в среде устраняет необходимость стерильной аэрации и диспергирования воздуха, что приводит к соответствующему снижению затрат. Вместе с тем, для получения высоких конечных концентраций биомассы в аноксиче-ских процессах требуются значительные стартовые концентрации окислителя в среде, например, нитратов. С другой стороны, восстановление нитратов микроорганизмами до газообразного азота происходит с образованием и промежуточным накоплением в среде токсичных нитритов, способных ингибировать рост рабочей культуры в очень низких концентрациях - 0,05 - 0,1% NaN02 (Chung et al., 2004). Таким образом, использование метаболизма полной денитрификации в классическом варианте не целесообразно из-за низких результирующих концентраций клеток. Сравнительно недавно (Усанов с соавт., 2002, 2003) обнаружены алкало-гапотолерантные микроорганизмы, относящиеся к роду Halomonas (Vree-land et al., 1980), устойчивые к высоким концентрациям нитритов и осуществляющие активную денитрификацию N03" и N02" до газообразного

азота. Представляется вероятным и возможным их использование в качестве базовых культур (хостов) для генетической модификации, что позволит осуществлять их культивирование без применения аэрации воздухом, заменив его адекватными концентрациями NaNC^. Можно предположить, что вследствие высокой токсичности нитрита, который неизбежно будет накапливаться в среде, подобные системы будут устойчивы к контаминации. В этом случае процесс культивирования можно будет осуществлять в биореакторах упрощенного типа, представляющих собой герметичную емкость с устройством для термостатирования, снабженных маломощной циркуляционной мешалкой, что, в свою очередь, приведет к значительному снижению капитальных, эксплуатационных и энергетических затрат.

Цель исследования

Выделение и изучение нитритрезистентных бактерий рода Halo-monas для процессов аноксической ферментации и получения рекомби-нантных белков в условиях неингибированного нитратного и нитритного дыхания.

Задачи исследования

1. Выделить из природных ниш обитания культуры денитрифицирующих бактерий, способные к активному аноксическому росту на минимальных субстратах (цитрат натрия) в присутствии высоких концентраций нитратов и нитритов, определить их таксономическое положение с использованием современных методов сравнительного филогенетического анализа структуры 16S рРНК.

2. Изучить физиологические и биохимические свойства, а также денитрифицирующую активность выделенных штаммов, их устойчивость к высоким концентрациям токсичных нитритов, выявить перспективные рабочие изоляты бактерий, способных к активному аноксическому дыханию.

3. Подобрать модельный вектор, кодирующий зеленый флуоресцентный белок, и провести трансформацию одного из активных изолятов рекомбинантной ДНК, испытать его в режиме периодической и проточной ферментации.

4. Изучить поведение культур наиболее активных денитрифика-торов в моделях технологии очистки образцов питьевой воды из подземных источников, загрязненной анионами нитратов и нитритов.

Научная новизна

Впервые обнаружены два типа акцепции нитрит анионов, используемых в качестве единственного акцептора электронов при росте культур денитрификаторов рода Halomonas в средах с высокой щелочностью (рН>9) - диффузия и активный транспорт.

Для обозначения предположительно новой группы денитрифика-торов, способных к активной акцепции N02", предложен термин "нитри-тофильные" культуры.

Определены полные последовательности гена 16S рРНК для 5 изолятов галомонад, проведена реконструкция моделей филогенетических древ и определено их положение в роду Halomonas.

Подобраны условия трансформации культуры рода Halomonas sp. IB-G4 плазмидой pHS15G2, несущей ген зеленого флуоресцентного белка (GFP), в результате чего получены 4 клона трансформантов.

Впервые проведена трансформация денитрификаторов рода Halomonas рекомбинантной ДНК без использования хелперной плазми-ды.

Качественно показана экспрессия плазмиды в хосте в процессе аноксического культивировании трансформанта G4.4 в условиях неинги-бированного нитратного и нитритного дыхания.

Практическая значимость

Создана коллекция штаммов Halomonas, развивающихся в анок-сических условиях на минимальном субстрате (цитрате), способных к одновременному активному росту и денитрификации в присутствии высоких концентраций нитрита натрия (до 8% масс.).

Полные последовательности генов 16S рРНК пяти культур депонированы в базе данных EMBL (European Molecular Biology Laboratory )/GenBank и доступны в сети Internet (http://vvwvv.ncbi.nlm.nih.gov) под номерами АМ490135, АМ490136, АМ490137, AM490I38, АМ490139.

Установлены кинетические параметры аноксического культивирования штамма Halomonas sp. IB-G4 в присутствии нитрата или нитрита в качестве единственного акцептора электронов - максимальная удельная скорость роста на нитрате цтах = 0,8 ч"1, на нитрите цгаах = 0,9 ч"'.

Показана принципиальная возможность и перспективность применения нитритофильных галомонад в процессах тонкой очистки питьевой воды, загрязненной анионами нитратов и нитритов.

Апробация работы

Материалы диссертации представлены на ряде научных форумов: межвузовской научно-технической конференции «Актуальные проблемы технических, естественных и гуманитарных наук» (Уфа, 2006), XIV Международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов» (Москва, 2007), межрегиональной школе-конференции «Биомика - наука XXI века» (Уфа, 2007), III Всероссийской научно-практической конференции «Проблемы экологии Южного Урала» (Оренбург, 2007), региональной конференции молодых ученых с международным участием «Современные проблемы экологии, микробиологии и иммунологии» (Екатеринбург - Пермь, 2007), II Международной

школе молодых ученых «Эмбриология, генетика и биотехнология» (Уфа, 2007), Международной научной конференции «Проблемы биоэкологии и пути их решения (Вторые Ржавитинские чтения)» (Саранск, 2008).

Конкурсная поддержка работы

Исследования поддержаны грантом Республики Башкортостан молодым ученым и молодежным научным коллективам «Экономически эффективные системы для получения рекомбинантных белков на основе нитритофильных бактерий рода На1отопазг> (№ 21 от 28.01.2008); грантом Фонда содействия развитию малых форм предприятий в научно-технической сфере «Новая парадигма ферментации» (№ ГР 01200850086) по программе «Участник молодежного научно-инновационного конкурса» («У.М.Н.И.К.»).

Публикации

По теме диссертации опубликовано 12 работ, в том числе 1 - в журнале, рекомендованном ВАК РФ для публикаций материалов кандидатских работ.

Структура и объем диссертации

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, изложения результатов, выводов, приложений и списка цитируемой литературы, содержащего 241 ссылку. Работа изложена на 154 страницах машинописного текста, содержит 28 рисунков и 17 таблиц.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Микроорганизмы. Объектами исследования служили галоалка-лофильные нитриттолерантные бактерии рода На1отопа5 из коллекции Института биологии УНЦ РАН, а также вновь выделенные из природных мест обитания изоляты.

Скрининг и культивирование. Выделение из почвенных образцов нитритрезистентных бактерий, предположительно относящихся к роду На1отопа$, осуществляли методом накопительных культур в анаэробных условиях на селективных средах с последующим пассажирова-нием для получения чистой культуры. Селективные среды, обозначенные СР (СвР), имели следующий состав, г/л: дрожжевой экстракт - 10 (цитрат натрия - 15), К.Н2Р04 - 4, №2СОз - 2, №С1 - 10, - 20; рН 9,2 -9,4. Дальнейшее исследование полученных культур проводили на аналогичных питательных средах при температуре 30 - 37°С. Аноксический рост культур изучали в специальных стеклянных пробирках с завинчивающимися крышками, заполненных до верха питательной средой. Аэробное культивирование проводили в конических колбах объемом 250

мл на воздушно-термостатируемых качалках типа УВМТ-12-250 при скорости перемешивания 150 - 200 об/мин.

Морфология клетки. Морфологию, подвижность и размеры клеток исследовали с помощью фазовой оптической и сканирующей зондо-вой микроскопии на микроскопах Carl Zeiss (Германия) и Solver Pro-M (NT-MDT, г. Зеленоград, Россия).

Фенотипическая характеристика. Изучение физиолого-биохимических характеристик исследуемых микроорганизмов проводили, руководствуясь требованиями к описанию новых групп бактерий семейства Halomonadaceae (Arahal et al., 2007), а также методами, описанными в руководствах: «Определитель бактерий Берджи» (1997), «Методы общей бактериологии» (Герхардт и др., 1984), «Практикум по микробиологии» (Нетрусов и др., 2005).

Филогенетический анализ. Выделение ДНК проводили методом фенольной экстракции (Wilson, 2001). Последовательности 16S рРНК генов (1463 - 1507 п.о.) были получены методом ПЦР, с использованием концевых праймеров 16SF27 и 16SR1512 и реакционной смеси, содержащей стандартные концентрации дНТФ и Год-полимеразы (Fermentas, Литва) и ДНК-матрицу. Полимеразную реакцию проводили в амплифи-каторе MasterCycler Personal (Eppendorf, Германия). Секвенирование гена 16S рРНК проводили на секвенаторе Perkin-Elmer ABI PRISM™ 373 с использованием универсальных для большинства прокариот праймеров. Анализ полученных последовательностей штаммов IB-NN3-2c, IB-OI8, IB-07-1, IB-07-6, IB-G4 и построение филогенетических древ были выполнены с помощью программ BioEdit (Hall, 2007) и TREECON (Van de Peer and De Wächter, 1994).

Трансформация плазмидной ДНК. Для трансформации штамма Halomonas sp. IB-G4 использовали плазмидный вектор pHS15G2, любезно предоставленный профессором Constantin Drainas (University of Io-annina Department of Chemistry Biochemistry Lab, Греция). Трансформацию проводили методом электропорации в электропораторе MicroPulser (Bio-Rad, США). Компетентные клетки подвергали действию электрического импульса напряжением 2,5 кВ в течение 5 мсек. Напряженность электрического поля составила 12,5 кВ/см.

Ферментация. Аноксическое культивирование рабочего штамма галомонад проводили в непрерывном и периодическом режиме в стеклянном реакторе с рабочим объемом 160 мл, оборудованном магнитной мешалкой (60 - 100 об/мин), насосами подачи стерильной питательной среды и отбора культуральной жидкости, рубашкой для поддержания постоянной температуры, а также патрубком для отвода образующегося азота.

Определение анионного состава. Качественный и количественный анализ анионного состава образцов воды и культуральной жидкости проводили методом высокоэффективного капиллярного электрофореза (ВЭКЭФ) на приборе АКИ «Нанофор 01» (г. Санкт-Петербург, Россия), в кварцевом капилляре длиной / = 75см, внутренний диаметр dBH = 70 мкм; при рабочем напряжении 11 кВ; детектирование - непрямое в ультрафиолетовой области с длиной волны X = 254 нм; буферный раствор — хроматный электролит (5 мМ оксида хрома (VI), 20 мМ диэтаноламина, 1,65 мМ М-цетил-]\[,1Ч,]\[-триметиламмония бромида). Статистически достоверная чувствительность метода по нитрит аниону составляла 0,5 мг/л.

Статистическая обработка экспериментальных данных. Статистическую обработку результатов экспериментов проводили стандартными методами дисперсионного и корреляционного анализа с помощью программы Microcal Origin 7.5 Pro.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Выделение из природных источников нитритрезистентных культур рода Halomonas, их морфологическая и физиолого-биохимическая характеристика

Скрининг денитрифицирующих бактерий, предположительно относящихся к роду Halomonas, проводили методом накопительных культур на жидких щелочных средах в анаэробных условиях. Фактором селекции служил NaN02, вносимый в питательную среду в качестве акцептора электронов в концентрации 2% масс. Накопительные культуры инкубировали при 37°С, 48 ч. Пробы, демонстрирующие активное образование газообразного азота, высевали на щелочной питательный агар. Было обследовано 24 природных образца, включавших пробы чернозема (Челябинская и Кировская обл.), песка и литорального грунта с прибрежных зон Красного и Черного морей, ила со дна содовых и соленых озер (Республика Бурятия и Оренбургская обл.), почвы, отобранные в районах горячих источников (Республика Бурятия и Камчатка). Всего были выделены 21 денитрифицирующий изолят: 10 на богатой

Рисунок 1. Клетки нитритрези-стентной культуры Halomonas sp. IB-G4.

Таблица 1. Сравнительная фенотипическая характеристика некоторых нитритрезистентных изолятов, классических видов рода Halomonas (H. elongata, H. variabilis) и денитрифицирующих галомонад, имеющих наиболее высокое сродство по 16S рДНК (Н. desiderata, H. halodenitrificans)

Характеристика IB-I6' IB-G4 IB-07-6 1В-018 IB-NN3-2с IB-07-1 H. elongata2 Н. variabilis1 H. desiderata1 H. halodenitrificans1

Морфология палочки палочки палочки палочки палочки палочки палочки палочки палочки палочки

Подвижность + + + + + + + + + -

Пигментация беж. прозрач. бел. бел. беж. бел. бел. беж. беж. беж.

