Никующая эндонуклеаза N.BspD6I

Рогулин, Евгений Алексеевич

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Никующая эндонуклеаза N.BspD6I
ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Никующая эндонуклеаза N.BspD6I"

На правах рукоп,

Рогулин Евгений Алексеевич

НИКУЮЩАЯ ЭНДОНУКЛЕАЗА КВврОбГ: ОПРЕДЕЛЕНИЕ ПРОСТРАНСТВЕННОЙ СТРУКТУРЫ И ПРИМЕНЕНИЕ ДЛЯ ГИБРИДИЗАЦИОННОГО АНАЛИЗА

03.00.03 — молекулярная биология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Пущино - 2006

Работа выполнена в Институте теоретической и экспериментальной биофизики РАН

Научные руководители:

доктор биологических наук Железная Людмила Алексеевна

кандидат физико-математических наук Качалова Галина Сергеевна

Официальные оппоненты:

доктор химических наук Ефимов Александр Васильевич

кандидат биологических наук Солонин Александр Сергеевич

Ведущая организация:

Институт кристаллографии имени А.В.Шубникова РАН, Москва

Защита диссертации состоится 26 октября 2006 года в 14.00 часов на заседании Диссертационного совета Д.002.038.01 при Институте биофизики клетки РАН по адресу: 142290 г. Пущино Московской области, Институтская ул., д. 3.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ИБК РАН г. Пущино Автореферат разослан «'2 сентября 2006 г.

Ученый секретарь Диссертационного кандидат биологических наук

'.И. Смолихина

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Никование двуспиральной ДНК, т.е. внесение разрыва (ника - nick) только в одну цепь ДНК, вовлечено во многие биологические процессы, такие как инициация репликации ДНК, ДНК-рекомбинация, репарация, конъюгативная мобилизация некоторых плазмид. Ни кующие эндонуклеазы, участвующие в биологических процессах, действуют либо в комплексе с другими белками, либо узнают сложные последовательности ДНК и поэтому не могут использоваться для практических целей. Недавно никующие эндонуклеазы (никазы), которые узнают короткую специфическую последовательность, вносят разрыв в ДНК в фиксированном положении относительно этой последовательности и действуют в виде мономеров, были выделены из бактерий. Эти никазы быстро натп.пи практическое применение. На их основе уже создан ряд новых биотехнологических методов, таких как изотермическая реакция для амплификации олишнуклеотидов, амплификация геномной ДНК, построение простейшего линейного мотора. Новый метод детектирования ДНК-мишеней на основе никазы предложен в настоящей работе. Предполагается, что никующие эндонуклеазы могут заменить эндонуклеазы рестрикции в клонировании ДНК и что некоторые проблемы нанотехнологий на основе ДНК могут быть решены с применением этих ферментов. Таким образом, никующие эндонуклеазы становятся ещё одним инструментом молекулярной биологии. Ограниченное количество природных никующих сайт-специфических эндонуклеаз стимулировало интенсивное конструирование на основе эндонуклеаз рестрикции искусственных никаз с новыми специфичностями. Информация о пространственной структуре никующих эндонуклеаз необходима как для выяснения механизма внесения разрыва в одну цепь ДНК, так и Для рационального конструирования никующих эндонуклеаз с новыми специфичностями.

Цели и задачи работы. Целью настоящей работы было определение пространственной структуры никующей эндонуклеазы N.BspD6I и разработка на основе никазы нового метода детектирования ДНК-мишеней. Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

— сконструировать штамм-суперподуцент никазы;

— отработать технику выделения никазы с чистотой не менее 95%;

— найти условия концентрирования (не менее 20 мг/мл) и кристаллизации никазы;

— получить набор дифракционных данных, достаточный для определения пространственной структуры;

— разработать метод гибридизационного анализа ДНК с использованием никазы.

Научная новизна. Определена пространственная структура никазы N.BspD6I — первой структуры этого класса ферментов. Координаты атомов N.BspDöl занесены в Банк Белковых Структур (PDB) под кодом 2EWF.

Разработан принципиально новый метод детектирования ДНК-мишеней с использованием никазы и молекулярных биконов.

Практическая значимость. Информация о структуре важна при конструировании никаз с новыми специфичностями. Использование никазы в сочетании с молекулярными биконами позволит повысить чувствительность существующих методов детектирования ДНК на два порядка.

Апробация работы и публикации. Результаты докладывались на IV Всероссийской Научно-Практической Конференции «Генодиагностика инфекционных заболеваний» (Москва, 2002 г.), на 7-ой Пущинской школе-конференции молодых учёных «Биология - наука XXI века». (Пущино, 2003 г.), на конференции молодых ученых, аспирантов и студентов по молекулярной биологии и генетике «50 лет двойной спирали» (Киев, 2003 г.), на II Московском международном конгрессе «Биотехнология: Состояние и перспективы развития» (Москва, 2003 г.), на Международной конференции «Наука и Бизнес: Поиск и использование новых биомолекул: биоразнообразие, окружающая среда и биомедицина» (Пущино, 2004 г.) и на конференции Deutsche Gesellschaft für Kristallographie (Freiburg, Germany 2006 г.).

По материалам диссертации опубликовано 10 печатных работ, в том числе 3 статьи в реферируемых журналах.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на '/'J> 3 страницах машинописного текста и содержит следующие разделы: введение, обзор литературы, описания использованных материалов и методов, изложения полученных результатов и их обсуждения, выводов и списка литературы. Материал иллюстрирован % 8 рисунками и 3 таблицами. Библиография включает 7 ^ссылок.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

I. Получение штамма-продуцента никазы

Никаза N.BspDöl (70,8 кДа) была найдена в штамме Bacillus species D6. Она узнает на двухспиральной ДНК последовательность (сайт) 5'-GAGTC-3'/5'-GACTC-3' и расщепляет только цепь, содержащую последовательность GAGTC на расстоянии 4 н.о. от сайта узнавания в сторону 3'-конца. Она проявляет активность при 55°С. Ранее нами был создан штамм Е. coli TOPlO/MSsc/Nick, несущий две плазмиды: pET28Nick с геном никазы BspD6I и pMSsc с геном адениновой метилтрансферазы M.SscLII, узнающей сайт GANTC и защищающей ДНК от расщепления никазой. Однако выход белка из этих клеток был крайне низким. Мы предположили, что слабая экспрессия никазы в клетках Е. coli обусловлена высоким содержанием редких кодонов в гене никазы.

Определение влияния кодонового состава на уровень экспрессии никазы. Анализ кодонового состава генов Е. coli выявил несколько кодонов, которые встречаются в последовательности генов этого организма реже остальных. Это, в частности, аргининовые кодоны AGA, AGG, CGA, CGG, изолейциновый кодон AUA, лейциновый CUA, глициновый GGA и пролиновый ССС. Наиболее низкая частота встречаемости этих кодонов характерна для генов с высоким уровнем экспрессии в клетке, на них приходится менее 2% от всех кодонов этих генов у Е. coli.

1 makkvnwyvs cspRspekiq pelkvLanfe Gsywkgvkgy kaqeafakel 51 aalpqflgtt ykkeaafstr dRvapmktyg fvfvdeegyl rlteagkmla 101 nnrRPkdvfl kqlvkwqyps fqhkgkeyPe eewslnplvf vlslLkkvgg 151 lskldiamfc Itatnnnqvd eiaeelmqfr nereklkGqn kkleftenyf 201 fkRfekiyGn vgkiregksd sshkskietk mRnardvada ttRyfrytgL 250 fvaRgnqlvl npeksdlide iissskvvkn ytRveefhey yGnpslpqfs 301 fetkeqlldL ahRIrdentR Laeqlvehfp nvkvelqvle diynslnkkv 351 dvetlkdviy hakelqLelk kkklqadfnd prqlesvidl levyhekknv 401 ieekikarfi ankntvfewl twngfiilGn aleyknnfvi deelqpvtha 451 agnqpdmeil yedfivlgev ttskGatqfk mesepvtRhy lnkkkelekq 501 GvekeLyclf lapeinkntf eefmkynivq ntRiiplslk qfnralLmvqk 551 kliekGRRls sydiknlmvs lyrttleceR kytqikagle etlnnwvvdk 601 evRf

Рис. 1. Распределение редких кодонов в последовательности никазы. Большими буквами и жирным шрифтом выделены аминокислотные остатки, соответствующие редким кодонам

Аминокислотная последовательность никазы содержит 42 остатка (7%), которые соответствуют редким для Е. coli кодонам, из них 13 аргининовых кодонов AGA (рис.1). Особенно неблагоприятное влияние на трансляцию оказывают кластеры из 2-3 редких кодонов (Robinson J., 1984). В последовательности гена никазы имеются четыре кластера: два редких кодона расположены тандемом в N-концевой части гена, еще две пары в центре и три редких кодона расположены подряд в С-концевой части.

Для оценки степени возможной экспрессии гена в клетках какого-либо организма прибегают к расчетам индекса кодонового соответствия (Codon Adaptation Index - CAI), предложенного Шарпом и Ли (Sharp Р. and Li W., 1987). Значение CAI, рассчитанное нами для гена никазы по отношению к геному Е. coli, оказалось равным 0.226, что соответствует низкоэкспрессируемым белкам. Таким образом, данные расчетов также подтверждают, что ген никазы должен плохо экспрессироваться в Е. coli.

Введение генов редких ®РНК в Е. coli. Для того, чтобы добиться увеличения выхода белка, было принято решение увеличить содержание редких тРНК в клетках штамма-продуцента. Для этой цели подходит плазмида pRARE («Novagen»), которая содержит гены argU, argW, glyT, ileX, leuW и proL (рис. 2), кодирующие тРНК для редко используемых в Е. coli кодонов

AGA, AGG (Arg), GGA (Gly), AUA (lie), CUA (Leu), CCC (Pro).

p15a orí

pro L

Рис.2. Плазмида pRARE. Белым цветом обозначены гены редких в Е. coli тРНК, серым -гены не редких тРНК.

m.sscLII

a/pW

Плазмида pRARE несет ген устойчивости к хлорамфениколу (cat) и в качестве сайта начала репликации (orí) в ней используется сайт р15а. Однако плазмида pMSsc, несущая ген метилтрансферазы, также построена на основе orí р15а и несет ген устойчивости к хлорамфениколу в качестве генетического маркера. По этой причине невозможно трансформировать клетки TOPlO/MSsc/Nick плазмидой pRARE для введения редких кодонов в клетки продуцента. Проблему можно решить путем совмещения генов редких тРНК и метилтрансферазы в одной плазмиде.

Однако плазмида pRARE не предназначена для использования в качестве вектора. Она не имеет полилинкера, и полная первичная последовательность её не опубликована. Компьютерный анализ последовательности генов плазмиды из банка данных NCBI Gen Bank показал, что сайты для большинства широко используемых эндонуклеаз рестрикции присутствуют в последовательностях гена резистентности к антибиотику, участка начала репликации orí и генов редких тРНК. Анализ последовательности генов не редких тРНК (metT, thrT, tyrU, thrU) выявил два близко расположенных сайта Aval в гене тирозиновой тРНК tyrU.

Ген метилтрансферазы M.SscLI с промоторной областью был вырезан из pl5Ssc с использованием эндонуклеаз ВатШ и EcoRI. Концы вырезанного фрагмента длиной 1700 п.о. и плазмиды pRARE, расщепленной Aval, были застроены до тупых фрагментом Кленова. Далее ген метилтрансферазы был клонирован по тупым концам в pRARE по сайту Aval (рис. 2). Плазмидой pRARE/MSsc, содержащей ген метилтрансферазы, были трансформированы клетки Е. coli TOPI OF'. Наличие в рекомбинантной плазмиде экспрессирующегося гена метилтрансферазы было подтверждено в эксперименте по защите плазмидной ДНК от эндонуклеазы Hinfl, узнающей сайт GANTC. Таким образом, было установлено, что плазмида pRARE, расщепленная Aval, может быть использована в качестве вектора для клонирования. Далее клетки были трансформированы плазмидой, содержащей ген никазы. Поскольку клетки ТОР ЮР не содержат гена Т7 РНК-полимеразы, индукция синтеза белка осуществлялась путем заражения фагом Х.СЕ6, содержащим этот ген.

Плазмида pRARE/MSsc действительно обеспечила увеличение экспрессии в клетках Е. coli TOPlOpRARE/MSsc/Nick (рис. За). Выход белка составил 0.18 мг очищенной никазы N.BspD6I на 1 г сырой биомассы клеток, что

соответствует 7х105 единиц активности и на два порядка превышает выход белка из клеток, не содержащих дополнительно генов редких тРНК.

Рис. 3. Влияние на экспрессию никазы

плазмиды pRARE/MSsc. а - в клетки ТОР 1 OF': 1 -лизат клеток

ТОР 10/MSsc/Nick после индукции; 2 - лизат клеток

TOPI OpRARE/MSsc/Nick после индукции; 3, 4 -лизат неиндуцированных клеток ТОР 10/MSsc/Nick и TOPI OpRARE/MSsc/Nick,

б - в клетки BL21(DE3): 1,2- лизаты клеток BL21/pRARE/MSsc/Nick после индукции; 3,4 - лизаты неиндуцированных клеток; М - маркер молекулярных весов (БСА, 68 кДа).

В работе была поставлена задача создать также продуцент на основе штамма Е. coli BL21(DE3). Этот штамм в отличие от ТОР 1 OF' несет ген Т7 РНК-полимеразы в составе дефектного профага DE3, что позволяет проводить индукцию с помощью ИПТГ, и у него делетированы гены двух главных протеаз отр и ¡on. Однако BL21(DE3) в отличие от ТОР 1 OF' содержит систему ограничения метилированной ДНК (mrr+ mcr+), что затрудняет получение на их основе суперпродуцента, содержащего ген метилтрансферазы. Тем не менее, нам удалось получить клон, который сохранил активный ген метилтрансферазы M.SscLII. Можно полагать, что полученный трансформант содержит дополнительную мутацию по гену ограничения метилированой по аденину ДНК (mrr). Далее клетки этого клона были трансформированы плазмидой pET28Nick. Выход белка при индукции этого штамма оказался выше (рис. 36), чем при индукции аналогичного штамма ТОРЮ - 1 мг очищенной никазы N.ÄspD6I на 1 г сырой биомассы клеток, что соответствует 4x106 единиц активности.

II. Определение пространственной структуры никазы и ее структурно-функциональный анализ

Выделение никазы. Для выделения никазы проводилось три стадии хроматографической очистки. На первой стадии очистки была использована колонка с фосфоцеллюлозой Р11. Фосфоцеллюлоза не связывает нуклеиновые кислоты, что позволило избежать дополнительной стадии преципитации нуклеиновых кислот перед нанесением лизата на колонку. Напротив, этот носитель хорошо связывает никазу; при линейном градиенте концентрации КС1 этот белок элюируется с колонки при достаточно большой концентрации соли - 450-500 мМ, гораздо позже примесных белков. Анализ показал, что фракции, дающие наиболее интенсивные полосы в районе 70 кДа в денатурирующем ПААГ-электрофорезе, проявляют и наибольшую специфическую никующую активность. Это свидетельствует о том, что эти фракции действительно содержат никазу. (рис. 4).

M 40 42 44 46 48 50 52 54 56 58 60 62 da» . - - —. — ad Ш «"■

Рис. 4

а — анализ фракций после очистки никазы на фосфоцеллюлозе Р11 в денатурирующем ПААГ. Цифрами указаны номера фракций; M -маркер молекулярных весов (БСА, 68 кДа).

б — анализ ферментативной активности во фракциях по расщеплению ДНК фага Т7 аликвотами фракций,

разведенными в 100 раз. M — маркер молекулярных весов (T7/BK736I).

На второй стадии была использована колонка с керамикой (оксиапатит). Затем была применена №-КТА агароза. Такая схема очистки позволяет получить белок со степенью чистоты выше 95%, с концентрацией ~3 мг/мл и практически избавленный от нуклеазных примесей (рис. 5).

123456789 10

Рис. 5. Анализ фракций после очистки на №-ЫТА агарозе: 5-10 - фракции, содержащие никазу

Кристаллизация никазы. Высокий выход высоко очищенной никазы позволил поставить задачу ее кристаллизации. Эксперименты по поиску условий кристаллизации никазы проводили при 22°С и 4°С методом диффузии паров в сидячей капле с использованием как коммерческих наборов Crystal Screen, Crystal Screen Cryo (Hampton Research), WizardI и Wizardll (Emerald BioStructures), так и самостоятельно приготовленных растворов. В начальных экспериментах по кристаллизации использовался белок, сконцентрированный до 12 мг/мл (при более высоких концентрациях белок агрегировал). Наилучшие результаты были получены при использовании в качестве осадителя 16% PEG8000 в буфере 40 мМ КН2Р04 с добавлением глицерина до 20%. Кристаллы с размерами 0,3x0,1x0,05 мм выросли за несколько недель и позволили добиться разрешения 2,9 Â. Съемку кристаллов проводили на станции BW6/DORIS на синхротроне DES Y (Гамбург, Германия) совместно с лабораторией структурной биологии, руководимой X. Бартуником. Съемка вели при температуре около 100° К. Кристаллы перед заморозкой вымачивали в криопретекторе.

Впоследствии было выяснено, что в присутствии 10% глицерина никазу удается сконцентрировать до 50 мг/мл. Повышение концентрации белка в капле привело к ускорению роста кристаллов с нескольких недель до 9 часов. При этом удалось получить более крупные кристаллы (максимальные размеры - 0,8x0,25x0,15 мм) (рис. 6).

Кристаллы давали дифракционную картину с разрешением 1,84 А. Кристаллы принадлежат к пространственной группе Р2Ь с параметрами ячейки а=59.55 À, b=92.56 À, с=76.35 А, р=111.82°. Ассиметричная часть ячейки содержит одну молекулу белка. Эти кристаллы были использованы в дальнейшей работе для сбора дифракционных данных.

Рис.6. Кристаллы никазы 1Ч.В5рП61, полученные в присутствии 40 мМ КН2Р04,16% РЕС8000, 20% глицерина при температуре 22°С. Концентрация белка в капле - 25 мг/мл.

Определение структуры никазы. Тяжелоатомные изморфные производные для определения экспериментальных фаз были получены путем вымачивания кристаллов в растворе ЫаВг. Для определения фаз был использован метод аномальной дифракции вблизи К-края полосы поглощения брома на нескольких длинах волн (метод МАО). Статистика полученного набора данных представлена в Таб.1.

Таблица 1. Характеристика набора данных, фазовая статистика и статистика уточнения_

Нативнын Кристалл, пропитанный раствором ЫаВг

Пространственная группа Р2,

Размеры ячейки а=59.55, Ь=92.56. с=76.3 5, |3 = 111.82°

Реак 1прс<11'»1 Яетогс

Длина волны (А) 1.05 0.9198 0.92005 1.05

Разрешение (А) 10-1.84(1.87) 20-2.50 (2.5-1 20-2.50(2.54) 20-2.50(2.54)

Л„.„, или 0.08(0.67) 0.067(0.108) 0.072(0.120) 0.066(0.109)

И I 14.7(1.8) 18.7(11.3) 18.4(10.5) 18.6(11.6)

Полнота набора (%) 99.9(100) 99.3(100) 99.5(100) 99.7(100)

Избыточность 3.31(3.25) 3.31(3.31) 3.36(3.35) 3.35(3.32)

Уточнение

Разрешение (А) 1.84

Число отражений, использованных 67523

при уточнении

■Каоть/Яи^ 20.0/23.6

Число атомов

Белка 4872

Ионов 12

Воды 634

В-факторы

Белок 35.4

Ионы 49.3

Вода 46.4

Отклонение от идеальных

параметров

Длин связей (А) 0.007

Длин углов (°) 0.022

Общая характеристика структуры. Окончательная модель включает все аминокислотные остатки от 1 до 604 (кроме областей 59-65 и 212-221), 12 атомов Вг и 634 молекулы воды. При этом из 604 остатков 92,6% остатков расположены в наиболее энергетически выгодных областях на карте Рамачандрана и остальные 7,4% находятся в дополнительных разрешенных областях. Молекула никазы представляет собой компактную глобулу продолговатой формы с размерами 50x60x80 А. Структура никазы состоит из 3 доменов: М-концевого (1-302), линкерного (303-380) и С-концевого (381-604). Структура никазы во многом сходна со структурой Рок1 — эндонуклеазы рестрикции типа II (рис. 7), которая, как и никаза расщепляет ДНК в стороне от сайта узнавания. У этого фермента Ы-концевая часть отвечает за узнавание и связывание ДНК, а С-концевая несет каталитическую функцию.

а б

Рис. 7. Структуры никазы (а) и Fokl (б). Голубым цветом изображен субдомен 1 N-концевого домена никазы и домен DI Fokl, фиолетовым - субдомен 2 N-концевого домена никазы и домен D2 Fokl, красным — каталитические домены обоих ферментов.

N-концевой домен. N-концевой домен можно разделить на два субдомена. Укладка обоих субдоменов представляет собой сильно искаженную версию мотива "спираль-поворот-спираль" (helix-turn-helix -НТН).

Субдомен 1 по данным сервера DALI проявил наибольшее сходство с доменом D1 эндонуклеазы рестрикции Fokl по архитектуре (Z-score 7.0) и укладке цепи (RSMD 2.2Á). Этот субдомен имеет трёхспиральный коровый мотив (al, a2, a3) и следующую за ним р-шпильку (Р2-РЗ). У Fokl имеется структура, напоминающая трёхспиральный кор никазы, но она составлена из

четырех спиралей (а1, а4, а5, аб), причем две короткие спирали а4 и а5, лежащие на одной оси, соответствуют спирали а2 никазы, а петля \Л у Рок! соответствует петле Ы никазы (рис. 8а,б). Так как структура Рок1 получена в комплексе с ДНК (1Гэк) и установлено, что спираль аб является узнающей, а петли Ы и Ь2 также важны для взаимодействия с ДНК, то можно предположить, что аналогичные структурные элементы никазы (аЗ, Ь2, 1Л), по-видимому, играют ту же роль.

Рис. 8. Структурные элементы Ы-концевых доменов никазы и Рок1.

а, в - субдомены 1 и 2, соответственно, никазы;

б, г — субдомены и 02, соответственно, Рок1.

Субдомен 2, в свою очередь, сходен с доменом В2 Рок1 (рис. 8в,г): как и в субдомене 2 никазы, у Рок1 в домене 02 шпилька аЗ-а4, соединяется с а-спиралью большого размера (а5), а затем переходит в протяженный р-структурный участок. У никазы спираль а5 почти в два раза длиннее

аналогичной спирали а5 FokI, ß-структурная область FokI (p2-ß5) заменена на р-шпильку (ß2—рЗ). Взаимодействующие между собой спирали al и аб ориентированы у обоих ферментов сходным образом. Наложение эквивалентных частей (более 160 атомов главной цепи) субдомена 2 никазы и D2 FokI дает величину RMSD, равную 4 А. Спираль а5 у FokI взаимодействует с большим желобком ДНК и является узнающей спиралью, что дает основание рассматривать спираль а5 никазы как узнающую спираль.

Линкерный домен. Архитектура второго (линкерного) домена проста. Он представляет собой пучок, состоящий из трех длинных антипараллельных a-спиралей соединенных короткими поворотами. Нужно отметить, что подобная структура у FokI отсутствует.

С-концевой домен. Этот домен имеет смешанную a/ß-укладку (a/ß-коровый мотив), где центральный ß-лист, состоящий из пяти р-тяжей (pl-p5), фланкирован с обеих сторон a-спиралями (рис. 9). Такая структура типична для эндонуклеаз рестрикции типа II. Элементы вторичной структуры С-домена никазы могут быть совмещены более чем 468 атомами главной цепи с соответствующими ßl-ß5 цепями и a2-a6 спиралями каталитического домена FokI с RMSD 4.0 А. Наложение 133 Са атомов никазы с аналогичными структурными элементами таких эндонуклеаз рестрикции как CfrlOI (lcfr), BsoBI (ldcl), или 129 Ca атомов NgoNIV (lfiu) дает выход 4.0, 3.5 and 3.8 Ä, соответственно, со значением Z-score около 6.

N.BspD6!

FokI

Рис. 9. Топология укладки С-концевых доменов

никазы и FokI.

Каталитический центр. Характерным мотивом каталитического центра эндонуклеаз рестрикции типа II является последовательность РВ....(0/Е)ХК.

Аналогичная последовательность, состоящая из остатков Р455, 0456, Е469, У470 выявлена нами и в никазе. Участие в катализе этих остатков согласуется с их положением в молекуле никазы (рис. 10). Как видно из рисунка, на расстоянии водородной связи с молекулой воды (02227) находятся карбоксильные группы трех остатков 0456, Е469 и Е482. Участие в катализе сразу трех кислых аминокислотных остатков - достаточно редкое явление. До сих пор известна лишь одна эндонуклеаза - ВатН1 - с подобным устройством каталитического центра. Следует отметить, что в отличие от типичного мотива каталитического центра в никазе, как и в ВатН1, отсутствует лизин.

✓ 1<)8 ^ \з.06

\2.61

% 02227 \

А450 р

D456

Рис. 10. Структура каталитического центра т - в452 4никазы и его окружение.

О- - г'' Пунктиром обозначены

расстояния между

2.83 "" - -----------атомами.

Участие аминокислотных остатков D456, Е469 и Е482 в катализе, подтверждается данными по мутагенезу другой никазы - N.BstNBI, которая на 100% гомологична N.BspD6I: каждая из замен D456A, Е469А и Е482А у этого фермента приводит к полной потере активности (Higgins L., 2001). Таким образом, последовательность P455D456Xi2E469V470XnE482 может быть идентифицирована как активный центр никазы.

Моделирование комплекса никазы с ДНК. Трехмерная структура двуспиральной ДНК была взята из трехмерной модели комплекса Fokl и ДНК (lfok). Построение модели комплекса проводилось с помощью программы для молекулярного докинга Нех4.5 и on-line сервера PatchDock, при этом учитывались результаты анализа структуры доменов никазы, данные о

поверхностном электростатическом потенциале молекулы никазы и данные о возможном смещении доменов друг относительно друга, рассчитанные на online сервере EINemo. Использовалась также информация о взаимодействии с ДНК других эндонуклеаз рестрикции.

Рис. 11. Модель комплекса никазы Ы.ВзрОб! с ДНК в двух ракурсах Голубым обозначен Ы-домсн (синим — узнающие а-спирали), зеленым — линкерный домен, красным — С-домен, оранжевым - ДНК.

Согласно полученной модели, узнавание ДНК обеспечивается Ы-доменом, в частности, узнающими спиралями аЗ субдомена 1 и а5 субдомена 2, которые взаимодействуют с большим желобком ДНК. Площадь взаимодействующей с ДНК поверхности ТЧ-домена составляет ~2000А2. Согласно модели, субдомен 1 взаимодействует с основаниями на 5'-конце узнаваемой последовательности (САйТС), а субдомен 2 узнает основания на 3'-конце этой последовательности.

Положение С-концевого домена относительно Ы-концевого домена в никазе, связанной с ДНК, представляет особый интерес. В трехмерной структуре комплекса Рок1 с ДНК С-домен расположен на большом расстоянии от места расщепления ДНК и его каталитический центр ориентирован по отношению к ДНК так, что он не может взаимодействовать с ДНК. Для того, чтобы каталитический домен Рок1 занял «рабочее» положение, необходимо его связывание с каталитическим доменом второй молекулы Рок1. В предложенной модели комплекса никазы с ДНК требуется лишь небольшое смещение каталитического домена относительно узнающего, для того чтобы

остатки, формирующие каталитический центр, расположились на расстоянии 4 п.о. от сайта узнавания никазы. В отличие от Fokl, смещение каталитического домена никазы, происходит, по-видимому, при связывании N-домена с узнаваемой последовательностью.

III. Использование никазы для детектирования ДНК-мишеней (метод NMB).

Принцип метода. Способность никазы разрезать только одну из цепей ДНК была использована нами при разработке нового метода детекции ДНК в реакции, протекающей при постоянной температуре (55°). В реакции участвуют никаза и молекулярный бикон, поэтому метод назван нами NMB-анализ (nickase-molecular beacon analysis).

Молекулярные биконы (MB) - это синтетические ДНК-зонды, имеющие структуру шпильки с петлей. Последовательность петли комплементарна последовательности участка ДНК-мишени. На одном конце олигонуклеотида находится флуоресцентная метка, а на другом — тушитель флуоресценции. В свободном состоянии флуорофор и тушитель флуоресценции находятся в непосредственной близости друг с другом, поэтому флуоресценция флуорофора гасится тушителем. При гибридизации MB с одноцепочечной ДНК-мишенью происходит разобщение флуорофора и тушителя в пространстве, что ведет к появлению сигнала.

Общий принцип предлагаемого метода представлен на рис. 12 и состоит в следующем. Петля молекулярного бикона комплементарна ДНК-мишени и содержит последовательность GAGTC, а ДНК-мишень должна содержать последовательность GACTC. Когда при гибридизации петли MB с мишенью образуется двуспиральный сайт, никаза разрезает MB, и образуется два одноцепочечных фрагмента. Фрагменты отделяются от ДНК мишени, если температура плавления каждого из них ниже температуры, при которой протекает реакция (55° С). Следовательно, после разрезания MB будет происходить необратимое усиление флуоресценции. Мишень, освобожденная от фрагментов, может принять следующий MB. Таким образом, процесс разрезания может повторяться много раз на одной мишени, обеспечивая накопление сигнала.

Молекулярный бикон

J3-

ДНК-мишень

Рис. 12. Принцип метода NMB-анализа.

Для проверки принципа метода были синтезированы три молекулярных бикона с длиной петли 23 н.о. и длиной шпильки 5, 7 и 9 п.о. В качестве флуорофора был выбран FAM, а тушителем флуоресценции — BHQ1. Длина петли была выбрана таким образом, чтобы гибридизация молекулярного бикона и мишени происходила при 55° С, и чтобы фрагменты петли, образующиеся после внесения никазой разрыва, отделялись от мишени. Регистрацию флуоресцентного сигнала в реальном времени проводили на приборе ABI Prism 7700. Исследование профиля тепловой денатурации этих трех MB показало, что оптимальное соотношение сигнала к шуму дает MB с длиной шпильки 7 п.о. (St7). Этот MB был использован в дальнейших экспериментах. В качестве модельной ДНК-мишени была использована одноцепочечная ДНК фага М13тр19.

50 нМ

Рис. 13. Зависимость интенсивности флуоресценции от

от

концентрации ДНК-мишенив в реакции расщепления МВ никазой. Стрелкой отмечен момент добавления никазы.

0 20 40 60 80 100 120 140 Время, мин

Как видно из рис. 13, флуоресцентный сигнал начинает возрастать с момента добавления никазы, что свидетельствует о расщеплении МВ никазой. Интенсивность флуоресцентного сигнала и скорость реакции зависит от концентрации мишени. При концентрации мишени менее 0.5 нМ флуоресцентный сигнал ненамного отличается от фонового, таким образом, предел чувствительности метода КМВ-анализа — 0,5 нМ ДНК. Изменение концентрации компонентов реакции - КС1 (50-300 мм), М§С12 (5-20 мм) и рН среды (7-9.5) не приводят к увеличению чувствительности ЫМВ-анализа.

Чтобы показать возможность использования ЫМВ-анализа для сложной смеси ДНК, был проведен эксперимент по гидролизу МВ никазой в присутствии избытка ДНК тимуса теленка. Было показано, что в присутствии посторонней ДНК сигнал уменьшается, но незначительно (рис. 14).

50 нМ ЛНК мишяни

10 -

Рис. 14. Влияние избытка ДНК тимуса теленка (1

мМ)

на

чувствительность ММВ-анализа.

а - в присутствии тимусной ДНК; б -в отсутствие ДНК.

0 20 40 60 80 100 120 Время, мин

Для оценки эффективности методов, использующих флуоресцентные зонды, принято рассчитывать фактор повышения флуоресценции. Значения этого фактора, рассчитанные для ЫМВ-анализа, при постоянной концентрации мишени (50 нМ) приведены в Таб. 2.

Таблица 2. Фактор повышения флуоресценции.

Конц. бикона St7 Время реакции, мин

5 10 20 30 40 60

0,5 цМ 4,71 13,18 16,11 16,76 17,20 17, 39

1 цМ 20, 09 28, 61 38, 38 42, 94 44, 74 46,27

2, 5 цМ 22, 69 33, 90 52,70 64, 43 76,21 89,15

5 ЦМ 20,34 31,48 51, 80 67, 48 81, 39 104,18

Из таблицы видно, что в присутствии 100-кратного избытка МВ по отношению к концентрации мишени фактор повышения флуоресценции достигает величины 100 после 60 минут инкубации с никазой. Поэтому, по крайней мере, 100 молекул бикона может быть расщеплено на одной молекуле мишени в течение 60 минут. Таким образом, за счет использования никазы чувствительность гибридизационного анализа увеличивается на два порядка.

ВЫВОДЫ:

1. Разработан способ введения в клетки Е. coli генов тРНК и ДНК-метилтрансферазы на одной плазмиде, что позволило повысить выход никазы N.BspD6I из штамма-продуцента более чем в 100 раз, по сравнению со штаммом, не содержащим дополнительно генов редких тРНК.

2. Найдены условия кристаллизации полноразмерной никазы (604 остатка) и определена ее пространственная структура с разрешением 1,84 А, первая для этого класса ферментов.

3. Никаза N.BspD6I представляет собой сложный трехдоменный белок. Сравнительный анализ структурных элементов никазы и эндонуклеаз рестрикции показал, что N-концевой домен выполняет функцию узнавания специфической последовательности ДНК, а С-концевой домен несет каталитическую функцию.

4. Построена модель комплекса никазы и ДНК. Согласно модели N- и С-домены взаимодействуют с разными участками ДНК и остатки С-домена, формирующие каталитический центр, ориентированы относительно ДНК так, что способны обеспечить расщепление фосфодиэфирной связи одной цепи.

5. Разработан метод, использующий никазу и молекулярный бикон, на два порядка повышающий чувствительность флуоресцентного гибридизационного анализа ДНК.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Рогулин Е.А.. Перевязова Т.А., Железная JI.A., Матвиенко Н.И. Плазмида pRARE в качестве вектора для клонирования при получении суперпродуцента сайт-специфической никазы N.Äs/?D6I. Биохимия, 2004, 69(10), 1381-1387.

2. G. S. Kachalova, Е. A. Rogulin. R. I. Artyukh, Т. A. Perevyazova, L. А. Zheleznaya, N. I. Matvienko and Н. D. Bartunik. Ciystallization and

preliminary crystallographic analysis of the site-specific DNA nickase Nb.BspD6I. Acta Crystallographies 2005, F61, 332-334.

3. Ludmila A. Zheleznaya, Damir S. Kopein, Evgeniy A. Rogulin. Sergey I. Gubanov, Nikolay I. Matvienko. Significant enhancement of fluorescence upon hybridization of a molecular beacon to a target DNA in the presence of a site-specific DNA nickase. Analytical Biochemistry, 2006, 248, 123126.

4. Рогулин E.A.. Перевязова T.A., Железная Л.А., Матвиенко Н.И. Перспективы использования сайт-специфических никаз в новом методе генодиагностики. Сборник тезисов IV Всероссийской Научно-Практической Конференции «Генодиагностика инфекционных заболеваний. Москва, 22-24 октября 2002 г., с 416-417.

5. Рогулин Е.А.. Перевязова Т.А., Бубнова О.А., Железная Л.А. Клонирование, секвенирование и получение суперпродуцента новой сайт-специфической никазы BspD6l. Сборник тезисов 7-ой Пущинской школы-конференции молодых учёных «Биология - наука XXI века». Пущино, 14-18 апреля 2003 г., с. 101.

6. Rogulin Е.А.. Perevyazova Т.А., Bubnova О.А. Zheleznaya L.A. Cloning and isolation of site-specific nickase 5spD6I. Сборник тезисов конференции молодых ученых, аспирантов и студентов по молекулярной биологии и генетике «50 лет двойной спирали». Киев, 25-27 сентября 2003 г., с. 202.

7. Рогулин Е.А.. Перевязова Т.А., Бубнова О.А., Железная Л.А. Новые методы гибридизации и изотермической амплификацииДНК для диагностики вирусных и наследственных заболеваний на основе сайт-специфических никаз. Сборник тезисов II Московского международного конгресса «Биотехнология: Состояние и перспективы развития». Москва, 10-14 ноября 2003 г., с. 75-76.

8. Рогулин Е.А.. Перевязова Т.А., Бубнова О.А., Железная Л.А. Сайт-специфическая никаза BspD6\\ клонирование, выделение и возможности её использования в гибридизационном анализе ДНК. Сборник тезисов Международной конференции «Наука и Бизнес: Поиск и использование новых биомолекул: биоразнообразие, окружающая среда и биомедицина». Пущино, 10-12 марта 2004 г., с. 136.

9. Рогулин Е.А.. Юнусова А.К. Пространственная структура сайт-специфической никазы BspD6I. Сборник тезисов 10-ой Пущинской школы-конференции молодых учёных «Биология — наука XXI века». Пущино, 17-21 апреля 2006 г., с. 43.

10.Kachalova G.S., Rogulin Е.А.. Artyukh R.I., Perevyazova Т.A., Zheleznaya L.A., Matvienko N.I., Bartunik H.D. "Crystal structure of site-specific DNA nickase Nb.BspD6I". Доклад на конференции Deutsche Gesellschaft fur Kristallographie, Freiburg (Germany) April 3-4 2006,. p. 65.

к исполнению 21/09/2006 Исполнено 22/09/2006

Заказ № 653 Тираж: 100 экз.

ООО «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 Москва, Варшавское ш., 36 (495) 975-78-56

www.autoreferat.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Рогулин, Евгений Алексеевич

ВВЕДЕНИЕ

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Общее представление о системах рестрикции-модификации

1.2. Разнообразие эндонуклеаз рестрикции типа II

1.3. Взаимодействие эндонуклеаз типа II с узнаваемой последовательностью

1.4. Пространственная структура эндонуклеаз рестрикции типа II

1.5. Биологическая роль систем рестрикции-модификации

1.6. Никующие эндонуклеазы

1.6.1. Искусственные никазы 39 Получение никаз с нарушенным димеризационным интерфейсом 39 Получение никаз путем инактивации одного из каталитически сайтов

Никование ДНК с использованием пептидных олигоиуклеотидов

1.6.2. Практическое применение сайт-специфических никаз

2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

2.1. Материалы

3.2. Методы 57 Рассчет значений индекса кодонового соответствия 57 Выделение плазмидной ДНК из E.coli 58 ПЦР-амплификация 58 Оч истка ДНК на Silica

Выделение двухцепочечной формы ДНК фага на основе М13 (мини-преп) 59 Выделение двухцепочечной формы ДНК фага на основе М13 (макси-преп)

Выделение одноцепочечной формы ДНК фага на основе М

Скринингрекомбинантных клонов при помощи ПЦР с колоний

Электрофорез белков в ПААГ

Получение компетентных клеток Е. coli

Трансформация компетентных клеток Е. coli

Индукция экспрессии генов в клетках Е. coli

Получение фага ХСЕ

Определение титра фага 64 Проверка способности фага ХСЕ6 активировать транскрипцию с промотора фага Т

Получение клеток BL21, не чувствительных к присутствию метилаз

Выделение никазы N.BspD6I

Определение активности никазы

Метод NMB-анализа

3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

3.1. Получение сулерпродуцента никазы

3.1.1. Получение продуцента никазы на основе клеток Е. coli TOPI OF'

3.1.2. Определение влияния кодонового состава на уровень экспрессии белка

3.1.3.Создание генетической конструкции, несущей одновременно гены редких транспортных РНК и ДНК-метилтрансферазы SscLlI

3.1.4. Конструирование продуцента никазы на основе клеток

E.coli BL21(DE3)

3.2. Выделение никазы

3.3. Определение пространственной структуры никазы

3.3.1. Кристаллизация никазы

3.3.2. Определение пространственной структуры никазы

3.4. Анализ пространственной структуры никазы

3.4.1. Субдомен 1 N-концевого домена никазы

3.4.2. Субдомен 2 N-концевого домена никазы

3.4.3. Линкерный домен

3.4.4. С-концевой домен

3.4.5. Каталитический центр никазы

3.4.6. Моделирование комплекса никазы с ДНК

3.5. Метод детекции нуклеиновых кислот с помощью молекулярных биконов и никазы

Введение Диссертация по биологии, на тему "Никующая эндонуклеаза N.BspD6I"

Никование двуспиральной ДНК, т.е. внесение разрыва (ника - nick) только в одну цепь ДНК, вовлечено во многие биологические процессы, такие как инициация репликации ДНК, ДНК-рекомбинация, репарация, конъюгативная мобилизация некоторых плазмид. Никующие эндонуклеазы, участвующие в биологических процессах, действуют либо в комплексе с другими белками, либо узнают сложные последовательности ДНК и поэтому не могут использоваться для практических целей. Недавно никующие эндонуклеазы (никазы), которые узнают короткую специфическую последовательность, вносят разрыв в ДНК в фиксированном положении относительно этой последовательности и действуют в виде мономеров, были выделены из бактерий. Эти никазы быстро нашли практическое применение. На их основе уже создан ряд новых биотехнологических методов, таких как изотермическая реакция для амплификации олигонуклеотидов, амплификация геномной ДНК, построение простейшего линейного мотора. Новый метод детектирования ДНК-мишеней на основе никазы предложен в настоящей работе. Предполагается, что никазы могут заменить эндонуклеазы рестрикции в клонировании ДНК и что некоторые проблемы нанотехнологий на основе ДНК могут быть решены с применением этих ферментов. Таким образом, никующие эндонуклеазы становятся ещё одним инструментом молекулярной биологии Ограниченное количество природных никующих сайт-специфических эндонуклеаз стимулирует интенсивное конструирование на основе эндонуклеаз рестрикции искусственных никаз с новыми специфичностями. Информаци л О ИрОС'фс»! СТ ВС и и о и структуре никующих эндонуклеаз необходима как для выяснения механизма внесения разрыва в одну пепь ДНК, гак и для рационального конструирования никааз с новыми специфичностями.

Никаза N.BspD6I (70.8 кДа) ранее была найдена в штамме Bacillus species D6. Она узнает на двухспиральной ДНК последовательность (сайт) 5'-GAGTC-3'/5'-GACTC-3' и расщепляет только цепь, содержащую последовательность GAGTC на расстоянии 4 н.п. от сайта узнавания в сторону 3'-конца. На сегодняшний день решена пространственная структура лишь одной нуклеазы, расщепляющей ДНК в стороне от сайта узнавания - эндонуклеазы рестрикции Fokl. Этот фермент, как и никаза, узнает пентануклеотидный сайт, однако место расщепления ДНК у Fokl находится гораздо дальше от сайта узнавания (9/13).

Недавно было показано, что никаза N.BspD6I, которой посвящена настоящая работа, сама является субъединицей гетеродимерной эндонуклеазы R.BspD6I типа II. В то время как подавляющее большинство эндонуклеаз рестрикции типа II требует димеризации для расщепления ДНК, N.BspD6I способна без участия второй субъединицы связываться с узнаваемой последовательностью и разрезать одну цепь ДНК. Поэтому рассмотрение структуры никазы целесообразно проводить в стравнении с эндонуклеазами рестрикции типа II.

Целью настоящей работы было определение пространственной структуры никующей эндонуклеазы N.BspD6I и разработка на основе никазы нового метода детектирования ДНК-мишеней. Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

- сконструировать штамм-суперподуцент никазы;

- отработать технику выделения никазы с чистотой не менее 95%;

- найти условия концентрирования (не менее 20 мг/мл) и кристаллизации никазы;

- получить набор дифракционных данных, достаточный для определения пространственной структуры;

- разработать метод гибридизационного анализа ДНК с использованием никазы.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Рогулин, Евгений Алексеевич

5. ВЫВОДЫ:

6. Список публикаций по материалам диссертационной работы

1. Рогулин Е.А., Перевязова Т.А., Железная J1.A., Матвиенко Н.И. Плазмида pRARE в качестве вектора для клонирования при получении суперпродуцента сайт-специфической никазы N.Z?.s/?D6I. Биохимия, 2004, 69(10), 1381-1387.

2. G. S. Kachalova, Е. A. Rogulin, R. I. Artyukh, Т. A. Perevyazova, L. А. Zheleznaya, N. I. Matvienko and Н. D. Bartunik. Crystallization and preliminary crystallographic analysis of the site-specific DNA nickase Nb.BspD6I. Acta Crystallographica, 2005, F61, 332-334.

4. Рогулин E.A., Перевязова T.A., Железная Jl.A., Матвиенко Н.И. Перспективы использования сайт-специфических никаз в новом методе генодиагностики. Сборник тезисов IV Всероссийской Научно-Практической Конференции «Генодиагностика инфекционных заболеваний. Москва, 22-24 октября 2002 г., с 416-417.

5. Рогулин Е.А., Перевязова Т.А., Бубнова О.А., Железная Л.А. Клонирование, секвенирование и получение суперпродуцента новой сайт-специфической никазы BspD6l. Сборник тезисов 7-ой Пущинской школы-конференции молодых учёных «Биология - наука XXI века». Пущино, 1418 апреля 2003 г., с. 101.

6. Rogulin Е.А., Perevyazova Т.А., Bubnova О.А. Zheleznaya L.A. Cloning and isolation of site-specific nickase BspD6l. Сборник тезисов конференции молодых ученых, аспирантов и студентов по молекулярной биологии и генетике «50 лет двойной спирали». Киев, 25-27 сентября 2003 г., с. 202.

7. Рогулин Е.А., Перевязова Т.А., Бубнова О.А., Железная Л.А. Новые методы гибридизации и изотермической амплификацииДНК для диагностики вирусных и наследственных заболеваний на основе сайт-специфических никаз. Сборник тезисов II Московского международного конгресса «Биотехнология: Состояние и перспективы развития». Москва, 10-14 ноября 2003 г., с. 75-76.

8. Рогулин Е.А., Перевязова Т.А., Бубнова О.А., Железная Л.А. Сайт-специфическая никаза BspD6l\ клонирование, выделение и возможности её использования в гибридизационном анализе ДНК. Сборник тезисов Международной конференции «Наука и Бизнес: Поиск и использование новых биомолекул: биоразнообразие, окружающая среда и биомедицина». Пущино, 10-12 марта 2004 г., с. 136.

9. Рогулин Е.А., Юнусова А.К. Пространственная структура сайт-специфической никазы BspD6I. Сборник тезисов 10-ой Пущинской школы-конференции молодых учёных «Биология - наука XXI века». Пущино, 14-18 апреля 2006 г., с. 43.

10. Kachalova G.S., Rogulin Е.А. Artyukh R.I., Perevyazova Т.A., Zheleznaya L.A., Matvienko N.I., Bartunik H.D. "Crystal structure of site-specific DNA nickase Nb.BspD6I". Доклад на конференции Deutsche Gesellschaft fur Kristallographie, Freiburg (Germany) April 3-4 2006,. p. 65.

4. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Основной задачей настоящей работы было определение пространственной структуры эндонуклеазы нового типа - никующей эндонуклеазы N.BspD6I, которая в виде мономера узнает короткую специфическую последовательность и расщепляет только одну предопределенную цеь ДНК. Задачу достижения высокого выхода белка удалось решить путем введения в клетки продуцента генов редких у Е. coli тРНК и гена ДНК-метилтрансферазы в составе одной плазмиды - pRARE. Информация о сайте Aval в нуклеотидной последовательности pRARE может теперь использоваться при клонировании любых генов в pRARE. Таким образом, плазмида pRARE может использоваться в качестве вектора для клонирования. Это может быть полезно при получении продуцентов белков с неоптимальным в Е. coli кодоновым составом при необходимости введения двух и более генов на разных векторах в клетки продуцента.

На этапе кристаллизации никазы мы ожидали столкнуться с большими проблемами, поскольку никаза пока самая большая эндонуклеаза (70 кДа) из тех, пространственная структура которых определена. Однако оказалось, что никаза относительно легко кристаллизуется. В подобранных условиях при высокой концентрации никазы (25 мг/мл) кристаллы образуются достаточно быстро. Кристаллизация никазы в этих условиях многократно воспроизводилась. Качество полученных кристалов позволило получить дифракционную картину, достаточную для определения пространственной структуры никазы.

Сравнение структуры никазы со структурами других эндонуклеаз рестрикции выявило наибольшее сходство ее структуры со структурой эндунуклеазы Fokl, которая, как и никаза, расщепляет ДНК в стороне ео сайта узнвания. Мы установили, что узнающие и каталитические домены у этих двух белков очень близки (несмотря на слабую гомологию их аминокислотных последовательностей - менее 20%). Однако проявляют активность эти ферменты по-разному. Эндонуклеаза Fokl работает, как правило, в виде димера и для проявления активности требует два сайта узнавания. Никаза проявляет активность в виде мономера, внесение разрыва в цепь ДНК происходит, очевидно, сразу после связывания специфической последовательности. Такое поведение объясняется особенностями организации доменов в составе молекулы фермента.

В имеющейся на сегодняшний день структуре комплекса эндонуклеазы Fokl с ДНК С-домен расположен на большом расстоянии от места расщепления ДНК и его каталитический центр ориентирован по отношению к ДНК так, что он не может взаимодействовать с ДНК [Wah et al., 1997]. По-видимому, такое положение С-домен занимает не только в кристаллах Fokl, но и в растворенном белке. Для того чтобы каталитический домен Fokl занял «рабочее» положение, необходимо его связывание с каталитическим доменом второй молекулы Fokl [Vanamee el al., 2001]. Мы предполагаем, что в отличие от Fokl у никазы взаимодействие N- и С-концевых доменов с ДНК происходит одновременно. Это объясняет, почему никаза способна расщеплять ДНК в виде мономера и не нуждается в димеризации. В предложенной нами модели комплекса никазы с ДНК требуется лишь небольшое смещение каталитического домена относительно узнающего, для того чтобы остатки, формирующие каталитический центр, расположились на расстоянии 4 п.н от сайта узнавания никазы.

Никазы находят все большее применение: новые методы с использованием никаз, иногда весьма оригинальные, появляются все чаще. Нами предложен новый флуоресцентный метод, использующий никазу N.BspD6I, названный нами методом NMB-анализа. Основное достоинство метода NMB-анализа - более высокая надежность и застрахованность от ложноположительного результата по сравнению с существующими флуоресцентными методами детектирования ДНК, основанными на использовании ПЦР. В этих методах величина флуоресцентного сигнала пропорциональна количеству молекул мишени, которое увеличивается во время реакции. В методе NMB-анализа количество молекул мишени в ходе реакции не изменяется, при этом амплификация флуоресцентного сигнала происходит за счет разрезания петли молекулярного бикона сайт-специфической никазой. Таким образом, достоверность получаемых результатов заложена в самой идее метода. Но, нужно отметить, что метод NMB-анализа уступает в чувствительности методам детектирования ДНК, основанными на использовании ПЦР. Заманчивой выглядит перспектива объединения в одной реакции техники ПЦР и детектирования ДНК с помощью никазы и молекулярных биконов. В этом случае можно ожидать, что созданный метод будет сочетать в себе чувствительность ПЦР и надежность метода NMB-анализа. Однако непреодолимым пока препятствием является отсутствие термостабильных никаз, способных выдержать нагрев до 95 °С и выше. Никаза N.BspD6I обладает некоторой термостабильностью (оптимум работы 55°С), однако при 80°С она инактивируется. Возможно, полученные данные по структуре никазы будут способствовать созданию более термостабильного фермента на основе N.BspD6I.

Но уже сегодня метод NMB анализа можно использовать для амплификации сигнала в реакции изотермической амплификации ДНК. В частности, его можно применять для отслеживания протекания в реальном времени таких реакций как амплификация по типу катящегося кольца (rolling circle amplification -RCA) и разветвленная амплификация по типу катящегося кольца (hiper-branched rolling circle amplification - HRCA) [Lizardi et al, 1998, Nilsson et al, 2002]. Нуклеотидная последовательность петли молекулярного бикона, которая содержит сайт никазы, может быть включена в кольцевые зонды (padlock probes) [Banar et al,

2001] в стороне от области, комплементарной последовательности мишени. В этом случае один и тот же молекулярный бикон может использоваться для обнаружения различных мишеней. Сочетание молекулярного бикона и никазы можно использовать также в методе LAMP (loop-mediated isothermal amplification) [Notomi et al, 2000]. В этом случае петля молекулярного бикона должна быть комплементарной петлям амплифицируемой ДНК, имеющим произвольные последовательности.

Инфрмация о стуктуре никазы и возможных аминокслотных остатков, участвующих в узнавании, важна, так как открывает возможность для получения никаз с новыми специфичностями, в частности, никаз, узнающих более короткий сайт ДНК. Получение таких ферментов представляет интерес как для фундаментальной науки, поскольку приведет к получению новых данных по ДНК-белковому взаимодействию, так и для практическогого применения.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Рогулин, Евгений Алексеевич, Пущино

1. Acosta-Rivero, N., Sanchez, J.C., Morales, J. Improvement of human interferon HUIFNalpha2 and HCV core protein expression levels in Escherichia coli but not of HUIFNalpha8 by using the tRNA(AGA/AGG). Biochem. Biophys. Res. Commun., 2002.296(5), 1303-9

2. Ahmad, I., Krishnamurthy, V. and Rao, D.N. DNA recognition by the EcoP15I and EcoPI modification methyltransferases. Gene, 1995.157,143-147

3. Alikhanian, S.I., el al. Preparation of functioning recombinant (hybrid) DNA molecules in vitro (genetic engineering experiments). Genetik, 1975.11(11), 34-45

4. Aim, R.A., Ling, L.-S.L., Moir, D.T., King, B.L., Brown, E.D., Doig, P.C. Genomic-sequence comparison of two unrelated isolates of the human gastric pathogen Helicobacter pylori. Nature, 1999. 397,176-180

5. Altschul, S.F., et al. Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs. Nucl. Acids Res., 1997. 25(17), 3389-402

6. Andras, S.C., Power, J.B., Cocking, E.C., Davey, M.R. Strategies for signal amplification in nucleic acid detection. Mol. Biolechnol, 2001. 9(1), 29-44

7. Arber, W. and Dussoix, D. Host Specificity of DNA Producted by Escherichia Coli: I. Host controlled modification of bacteriophage lambda. J. Mol. Biol., 1962. 5,18

8. Athanasiadis, A., Vlassi, M., Kotsifaki, D., Tucker, P.A., Wilson, K.S. and Kokkinidis, M. Crystal structure of Pvull endonuclease reveals extensive structural homologies to EcoRV. Nature Struct. Biol, 1994.1,469—475

9. Banar, J., Nilsson, M., Isaksson, A., Mendel-Hartvig, M., Antson, D.-O., Landegren, U. More keys to padlock probes: mechanisms for highthroughput nucleic acid analysis. Curr. Opin. Biotechnol., 2001.12, 11-15

10. Bath, J., Green, S.J. and Turberfield, A.J. A free-running DNA motor powered by a niching enzyme. Angew. Chem. Int. Ed, 2005. 44, 4358-4361

11. Bath, A. J., Milsom S E., Gormley N A. and Halford S. E. Many Type lis Restriction Endonucleases Interact with Two Recognition Sites before Cleaving DNA. J. Biol. Chem.,2002. 277(6), 4024-33

12. Bellamy, S.R.W., Milsom, S.E., Scott, D.J., Daniels, L.E., Wilson, G.G., Halford, S.E. Cleavage of individual DNA strands by the different subunits of the heterodimeric restriction endonuclease BbvCI. J. Mol. Biol., 2005. 348, 641-653

13. Berg, D.E. and Logan, R.P. Bioassays, 1997.19, 86-90

14. Bertani, G. and Weigle, J.J. Host controlled variation in bacterial viruses. J. Bacteriol, 1953.65,113

15. Besnier, C.E., and Kong, H. Converting Mlyl endonuclease into a nicking enzyme by changing its oligomerization state. EMBO J., 2001. 21, 782-786

16. Bilcock, D.T., Daniels, L.E., Bath, A.J. and Halford, S.E. Reactions of type II restriction endonucleases with 8-base pair recognition sites. J. Biol. Chem., 1999. 274, 36379-36386

17. Bitinaite, J., Wah, D.A., Aggarwal, A.K. and Schildkraut, I. Fokl dimerization is required for DNA cleavage. Proc. Nail. Acad. Sci. U.S.A., 1998. 95,10570-10575

18. Bochtler, M., Szczepanowski, R.H., Tamulaitis, G., Grazulis S., Czapinska, H., Manakova, E., Siksnys, V. Nucleotide flips determine the specificity of the Ecll8kl restriction endonuclease. EMBO J., 2006. 25(10), 2219-29

19. Brinkmann, U., Mattes, R.E. and Buckel, P. Gene, 1989. 85, 109-114

20. Broude, N.E. Stem-loop oligonucleotides: a robust tool for molecular biology and biotechnology. Trends Biotechnol., 2002. 20, 249-256

21. Bujnicki, J.M. Understanding the evolution of restriction-modification systems: clues from sequence and structure comparisons. Acta Biochemica Polonica, 2001. 48, 935967

22. Bulmer, M. Coevolution of codon usage and transfer RNA abundance. Nature, 1987. 325, 728-730

23. Bulmer, M. The effect of context on synonymous codon usage in genes with low codon usage bias. Nucleic Acids Res., 1990.18, 2869-2873

24. Bylund, G.O., Burgers, P.M. Replication protein A-directed unloading of PCNA by the Ctfl8 cohesion establishment complex. Mol. Cell. Biol., 2005. 25(13), 5445-55

25. Catto, L.E., Ganguly, S., Milsom, S.E., Welsh, A.J. and Halford, S.E. Protein assembly and DNA looping by the Fokl restriction endonuclease. Nucl. Acids Res., 2006. 34(6), 1711-1720

26. Chan, S., Zhu, Z., Van Etten, J.L. and Xu, S. Cloning of CviPII nicking and modification system from chlorella virus NYs-1 and application of Nt. CviPII in random DNA amplification. Nucl. Acids Res., 2004. 32(21), 6187-6199

27. Daniels, L.E., Wood, K.M., Scott D.J. and Halford, S.E. Subunit Assembly for DNA Cleavage by Restriction Endonuclease SgrAI. J. Mol. Biol., 2003. 327, 579-591

28. Deibert, M., Grazulis, S., Sasnauskas, G., Siksnys, V., Huber, R. Structure of the tetrameric restriction endonuclease NgoMIV in complex with cleaved DNA. Nat. Struct. Biol., 2000. 7,792-799

29. Degtyarev, S.Kh., Zilkin, P.A., Prihodko, G.G., Repin, V.E. and Rechkunova, N.I. Molekularnaja Biologija, 1989. 23, 1051-1056

30. Demidov, V.V., Protozanova, E., Izvolsky, K.I., Price C., Nielsen, P.E. and Frank-Kamenetskii, M.D. Kinetics and mechanism of the DNA double helix invasion by pseudocomplementary PNAs. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 2002. 99, 15953-15958

31. Dorner, L.F. and Schildkraut, I. Direct selection of binding proficient/catalytic deficient variants of ВатШ endonuclease. Nucl. Acids Res., 1994. 22, 1068-1074

32. Drexler, H. and Christensen, J.R. Genetic crosses between restricted and unrestricted phage T1 in lysogenic and nonlysogenic hosts. Virology, 1961.13, 31-39

33. Duhovny, D., Nussinov, R. and Wolfson, H.J. Efficient unbound docking of rigid molecules. WABI2002, LNCS 2452, pp. 185-200, 2002.

34. Ellis, D., Dryden, D.T.F., Berge, Т., Edwardson, J.M. and HendersoT R.M. Direct observation of DNA translocation ana cleavage by atomic force microscopy. Nuture Struct. Biol., 1999. 6,15-17

35. Engler, L.E., Welch, K.K. and Jen-Jacobson, L. Specific binding by endonuclease to its DNA recognition site GATATC. J. Mol. Biol., 1997. 269, 82-101

36. Gautier, G.M., Codon, C. Usage in bacteria: correlation with gene expressivity. Nuc. Acids Res., 1982.10, 7055-7074

37. Hadi, S.M., Bachi, В., Shepherd, J.C.W., Yuan, R., Ineichen, K. and Bickle, T.A. DNA Recognition and Cleavage by the Eco?\5 restriction endonuclease. J. Mol Biol., 1979.134,655-666

38. Hafner, G.J., Yang, I.C., Wolter LC, Stafford, M.R., Giffard, P.M. Isothermal amplification and multimerization of DNA by Bst DNA polymerase. Biotechniques, 2001.30(4), 852-6, 858, 860

39. Handa, N., Nakayama, Y., Sadykov, M. and Kobatashi, I. Experimental gemone evolution: large-scale genome rearrangements associated with resistance to replacement of a chromosomal restriction modification gene complex. Mol. Microbiol., 2001. 40,932-940

40. Hebert, M.L. and Wells, R. D. Roles of double-strand breaks, nicks and gaps in stimulating deletions of CTG CAG repeats by intramolecular DNA repair. J. Mol. Biol., 2005.353, 961-979

41. Hegtpeth, J., Goodman, H.M., Boyer, H.W. DNA nucleotide sequence restricted by the RI endonuclease. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 1972. 69, 3448-3452

42. Heiter, D.F., Lunnen, K.D. and Wilson, G.G. Site-specific DNA-nicking mutant of the heterodimeric restriction endonucclease R. BbvCI. J. Mol. Biol., 2005. 348, 631-640

43. Higgins, L.S., Besnier, C., and Kong, H. The nicking endonuclease N.ifa/NBI is close related to type IIS restriction endonucleases Mlyl and Plel. Nucleic Acids Res., 2001. 29, 2492-2501

44. Horton, J.P. and Cheng, X. PvuW endonuclease contains two calcium ions in active sites. J. Mol Biol, 2000. 300, 1049-1056

45. Janulailis, A., Petrusyte, M., Maneliene, Z., Klimasauskas, S. and Burkus, V. Purification and properties of the EcoSll restriction endonuclease and methylase -prototypes of a new class (typelV). Nucl. Acids Res., 1992. 20, 6043-6049

46. Jeltsch, A. and Pingoud, A. Horizontal gene transfer contributes to the wide distribution and evolution of type II restriction-modification systems. J. Mol Evol,. 1996. 42,91-96

47. Jo, K. and Topal, M.D. Effects on Nael-DNA recognition of the leucine to lysine substitution that transforms restriction endonuclease Nael to a topoisomerase: a model for restriction endonuclease evolution Nucleic Acids Res., 1996. 24,4171-4175

48. Karlin, S., Burge, C. and Campbell, A.M. Statistical analysis of count and distributions of restriction sites in DNA sequences. Nucl. Acids Res., 1992.20,1363-1370

49. Karlin, S., Campbell, A.M. and Mrazek, J. Comparative DNA analysis across diverse genomes. Annu. Rev. Genet., 1998. 32,185-225

50. Kessler, C. and Manta, V. Specificity of restriction endonucleases and DNA modification methyltransferases a review (Edition 3). Gene, 1990. 92, 1-248

51. Kim,Y., Grable.J.C., Love,R., Greene,P.J. and Rosenberg,J.M. Refinement of ЕсоШ endonuclease crystal structure: A revised protein chain tracing. Science, 1990. 249, 1307-1309

52. Kita, K., Tsuda, J., Okamoto, K., Yanase, H. and Tanaka, M. Evidence of horizontal transfer of the £co01091 restriction-modification gene to Escherichia coli chromosomal DNA. J. Bacteriol., 1999.181, 6822-6827

53. Kobayashi, I. Behavior of restriction-modification systems as selfish mobile elements and their impact on genome evolution. Nucl. Acids Res., 2001. 29, 3742-3756

54. Kobayashi, I., Nobusato, A., Kobayashi-Takahashi, N. and Uchiyama, I. Shaping the genome-restriction-modification systems as mobile genetic elements. Curr. Opin. Genet. Dev., 1999. 9, 649-656

55. Kobayashi, I. Selfishness and death: raison d'etre of restriction, recombination and mitochondria. Trends Genet., 1998.14, 368-374

56. Kong, H. Analyzing the functional organization of a novel restriction modification system, the Bcgl system. JMol Biol. 1998. 279(4), 823-32

57. Kong, H., Smith, C.L. Substrate DNA and cofactor regulate the activities of the multi-funtional restriction-modification enzyme, Bcgl. Nucl. Acids Res., 1997. 25, 36873692

58. Kostrewa, D. and Winkler, F.K. Mg2+ binding to the active site of EcoKV endonuclease: a crystallographic study of complexes with substrate and product DNA at 2A resolution. Biochemistry, 1995. 34, 683-696

59. Kovall, R.A. and Matthews, B.W. Type II restriction endonucleases: Structural, functional and evolutionary relationships. Curr. Opin. Chem. Biol., 1999. 3, 578-583

60. Kuhn, H., Hu, Y., Frank-Kamenetskii, M.D. and Demidov, V.V. Artificial Site-Specific DNA-Nicking System Based on Common Restriction: Enzymes Assisted by PNA Openers. Biochemistry, 2003. 42, 4985-4992

61. Kunst, F., Ogaswara, N., Moszer, I., Albertini, A.M., Alloni, G., Azevedo, V., Bertero, M.G., Bessieres, P., Bolotin, S. The complete genome sequence of the gram-positive bacterium Bacillus subtilis. Nature, 1997. 390, 249-256

62. Makoff, A.J., Oxer, M.D., Romanos, M.A., Fairweather, N.F. and Ballantine, S. Expression of tetanus toxin fragment С in E.coli: high level expression by removing rare codons. Nucl. Acids Res., 1989.17(24)

63. Martin, S.L., Vrhovski, В., Weiss, A.S. Total synthesis and expression in Escherichia coli of a gene encoding human tropoelastin. Gene, 1995.154,159-166(8)

64. Meisel, A., et al. Type III restriction endonucleases translocate DNA in a reaction driven by recognition site-specific ATP hydrolysis. EMBOJ., 1995.14, 2958-2966

65. Meselson, M. and Yuan, R. DNA restriction enzyme from E. coli. Nature, 1968. 217(134), 1110-1114

66. Morgan, R.D., Calvet, C., Demeter, M., Agra, R. and Kong, H. Characterization of the specific DNA nicking activity of restriction endonuclease N.BstNBI. Biol. Chem., 2000.381,1123-1125

67. Mouchirond, D.L. Expression pattern and, surprisingly, gene length shape codon usage in Caenorhabditis, Drosophila and Arabidopsis . Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 1999. 96, 4482-4487

68. Mucke, M, Grelle G., ВеЫке, J., Kraft, R., Kruger D.H. and Reuter, M. EcoRII: a restriction enzyme evolving recombination functions? EMBO J., 2002. 21(19), 52625268

69. Murray, N.E. Type I restriction systems: sophisticated molecular machines. Microbiol. Mol. Biol. Rev., 2000. 64, 412-434

70. Naito, Т., Kusano, K., Kobayashi, I. Selfish Behavior of Restriction-Modification Systems. Science, 1995. 267, 897-899

71. Nallur, G., Luo, C., Fang L., Cooley, S., Dave, V., Lambert, J., Kukanskis, K., Kingsmore, S., Lasken, R., Schweitzer, B. Signal amplification by rolling circle amplification on DNA microarrays. Nucl. Acids Res., 2001. 29(23), 118

72. Newman, M., Strzelecka, Т., Dorner, L.F., Schildkraut, I and Aggarwal, A.K. Structure of restriction endonuclease ВатШ and its relationship to ЕсоШ. Nature, 1994.368, 660-664

73. Novy, R., Drott, D., Yaeger, K. and Mierendorf, R. Overcoming the codon bias of E. coli for enhanced protein expression. Innovation, 2001.12,1-3/ (Novagen, Inc.)

74. Nuovo, G.J. In situ strand displacement amplification: an improved technique for the detection of low copy nucleic acids. Diagn. Mol. Pathol., 2000. 9(4), 195-202

75. Percudani, R., Pavesi, A., Otonello, S. Transfer RNA redudancy and translation selection in Saccharomyces cereviseae. J. Mol. Biol., 1997. 268, 322-330

76. Perona, J.J. and Martin, A.M. Conformational transitions and structural deformability of EcoRY endonuclease revealed by crystallographic analysis. J. Mol. Biol, 1997. 273, 207-225

77. Pfannschmidt, C., and Langowski, J. Superhelix organization by DNA curvature as measured through site-specificlabeling. J. Mol Biol, 1998.275, 601-611

78. Piekarowicz, A., Golaszewska, M., Sunday, A.O., Siwinska, M. and Stein, D.C. The HaeIV restriction modification system of Haemophilus aegyptius is encoded be a single polypeptide. J. Mol. Biol, 1999. 293,1055-1065

79. Pingoud, A., Jeltsch, A., Maxwell, A., Sherratt, D. Enzymes that keeps DNA under control. EMBO reports, 2001. 21, 271-276

80. Pingoud, A. and Jeltsch. A. Structure and function of type II restriction endonucleases. Nucl Acids Res., 2001. 29(18), 3705-3727

81. Post, L.E. and Nomura, M. DNA sequences from the str operon of Escherichia coli. J. Biol Chem., 1980. 255, 4660-4666

82. Protozanova, E., Demidov V.V., Soldatenkov, V., Chasovskikh, S. and Frank-Kamenetskii M.D. Tailoring the activity of restriction endonuclease Plel by PNA-induced DNA looping. EMBO Rep., 2002.3(10), 956-961

83. Reich, S., et al. DNA cleavage by the restriction endonuclease EcoP15I. Biochem. Soc. Trans., 2000. 28, A331

84. Roberts, R.J., Vineze, Т., Posfai, J. and Maeelis, D. REBASE restriction enzymes and DNA methyltransferases. Nucl. Acids Res., 2005. 33,230-232

85. Robinson, M., Lilley, R., Little, S., Emtage, J.S., Yarranton, G., Stephens, P., Millican, A., Eaton, M., Humphreys, G. Codon usage can affect efficiency of translation of genes in Escherichia coli. Nucl. Acids Res., 1984.12(17), 6663-66671

86. Rochepeau, P., Selinger, L.B. and Hynes, M.F. Transposon-like structure of a new plasmid-encoded restriction-modification system in Phizobium leguminosarum VF39SM. Mol. Gen. Genet., 1997. 256, 387-396

87. Rosenberg, A.H., Goldman, E., Dunn, J.J., Studier, F.W. and Zubay, G. Effects of consecutive AGG codons on translation in Escherichia coli, demonstrated with a versatile codon test system. J. Bacterial 1993.175, 716-722

88. Rougeon, F., Kourilsky, P. and Mach, B. Insertion of a rabbit beta-globin gene sequence into an E. coli plasmid. Nucleic Acids Res., 1975. 2(12), 2365-2378

89. Saha, S. and Rao, D.N. ATP hydrolysis is required for DNA cleavage by EcoPI restriction enzyme. J. Mol Biol., 1995. 247, 559-567

90. Samuelson, J.C., Zhu, Z. and Xu, S. The isolation of strand-specific nicking endonucleases from a randomized Sapl expression library. Nucl Acids Res., 2004. 32(12), 3661-3671

91. Sayers, J.R., Schmidt, W, and Eckstein, F. 5-3' Exonucleases in phosphorothioate-based oligonucleotide-directed mutagenesis. Nucl Acids Res., 1988.16(3), 791-802

92. Schildkraut, I., Banner, C.D.B., Rhodes, C.S., Pacerkh, S. The cleavage site for the restriction endonuclease EcoRV is GATATC. Gene, 1984. 27, 3448-3552

93. Schweitzer, В., Kingsmore, S. Combining nucleic acid amplification and detection. Curr. Opin. Biotechnol, 2001.12(1), 21-27

94. Seidel, H.M., Pompliano, D.L. and Knowes J.R. Biochemistry, 1992. 31, 2598-2608

95. Selent, U., Riiter, Т., Kohler, E., Liedtke, M., Thielking, V., Alves, J., Oelgeschlager. T. The crystal structure of EcoRV and of its complexes with cognate and non-cognate DNA.

96. Biochemistry, 1992. 31, 4808-4815

97. Sharp, P.M. and Li, W. The codon adaptation index a measure of directional synonymous codon usage bias and it potential applications. Nucleic Acids Res., 1986. 15,1281-1295

98. Shortle, D., Grisafi, P., Benkovic, S.J. and Botstein, D. Gap misrepair mutagenesis: efficient site-directed induction of transition, transversion, and frameshift mutations in vitro. Proc. Natl Acad. Sci. U.S.A., 1982. 79,1588-1592

99. Siksnys, V., Skirgaila, R., Sasnauskas, G., Urbanke, C., Cherny, D., Grazulis, S. and Huber, R. The Cfr\01 restriction enzyme is functional as a tetramer. J. Mol. Biol., 1999. 291,1105-1118

100. Simoncsits, A., Tjornhammar, M.-L., Rasko, Т., Kiss, A. and Pongor, S. Covalent joining of the subunits of a homodimeric type II restriction endonuclease: single-chain Pvull endonuclease. J. Mol. Biol., 2001. 309, 89-97

101. Smith, H.O. and Wilcox, K.W. A restriction enzyme from Hemophilus influenzae. I. Purification and general properties. J. Mol. Biol., 1970. 51, 379-391

102. Smith, H.O. Restriction endonucleases as enzymatic tools for DNA analysis and genetic manipulation. PAABS Revista, 1976. 5, 313-319

103. Soundararajan, M., Chang Z., Morgan, R.D., Heslop, P. and Connolly, B. A. DNA Binding and Recognition by the lis Restriction Endonuclease MboII. J. Biol. Chem., 2002. 277(2), 887-895

104. Stahl, F., Wende, W., Jeltsch A. and Pingoud, A. Introduction of asymmetry in the naturally symmetric restriction endonuclease EcoRV to investigate intersubunit communication in the homodimeric protein. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1996. 93, 6175-6180

105. Stankevicius, K., Lubys, A., Timinskas, A. and Janulaitis, A. BpulOI restriction endonuclease is composed of two nonidentical subunits. Biologija, 1996. 2, 51-53

106. Stankevicius, K., Lubis, A., Timinskas, A., Vaitkevicius, D. and Janulaitis, A. Cloning and analysis of the four genes coding for BpulOI restriction-modification enzymes. Nucl. Acids Res., 1998. 26,1084-1091

107. Stein, D.C., Gunn, J.S. and Piekarowicz, A. Sequence similarities between the genes encodimg the S.Ngol and Haell restriction/modification systems. Biol. Chem., 1998. 379, 575-578

108. Stuckey, J. A., and Dixon, J. E. Crystal structure of a phospholipase D family member. Nat. Struct. Biol. 1999. 6,278-284

109. Studier, F.W. and Bandyopadhyay, P.K. Model for how type I restriction enzymes select cleavage sites in DNA. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1988. 87, 8070-8074

110. Suhre, K. and Sanejouand Y.-H. EINemo: a normal mode web server for protein movement analysis and the generation of templates for molecular replacement. Nucl. Acids Res., 2004. Vol. 32, W610-W614

111. Sugisaki, H. and Kanazawa, S. New restriction endonucleases from Flavobacterium ockeanokoites (Fokl) and Micrococcus luteus (Mlul). Gene, 1981.16,169-173

112. Tomb, J.F., White, Q., Kerlavage, A.R. The complete genome sequence of the gastric payhogene. Helicobacter pylor. Nature, 1997. 388, 539-547

113. Topal, M.D., Thresher, R.J., Conrad, M. and Griffith, J. Nael endonuclease binding to pBR322 DNA induces looping. Biochemistry, 1991. 30,2006-2010

114. Tsourkas, A., Behlke, M.A., Rose, S.D., Bao, G. Hybridization kinetics and thermodynamics of molecular beacons, Nucl. Acids Res., 2003. 31,1319-1330

115. Tyagi, S., Kramer, F.R. Molecular beacons: probes that Xuoresce upon Hybridization. Nat. Biotechnol., 1996.14, 303-308

116. Vanamee, E.S., Santagata, S. and Aggarwal, A.K. Fokl requires two specific DNA sites for cleavage. J. Mol. Biol., 2001. 309, 69-78

117. Vanamee, E.S., Viadiu, H., Kucera, R., Dorner, L., Picone, S., Schildkraut, I., Aggarwal, A.K. A view of consecutive binding events from structures of tetrameric endonuclease Sfil bound to DNA. Embo J., 2005. 24,4198-4208

118. Van der Woerd, M.J., Pelletier, J.J., Xu, S. and Friedman A.M. Restriction Enzyme BsoBI-DNA Complex: A Tunnel for Recognition of Degenerate DNA Sequences and Potential Histidine Catalysis. Structure, 2001. 9, 133-144

119. Van Ness, J., Van Ness,L.K. and Galas, D.J. Isothermal reactions for the amplification of oligonucleotides. PNAS, 2003.100(8), 4504-4509

120. Venter, J.C. Remington, K., Heidelberg, J F.,. Halpern, A L., Rusch, D., Environmental Genome Shotgun Sequencing of the Sargasso Sea. Science, 2004. 304, 66-74

121. Wah, D.A., Hirsch, J.A., Dorner, L.F., Schildkraut, I. and Aggarwal, A.K. Structure of the multimodular endonuclease Fokl bound to DNA. Nature, 1997. 388, 97-100

122. Walker, G.T., Little, M.C., Nadeau, J.G. and Shank, D.D. Isothermal in vitro amplification of DNA by a restriction enzyme/DNA polymerase system. Proc. Natl Acad. Sci. U.S.A, 1992. 89, 392-396

123. Wang, H. and Hays, J.B. Simple and rapid preparation of gapped plasmid DNA for incorporation of oligomers containing specific DNA lesions. Mol. Biotechnol., 2001. 19,133-140

124. Wang, L., Hall, J. G., Lu, M., Liu, Q. and Smith, L. M. A DNA computing readout operation based on structure-specific cleavage Nat. Biotechnol. 2001.19, 1053-1059

125. Wilson, G.G. and Murray, N.E. Restriction and modification systems. Annu. Rev. Genet., 1991. 25, 585-627

126. Winkler, F.K., Banner, D.W., Oefner, C. The crystal structure of EcoRV endonuclease and of its complexes with cognate and non-cognate DNA fragments. EMBO J., 1993. 2,1781-1795

127. Wolfe, G.A. KH Relationship of codon bias to mRNA concentration and protein length in Saccharomyces cereviseae. Yeast, 2000.16,1131-1145

128. Xia, Y., Morgan, R., Schildkraut, I., and Van Etten, J. L. A sitespecific single strand endonuclease activity induced by NYs-1 virus infection of a chlorella-like green alga. Nucl. Acids Res., 1988.16, 9477-9487

129. Xu, Y., Lunnen, K.D. and Kong, H. Engineering a nicking endonuclease N.AlwI by domain swapping. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 2001. 98, 12990-12995

130. Zhang, D.Y., Zhang, W., Li, X, Konomi Y. Detection of rare DNA targets by isothermal ramification amplification. Gene, 2001. 274(12), 209-216

131. Zhang, X., Yan, H., Shen, Z. and Seeman, N.C. Paranemic Cohesion of Topologically-Closed DNA Molecules. J. Am. Chem. Soc. 2002.124, 12940-12941

132. Zhang, Y., Nelson, M., Nietfeldt, J., Xia, Y., Burbank,D., Ropp, S. and Van Etten, J.L. Chlorella Virus NY-2A Encodes at Least 12 DNA Endonuclease/Methyltransferase Genes. Virology, 1998.240,366-375

133. Zhou, X.E., Wang, Y., Reuter, M., Mucke, M., Kruger, D.H., Meehan, E.J., Chen, L. Crystal Structure of Type HE Restriction Endonuclease EcoRII Reveals an Autoinhibition Mechanism by a Novel Effector-binding Fold. J. Mol. Biol., 2004. 335, 307-319

134. Zhu, Z., Samuelson J.C., Zhou, J., Dore, A. and Xu, S-Y. Engineering strand-specific DNA nicking enzymes from the type IIS restriction endonucleases Bsal, BsmBI, and BsmAI. J. Mol. Biol, 2004.237, 573-583

135. Абдурашитов, M.A., Беличенко, O.A., Шевченко, A.B., Дегтярев, С.Х. N.BstSE-сайт-специфическая нуклеаза из Bacillus stearothermophilus SE-589. Мол. биол., 1996. 30,1261-1267

136. Васильева, Л.Ю., Железная, JI.A., Матвиенко, Н.И. Клонирование и экспрессия новой сайт-специфической метилтрансферазы M.&cLlI из Staphylococcus sp. LI. Биохимия, 2000. 65,665-671

137. Гололобова, Н.С., Охалкина, С.С., Абдурашитов, М.А., Дегтярев, С.Х. Первичная структура оперона NM.BstSEI из Bacillus stearothermophilus SE-589, продуцента сайт-специфической никазы N.BstSEI. Мол. биол., 2005. 39(6), 960-964

138. Дедков, B.C., Абдурашитов, М.А., Янковский, Н.К., Килева, Е.В., Мякишева, Т.В., Попиченко, Д.В., Дегтярев, С.Х. Новая сайт-специфическая ДНК-никаза N.Bst9I Bacillus stearothermophilus 9. Биотехнология, 2001. 4, 3-8

139. Железная, JI.A., Перевязова, Т.А., Железнякова Е.Н., Матвиенко, Н.И. Некоторые свойства сайт-специфической никазы BspD6I и возможность ее применения для гибридизационного анализа ДНК. Биохимия, 2002. 67(4), 12151220

140. Железная, Л.А., Перевязова, Т.А., Альжанова, Д.В., Матвиенко, Н.И. Сайт-специфическая никаза из штамма Bacillus species D6. Биохимия, 2001. 66, 12151220

141. Маниатис, Т., Фрич, Э., Сэмбрук, Дж. Молекулярное клонирование. 1984, Москва, Мир

142. Перевязова, Т.А., Рогулин, Е.А., Железная, Л.А., Матвиенко, Н.И. Клонирование и секвенирование сайт-специфической никазы N.BspD6I. Биохимия, 2003, 68(9), 1203-1207

143. Юнусова, А.Л., Рогулин, Е.А., Артюх, Р.И.,. Железная, Л.А, Матвиенко, Н.И. Белок, кодируемый открытой рамкой считывания, расположенной рядом с геном никазы BspD6l, в комплексе с никазой образует эндонуклеазу рестрикции. Биохимия, 2006. 71(7), 1002-1005

144. Также хотелось бы выразить признательность Артюх Римме Ивановне за ценные советы и помощь в проведении работы.

145. Хотелось бы отдельно поблагодарить весь наш дружный коллектив за теплую атмосферу и неравнодушие, делающую работу в нем приятной и плодотворной. Я рад, что являюсь частью этого коллектива.

146. Особую благодарность хотелось бы выразить Смолихиной Татьяне Ивановне за серьезное отношение и четкую организацию при защите этой работы.

147. Отдельно хотелось бы поблагодарить всех моих друзей за сопереживание и поддержку.

Информация о работе

Рогулин, Евгений Алексеевич
кандидата биологических наук
Пущино, 2006
ВАК 03.00.03

Диссертация

Никующая эндонуклеаза N.BspD6I - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно