Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Нарушения антиоксидантной защиты в ткани мозга и печени потомства крыс после антенатального воздействия этанола и их коррекция лимонтаром

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Нарушения антиоксидантной защиты в ткани мозга и печени потомства крыс после антенатального воздействия этанола и их коррекция лимонтаром"

ШДВДЯ МЕДЩИНСИК НАУК СССР ШУШУТ ПИТАНИЯ

На правах рунэтюи

БЫКОВА Любовь Петровна УЛВ 618. 33-092. 4/9-07: 613. 8/

НАРУШЕНИЯ АНГИОКСИДАНТЮЯ ЗАЩИТЫ В ТКАНИ МОЗГА И ПЕЧЕНИ ПСТОЮВА КРЫС ПОСЛЕ АНТЕНАТАЛЬНОГО ВОЗДЕЙСТВИЯ ЭТАНОЛА И ИХ КОРРЕКЦИЯ ЛИШЯГАРОМ.

(03.00.04-Биохимия)

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Мэсква - 1991

Работа выполнена в ордена Ленина и ордена Трудового Красного Знамени Научно-исследовательской институте педиатрии АНН СССР

(

Научный руководитель: доктор биологических наук,профессор ЖУКОВА Т. П.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук,профессор ЛЕВАЧЕВ и И

доктор ыедицинских наук,профессор ПАНЧЕНКО Л. Ф.

Ведущее учреждение: Научно-исследовательский институт психиатрии МЗ РСФСР

. Защита состоится 1992 г. в ./.^чъаоъ

ва ааседаник специализированного совета Д 001.02.01 при Институте питания АЫН СССР (109240, Мэсква, Устьинский, ар. 2/14).

С диссертацией ыоюю ознакомиться в библиотеке Института питания АУН ссор.

Автореферат разослан " 1.-г 1992 г.

Ученый секретарь специализированного совета

кандидат медицинских наук _л» _") Е Ы. Лшнченко

ОЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Известно, что функциональная полноценность клеточных мембран и входящих в их состав липидных структур является важным фактором, определяющем нормальное функционирование и адаптационные возможности клеток, тканей и органов (Владимиров Ю. А, и др., 1972; Козлов В. П , 1973; Храиова Н. Г., 1981; Halllwell В. et al., 1976).

В последние годы большое внимание уделяется изучению интен- -сивности перекисного окисления липидов как одного из механизмов повреждения клетки при различных патологических состояниях (Архи-пенко К1 К и др., 1977; Козлов А. Е и др., 1987; Ланкин В. 3. и др., . 1989; Koide Т. 1987; Uysal М. et al., 1986; Weiss A. et al., 1988).

В ряде работ достаточно подробно описана химическая природа реакций перекисного окисления липидов (ПОЛ). Показано, что этот процесс имеет свободно-радикальную природу. Свободные радикалы запускают цепь реакций, ведущих в итоге к появлении гидроперекисей липидов, дают начало новым радикалам, ' а такхе образуют конечные продукты - спирты и карбонильные соединения ($ридович И. и др., 1979; Каган ЕЕ. и др., 1986; Wilhelm J., 1991).

Клеточные повреждения при индукции ПОЛ обычно объясняют накоплением большого количества высокоактивных свободных радикалов, которые вызывают перераспределение и резкое увеличение полярности липидного бислоя мембраны, изменяют ее текучесть, что приводит к изменению активности интегральных мембранных белков, лишая органе ллы необходимой физиологической активности (Бурлакова Е. Б. и др., 1982; Goldstein D. V. et al. , 1981; Harris R. A., 1984).

Активации ПОЛ и накоплению свободных радикалов в организме противостоит система антиоксидантной (АО) защиты, включающая ряд специфических ферментов (супероксидрисмутаза, каталаза, глутагион-пероксидаза, глутатионредуктаза), действие которых направлено на устранение избыточно образуюдихся радикалов и продуктов ГОЛ (Герасимов А. М., 1981; Лангат. В.З. , 1081; Поберешсина Н. Б. и др., 1989; Chance В. et al., 1989).

Установлено, что активация ПОЛ является одним из первичных проявлений действия этанола и развития хронического алкоголизма, что приводит к повреждению биологических мембран и нарушению их проницаемости, и, в конечном счете, к изменению функции клеток (Антоненков Е Д. и др., 1986; Дорофеева л. И. 1986; Пирожков С. а и др., 1989; Macdonald С., 19?3; Koes М. et ai., 19?4; Lieber C.S., 1983; Diansani M. U. . 1985; Uysal Я el al., 19S9).

Из этого следует, что изучение реакций EOJI может служить важным показателем нарушения обменных процессов на различных стадиях алкоголизма. Однако многие вопросы, касаювдеся этой проблемы, изучены недостаточно. Следует подчеркнут:, что имевшиеся данные а этом плане относятся главным образом к ь рослому организму.

В связи с ростом женского алкоголизма особое значение приобретает изучение патогенетических механизмов действия этанола в различных органах и тканях развивающегося организма.

Показано, что потребление алкоголя во время беременности способствует увеличению числа детей с физическими и психоневрологическими отклонениями в их развитии (Бадалян Л 0. и др., 1986; Сту-дени :чн М. Я., 1986; Анохина И. П. и др., 1987; Шаманеуров Е Ш., 198?. Ллипов В. И. И др., 1988; Фогел П. И. И др., 1989).

Как показывают экспериментальные исследования и клинические наблюдения, наиболее чувствительной к действии алкоголя оказывается нервная система (Сьдинский НА., 1980; Попова Э. Н., 1983, 1988; Гармашова Е Л. и др., 1988; Коломейцева И. А. и др., 1989; Miller М V. et а]., 1988). Этанол и продукты его метаболизма, например, ацетальдегид, обладающий высокой токсичностью по отношению к нервной ткани, легко проходит через плаценту в кровоток плода (Brien J. F. et al. ,1983, 1985). В таких случаях нередко рождаются дети с так называемым "алкогольным синдромом плода", со специфическими уродствами, нарушениями физического и психического развитии (Jones К. L. et al. , 1973; ClarrenS.N. et al. , 1978; Tennes К., 1980; Charness M. E. et al. , 1989). Мор<|шогические отклонения в формировании мозга, нарушения поведения покаеаны во многих экспериментальных исследованиях на животных (Попова а Н. и др., 1982; Артю

хина ЕИ., 1937; Sterling O.K. et al., 1978; Rlley E. et al. , 1980; Fisher S. E. , 1985).

Не исключено, что эти нарушения обусловлены снижением окислительно- восстановитель яьи и биоэнергетических процессов в митохондриях, в результате чего наступает активация свободно-радикальных процессор (Шишов В.IL и др., 1974; Комиссарова И.А. и др., 1986; Островский Ю.М. и др. , 1986; Ганченко Л.Ф. и др., 1987).

Однако антенатальное действие алкогольной интоксикации на процессы ПОЛ и систему ферментов АО защиты потомства практически не изучено, существуют лишь единичные работы, касающиеся отдельных сторон этой проблеммы (Золотая Р. Д. и др., 1987; Узбеков И Г. и др., 1991; Dreostl I.E. et al., 1979; Ward R. et al. , 1989; Zidenberg-Cherr S. et al., 1989). Изучение состояния ферментной системы АО защиты представляет особый интерес, так как она может характеризовать адаптационные возможности развивающегося организма, направленные на устранение избыточно образующихся под влиянием алкоголя свободных радикалов и продуктов ГОЛ. ■

Важным аспектом проблемы влияния алкоголя на развивающийся организм является также поиск и разработка средств, защищающих плод от повреждающего действия этанола. Перспективными в этом отношении могут явиться, например, новые метаболитные препараты (гликал, лимонтар, фалутар), разработанные в Лаборатории регуляторов тканевого обмена НИИ по биологическим испытаниям химических соединений, уменьшающие токсическое влияние алкоголя и ускоряющие его выведение из организма за счет активация процессов счисления (Комиссарова И.А. и др., 1991; Нарциссов Р.П. и др., 1991),

Экспериментальные исследования их действия на процессы ПОЛ и систему АО защиты плода при антенатальной алкоголизации могли бы вскрыть один из механизмов их действия и отсюда явиться важным критерием их эффективности.

Дель работы - изучить антенатальное воздействие этанола на перекисное окисление липидсв и ферментную систему антисксидангной защиты в тканях головного мозга к печени потомства крыс и оценить при этом эффективность действия лимонтара, используемого в качестве алкопротестора . •

Задачи исследования:

1. Исследовать состояние ГШ в ткани мозга и печени потоыс-; тва крыс, подвергавшихся кратковременному и длительному

антенатальному воздействию зтанола (5 г/кг).

2. Изучить изменения активности ферментов системы АО защиты в ткани мозга и печени потомства крыс после кратковременного и длительного антенатального воздействия этанола.

3. Оценить алкопротекторные свойства лимонтара (1 мг/кг) и

* получить данные о влиянии его на перекисное окисление ли-

падов и Ферментную систему АО залиты в ткани мозга и печени потомства крыс, родившихся от матерей, получавших этанол во время беременности.

Научная новизна. В настоящей работе на адекватной экспериментальной модели впервые проведено комплексное исследование продуктов перекисного окисления липидов и активности ферментов анти-оксидантной защиты в дазге и печени потомства крыс, подвергавшихся алкогольной интоксикации на разных сроках алтенатального развития.

Установлено, что после кратковременного антенатального воздействия этанола обнаруженная активация ГОЛ в ткани мозга цлодов и новорожденных крью не сопровождалась изменением активности ферментов АО в ада и. В то же время в ткани печени активация ЮЯ выявлена на фоне снижения активности ряда ферментов АО защиты.

Длительное антенатальное воздействие этанола приводило к уменьшению показателей ПОЛ в ткани мозга и печени 7-дневных крыс при активации ферментной системы АО зашиты.

Увеличение активности ферментов АО защити у 7-дневных крыс как после кратковременного, так и длительного антенатального воздействия этанола ыо*ет рассматриваться как результат отставленной во времени активации адаптационных механизмов.

Показана возможность коррекции нарушений перекисного окисления липидов и активности ферментов АО вашдты в мозге и печепи животных, перенесших антенатальное воздействие этанола, при применении в период внутриутробного развития алкопротектора лимонтара, обладающего антиоксидантным действием.

Теоретическая и практическая значимость. Исследование пере-кисного окисления липидов и ферментной системы АО защиты в мозге и печени плодов и потомства крыс, перенесших антенатальное воздействие этанола, позволило выявить один из возможных патогенетических механизмов действия этанола на развивающийся организм.

Результаты работы свидетельствуют, что введение лнмонтара на фоне алкогольной интоксикации способствовало устранению патологического эффекта этанола на перекислое окисление липидов при кратковременном воздействии, однако не приводило к полной нормализации этого процесса при длительном введении этанола.

Полученные данные могут явиться основой для разработки комплекса средств антенатальной профилактики и терапии с целью их внедрения в клиническую практику. Лимонтар может быть рекомендован как перспективное средство для предупреждения повреждающего действия алкоголя на развивающийся организм.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены нз V! Европейской конференции по педиатрии (1987 г.), Ш Всесоюзной конференции "Биоантиокеидант" (198У г.).

Структура работы. Диссертация изложена наог. страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, методов исследований, результатов и их обсуждения, заключения, выводов, списка литературы. Иллюстрирована 13 таблицами, 13 рисунками. В списке литературы приведенойб?¿источников, из них /Й^ иностранных авторов.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Работа выполнена на крысах линии Вистар, содержавшихся на стандартном полноценном, рационе вивария в условиях естественного светового дня.

Проведено две серии экспериментов: в первой - крысы получали этанол с 16 по 19 день беременности (кратковременное воздействие),

во_второй - с 1 по 20 день, то есть в течение всей беременности

(длительное воздействие). В обеих сериях опытов использовался 30/4 раствор этанола дня внутрстедудочного введения ио расчета 5 г/кг

веса животного. В контрольной группе использовался тот же способ введения зквиобъемного количества воды. Лимонтар в качестве алкоп-ротектора вводили беременным крысам внутрижелудочно за 40 минут до этанола в дозе 1 мг/кг веса животного. В отдельной группе опытов каадой серии изучали действие самого лимонтара на исследуемые процессы. Итак, в каадой серии экспериментов имелось 4 группы зкивот-ных, получавших этанол, воду, лимонтар, зтансл и лимонтар Ч (табл. 1).

tel предположили, что при кратковременном введении этанола беременным животным изменения ПОЛ и ферментной системы АО зашиты могут быть незначительными и приходящими, поэтому в этой серии экспериментов обследовалось потомство крыс как в пренатальный (20-дневные плоды), так и в ранний постнатальный период (1- и 7-дневные крысы). При длительном воздействии этанола для обследования использовали только 7-дневных животных (табл. 1).

Таблица N 1 Распределение материала по группам опытов.

Условно^-обозначение групп опытов

1 К вода (контроль) 16 - 19 20 1, 7

I 1 а этанол 16 - 19 20 1. 7

серия 1 эл этанол + яшюнтар 16 - 19 20 1, 7

1 л лимонтар 16 - 19 20 1. 7

11 к вода (контроль) 1 - £0 7

II 11 э этанол 1 - 20 «7

серия 11 эл этанол + лимонтар 1 - 20 7

11 л лимонтар 1 - 20 7

Шриод воз- Возраст (дни)

Вводимый действия _

препарат (дни бере- Плоды После менности) ровд.

В работе использовано 88 беременных крыс, 64 плода 20-го дня внутриутробного развития и 124 молодые крысы в возрасте 1 и 7 дней.

Животных всех возрастов вабивали декапитацией. Мозг быстро извлекали и замораживали в жидком азоте, затем гомогенизировали в течение 1 минуты в 0,С5 М калий-фосфатном буфере СрН Л 8) с 0,1 мМ ЭДТА в соотношении 1:15 (масса : объем). Аналогично готовили гомо-генаты печени в 0,05 М трис-HCL буфере (рН 7,4) с 0,1 мМ ЭДТА. Го-могенаты центрифугировали при 3500 об/мин в течение 15 минут. Для определения продуктов ПОЛ и ферментов АО зашиты использовали надо-садочную жидкость, причем в случае ферментов гомогенаты инкубировали на холоду в течение 3-5 минут с 0,1% раствором тритона Х-100 (конечная концентрация).

Липиды экстрагировали хлороформ-метанольной смесью. Диеновые конъюгаты (ДК) измеряли в экстракте липидов при 233 нм методом J.Balland et al. (1945), выражая их концентрацию в оптических единицах на 1 мг липидов.

Концентрацию малонового диальдегвда (МДА) определяли спектро-фотометрически в гомогенатах мозга и печени по содержанию в них продуктов, реагирующих с 2-тиобарбитуровой кислотой, методом F. Bernheim et al. (1948), рассчитывая его концентрацию в нмолях на 1 мг липидов.

Содержание шиффовых оснований (ПЮ) измеряли в экстракте липидов на флюориметре "Hitachi" методом W. Eidlack et al. (1973), используя в качестве стандарта раствор сернокислого хинина в 0,1 н серной кислоте (1 мкг/мл); концентрацию их выражали в X по отношению к интенсивности флюоресценции стандартного раствора (100%) в расчете на 1 мг липидов.

Общие липиды определяли с помощью набора фирмы "Lachema" (ТОР). '

Активность супероксиддисмутазы (СОД) измеряли методом Н. Misra et al. (1972)'в модификации О. С. Брусова с соавт. (1981) по способности СОД ингибировать аутоокисление адреналина. Количество СОД, необходимое для ингибирования скорости аутоокисления адреналина на 50%, принималось за единицу активности.

Активность каталазы определяли методом H. Aebi (1970) по скорости расвэлления перекиси водорода при 240 нм, за единицу ее активности принимали разность десятичных логарифмов концентраций перекиси водорода аа 1 минуту.

Активность глутатионредуктазы (ГР) определяли методом S. Hosoda et al. (1970); активность глутатионпероксидазы (ГП) - методом D. Paglia et al. (1967) в модификации A. M. Герасимова (1974) на спектрофотометре "rue Umcarrr SP-800 при 340 нм по скорости окисления НАДЖ Активность обоих ферментов выражали в микромолях окисленного НАДФН за 1 минуту.

Активность Есех ферментов рассчитывали на 1 мг белка Концентрацию белка определяли микробиуретовым методом.

Результаты обрабатывали статистически с использованием критерия Стьюдента на компьютере IBM PC. Оценка достоверности различий проводилась по t-критерию для малой выборки, достоверными считали различия при р < 0.05.,

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

В результате проведенной экспериментальной работы было показано, что длительная алкоголизация беременных крыс приводила к большей перинатальной гибели плодов, чем кратковременная. Так, при кратковременной алкоголизации крыс гибель плодов составляла 6,8%, а при длительной - 16,7%; в контроле этот показатель был в среднем 3,7%, Сочетанное введение этанола и лимонтара снижало покаватели перинатальной гибели плодов до контрольных величин как в 1-й, так и во И-й серии опытов. Таким образом, лимонтар способствовал уменьшению перинатальной смертности, достаточно высокой при действии одного этанола

Положительный эффект лимонтара проявился также при изучении физического развития крыс. Так, если антенатальное воздействие одного этанола приводило к уменьшению массы тела и массы мозга плодов и новорожденных крыс, то при сочетанием введении лимонтара и этанола этих изменений не наблюдалось.

Действие этанола и лнмонтара в последней трети антенатального развития на перекисное отсление липидов в ткани мозга и печени плодов и потомства крыс

Показано, что воздействие этанола в последней трети антенатального развития приводит к изменению активности лерекисного окисления липидов в ткани мозга и печени плодов и новорожденных крыс.

Так, в ткани мозга 20-дневных плодов обнаружено накопление шиффовых оснований, а у 1-дневных крыс - диеновых конъюгатов (рис. 1).

Однако в ткани печени 20-дневных плодов не выявлено изменений содержания исследуемых показателей ГОЛ, а у 1-дневных крыс наблюдалось увеличение содержания малонового диальдегида (рис.2).

По-видимому, новорожденные, ослабленные действием этанола во внутриутробном периоде, дают более выраженную реакцию в первый день жизни в ответ на родовой стресс и переход организма в среду с относительно более высоким содержанием кислорода, чем контрольные крысы.

Кроме того, вышеприведенные данные указывают на то, что ткань мозга более чувствительна к действию этанола, чем ткань печени, о чем также свидетельствуют и литературные данные (Попова Э. а и др., 1988; Таболин а А. и др., 1988).

В ткани мозга и печени 7-дневных крыс, подвергавшихся воздействию этанола с 16 по 19 день внутриутробного развития, не обнаружено увеличения содержания продуктов перекиснсго окисления липидов, что может свидетельствовать'о нормализации этого процесса к концу первой недели жизни (рис. 1 и 2).

Е данной работе была предпринята попытка коррекции лерекисного окисления липидов и системы АО заниты при алкогольной интоксикации с помощью нового фармакологического препарата - лимонгара, в состав которого входят янтарная и лимонная кислоты, являющееся естественными метаболитами цикла трикарбоновых кислот. Выбор данного препарата обусловлен еще и тем, что янтарная и лимонная кис-

0.4

а

о с* 0.3

С

ч 0.2

с.

а ч

« 0.1

а>

Ё

о 0

в 16

о

ч 10

и

£ Л 5

ч о

1 0

№ О

<=г

и

к ч

Сч

г

о.в

0.6

0.4

0.2 0.

Рис Л.

х ++

ал

XXX

Н

+++

гЬ

л ал

20 вн. плоды

х

Ж

зл

XX

н- 1 ++ 1

к э 1 л 1 ал

ММ

к э л ал кэлэл к э л ал

шо

л ал

л ал

I день

7 дней

Содержание продуктов перекисного окисления липидов ( X $ <9 ) в ткани мозга плодов и потомства крыс, подвергавшихся экспериментальным воздействиям в последней трети внутриутробного развития: х р 4 0,05; ххр < 0,01; хххр <• 0,001 - по сравнению с группой 1К; +р < 0,05; ^р < 0,01; +++р < 0,001 - по сравнению с группой 1Э; 00р < 0,01 - по сравнению с группой 1ЭЛ.

Э

К

К

э

ю

сг

к с 0.3

к

к

и г 0.2

с}

а> 0.1

С

0

с* Я С

К

Ц

и 2

ег

К

с

я ч

10

8 6 4

2 0

1.5 I

0.5 О

+

К Э Л ЭЛ К Э Л ЭЛ к Э л -ЭЛ

ж

+1

мм

К Э Л ЭЛ:

кэлая кэлэл

к э л ЭЛ

шо

к э л эл К Э Л ЭЛ

20 цн.плоды

I день

7 дней

Рис.2. Содержание продуктов перекисного окисления липидов ( X - £з ) в ткани печени плодов и потомства крыс, поцверггтшихся экспериментальным воздействиям в последний трети внутриутробного развития.' хх р ^-0,01 - по сраг.ненио с группой I К; + р <0,05 - по сравнению с группой Т Э.

лоты обладают АО активностью, и потому действие лимонтара может способствовать нормализации процесса ЮЛ в организме плода и новорожденного. Следует отметить, что дозы лимонтара были низкими (1 мг/кг массы тела), что позволяет рассматривать его действие скорее как каталитическое, а не как субстратное.

Было показано, что введение одного лимонтара с 16 по 19 день беременности приводило к изменению одного из исследуемых нами показателей ГОЛ (ДК) б ткани мозга развивающихся крыс: у 20-дневных плодов их уровень увеличивался, у 1-дневных крыс - не изменялся, у 7-дневных крыс - уменьшался (рис.1). В ткани печени этих животных изменений ДК, ВДА, 1Ю не обнаружено (рк. 2).

В наших опытах сочетанное воздейс.вие этанола и лимонтара в последней трети антенатального периода развития способствовало снижению до контрольного уровня показателей ПОЛ, содержание которых было увеличено под воздействием этанола в ткани мозга плодов (Ш) и 1-дневных крыс (ДК) и в ткани печени 1-дневных крыс (ВДА) (рис.1 и 2).

Таким образом, исследуемый препарат нормализовал процесс ЮЛ в змии мозга и печени развивающихся крыс.

Действие этанола и лимонтара в последней трети антенатального развития на ферментную систему антиоксидантной защиты в ткани мозга и печени плодов и потомства крыс

Как уже было отмечено, активации ЮЛ противостоит ферментная система АО защиты, включающая ряд специфических ферментов. Основ-мым ферментом этой системы является супероксиддисмутаза, которая обезвреживает супероксидный анион с образованием перекиси водорода и молекулярного кислорода В обезвреживании перекиси водорода принимает участие каталаза. Глутатионпероксидаза также способна использовать в качестве субстрата перекись водорода, но основным ее субстратом являются органические гидроперекиси. Восстановленный глутатион используется как кофактор в этой реакции. Внутриклеточное содержание восстановленного глутатиона эатем снова может по-

полниться глутатнонредуктазой (Герасимов n.M., 1981; Chance В. et al., 1979).

Ферментную систему антиоксидангной запиты оценивали, определяя активность супероксиддисмутазы (СОД), кагал азы, глутатионпе-роксидаэы (ГШ, глутатионредуктазы (ГР).

В ткани мозга плодов и 1-дневных крыс, подвергавшихся воздействию этанола в последней трети антенатального развития, не выявлено изменений активности ферментов АО защиты, что может быть связано с низким уровнем их активности вследствии незрелости мозговой ткани в этом периоде. К 7-му дню постнатальной кизни в ткани мозга обнаружена активация ферментной системы АО зашиты, что проявилось в увеличении активности СОД на 21% и ГР на 19% (рис.З). Это, по-видимому, является отставленным во времени адаптационным ответом системы АО защиты на антенатальное воздействие этанола и активацию процесса ГОЛ в остром периоде.

Кратковременное антенатальное воздействие этанола приводило-к снижению активности ферментной системы АО защиты в ткани печени этих животных: уменьшалась активность каталазы и ГР у 20-дневных плодов и активность ГОу 1-дневных крыс (рис.4). Вероятно, это и могло обусловить накопление МДА в ткани печени 1-дневных крыс.

Как видно из рисунка 4, к 7-му дню постнатальной жизни в ткани печени, Kai; и в ткани мозга, обнаружилось увеличение активности ГР на 31% под воздействием этанола, что такж может рассматриваться как замедленный ответ на антенатальное введение алкоголя.

Воздействие лимонтара в последней трети внутриутробного развития увеличивало активность ферментов АО защиты в ткани мовга плодов (ГП) и ноБоровдениых крыс (ГР), у 7-дневных животных изменений активности этих ферментов не выявлено (рис.З). В ткани печени животных группы I Л активности ферментов АО зашиты увеличивались: у 20-дневных плодов - ГП, у 1-дневных крыс - каталазы и у 7-дневных крыс - СОД, каталазы, ГП и ГР (рис. 4). Таким образом, результаты исследований указывает на то, что одним ив ведущих механизмов антенатального действия лимонтара является активация ферментов АО защиты как в ткани мозга, так и в ткани печени плодов -и крыс первой недели жизни. ... -

с; ф

■о

и

2 >

О

Ч О о

<ю

т. к а

•ч

г: «

©I к

зз <з

л ь. ч а

х к

ЯП п!

о. к

3 <» ж о

л

4 а о

10

0 I

0.5 0

10

о 20

15

10

5

+г

ал

сод

©

к э л ал

@

+++

к э л эл

КАТАЛАЗА

ал

эл

эл

гНЧ

эл

++«-XXX

гп

Рис.3.

@

р < 0,02 - по сравнению с I ЭЛ группой.

ал

рр ххх +

©

эл

ГН 1-4-1 -1 1

гН гЬ1 1 ■П эл 1. +

к Э л ЭЛ' к э л —J к э —1—1 л -н эл

20 дн. плоды I день 7 дней

Активность ферментов антиоксидантной защиты ( X - б> ) в ткаки мозга плодов и потомства крыс подвергавшихся экспериментальным воздействиям в последней трети внутриутробного периода развития: © р < 0,02; х р < 0,0Ь; ххх р с 0,001 - по сравнению с I К группой; ®р < 0,02; + р < 0,05; +++ р 0,001 - по сравнению с I Э группой;

К

К

э

л

к

л

к) §

•о

и

Я >

<Р

10 0

СО

к *=» 20

0)

ю

Си 10

а)

0

\ се 40

ас и

ач

Ща>

а10 20

с.

■о 2

О X

II 0

«в

К м ©14

50

и да 2

К

+++

Л эл

+

х х + + х х

Л

зл

[Ъ-г^ гЫтЬ+П

к э я эл А э л ач

@

+

Л

ЭЛ

оо

Ф

ГР

о

ххх ххх

Л ЭЛ

л эл

гп

++

ооо ххх.

К

-н-н

Л

эл

к

л

эл

Рис. А

20 цн. плоды I день 7 дней

Активность ферментов янтиоксидантной защиты ( X - бэ ) в ткани печени плодов и потомства крыс, подвергавшихся экспериментальным воздействиям в последней трети внутриутробного периода развития: ®р 4 0,02; х р ¿0,05; хх р «С 0,01; ххх р < 0,001 - по сравнению с I К группой; @р < 0,02; + р < 0,05; ++ р < 0,01; +++ р < 0,001 - по сравнению с I Э группой; ©р С 0,02; 0 р < 0,05; 00 р <С 0,01; 000 р <0,001 - по сравнению с I ЭЛ группой.

. - 16 -

В ткани печени развивающихся крыс, подвергавшихся в последней трети антенатального развития еочетанному воздействию этанола и лимонтара, обнаружено увеличение и тем самым Нормализация активностей каталазы и ГР у 20-дневных плодов и ГЛ - у 1-дневных крыс, активности которых были снижены под воздействием этанола.

В ткани мозга и печени 7-дневных :-рыс этой группы активность ферментов АО защиты под воздействием лимонтара и этанола восстанавливалась до контрольного уровня: СОД и ГР - в ткани мозга, ГР - в ткани печени. Наблюдаемое при этом увеличение активности СОД в ткани печени может быть обусловлено действием самого лимонтара (рис.4).

Таким образом, использование лимонтара при кратковременном антенатальном воздействии этанола позволило нормализовать процессы ПОЛ в тчсанн мозга и печени плодов и новорожденных крыс, вероятно, эа счет активации ферментов АО защиты. Учитывая, что у 7-дневных крыс зтсй группы опытов (I Э) ферментная система АО •защиты была уже активирована, лимонгар не проявил в данном случае своего действия.

' Действие этанола и лимонтара. на протяжении всего периода антенатального развития на перекисное окисление липидов и Ферментную систему антиоксидантной защиты в ткани моага и-печени 7-дневных крыс

Как уже было отпечено ранее, у потомства крыс, подвергавшихся воздействию этанола в последнюю треть антенатального . развития, к концу первой недели жизни не найдено изменений в показателях ПОЛ. Возможно, это связано с тем, что при кпатковременном введении этанола за счет активации ферментов АО 8авдты организм быстро справляется с повреждающим действием этанола

Однако остается неясным, будут ли изменены процессы ГОЛ и активность ферментов системы АО заняты после длительного антенатального воздействия этанола. Поэтому была проведена серия экспериментов, в которой этанол вводился крысам на протяжении Есей беременности.

При воздействии этанола на протяжении всего периода антенатального развития у крыс на 7-оЯ день жизни обнаружено снижение показателей ПОЛ в ткани мозга (уровень ДК уменьшался на 61%) и в ткани печени (уровень ДК уменьшался на 42% и ИЮ - на 29%) (рис.5).

У этих зке животных обнаружена активация ферментной системы АО защиты в ткани мозга (увеличение активности ГР на 18% и СОД -на 27%) и в ткани печени (увеличение активности ГР на 44% и ката-лазы - на 41% при уменьшении активности ГП на 412) (рис.б). Активация ферментов системы АО защиты, возможно, и обусловила быструю деградацию продуктов ПОЛ.

Таким образом, в этой серии экспериментов действие этанола на ткани юзга и печени 7-дневных крыс было сходным как в отношении продуктов ПОЛ, так и в отношении ферментов системы АО защита

Следует отметить, что при более длительном воздействии зта-нола у 7-дневных животных наблюдались изменения исследуемых нами процессов, тогда как при кратковременном воздействии этанола этих изменений уже не обнаружено.

Сам по себе лимонтар в этой серии опытов не вызывал существенных изменений в содержании таких продуктов ГОЛ, как ВДА и ШО, в исследуемых тканях 7-дневных крыс. Отмечено только статистически достоверное уменьшение содержания ДК в Т1санях мозга и печени на 7-ой день жизни, как и при кратковременном введении его (I серия) (рис.5). Одновременно уменьшалась активность ферментов АО защиты а обоих органах (рис.6).

Однако, во Н-ой серии экспериментов (группа И ЭЛ) сочетан-ное воздействие этанола и лиыонтара на протяжении всего периода антенатального развития на оказывало полного нормализующего эффекта на уровень ДК в ткани мозга и уровни ДК и 1Ю в ткани печени к 7-му дню яизни крыс. Их содержание бы.ю снижено под воздействием этанола (рис. Б).

Таким образом, при более длительном воздействии этанола в антенатальном периоде не наблюдалось нормализующего эффекта лимон-тара на процесс 1ЮЛ в ткани мозга и печени 7-дневных крыс.

У 7-дневных крыс группы 11 ЭЛ сочетанное воздействие этанола и лимонтара способствовало нормализации активностей ферментов АО

.0.25

ш о

§ 0.20

с

Е

* 0.15

ы

й 0-10 О)

£ 0.05 с

0

№ §

Я

и а

о

30

25 20 15

10 5 0 2.0

ё 1.6

3

х ч

1.0 0.5

0

х++ х+++

XXX

ал

X +

ооо

ЭЛ

К

ач

мозг

- 18

Ж

км

о

с-я

о «

к

с

к «?

с.

з *

0.6 0.5

0.4

0.3 0.2 0.1 0.

20

15

10

5

0 4

3

2 I 0

х +

ЭЛ

хх+

ООО

ЭЛ

X X

ЭЛ

ПЕЧЕНЬ

Рис.5. Содержание продуктов ПОЛ ( X -6) в ткЬни мозга и

печени 7-дневных крыс, подвергавшихся экспериментальным воздействиям на протяжении всего периода антенатального развития: хр 0,05; ххр < 0,01; хххр < 0,001-по сравнению с группой II К; +р <£ 0,05; ++р С 0,01; "^р 0,001 - по сравнению с группой II Э; °р ^ 0,05; 00°р 0,001 - по сравнении с группой И ЭЛ.

К

Л

4 +

+

К

Л

Л

10 0 6 4 2

. 0

1.2 0.8

0.4

0

10

0 10

ал

эл

4-

эл

т "1"

к э

х х +++

ООО

ЭЛ

МОЗГ

сод

а х ч <и о

с.

ж

>

ш

■Каталаза

л ¡с ч

8

0)

и я

ГР

Ж К

«1 ч

=1 Я)

л а ц ^

О X

2 I

ГН

\ я! пз к

tч о ю

с. £ 2 ч ^

0 X

г к

1 5

20 15 10 5 0

20

10 0

30

20

10

0 60;

40

20 0

ал

л а1Г

XXX

++0

ал

X X XXX

Э

Л

эл

ПЕЧЕНЬ

Рис.6. Активность ферментов АО защиты ( X - <э ) в ткани мозга и печени 7-дневных крыс, подвергавшихся экспериментальным воздействиям на протяжении всего периода антенатального развития: *р 4 0,С5; ххр < 0,01; хх*р < 0,001 - по сравнению с группой II К; 4р < 0,05; ++р < 0,01; +++р 0,001-по сравнению с группой ПЭ; °р < 0,05; соор <0,001 -по сравнению с группой ПЭЛ.

К

Э

Л

х

И

э

х х

5

Э

Л

Э

К

запиты как в ткани мозга (СОД и ГР), так и в ткани печени (катала-за и ГР), которые были повышены под воздействием этанола. Исключением была ГП, активность которой в ткани печени оказалась сниженной как в группе II Э, так и в группе II ЭЛ (рис.6).

Таким образом, в данной работе было показано, что кратковременное антенатальное воздействие этанола вызывает активацию процесса ПОЛ в ткани мозга и печени плодов и новорожденных крыс. Это может быть связано с тем, что потребление этанола приводит, к образованию избыточного количества НАДН, что, в свою очередь, создает условия для эффективного функционирования микросомальной этаноло-кисляющей системы (Панченко Л.З., 1987). Показано, что такие компоненты этой системы, как НАДФН-цитохром-с-редуктаза-Р-450 способны генерировать супероксидный радикал и перекись водорода (Lai С. S. et al., 1979).

Кроме того известно, что в условиях перегрузки организма экзогенным этанолом метаболизм его требует участия альдегидоксида-тивных систем, включающих альдегидоксидазу и ксантинокоидаау (Комиссарова И. А. и др., 1983). При этом также образуются перекись водорода и супероксидный радикал, которые способны сами по себе инициировать перекисное окисление ненасыщенных жирных кислот. Это, в свою очередь, может приводить к структурным изменениям мембран и нарушению их функций.

Обнаруженное нами снижение активности отдельных ферментов АО защиты в ткани печени плодов и новорожденных крыс, подвергавшихся кратковременному антенатальному воздействию этанола, также могло способствовать интенсифксации ПОЛ.

Не исключено, что активация этих процессов в определенной мере ответственна эа те биохимические и морфологические изменения в ткани головного мозга и печени, которые были прослежены на той же модели у потомства крыс в постнатальный период развития (Нарциссов Р. П. и др., 1991; Жукова Т. П., 1991).

Более длительная (20-дневная) алкоголизация беременных крыс приводила к снижению содержания продуктов ПОЛ в ткани мозга и печени их потомства на 7-ой день жизни. Это может быть связано с ис-юи^нием субстратов ПОЛ под влиянием этанола, о чем могут свиде-

тедьствовать нарушения дипидного обмена при его потреблении (Sun йY. et al.. 1980; La Droitte С. et al. , 1984).

В. этой серии опытов (II Э), как и при кратковременном.. воздействии этанола, в ткани мозга и печени 7-дневных крыс наблюдалась активация ферментов АО защити. Исключением была ГП, активность которой в ткани печени была снижена, что молит быть обусловлено уменьшением уровня восстановленного гдутатиона под воздействием этанола, который, .как известно, является кофактором для этого фермента (Vina J. et al., 1980).

Как уже было отмечено, линонтар в значительной мере устранял токсическое действие этанола на биохимическом и структурном уровне. Это может быть связано с тем. что лимонная и янтарная кислоты, входящие в состав этого препарата и являющиеся естественными метаболитами цикла трикарбоновых кислот, способны стимулировать окислительные процессы и усиливать окисление недоокисленных продуктов., В данной работе также было показано, что при кратковременном антенатальном воздействии этанола лимснтар, за счет активации ферментов АО эащиты и собственных антиоксидантных свойств, нормализовал влияние этанола на ПОЛ При длительном введении этанола алкоп-ротекторные свойства лимонтара были менее выражены.

Полученные результаты могут явиться базой для более углубленной разработки комплекса средств антенатальной профилактики и терапии нарушений развития детей, матери которых злоупотребляли алкоголем.

ВЫВОДЫ

1. Кратковременное воздействие этанола в последней трети антенатального периода развития приводит к активации перекисного окисления липидов, выражающейся в ткани мозга увеличением содержания шиффовых оснований - у плодов, и диеновых кон^пгатов - у новорожденных крыс. В ткани печени новорожденных крыс выявлено накопление ыалонового диальдегида. К концу первой недеда жизни перекисное окисление липидов стабилизируется как в ткани мозга, так и в ткани печени.

2. Длительная антенатальная алкогольная интоксикация значительно снижала показатели перекисного окисления липидов в мозге (диеновые конъюгаты) и печени (диеновые конъюгаты и шиффовы основания) крыс к концу пергой недели жизни.

3. Активация перекисного окисления липидов в ткани мозга плодов и новорожденных крыс при кратковременном антенатальном воздействии этанола не сопровождалась угнетением ферментов системы антиоксидантной защиты (супероксиддисм;тазы, катапазы, глутатион-пероксидазы, глутатионредуктазы). В то же время в ткани печени этих животных найдено снижение активности отдельных ферментов антиоксидантной защиты (у плодов - глутатионредуктазы и каталазы, у новорожденных - глутагиошхероксвдазы).

4. Показана активация изученных ферментов системы антиоксидантной защиты у потомства крыс к концу первой недели жизни в ткани мозга ' и печени как после кратковременного, так и длительного воздействия этанола, что могкет рассматриваться как результат отставленной во времени активации адаптационных механизмов.

5. Алкопротектор (лимонтар) вызывал увеличение активности ферментов антиоксидантной защиты, особенно у 7-дневных крыс после кратковременного антенатального применения, что, по-видимому, и обусловливает нормализацию показателей перекисного окисления липидов.

6. фи длительном антенатальном применении лимонгара у контрольных животных показатели перекисного окисления липидов и активности ферментов антиоксидантной защиты были снижены, что может быть связано с антиоксидантными свойствами данного препарата

7. Введение лимонгара на фоне кратковременной антенатальной алкогольной интоксикации приводило к нормализации показателей перекисного окисления липидов как за счет собственных антиоксидант-ных свойств препарата, так и за счет умеренного увеличения активности ферментов антиоксидантной защита

8. При длительном антенатальном сочетанном воздействии этанола и лишнтара выявлено снижение показателей перекисного окисления липидов как в мозге, так и в печени потомства крыс. к концу первой недели жизни, которое сопровождалось нормализацией активности большинства ферментов системы антиоксидантной эавдты.

9. Введение лимонтара на фоне алкогмьной интоксикации способствовало устранению патологического эффекта этанола на перекис-ноне окисление лшшдов при кратковременном воздействии, однако не приводило к полной нормализации процесса перекисного окисления ли-пидов при длительном введении этанола.

Список научных работ, опубликованных по теме диссертации

1. Изменения перекисного окисления лилидов в мозге плодов и новорожденных крыс как биохимические показатели повреждающего действия гипоксии и алкоголя во время беременности // Материалы VI Европейской конференции по педиатрии. - Хельсинки, 1987.' - С. 26 (в соавт. с Т. П Жуковой) (на английском языке).

2. Влияние хронического потребления этанола крысами в период беременности на активность тканевых ферментов антиоксидантной зашиты их потомства в постнатальном периоде // Тез. науч. сообщений-Ш Всесоюзной конференции "Биоантиоксидант". - Мэсква, 1989.-

- С. Ü1-62 (в соавт. с Т. П. Жуковой).

3. Влияние внутриутробной гипоксии и хронического потребления этанола во время беременности на активность тканевых ферментов антиоксидантной запиты у новорожденных крыс. М., 1989.- 14с. -Деп. ВИНИТИ, 13.10.89, N 6312-В83 (в соавт. с 'Г. П. Жуковой).,

4. Действие этанола и лимонтара в антенатальном периоде развития на процесс перекисного окисления дипидов и систему антиокси- • дантной защити в ткани мозга и печени плодов и новорожденных крыс // Бюлл. эксперим. биологии и медицины. - 1991. - Т. 112, N 12. -С. 680-583 (в соавт. с Т. IL Жуковой).

5. Вышние алкоголизма беременных крыс на процесс перекисного окисления липидои и систему антиоксидантной еащиты в ткани мозга и печени их потомства // Отчет: "Изучить влияние алкоголя на растущий организм". - М., 1991. - N госуд. регистрации 616-053.2:613.816, инвенг.\ы 029.10040341. - С. 41-58.