Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Направленные изменения спектральных свойств флуоресцентных белков в живой клетке как инструмент изучения функционирования белков

ВАК РФ 03.01.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Направленные изменения спектральных свойств флуоресцентных белков в живой клетке как инструмент изучения функционирования белков"

УЧРЕЖДЕНИЕ РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ НАУК ИНСТИТУТ БИООРГАНИЧЕСКОЙ ХИМИИ ИМ. АКАДЕМИКОВ М.М.ШЕМЯКИНА И Ю.А.ОВЧИННИКОВА РАН

на правах рукописи

ЧЖАН ЛИЦЗЮАНЬ

□□34Э4571

НАПРАВЛЕННЫЕ ИЗМЕНЕНИЯ СПЕКТРАЛЬНЫХ СВОЙСТВ ФЛУОРЕСЦЕНТНЫХ БЕЛКОВ В ЖИВОЙ КЛЕТКЕ КАК ИНСТРУМЕНТ ИЗУЧЕНИЯ ФУНКЦИОНИРОВАНИЯ БЕЛКОВ

специальность 03.01.03 — Молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

2 5 20'0

Москва-2010

003494571

Работа выполнена в лаборатории молекулярных технологий Института биоорганической химии им. Академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН.

Научный руководитель: член-корреспондент РАН

доктор биологических наук Сергей Анатольевич Лукьянов

Официальные оппоненты:

Деев Сергей Михайлович, доктор биологических наук, член-корреспондент РАН, заведующий лабораторией молекулярной иммунологии ИБХ РАН

Савицкий Александр Павлович, доктор химических наук, профессор, заведующий лабораторией физической биохимии института биохимии им. А.Н. Баха РАН

Ведущая организация:

Институт биологии гена РАН

Защита состоится 7 апреля 2010 г. в 10 часов на заседании диссертационного совета Д.002.019.01 при Институте биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН по адресу: 117871, ГСП-7, Москва В-437, ул. Миклухо-Маклая, д. 16/10.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН.

Автореферат разослан 5 марта 2010 г. Ученый секретарь диссертационного совета, доктор физико-математических наук

В.А. Олейников

ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Зеленый флуоресцентный белок вРР и его варианты и гомологи представляют собой уникальное семейство белков, способных к образованию хромофорной группы за счет автокаталитической посттрансляционной модификации собственных аминокислотных остатков, происходящей без привлечения внешних кофакторов и ферментов. Благодаря этому свойству, СИР-подобные белки широко используются в современной молекулярной и клеточной биологии в качестве генетически кодируемых флуоресцентных меток для прижизненного мечения белков, органелл и клеток. Фотоактивируемые флуоресцентные белки (ФАФ-белки) составляют особую группу ОРР-подобных белков, способных к многократному увеличению яркости флуоресценции в ответ на облучение светом определенной длины волны и интенсивности. ФАФ-белки являются мощным инструментом для точного оптического мечения и последующего слежения за перемещением выбранного объекта (отдельных клеток, внутриклеточных органелл и белков). В последнее время ФАФ-белки успешно применяются в новых методах получения изображений со сверхвысоким разрешением.

Создание новых ФАФ-белков, особенно с эмиссией в красной области видимого спектра, а также новых методов их использования представляется высоко актуальной задачей, позволяющей расширить область применения ОРР-подобных белков.

Цели и задачи работы. Целью работы было разработать новые методы анализа деградации и взаимодействий целевых белков на уровне единичных живых клеток с использованием ФАФ-белков. В рамках этой цели были поставлены следующие задачи:

1. Разработать метод мониторинга деградации целевых белков с использованием необратимо фотоактивируемого белка Эепс1га2.

2. Создать мономерный обратимо фотоактивируемый красный флуоресцентный белок и применить его для изучения взаимодействия целевых белков между собой.

Научная новизна и практическая ценность работы. Впервые показана возможность использования ФАФ-белков для определения скорости деградации целевых белков в режиме реального времени на уровне отдельных живых клеток. Получены и охарактеризованы обратимо фотоактивируемые варианты мономерного красного флуоресцентного белка TagRFP; выявлены аминокислотные позиции, имеющие определяющую роль в проявлении свойств фотоактивируемости мутантов белка Та£11РР. Предложен метод изучения взаимодействия целевых белков в живой клетке в режиме реального времени с

использованием красного обратимо фотоактивируемого флуоресцентного белка в качестве акцептора для резонансного переноса энергии, модулируемого светом. Разработанные методы могут быть широко использованы в молекулярной и клеточной биологии для изучения функционирование белков в живой клетке.

Структура диссертации. Диссертационная работа изложена на страницах и состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы, включающего 144 ссылок. Диссертация содержит 35 рисунков и 5 таблицы.

Апробация работы. Основные материалы диссертации были доложены на международной летней школе Molecular Imaging (Гейдельберг, Германия, 2006), V съезде Российского фотобиологического общества (Пущино, 2008) и Международной научной конференции по биоорганической химии, биотехнологии и бионанотехнологии, посвященной 75-летию со дня рождения академика Ю. А. Овчинникова (Москва-Пущино, 2009).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано две статьи в рецензируемых журналах.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. РАЗРАБОТКА МЕТОДА МОНИТОРИНГА ДЕГРАДАЦИИ ЦЕЛЕВЫХ БЕЛКОВ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ НЕОБРАТИМО ФОТОАКТИВИРУЕМЫХ ФЛУОРЕСЦЕНТНЫХ БЕЛКОВ

1.1. Описание предлагаемого метода.

Протеолиз является одним из существенных регуляторных механизмов в жизнедеятельности клетке. Протеолитическая регуляция встречается практически во всех клеточных процессах (рост, дифференцировка, апоптоз, MHCI презентация, передача сигналов, стрессовый ответ, регуляция клеточного цикла, ДНК репарация, транскрипция). Время полужизни клеточных белков варьирует от нескольких минут до нескольких дней. К тому же, время жизни многих клеточных белков может существенно меняться в зависимости от клеточного цикла или в ответ на внешний стимул. Нарушение регуляции протеолиза в клетке может привести к различным патологиям. Получив данные о времени полужизни целевого белка in vivo, можно оценить, насколько его функция регулируется протеолизом в данных условиях.

Классические методы определения времени полужизни белка в клетке основаны либо на кратковременном включении радиоактивно-меченых аминокислот, либо на общем ингибировании синтеза белка с последующим количественным определением постепенного уменьшения количества целевого белка во времени с помощью специфических антител. К недостаткам этих

методов следует отнести их трудоемкость, необходимость работы с радиоактивной меткой, а также, в случае применения ингибиторов белкового синтеза, серьезное нарушение метаболизма клетки, которое может повлиять на

полученный результат. Очевидно

целевой белок - ФЛФ-белок

фотоактнвация ФДФ-белка

слежение во времени

ирсмя

Рис. 1. Схема предлагаемого метода слежения за деградацией целевого белка с помощью ФАФ-белка. Клетки экспрессируют конструкцию, кодирующую целевой белкок, слитый с ФАФ-белком. Стационарная концентрация химерного белка и соответствующий флуоресцентный сигнал (например, зеленый) зависит от уровня синтеза белка и скорости его деградации, а также скорости созревания ФАФ-белка. После фотопереключения ФАФ-белка в клетке появляется новый сигнал (например, красный), уровень которого не зависит от синтеза и созревания новых молекул ФАФ-белков, а зависит только от скорости деградации данного белка. Соответственно, слежение за интенсивностью флуоресценции фотоактивированной формы ФАФ-белка позволяет оценить скорость деградации целевого белка в режиме реального времени на уровне одной клетки.

также, что классические подходы неприменимы для анализа отдельных клеток в режиме реального времени.

С появлением вИР было показано, что его флуоресценция позволяет проводить оценку времени полужизни целевых белков, слитых с СИР, в индивидуальных клетках в реальном времени с помощью флуоресцентной микроскопии или проточной цитофлуориметрии.

Однако, поскольку яркость флуоресценции ОРР зависит как от синтеза и созревания нового белка, так и от его последующей деградации, данный подход требует применения ингибиторов белкового синтеза, очевидно нарушающих нормальную жизнедеятельность клетки.

В данной работе мы предлагаем метод мониторинга деградации целевых белков с использованием мономерных фотоактивируемых флуоресцентных белков, способных к необратимому изменению спектров возбуждения и эмиссии после облучения светом определенной длины волны.

Метод основан на экспрессии в клетках конструкции, кодирующих целевой белок, слитый с ФАФ-белком (Рис. 1). После фотоактивации образуется спектрально различимый пул ФАФ-белка, количество которого не зависит от синтеза нового белка, а

зависит только от его деградации в клетке (следует учитывать обесцвечивание флуоресценции при ее регистрации). Это позволяет количественно оценивать скорость распада белка по исчезновению флуоресцентного сигнала.

Предложенный подход был опробован на примере белка Dendra2 в качестве ФАФ-белка. Dendra2 - это мономерный зеленый флуоресцентный белок (максимум возбуждения и эмиссии при 490 и 507 нм, соответственно), который необратимо фотоактивируется, то есть приобретает красную флуоресценцию (максимум возбуждения и эмиссии при 553 и 573 нм, соответственно) в ответ на облучение ближним УФ (360-410 нм) или синим (450-490 нм) светом. Время полусозревания хромофора Dendra2 составляет 90 мин при 37°С. В данной работе мы показали возможность использования белка Dendra2 для определения времени полужизни целевых белков in vivo.

1.2. Подбор условий для визуализации, фото переключения и наблюдения за белком Dendra2 в клетках млекопитающих

В качестве модельного объекта мы использовали культуры клеток человека (линии HeLa, НЕК293 и РС12), временно трансфецированные плазмидами, кодирующими белок Dendra2 и белки слияния. Для визуализации клеток использовали лазерный сканирующий конфокальный микроскоп Leica DMIRE2 SP2, имеющий 100 мВт аргоновый лазер с линией при 488 нм, 1 мВт гелий-неоновый лазер с линией при 543 нм, 150 Вт ртутную лампу, 63х объектив и термостатируемую камеру. Для визуализации зеленой флуоресценции Dendra2 применяли сканирование 2-10% 488 нм лазером. Важно отметить, что при таком режиме сканирования фотопереключения Dendra2 в красную форму не происходит, что дает возможность оценивать интенсивность зеленой флуоресценции в клетке, не вызывая нежелательной фотоконверсии. Также было обнаружено, что такое многократное сканирование практически не приводило к обесцвечиванию зеленой формы Dendra2. Для фотопереключения Dendra2 клетки подвергали облучению в течение 15 секунд синим светом от ртутной лампы (450490 нм). Для визуализации красной флуоресценции белка в конфокальном режиме сканирования использовали 25% 543 нм лазер. В данных условиях практически не наблюдалось обесцвечивания красной флуоресценции Dendra2 после 20-30 сканирований, что достаточно для построения графика падения интенсивности красной флуоресценции вследствие деградации белка в клетке.

При трансфекции клеток линии HeLa и НЕК293 плазмидой, содержащей нуклеотидную последовательность Dendra2, была обнаружена зеленая флуоресценция, интенсивность которой при добавлении циклогексимида к клеткам не уменьшалась в течение нескольких часов. При фотоактивации синим светом наблюдали уменьшение зеленой флуоресценции и возрастание красной.

Далее следили за красной флуоресценцией клеток при 37°С на конфокальном микроскопе. Оказалось, что интенсивность красного сигнала в течение нескольких часов практически не падала (Рис. 2а), что показывает стабильность белка Dendra2 в живых клетках.

1.3. Влияние PEST-мотивов и убиквитина на время жнзни белка Dendra2 в клетке

Далее мы проверили, возможно ли направить белок Dendra2 на путь протеосомной деградации с помощью известных деградационных мотивов. Из литературы известно, что белки с периодом полураспада менее 2 часов часто содержат фрагменты, обогащенные пролином, глутаминовой кислотой, серином и треонином (так называемые PEST-сигналы). Делеция фрагмента, содержащего PEST-сигнал, значительно увеличивает период полураспада белка, а перенос этого фрагмента на стабильную молекулу приводит к быстрому гидролизу последней. Для проверки способности белка Dendra2 деградировать в клетке были получены следующие химерные конструкции: pDendra2-PEST(odc) и pDendra2-PEST(npdq, где PEST(odc) - PEST-последовательность орнитиндекарбокислазы (ODC, ornithine decarboxilase) и PEST(npdc) - PEST-последовательность белка фактора нейтральной дифференцировки 1 (NPDC-1, neural proliferation and differentiation control protein-1).

Деградаиионный мотив PEST белка ODC. Ранее было показано, что EGFP, слитый с мотивом PESTodc, имеет время полужизни от 2 до 9.8 часов в зависимости от конкретной химерной конструкции и клеточной линии. В натоящей работе, клетки НЕК293, трансфецированные плазмидой pDendra2-PEST(odc)> после фотоактивации показали быстрое падение красной флуоресценции со временем полужизни 2-3 часа (Рис. 2а).

Деградаиионный мотив PEST белка NPDC-1. При экспрессии химерной конструкции pDendra2-PEST(NPDc) в клетках PC 12 наблюдали очень слабую зеленую флуоресценцию. При добавлении циклогексимида (100 мкг/мл) зеленая флуоресценция исчезала очень быстро; время полужизни белка составило 15 мин (Рис. 3). При инкубации трансфецированных клеток с необратимым ингибитором протеасомы эпоксомицином (0,5 мкМ) в течение шести и более часов наблюдалось существенное увеличение интенсивности зеленой флуоресценции.

Короткоживущий белок Dendra2 с N-кониевым неотщепляем ым убиквитином. Была создана химерная конструкция pUb(G75A/G76V)-Dendra2, которая содержит последовательность кДНК убиквитина, несущего замены G75A и G76V, и последовательность Dendra2. Известно, что при наличии этих мутаций не происходит отщепления убиквитина от белка слияния, что приводит к дестабилизации белка. При экспрессии химерной конструкции pUb(G75A/G76V)-Dendra2 в клетках НЕК293 зеленая флуоресценция не наблюдалась. При

инкубации трансфецированных клеток с ингибитором протеасомы эпоксомицином (0.5 мкМ) в течение шести и более часов появлялась зеленая флуоресценция.

Вместе, эти результаты четко показывают, что белок Оеп<1га2, как и СРР, является стабильным белком, но может быть направлен в убиквитин-протеасомную систему в составе химерных белков, несущих быстро деградируемые последовательности.

(а)

I

\ ' \

1>

013-

z о

0-4-

г: к

п £ 0.2-

£

0.0-

(б)

Х-...

(Л

к

Е 0,8 о и: ^

™ V 06

к! 9 ~ -СО .^ 0 4

75 2 0,2 О.Я

о Ь,

X О.О

3-о*й с, /' „ V А

\ 4

(в)

«ГЛ

X Лн*

: и" 0.0'

100 1Й время, мни

v -и' «ъ »• -о

(Г)

20 <10 60 № время, мин

100 120 140

« •

-с-и"—0*-

(д)

0.8

о

2 о о.е

§ % 0.4

г* 2 0.2

г- У

г 1С 00

время, мин

время, мин

, -г

\ •

РМА \

40 !М 80 время, мим

20 30 60 80 109 120 время, мин

s 08

I-4 0.6

1.4. Определение времен» полужизни белка 1кВа при помощи Dendra2

В качестве модельного белка для определения времени полужизни по изменению красной флуоресценции Dendra2 был выбран ингибитор NFkB (1кВа). 1кВа относится к семейству белков 1кВ, которые связываются с

транскрипционным фактором NF-кВ в цитоплазме, препятствуя его транслокации в ядро. При воздействии на клетки TNFa (Tumor Necrosis Factor-a), IL-1 (Interleukin-1) или форболовым эфиром (PMA, phorbol 12-myristate 13-acetate) происходит активация 1кВ киназных комплексов IKK (1 и/или 2), которые фосфорилируют 1кВа по остаткам Ser32 и Ser36. Это приводит к быстрому распаду 1кВа и активации NF-kB.

Rpt'MU, mihi

Рис. 3. Репрезентативные графики изменения зеленой флуоресценции Dendra2-PEST(npdq в клетках РС12 в присутствии циклогексимида (100 мкг/мл). Представленные графики соответствуют интенсивности флуоресценции отдельных клеток.

Рис. 2. Измерение скорости деградации белков с использованием Dendra2 в трансфецированных клетках НЕК293. В приведенных графиках каждая линия соответствует уровню интенсивности флуоресценции отдельной клетки (для каждого эксперимента было подсчитано по 10-15 клеток и представлено по 1-2 репрезентативных графика), (а) Изменение красной флуоресценции клеток, трансфецированных pDendra2 (пустые квадраты) или pDendra2-PESTodc (черные круги и треугольники), (б) Изменение красной флуоресценции клеток, экспрессирующих pkBa-Dendra2. Вставка показывает пример конфокального изображения клеток в зеленом канале (возбуждение при 488 нм, регистрация при 500-530 нм). (в) Изменение красной флуоресценции клеток на той же культуральной чашке, что и в (б), но после добавления 0.5 мкМ ингибитора протеосомы MGI32. (г) Изменение красной (пустые квадраты) и зеленой (черные круги) флуоресценции MlKBa-Dendra2 в клетке НЕК293. (д, е) Изменение красной флуоресценции lKBa-Dendra2 (клетки, не подвергавшиеся воздействию - открытые символы; клетки, инкубированные с 0.1 мкг/мл РМА (стрелкой показан момент добавления) -заполненные символы) в линейной (д) и полулогарифмической (е) шкалах.

Для белка 1кВа показана деградация по убиквитин-зависимому протеасомному пути. Было показано, что деградация 1кВа и последующая активация ЫР-кВ происходит в клетках и без стимулирующих воздействий со средней скоростью, варьирующей от 1.5 до 5 часов в зависимости от клеточной линии.

Клетки НЕК293, трансфецированные конструкцией р1кВа-Оепс1га2, визуализировали под микроскопом. В клетках со средним уровнем экспрессии наблюдалась ожидаемая преимущественно цитоплазматическая локализация зеленой флуоресценции (Рис. 26). После фотоактивации Бепс1га2 интенсивность возникшего красного сигнала быстро падала. Время полужизни белка 1кВа-Оепс1га2, измеренное по падению интенсивности красной флуоресценции, составило 1.5-2 часов (Рис. 26). После инкубации этих клеток с ингибитором протеасомы МС132 мы наблюдали прекращение падения красной флуоресценции (Рис. 2в). Это свидетельствует о том, что падение красной флуоресценции обусловлено протеасомной деградацией белка р1кВа-Оепс1га2. Полученные нами результаты совпадают с ранее опубликованными результатами о времени полужизни химерного белка 1кВа-ОРР и внутриклеточного 1кВа.

В качестве контроля мы определили время \ полужизни химерного

белка 1кВа-Оепс1га2

классическим методом инкубации клеток с ингибитором белкового синтеза циклогексимидом и последующим вестерн-блот анализом с помощью поликлональных антител против Оепс1га2; время полужизни 1кВа-Оепс1га2, измеренное таким образом, составило 2 часа (Рис. 4).

В качестве

дополнительного контроля был получен мутант 1кВа с аминокислотными заменами 832А и БЗбА (М1кВа). Из литературных

1 0-

: 08-

л: 08-

£ 3 04.

0 2-

05

О 2 л Д 5

инкубация с циклогексимидом, часы

Рис. 4. Скорость деградации 1кВа-Оепс1га2, измеренная с помощью инкубации клеток с циклогексимидом. Вставка показывает вестерн-блот анализ (антитела против Оепс1га2) суммарного белка из 1кВа-Оепс1га2-трансфецированных клеток, инкубированных с циклогексимидом в течение 0, 1, 3 и 5 часов. Полоса соответствует ожидаемой массе 60 кДа, других полос на пленке не обнаружилось. График построен на основе данных, полученных из иммуноблота.

данных известно, что эти мутации приводят к повышению стабильности белка 1кВа. Полученную химерную конструкцию pMlKBa-Dendra2 экспрессировали в клетках линии НЕК293. Как и ожидалось, после фотоактивации наблюдалось постепенное возрастание зеленой флуоресценции, а уровень красной флуоресценции оставался практически постоянным (Рис. 2г).

Из литературных данных известно, что активация клеток форболовым эфиром (РМА) уменьшает время полужизни 1кВа. Действительно, мы наблюдали значительное ускорение падения красной флуоресценции после инкубирования клеток, трансфецированных plKBa-Dendra2, с форболовым эфиром (Рис. 2д,е). Время полужизни 1кВа составило 20 мин, что хорошо согласуется с ранее описанным значением, равным 15 мин. Отметим, что нам удалось зарегистрировать изменения в скорости деградации белка в одной и той же клетке до и после добавления форболового эфира.

В целом, полученные нами результаты относительно скорости деградации lKBa-Dendra2 хорошо согласуются с литературными данными по деградации эндогенного 1кВа, a также с данными по белку слияния IicBa-EGFP.

К недостаткам предлагаемого метода можно отнести:

1. Необходимость работать с экзогенными генно-инженерными конструкциями, обычно обеспечивающими повышенный уровень экспрессии целевого гена для четкой регистрации флуоресцентного сигнала.

2. Возможное влияние ФАФ-белка на деградацию целевого белка

3. Невозможность регистрации белков с очень короткими временами жизни, так как хромофор ФАФ-белка требует времени для своего созревания.

Следует отметить, что все эти недостатки также можно отнести к мечению белков с помощью EGFP и других флуоресцентных белков, но несмотря на это, этот подход широко применяется в современной клеточной биологии. Предложенный нами метод дает уникальную возможность регистрации деградации целевого белка в режиме реального времени на уровне одной клетки без добавления ингибитора белкового синтеза, позволяет следить за изменениями скорости деградации белка при внешних воздействиях на клетку, выявить возможную связь деградации целевого белка с особенностями отдельных клеток (размер, форма, стадия клеточного цикла и пр.).

2. ПОЛУЧЕНИЕ И ИСПОЛЬЗОВАНИЕ МОНОМЕРНЫХ ОБРАТИМО ФОТОАКТИВИРУЕМЫХ КРАСНЫХ ФЛУОРЕСЦЕНТНЫХ БЕЛКОВ

TagRFP является на сегодняшний день самым ярким мономерным красным флуоресцентным белком. Это делает TagRFP перспективной основой для получения обратимо фотопереключаемых красных флуоресцентных белков.

2.1. Получение мономерного обратимо фотопереключаемого красного флуоресцентного белка KFP-HC

Мы провели мутагенез TagRFP методом случайного мутагенеза по ключевым позициям, 148 и 165 (здесь и далее нумерация по GFP, рис. 5), которые согласно литературным данным по другим флуоресцентным белкам должны в большой степени определять возможность цис-транс-изомеризации хромофора. Была получена библиотека мутантных вариантов, несущих 20 возможных аминокислотных остатков в положениях 148 и 165 в различных сочетаниях (всего 400 возможных сочетаний), экспрессирующихся в Е. coli. Визуальный скрининг около 5000 колоний этой библиотеки показал наличие красных флуоресцентных белков различной яркости, однако вариантов с ярко выраженными свойствами фотоактивации найдено не было. Мы предположили, что некоторые аминокислотные остатки в окружении хромофора TagRFP мешают проявлению свойств фотоконверсии.

Для преодоления этой проблемы был проведен мутагенез по положениям 148 и 165 белка-предшественника TagRFP, называемого NRM14 и обладающего мономерной структурой, но имеющего более низкую, чем у TagRFP, яркость флуоресценции. Анализ аминокислотных позиций, различающих белки TagRFP и NRM14, показывает, что только для трех из них (позиции 69, 179 и 181) боковые цепи погружены внутрь белковой глобулы (рис. 5) и, следовательно, могут напрямую влиять на способность к обратимой фотоконверсии. Мы предположили, что в случае TagRFP более объемные остатки Arg69 и Phel81 (Lys69 и Leul81 в NRM14) могут мешать г/ис-транс-изомеризации хромофора, которая должна происходить при фотоконверсии. Интересно, что в фотоконвертируемом белке KFP1 в соответствующих позициях 69 и 181 стоят именно Lys и Leu.

При мутагенезе NRM14 было обнаружено два мутантных варианта, обладающих способностью к обратимой фотоконверсии. Один из них содержал замену S148C и проявлял фотоконверсию, аналогичную обратимой фотоактивации KFP1: интенсивность красной флуоресценции возрастала в 3-4 раза под воздействием зеленого света (530-560 нм) и затем возвращалась к исходному уровню при облучении синим светом (450-490 нм) или после инкубации в темноте. Второй мутантный белок, названный KFP-HC, содержал замены N148H и S165C (рис. 5) и проявлял свойства, обратные свойствам белка

КРР1: исходно относительно высокая интенсивность красной флуоресценции падала в 10 раз под воздействием зеленого света (530-560 нм) и затем возвращалась к исходному уровню при облучении синим светом (450-490 нм) или после инкубации в темноте. Так как мутант КТР-НС проявлял большую яркость флуоресценции и больший динамический диапазон фотоконверсии, мы охарактеризовали его более подробно.

GFP MSf;GEELFT3WPI^V3L3dIWN3HKFiVSGEG5G:iArYGiaüTLKF:CTT-GKLPVPWPT

DsRed MP.SSKNVXKSFiSRFKVP^EGTVjrSHEFEISGSGSGEFYEGHNTVKLf'.VTr'.'S'I-PIPFAWDI

KFP1 MASLLTETMPFKTrlEG-VNGHCFKCXGKGEGNFFEGTQEMKIEVISGGPLPFÄFHI

TagRFP MSEllraKMKMKL;MEG7V:iKHHFF.CrSEG3GK?i'EGrQTMKIia?VS3GPLPFAFDI

MMP.14 HSELIKS™KMKLlMEG7V:c:,"4KFKCrSEG3GF.PYEGrQTMKIKWE33PLPFaFDI

KFP-HC MSELIiCSKMKMIKLVMEGrVXNHKFilCrSEGEGKPYEGTQTMKIKWSi.SPLPFÄFDI rsTagRFP MSELIF3NMHM:KiiMEGrV:4"CHHFF.C-SEGSGr.?iEG~QTMRIRWE33FLPFÄFDI

GFP

DsRed

KFP1

TagRFP

NMR 14

KFP-HC

rsTagRFP LATSEMY'

70 SO SO 100 110

CFSRYPDKKr.QKDFFKSAM?EiSYVQERTIFFKrDC-:«KT?AEV::.FEGDT AI>IP--DYKKLSFPEGFK№RVMNFEDGGVVTVrQDSSb5DGC |SKTFIKXViGXF--DYFKQSFPEGFTWERTTrY'EDGGFLrA:-iQ:>TSLMDC [SP.TFTItfHTQGIF—DFFKQSFPEGFTWSRVTTYEE 3GVI,7A7Q;>TSI,2DGC RTFXNHTQGXP— DFFKQSFPEGFTWSRVTTYEE SGVbTAiQtiisfiDGC QGIP--DFFKQSFPEGFTWERVTrY"EDGC-VLTArQDTSL2DGC INHTQGIP—DFWKQSFFEGFTWERVTTYEE SGVbTATQDTSLSDGC

120 130 140 150 160 170

GFP L\T^.ISLKGZDFr3rGr4lLGHFXEY!^NSHl^YXKAEKQKNGXKV>JFKIRHNIEDGSVQL

DsRed FIYF-VF.FIGVNFFSDGFWlJKr^Ty-GWEASTERLYF— REGVLKGEIHKALKLRDGGHYL

KFP1 LVYKV:--.ILGX:1FPA;3PVK;NF.V---F.WEFATEIVYE—VE SVbRGQSlJiAi,KCPGGF.HLr

TagRFP LI Y'MVr'.I RÜ3VNFPSNG F VMQKKTL - GWEäI|tEMIjY F —AE- 3GLEGF.S E'MÄLKLVGGGHX I

MMP.14 l:y:jvkxf-.gvmfpsn3PVm;kkxi-gweante:4jY?—acgglegrsemalklvggghli

KFP-HC L;y:-rVKIRÜVNFPSir3FVMiKF.TL-:-WEAHTEMLiF—ADGGLEGRCDMAMKLVGGSHLI

rsTagRFP LIYNVKLRGVNFFSNGFVMgKKTL-GWEAArEMLYF—A DG GLEG P.G E'MAL KL VG GG H X X

130 190 200 210 220 230

ÄDHY^'JHTPIGDG-PVLLPE NHYtSTQSALSKr PNEKP.r^MVLlEFVTAÄl-ITHGKDELYK

VE FKSIYMAKK---FVQLFSYYYVEiSKLDIISHNEDYT-IVEQYERTEGRHHLFL

CKLHTrYPiKKPAS^ALriiPC-FHFEDHF.IEI.MSEVEKl-F-CYF.QYEAAVGRYCr^AAPSKLGHH CNFF.TTXRSKKPAKNLKKPGVYYVD^.LEBIK3ADKET-YVEQHEVAVÄP.ICDLPSKLGHKLN ^^^TYFtSKKPAKNL^PGV^YV^RLERXKSADFXT-i^EeHEKAv'^YCEiLPSKLGHKLN MX,r.TTYT>.SKKPAKM.^PGVYl^lfcjfeRIf3ADKET-i^EQHB№VAKYCDLPSKLGHKLN rsTagRFP CNLI:T7YP3KHPAKNL№P3VYFVE'KRLERIK3ADKET-YVEQHEVAVARYCDLPSK1GHKL.V

Рис. 5. Выравнивание аминокислотных последовательностей флуоресцентных белков. Нумерация остатков соответствует последовательности GFP. Разрывы, внесенные для выравнивания последовательностей, обозначены прочерками. Аминокислотные остатки, боковые цепи которых погружены в белковую глобулу, показаны на сером фоне. Аминокислотные остатки в положениях 65-67, образующие хромофорную группу, выделены прямоугольником. Замены в NMR 14, отличающие его от TagRFP, подчеркнуты. Замены, характерные для KFP-HC и rsTagRFP, выделены жирным шрифтом и подчеркиванием.

GFP

DsRed

KFP1

TagRFP

NMF.14

KFP-HC

2.2. Спектральные свойства KFP-HC

Выделенный белок KFP-HC обладал флуоресценцией в красной области спектра с максимумами возбуждения и эмиссии при 585 и 615 нм, соответственно (рис. 6а). После облучения интенсивным зеленым светом интенсивность флуоресценции падала в 8-10 раз (рис. 6а). Кроме изменения интенсивности флуоресценции, происходило также некоторое изменение формы спектров возбуждения и эмиссии, что хорошо заметно при сравнении нормализованных спектров (рис. 66). В "потушенном" состоянии основной пик возбуждения

немного сдвигается в синюю область (максимум при 575 нм), а также появляется новый пик при 480 нм. Последний, вероятно, соответствует протонированному состоянию хромофора и определяет восстановление "потушенного" синим светом белка KFP-HC. Максимум эмиссии также претерпевает гипсохромный сдвиг на 13 нм (602 нм). Измерение спектров поглощения показало, что при тушении KFP-HC зеленым светом происходит сдвиг максимума с 575 до 565 нм с некоторым увеличением коэффициента молярного поглощения (рис. 6в). Поскольку яркость флуоресценции пропорциональна произведению

коэффициента молярного поглощения и квантового выхода, то очевидно, что тушение KFP-HC объясняется уменьшением квантового выхода флуоресценции. В активированном состоянии KFP-HC обладал квантовым выходом флуоресценции 0.08 и коэффициентом молярного поглощения

450 400 500 550 Длима полны, мм

Рис. 6. Спектральные свойства белка КИР-НС. (а) Спектры возбуждения (штриховые линии) и эмиссии (сплошные линии) КРР-НС в исходном (черные линии) и потушенном (серые линии) состояниях, (б) Спектры из панели а, нормализованные на максимальное значение флуоресценции для каждой кривой, (в) Спектры поглощения К^Р-НС в исходном (черная линия) и потушенном (серая линия) состояниях.

72000 М"1 см"1. После тушения КРР-НС зеленым светом, в темновых условиях, белок медленно возвращался к исходному (флуоресцентному) состоянию с временем полувосстановления около 30 мин.

2.3. Фотоконверсия KFP-HC в культуре клеток млекопитающих

Для демонстрации возможности использования KFP-HC для прижизненного мечения кодирующая последовательность KFP-HC была клонирована в вектор для экспрессии в клетках млекопитающих. Была проведена временная трансфекция клеток линии Phoenix Eco (модификация широко используемой линии клеток эмбриональной почки человека НЕК293). Флуоресцентная микроскопия показала наличие трансфецированных клеток с флуоресценцией в красной области спектра (рис. 7а). Интенсивность флуоресценции была низкой, но четко детектируемой. При наблюдении под флуоресцентным микроскопом интенсивность флуоресценции быстро падала, поскольку возбуждающий зеленый свет вызывал затухание флуоресценции белка KFP-HC. После кратковременного облучения синим светом (набор фильтров для визуализации GFP) происходило восстановление красного сигнала. Путем варьирования яркости и продолжительности облучения зеленым и синим светом удалось подобрать условия для проведения многократных циклов тушения активации белка KFP-HC без заметного необратимого фотообесцвечивания (рис. 76). В ходе этих экспериментов выяснилось, что избыточное облучение именно синим, а не зеленым светом оказывает основное влияние на скорость необратимого фотообесцвечивания белка KFP-HC.

Таким образом, белок KFP-HC может быть применен для флуоресцентного мечения в культуре клеток млекопитающих. Свойства обратимой фотоконверсии потенциально могут быть использованы для локального оптического мечения, а также для микроскопии сверхвысокого разрешения. Выявленная взаимосвязь между структурой (аминокислотной последовательностью) и способностью к обратимой фотоконверсии у различных вариантов красного флуоресцентного белка TagRFP может позволить в будущем разработать более яркие фотоконвертируемые красные флуоресцентные белки.

(а)

Il 12 ¡.~ Ы |J 16 17 IS 19 20

Время, с

Рис. 7. Фотоконверсия KFP-HC в живых клетках млекопитающих, (а) Микрофотографии двух клеток линии Phoenix Eco, содержащих KFP-HC, полученные с использованием наборов фильтров ТХ2 для визуализации флуоресценции в красной области спектра. Фотографии получены последовательно в указанном порядке, каждое нечетное изображение соответствует KFP-HC в активированном состоянии, каждое четное - в потушенном состоянии. Тушение KFP-HC осуществлялось облучением зеленым светом (набор фильтров ТХ2), активация - облучением синим светом (набор фильтров GFP). (б) Изменение интенсивности флуоресценции KFP-HC в клетках, показанных на панели (а). Серые и черные прямоугольники над графиком обозначают интервалы облучения зеленым и синим светом, соответственно. Цифры соответствуют изображениям на панели (а).

2.4._Получение_обратимо_фотопереключаемого_красного

флуоресцентного белка гаТаеЯРР

В сотрудничестве с лабораторией В. В. Верхуши (Медицинский колледж А. Эйнштейна, Бронкс, США) путем направленного и случайного мутагенеза красного флуоресцентного белка Та§ЯРР был получен его вариант, имеющий обратимо фотопереключаемый спектр поглощения. Для этого был проведен направленный мутагенез по позициям 148, 165 и 203 с помощью «вырожденных» праймеров, в сочетании с случайным мутагенезом. Отбор целевых клонов производился с использованием проточного флуориметрического сортера клеток (эта работа выполнялась в лаборатории В.В. Верхуши). Изменение спектра

поглощения дополнительно детектировали визуально по изменению окраски бактериальных колоний (при дневном освещении) из розового в желтый после фотопереключения. В результате был получен вариант Та£ЯРР/РЬе84Тгр/Ие125Ьеи/А8п 148А1а/8ег165С1у/РЬе181 Ьеи/ЬуБ 189А5пЯуг200РИе, который был назван гзТа§ЯРР (геуегеЫу зшИсЬаЫе Та§[1РР).

Вероятно, ключевыми заменами, обеспечивающими фотопереключаемость rsTagRFP, являются А5п148А1а и Бег165С1у, т.к. остатки А1а148 и в1у165 не могут образовать водородные связи с хромофор-образующим Тугбб, что облегчает цис-т/>аяс-изомеризацию хромофора, а также мутация РЬе181Ьеи, характерная и для КРР-НС. Разные максимумы поглощения при фотопереключении rsTagRFP, очевидно, являются следствием протонирования хромофора в «потушенном» состоянии. Схожий механизм фотопереключения был описан у других ФАФ-белков, например, Огопра и тТРР0.7.

2.5. Характеристика выделенного геТааЯРР в растворе

Облучение светом при 445/25 нм переключает геТа£ЯРР во флуоресцентное состояние с максимумами поглощения при 567 нм и эмиссии при 585 нм (Рис. 8 и Табл. 1). Облучение светом при 570/30 нм переключает геТа£КРР в низкофлуоресцентное состояние; при этом пик поглощения при 567 нм почти исчезает, и вместо него появляется новый пик поглощения при 440 нм. Изменения в поглощении при фотоконверсии rsTagRFP, рассчитанные как изменение интегрального поглощения в диапазоне ±50 нм от максимумов при 567 нм и 440 нм составили 22 и 3.4 раза, соответственно. Соотношение яркости флуоресценции флуоресцентной и низкофлуоресцентной форм составило около 20, что совпадает

с соотношением для полосы поглощения при 567 нм. Квантовый выход красной флуоресценции не изменялся при фотоконверсии и составлял 0.11. (Табл. 1).

100

= 80

¡60

>40

¡20

— поглощение НФ

...... эмиссия Ф

возбуждениеФ

300 400

500 600 700

Длина волны, мм

Рис. 8. Спектры поглощения, эмиссии и возбуждения г5Та§ЯРР. Здесь НФ -нефлуоресцентная форма, Ф флуоресцентная форма.

Интересно отметить, что при титровании рН к кислую область интенсивность пика поглощения при 567 нм постепенно уменьшается и появляется пик при 440 нм. Эти два пика, очевидно, относятся к анионной и нейтральной формам

гидроксифенильной группы хромофора.

Таблица!. Спектральные характеристики rsTagRFP по сравнению с TagRFP.

Белок rsTagRFP TagRFP

Ф НФ

Максимум поглощения, нм 567 440 555

Изменение поглощения в диапазоне ±50 нм от максимума (соотношение) 22 3.4 -

Коэффициент экстинкции, М''см"' 36800 15300 69900

Максимум эмиссии, нм 585 585 584

Квантовый выход 0.11 0.11 0.48

Относительная яркость, % 12 0.6 100

РЪ 6.6 3.9

Ф - флуоресцентное состояние, НФ - нефлуоресцентное состояние.

рКа - pH, при котором флуоресценция падает в 2 раза при титровании белка из

нейтральной в кислую область.

2.6. Применение rsTagRFP для изучения белок-белковых взаимодействии в живой клетке

Для изучения взаимодействия целевых белков в клетке часто используют метод резонансного переноса энергии (Fluorescence or Forster Resonance Energy Transfer, FRET) между двумя флуоресцентными белками. Один флуоресцентный белок выступает в качестве донора, другой, чей спектр поглощения хорошо перекрывается со спектром эмиссии донора, - в качестве акцептора. При сближении молекул донора и акцептора на расстояние менее 10 нм при возбуждении донора происходит нерадиационный перенос энергии на молекулу акцептора, что выражается в уменьшении яркости (и времени жизни) флуоресценции донора и увеличении яркости флуоресценции акцептора. Для детекции взаимодействия между двумя изучаемыми белками, в клетке экспрессируют конструкции, кодирующие белки слияния целевых белков с флуоресцентными белками, между которыми может происходить эффективный FRET. При взаимодействии целевых белков, флуоресцентные белки сближаются, что можно детектировать по возникновению FRET. Недавно была предложена стратегия фотохромного нерадиационного переноса энергии (photochromic FRET, pcFRET), основанного на измерении изменений яркости и/или времени жизни флуоресценции донора при обратимом «включении» и «выключении» акцептора за счет фотоиндуцируемого изменения его спектра поглощения. Это позволяет

упростить и повысить чувствительность детекции FRET, а также проводить многократные измерения на одной клетке. Однако, ни один из ранее описанных обратимо фотоактивируемых белков не обладал фотопереключаемым спектром поглощения, поэтому pcFRET был продемонстрирован только на синтетических красителях.

Поскольку фотоконверсия rsTagRFP сопровождается резким изменением формы спектра поглощения (в частности, 20-кратным изменением амплитуды пика при 567 нм), этот белок, возможно, является подходящим акцептором для метода pcFRET. Для проверки этой возможности, в качестве донора был выбран желтый флуоресцентный белок EYFP, так как имеется значительное перекрывание между спектрами эмиссии EYFP и поглощения rsTagRFP во флуоресцентном состоянии (Рис. 9а); также ожидается минимальное изменение флуоресценции rsTagRFP при воздействии возбуждающего света на EYFP. В химерном белке rsTagRFP-EYFP мы ожидали увидеть модуляцию интенсивности флуоресценции EYFP в ответ на фотоконверсию rsTagRFP (Рис. 96). Действительно, мы регистрировали многократное обратимое усиление флуоресценции EYFP как результат тушения rsTagRFP на выделенных белках слияния rsTagRFP-EYFP (Рис. 9в) и бактериальных колониях, синтезирующих белок слияния. Обратимое увеличение яркости флуоресценции EYFP составляло 19-20%.

(а)

100

g 80 >| ео

¡14° II

¡5 8-20 в-Э-

0

Рис. 9. Характеристика выделенных в растворе белков слияния EYFP-rsTagRFP. (а) Наложение спектра поглощения rsTagRFP во флуоресцентном состоянии и в нефлуоресцентном состоянии I на спектр эмиссии EYFP. (б) Схематическое изображение фотохромного FRET, где донор -EYFP, а акцептор - rsTagRFP во флуоресцентном (rsTagRFP окрашен в красный цвет) или нефлуоресцентном состоянии (rsTagRFP окрашен в синий цвет), (g) Циклы фотопереключения ! белков слияния EYFP-rsTagRFP при облучении светом при 436/20 нм (16 мВт/см2 , 0.6 с) и 570/30 нм (82 мВт/см2 , 0.5 с). Интенсивность флуоресценции EYFP нормализовали на интенсивность в первом цикле переключения rsTagRFP во флуоресцентном состоянии.

(а)

(г)

ЕСРЯ-ЕУРР

СгЬг-гвТадРРР

*

X \

% ж

сч т

X 1

к 2 'V \

ГЧ % г А

X л • Ш

5 О V "'-А,

т

ч*

Ъ. *

-2 мин

2 мин

4 мин

(б) ^ 12

& 1.0

оо

я

& 08 II0'6

ВО X

о ^ 0.4 к и

5 о. 0.2

о.£> ° 5

х-9-

0.0

(В)

= 25

-3В

8Е

15

Н я з: к

е § ю

: о

§ I ё-2.

с -в-

10 мин

о

2 4 6 8 10 12 циклы фотопереключения

I)

I

А

-2 0 5

10 15 20 25 30 35 время, мин

15 мин

30 мин

1 Ф Л. ■ \ ' чИГ ' 4 ь А— V

НФ » ■тФ* /Л 4 чЛ* Шш V

Рис. 10. Взаимодействие между ЕвРК-ЕУРР и Grb2-rsTagRFP в живых клетках НеЬа, визуализированное при помощи метода рсРЯЕТ. (а) Эпифлуоресцентные изображения клеток одного поля в фильтре УБР (левая) и ТХ2 (правая) до и после добавления ЕвР. (б) Модуляция интенсивности красной флуоресценции в клетке во время циклов фотопереключения акцептора Grb2-rsTagRFP. (в, г) Изменение флуоресценции БОРЯ-БУЕР в ответ на переключение ОгЬ2-гзТа§11РР. (в) На графике показано относительное возрастание интенсивности флуоресценции ЕОРЯ-ЕУРР в ответ на переключение Grb2-rsTagRFP в нефлуоресцентное состояние в различное время до и после стимуляции ЕОР. Для расчета этих значений сравнивали интенсивность флуоресценции ЕСРЯ-ЕУРР за вычетом фона в избранных областях клеточной мембраны (время -2, 2 и 4 мин) или эндосом (время >4 мин) для пар изображений, полученных, когда rsTagRFP находился во флуоресцентном и нефлуоресцентном состоянии, (г) Псевдоцветные изображения флуоресценции ЕОРЯ-ЕУРР (верхний ряд: Grb2-rsTagRFP во флуоресцентном состоянии; нижний ряд: Grb2-rsTagRFP в нефлуоресцентном состоянии) до и после стимуляции ЕОР в нулевой момент времени.

Чтобы показать возможность применения pcFRET с rsTagRFP для детекции белок-белковых взаимодействий, мы использовали хорошо описанную в литературе модельную систему, в которой рецептор эпидермального ростового фактора EGFR (Epidermal Growth Factor Receptor) взаимодействует с белком, связывающим рецептор фактора роста Grb2 (Growth factor receptor-binding protein 2), при стимуляции клеток эпидермальным фактором роста EGF. В многочисленных экспериментах, в том числе и с применением FRET между флуоресцентными белками, ранее было показано, что после добавления в клеточную среду белка EGF активированный EGFR взаимодействует с Grb2 на плазматической мембране, а затем этот сигнальный комплекс подвергается эндоцитозу.

Мы экспрессировали химерные конструкты EGFR-EYFP и Grb2-rsTagRFP в клетках линии HeLa. Внутриклеточная локализация белков слияния в нестимулированных клетках была различной. В то время как сигнал EGFR-EYFP в основном был локализован на плазматической мембране, флуоресценция Grb2-rsTagRFP была распределена по всей клетке с некоторым накоплением в ядре (Рис. 10а). Добавление 100 нг/мл EGF в культуральную среду привело к быстрой (1-2 мин) транслокации Grb2-rsTagRFP и накоплению этого белка на плазматической мембране. Затем в течение 15-30 мин происходил эндоцитоз, EGFR-EYFP и Grb2-rsTagRFP оказались колокализованы на эндосомах. Эти наблюдения были полностью аналогичны тем, которые описаны для белков слияния EGFR и Grb2 с другими флуоресцентными белками, что свидетельствует об отсутствии негативного влияния rsTagRFP на функционирование белка Grb2.

Для визуализации pcFRET между EGFR-EYFP и Grb2-rsTagRFP были подобраны такие условия облучения, при которых не происходит заметного необратимого выцветания rsTagRFP во время циклов фотопереключения (Рис. 106). Как и предполагалось, фотопереключение Grb2-rsTagRFP не влияло на эмиссию EGFR-EYFP в отсутствие EGF (Рис. 10в,г), что подтверждает отсутствие взаимодействий между EGFR и Grb2 в нестимулированных клетках. После добавления EGF, фотопереключение Grb2-rsTagRFP привело к примерно 20% обратимому изменению флуоресценции EGFR-EYFP и на плазматической мембране, и на эндосомах, очевидно, вследствие взаимодействия EGFR и Grb2. Следует отметить, что использованные для фотоконверсии и детекции интенсивности синего и зеленого света оказались нетоксичными для живых клеток.

Таким образом, с помощью метода pcFRET нам удалось регистрировать взаимодействие EGFR и Grb2 в одной и той же клетке, до и после стимуляции. Не было обнаружено достоверной разницы между эффективностью pcFRET на плазматической мембране и эндосомах (Рис. 1 Ов). Также мы обнаружили, что

добавление EGF привело к максимальному значению эффективности FRET меньше чем за 2 минуты, и в течение последующих 30 минут существенные изменения эффективности отсутствовали (Рис. 10в,г). Наши данные свидетельствуют, что комплекс EGFR-Grb2 формируется на плазматической мембране в течение нескольких десятков секунд после стимуляции EGFR и далее сохраняется неизменным при эндоцитозе в течение последующих 30 мин.

Предложенный в данной работе метод pcFRET с желтым флуоресцентным белком EYFP в качестве донора и обратимо фотоактивируемым красным флуоресцентным белком rsTagRFP в качестве фотопереключаемого акцептора дает возможность простой и чувствительной детекции белок-белковых взаимодействий в живых клетках с использованием стандартных флуоресцентных или лазерных сканирующих конфокальных микроскопов. Метод позволяет измерять FRET много раз, что повышает точность детекции и позволяет проводить продолжительное наблюдение за индивидуальными клетками.

ВЫВОДЫ

1. Разработан метод мониторинга деградации целевых белков на уровне отдельных клеток в режиме реального времени, основанный на использовании необратимо фотоактивируемых флуоресцентных белков.

2. Получены обратимо фотоактивируемые варианты мономерного красного флуоресцентного белка TagRFP с различными механизмами фотоконверсии: изменением квантового выхода флуоресценции в случае белка КРР-НС, и изменением спектра поглощения при неизменном квантовом выходе флуоресценции в случае белка rsTagRFP. Показано, что аминокислотные позиции 148, 165 и 181 (нумерация относительно зеленого флуоресцентного белка ОРР) играют определяющую роль в проявлении свойств фотоактивируемости.

3. Предложен метод изучения взаимодействия целевых белков в живой клетке в режиме реального времени с использованием красного обратимо фотоактивируемого флуоресцентного белка rsTagRFP в качестве акцептора для резонансного переноса энергии, модулируемого светом.

Список работ, опубликованных по теме диссертации Статьи

1. Zhang L., Gurskaya N.G., Merzlyak Е.М., Staroverov D.B., Mudrik N.N., Samarkina O.N., Vinokurov L.M., Lukyanov S., Lukyanov K.A. Method for realtime monitoring of protein degradation at the single cell level. BioTechniques, 2007, 42, 446-450.

2. Чжан Jl., Гурская Н.Г., Копанцева Е.Е., Мудрик Н.Н., Вагнер Л.Л., Лукьянов К.А., Чудаков Д.М.. Выявление аминокислотных остатков, ответственных за способность к обратимой фотоконверсии мономерного красного флуоресцентного белка TagRFP. Биоорган, химия, 2010, 36, 192-198.

Тезисы докладов на конференциях

1. Gurskaya N., Zhang L., Lukyanov К. A method for real-time monitoring protein degradation at single cell level. EMBL Heidelberg, September 4-8 2006, с 80.

2. Zhang L. Gurskaya N.G., Kopanceva E.E. Lukyanov K.A. Reversibly photoconvertible monomeric red fluorescent protein. Международная научная конференция по биоорганической химии, биотехнологии и бионанотехнологии, посвященная 75-летию со дня рождения академика Ю. А. Овчинникова (Москва-Пущино, 2009) стр. 276.

Заказ№ 19-а/03/10 Подписано в печать 02.03.2010 Тираж 100 экз. Усл. п.л. 1

ООО "Цифровичок", тел. (495) 649-83-30 www.cfr.i~u; е-таН:info@cfr.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Чжан Лицзюань

Используемые сокращения.

I. ВВЕДЕНИЕ.

И. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

11.1. Фотоактивируемые флуоресцентные белки.

П.1.1. РА-СЕР.

П.1.2. РБ-СЕР.

П.1.3. РА-ш1*ЕР1.

П.1.4. РАтСЬеггу1, РАтСЬеггу2 и РАтСИеггуЗ.

П.1.5. ЮРТ1.

П.1.6. КвСЬеггу и геСИеггуКеу.

П.1.7. Бгопра.

П.1. 8. Мутантные варианты белка Бгопра.

II. 1.9. тТЕР0,7.

П.1.10. Кае(1е.

П.1.11. Kaede-пoдoбныe белки.

П.1.12. ЫвЕР.

11.1.13. Свойство фотопереключения красных флуоресцентных белков.

11.2 Флуоресцентная микроскопия со сверхвысоким разрешением.

П.2.1. Разрешающая способность микроскопа.

П.2.2. Лазерная сканирующая конфокальная микроскопия.

П.2.3. 4Р1 и 15М микроскопия.

П.2.4. 8ТЕР микроскопия.

П.2.5. ЫЕЭОЬЕТ.

IL2.6. Методы флуоресцентной микроскопии высокого разрешения на уровне одной молекулы.

11.2.7. PALM.

11.2.8. Многоцветное изображение с высоким разрешением.

II.3. Убиквитин - протеасомная система.

11.3.1. Система убиквитинирования.

11.3.2. Строение 268-протеасомы.

11.3.3. Регуляторные субкомплексы протеасомы.

11.3.4. Внутриклеточная локализация протеасом.

11.3.5. Сигналы деградации.

11.3.6. Методы определения времени полужизни белков in vivo.

П.4. Флуоресцентный резонансный перенос энергии.

П.4.1. Способы измерения FRET.

III. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

III.1. Оборудование.

111.2. Реактивы.

111.3. Использованные методы.

IV. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

IV. 1. Разработка метода мониторинга деградации целевых белков с использованием необратимо фотоактивируемых флуоресцентных белков.

IV. 1.1. Описание предлагаемого метода.

IV.1.2. Подбор условий для визуализации, фотопереключения и наблюдения за белком Dendra2 в клетках млекопитающих.

IV.1.3. Влияние PEST-мотивов и убиквитина на время жизни белка Dendra2 в клетке.

IV.1.4. Определение времени полужизни белка 1кВа при помощи Dendra2.

1У.2. Получение и использование мономерных обратимо фотоактивируемых красных флуоресцентных белков.

1У.2.1. Получение мономерного обратимо фотопереключаемого красного флуоресцентного белка КРР-НС.

1У.2.2. Спектральные свойства КГР-НС.

1У.2.3. Фотоконверсия КПР-НС в культуре клеток млекопитающих

1У.2.4. Получение обратимо фотопереключаемого красного флуоресцентного белка rsTagRFP.

1У.2.5. Характеристика выделенного rsTagRFP в растворе.

IV 2.6. Применение rsTagRFP для изучения белок-белковых взаимодействий в живой клетке.

V. ВЫВОДЫ.

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Чжан Лицзюань

V. выводы

1. Разработан метод мониторинга деградации целевых белков на уровне отдельных клеток в режиме реального времени, основанный на использовании необратимо фотоактивируемых флуоресцентных белков.

2. Получены обратимо фотоактивируемые варианты мономерного красного флуоресцентного белка TagRFP с различными механизмами фотоконверсии: изменением квантового выхода флуоресценции в случае белка КБР-НС, и изменением спектра поглощения при неизменном квантовом выходе флуоресценции в случае белка rsTagRFP. Показано, что аминокислотные позиции 148, 165 и 181 (нумерация относительно зеленого флуоресцентного белка ОБР) играют определяющую роль в проявлении свойств фотоактивируемости.

3. Предложен метод изучения взаимодействия целевых белков в живой клетке в режиме реального времени с использованием красного обратимо фотоактивируемого флуоресцентного белка rsTagRFP в качестве акцептора для резонансного переноса энергии, модулируемого светом.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Протеолиз является одним из существенных регуляторных механизмов в клетке. Время жизни многих белков может существенно меняться в зависимости от клеточного цикла или в ответ на внешний стимул. В настоящей работе разработан новый метод мониторинга времени жизни целевых белков в живой клетке в реальном времени с использованием ФАФ-белка Бепс1га2. Показано, что ФАФ-белок Оепс1га2 не влияет на время жизни целевого белка и способен к протеасомной деградации при слиянии Бепс1га2 с ранее описанными в литературе деградационными мотивами. В качестве модельной системы был выбран хорошо изученный белок 1кВа. Время полужизни 1кВа, определенное с помощью предложенного нами метода, совпало с данными, описанными в литературе и результатами, полученными классическим методом. Нам удалось показать существенное изменение скорости деградации 1кВа в одной и той же клетке до и после добавления форболового эфира. Получение таких данных при помощи классических методов определения времени полужизни белков является исключительно трудоемкой, а иногда и невозможной задачей. Таким образом, предложенный метод позволяет не только определять время полужизни белка, но и измерять скорость деградации целевого белка в различных условиях культивирования клеток в режиме реального времени на уровне отдельных клеток. Полученные нами результаты показывают, что предложенный метод удобен в применении и должен дополнить арсенал современных методов молекулярной и клеточной биологии.

В данной работе получены и охарактеризованы два обратимо фотоактивируемых флуоресцентных белка: КБР-НС и rsTagRFP с эмиссией в красной области спектра. Показана возможность прижизненного мечения клеток белком КБР-НС. Был получен белок rsTagRFP, у которого при фотопереключении изменяется спектр поглощения. Это уникальное свойство позволило использовать rsTagRFP в качестве модулируемого светом акцептора для резонансного переноса энергии в паре с ЕУБР. Использование такой РЯЕТ-пары дает возможность многократного определения белок-белковых взаимодействий в живых клетках при продолжительном наблюдении и/или при разных условиях культивирования клеток, поскольку не сопровождается необратимым обесцвечиванием флуорофора акцептора. С помощью предложенного метода удалось показать отсутствие и появление взаимодействия белков вгЬ2 и ЕОБЯ до и после стимуляции БОБ, соответственно.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Чжан Лицзюань, Москва

1. Ando R., Flors C., Mizuno H., Hofkens J. and Miyawaki A. (2007). Highlighted generation of fluorescence signals using simultaneous two-color irradiation on Dronpa mutants. Biophys J 92 (12), L97-99.

2. Ando R., Hama H., Yamamoto-Hino M., Mizuno H. and Miyawaki A. (2002). An optical marker based on the UV-induced green-to-red photoconversion of a fluorescent protein. Proc Natl Acad Sci U S A 99 (20), 12651-12656.

3. Andresen M., Stiel A. C., Trowitzsch S., Weber G., Eggeling C., Wahl M. C., Hell S. W. and Jakobs S. (2007). Structural basis for reversible photoswitching in Dronpa. Proc Natl Acad Sci U S A 104 (32), 13005-13009.

4. Asher G., Bercovich Z., Tsvetkov P., Shaul Y. and Kahana C. (2005). 20S proteasomal degradation of ornithine decarboxylase is regulated by NQOl. Mol Cell 17 (5), 645-655.

5. Belousov V. V., Fradkov A. F., Lukyanov K. A., Staroverov D. B., Shakhbazov K. S., Terskikh A. V. and Lukyanov S. (2006). Genetically encoded fluorescent indicator for intracellular hydrogen peroxide. Nat Methods 3 (4), 281-286.

6. Berntsson P. S., Aim K. and Oredsson S. M. (1999). Half-lives of ornithine decarboxylase and S-adenosylmethionine decarboxylase activities during the cell cycle of Chinese hamster ovary cells. Biochem Biophys Res Commun 263 (1), 13-16.

7. Bhat R. A., Lahaye T. and Panstruga R. (2006). The visible touch: in planta visualization of protein-protein interactions by fluorophore-based methods. Plant Methods 2 12.

8. Birbach A., Gold P., Binder B. R., Hofer E., de Martin R. and Schmid J. A. (2002). Signaling molecules of the NF-kappa B pathway shuttle constitutively between cytoplasm and nucleus. J Biol Chem 277(13), 10842-10851.

9. Bonifacino J. S. and Weissman A. M. (1998). Ubiquitin and the control of protein fate in the secretory and endocytic pathways. Annu Rev Cell Dev Biol 14 19-57.

10. Breitschopf K., Bengal E., Ziv T., Admon A. and Ciechanover A. (1998). A novel site for ubiquitination: the N-terminal residue, and not internal lysines of MyoD, is essential for conjugation and degradation of the protein. EMBO J 17 (20), 5964-5973.

11. Brodsky J. L. and McCracken A. A. (1999). ER protein quality control and proteasome-mediated protein degradation. Semin Cell Dev Biol 10 (5), 507-513.

12. Brooks P., Fuertes G., Murray R. Z., Bose S., Knecht E., Rechsteiner M. C., Hendil K. B., Tanaka K., Dyson J. and Rivett J. (2000). Subcellular localization of proteasomes and their regulatory complexes in mammalian cells. Biochem J 346 Pt 1 155-161.

13. Brown K., Gerstberger S., Carlson L., Franzoso G. and Siebenlist U. (1995). Control of I kappa B-alpha proteolysis by site-specific, signal-induced phosphorylation. Science 267 (5203), 1485-1488.

14. Chalfie M., Tu Y., Euskirchen G., Ward W. W. and Prasher D. C. (1994). Green fluorescent protein as a marker for gene expression. Science 263 (5148), 802-805.

15. Chudakov D. M., Belousov V. V., Zaraisky A. G., Novoselov V. V., Staroverov D. B., Zorov D. B., Lukyanov S. and Lukyanov K. A. (2003). Kindling fluorescent proteins for precise in vivo photolabeling. Nat Biotechnol 21 (2), 191-194.

16. Chudakov D. M., Feofanov A. V., Mudrik N. N., Lukyanov S. and Lukyanov K. A. (2003). Chromophore environment provides clue to "kindling fluorescent protein" riddle. J Biol Chem 278 (9), 7215-7219.

17. Chudakov D. M., Verkhusha V. V., Staroverov D. B., Souslova E. A., Lukyanov S. and Lukyanov K. A. (2004). Photoswitchable cyan fluorescent protein for protein tracking. Nat Biotechnol 22 (11), 1435-1439.

18. Ciechanover A., Breitschopf K., Hatoum O. A. and Bengal E. (1999). Degradation of MyoD by the ubiquitin pathway: regulation by specific DNA-binding and identification of a novel site for ubiquitination. Mol Biol Rep 26 (1-2), 59-64.

19. Corish P. and Tyler-Smith C. (1999). Attenuation of green fluorescent protein half-life in mammalian cells. Protein Eng 12 (12), 1035-1040.

20. Dantuma N. P., Lindsten K., Glas R., Jellne M. and Masucci M. G. (2000). Short-lived green fluorescent proteins for quantifying ubiquitin/proteasome-dependent proteolysis in living cells. Nat Biotechnol 18 (5), 538-543.

21. Day R. N. and Schaufele F. (2005). Imaging molecular interactions in living cells. Mol Endocrinol 19 (7), 1675-1686.

22. Dundr M., Hoffmann-Rohrer U., Hu Q., Grummt I., Rothblum L. I., Phair R. D. and Misteli T. (2002). A kinetic framework for a mammalian RNA polymerase in vivo. Science 298 (5598), 1623-1626.

23. Dunn G. A., Dobbie I. M., Monypenny J., Holt M. R. and Zicha D. (2002). Fluorescence localization after photobleaching (FLAP): a new method for studying protein dynamics in living cells. J Microsc 205 (Ptl), 109-112.

24. Dunn G. A., Holt M. R., Soong D. Y., Gray C. and Zicha D. (2004). Fluorescence localization after photobleaching (FLAP). Curr Protoc Cell Biol Chapter 21 Unit 21 22.

25. Fang S. and Weissman A. M. (2004). A field guide to ubiquitylation. Cell Mol Life Sci 61(13), 1546-1561.

26. Fehr M., Frommer W. B. and Lalonde S. (2002). Visualization of maltose uptake in living yeast cells by fluorescent nanosensors. Proc Natl Acad Sci U S A 99 (15), 9846-9851.

27. Flors C., Hotta J., Uji-i H., Dedecker P., Ando R., Mizuno H., Miyawaki A. and Hofkens J. (2007). A stroboscopic approach for fast photoactivation-localization microscopy with Dronpa mutants. J Am Chem Soc 129 (45), 13970-13977.

28. Gadella T. W., Jr., van der Krogt G. N. and Bisseling T. (1999). GFP-based FRET microscopy in living plant cells. Trends Plant Sci 4 (7), 287-291.

29. Ghoda L., Lin X. and Greene W. C. (1997). The 90-kDa ribosomal S6 kinase (pp90rsk) phosphorylates the N-terminal regulatory domain of IkappaBalpha and stimulates its degradation in vitro. J Biol Chem 272 (34), 21281-21288.

30. Gordon G. W., Beriy G., Liang X. H., Levine B. and Herman B. (1998). Quantitative fluorescence resonance energy transfer measurements using fluorescence microscopy. Biophys J 74 (5), 2702-2713.

31. Gray C. W., Slaughter C. A. and DeMartino G. N. (1994). PA28 activator protein forms regulatory caps on proteasome stacked rings. J Mol Biol 236 (1), 7-15.

32. Groll M., Ditzel L., Lowe J., Stock D., Bochtler M., Bartunik H. D. and Huber R. (1997). Structure of 20S proteasome from yeast at 2.4 A resolution. Nature 386 (6624), 463-471.

33. Gurskaya N. G., Fradkov A. F., Terskikh A., Matz M. V., Labas Y. A., Martynov V. I., Yanushevich Y. G., Lukyanov K. A. and Lukyanov S. A. (2001). GFP-like chromoproteins as a source of far-red fluorescent proteins. FEBS Lett 507 (1), 16-20.

34. Haas A. L. and Rose I. A. (1982). The mechanism of ubiquitin activating enzyme. A kinetic and equilibrium analysis. J Biol Chem 257 (17), 10329-10337.

35. Habuchi S., Ando R., Dedecker P., Verheijen W., Mizuno H., Miyawaki A. and Hofkens J. (2005). Reversible single-molecule photoswitching in the GFP-like fluorescent protein Dronpa. Proc Natl Acad Sci U S A 102 (27), 9511 -9516.

36. Habuchi S., Tsutsui H., Kochaniak A. B., Miyawaki A. and van Oijen A. M. (2008). mKikGR, a monomeric photoswitchable fluorescent protein. PLoS One 3(12), e3944.

37. Hatakeyama S., Yada M., Matsumoto M., Ishida N. and Nakayama K. I. (2001). U box proteins as a new family of ubiquitin-protein ligases. J Biol Chem 276 (35), 33111-33120.

38. Hayashi S., Murakami Y. and Matsufuji S. (1996). Ornithine decarboxylase antizyme: a novel type of regulatory protein. Trends Biochem Sci 21 (1), 27-30.

39. Hein B., Willig K. I. and Hell S. W. (2008). Stimulated emission depletion (STED) nanoscopy of a fluorescent protein-labeled organelle inside a living cell. Proc Natl Acad Sci U S A 105 (38), 1427114276.

40. Henderson J. N., Ai H. W., Campbell R. E. and Remington S. J. (2007). Structural basis for reversible photobleaching of a green fluorescent protein homologue. Proc Natl Acad Sci U S A 104 (16), 6672-6677.

41. Henkel T., Machleidt T., Alkalay I., Kronke M., Ben-Neriah Y. and Baeuerle P. A. (1993). Rapid proteolysis of I kappa B-alpha is necessary for activation of transcription factor NF-kappa B. Nature 365 (6442), 182-185.

42. Hershko A. and Ciechanover A. (1998). The ubiquitin system. Annu Rev Biochem 67 425-479.

43. Hershko A., Heller H., Elias S. and Ciechanover A. (1983). Components of ubiquitin-protein ligase system. Resolution, affinity purification, and role in protein breakdown. J Biol Chem 258 (13), 8206-8214.

44. Hicke L. (1999). Gettin' down with ubiquitin: turning off cell-surface receptors, transporters and channels. Trends Cell Biol 9 (3), 107-112.

45. Hink M. A., Bisselin T. and Visser A. J. (2002). Imaging protein-protein interactions in living cells. Plant Mol Biol 50 (6), 871-883.

46. Ho S. N., Hunt H. D., Horton R. M., Pullen J. K. and Pease L. R. (1989). Site-directed mutagenesis by overlap extension using the polymerase chain reaction. Gene 77 (1), 51-59.

47. Hofmann M., Eggeling C., Jakobs S. and Hell S. W. (2005). Breaking the diffraction barrier in fluorescence microscopy at low light intensities by using reversibly photoswitchable proteins. Proc Natl Acad Sci U S A 102 (49), 17565-17569.

48. Hoyt M. A. and Coffino P. (2004). Ubiquitin-free routes into the proteasome. Cell Mol Life Sci 61 (13), 1596-1600.

49. Huang B., Bates M. and Zhuang X. (2009). Super-resolution fluorescence microscopy. Annu Rev Biochem 78 993-1016.

50. Jiang X., Coffino P. and Li X. (2004). Development of a method for screening short-lived proteins using green fluorescent protein. Genome Biol 5 (10), R81.

51. Kim M. S., Kim Y. K„ Kim Y. S., Seong M., Choi J. K. and Baek K. H. (2005). Deubiquitinating enzyme USP36 contains the PEST motif and is polyubiquitinated. Biochem Biophys Res Commun 330 (3), 797-804.

52. Kisselev A. F. and Goldberg A. L. (2001). Proteasome inhibitors: from research tools to drug candidates. Chem Biol 8 (8), 739-758.

53. Kohler A., Cascio P., Leggett D. S., Woo K. M., Goldberg A. L. and Finley D. (2001). The axial channel of the proteasome core particle is gated by the Rpt2 ATPase and controls both substrate entry and product release. Mol Cell 7 (6), 1143-1152.

54. Kremers G. J., Hazelwood K. L., Murphy C. S., Davidson M. W. and Piston D. W. (2009). Photoconversion in orange and red fluorescent proteins. Nat Methods 6 (5), 355-358.

55. Kurucz E., Ando I., Sumegi M., Holzl H., Kapelari B., Baumeister W. and Udvardy A. (2002). Assembly of the Drosophila 26 S proteasome is accompanied by extensive subunit rearrangements. Biochem J 365 (Pt 2), 527-536.

56. Lam Y. A., Lawson T. G., Velayutham M., Zweier J. L. and Pickart C. M. (2002). A proteasomal ATPase subunit recognizes the polyubiquitin degradation signal. Nature 416 (6882), 763-767.

57. Leggett D. S., Hanna J., Borodovsky A., Crosas B., Schmidt M., Baker R. T., Walz T., Ploegh H. and Finley D. (2002). Multiple associated proteins regulate proteasome structure and function. Mol Cell 10 (3), 495-507.

58. Li X., Fang Y., Zhao X., Jiang X., Duong T. and Kain S. R. (1999). Characterization of NFkappaB activation by detection of green fluorescent protein-tagged IkappaB degradation in living cells. J Biol Chem 274 (30), 21244-21250.

59. Li X., Zhao X., Fang Y, Jiang X, Duong T., Fan C., Huang C. C. and Kain S. R. (1998). Generation of destabilized green fluorescent protein as a transcription reporter. J Biol Chem 273 (52), 34970-34975.

60. Lippincott-Schwartz J., Altan-Bonnet N. and Patterson G. H. (2003). Photobleaching and photoactivation: following protein dynamics in living cells. Nat Cell Biol Suppl S7-14.

61. Lippincott-Schwartz J., Snapp E. and Kenworthy A. (2001). Studying protein dynamics in living cells. Nat Rev Mol Cell Biol 2 (6), 444-456.

62. Lord J. M., Davey J., Frigerio L. and Roberts L. M. (2000). Endoplasmic reticulum-associated protein degradation. Semin Cell Dev Biol 11 (3), 159-164.

63. Lowe J., Stock D., Jap B., Zwickl P., Baumeister W. and Huber R. (1995). Crystal structure of the 20S proteasome from the archaeon T. acidophilum at 3.4 A resolution. Science 268 (5210), 533-539.

64. Lukyanov K. A., Chudakov D. M., Lukyanov S. and Verkhusha V. V. (2005). Innovation: Photoactivatable fluorescent proteins. Nat Rev Mol Cell Biol 6 (11), 885-891.

65. Mas P., Devlin P. F., Panda S. and Kay S. A. (2000). Functional interaction of phytochrome B and cryptochrome 2. Nature 408 (6809), 207-211.

66. McKinney S. A., Murphy C. S., Hazelwood K. L., Davidson M. W. and Looger L. L. (2009). A bright and photostable photoconvertible fluorescent protein. Nat Methods 6 (2), 131-133.

67. Mishto M., Santoro A., Bellavista E., Bonafe M., Monti D. and Franceschi C. (2003). Immunoproteasomes and immunosenescence. Ageing Res Rev 2 (4), 419-432.

68. Miyawaki A., Llopis J., Heim R, McCaffery J. M., Adams J. A., Ikura M. and Tsien R. Y. (1997). Fluorescent indicators for Ca2+ based on green fluorescent proteins and calmodulin. Nature 388 (6645), 882-887.

69. Mizuno H., Mai T. K, Tong K. I., Ando R, Furuta T., Ikura M. and Miyawaki A. (2003). Photo-induced peptide cleavage in the green-to-red conversion of a fluorescent protein. Mol Cell 12 (4), 10511058.

70. Murakami Y., Matsufuji S., Hayashi S., Tanahashi N. and Tanaka K. (2000). Degradation of ornithine decarboxylase by the 26S proteasome. Biochem Biophys Res Commun 267 (1), 1-6.

71. Nienhaus K, Nienhaus G. U., Wiedenmann J. and Nar H. (2005). Structural basis for photo-induced protein cleavage and green-to-red conversion of fluorescent protein EosFP. Proc Natl Acad Sci U S A 102 (26), 9156-9159.

72. Ortega J., Heymann J. B., Kajava A. V., Ustrell V., Rechsteiner M. and Steven A. C. (2005). The axial channel of the 20S proteasome opens upon binding of the PA200 activator. J Mol Biol 346 (5), 1221-1227.

73. Ozkaynak E., Finley D., Solomon M. J. and Varshavsky A. (1987). The yeast ubiquitin genes: a family of natural gene fusions. EMBO J 6 (5), 1429-1439.

74. Passmore L. A. and Barford D. (2004). Getting into position: the catalytic mechanisms of protein ubiquitylation. Biochem J 379 (Pt 3), 513-525.

75. Patterson G., Davidson M., Manley S. and Lippincott-Schwartz J. Superresolution Imaging using Single-Molecule Localization. Annu Rev Phys Chem

76. Patterson G. H. and Lippincott-Schwartz J. (2002). A photoactivatable GFP for selective photolabeling of proteins and cells. Science 297 (5588), 1873-1877.

77. Phair R. D. and Misteli T. (2001). Kinetic modelling approaches to in vivo imaging. Nat Rev Mol Cell Biol 2 (12), 898-907.

78. Pickart C. M. (2001). Mechanisms underlying ubiquitination. Annu Rev Biochem 70 503-533.

79. Pickart C. M. and Cohen R. E. (2004). Proteasomes and their kin: proteases in the machine age. Nat Rev Mol Cell Biol 5 (3), 177-187.

80. Prasher D. C., Eckenrode V. K., Ward W. W., Prendergast F. G. and Cormier M. J. (1992). Primary structure of the Aequorea victoria green-fluorescent protein. Gene 111 (2), 229-233.

81. Quillin M. L., Anstrom D. M., Shu X., O'Leaiy S., Kallio K., Chudakov D. M. and Remington S. J. (2005). Kindling fluorescent protein from Anemonia sulcata: dark-state structure at 1.38 A resolution. Biochemistry 44 (15), 5774-5787.

82. Rechsteiner M. and Rogers S. W. (1996). PEST sequences and regulation by proteolysis. Trends Biochem Sci 21 (7), 267-271.

83. Reinstein E., Scheffner M., Oren M., Ciechanover A. and Schwartz A. (2000). Degradation of the E7 human papillomavirus oncoprotein by the ubiquitin-proteasome system: targeting via ubiquitination of the N-terminal residue. Oncogene 19 (51), 5944-5950.

84. Rivett A. J., Palmer A. and Knecht E. (1992). Electron microscopic localization of the multicatalytic proteinase complex in rat liver and in cultured cells. J Histochem Cytochem 40 (8), 11651172.

85. Rogers S., Wells R. and Rechsteiner M. (1986). Amino acid sequences common to rapidly degraded proteins: the PEST hypothesis. Science 234 (4774), 364-368.

86. Sakaue-Sawano A., Kurokawa H., Morimura T., Hanyu A., Hama H., Osawa H., Kashiwagi S., Fukami K., Miyata T., Miyoshi H. et al. (2008). Visualizing spatiotemporal dynamics of multicellular cell-cycle progression. Cell 132 (3), 487-498.

87. Shah K., Gadella T. W, Jr., van Erp H., Hecht V. and de Vries S. C. (2001). Subcellular localization and oligomerization of the Arabidopsis thaliana somatic embryogenesis receptor kinase 1 protein. J Mol Biol 309 (3), 641-655.

88. Shaner N. C., Campbell R. E., Steinbach P. A., Giepmans B. N., Palmer A. E. and Tsien R. Y. (2004). Improved monomeric red, orange and yellow fluorescent proteins derived from Discosoma sp. red fluorescent protein. Nat Biotechnol 22 (12), 1567-1572.

89. Shaner N. C., Lin M. Z., McKeown M. R., Steinbach P. A., Hazelwood K. L., Davidson M. W. and Tsien R. Y. (2008). Improving the photostability of bright monomeric orange and red fluorescent proteins. Nat Methods 5 (6), 545-551.

90. Shaner N. C., Patterson G. H. and Davidson M. W. (2007). Advances in fluorescent protein technology. J Cell Sci 120 (Pt 24), 4247-4260.

91. Shimomura O., Johnson F. H. and Saiga Y. (1962). Extraction, purification and properties of aequorin, a bioluminescent protein from the luminous hydromedusan, Aequorea. J Cell Comp Physiol 59 223-239.

92. Sorkin A., McClure M., Huang F. and Carter R. (2000). Interaction of EGF receptor and grb2 in living cells visualized by fluorescence resonance energy transfer (FRET) microscopy. Curr Biol 10 (21), 1395-1398.

93. Spencer M. L., Theodosiou M. and Noonan D. J. (2004). NPDC-1, a novel regulator of neuronal proliferation, is degraded by the ubiquitin/proteasome system through a PEST degradation motif. J Biol Chem 279 (35), 37069-37078.

94. Spriet C., Trinel D., Riquet F., Vandenbunder B., Usson Y. and Heliot L. (2008). Enhanced FRET contrast in lifetime imaging. Cytometry A 73 (8), 745-753.

95. Subach F. V., Patterson G. H., Manley S., Gillette J. M., Lippincott-Schwartz J. and Verkhusha V. V. (2009). Photoactivatable mCherry for high-resolution two-color fluorescence microscopy. Nat Methods 6 (2), 153-159.

96. Toth C. and Coffino P. (1999). Regulated degradation of yeast ornithine decarboxylase. J Biol Chem 274 (36), 25921-25926.

97. Tretyakova Y. A., Pakhomov A. A. and Martynov V. I. (2007). Chromophore structure of the kindling fluorescent protein asFP595 from Anemonia sulcata. J Am Chem Soc 129 (25), 7748-7749.

98. Tsien R. Y. (1998). The green fluorescent protein. Annu Rev Biochem 67 509-544.

99. Tsutsui H., Karasawa S., Shimizu H., Nukina N. and Miyawaki A. (2005). Semi-rational engineering of a coral fluorescent protein into an efficient highlighter. EMBO Rep 6 (3), 233-238.

100. Tsutsui H., Shimizu H., Mizuno H., Nukina N., Furuta T. and Miyawaki A. (2009). The El mechanism in photo-induced beta-elimination reactions for green-to-red conversion of fluorescent proteins. Chem Biol 16 (11), 1140-1147.

101. Ustrell V., Hoffman L., Pratt G. and Rechsteiner M. (2002). PA200, a nuclear proteasome activator involved in DNA repair. EMBO J 21 (13), 3516-3525.

102. Varshavsky A. (2003). The N-end rule and regulation of apoptosis. Nat Cell Biol 5 (5), 373-376.

103. Varshavsky A. (2005). Regulated protein degradation. Trends Biochem Sci 30 (6), 283-286.

104. Verkhusha V. V. and Sorkin A. (2005). Conversion of the monomeric red fluorescent protein into a photoactivatable probe. Chem Biol 12 (3), 279-285.

105. Wang Y., Shyy J. Y. and Chien S. (2008). Fluorescence proteins, live-cell imaging, and mechanobiology: seeing is believing. Annu Rev Biomed Eng 10 1-38.

106. Weiss M. (2004). Challenges and artifacts in quantitative photobleaching experiments. Traffic 5 (9), 662-671.

107. Weissman A. M. (2001). Themes and variations on ubiquitylation. Nat Rev Mol Cell Biol 2 (3), 169-178.

108. Willoughby D. and Cooper D. M. (2008). Live-cell imaging of cAMP dynamics. Nat Methods 5 (1), 29-36.

109. Wilmann P. G., Turcic K., Battad J. M., Wilce M. C., Devenish R. J., Prescott M. and Rossjohn J. (2006). The 1.7 A crystal structure of Dronpa: a photoswitchable green fluorescent protein. J Mol Biol 364 (2), 213-224.

110. Wolf D. H. and Hilt W. (2004). The proteasome: a proteolytic nanomachine of cell regulation and waste disposal. Biochim Biophys Acta 1695 (1-3), 19-31.

111. Yamano H., Gannon J. and Hunt T. (1996). The role of proteolysis in cell cycle progression in Schizosaccharomyces pombe. EMBO J 15 (19), 5268-5279.

112. Yamazaki T., Zaal K., Hailey D., Presley J., Lippincott-Schwartz J. and Samelson L. E. (2002). Role of Grb2 in EGF-stimulated EGFR internalization. J Cell Sci 115 (Pt 9), 1791-1802.

113. Yang Y. (2003). Generation of major histocompatibility complex class I antigens. Microbes Infect 5 (1), 39-47.

114. Zaccolo M. (2004). Use of chimeric fluorescent proteins and fluorescence resonance energy transfer to monitor cellular responses. Circ Res 94 (7), 866-873.

115. Zacharias D. A., Violin J. D., Newton A. C. and Tsien R. Y. (2002). Partitioning of lipid-modifled monomeric GFPs into membrane microdomains of live cells. Science 296 (5569), 913-916.

116. Zhang M., MacDonald A. I., Hoyt M. A. and Coffino P. (2004). Proteasomes begin ornithine decarboxylase digestion at the С terminus. J Biol Chem 279 (20), 20959-20965.

117. Zhou P. (2004). Determining protein half-lives. Methods Mol Biol 284 67-77.

118. Абрамова Е.Б., Шарова Н.П., Карпов B.JI. (2002). Протеасома: разрушать, чтобы жить. Молекуляр. биология, т.36. № 5. с. 761-776.

119. Зубова Н.Н., Савицкий А.П (2005). Молекулярные клеточные сенсоры, созданные на основе цветных флуоресцентных белков. Сенсоры рН, ионов СГ, Са2+, Zn2+, Cu2+. Успехи биологической химии, т.45, с. 391-454.

120. Пахомов, Н. Мартынов, Гурская, Балашов, В. Мартынов (2004). Фотопревращение хромофора флуоресцентного белка из Dendronephthya sp. Биохимия, т. 69, с. 1108-1117.

121. Феофанов А. В. (2007). Спектральная лазерная сканирующая конфокальная микроскопия в биологических исследованиях. Успехи биологической химии, т. 47, с. 371^110.