Окраска по Граму - - - - - — - —

Факульт. анаэроб ■ + ■ + + + + - + +

Каталаза + + + + + + НД НД + НД

Восстановление N03" до N02" + + + + + + + - + +

Денитрификация + + + + + + - - + +

Потребность в Ыа+, М 0,001 0,051 0,068 0,204 0,034 0,034 НД НД + НД

Диапазон рН 6,5-11,5 7,0-11,5 7,0-11,5 7,0-10,5 7,0-11,5 6,5-11,5 5-10 6-9 7-11 5-10

Температура, °С 6-50 6-48 6-48 6-45 6-48 6-45 4-45 15-37 10-48 5-37

Концентрация №С1, %, рН 9,4 0-18 0,1-18 0,2-15 1-18 0-20 0-20 0-20 1-25 0-18 3-20

Примечание. НД- нет данных; + положительная реакция; - отрицательная реакция. 1 По данным лаборатории прикладной микробиологии ИБ УНЦ РАН. 1 По литературным данным (АгаЬа! е1 а/., 2002;Вегепс1е5 еГ о/., 1996;Ма1а еI а1, 2002).

накопительной среде (субстрат - дрожжевой экстракт) и 11 на минимальном субстрате (с цитратом натрия). Полученные штаммы были объединены в коллекцию нитритрезистентных денитрификаторов и использованы для дальнейшей работы. Все культуры коллекции представляли собой грамотрицательные факультативно анаэробные подвижные палочки размером (0,7^-1,0)х(1,5-^-2,5) мкм (рис. 1), проявлявшие каталазную и оксидазную активность, не сбраживавшие сахара, активно окислявшие спирты, органические кислоты и другие соединения в аноксических условиях в присутствии 1 - 3% NaN02/ NaN03 в качестве единственного акцептора электронов. Одновременно все культуры являлись умеренными галофилами (рост до 20% NaCl) и нуждались в Na+ для роста (исключение составил штамм IB-I6). Температурный интервал и диапазон рН для роста большинства изолятов составляли соответственно + 6 + + 48 °С и рН 7,0 -í- 11,5. Некоторые биохимические и культуральные свойства выделенных нами нитритрезистентных культур и некоторых типовых штаммов рода Halomonas представлены в таблице 1. Учитывая совокупность культурально-морфологических и физиолого-биохимических признаков, все вновь выделенные бактерии предварительно были отнесены к роду Halomonas (Bergey's Manual, 2005; Mata et al., 2002).

Денитрифицирующая активность нитритрезистентных галомонад

Известно, что содержание NaN02 в нейтральных средах (как и NaN03, из которого образуется нитрит) ограничено концентрацией 1,5 -3 г/л (Гильванова и Усанов, 2003; Chung et al., 2004). В отличие от известных денитрификаторов, полученные нами культуры галомонад обладали устойчивостью и способностью к восстановлению сравнительно высоких концентраций нитрита натрия. Максимум содержания NaN02 в средах, на которых наблюдался рост наших изолятов, варьировал в пределах от 30 до 80 г/л (табл. 2), при оптимуме 10-15 г/л.

В процессе определения минимального порога концентрации нитрита, как единственного акцептора электронов, было обнаружено, что 13 изолятов способны к аноксическому росту и денитрифиции в щелочных условиях даже при низких концентрациях NaN02 (до 0,2 г/л). Все они восстанавливали это соединение до концентраций, не детектируемых методами ВЭКЭФ. Вместе с тем, также были определены 8 изолятов, не способных к росту при содержании нитрита в среде менее 0,2 - 1,0 г/л (табл. 2), но развивающихся при наличии более высоких концентраций этого окислителя. Наиболее требовательным к концентрации нитрита в среде оказался штамм IB-07-6, восстанавливающий NaN02 лишь при его концентрациях в питательных средах выше 2,6 г/л.

Скорость денитрификации для каждой культуры определяли двумя методами: по объему газообразных продуктов (главным образом, N2),

Таблица 2. Рост культур Halomonas sp. в условиях денитрификации

Штамм Диапазон концентраций NaN02, г/л; pH 9,4 Остаточный нитрит1, г/л Штамм Диапазон концентраций NaN02, г/л; pH 9,4 Остаточный нитрит1, г/л

J1 0,1 -50 0 07-1 0,1-80 0

Аг4 1-50 0,7 07-2с 0,1-80 0

559 1-80 1,0 04с 0,1-80 0

16 0,1-50 0 018-1с 1-80 0,8

G4 0,1-80 0 NN2c 0,1-30 0

07-Id 1-80 0,7 NN5c 0,1-80 0

07-5 0,1-80 0 NN3-1C 0,5-50 0,5

07-6 3-50 2,6 NN3-2C 0,1-80 0

018 0,5 - 80 0,5 Sic 0,1-50 0

018-3 0,2-30 0,16 S9c 0,1-30 0

SL3c 0,1-80 0

1 Остаточная концентрация нитрит анионов в КЖ после окончания роста культуры.

выделявшихся в результате денитрификации нитрита натрия в заданный промежуток времени и с помощью ВЭКЭФ. В первом случае опыты выполняли в 10 мл стерильных медицинских шприцах, в которые помещали 2 мл инокулированной питательной среды с 10 г/л NaN02 и инкубировали при 37°С. Объем выделившегося газа фиксировали по выдвижению штока. Параметры образования газов различными штаммами представлены в таблице 3.

С целью количественной оценки динамики денитрификации использовали метод ВЭКЭФ, с помощью которого в процессе аноксическо-го роста культуры IB-G4 через равные интервалы времени определяли остаточную концентрацию нитрит анионов в среде. Скорость восстановления нитрита в благоприятных условиях достигала 5,5 мМ N02"An среды в час, что в несколько раз превышало известные значения (Chung et al., 2004; Francis and Mankin, 1977).

На основе полученных данных выявлены штаммы, отличавшиеся высокой скоростью денитрификации нитрита (или нитрата) натрия. Для более подробного изучения процесса аноксического культивирования, а также в качестве предполагаемого хоста для генетической модификации был выбран штамм Halomonas sp. IB-G4. Эта культура активно развивалась на средах, содержащих до 80 г/л NaN02, и обладала высокой скоростью денитрификации, протекавшей до недетектируемых методом ВЭКЭФ концентраций.

Таблица 3. Динамика образования газообразных продуктов культурами На1отопазър. в результате осуществления нитритного дыхания_

Штамм Скорость газообразования, мл/сут Максимальный объем газа, мл Штамм Скорость газообразования, мл/сут Максимальный объем газа, мл

J1 1,6 3,6 07-1 1,0 4,2

Аг4 1,0 2 07-2с 0,8 4,0

559 1,2 2,8 04с 1,0 3,2

16 1,0 3,4 018-lc U 3,4

G4 1,6 3,7 NN2c 1,3 4,1

07-Id 1,0 2,6 NN5c 1,0 3,3

07-5 1,1 3,3 NN3-lc 0,9 3,1

07-6 1,5 3,1 NN3-2c 1,4 4,5

018 1,7 3,8 Sic 0,9 3,7

018-3 1,1 2,1 S9c 0,5 3,3

SL3c 0,5 4,2

Филогенетическая позиция нитритрезистентных бактерий

Согласно полученным данным анализа секвенированных последовательностей гена 16S рРНК все наши культуры входят в у-подгруппу протеобактерий и принадлежат к роду Halomonas. Филогенетические взаимоотношения изолятов нитриттолерантных бактерий с другими га-ломонадами представлены в виде древа на рисунке 2. Обнаружено, что выделенные нами культуры располагаются в третьей группе галомонад "ungrouped Halomonas" (Arahal et al., 2002). Уровень сходства последовательностей 16S рРНК изучаемых изолятов внутри этой выборки находился в пределах 92,5 - 98,4%. Ближайшим родственником для наших штаммов оказался Halomonas desiderata (Berendes et al., 1996) с уровнем сходства последовательностей 98 - 98,4%.

Получение рекомбинантного штамма Halomonas sp. IB-G4 для аноксического культивирования

Для создания модельной системы синтеза рекомбинантного белка мы использовали плазмидный вектор pHS15G2 (Douka et al., 2001), несущий ген внутриклеточного зеленого флуоресцентного белка (GFP). Селектирующим признаком при скрининге трансформантов служила устойчивость к антибиотикам - стрептомицину и ампициллину. В качестве хоста использовали рабочий штамм Halomonas sp. IB-G4, чувствительный к ампициллину и стрептомицину в концентрациях выше 40 мкг/мл.

0.02

100

j— Я. eurihalina (Х87218)

■ Я halmophila (AJ306889) Я. organivorans (AJ616910) 100 г II salina (AJ295145)

1— H. halophila (M93353) H. pacifica (L42616) Я. nitroredusens (EF613113) Я cupida (L42615) - Я. denitrificans (AM229317) H.síiengIiensis(Em\851)

-Я halodenitrificans (L04942)

Я. alimentaría (AF211860) - Я. campaniensis (AJ515365)

-Я. gudaonensis (DQ421808)

-Я cerina (EF613112)

-Я. halocvnthiae (AJ417388)

100 i-H.'subglaciescola (AJ306892)

1-Я. halodurans (L42619)

97j- Я boliviensis (AY245449) 100 -Р-Я. neptunio (AF212202)

100

Я. variabilis (AJ306893) H. venusta (AJ306894)

H. magadiensis (X92150)

100 г Я. meridiana (AJ306891) 1 Я. aguamarina (AJ306888)

■ Halomonas sp. IB-018 ■ Halomonas sp.IB-07-6 i Halomonas sp.IB-559 7 ¿b Halomonas sp.IB-NN3-2c 85" Halomonas sp.IB-G4

-H. pantelleriensis (X93493)

■ Я muralis (AJ320530)

100

■ Я desiderata (X92417)

■ Halomonas sp.IB-I6

" j-Halomonas sp.iB-io

Л100 , Halomonas sp.IB-07-1 ' ''Halomonas nitrilophilus' IB-Ar4 J

• Zymobacter palmae (D14555)

Рисунок 2. Филогенетическая позиция нитритрезистентных культур Halomonas (III группа Halomonas по Arahal et al., 2002).

Были получены 4 клона трансформантов, которые обозначены как IB-G4.4, IB-G4.5, IB-G4.6, IB-G4.7. После трансформации клоны выращивали аноксически на питательной среде GF. Экспрессию GFP наблюдали после инкубации суточной культуры трансформантов при 4 °С в течение 24 часов. Зеленый флуоресцентный белок экстрагировали из биомассы 3,5 М раствором хлорида натрия и регистрировали интенсивность флуоресценции на спектроф-луориметре СМ - 2203 (г. Минск) (рис. 3). Пик флуоресценции клеточного экстракта установлен в области А. = 475 нм, что соответствовало излучению мутантного флуоресцентного белка, так называемого aGFP (Patterson etal., 1997).

Наличие плазмиды в клетках

трансформантов установлено как

при аэробном культивировании, так

и в аноксических условиях. Для это- р

го культуры трансформантов выра- " пектРы поглоще-с- ния (1) и флуоресценции (ФЛ) щивали аэробно и в условиях денит- w ^ J ^ v ' , клеточного экстракта клона Тарификации на питательной среде GF , тгл L я

г Lomonas sp. 1B-G4.4 (2) и пита-

при температуре 37 С. Биомассу су- „ , „„ „\

тельной среды LB2 (3).

точных культур лизировали, полу- к v '

ченную тотальную ДНК разделяли электрофорезом в 0,8% геле агарозы. Плазмидная ДНК pHS15G2 обнаруживалась в клетках всех трансформантов независимо от условий культивирования (рис. 4).

Рисунок 4. Результаты гель-электрофореза лизатов трансформированных клеток: 1 -ДНК маркер, 2 - 5 - примеры трансформантов НаЬтопаэ эр. 1В-С4 аэробных условиях роста, 6 - 9 - то же в аноксических условиях, 10 - контроль (плазмидный вектор рШ15С2).

1 2 3 4 5 С

I 9 10

3000

2000

1500 1200

На примере GFP доказана возможность создания генетически модифицированных штаммов денит рифицирующих галомонад для эффективного синтеза рекомбинантных белков в условиях аноксической ферментации.

Определение основных параметров аноксического культивирования

Для определения наиболее эффективного состава питательной среды для аноксического культивирования нами исследована интенсивность роста рабочего штамма Halomonas sp. IB-G4 при различном сочетании концентраций (% масс.) субстрата (S) и акцептора электронов (N). В качестве источника углерода использовали дрожжевой экстракт, а источником кислорода служил нитрат натрия. В ходе опыта «анаэробные» пробирки, заполненные стерильной средой GF с различным соотношением S:N, одновременно инокулировали 12-ти часовой культурой галомонад и инкубировали при 37°С. Во время экспоненциальной фазы роста культуры измеряли оптическую плотность КЖ (OD6oo)- Через 7 - 10 суток инкубации определяли остаточное содержание нитратов и нитритов в КЖ методом ВЭКЭФ. По результатам эксперимента установлено, что количество восстанавливаемого азота практически не зависит от исходной концентрации нитрата, а изменяется только при увеличении содержания субстрата (рис. 5). При этом, было также отмечено, что увеличение концентрации дрожжевого экстракта выше 2 % масс, уже не влияет на степень восстановления N03". В эксперименте было установлено, что наилучшие условия культивирования достигаются при соотношении донора и акцептора электронов S:N =1:1.

Культивирование рабочего штамма на питательных средах с различным количеством субстрата и акцептора, но при постоянном соотношении S:N =1:1 позволило определить близкие к оптимальным концентрации дрожжевого экстракта и NaN03, которые составили Sopt = 1% масс, и Nopt = 1% масс, соответственно (рис. 6). В этих условиях достига-

Рисунок 5. Зависимость количества восстанавливаемого нитрата (N) культурой Halomonas sp. IB-G4 от содержания источника углерода (S) в среде культивирования в условиях денитрификации. * Концентрация оксианионов азота в пересчете на NaN03

о о оз

со со

о н оз н о О

лись стабильность системы анок-сического роста, достаточно высокая оптическая плотность культу-ральной жидкости и полная утилизация нитрат и нитрит анионов.

Оптимизацию условий ферментации по температуре, рН, присутствию молекулярного кислорода проводили на основе определения продолжительности лаг-фазы. В эксперименте одно-

Субстрат (8), о/оМасс

Рисунок 6. Зависимость оптиче- временно была задействована се-ской плотности и содержания ос- рия вариантов условий культиви-таточного азота в КЖ от концен- рования. В качестве четырех фак-трации субстрата при культивиро- торов варьирования были выбра-вании На1отопаБ эр. 1В-С4 на сре- ны: температура, рН, концентра-де с соотношением = 1:1. ция сульфида натрия, количество

вносимого инокулята (табл. 4). Содержание остальных компонентов ферментационной среды было постоянным. Анализ результатов, представленных в таблице 4, показал, что крайне негативно на скорости роста рабочего штамма сказывается отклонение температуры и рН среды культивирования от нормальных для этого штамма значений. Внесение сульфида натрия для снижения редокс-потенциала питательной среды практически не оказывало влияния на рост бактерий. Положительное воздействие на снижение продолжительности лаг-фазы оказывало увеличение количества вносимого инокулята до 10% об.

Таблица 4. Выбор оптимальных параметров аноксического культивирования штамма На1отопа$ Бр. 1В-04

Номер опыта Факторы варьирования Продолжительность лаг-фазы, ч. Оптическая плотность КЖ через 12 часов роста

Температура, °С рн N325, % масс. Инокулят, % об.

1 (контроль) 37 9,5 0 1 6 0,4

2 30 9,5 0 1 10 0,2

3 45 9,5 0 1 14 0,2

4 37 10 0 1 9 0,2

5 37 10,5 0 1 12 0,2

6 37 9,5 0,005 1 6 0,4

7 37 9,5 0,01 1 5,5 0,4

8 37 9,5 0,015 1 5,5 0,4

9 37 9,5 0,02 1 6 0,4

10 37 9,5 0 5 2,5 1,4

11 37 9,5 0 10 2 2,1

В результате проведенных экспериментов были выявлены наилучшие значения показателей аноксического культивирования рабочего штамма НаЬтопаз эр. 1В-С4 на питательной среде с дрожжевым экстрактом в качестве источника углерода и с нитратом натрия в качестве единственного акцептора электронов, обеспечивающие наименьшую продолжительность лаг-фазы и наибольшую интенсивность роста и де-нитрификации. Этому соответствовали следующие параметры: концентрация дрожжевого экстракта 1% масс., концентрация нитрата натрия 1% масс., рН = 9,5, температура 37°С, количество инокулята 10% об.

Периодическое и непрерывное культивирование рабочего штамма в аноксических условиях

Процесс аноксической ферментации рабочего штамма проводили на лабораторной установке для аноксического культивирования. Для сравнения скоростей роста и развития нитритрезистентных галомонад в аэробных и в аноксических условиях провели параллельную ферментацию штамма На1отопаз эр. 1В-С4 в условиях эффективной аэрации и де-нитрификации. Для проведения процесса использовали параметры и состав питательной среды, представленные в предыдущем разделе. Продолжительность опыта составила 28 ч. Рост культуры и аэробно, и в условиях денитрификации протекал одинаково активно (рис. 7). Только на

первых этапах в развитии аноксической культуры наблюдалась довольно длинная лаг-фаза, что связано с присутствием молекулярного кислорода в среде ферментера. В дальнейшем, активно образующийся в результате денитрификации азот вытеснил воздух, что обеспечило эффективный рост аноксической культуры с высокой удельной скоростью. Результаты эксперимента, выполненного без аэрации, впервые продемонстрировали возможность достижения технологических показателей аноксической ферментации, в частности, скоростей роста и концентрации биомассы, сопоставимых с аналогичными показателями, достигаемыми при использовании методов аэробного культивирования.

Для определения максимальной удельной скорости роста (цтах) рабочего штамма в условиях аноксической ферментации провели культивирование в непрерывном режиме. При скоростях разбавления (Э)

Время, ч. Рисунок 7. Кривые роста периодической культуры Halo-monas sp. IB-G4 в условиях аэробного и аноксического культивирования.

близких к критическим значениям, когда скорость вымывания клеток превышает скорость прироста, можно достичь максимальной удельной скорости роста культуры цтах. В этих условиях D ~ р.тах. Во время аноксического роста скорость разбавления увеличивали постепенно, вплоть до начала вымывания культуры из ферментера. На графике этот момент хорошо заметен по перелому кривой оптической плотности (рис. 8). Последнее значение D перед полным исчезновением клеток из среды, обеспечивавшее стабильное развитие культуры, соответствует максимальной удельной скорости роста штамма в данных условиях. При росте на богатой питательной среде с нитритом в качестве акцептора электронов рабочий штамм Halomonas sp. IB-G4 достигал Цтах = 0,9 Ч"' (рИС. 8).

Изучение транспорта нитрит анионов внутрь клеток алкалофильных денитрификаторов

Принято считать, что нитрит поступает в клетки бактерий через цитоплазматическую мембрану посредством диффузии в форме прото-нированной азотистой кислоты (HN02) (Moir, Wood, 2001). Её концентрацию в среде, содержащей нитрит натрия, можно вычислить по уравнению Хендерсона-Хассельбаха (1):

lg([HN02]) = lg([NaN02]) + рКа- рН , (1)

где [HNO2] - концентрация протонированной азотистой кислоты, М;

[NaN02] - концентрация нитрита натрия, М; рКа=3,3 - константа диссоциации HN02; рН - водородный потенциал. Анализ этого уравнения позволяет сделать вывод о наличии обратной зависимости, связывающей концентрацию протонированной азотистой кислоты с величиной рН среды. Так для условий рН=6,8 и [NaN02] = 0,1 М концентрация протонированной азотистой кислоты составит [HN02] = 3,1*10"5 М, а при рН=9,8 и прочих равных условиях величина [HN02] снижается на три порядка. Это позволяет, во-первых, объяснить факт активного аноксического роста алкалофильных галомо-над на средах с высокими концентрациями нитритов, а, во-вторых, признать модель пассивного диффузного транспорта вполне состоятельной.

Непрерывное аноксическое культивирование Halomonas sp. IB-G4 Максимальная удельная скорость роста 0,9 час'

0,4 0,5 0,6 0,7 0.8 0,9 1,0 1,1

Скорость разбавления, об./час Рисунок 8. Определение максимальной удельной скорости роста рабочего штамма с N02" в качестве акцептора электронов.

О со

п со о. н

си гг

о-1 - На1отопа$ ер. 1В-С4 о- ■ 2 - НаЬтопаэ эр. 1В-07-6

Вместе с тем необходимо отметить, что аноксическое развитие многих галомонадных изолятов из нашей коллекции происходило в щелочных средах (рН = 9,6) и при очень низких исходных концентрациях нитрита (1,5-3 мМ), внесенного в качестве единственного акцептора электронов. Также нами было обнаружено практически полное исчезновение нитрит анионов из среды культивирования при росте большинства нитритрезистент-ных штаммов На1отопа.5 в условиях денитрификации, что необъяснимо с точки зрения диффузии (табл. 2). Указанные факты позволяют предположить наличие активного типа акцепции нитрит анионов некоторыми галомонадами, выявляющегося в щелочных условиях.

Изучение динамики денитрификации у двух изолятов нашей коллекции методом ВЭКЭФ впервые позволило показать четкие различия между «классическими» денитрификатерами и культурами, активно акцептирующими нитриты (рис. 9). Развитие ряда культур сопровождалось

практически полным исчезнове-

1 2 3 4 5 6 7 8

Время, сут.

Рисунок 9. Динамика денитрификации штаммами галомонад с активным (I) и диффузионным (2) типом акцепции нитрит анионов.

2,5

2,0

1,5

1,0

0,5

0,0

Скорость разбавления Э = 0,9 час1 Время культивирования 12 суток, рН = 9,6

0123456789 10

Концентрация ЫаЫ02, г/л

сунок Ю. Непрерывное аноксическое льтивирование нитритофильного штам-На1отопач эр. 1В-С4 при снижающихся нцентрациях нитрита натрия, нктирной линией показана возможная висимость плотности культурапьной дкости от концентрации нитрита при ффузионном типе акцепции N02".

нием N02" из среды культивирования (штамм 1В-С4 на рис. 9), в то время как часть изолятов не была способна утилизировать нитрит натрия при его концентрации ниже 2,6 г/л (штамм 1В-07-6 на рис. 9). Для изучения динамики потребления нитрита использовали питательную среду вР, содержавшую нитрит натрия в концентрации 10 г/л (рН 9,2 -9,4).

Дополнительным доказательством обнаруженного факта может служить культивирование штамма На1отопаз эр. 1В-С4 на установке для аноксической ферментации в непрерывном ре-

жиме с нитритом в качестве единственного акцептора электронов (рис. 10). Культивирование вели при максимальной удельной скорости роста штамма, равной 0,9 ч"1, с постепенным снижением концентрации нитрита натрия в питательной среде. Продолжительность непрерывного роста бактерий составила 12 суток. При этом оптическая плотность КЖ в ферментере оставалась практически неизменной независимо от содержания в среде нитрита натрия, что было бы невозможно при диффузионном типе акцепции N02". В последнем случае интенсивность роста должна была бы изменяться прямо пропорционально концентрации нитрита в питательной среде (показано пунктиром, рис. 10).

Таким образом, полученные данные на метаболическом уровне подтверждают возможность существования в клетках бактерий активного способа транслокации N02", осуществляемой, возможно, по принципу симпорта с протонами или ионами При этом отсутствие остаточных концентраций нитрита в среде культивирования и стабильный рост при пониженном содержании нитрита на средах с высокой щелочностью может служить четким физиологическим признаком для отделения денит-рификаторов, активно акцептирующих этот анион. Учитывая потенциальную токсичность N02", бактерии, резистентные к очень высоким концентрациям нитрита и активно использующие этот анион для энергетических нужд, могут быть обозначены как нитритофильные.

Применение нитритофилов для тонкой денитрификации питьевой воды

Современная экологическая ситуация характеризуется тем, что количество водоемов и рек с водой, пригодной для питья, катастрофически уменьшается, и это утверждение, к сожалению, справедливо для регионов, богатых пресными гидроресурсами, в частности, таких, как Башкортостан. Проведенные нами анализы показали, что в зоне хозяйственной деятельности человека пресная вода не только рек, но и артезианских скважин, колодцев, родников почти всегда содержит нитраты и нитриты в концентрациях, превышающих ПДК (полученные данные не приводятся). Согласно СанПиН 2.1.4.1175-02 «Гигиенические требования к качеству воды нецентрализованного водоснабжения. Санитарная охрана источников» предельно допустимые концентрации нитратов составляют 45 мг/л, нитритов - 3 мг/л. Существующие способы глубокой очистки воды, например, от нитритов, концентрации которых даже незначительно превышают предельно допустимые (~ 5-7 мг/л), многостадийны и довольно сложны (БЬосЫеу е1 а1., 2007; ТаЛакоувку е1 а1., 2003). Применение нит-ритофильных галомонад позволит значительно упростить и удешевить очистные технологии. Биохимический процесс очистки можно осуществлять одностадийно, и необходимым условием является лишь добавление

в среду требуемых количеств окисляемого субстрата. Техническим результатом процесса является удаление из загрязненной воды даже следовых количеств N02", что пока достигается лишь комплексными физико-

химическими методами.

Для денитрификации образца воды из артезианской скважины, загрязненной нитрат и нитрит анионами, мы использовали штамм Halomonas sp. IB-I6, отличавшийся от других культур ростом в наиболее широком диапазоне рН, отсутствием потребности в ионах Na+, а также обладавший активным типом акцепции нитрит анионов и нитритрезистентностью до 50 г/л NaN02. Процесс вели при температуре 28 - 30 °С. В качестве органического субстрата добавляли дрожжевой экстракт в количестве, адекватном содержанию нитратного и нит-ритного азота. О высокой эффективности денитрификации свидетельствует снижение концентрации оксианионов азота до предела детекции, определяемого чувствительностью прибора для ВЭКЭФ (рис. 11).

ВЫВОДЫ

1. Выделенные нитритрезистентные денитрифицирующие бактерии рода Halomonas образуют обособленную филогенетически компактную группу, по строению 16S рРНК близкую к Halomonas desiderata (степень гомологии 98 - 98,4%).

2. Нитритрезистентный штамм Halomonas sp. IB-G4 характеризуется высокой скоростью роста и денитрификации, генетической стабильностью, отсутствием патогенности и устойчивостью к контаминации и представляет собой наиболее перспективный объект для генетической модификации.

3. Впервые показана экспрессия рекомбинатного белка (GFP) в условиях неингибированного аноксического роста на щелочной среде с высокой концентрацией нитрита натрия с использованием в качестве хост-культуры денитрифицирующего штамма Halomonas sp., а в качестве вектора - плазм иды pHS15G2.

го" 70

H 60

П) 50

сг s 40

и го 30

CL h- 20

X CD 10

э- 0

: |;:г] Нитрат (N03") : . : Нитрит (N0/)

5 10 15 20 25

Время, сут Рисунок 11. Денитрификация воды из артезианской скважины культурой Halomonas sp. IB-I6.

ми, достигаемыми при использовании методов аэробного культивирования той же культуры.

5. Обнаружены два типа акцепции NO2' галоалкалотолерантными штаммами Halomonas sp., предполагающие наличие активной и пассивной систем транслокации этого токсичного аниона внутрь клетки. Нит-ритрезистентные денитрификаторы с активным типом акцепции нитрита обозначены как «нитритофильные».

6. Культуры Halomonas sp., обладающие системами активной акцепции N02", являются основой для новых перспективных технологий глубокой очистки воды от нитратов и нитритов.

БЛАГОДАРНОСТИ

Автор выражает глубокую признательность к.б.н. Е.А.Гильвано-вой за постоянное внимание и помощь в работе. Свою искреннюю благодарность автор выражает сотрудникам Института биохимии и генетики УНЦ РАН - д.б.н., проф. А.В.Чемерису, к.б.н. Р.Р.Гарафутдинову, к.б.н. Р.Т.Матниязову; сотрудникам Института органической химии УНЦ РАН - к.х.н. С.С.Остахову, И.О.Осиной; заведующему Центральной научно-исследовательской лабораторией БГМУ, д.м.н., проф. В.В.Сперанскому за исчерпывающие консультации и методическую помощь в проведении исследований. Автор искренне благодарит всех сотрудников лаборатории прикладной микробиологии ИБ УНЦ РАН за постоянную поддержку в процессе выполнения работы. Автор искренне благодарен профессору Constantin Drainas University of Ioannina Department of Chemistry Biochemistry Lab (Греция) за любезно предоставленные образцы плазмид pRK.2013, pHS15, pHSl 5G1 и pHS15G2.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Семёнова Е.А., Гильванова Е.А., Усанов Н.Г. Глубокая одностадийная очистка питьевой воды от нитратов и нитритов при помощи бактерий рода Halomonas II Вестник Оренбургского государственного университета -2007-№75-С. 313 -316.

2. Семёнова Е.А., Гильванова Е.А., Усанов Н.Г. Подбор состава питательных сред для бактерий рода Halomonas II Межвузовская научно-техническая конференция «Актуальные проблемы технических, естественных и гуманитарных наук», 27 - 28 апреля 2006 г., Уфа / Изд-во УГНТУ.- Уфа, 2006,- С. 357-359

3. Семёнова Е.А. Активный транспорт нитрита у некоторых штаммов Halomonas II Международная конфернция студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2007»; секция «Биология»; 11-14 апреля 2007 г., Москва, МГУ им. М.В. Ломоносова, биологический факультет - М.: МАКС Пресс, 2007,- С. 117 - 118.

4. Семёнова Е.А Новые принципы ферментации микроорганизмов // БИОМИКА - НАУКА XXI ВЕКА; Материалы школы-семинара; Уфа, 9- 15 сентября 2007 г.-Уфа, 2007.-С. 118-120.

5. Семёнова Е.А., Гильванова Е.А. Алкалофильные нитритофилы группы Halomonas II Современные проблемы экологии, микробиологии и иммунологии: Материалы региональной конференции молодых ученых с международным участием, 29 ноября - 1 декабря 2007 г., Екатеринбург - Пермь / Институт экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН,- Пермь, 2007,-С. 101-103.

6. Семёнова Е.А. Новая парадигма ферментации // Материалы II Международной Школы молодых ученых «Эмбриология, генетика и биотехнология», Уфа, 3-7 декабря 2007 г.- Уфа: Изд-во БГПУ, 2007,-С. 107-108.

7. Семёнова Е.А., Гильванова Е.А., Усанов Н.Г. Экологическое состояние подземных вод в условиях антропогенного загрязнения: проблемы и перспективы микробиологической очистки от нитратов и нитритов // материалы Междунар. науч. конф. «Проблемы биоэкологи и пути их решения (Вторые Ржавитинские чтения)», Саранск, 15 - 18 мая 2008 г.- Саранск: Изд-во Мордов. ун-та, 2008.- С. 423 -425.

8. Gilvanova Е.А., Semenova Е.А., UsanovN.G. Halomonas sp. partial 16S rRNA gene, strain IB-G4 // EMBL Nucleotide Sequence Database-2007. - Accession number AM490139.

9. Gilvanova E.A., Semenova E.A., Usanov N.G. Halomonas sp. partial 16S rRNA gene, strain IB-07-1 // EMBL Nucleotide Sequence Database.-2007 - Accession number AM490137.

10. Gilvanova E.A., Semenova E.A., Usanov N.G. Halomonas sp. partial 16S rRNA gene, strain IB-07-6 // EMBL Nucleotide Sequence Database-2007 - Accession number AM490138.

11. Gilvanova E.A., Semenova E.A., Usanov N.G. Halomonas sp. partial 16S rRNA gene, strain IB-018 // EMBL Nucleotide Sequence Database-2007,- Accession number AM490136.

12. Gilvanova E.A., Semenova E.A., Usanov N.G. Halomonas sp. partial 16S rRNA gene, strain IB-NN3-2c // EMBL Nucleotide Sequence Database-2007.- Accession number AM490135.

Отпечатано в типографии издательства БИРО 450005, г. Уфа, ул. Мингажева, 120 Лиц. № Б848151 МПиМИ РБ от 15.05.1998

Подписано в печать 10.03.2009 Бумага ксероксная. Формат 60x84 1/16 Тираж 150 экз. Заказ 059

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Семенова, Екатерина Александровна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ДЕНИТРИФИЦИРУЮЩИЕ ПРОКАРИОТЫ

Обзор литературы)

1.1. Введение

1.2. Сущность процесса денитрификации

1.3. Денитрифицирующие микроорганизмы

1.4. Денитрифицирующие бактерии рода Halomonas

1.5. Энзимология денитрификации

1.6. Транспорт нитрата и нитрита в бактериях

1.7. Биотехнологический потенциал денитрификаторов

Введение Диссертация по биологии, на тему "Нитритрезистентные бактерии рода Halomonas в процессах аноксического культивирования"

Актуальность проблемы

В 70-е годы XX века, когда технология рекомбинантной ДНК прочно вошла в практику биотехнологов, бактериальная клетка стала основной платформой для получения гетерогенных белков (Muller et al., 2006). Промышленные биотехнологические процессы, основанные на использовании микроорганизмов, практически всегда связаны с их культивированием, осуществляемым различными способами. Одним из основных требований, предъявляемых к микробным технологиям, является создание асептических условий, при одновременной подаче и диспергировании в питательной среде свежих порций стерильного кислорода (воздуха) в сочетании с отводом отработанного газа (Капе, 1993; McNeil and Harvey, 2008; Schallmey et al., 2004). Реализация этого требования возможна лишь при использовании сложного технологического оборудования и сопряжена с высокими энергетическими и экономическими затратами. Одним из путей их снижения является использование методов анаэробного культивирования, осуществляемых, например, при ферментации облигатно анаэробных бактерий или микроорганизмов, обладающих бродильным типом метаболизма, архей, дрожжей (Morris, 1994; Stal and Moezelaar, 1997). Недостатком биотехнологий данного типа являются их сравнительно низкие скорость и эффективность. Вместе с тем, известны микроорганизмы, обладающие аэробным типом дыхания, и, одновременно, способные к энергетическому метаболизму при наличии в питательной среде других окислителей, например, нитратов, перхлоратов (Stal and Moezelaar, 1997; Straub et al., 2000; Zumft, 1992). Процессы их ферментации относятся к аноксическим и применяются, главным образом, в технологии очистки сточных вод, при этом скорость деления клеток приближается к уровню аэрируемого культивирования (Casella and Payne, 1996; Stepanov and Korpela, 1997). Присутствие NaN03 в среде устраняет необходимость стерильной аэрации и диспергирования воздуха, что приводит к соответствующему снижению затрат. Вместе с тем, для получения высоких конечных концентраций биомассы в аноксических процессах требуются значительные стартовые концентрации окислителя в среде, например, нитратов. С другой стороны, восстановление нитратов микроорганизмами до газообразного азота происходит с образованием и промежуточным накоплением в среде токсичных нитритов, способных ингибировать рост рабочей культуры в очень низких концентрациях - 0,05 - 0,l%NaN02 (Chung et al., 2004); Таким образом, использование метаболизма полной денитрификации в;классическом варианте не целесообразно из-за низких результирующих концентраций клеток. Сравнительно- недавно; (Усанов с соавт., 2002, 2003) обнаружены алкалогалотолерантные микроорганизмы, относящиеся к роду Halomonas(Vreeland etal., 1980); устойчивые к. высоким концентрациям нитритов и осуществляющие активную, де-нитрификацию NOf и NOo" до газообразного азота. Представляется вероятным и возможным их использование в качестве базовых-культур (хостов) для генетической модификации, что позволит осуществлять их культивирование без применения аэрации-воздухом, заменив>его адекватными концентрациями NaN03. Можно предположить, что вследствие высокой токсичности нитрита, который неизбежно будет накапливаться: в среде, подобные: системы будут устойчивы к контаминации. В этом случае процесс культивирования можно: будет осуществлять в биореакторах упрощенного типа, представляющих собой герметичную емкость с устройством для. термостатирования, снабженных маломощной циркуляционной мешалкой; что, в свою - очередь, приведет к значительному снижению капитальных, эксплуатационных и энергетических затрат.

Цель исследования

Выделение и изучение нитритрезистентных бактерий рода Halomonas для процессов аноксической ферментации и получения рекомбинантных белков в.условиях неингибированного нитратного и нитритного дыхания:

Задачи исследования

3. Подобрать модельный вектор, кодирующий зеленый флуоресцентный белок, и провести трансформацию одного из активных изолятов реком-бинантной ДНК, испытать его в режиме периодической и проточной ферментации.

4. Изучить поведение культур наиболее активных денитрификаторов в моделях технологии очистки образцов питьевой воды из подземных источников, загрязненной анионами нитратов и нитритов.

Научная новизна

Впервые обнаружены два типа акцепции нитрит анионов, используемых в качестве единственного акцептора электронов при росте культур денитрификаторов рода Halomonas в средах с высокой щелочностью (рН>9) — диффузия и активный транспорт.

Для обозначения предположительно новой группы денитрификаторов, способных к активной акцепции NCV, предложен термин "нитритофиль-ные" культуры.

Впервые проведена трансформация денитрификаторов рода Halomonas рекомбинантной ДНК без использования хелперной плазмиды.

Качественно показана экспрессия плазмиды в хосте при аноксическом культивировании трансформанта G4.4 в условиях неингибированного нитратного и нитритного дыхания.

Практическая значимость

Создана коллекция штаммов Halomonas, развивающихся в аноксиче-ских условиях на минимальном субстрате (цитрате), способных к одновременному активному росту и денитрификации в присутствии высоких концентраций нитрита натрия (до 8%масс.).

Полные последовательности генов 16S рРНК пяти культур депонированы в базе данных EMBL (European Molecular Biology Laboratory)/GenBank и - доступны в сети Internet (http://www.ncbi.nlm.nih.gov) под номерами АМ490135, АМ490136, АМ490137, АМ490138, АМ490139.

Установлены кинетические параметры аноксического культивирования штамма Halomonas sp. IB-G4 в присутствии нитрата или нитрита в качестве единственного акцептора электронов - максимальная удельная скорость роста на нитрате р,тах = 0,8 ч"1, на нитрите jj,max = 0,9 ч"1.

Апробация работы

Материалы диссертации представлены на ряде научных форумов: межвузовской научно-технической конференции «Актуальные проблемы технических, естественных и гуманитарных наук» (Уфа, 2006), XIV Международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов» (Москва, 2007), межрегиональной школе-конференции «Биомика -наука XXI века» (Уфа, 2007), III Всероссийской научно-практической конференции «Проблемы экологии Южного Урала» (Оренбург, 2007), региональной конференции молодых, ученых с международным участием «Современные проблемы экологии, микробиологии и иммунологии» (Екатеринбург -Пермь, 2007), II Международной школе молодых ученых «Эмбриология, генетика и биотехнология» (Уфа, 2007), Международной научной конференции «Проблемы биоэкологии и пути их решения (Вторые Ржавитинские чтения)» (Саранск, 2008).

Публикации

Структура и объем диссертации

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология", Семенова, Екатерина Александровна

ВЫВОДЫ

1. По строению 16S рРНК выделенные нитритрезистентные денитрифицирующие Halomonas spp. образуют обособленную, филогенетически компактную группу, близкую к Halomonas desiderata со степенью гомологии 98 - 98,4%.

3. Впервые показана экспрессия рекомбинатного белка (GFP) в условиях неингибированного аноксического роста на щелочной среде с 1 - 1,5% нитрита натрия с использованием в качестве хост-культуры денитрифицирующего штамма Halomonas sp. IB-G4, а в качестве вектора - плазмиды pHS15G2.

4. Скорость роста и концентрация биомассы в условиях периодической и непрерывной аноксической ферментации денитрифицирующего штамма Halomonas sp. IB-G4 сопоставимы с аналогичными показателями, достигаемыми при использовании методов аэробного культивирования той же культуры.

5. Обнаружены два типа акцепции N02" галоалкалотолерантными штаммами Halomonas sp., предполагающие наличие активной и пассивной систем транслокации этого токсичного аниона внутрь клетки. Нитритрезистентные денитрификаторы с активным типом акцепции нитрита обозначены как «нитритофильные».

6. Культуры Halomonas sp., обладающие системами активной акцепции NOT, являются основой для новых перспективных технологий глубокой очистки воды от нитратов и нитритов.

1.8. Заключение

Обобщая данные, приведенные в обзоре литературы, следует отметить, что денитрифицирующие бактерии составляют 10 — 15% от бактериальных популяций в окружающей среде. Они встречаются почти во всех типах экологических ниш с дефицитом кислорода, изученных на сегодняшний день. Денитрификаторы используют широкий диапазон неорганических и органических соединений в качестве источников углерода и энергии, эффективность фосфорилирования которых в условиях денитрификации составляет 67 - 71%> по сравнению с процессом аэробного дыхания (Casella and Payne, 1996). В связи с этим денитрификация представляет собой наиболее эффективный тип микробной биотрансформации в условиях нехватки кислорода и наличия нитратов, нитритов или других окислов азота. Более того, нитрат гораздо лучше растворяется в воде и, зачастую, менее дорогой, чем кислород, что делает процессы денитрификации особенно привлекательными для промышленной биотехнологии.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1. Объекты исследований

2.1.1. Микроорганизмы

В работе использовали нитритрезистентные штаммы Halomonas sp. из коллекции лаборатории прикладной микробиологии Института биологии УНЦ РАН, а также бактерии рода Halomonas, выделенные из различных природных мест обитания. В качестве тестовых культур при проведении физио-лого-биохимических анализов использовали типовые штаммы Немецкой коллекции MHKp00praHH3M0B(DSZM): Halomonas halophila DSM 4770, Halomonas desiderata DSM 9502. Для амплификации плазмидного вектора использовали культуру E.coli DH5a (Douka et al., 2001).

Чистые культуры бактерий хранили при 4 - 5°С на чашках Петри, содержавших агаризованные среды BS или СА, пересевая с периодичностью один раз в три месяца. Для более длительного хранения использовали замораживание бактериальной суспензии, содержавшей 50% глицерина, при -18 — -20°С. В экспериментах использовали 2 - 3-х суточные колонии чистых культур, полученные путем высева бактериальной суспензии, разведенной в стерильном растворе 0,9% хлорида натрия, на базовую агаризованную среду. В экспериментах, связанных с изучением аноксического культивирования, использовали жидкую анаэробную культуру, полученную в течение суток на средах GF1 или CGF1 при температуре 35 - 37°С.

2.1.2. Плазмидный вектор

Для трансформации культуры Halomonas sp. IB-G4 использовали плазмидный вектор pHS15G2 длиной 13180 п.о. под контролем универсального гетерогенного промотора (Douka et al., 2001). Вектор кодировал синтез зеленого флуоресцентного белка (GFP), содержал гены устойчивости к стрептомицину и ампициллину. Клетки, несущие эту плазмиду, выращивали аэробно или в условиях денитрификации при 35 - 37°С на среде, содержавшей по 40 мкг/мл ампициллина и стрептомицина. Флуоресценцию GFP наблюдали поеле инкубации трансформированной культуры в течение 24 часов при 4 - 5°С. Образцы плазмид были любезно предоставлены профессором Constantin Drainas (University of Ioannina Department of Chemistry Biochemistry Lab, Греция).

2.2. Материалы и реагенты

2.2.1. Реактивы для микробиологических исследований

В работе использовали агар бактериологический (Испания), дрожжевой экстракт (Франция), триптоп («Amresco», США), органические и неорганические натриевые и калиевые соли, углеводы, растворители, щелочи и кислоты категорий ч.д.а. и х.ч. фирм АО «Реахим» (г. Москва, Россия); ЗАО «Химре-активенаб», ЗАО «Уфимская химическая компания», ЗАО НПП «Биомед-хим» (г. Уфа, Башкортостан); ЗАО «НПО Экрос» (г. Санкт-Петербург, Россия).

2.2.2. Реактивы для молекулярной биологии

В работе применяли трис («Sigma», США), этилендиаминтетрауксус-ной кислоты динатриевую соль (ЭДТА) («Amresco», США), додецилсульфат натрия (SDS) («Pract», Англия), глицерин («Мегск», Германия); ацетат натрия, фенол, хлороформ, изоамиловый спирт, кальций хлористый российского производства; ферменты, олигонуклеотидные праймеры, смесь дНТФ фирм «Fermentas» (Литва), «Promega» (США); агарозу разного типа фирм «Sigma» и "Promega" (США); а также набор QIAquik Gel Extraction Kit (50) (QTAGEN, Германия). Для приготовления селективных питательных сред использовали антибиотики медицинского качества: ампициллин (ОАО «Биосинтез», г. Пенза), стрептомицин (ОАО «Синтез», г. Курган).

2.2.3. Реактивы для капиллярного электрофореза

Для приготовления хроматного буферного раствора использовали оксид хрома (VI) (г. Уфа, Россия), Н-цетил-Ы^Ы-триметиламмония бромид (ЦТАБ) и диэтаноламин фирмы «Мегск» (Германия). Калибровочные растворы готовили с применением безводных натриевых солей категории х.ч. российского производства, а также использовали гидроксид натрия и соляную кислоту фирмы АО «Реахим» (г. Москва, Россия).

2.3. Микробиологические методы 2.3.1. Питательные среды

Для скрининга нитриттолерантных бактерий, хранения и поддержания культур на чашках Петри использовали базовую среду BS следующего состава, в граммах:

Дрожжевой экстракт 10

NaCl 40

NaN02 10

КН2Р04 2

Агар 16

Вода дистиллированная 1000 мл рН после стерилизации 9,2 - 9,4

Перед стерилизацией, кислотность среды доводили до значения 6,8, используя 20% раствор КОИ и контролируя рН с помощью рН-метра РВ-11 («Sartorius», Германия). Стерилизацию сред осуществляли автоклавировани-ем при 1 ати в течение 40 минут. Значение рН питательной среды 9,2 - 9,4 получали путем смешения стерильных растворов 10% Ыа2СОз и собственно питательной среды непосредственно перед разливом ее в чашки Петри. Во всех остальных средах рН корректировали теми же методами.

Для выделения нитритрезистентных культур на минимальном субстрате, хранения и поддержания их на чашках Петри использовали базовую среду

СА следующего состава, в граммах:

Натрий лимоннокислый 2-зам. 15

Дрожжевой экстракт 0,25

NaCl 40

NaN02 10

КН2Р04 2

Агар 16

Вода дистиллированная 1000 мл рН после стерилизации 9,2 - 9,4

Для изучения физиолого-биохимических свойств выделенных культур использовали питательные среды, аналогичные по составу BS и С А без добавления нитрита натрия.

Для получения накопительной культуры и изучения роста бактерий в условиях денитрификации использовали жидкую среду GFx, содержавшую следующие компоненты, в граммах:

Дрожжевой экстракт 10

NaCl 10

КН2Р04 4

NaN02 х-10

Вода дистиллированная 1 ООО мл рН среды после стерилизации 9,2 - 9,4

Денитрифицирующую активность культур, выделенных на цитрате натрия, изучали при культивировании на жидкой среде CGFx следующего состава, в граммах:

Натрий лимоннокислый 2-зам. 15

Дрожжевой экстракт 0,25

NaCl 10

КН2Р04 4

NaN02 х-10

Вода дистиллированная 1000 мл рН после стерилизации 9,2 - 9,4

Облигатную потребность изучаемых бактерий в ионах натрия определяли по наличию или отсутствию бактериального роста на безнатриевой среде МК, содержавшей следующие компоненты, в граммах: Дрожжевой экстракт 10

КН2Р04 2

Агар 16

Вода дистиллированная 1000 мл рН после стерилизации 9,2 — 9,4

Для доведения рН после автоклавирования до значения 9,2 - 9,4 вместо 10% раствора Na2C03 был использован 10% раствор К2С03. Общее содержание натрия, вносимого в тестовую среду МК вместе с другими компонентами среды, составляло 1,5-1,7 мМ.

Антибиотикоустойчивость галомонад определяли по интенсивности бактериального роста на базовой питательной среде BS или СА с добавлением стрептомицина или ампициллина. Стерильный раствор антибиотиков необходимой концентрации вводили в питательную среду после автоклавирования непосредственно перед разливом её в чашки Петри. Все остальные среды, содержавшие антибиотики, готовили аналогичным образом.

Для работ по молекулярной биологии использовали питательный бульон LBx (Luria - Bertani) (Маниатис и др., 1984). Состав среды LBx, в граммах:

Триптон 10

Дрожжевой экстракт 5

NaCl х-10

Вода дистиллированная 1000 мл

Агаризованную среду LB получали аналогичным образом с добавлением агара в количестве 16 г/л. Кислотность среды доводили до значения 7,5 перед стерилизацией, используя 20% раствор КОН.

Для амплификации и хранения плазмидного вектора штамм-хозяин E.coli DH5a pHS15G2 культивировали на питательной среде LB1, рН 7,5 с добавлением ампициллина и стрептомицина по 40 мкг/мл каждого.

Для культивирования трансформированной культуры Halomonas sp. IB-G4 использовали питательную среду LB2, рН 9,2 - 9,4.

2.3.2. Условия культивирования и инокуляции

Инкубирование на чашках Петри и в пробирках осуществляли в биологических воздушных термостатах типа ТС-80-М2 при рабочей температуре 35 - 37°С, за исключением экспериментов, связанных с определением температурного диапазона роста культур. Для культивирования в аноксических условиях накопительную и чистую культуру микроорганизмов получали, выращивая в специальных стеклянных пробирках с завинчивающимися крышками и заполненных до верха питательной средой. Аэробное культивирование на воздушно-термостатируемых качалках типа УВМТ-12-250 проводили в 250 мл колбах, содержавших 60 мл соответствующей среды. Выращивание осуществляли при температуре 30 — 37°С и скорости перемешивания 150 — 200 об/мин в зависимости от условий эксперимента.

2.3.3. Почвенные образцы и пробы воды, их отбор и хранение

В качестве природных источников новых бактериальных изолятов использовали отдельные пробы почв и осадков, отобранные в период времени 1998 - 2006 гг. в географически удаленных местах: Россия (респ. Башкортостан, респ. Бурятия, Оренбургская обл., Челябинская обл., Краснодарский кр., п-ов. Камчатка), Египет (побережье Красного моря). Почвенные образцы после отбора хранились при температуре 4 — 5°С. Краткая характеристика всех образцов представлена в таблице 2.1.

Пробы воды для изучения их анионного состава отбирали в 2007 - 2008 гг. на территории Республики Башкортостан из различных природных источников. Воду отбирали в сухие 0,5 л сосуды из ПЭТФ с завинчивающимися крышками, хранили не более суток при 4 — 5°С и сразу использовали для анализа.

2.3.4. Учет численности микроорганизмов

Индивидуальный титр отдельных штаммов и накопительных культур определяли стандартным методом предельных разведений путем высева бактериальной суспензии на агаризованную среду (Практикум по микробиологии, 2005). Для десятичных разбавлений использовали стерильный 0,9% раствор хлорида натрия. Количество выросших колоний выражали в колониеоб-разующих единицах, КОЕ/мл.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Семенова, Екатерина Александровна, Уфа

1. Болтянская Ю.В. Галоалкалофильные денитрифицирующие бактерии рода Halomonas из содовых озер // Алкалофильные микробные сообщества- М.: Наука 2007 - С. 276 - 298 - (Тр. Ин-та микробиологии им. Виноградского РАН; Вып. 14).

2. Брода П. Плазмиды: Пер. с англ./Под ред. А.А. Баева М.: Мир - 1982-224с.

3. Гильванова Е.А., У санов Н.Г. Количественная оценка биоцидной активности химических соединений с помощью микробных ассоциаций почвы // Прикладная биохимия и микробиология 2003 — Т. 39, № 3 — С. 329 -334.

4. Гильванова Е.А., Усанов Н.Г. Потенциал денитрификаторов рода Halomonas в биотехнологических процессах // Биотехнология.- 2003- Т. 6-С. 58-66

5. ГОСТ Р 51232-98 «Вода питьевая. Общие требования к организации и методам контроля качества».

6. Готтшалк Г. Метаболизм бактерий: Пер. с англ./Под ред. Е.Н. Кондратьевой.-М.: Мир.- 1982.-310 с.

7. Деткова Е.Н. Осмоадаптация галоалкалофильных бактерий из содовых озер // Алкалофильные микробные сообщества М.: Наука - 2007 - С. 348 - 373.- (Тр. Ин-та микробиологии им. Виноградского РАН; Вып. 14).

8. Логинова Л. П. Главный продукт потребления: питьевая вода // Университеты. Наука и просвещение — 2002 № 3.

9. Мельник А.И., Мельник В.А. Обострение наследственной метгемогло-бинемии у близнецов грудного возраста // Педиатрия 1986 - № 12.- С. 58 - 60.

10. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование: Пер. с англ./Т. Маниатис, Э. Фрич, Дж. Сэмбрук.-М.: Мир 1984 - 480 с.

11. Методы общей бактериологии: В 3-х томах. Пер. с англ./Под ред. Ф. Гер-хардта и др.-М.: Мир 1984.

12. Определитель бактерий Берджи: Пер с англ./Под ред. Дж. Хоулта, Н. Крига, П. Снита, Дж. Стейли, С. Уилльямса-М.: Мир 1997 - 800 с.

13. Патент Российской федерации № 2001120819 Способ денитрификации воды / А.Паскуале, К.Рубини, М.Росси, Л.Кавалли Опубл. 10.06.2003.

14. Патент Российской федерации № 2005108254 Установка для культивирования микроорганизмов / И.В.Владимцева, В.М.Самыгин, Л.К.Жога, Т.А.Гришкина, Л.В.Потапова. Опубл. 10.09.2006.

15. Патент Российской федерации № 2122979 Способ очистки воды от нитратов и нитритов / Аль Аджи Басам, Е.А.Лукашев Опубл. 10.12.1998.

16. Патент Российской федерации № 2134662 Аэрирующее устройство / Ю.М.Мешенгиссер, Р.А.Галич, Ю.Г.Марченко, В.А.Чернуха.- Опубл. 20.08.1999.

17. Патент Российской федерации № 2222500 Способ анаэробной микробиологической очистки воды от органических соединений с использованием азотной кислоты в качестве акцептора электронов / Е.А.Гильванова, Н.Г.Усанов- Опубл. 27.01.2004.

18. Патент Российской федерации № 2244687 Способ очистки воды / М.Уэйт — Опубл. 20.01.2005.

19. Патент Российской федерации № 2324730 Биореактор для проведения аэробных микробиологических процессов / А.Ю.Винаров, Д.П.Соколов, В.Н.Смирнов.- Опубл. 27.10.2007.

20. Практикум по микробиологии: Учеб. пособие/А.И. Нетрусов, М.А. Егорова, Л.М. Захарчук и др.; Под ред. А.И. Нетрусова.- М.: Издательский центр «Академия».- 2005 608 с.

21. Пушева М.А. Особенности энергетического метаболизма галоалкало-фильных анаэробных прокариот // Алкалофильные микробные сообщества- М.: Наука— 2007 С. 323 - 347- (Тр. Ин-та микробиологии им. Виноградского РАН; Вып. 14).

22. СанПиН 2.1.4.1074-01 «Питьевая вода. Гигиенические требования к качеству воды централизованных систем питьевого водоснабжения. Контроль качества».

23. СанПиН 2.1.4.1175-02 «Гигиенические требования к качеству воды нецентрализованного водоснабжения. Санитарная охрана источников».

24. Справочник биохимика: Пер. с англ./Р. Доусон, Д. Элиот, У. Элиот, К. Джонс.- М.: Мир.- 1991.- 544 с.

25. Титов В.Ю., Петренко Ю.М. Предполагаемый механизм развития нит-рит-индуцированной метгемоглобинемии // Биохимия.- 2005 Т. 70, № 4.-С. 575-587.

26. Abdelkafi S., Sayadi S., АН Gam Z. В., Casalot L. and Labat M. Bioconver-sion of ferulic acid to vanillic acid by Halomonas elongata isolated from table-olive fermentation // FEMS Microbiology Letters.- 2006.- V. 262.- P. 115-120.

27. Abu-Shammala F. Quantitative determination of subnanomolar concentration of nitrite in natural water by high-performance liquid chromatography // Asian Journal of Chemistry.- 1999.-V. 1 l.-P. 550-558.

28. Adman E. Т., Godden J. W. and Turley S. The structure of copper-nitrite reductase from Achromobacter cycloclastes at five pH values, with NCb bound and with type II copper depleted // Journal of Biological Chemistry 1995-V. 270.-P. 27458-27474.

29. Ahn Y., H. Sustainable nitrogen elimination biotechnologies: A review // Process Biochemistry.-2006.-V. 41-P. 1709-1721.

30. Alefounder P. R. and Ferguson S. J. The location of dissimilatory nitrite reductase and the control of dissimilatory nitrate reductase by oxygen in Para-coccus denitrificans II Biochemical Journal 1980 - V. 192 - P. 231-240.

31. Afendra A. S., Vargas C., Nieto J. J. and Drainas C. Gene transfer and expression of recombinant proteins in moderately halophilic bacteria // Methods in molecular biology (Clifton N. J.).- 2004,- V. 267.- P. 209-223.

32. Almeida J. S., Reis M. A., M. and Carrondo M. J. T. Competition between nitrate and nitrite reduction in denitrification by Pseudomonas fluorescens // Biotechnology and Bioengineering 1995 - V. 46 - P. 476-484.

33. Almeida J. S., Julio S. M., Reis M. A. M. and Carrondo M. J. T. Nitrite inhibition of denitrification by Pseudomonas fluorescens И Biotechnology and Bioengineering- 1995.-V. 46,-P. 194-201.

34. Alva V. A., and Peyton В. M. Phenol and catechol biodegradation by the haloalkaliphile Halomonas campisalis: Influence of pH and salinity // Environmental Science and Technology.- 2003.- V. 37.- P. 4397-4402.

35. Amelin V. G., and Kolodkin I. S. Cellulose paper with chemically immobilized 1-naphthylamine for the rapid determination of nitrites, nitrates, and aromatic amines // Journal of Analytical Chemistry.- 2001 V. 56 - P. 182187.

36. Arahal D. R., Ludwig W., Schleifer К. H. and Ventosa A. Phylogeny of the family Halomonadaceae based on 23 S and 16S rDNA sequence analyses // International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology.- 2002 V. 52.-P. 241-249.

37. Aston J. E. and Peyton В. M. Response of Halomonas campisalis to saline stress : Changes in growth kinetics, compatible solute production and membrane phospholipid fatty acid composition // FEMS Microbiology Letters-2007.-V. 274.-P. 196-203.

38. Azachi M., Henis Y., Oren A., Gurevich P. and Sarig S. Transformation of formaldehyde by a Halomonas sp. // Canadian Journal of Microbiology.-1995.-V. 41.-P. 548-553.

39. Badea M., Curulli A., Danet A., Moscone D. and Palleschi G. New electrochemical sensors used in flow injection analysis for nitrite/nitrate determination / UPB Scientific Bulletin, Series B'// Chemistry and Materials Science-2001.-V. 63.-P. 329-338.

40. Baumann L., Bowditch R. D. and Baumann P. Description of Deleya gen. nov. created to accommodate the marine species Alcaligenes aestus, A. pacificus,

41. A. cupidus, A. venustus and Pseudomonas marina II Int.J.Syst. Bacterid— 1983.-V. 33,-P. 793-802. '

42. Baumgartner M. and Conrad R. Role of nitrate and nitrite for production and consumption of nitric oxide during denitrification in soil // FEMS Microbiology Ecology.- 1992.-V. 101.-P. 59-65.

43. Berendes F., Gottschalk G., Heine-Dobbernack E., Moore E. R. B. and Tindall

44. B. J. Halomonas desiderata sp. nov., a new alkaliphilic, halotolerant and denitrifying bacterium isolated from a municipal sewage works // Systematic and Applied Microbiology.- 1996.-V. 19.-P. 158-167.

45. Bergey's Manual of Systematic Bacteriology 2nd ed.//Springer US: 2005.2816 p.

46. Berthelet M., and MacLeod R. A. The role of Na+ in membrane transport and respiration in the marine bacterium Deleya aesta 134 // Canadian Journal of Microbiology.- 1991.-V. 37.-P. 433-439.

47. Blasco R., Martinez-Luque M., Madrid M. P., Castillo F. and Moreno-Vivian

48. C. Rhodococcus sp. RBI grows in the presence of high nitrate and nitrite concentrations and assimilates nitrate in moderately saline environments // Archives of Microbiology.-2001.- V. 175.-P. 435-440.

49. Blaszczyk M. and Rzeczycka M. Biological removal of mineral forms of nitrogen from wastewaters // Postepy Mikrobiologii 2006 - V. 45— P. 275286.

50. Boltyanskaya Y., Kevbrin V. V., Lysenlco A. M., Kolganova Т. V., Tourova T. P., Osipov G. A. and Zhilina T. N. Halomonas mongoliensis sp. nov. and Halomonas kenyensis sp. nov., new haloalkaliphilic denitrifiers capable of

51. N20 reduction, isolated from soda lakes // Microbiology 2007- V. 76 - P. 739-747.

52. Bonete M. J., Martinez-Espinosa R. M., Pire C., Zafrilla B. and Richardson D. J. Nitrogen metabolism in haloarchaea // Saline Systems 2008 - V. 4.

53. Breadmore M. C., and Haddad P. R. Approaches to enhancing the sensitivity of capillary electrophoresis methods for the determination of inorganic and small organic anions // Electrophoresis.— 2001.— V. 22 — P. 2464-2489.

54. Brosius J., Palmer M. L., Kennedy P. J. and Noller H. F. Complete nucleotide sequence of a 16S ribosomal RNA gene from Escherichia coli // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America-1978.- V. 75.- P. 4801-4805.

55. Burns L. C., Stevens R. J. and Laughlin R. J. Production of nitrite in soil by simultaneous nitrification and denitrification // Soil Biology and Biochemistry.- 1996.- V. 28.-P. 609-616.

56. Canovas D., Vargas C., Csonka L. N., Ventosa A. and Nieto J. J. Osmoprotec-tants in Halomonas elongata: High-affinity betaine transport system and cho-line-betaine pathway // Journal of Bacteriology- 1996 V. 178 - P. 72217226.

57. Casella S., and Payne W. J. Potential of denitrifiers for soil environment protection // FEMS Microbiology Letters 1996.- V. 140.- P. 1-8.

58. Cheneby D., Perrez S., Devroe C., Hallet S., Couton Y., Bizouard F., Iuretig G., Germon J. C. and Philippot L. Denitrifying bacteria in bulk and maize-rhizospheric soil: diversity and N20-reducing abilities // Can. J.Microbiol.-2004.-V. 50.-P. 469-474.

59. Clegg S., Yu F., Griffiths L. and Cole J., A. The roles of the polytopic membrane proteins NarK, NarU and NirC in Escherichia coli K-12: Two nitrate and three nitrite transporters // Molecular Microbiology 2002.- V. 44 — P. 143-155.

60. Clifford D. and Liu X. Ion exchange for nitrate removal // Journal / American Water Works Association 1993.-V. 85.- P. 135-143.

61. Connolly D. and Paull B. Rapid determination of nitrate and nitrite in drinking water samples using ion-interaction liquid chromatography // Analytica Chimica Acta.- 2001.- V. 441.-P. 53-62.

62. Conrad R. Soil microorganisms as controllers of atmospheric trace gases (H2, CO, CH4, OCS, N20 and NO) // Microbiol.Rev.- 1996.- V. 60.- P. 609-640.

63. Coronado M. J., Vargas C., Mellado E., Tegos G., Drainas C., Nieto J. J. and Ventosa A. The a-amylase gene amyH of the moderate halophile Halomonas meridiana: Cloning and molecular characterization // Microbiology — 2000-V. 146.-P. 861-868.

64. Coronado M. J., Vargas C., Hofemeister J., Ventosa A. and Nieto J. J. Production and biochemical characterization of an a-amylase from the moderate halophile Halomonas meridiana II FEMS Microbiology Letters — 2000 — V. 183.-P. 67-71.

65. Coyne M. S., Arunakumari A., Pankratz H. S. and Tiedje J. M. Localization of the cytochrome cd. and copper nitrite reductases in denitrifying bacteria // Journal of Bacteriology.- 1990.-V. 172.-P. 2558-2562.

66. Deeudom M., Rock J. and Moir J. Organization of the respiratory chain of Neisseria meningitidis II Biochemical Society Transactions 2006— V. 34 — P. 139-142.

67. Del Moral A., Severin J., Ramos-Cormenzana A., Truper H. G. and Galinski E. A. Compatible solutes in new moderately halophilic isolates // FEMS Microbiology Letters.-1994.-V. 122.-P. 165-172.

68. Denariaz G., Jackson Payne W. and LeGall J. The denitrifying nitrite reductase of Bacillus halodenitrificans II Biochimica et Biophysica Acta Bioener-getics.- 1991.-V. 1056.-P. 225-232.

69. Detkova E. N. and Boltyanskaya Yu. Relationships between the osmoadapta-tion strategy, amino acid composition of bulk protein, and properties of certain enzymes of haloalkaliphilic bacteria // Microbiology 2006 - V. 75.- P. 259265.

70. Dhamole P. В., Nair R. R., D'Souza S. F. and Lele S. S. Denitrification of Highly Alkaline Nitrate Waste Using Adapted Sludge // Applied Biochemistry and Biotechnology.- 2008.- V. 151.- P.433-440.

71. Diaz E. Bacterial degradation of aromatic pollutants: A paradigm of metabolic versatility II International Microbiology 2004- V. 7 - P. 173-180.

72. Dobson S. J., James S. R., Franzmann P. D. and McMeekin T. A. Emended description of Halomonas halmophila (NCMB 1971(T)) // International Journal of Systematic Bacteriology.- 1990.-V. 40.-P. 462-463.

73. Douka E., Christogianni A., Koukkou A. I., Afendra A. S. and Drainas C. Use of a green fluorescent protein gene as a reporter in Zymomonas mobilis and Halomonas elongata // FEMS Microbiology Letters.- 2001.- V. 201.- P. 221227.

74. Duckworth A. W., Grant W. D., Jones В. E. and Van Steenbergen R. Phy-logenetic diversity of soda lake alkaliphiles // FEMS Microbiology Ecology.— 1996.-V. 19,-P. 181-191.

75. Duckworth A. W., Grant W. D., Jones В. E., Meijer D., Marquez M. C. and Ventosa A. Halomonas magadii sp. nov., a new member of the genus Halomonas, isolated from a soda lake of the East African Rift Valley // Extremo-philes-2000.- V. 4.-P. 53-60.

76. Elbahloul Y. and Steinbuchel A. Engineering the genotype of Acinetobacter sp. strain ADP1 to enhance biosynthesis of cyanophycin // Applied and Environmental Microbiology-2006.-V. 72.-P. 1410-1419.

77. Ensafi A. A., Rezaei B. and Nouroozi S. Simultaneous spectrophotometric determination of nitrite and nitrate by flow injection analysis // Analytical Sciences.-2004.-V. 20.-P. 1749-1753.

78. Farhadian M., Vachelard C., Duchez D. and Larroche C. In situ bioremedia-tion of monoaromatic pollutants in groundwater: A review // Bioresource Technology.-2008.-V. 99.-P. 5296-5308.

79. Farver O., Kroneck P. M. H., Zumft W. G. and Pecht I. Intramolecular electron transfer in cytochrome cdi nitrite reductase from Pseudomonas stutzeri\ kinetics and thermodynamics // Biophysical Chemistry 2002- V. 98.- P. 2734.

80. Felsenstein J. Confidence limits on phylogenetics: An approach using the bootstrap // Evolution.- 1985,- V. 4.- P. 483.

81. Fendrich C. Halovibrio variabilis gen. Nov. sp. Nov., Pseudomonas halophilia sp. nov. and a new halopilic aerobic Coccoid Eubacterium from Great Salt Lake Utah, USA // Syst Appl Microbiol.- 1988.- V. 11.- P. 36-43.

82. Flores E. and Herrero A. Nitrogen assimilation and nitrogen control in cyano-bacteria // Biochemical Society Transactions 2005 - V. 33 — P. 164-167.

83. Francis A. J., Dodge C. J., Gillow J. B. and Papenguth H. W. Biotransformation of uranium compounds in high ionic strength brine by a halophilic bacterium under denitrifying conditions // Environmental Science and Technology.-2000.-V. 34.-P. 2311-2317.

84. Francis C. W. and Mankin J. B. High nitrate denitrification in continuous flow stirred reactors // Water Research.- 1977.- V.l 1.- P. 289-294.

85. Francis C. W. and Brinkley F. S. Biological denitrification of high concentration nitrate waste // US Patent 4,043,936.- 1977.

86. Franzmann P. D., Burton H. R. and McMeekin T. A. Halomonas subglaci-escola, a new species of halotolerant bacteria isolated from Antarctica // Int.J.Syst.Bacteriol 1987.-V. 37.-P. 27-34.

87. Gao D., Peng Y. and Wang S. Nitrogen removal from high nitrogen soybean wastewater by simultaneous nitrification and denitrification via nitrite // Huagong Xuebao/Journal of Chemical Industry and Engineering (China).-2005.-V. 56.-P. 699-704.

88. Garcia M. Т., Mellado E., Ostos J. C. and Ventosa A. Halomonas or-ganivorans sp. nov., a moderate halophile able to degrade aromatic compounds // International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology.-2004.-V. 54.-P. 1723-1728.

89. Gayon U. and Dupetit G. Sur la fermentation des nitrates // C.R.Acad.Sci-1882-V. 95.-P. 644-646.

90. Gayon U. and Dupetit G. Recherches sur la reduction des nitrates par les in-finement petits // Mem.Soc.Sci.Phys.Nat.(Bordeaux) Ser- 1886 V. 3 - P. 201-307.

91. Ghafari S., Hasan M. and Aroua M. K. Bio-electrochemical removal of nitrate from water and wastewater-A review // Bioresource Technology 2008 — V. 99.-P. 3965-3974.

92. Giuliano M., Schiraldi C., Marotta M. R., Hugenholtz J. and De Rosa M. Expression of Sulfolobus solfataricus a-glucosidase in Lactococcus lactis II Applied Microbiology and Biotechnology.- 2004.- V. 64 P. 829-832.

93. Glass C., Silverstein J. and Oh J. Inhibition of denitrification in activated sludge by nitrite // Water Environment Research 1997 — V. 69 — P. 10861093.

94. Glass C. and Silverstein J. Denitrification kinetics of high nitrate concentration water: pH effect on inhibition and nitrite accumulation // Water Research.- 1998.- V. 32.-P. 831-839.

95. Godden J. W., Turley S., Teller D. C., Adman E. Т., Liu M. Y., Payne W. J. and LeGall J. The 2.3 angstrom X-ray structure of nitrite reductase from Achromobacter cycloclastes II Science 1991- V. 253 - P. 438-442.

96. Gonzalez-Domenech С. M., Bejar V., Martinez-Checa F. and Quesada E. Halomonas nitroreducens sp. nov., a novel nitrate- and nitrite-reducing species // International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology.— 2008.-V. 58.-P. 872-876.

97. Goregues С. M., Michotey V. D. and Bonin P. C. Molecular, biochemical and physiological approaches for understanding the ecology of denitrification // Microbial Ecology.- 2005.- V. 49.- P. 198-208.

98. Granger J. and Ward В. B. Accumulation of nitrogen oxides in copper-limited cultures of denitrifying bacteria // Limnology and Oceanography 2003- V. 48.-P. 313-318.

99. Gutell R. R., Larsen N. and Woese C. R. Lessons from an evolving rRNA: 16S and 23S rRNA structures from a comparative perspective // Microbiological Reviews 1994.-V. 58.-P. 10-26.

100. Haider A. K. and Chakrabartty P. K. Constitutive nitrate- and nitrite reductase activities of Rhizobium in relation to denitrification // Journal of Basic Microbiology.- 1995.- V. 35.-P. 233-239.

101. Hall T. BioEdit Biological Sequence Alignment Editor Version 7.О.9.- 2007

102. H.Harris R. L., Eady R. R., Samar Hasnain S. and Gary Sawers R. Coordinate synthesis of azurin I and copper nitrite reductase in Alcaligenes xylosoxidans during denitrification // Archives of Microbiology 2006 - V. 186.- P. 241249.

103. Hartmann H. and Ahring В. K. Strategies for the anaerobic digestion of the organic fraction of municipal solid waste: An overview 2006 - 53 8.- P. 722.

104. Hebert A. M. and Vreeland R. H. Phenotypic comparison of halotolerant bacteria: Halomonas halodurans sp. nov. nom. rev. comb. nov. // Int J Syst Bacte-riol 1987.-V. 37.-P. 347-350.

105. Herbert R. A. A perspective on the biotechnological potential of extremo-philes // Trends in Biotechnology 1992.- V. 10.- P. 395-402.

106. Higgins D. G., Thompson J. D. and Gibson T. J. Using CLUSTAL for multiple sequence alignments 1996 - 266 - P. 383-400.

107. Horikoshi К. Alkaliphiles: Proceedings of the Japan Academy Series В // Physical and Biological Sciences.-2004.-V. 80.-P. 166-178.

108. Huesemann M. H., Skillman A. D. and Crecelius E. A. The inhibition of marine nitrification by ocean disposal of carbon dioxide // Marine Pollution Bulletin.-2002.-V. 44.-P. 142-148.

109. James S. R., Dobson S. J., Franzmann P. D. and McMeekin T. A. Halomonas meridiana, a new species of extremely halotolerant bacteria isolated from antarctic saline lakes // Systematic and Applied Microbiology 1990.- V. 13 — P. 270-278.

110. Jayakumar D. A., Francis C. A., Naqvi S. W. A. and Ward В. B. Diversity of nitrite reductase genes (nirS) in the denitrifying water column of the coastal Arabian Sea // Aquatic Microbial Ecology.- 2004- V. 34.- P. 69-78.

111. Jia W. and Cole J. A. Nitrate and nitrite transport in Escherichia coli II Biochemical Society Transactions-2005.-V. 33-P. 159-161.

112. Jones A. M. and Knowles R. Denitrification in Flexibacter canadensis II Canadian Journal of Microbiology.- 1990.- V. 36.- P. 430-434.

113. Jukes Т. H. and Cantor C. R. Evolution of protein molecules // Mammalian Protein Metabolism.- 1969.-P. 21-132.

114. Kaminskaya О. V., Zakharova E. A. and Slepchenko G. B. Simultaneous volt-ammetric determination of nitrites and nitrates in waters // Journal of Analytical Chemistry.-2004.-V. 59.-P. 1091-1096.

115. Kane J. F. Environmental assessment of recombinant DNA fermentations // Journal of Industrial Microbiology.- 1993.- V. 11.- P. 205-208.

116. Kim J. В., Cho К. S., Jeong S. K., Nam S. W., Jeong H. D. and Kim J. K. Identification and characterization of a pigment-producing denitrifying bacterium // Biotechnology and Bioprocess Engineering 2008.- V. 13.- P. 217223.

117. Kimura E. Metabolic engineering of glutamate production // Advances in biochemical engineering/biotechnology — 2003—V. 79.-P. 37-57.

118. Kluyver A. J. and Donker H. J. L. Die Einheit in der Biochemie // Chem.Zelle Gewebe — 1926-V. 13.-P. 134-190.

119. Knowles R. Denitrification: microbiology and ecology // Life support & biosphere science: international journal of earth space 1996 - V. 3.- P. 31-34.

120. Kornaros M., Zafiri C. and Lyberatos G. Kinetics of denitrification by Pseudomonas denitrificans under growth conditions limited by carbon and/or nitrate or nitrite // Water Environment Research 1996 - V. 68 - P. 934-943.

121. Krause B. and Nealson К. H. Physiology and enzymology involved in denitrification by Shewanella putrefaciens II Applied and Environmental Microbiology.- 1997.-V. 63.-P. 2613-2618.

122. Krulwich T. A. and Guffanti A. A. The Na+ cycle of extreme alkalophiles: A secondary NaVfT antiporter and Na+/solute symporters // Journal of Bioener-getics and Biomembranes.- 1989.-V. 21.-P. 663-677.

123. Krulwich T. A. and Guffanti A. A. Alkalophilic bacteria // Annual Review of Microbiology.- 1989.-V. 43.-P. 435-463.

124. Lens P. N. L., Visser A., Janssen A. J. H., Hulshoff Pol L. W. and Lettinga G.- Biotechnological treatment of sulfate-rich wastewaters // Critical Reviews in

125. Environmental Science and Technology 1998.- V. 28 - P. 41-88.

126. Mano A. and Santana F. Nitrite removal in a submerged biofilter // Environmental Technology.- 2002.- V. 23.- P. 1189-1195.

127. Maskow T. and Babel W. Calorimetrically obtained information about the efficiency of ectoine synthesis from glucose in Halomonas elongata II Bio-chimica et Biophysica Acta General Subjects - 2001.- V. 1527 - P. 4-10.

128. Maskow T. and Babel W. Thermokinetic description of anaerobic growth of Halomonas halodenitrificans using a static microcalorimetric ampoule technique // Journal of Biotechnology.- 2003.- V. 101- P. 267-274.

129. Mata J. A., Martinez-Canovas J., Quesada E. and Bejar V. A detailed pheno-typic characterisation of the type strains of Halomonas species // Systematic and Applied Microbiology.- 2002 V. 25,- P. 360-375.

130. McNeil B. and Harvey L. M. Practical Fermentation Technology Chichester: John Wiley & Sons Ltd.- 2008.- 388 p.

131. Merten O., Mattanovich D., Cole J., Lang C., Larsson G., Neubauer P., Porro D., Postma P. and Mattos J. T. Production of recombinant proteins with pro-karyotic and eukaryotic cells: Kluwer Academic Publ 2001 - P. 339-346.

132. Mierau I. and Kleerebezem M. 10 Years of the nisin-controlled gene expression system (NICE) in Lactococcus lactis II Applied Microbiology and Biotechnology.-2005.-V. 68.-P. 705-717.

133. Miller D. J. and Nicholas D. J. D. Characterization of a soluble cytochrome oxidase/nitrite reductase from Nitrosomonas europaea II Journal of General Microbiology.- 1985.-V. 131.-P. 2851-2854.

134. Minami H., Suzuki H. and Kumagai H. Salt-tolerant y-glutamyltranspeptidase from Bacillus subtilis 168 with glutaminase activity // Enzyme and Microbial Technology.-2003.-V. 32.-P. 431-438.

135. Moir J. W. B. and Wood N. J. Nitrate and nitrite transport in bacteria // Cellular and Molecular Life Sciences.- 2001.- V. 58 P. 215-224.

136. Mormile M. R., Romine M. F., Garcia M., Ventosa A., Bailey T. J. and Peyton В. M. Halomonas campisalis sp. nov., a denitrifying, moderately haloalka-liphilic bacterium // Systematic and Applied Microbiology 1999 - V. 22- P. 551-558.

137. Morris J. G. Obligately anaerobic bacteria in biotechnology // Applied Biochemistry and Biotechnology 1994- V. 48 - P. 75-106.

138. Muller D., Bayer K. and Mattanovich D. Potentials and limitations of pro-karyotic and eukaryotic expression systems for recombinant protein production a comparative view // Microbial Cell Factories - 2006 - V. 5 - P. 61.

139. Pao S. S., Paulsen I. T. and Saier J. Major facilitator superfamily // Microbiology and Molecular Biology Reviews 1998- V. 62 - P. 1-34.

140. Park E. Y. Recent progress in microbial cultivation techniques // Advances in biochemical engineering/biotechnology 2004 — V. 90 — P. 1-33.

141. Patterson G. H., Knobel S. M., Sharif W. D., Kain S. R. and Piston D. W. Use of the green fluorescent protein and its mutants in quantitative fluorescence microscopy//Biophysical Journal.- 1997.- V. 73.-P. 2782-2790.

142. Payne W. J., Grant M. A., Shapleigh J. and Hoffman P. Nitrogen oxide reduction in Wolinella succinogenes and Campylobacter species // Journal of Bacteriology.- 1982.-V. 152.-P. 915-918.

143. Peyton В. M., Mormile M. R. and Petersen J. N. Nitrate Reduction with Halomonas campisalis: Kinetics of denitrification at pH 9 and 12.5% NaCl // Water Research.- 2001.- V. 35.- P. 4237-4242.

144. Philippot L. and Hojberg O. Dissimilatory nitrate reductases in bacteria // Bio-chimica et Biophysica Acta Gene Structure and Expression- 1999 - V. 1446.-P. 1-23.

145. Philippot L., Hallin S. and Schloter M: Ecology of Denitrifying Prokaryotes in Agricultural Soil 2007.- 96.- P. 249-305.

146. Pinar G. and Ramos J. L. A strain of Arthrobacter that tolerates high concentrations of nitrate // Biodegradation.- 1997.- V. 8.- P. 393-399.

147. Pinar G., Duque E., Haidour A., Oliva J. M., Sanchez-Barbero L., Calvo V. and Ramos J. L. Removal of high concentrations of nitrate from industrial wastewaters by bacteria // Applied and Environmental Microbiology — 1997— V. 63.-P. 2071-2073.

148. Poth M. and Focht D. D. 15N kinetic analysis of N20'production by Nitrosomonas europaea: An examination of nitrifier denitrification // Applied and Environmental Microbiology.- 1985 V. 49-P. 1134-1141.

149. Prieme A., Braker G. and Tiedje J. M. Diversity of nitrite reductase (nirK and nirS) gene fragments in forested upland and wetland soils // Applied and Environmental Microbiology.-2002.-V. 68.-P. 1893-1900.

150. Quesada E., Ventosa A., Ruiz-Berraquero F. and Ramos-Cormenzana A. Deleya halophila, a new species of moderately halophilic bacteria // International Journal of Systematic Bacteriology.- 1984 V. 34- P. 287-292.

151. Richardson D. J., Bell L. C., Moir J. W. B. and Ferguson S. J. A denitrifying strain of Rhodobacter capsulatus И FEMS Microbiology Letters 1994.- V. 120.-P. 323-328.

152. Richardson D. J. Bacterial respiration: a flexible process for a changing environment // Microbiology (Reading, England).- 2000 V. 146.

153. Rodriguez-Moreno P. A. and Tarazona J. V. Nitrite-induced methemoglobin formation and recovery in rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) at high chloride concentrations // Bulletin of Environmental Contamination and Toxicology.-1994.-V. 53.-P. 113-119.

154. Romano I., Giordano A., Lama L., Nicolaus B. and Gambacorta A. Halomonas campaniensis sp. nov., a haloalkaliphilic bacterium isolated from a mineral pool of Campania Region, Italy // Systematic and Applied Microbiology.-2005.-V. 28.-P. 610-618.

155. Rowe J. J., Yarbrough J. M., Rake J. B. and Eagon R. G. Nitrite inhibition of aerobic bacteria // Current Microbiology 1979.- V. 2- P. 51-54.

156. Rudolf M. and Kroneck P. M. H. The nitrogen cycle: Its biology.- 2005.- 43 -P. 75-103.

157. Rysgaard S., Glud R. N., Sejr M. K., Blicher M. E. and Stahl H. J. Denitrification activity and oxygen dynamics in Arctic sea ice // Polar Biology.- 2008-V. 31.-P. 527-537.

158. Saitou N. and Nei M. The neighbor-joining method: a new method for reconstructing phylogenetic trees // Molecular biology and evolution 1987 - V. 4.- P. 406-425.

159. Sakamoto Т., Inoue-Sakamoto K. and Bryant D. A. A novel nitrate/nitrite permease in the marine cyanobacterium Synechococcus sp. strain PCC 7002 // Journal of Bacteriology.- 1999.-V. 181,-P. 7363-7372.

160. Sakurai Т., Nakashima S., Kataoka K., Seo D. and Sakurai N. Diverse NO reduction by Halomonas halodenitrificans nitric oxide reductase // Biochemical and Biophysical Research Communications 2005.- V. 333 - P. 483-487.

161. Sanchez-Porro C., Martin S., Mellado E. and Ventosa A. Diversity of moderately halophilic bacteria producing extracellular hydrolytic enzymes // Journal of Applied Microbiology.- 2003,- V. 94.- P. 295-300.

162. Sann R., Kostka S. and Friedrich B. A cytochrome cdrtype nitrite reductase mediates the first step of denitrification in Alcaligenes eutrophus И Archives of Microbiology.- 1994.-V. 161.-P. 453-459.

163. Schallmey M., Singh A. and Ward O. P. Developments in the use of Bacillus species for industrial production // Canadian Journal of Microbiology — 2004 — V. 50.-P. 1-17.

164. Seibold G., Auchter M., Berens S., Kalinowski J. and Eikmanns B. J. Utilization of soluble starch by a recombinant Corynebacterium glutamicum strain: Growth and lysine production // Journal of Biotechnology 2006 - V. 124-P. 381-391.

165. Shapleigh J. P. The denitrifying Prokaryotes // The Prokaryotes.- 2006 V. 2.- P. 769-792.

166. Shapovalova A. A., Khijniak Т. V., Tourova T. P., Muyzer G. and Sorokin D. Y. Heterotrophic denitrification at extremely high salt and pH by haloalka-liphilic Gammaproteobacteria from hypersaline soda lakes // Extremophiles.-2008.-V. 12.-P. 619-625.

167. Shiloach J. and Fass R. Growing E. coli to high cell density A historical perspective on method development // Biotechnology Advances - 2005 - V. 23-P. 345-357.

168. Shockley С. E., Miller J. D. and Shah P. S. Nitrate removal in a purge stream using constructed wetlands // US Patent 7,276,164 2007.

169. Shoun H., Капо M., Baba I., Takaya N. and Matsuo M. Denitrification by ac-tinomycetes and purification of dissimilatory nitrite reductase and azurin from Streptomyces thioluteus II Journal of Bacteriology 1998 - V. 180 - P. 44134415.

170. Sin G., Kaelin D., Kampschreur M. J., Wett В., Gernaey К. V., Rieger L., Sie-grist H. and Van Loosdrecht M. С. M. Modelling nitrite in wastewater treatment systems // A discussion of different modelling concepts 2008 - 586.-P. 1155-1171.

171. Sorokin D. Y. and Kuenen J. G. Chemolithotrophic haloalkaliphiles from soda lakes // FEMS Microbiology Ecology.- 2005.- V. 52.- P. 287-295.

172. Souza J. M., Castro L., Cassina A. M., Batthyany C. and Radi R. Nitrocyto-chrome c: Synthesis, Purification and Functional Studies 2008 - 441.— P. 197-215.

173. Stal L. J. and Moezelaar R. Fermentation in cyanobacteria // FEMS Microbiology Reviews.- 1997.- V. 21.- P. 179-211.

174. Stepanov A. L. and Korpela Т. K. Microbial basis for the biotechnological removal of nitrogen oxides from flue gases // Biotechnology and Applied Biochemistry.- 1997.-V. 25.-P. 97-104.

175. Straub K. L., Benz M. and Schink B. Iron metabolism in anoxic environments at near neutral pH // FEMS Microbiology Ecology.- 2000.- V. 34 P. 181186.

176. Streminska M. A. and Blaszczyk M. Biogeochemical cycle of nitrogen in the soils of coniferous forests // Postepy Mikrobiologii 2004 - V. 43- P. 235250.

177. Stres В., Mahne I., Avgustin G. and Tiedje J. M. Nitrous Oxide Reductase (nosZ) Gene Fragments Differ between Native and Cultivated Michigan Soils // Applied and Environmental Microbiology 2004.- V. 70.- P. 301-309.

178. Strohm Т. O., Griffin В., Zumft W. G. and Schink B. Growth yields in bacterial denitrification and nitrate ammonification // Applied and Environmental Microbiology.-2007.-V. 73.-P. 1420-1424.

179. Sung-Sik Y. and Kim C. Development of host-vector systems for lactic acid bacteria // Korean Journal of Applied Microbiology and Biotechnology — 2001.-V. 29.-P. 1-11.

180. Tallec G., Gamier J. and Gousailles M. Nitrogen removal in a wastewater treatment plant through biofilters: Nitrous oxide emissions during nitrification and denitrification //Bioprocess andBiosystems Engineering.-2006.- V. 29-P. 323-333.

181. Tartakovsky В., Guiot S., Breton J. and Delisle S. Bioremediation of nitrate contaminated groundwater // US Patent 6,599,425 2003.

182. The 3rd World Water Forum Final Report / Japan, Kioto // Secretariat of the 3rd World Water Forum 2003.- 275 p.

183. The Recombinant Protein Handbook. Protein Amplification and Simple Purification.- Uppsala, Sweden, Amersham: Pharmacia Biotech AB 2000 - 106 -P

184. Van de Peer Y. and De Wachter R. TREECON for Windows: a software package for the construction and drawing of evolutionary trees for the Microsoft Windows environment // Computer Applications in the Biosciences.— 1994.-V. 10.-P. 569-570.

185. Ventosa A. and Nieto J. J. Biotechnological applications and potentialities of halophilic microorganisms // World Journal of Microbiology & Biotechnology.- 1995.-V. 11.-P. 85-94.

186. Ventosa A., Nieto J. J. and Oren A. Biology of moderately halophilic aerobic bacteria // Microbiology and Molecular Biology Reviews 1998.- V. 62 - P. 504-544.

187. Villaverde A. and Mattanovich D. Recombinant protein production in the new Millennium // Microbial Cell Factories 2007 - V. 6.

188. Vreeland R. H., Litchfield C. D., Martin E. L. and Elliot E. Halomonas elongata, a new genus and species of extremely salt-tolerant bacteria // International Journal of Systematic Bacteriolog.- 1980 у-V. 30 P. 485-495.

189. Wang Y. N., Cai H., Yu S. L., Wang Z. Y., Liu J. and Wu X. L. Halomonas gudaonensis sp. nov., isolated from a saline soil contaminated by crude oil // International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology 2007.-V. 57.-P. 911-915.

190. Wilson K. Preparation of genomic DNA from bacteria // Current protocols in molecular biology / edited by Frederick M., Ausubel et al 2001 - Chapter 2.

191. Woese C. R. Bacterial evolution // Microbiological Reviews 1987 - V. 51-P. 221-271.

192. Ye R. W., Averill B. A. and Tiedje J. M. Denitrification: Production and consumption of nitric oxide // Applied and Environmental Microbiology 1994 — V. 60.-P. 1053-1058.

193. Yoshie S., Ogawa Т., Makino H., Hirosawa H., Tsuneda S. and Hirata A. Characteristics of bacteria showing high denitrification activity in saline wastewater // Letters in Applied Microbiology 2006 - V. 42 - P. 277-283.

194. Yoshinari T. N20 reduction by Vibrio succinogenes II Applied and Environmental Microbiology 1980- V. 39.-P. 81-84.

195. Zimmer W., Stephan M. P. and Bothe H. Denitrification by Azospirillum bra-silense Sp 7.1. Growth with nitrite as respiratory electron acceptor // Archives of Microbiology.- 1984,-V. 138.-P. 206-211.

196. Zumft W. The prokaryotes A handbook of the biology of bacteria // The Denitrifying Prokaryotes, 2nd Ed - 1992.- V. 1.- P. 555-582.

197. Zumft W. G. Cell biology and molecular basis of denitrification // Microbiology and Molecular Biology Reviews.- 1997- V. 61— P. 533-616.

198. Zumft W. G. and Korner H. Enzyme diversity and mosaic gene organization in denitrification // Antonie van Leeuwenhoek, International Journal of General and Molecular Microbiology.- 1997.- V. 71- P. 43-58.

199. Zumft W. G. Nitric oxide reductases of prokaryotes with emphasis on the respiratory, heme-copper oxidase type // Journal of Inorganic Biochemistry.-2005.-V. 99.-P. 194-215.

Информация о работе

Семенова, Екатерина Александровна
кандидата биологических наук
Уфа, 2009
ВАК 03.00.23

Диссертация

Нитритрезистентные бактерии рода Halomonas в процессах аноксического культивирования - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы