Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Некоторые вопросы партеногенетического и гиногенетического размножения тутового шелкопряда

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Губанов, Евгений Анатольевич, Москва

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ИНСТИТУТ БИОЛОГИИ РАЗВИТИЯ им. Е К КОЛЬЦОВА

На правах рукописи УДК 591.391. 2

ГУБАНОВ ЕВГЕНИЙ АНАТОЛЬЕВИЧ

НЕКОТОРЫЕ ВОПРОСЫ ПАРТЕНОГЕНЕТИЧЕСКОГО И ГМВОГЕНЕТИЧЕСКОГО РАЗМНОЖЕНИЯ ТУТОВОГО ЩЕЛКОПРЯДА

03. 00.15 - генетика

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

СОДЕРЖАНИЕ

Стр.

Используемые сокращения и условные обозначения......... 3

ВВЕДЕНИЕ............................................... 4

ГЛАВА 1. СРАВНИТЕЛЬНОЕ ИЗУЧЕНИЕ ВЛИЯНИЯ УСЛОВИЯ

ТЕРМОАКТИВАЦИИ К АМЕЙОТИЧЕСКОМУ ПАРТЕНОГЕНЕЗУ, ХРАНЕНИЯ И СНЯТИЯ ДИАПАУЗЫ ЯИЦ НА СОВРЕМЕННЫХ КЛОНАХ И ЛИНИЯХ ТУТОВОГО ШЕЛКОПРЯДА

1.1. Литературный обзор.......................... 8

1.2. Материалы и методы........................... 11

1.3. Результаты и обсуждение..................... 16

1.3.1. Влияние длительности хранения извлеченных

яиц перед их активацией на СПП............ 16

1.3.2. Влияние длительности прогрева яиц в воде

при 46° на СПП........................... 21

1. 3. 3. Охлаждение яиц после активации............. 27

1.3.4. Инкубация активированых яиц при пониженной

температуре перед обработкой HCL.......... 28

1. 3. 5. Снятие зимней диапаузы.................... 35

1.3.6. Задержка активации извлеченных и не извлеченных яиц холодом........................ 44

ГЛАВА 2. ТЕРМИЧЕСКИЙ ГИНОГЕНЕЗ У ТУТОВОГО ШЕЛКОПРЯДА И ЕГО ЗНАЧЕНИЕ ДЛЯ ПРЕОДОЛЕНИЯ ПАРТЕНОГЕНЕ-ТИЧЕСКОЯ ДЕПРЕССИИ В ПОЛНОСТЬЮ ГОМОЗИГОТНОМ МАТЕРИАЛЕ

2.1 Литературный обзор......................... 50

2. 2 Материалы и методы......................... 55

2. 3 Результаты и обсуждение.................... 56

ГЛАВА 3. БИОЛОГИЧЕСКИЕ МЕХАНИЗМЫ АКТИВАЦИИ ЕСТЕСТВЕННОГО ПАРТЕНОГЕНЕЗА У ТУТОВОГО шелкопряда

3.1. Литературный обзор.....'..........................................64

3. 2. Материалы и методы....................................................72

3. 3. Результаты и обсуждение..........................................74

ЗАКЛЮЧЕНИЕ..................................................................................83

ВЫВОДЫ...................................................................85

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ...........................................................................87

ИСПОЛЬЗУЕМЫЕ СОКРАЩЕНИЯ И УСЛОВНЫЕ ОБОЗНАЧЕНИЯ ПК - партеноклон АМП- амейотический партеногенез МП - мейотический партеногенез ОГЛ- обоеполая полностью гомозиготная линия Г - термический гиногенез Ак - андрогенез Бис - бисексуальный ЖС - жизнеспособность СП - склонность к партеногенезу

(или частота активации) СПИ- склонность к полному партеногенезу

(или выход партеногенетических гусениц) ККГ - компенсационный комплекс генов V - коэффициент вариабильности Р - уровень значимости ТНЬ термошок Гом- гомозиготность (ый) Осем- осеменение МЭ- материнский эффект

КО - камера оплодотворения

ЕП естественный партеногенез

СПр - семяприемник

СПК - спиральный канал

СК - семянной каналец

ПЖ - придаточная железа семяприемника

КЖ - клеющая железа

НЯ - непарный яйцевод

ПЯ - парный яйцевод

КС - копулятивная сумка

ВВЕДЕНИЕ

Разведение тутового шелкопряда в домашних условиях имеет давнюю историю и начиналось около 5 тысяч лет назад в Южном Китае. Постепенно щелководство распространилось во многие другие страны с благоприятным для этого теплым климатом (Поярков, 1940; Михайлов, 1950 ). Распространение шелководства и торговля велась в частности и по Великому шелковому пути, протяженностью почти 12 тыс. км из Зап. Китая в страны Азии, Европы и обратно (Мухомедов и др.,1991). В процессе искусственного отбора и селекции удалось повысить шел-коносность коконов более чем в 5 раз. В шелководстве первым, среди всех отраслей животноводства, был введен прогрессивный метод выращивания межпородных гибридов первого поколения с применением эффекта гетерозиса (Струнников,1987). Для шелковой нити, получаемой от тутового шелкопряда, характерны прочность, гигиеничность и упругость, что делает ее ценным натуральным сырьем в текстильной промышленности (Михай-

лов,1950). Кроме того высокая степень изученности тутового шелкопряда с"генетической точки зрения (Tazima, 1964; Насири-лаев,1978) и в отношении различных искуственных способов размножения (Тихомиров,1887,1902; Кольцов,1932; Берме ль, 1932, 1934; Астауров,1940, 1968,1977; Струнников, 1987, 1994) делают этот объект интересным и для научных исследований, в результате которых у него удалось осуществить искусственным путем все известные способы полового размножения (Струнников, 1987).

Основы работ по искусственным способам размножения тутового шелкопряда были заложены в классических опытах R JL Астаурова при разработке им метода искусственного амейоти-ческого партеногенеза (Астауров,1940,1973,1977). Их роль для практического шелководства и решения ряда фундаментальных биологических проблем трудно переоценить. Вместе с тем, несмотря на большое количество проведенных в этой области исле-дований, многие вопросы и задачи оставались нерешенными. Первые, полученные еще в 30-х годах Б. JL Астауровым амейоти-ческие партеноклоны (АМП клоны), были сильно депрессированы, что выражалось в низкой склонности к полному партеногенезу (СПП) или выходу партеногенетических гусениц, низкой шелкоп-родуктивности и значительной фенотипической вариабельности, которая в несколько раз превышала теоретически ожидаемую (Астауров,1940). Постепенно, с помощью проведения дополнительной селекции, СПП удалось существенно повысить (Астауров, 1973). На повестку дня встал вопрос о возможности внедрения АМП клонов в практическое шелководство. В связи с этим было необходимо проверить и устранить некоторые слабые места метода АМП и попытаться повысить его эффективность и надеж-

- б -

ность применительно к современному генетическому материалу путем изучения влияния различных генетических и средовых факторов.

Среди вопросов требовавших своего решения были пониженные показатели шелкопродуктивности АМП клонов, их высокая фенотипическая вариабельность и. другие проявления партеноге-нетической депрессии, которые особенно сильно проявлялись на гомозиготном материале при размножении его методом АМП (Струнников,1987, 1989; Алексеева,Губанов,1993), отсутствие данных (и их статистической обработки) о зависимости СПП от экспозиций на различных этапах метода АМП, а также пред- и послеактивационной обработки, хранения и снятия зимней диа-паузы яиц для современного генетического материала. Эти вопросы являлись актуальными, поскольку отклонение от оптимальных условий активации приводит к значительному снижению СПП и другим проявлениям партеногенетической депрессии (Астау-ров, 1940, 1977). Метод АМП разрабатывался Б. Л. Астауровым еше в 30-х годах на клонах с низкой СПП, на генетически неоднородном материале и необходимо было выяснить, в какой мере эта методика может быть применена к иным породам, нельзя ли ее модифицировать с учетом современных требований практики шелководства. Поскольку особенностью производства является большой объем работы, то в целях облегчения практического применения метода АМП представлялось целесообразным изыскать возможности расширить диапазоны допустимых экспозиций на различных этапах метода и обеспечить возможность задержки активации при скоплении больших объемов материала. Решение теоретических вопросов о повышении эффективности активации при различных искусственных методах партеногенетического

размножения осложнялось отсутствием сведений о механизмах активации естественного партеногенеза (ЕП) у тутового шелкопряда.

Цель и задачи исследования. В целях повышения эффективности метода АМП, облегчения его практического применения, снижения проявления партеногенетической депрессии и разработки теоретических основ процесса активации партеногенети-ческого развития в работе были поставлены следующие конкретные задачи:

1. Исследовать зависимость активации АМП от величины экспозиции на различных этапах метода, а также при снятии зимней диапаузы по критерию СПП на современных клонах и у полностью гомозиготной обоеполой линии (ОГЛ). Определить целесообразность и возможность изменения этих параметров в зависимости от генетических особенностей материала.

2. Определить возможность задержки процедуры активации извлеченных и неизвлеченных яиц холодом.

3. Изучить возможность применения термического гиноге-неза для снижения партеногенетической депрессии, обусловленной АМП, в ОГЛ.

4. Изучить биологические механизмы активации ЕП у тутового шелкопряда.

Тутовый шелкопряд выкармливался в весенние выкормки главным образом в САНИИШ (г.Ташкент), летняя и осенняя вы-комка, папильонаж и непосредственное проведение опытов выполнялись на Кропотовской биостанции ИБР им. Н. К. Кольцова РАН под Москвой в период 1982 по 1997гг.

В виду достаточно большого объема литературной информации и экспериментальных данных и для удобства их восприятия

они даны отдельно по главам.

По теме диссертации опубликовано 4 работы. Материалы диссертации были доложены на Объединенном генетическом коллоквиуме Института биологии развития им. Е К. Кольцова РАЕ

ГЛАВА 1.

СРАВНИТЕЛЬНОЕ ИЗУЧЕНИЕ ВЛИЯНИЯ УСЛОВИЙ ТЕРМОАКТИВАЦИЙ К АМЕЙОТИЧЕСКОМУ ПАРТЕНОГЕНЕЗУ, ХРАНЕНИЯ И СНЯТИЯ ДИАПАУЗЫ ЯИЦ НА СОВРЕМЕННЫХ КЛОНАХ И ЛИНИЯХ ТУТОВОГО ШЕЛКОПРЯДА

1.1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР Метод активации неоплодотворенных яиц к амейотическому партеногенезу был разработан Б. Л Астауровымм (1940) в 30-х годах в основном на Багдадской породе тутового шелкопряда (Bombyx mori L. ). Выведенные им позднее амейотические парте-ногенетические (АМП) клоны отличались низкой шелконоеностью, не превышающей у самок 15-16% ( Астауров,1973). Исходным материалом для получения клонов явилось несколько генетически различных пород, в том числе и Багдадская порода. Выведение этих клонов выполнялось с использованием упомянутой выше методики активации яиц к партеногенетическому развитию. По мере совершенствования технологических приемов получения АМП

клонов, наряду с активацией АМП высокой температурой появи-

о

лись новые методы с применением как низких температур (-11 С,300 мин.), так и с применением комбинирования низких и высоких температур. Последний способ дает возможность проводить термоактивацию на яйцах более старшего возраста, чем это позволяет традиционный способ и дает возможность активи-

ровать не только извлеченные, а и отложенные виргинными самками яйца (Струнникова, Демьянов,1980; Струнников,1987). Кроме того появилась возможность активации яиц тутового шелкопряда к АМП в теле бабочек с применением низкой температу-

О О

ры - 5 или -6 в течении 12 часов, что позволяет облегчить процедуру активации (Струнникова, 1979а,19796). Исследования по активации искусственного партеногенеза ведутся на только на тутовом шелкопряде, но и на других сельскохозяйственных животных (Эрнст и др. ,1980). Вопросами изучения механизмов искуственной активации амейотического партеногенеза на тутовом шелкопряде занимались многие отечественные (Тихомиров, Кольцов, Астауров, Струнников) и зарубежные ученые - Сато (5а1о,1934), Хасимото, Сугаи и др. Этот интерес к АМП клонам в значительной степени обусловлен возможностью сохранения генетической конституции родителей в ряду поколений, что существенно облегчает селекционный процесс и сохраняет эффект гетерозиса. Изогенность особей АМП клонов как между собой, так и в ряду поколений подтверждена в серии специально проведенных опытов (Астауров,1940;Степанова,Губанов,1985;Третьяк и др.,1992). Изогенности АМП особей (а они все женского пола) способствует и отсутствие у них мейотического кроссин-говера (Назтиззеп,1977). В 70-80-х годах началась работа по селекции АМП клонов из новых высокошелконосных пород с тем, чтобы партеногенетических самок можно было использовать в качестве материнской породы для промышленной гибридизации. На этом пути уже достигнуты значительные успехи (Струнников и др. 1985, Струнников, 1986; Гуламова и др. 1986; Струнников 1987,1994;Струнникова,Струнников,1994). И в этой работе также применялась разработанная Б. Л. Астауровым методика активации.

Новые породы генетически резко отличались от старых превде всего высокой'шелковой продуктивностью. Шелконосность и у самок и у самцов достигает 25-26%. Кроме того в научных и практических целях стал применяться новый генетический материал с повышенной степенью гомозиготности и содержащий компенсационный комплекс генов (ККГ), например полностью гомозиготная обоеполая линия (ОГЛ) (Струнников, 1987), в связи с чем возникла необходимость проверки применимости для него тех же условий, что и для генетического материала с высокой степенью гетерозиготности. В свое время Б. Л. Астауров допускал, что его метод активации возможно усовершенствовать е еще большей степени, в частности подбирая условия активации партеногенетического развития в зависимости от генотипа ин-дивидумов. Так же им было замечено, что в зависимости от склонности к партеногенезу (СП) клона, а таким образом и от его генотипа может меняться ширина зоны оптимальных экспозиций, в частности при изучении вопроса влияния возраста яиц при их активировании. В связи с этим важно было выяснить в какой мере разработанная Б. Л. Астауровым методика может быть применима к иным породам? Нельзя ли ее модифицировать с учетом требований теории и практики шелководства. С этой целью для повышения надежности метода в дополнение к уже имеющимся данным (Астауров,1940, 1948,1968,1977), важно было иметь сведения о зависимости не только процента активации, но и выхода партеногенетических гусениц от различных условий активации, и в более широком диапазоне их варьирования. Поскольку, как ¿оказал В. А. Струнников и учитывая наши собственные наблюдения, процент активации недостаточно адекватно отражает эту зависимость, особенно при значительных отклоне-

ниях режима от оптимального. А такие отклонения возможны как в экспериментальных, так и в производственных условиях в силу случайных причин или неопытности технического персонала. Для этих же целей было важно найти возможность отсрочки активации яиц, например, посредством хранения извлеченных и не извлеченных яиц при пониженной температуре, что облечило бы проведение метода АМП в производственных условиях. В данной работе изучалась склонность к полному партеногенезу (СПГГ) или выход партеногенетиических гусениц в зависимости от экспозиций на различных этапах активации извлеченных яиц к АМП, а также их хранения и снятия зимней эмбриональной диапау-зы. Эти этапы показаны в виде схемы на рис. 2. Общий перечень способов размножения, рассматриваемых в диссертации, в том числе и АМП, дан на рис. 1.

1. 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

Работа проводилась на двух моновольтинных АМП клонах тутового шелкопряда (Bombyx mori L. ), имеющих различную генетическую конституцию. ПК 29 это "старый" клон, выведенный еще Б. Л. Астауровым и репродуцируемый в течение уже более 50 партеногенетических поколений, а также новый клон ПК 9, недавно полученный из высокошелконоеных промышленных пород. Оба клона выведены в результате длительной селекции к партеногенезу и поэтому отличаются высоким процентом полного партеногенеза, чаще превышающего 80%, но имеют различную шелко-носность. Шелконосность ПК 29 и ПК 9 составляет 13 и 23% соответственно. Контрольным вариантом был разработанный Б. Л. Астауровым (Астауров,1940,1948,1958,1968) метод побуждения к партеногенетическому развитию неоплодотворенных яиц. Извле-

- - -12 -

Виды размножения Способы их проведения

I Бисексуальный осеменение

2 . Андрогенез О осеменение ----------> 38 ,200мин 55-85мин,25°

3 . Гиногенез 0 осеменение - >46 ,18мин 10-60сек,25°

4 . Амейотический партеногенез о 46 ,18мин

5 . Естественный партеногенез специфическая активация в КО

Рис. 1 Основные виды полового размножения рассматриваемые в диссертации и способы их проведения

ченную из овариол смесь яиц от нескольких бабочек отмывали

о

от остатков овариол, 12ч содержали на воздухе при 25 , затем

о

прогревали в водепри 46 18 мин, охлаждали в воде 5-10 мин о

при 15-25 и быстро высушивали при комнатной температуре.

о

После этого их хранили трое суток при 16 , вслед за тем обо 3

рабатывали соляной кислотой (8мин, 30 ,d=l. 120г/см ) для

снятия зимней диапаузы, промывали в проточной воде в течение

о

1ч, вновь просушивали и помещали на инкубацию при 25 . Температуру поддерживали на всех этапах с помощью водяных и воздушных термостатов, влажность была на уровне 85- 90%. Отличием нашей техники активации от предложенной Астауровым являлся прогрев яиц не в марлевых мешочках, а в более удобных для этой цели перфорированных пергаментных пакетиках, в которых обрабатываемые яйца проходили все операции, вплоть до их оживления.

В нашем исследовании изучалось влияние на СПП экспозиций хранения извлеченных из овариол яиц перед активацией при

о 0

25 , прогрева их в воде при 46 , послеактивационной инкуба-

о

ции при 16 и обработки в HCL. Это соответствует этапам 3-7

соответственно на рис. 2. Помимо этого изучалась возможность

задержки активации извлеченных и не извлеченных яиц холодом

(этапы 1а и 16 на рис.2). При обработке в HCL яиц, инкубиро-о

вавшихся при 16 более 4 сут, экспозицию обработки увеличивали с 8 до 10-14 мин, если позволяли