Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

НАПРАВЛЕННОЕ ИЗМЕНЕНИЕ СПЕКТРАЛЬНЫХ СВОЙСТВ ФЛЮОРЕСЦЕНТНЫХ И ОКРАШЕННЫХ БЕЛКОВ ИЗ КОРАЛЛОВ.

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "НАПРАВЛЕННОЕ ИЗМЕНЕНИЕ СПЕКТРАЛЬНЫХ СВОЙСТВ ФЛЮОРЕСЦЕНТНЫХ И ОКРАШЕННЫХ БЕЛКОВ ИЗ КОРАЛЛОВ."

ззш

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ИНСТИТУТ БИООРГАНИЧЕСКОЙ ХИМИИ ИМ. М.М.ШЕМЯКИНА И Ю.А. ОВЧИННИКОВА

На правах рукописи

Булина Мария Евгеньевна

Направленное изменение спектральных свойств флюоресцентных и окрашенных белков из кораллов.

специальность — 03.00.03 — молекулярная биология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 2003

Работа выполнена в лаборатории генов регенерации Института биоорганичеекой химии им. М.М,Шемякина и ТО. А.Овчинникова РАН.

Научный руководитель:

кандидат биологических наук К. А. Лукьянов

Официальные оппоненты;

доктор биологических наук С, М. Леев

доктор биологических наук Г, В. Максимов

Ведущая организации;

Московский Госуларственный Университет км. М.В. Ломоносова. ИИИФХЕ им. А. Н. Белощекого

Зашита состоится 14 января 2003 г, в /¿/^члеов на заседании специализированного совета Д.002.01901 при Инслгтуте биоорганической химии им М.М. Шемякина и Ю.А, Овчинникова РАИ по адресу- 117997. ГСП-7, Москва. В-437, ул. Миклухо-Маклая. 16-10.

С диссергаиией можно ознакомится в бнбл^теке Инститл-га бчсюрганнческоА химии им, М.М. Шемякина и Ю.А. Овчиштиг^-^Ну ■ \ ■/.; •". Л.*^

Автореферат разослан '*" ^^ - '._ ■ *

Ученый секретарь спеит ■ —«6, -у., ' >. ' Ч

доктор химических наук*^' . |" ^.'. _ ; ■ 5 Г*-Л. Иесмсннпв

Актуальность проблемы

Пол плен не к молекулярной биологии С РР-подобных оелкоя стаю революционным нововведением СпоспГчюсть к а вто к атаа нтнчес к о й циклизации .хромофора. устойчивость к воздействиям срелы. нею кс ют ость для клеток, хорошие показатели яркости флюоресценции, наконец - прямая возможность получения химерных белков с СРР -дслакгг данный белок популярным орудием ял я исследований динамических клеточных процессов и перемещений отдельных молекул развития организмов и онкологических пропетой Современные метлы исследований, направленные на изучение многофакгорных процессов, часто используют ОРР в сочетании с другими маркерами пли несколько форм СРР. Развитие таких методов было бы невозможно, если бы невозможно было «нсиравигь» некоторые свойства ОРТ*. В то же время управлешге свойствами О Г Р и получение желаемых вариантов требует всестороннего изучения структурно-фуншнональньтх заиисн мосте й строения угон молекулы Интерес представляют основные закономерности зависимости цвета флюоресценции Редка от его первичной структуры.

Цель работы.

Целью данной работы было проведение исследования масштабов нзмигчнвостн флюоресцентных свойств бенкон разных групп » возможности различных переводов между группами флюоресцентных и окрашенных белков. Основной задачей являлось изучение плияния различные изменений первичной структуры белка на процесс форм пронация хромофора н ira изменение флюоресцентных свойств конкретного хромофора ноа влиянием аминокислотного о кружен ия.

( Тру к*ГурЯ рЯбОТЫ.

Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, результатов и их обсуждения и чкепepj lm с т а, !ьной части, а также выводов и списка литературы РаГч1та изложена на 0^стратша.х и содержит иллюстрации и $/ссылок на литературные источники

Шумная ношшта.

Проведено систематическое изучение зависимости флюорссиеит]и.гх свойств ряда белков от первичной структуры белка На основании полученных данньк сделаны выводы об обших закономерностях crpvKTjvpiiLi фч национальных взаимоотно лений в семействе GFP-подобных

' ЦНБ МСХА

белков Кириллов Впервые получены ланкис о переходе флквдрещентных белков в Heiji.iKXipccueiiTitoe г краше иное состояние. а также возможности перехода чел-ду гришамн зеленых it желты* флкшресиснтммх белков Выявлены основные аминокислотные ПОЛПЖХМН1Я, ! «и воля юн н ie и ¡менять к манто вый выход флюоресценции, «охчейетвуя непосредственно на хромофор чолекглы Практическая in ;i<tn чисть райптм

Па основании полученных данных предложен метол со мания ноевло - мономерной метки на Гчие гетрамepiiotuirx ся красных белков корачлои Лнрпбягшя работы

Основные материалы лнееертапип былн положены на международных конференциях 12-ый МежаунаролнмП Симпозиум «Bioluminescence & Chemilirmmescencc» (Великобритания, Кембридж, 2002 гол) на международных, школах «Monitoring Molecular interactions and Reactions ir: Living Cells» {Нидерланды. Вахенингеи. 2002 ron), «lipid Signalling and Membrane Traffic* (Италия. Сайга-M ар ня Нмбаро. 2005 год).

Публика ими.

По материалам диссертации «публиковано 3 оатьн.

Содержание рябогы.

Использование чстояов то.тнтионной генетики для поиска пошипи, плиикншп на флморсснснтные свойствя (>ГГ-11олоПиы\ Оелк-он.

Го мо. ю пи я между отдельными ир&лставшслячи в семействе ОГР-подобных белков достаточно ннчка и составляет. в срелнем. 25-35°« Консервативными. в основном, являются детален, огвет<л репные та формирование -цхстнчной структуры С>елкив, абсонотно копсерзатнвны ксго лишь менее Ш остатков в белках. состоящих 1в, прнб.ишггельно 250 ечинокнслот Таким обраюм опенка влияния отдельных аминокислотных полиций на флюоресцентные свойства белков представляется затруднительной

Мы предположили, что флюоресценция О К Г1 - подобных белков может быть функнионатьно значимым признаком В гаком с.п'час. методы ¡во.'ношгоннон генетики пригодны для поиска отдельных аминокислотных позиций. вовлеченных в формирование фенотипа - в нашем случае. предположительно. ф лнчхрееп е н п :ы\ сройстн

В отряде трерлмх кораллов (ЬскгасипЫ н:1 вестиы бедкн. принадлежащие к лвум из четырех 1 рупп > -оргеиен I Н1.|\ Оелноя 1 (' 'тс. подробно о способах систем агитации ОМ'- мо.'(с(чи.[\ белков ем. диссертационную работу) Нами был про ре лен анализ группы тенов. соотпетсгвующ!красным 11 зеленым (СРР) Г>слкам твердых кораллов, с целью

о пределен! I я степени консервативности аминокислотных гачожений на всей протяженности структуры белка Был сделан вывод о наличии аминокислотых нозиин!г подвергающихся по! о л тыльном у давлению (отношение значащих тамен к незначащим» 1> Было проверено моделирование расположении выявленные положений в третичной структуре СНР-поло(>цъп белков на примере белка ?снЬйП\ Ео зьшинство выявленных положений рас по та лены на внешней поверхности молекулы, причем на участках поверхности, не закрытых взаимодействую! ними суСч-с^ичнч.гип |фн образовании тстрамерных структур Мы исследоват возможность воздействия положительного отбора, влияющего на выявленный ряд аминокислотных положений, на возникновение новых цветных вариантов СЛТ-поаобных белков Действительно. если положительный отбор напраатен на возникновение как можно бот ы^ его количества разноцветных вариантов белка. то замены, внесенные в первичную структуру белка по выявленным потоженияч. должны вызвать почтение новьтх спектральных рарнзитов

Выявленные ам и (то кислотные положения были подвергнуто исчерпывающемуся сайт-направленному мутагенезу в красном белке ^сиЬКРР,

Рис. 1. ( /¡тнюресиенцин '".> 147 sctibRFP

Кылн no чены л.-iKHbiï по В различным положениям Чутапшые нарпдити белков но всем проверенным положениям не облалали заметным спектральным ра:шооР|">ячнеч. Максимумы фдкюрсспешши не менял» положение, изменения в соотношении ннтенснвчостсй краепои и челенон флк^ресчснппи Оылн no : i:i''i 11 c.;¡

Полученные л энные говорят о том, что наблюдаемое 1НОЛИ1ЦПОННОК л явление в группе СН'-полобних

Г>елкг>в не направлено на увеличение спсклралвного разнообразия, то есть. естественная тменчинослi (¡[Т-иолоГних Селков не н "правлена, но всей милимости па получение возможно Пол 1,1] rt г о числа цветных вариантов Пелков (.'леловатстьио. использованные мстолы чволкннюнно(! генетики. к сожалению, неприменимы к решению проблемы поиска аминокислотных остатков, отвечающих изменение окраски белка. Пространственное распределение ачиноки^тотны* остатков подвергающихся деЛстпшо но-ожительлоП селе к пи И, ь ¡чме кластера и:-, внешней сгоронс MiriOKV-:!.! GFP-n0.1oí>Hbix г\?.:!Ул;ч\ не л непосредственной Гиизости от хромофора. частапляет предположить сушеелювалие »"iiт.1 к-п■ oii поверхности лля вчанмолейгткпя с: клкимилиГн"' клеточными Гедками. либо с продуктами генов лрутт СТ-Р-подобних fie i ков. -Репрессируемых в тип же организме К сожллснию. о и: у perdu с данных о Гепка\. вз.>нмоленслву>опшх с GFP -подобными Грелками н

i к'оцолн'м in k'cu'-и г i н.| \ Г' р г ■ 'И и <M:ï\. не по í г> : ^ с i' 11 ронср'.г! ь ллниую IHHI'IC ¡\

Получение белков с измененными сиек1р;|л[.ными свойствами.

Осознав невозможность выяняеннч ачипо^нслотпых положений, влияющих на свойства флюореспешши бел кои кораллов, иск гочшельно m s:!ico с помощью методов >noT¡toi]noitiroii генетики, им обратили ci к 1шым подходам Во-первых. изучались нопоженяя, оказывающие влияние на свойства флюоресценции OFR Так. мутагене-* mi положениям 6? и 20} лег в основу по 1учепия многочисленных мутантов GFP. и были все основания предполагать рпаиость данных положений н для остальных ф.поореенентных: белков Во-вторых. изучались положения несущие различные остатки для разных цветовых групп Г>елков В-третьих, широко испои, юя ал си четод молекулярного моделирования с использованием известных кристаллических структур и первичных структур исследуемых белков ручалось в i ляпис отдельных имен в первичной структуре Оедков на положение максимумов флюоресценции (tiков. коэффициент жстипкинн хромофоров и кнантош.ш

PMVOJ (JvilOOpeCllíHllliH Г-СЛКОВ Móic-H.rjjj; ГчММ! №|Г>ИраЛИ<Ь С МкИЯ расчггоч, чтобы нэиГчмее пол ко i:poiiei(it> вклал ыюсичоП в перричтю сгр\кл>р\ Г>е.1ка имени

llüfiokue iitpcчсжду iuiih'iiinmii трчшдчн СП'-чои.г.чм\ (Víyikob. Keptvoi между i p> пчлчи желтых и клены\ флюмреснштшлх Оелкои.

[In coepcvemiuy нре^стзяле н ия \t -l upctobijc тр\тшы (¡НМюлоСишч Гчпкоя (золеные, м.име. крдшые флюоресцентные и цяетнпо ¡ie|ткч-реси;ншмс) соответствуют леленич» но раншч -шпач хрпчо^ероа оОгспечпвэкмиих <5';r:ocpecnemimo р онрелслсшюч диапазоне л.иш {-отн. Вопрос о возможное» и перехода мсжл\ см го рычи трчниачи Селит прелегатяогел налпич Очекнлно, что ítpn переходе oí белюп с Сч'лее ллииново.нювлй г|.лкlopcc!¡снимай к белкач с petite лит ¡оно л hopo tí лосгаючмо затронул, неси» лишь одни in аминокислотных оста i ко к роягсчепнмх в формирование чрелосо хргчг>фора Так. чшчле Чу-ГЛИИН KPJCJIIJK ClMbOB НрИВОЛЧ! К lljpUlieillllO (}'1>рЧ НрОВ^Н] (Я Красного XpOUOÍ'Op.T- к хромо;) цр f<,ni\3 остается на прочелугочной, -пеленой» стлиш созреганш. Гор.ило сложнее Fj.WFjrn. все аминокислот«. воклеченш-к- в .i,->ir«nmrc.it-fí\io кага-иличгскгк) стлкпо ири OfpaíORJHIIII .хрочо^орл

Ii лампой рлГчис ми. испольэул ерлнненпе перрнчных стр\кт\р близких гочолоюч. пока).!"и возможность перехода чежд; цветовыми ip>irti2xm желтых н -зеленых флюоресцентных белков Mu нр(1лечон.стрировд1Н вомсхлность изменения снсктра флюореспеннни белков в сторону \м,*шчения длины ролны чаксич^ча флюоресценции поергдетвоч ивелешт jiccmi.tvmix «"Отнщ чутаинП в Гиилайшгс о к рул спи; чрочо Jopa для белка гП'ЗОб В сллчгс ?ГРМ)6 в одном организме содержатся тени флюоресигтных С-оков равных wcjcn Зелений ("»слох 7KPJ06 на К7ес nioimricii СРОеч\ жслючу гочолоту Я'РЗЗК lis 31 кчннежкел^инлх 110»«¡иЛ- различающих /FI'?06 ti 1ГР53К, lo.mo восемь приходится ид внутренние (потруженние в тлоОулу) остатки '¡eiupe in них востчи пстаткор ipy¡imtp\wres в непосредственной близости от ачнпокиглопшх пояший 6ft и 67. формирующих \ромо}ч>р Ми прел положит л. что ipn in >гих остатков (позиции 63. 65 и 68) чогуг определен, различие цветов флюоресненнни ^И'^Об и rf'Pí.lS

Пошипи 65 ti 68 окружают xpow'opof'paí>h>uhiH гстероцнкл. Mu показати. что ллч появления желто ¡i флюоресценции р белке ?FP538 положение 6? лат amo бить злнчигч остатком лплта tlonyicmniii р«улыаг окатпея ¡кмжюашшч, поскольку л тин в тюч положении ис явт*с!ся уянкальинч ,111 ?П'53Л eu:e олин in itidecniWN iJi.TioopcciieimiiJx Рслм'й. anil;P4P6. махеич;^ снемрл >чнесчп ююрою лежит в ciiiis-icленой (4К6 им) области спсктрл- tiícer остаток I.w'jí . Остакж Л$р6В утткатеи дла /ГР53К (остальные jDPCCTiiiie iJ'-THXJpeciieiniific feiwt нес\л к но пожени и 6S (Чггагкн Л^п. Ser или Val) Зачеиа

7

приводит к лвумшкпвой форме v»inccin4iHO]i полосы с максимумами в teienori (50ft им) к желтой (537 им) областях спектра (I'm-. 2), Таким образом, остаток Л;.р6К и гГР53К важен, но не абсолютно необходим для проявления желтой флюоресценции Остаток 63 ткже находится достаточно ближо or \ромофоробра:)уюшей триады аминокислот Замены в данном положении могут способствовать устранению стерических эа! руд нений при

замыкании чроуофора

Нсцолъ-ця данные наблюдения мм превратили 1С лены fi гГР50о в желтый флуоресцентный белок Тройной мутант 7Н';(16-A63G/N65K/N*fi8D имеет желтую

фнооресненпит с максимумом спектра эмиссии при Î37 нм <Рнс. 2).

Рис. 2. (Л) Спектр нонЪ'.жОении ф. чооресиетяш и фтооресиении!' '>с.ч<>.\: мутанта zFPS3B-K6SM лселтосо бечка zFP53S te тошные линии) и нелепого ве чка zFP506 ии: If>) Спектр <Г>\ жосниу флюоресценции и флюоресценции

иьухивстного ч(утанпю zFP53$~DfiftS (B)Cnermp «oiôvracûeHUH флюоресценции и ф iHjopecueitumi желтого яарнанта :FP506-ЗС-,V65K'.\'6,4D /сплошные линии) -ieienoso '1 а и, иселг»п?о Сеяка zFP53X /серы? п/нии/

Переход между теленым н желтым флюоресцентным состоянием происходил скачкообразно. Таким обратом вероятно внедрение нескольких точечных чамен создает пред посылку для формирования хромофора с иной, отличной от исходной, структурой

Нтаммиыс перезолы между группами флюоресцентных и нефлюорсспентнм* белкой. Прекращение иефлюиресиенгных белков и флюоресцентные.

Нефлюореспентный цветной белок cisiiiCP) Hi морского анемона Апепюта sulcata

Cm.ii превраи1ен яо флюоресцентный красный (телок посредством введения единственной )амены A14BS. Нами была сделана попытка выявления лрутих позниий, вовпеченных в переход чеждх1 флюоресцентной н нефлюорсенентной формами белка

300 400 ÎOO 600 ТОО пт

Анализ аминокислотных остатков, расположенных вблизи хромофора.

На протяжении нескольких лет большинство работ по изменению спектральных свойств ОГР-полобных белков ставило целью добиться смешения максимума флюоресценции белка, а не изменения квантового выхода. Нам же требуется выявить закономерности отличий между группами флюоресцентных к окрашенных белков. Наиболее удобной моделью для изучения таких закономерностей является белок акиЮР. Уникальность а$и1СР заключается в том, что данный белок занимает по свойствам промежуточное положение между группами флюоресцентных и окрашенных белков. Изначально низкий квантовый выл од флюоресценции его увеличивается в десятки раз при продолжительном облучении белка светом определенной длины волны. Для а$и)СР активирующим светоч является зеленый. Так как подобное увеличение в ликом белке обратимо - в синеч свете квантовый выход надает -приходится говорить о некоеалентных изменениях в структуре белка.

Если рассмотреть аминокислотные остатки, занимающие 148 положение в флюоресцентных и цветных белках, оказывается, что для двух групп белков они будут различными. Во флюоресцентных белках 14К положение занято полярными аминокислотными остатками, в время как в цветных белках, не способных к флюоресценции, в данном положении встречаются атифатические аминокислотные остатки (Тяблипа 1).

Таблица 1. Сравнение аминокислот, расположенных вблизи хромофора в определенных положениях хромо и флюоресцентных белков.

I4S 1165 203

FPi Ser, His lie. Val, Phe Hís, Ser, Thr

C'Pi Cys, Ala, Asn ¡Asn, Ser I.eu, lie, His, Are

Согласно кристаллическим структурам ОП* и DsRcd. остаток 14RA находится в непосредственной близости от тирозинового остатка хромофора. Логично предположить по аналогии с GFP, что полярные остатки в непосредственной близости от хромофора «огут поляризовать гндроксил тирозина хромофора, увеличивая подвижность Э1ектронов сопряженной п-системы.

Дтя проверки „чанного суждения был проведен исчерпывающий мутагенез белка asulCP по 14В положению. По результатам анализа 50 рекомбинантных клопов было показано, что юлько замена A148S приводит к появлению ^утантнего флюоресцентного белка с более кысоким квантовым выходом флюоресценции. Наоборот, мутанты, несушис Ala. Cys, Asn и G)y н 14К положении отличались высоким коэфиннеигом экстинкпии, но обладали слабой

флкюресисниией. Остальные замены окажись недопустимыми и нарушали созревание белка. Б природных бедках в 14S положении также встречаются лишь 5 аминокислотных остатков, обнаруженных в мутантах. Мутация A !4SS характеризуется сохранением размера лмннокнслотного остатка, и наличием полярного гидрокснла. Следует предположить, что остальные полярные аминокислоты окапались не представленными в конечной выборке мутантов в сил; того, что размер остатка нарушал правильное созревание белка. Таким образом, было показано, что полярность аминокислотного остатка, прилегающего к тирозину .хромофора обуспаняииает увеличение квантового выхода флюоресценции. Следует

предположить, что замена других тесно прилегающих к хромофору остатков также должна сказаться на флюоресцентных свойствах полученного белка. Так, среди остатков .хромофорного окружения остатки в положении 165 различаются в группах окрашенных и флюоресцентных белков. De, Val и Phe встречаются в флюоресцентных белках, в vo время как Asn н Ser присутствуют в окрашенных. ¡Зиелренне мутации S165V в первичную структуру белка asulCI* привело к получению флюоресцентного мутанта с измененными, по сравнению с диким типом, спектрами флюоресценции и абсорбции (Рис, .1). Интересно, что замена привела к появлению у мутантного белка дополнительного пика абсорбции в районе 390км. Возбуждение *>1т>го дополнительного пика нриволит к появлению очень слабого (в 10 раз слабее основного) пика енней флюоресценции в области -)й5 км.

Рис. J. Спектры поглощения. ! 'r'/íivn I, флюоресценции с' ïs,' <j/:¡í.) 1

мутантам Úeixc <t^u:CP. jl.l* ко&с<)о?о .wWiftuma укаъан спектр поглощения (сплошная черна»

iH'iiífil. «"уй'ГЗЧг'О'ип (пункмир? н <?' i*'*"/1'-a/' Hi;i;u /'серая стошноя "uhuxí,

A. a$u!CP-S¡65V Синая флюоресиенуия ч 10pal слабее красной, R. asu!CP-S165A. С wwtCP-

S¡6iC D. uíu/CP-S 165ТЗс7еиля флюоресценция я 2 раза сильнее красной.

Положение 165 было также подвергнуто нечерпьн^аюшему мутагенезу, который показал, что

имена S165V велет к образованию самого яркого из возможных флюоресцентных мутантов.

Допустимыми аминокислотными остатками также являются А!з, Cys и Thr. но квантовый выт! флюоресценции для таких мутантов гораздо ниже, чем для S165V. Для мутантов ik> 16; положению характерно несовпадение формы пиков поглощения н возбуждения. Вероятно, уго связано с сосуществованием нескольких конечны* продуктов созревания хромофоров мутзнтных белков.

Поиск- дополнительных аминокислотных позиций, нзигниншнх кпиггоеыА выпад флнюреспешши.

Для выявления дополнительных аминокислотных положений, влияющих на каповый выход флюоресценции, был проведен мутагенез нелого гена хромобелка asulCP. Условия проведения опыта были подобраны так. чтобы в среднем па каждую молекулу белка приходилось I - 2 случайные мутации. Среди проанализированных 5000 клонов были выявлены всего несколько ч\тэнтов, обладающих слабой флюоресценцией: S6SG. I72N, Ü176R/K219I. H203R, H203Q, Q220L. Также был обнаружен мутант A14RS, заметно превосходящий остальные по своим флюоресцентным свойствам Важно отметить, что были найдены сразу 2 клона, несущие замены в 203 положении Так как квантовый выход флюоресценции всех мутантов, за исключением »шестого A148S, был заметно ниже, чем у ранее опнеаных. нельзя утверждать, что обнаруженные новые позиции шрают значительную роль о изменении состояния бедка во флюорсспагшое, Вместе с тем, полученный результат указывает на ранее известные положения (68, 14fs, 203) как на основные, определяющие интенсивность флюоресценции белка. Ограничение числа положений, влияюших на интенсивность флюоресценции, нозпотяет более детально исследовать ключевые позиции при попытках изменения квзктооою выхода флюоресценции.

Превращение флюоресцентных белков в нефлюоресиеитные.

В связи с получением флюоресцентных мутантов нсфлюорссиентных белков возникает вопрос о возможности обратного перехода. Нами было осуществлено превращение флюоресцентного белка DsRcd в цветной нефл юорсиектиий белок.

\lyrai tKc3 DsRed.

На основании данных, полученных прн превращении нефякюресиентных белков в флюоресцентные. и анализа окружения хромофора, была предпринята попытка превратить один ш самых ярких известных флюоресцентных белков - PsRed - в хромобелок. Так как наиболее выраженной флюоресценцией в предыдущих опытах с изменением квантового выхода флкюресиеннин об чад ал мутант цвет-ного белка с заменой в 148 положении, было

решено внести мутацию 5J48A в первичную структуру мутанта DsRcd. Неожиданным образом, данная замена снизила квантовый выход флюоресценции белка DsRed всего лишь в 1.5 раза по сравнению с исходным вариантом (Таблиц» 2). Далее в мутантный белок были привнесены дополнительные замены I16SS. К167М, S203A в различных сочетаниях. Мутация по 167 положению была добавлена ввиду близости остатка в этом положении к тирозину хромофора по данным рснтгсноструктурного анализа. Так как Lvsl67 является Заряженным остатком, он должен стабилизировать ионизованную форму хромофора DsHed как и в случае с остатком 14SS.

В гаГчинс 2 приведены данные по квантовому выходу и коэффициенту -жстинкиии для различных сочетаний мутаций, введенных в первичную последовательность DsRed, Наиболее важным оказался факт постепенного снижения величины квантового выхода флюоресценции при добавлении каждой еле л употей мутации. Интересно, что оказалось возможным дополнительно еннзигь ква1гтоиый выход флюоресценции Редка посредством введении дополнительных замен в положении 148 и!65. Для получения хром оСелка были использованы амииокислоты, наряд}' с Ser встречающиеся в положениях в природных хромобелках. Конечный муганг. названный DsRedNK (от Non-Ruorescent) S14КСЛ165Ы/К167M/S203Л обладал свойствами, неотжгчимымн от свойств природных хромобелков. то есть обладал заметной способностью к поглощению видимого света и низким квантовым выходом флюоресценции (Гайлимя 2).

Таблица 2. Свойства мутантных вариантов белка DsRett.

Ф С1 Ч'*Т И IT Максимум Маисичум Коэффициент CMfflflKMii

фтюоресивнин [С МЛ01

флюорездяекинн fi'MJ (w)

Длкий тип 55* Í85 75,000 0.70

¡.НЙА ÍM 591 7J,(XW 04í

S20M W 5U 74.OU0 0.70

si д^д, szaiA 574 541 73,(WU

572 505 SO,OW> 0.22

SMü/t,KlfWM,S203A i'M J4f> 104,000 o.ov

514»Л. Ш55, S20M JM 545 ьн.ооа OOft

SMSA.IIMS. K.16JM, S203A Í52 54) 77.0W OMP

SMKC.llftíN.SIOJA 574 J4I »ü.wo 0004

S14M', [IMN. K1MM, WQ3A ÍM MU 57,000 «v 0001

Таким обратом. хотя, зная первичную структур} белка и нельзя сулить о величине квантового выхода флюоресценции. можно предположить, что по набору аминокислот, занимающих выявленные ключевые положения в белке, можно определить степень проявления флюоресиеггтных свойств белка и сделать предположен us о возможности изменения его флюоресцентных свойств в соответствии с требованиями, налагаемыми условиями эксперимента. В самом деле, в поставленном опыте вклад каждой из привнесенных замен в уменьшение квантового выхода флн>оресисниии соответствовал порядку внесения мутаций. Так. квантовый выход флюоресценции мутанта S20JA был таким же. что н у природного белка. Внедрение той же мутации » вариант белка, уже несущий замену S14PA приводил к снижению квантового выхода в полтора рала по сравнению с исходным белком. Добавление замены S203A к мутанту S14RA;K i<S7M снижает квантовый выход уже в 2.4 рала. Подобным образом, замена К167М велег к 2-, 3.2- или К 6-кратному снижению квантового выхода, когда мутация внедряется как вторая, третья либо четвертая по порядку замена в белке. Также, добавление мутации 11655 к вариантам Si4HA/S203A и S14KA/K.I67M.'S2f>3A приводит к 4 Я- и 12.9- кратному снижению квантового выхода соответственно. Можно было бы предположить, что при появлении кажлой следующей мутанин в окружении хромофора образование хромофора идет по новому пути, в результате чего спектральные свойства белков различаются между собой. Однако гораздо более вероятной представляется гипотеза о влиянии окружения хромофора на спектральные свойства флюоресценции В таком случае каждый из остатков, положительно влияющий на увеличение квантового выхода, должен становиться все более важным с уменьшением числа •то, остатков в белке.

Наиболее подробного внимания заслуживает вклад замены II&5N в изменения спектральных свойств белка. Это замена алифатической аминокислота на полярную, 'по, казалось бы должно производить действие обратное наблюдаемому. то есть увеличивать квантовый выход флюоресценции в соответствии с рассуждением о поляризации хромофора. Внедряя данную замену в первичную структуру белка, мы исходили нз следующих соображений. Известно, что ОРР-нолооные хромофоры очень слабо флюоресцентны в растворах, так как обладают способностью к иис-транс июмеризапии Представляется вероятным, что. пребывая в тесном котгтакте с рядом аминокислотных остатков, хромофоры О KP-подобных белков оказываются стабилизированы в одной из конформацнй. По видимому, ослабление контактов за счет появления полостей внутри молекулы при замене крупных остатков более маленькими ведет к увеличению подвижности хромофора за счет нис-гранс изомеризации. Моделирование пзанмного расположения хромофора н остатка 1651.N показывает

следующее. Исходно в природном варианте Редка хромофор ПяЙЫ оказывается плотно зафиксированным в цие положении за счет остатка Ле)б5. При замене на А5Л165 образуется полость, позволяющая тирозин) хромофора изомеризоеаггься. Возможно, именно размер остатка, а не юмененне заряда и играет решающую роль в изменении спектральных свойств белка так как серии и аспарагнн оказывают сходное действие на снижение квантового выхода флюоресценции в положении Не 165.

В последние несколько месяцев каша гипотеза о возможной изомеризации хромофоров ОРР-полобных подучила веское подтверждение. Недавние публикаш« описывают кристаллические структуры двух белков - еяГРбП и №т$5. Пелкн. обладая ныраженой гомологией с группой цветных белков семейства, имеют различный флюореспентный статус. В то время как квантовый выход флюоресценции белка ес^Рб! I приближается к таковому для Г>$К«1, (итб? является типичным хромобелком. Хромофоробразуюшие остатки обоих белков позиционированы необычно. В от-точие от Г>5ЙеД ароматический о станок хромофоров прибывает в 1ранс - конформации, причем цланариость хромофора белка Штаб нарушена поворотом на 43" по отношению к плоскости гетсроликда. Представляется вероятным, что многие цветные белки имеют организацию хромофора, сходную с Таким образом, группы красных и цветных белков являются носителями очень сходных хромофорных структур, и способность белков к флюоресценции определяется почти исключительно кенггекстом хромофорного окружения. Легкость перехода между группами красных и цветных белков заставляет по-иному взглянуть на классификацию белков -гомологов ОКР. 1а ключей не.

На основе опытов по направленному изменению флюоресцентных свойств белков -гомологов ОРТ можно сделать следующие выводы. Во-первых, не только известный из литературных источников остаток Агд96, но и все йлнжайшее аминокислотное окружение хромофора оказывает значительное ачияние на каталитическую стадию образования хромофора, и. кроме того, отвечает за позиционирование хромофора внутри молекулы белка В свою очередь, расположение хромофора в белке напрямую связано с интенсивностью флюоресценции, проявляемой белком. Точечные .замены, внесенные в ближайшее окружение хромофора, помогают изменить конформашпо хромофора и. таким образом, сказываются на степени проявленности флюоресцентных свойств белков Так, несколько точечных замен, внесенных в первичную структуру зеленого белка гоапОРР, позволяют осуществить расширение сопряженной п-системы и, по-видимому, приводят к образованию более протяженного хромофора. С другой стороны, небольшое число внедренных замен способно вызвать изомеризацию хромофора в белке 0$Ле<3. Колмиую роль в определении положения

14

ОзКЫ - образного хромофора белка играет степень полярности остатков ближайшего окружения. Кроме того, уменьшение размеров некоторых остатков, ориентированных внутрь глобулы, также способствует увеличению поднияеност и изомеризации хромофора. Во-вторых, наиболее выраженное влияние на флюореспеотные свойства белков оказывают те аминокислотные остатки окружения хромофора, которые находятся в непосредственном контакте с ароматическим хромофоробразуюшим остатком белка. При создании новых флюоресцентных белков на основе су [пестующих первичных структур основное влияние следует уделять остаткам, )аннмаюшим положения 65.68. 148. 165. 167,203. Наконец, мы показали, что уменьшение подяризоваиности остатков чрочо>]юрного окружения ведет к увеличению длин волн флюоресненпки К пример}, замена любого полярного осгатка в окружении хромофора №Кес1 на алифатический ведет к сходным изменениям спектральных свойств мутантных вариантов {Таблица 2).

Метод гстероплш нмерных мел ок.

Предпосылки созданию чего л а гетсроолнюмерных меток. Обща и схема метола гетероолкгочернык четок.

На протяжении последних нескольких дет были предприняты определенные усилия для создания красной фдюореспснтпой метки па базе ОП'-нолобнык белков, применимой для мечения отдельных клеточных белков. Решение такой проблемы должно заключаться как в получении отдельных красных маркеров, гак и, желательно, п понимании процессов ведущих к олнгочеризапии и системном метоле, применимом к произвольному флюнреспе»ггночу белку, нуждающемуся в моиомернзации.

Явление образования крупных агрсгапш в клетках, трансфеипрованных химерными белками, включающими флюоресцентные белки кораллов, мы объяснили следующим образом. Химерный белок, состоящий из фчюорееиентного Оеяка (ФК) и целевого белка (ЦБ), имеет места связывания как для для субьедитш ФВ. так и ЦВ, если тот способен к олигомеризаннн. Неупорядоченное образование таких связей и насыщение их ведет к образованию трехмерной сети, вовлекающей большое количество белковых субъелиниц и нарушению правильной структуризации целевого белка.

Создание мономеров красных белков сопряжено с внсоеннем многочисленных мутанип в первичную структуру белка и. па данный момент, существует единственный мономерный красный белок. гг.КГР. Проанализировав опыт предыдущих исследователей, мы предложили свой метод. позволяющий сослать псенломономерную метку для любого

тетрамеризуюшегося флуоресцентного белка. Метол базируется на использовании способности белков к тетрамеризаюш, а не на преодолении склонности к ней. Основной стратегический ход. помогающий преодолеть получить псевдо - мономерную метку, заключается в идее маскировки точек связывания для ОРР -подобных белков в химерных белках, В клетке, содержащей химерный белок, нужно ■жспрессировать избыточное количество несвязанного с целевым ОРР-подобного белка - помощника. Для того, чтобы успешно применить такой вариант метола, нужно преодолеть лишь одну сложность- будучи представленным в клетке в избыточных количествах, свободный ОГР-подобный белок будет создавать флюоресцентный фон. затрудняющий определение точного положения целевого белка. Таким образом, необходимо создать такой О РР-по лобный белок, который, сохраняя способность к тетрзмернзацни. не обладая бы флюоресцентными свойствами.

И <щщ. lHHwilW №BS '* ш

т»т*п» i и, 4 и

о°о

/

П< •»•» hli №.|И||И|Ц м*п

Рис. 4. Схема прелюгагмого метода союания псевдомономерной метки с verton ?о*ание.н тетрамерных флюоресцентных белкоя. Наличие к среде свободною неф?юоресиентно?о белка - помощника препятствует образованию ризветлгемыых трехмерных струкпгур

Получение нефлюортгпентного варианта флюореспе1Пного белка.

Флюоресцентным белком. использованном в опыте, стал мутант M355NA, Нефлк>оресие1гшым белком-помоншиком. па первый взгляд, мог бы стать исходный природный белок asulCP, Однако, учитывая способность asulCP к фсггоконверсин (см, выше), было решено создать на его основе ряд нефлюоресцентны к мутантов. Выли созданы два нефяюоресиентных мутанта, названные asutCP-NFl и asulCP-NF2(ot ehroinoprotein и воп-fluorescenl). Мутант asu!CP-NFl содержал замену Y66C. непосредственно нарушающую структуру хромофора. Таким образом, он не был способен ни к поглощению света, ни к флюоресценции. Основной заменой, определяющей свойства бедка для Myraitte asu1CP-NF2 стала замена А148С, полностью нарушающая способность белка к фогоконверсии. Вариант А148С обладал высоким коэффициентом экепшкции и крайне низким квантовым выходом флюоресценции, то егть проявлял свойства типичного хрочобелка. Кроме мутаций,

изменяющих флюоресцентные спой слеш. аяЫСР-МП и а$о1СР -ЫР2 содержали также чамены К6Т и К ТЕ. ггрелотврашагошие неспец нфическую агрегацию белков,

Мечеиие бета-актина.

Функциональный человеческий бета-актин представляет собой в ысокополн мерный цито плазматический белок, составляющий большую часть от суммы всех белков, акхпресснруемых фибробластами. В силу своей высокой способности к полнмериэашш бета-актин являлся удачным модельным белком для ргаших чкснсриментов. так как малейшая склонность к полимеризации беяка-метки должна была необходимо отразиться на распределении целевого белка п клетке. Регулярные структуры, образуемые актииовымн полимерными нитями в фиброб.застзх. удобны для наблюдения, так как легко позволяют выявить нарушения натнвны\ свойств белка.

Фу < гкииональпый. коммерчески-доступный химерный белок ВОР Р-актин исипльзовачея лля выявления распределения актннонмх филаментов в клетке. Одновременная трансформация клеток !1лазмидами, жслресенруюшими как ЁОРР-актип, так и .химерный белок М355ЫЛ-актпи. позволила фавнить распил ело те акти новых филаментов. меченных обоими белками. Таким образом, любые нарушения структуры актиноиых филаментов сразу же могли быть выявлены.

По условиям зкеиернмета. пефлрооресиентиый белок должен быть представлен в клетке п значительном избытке но сравнению с нелепым. Чтобы определить необходимый избыток иефлюореспентных мутантов. аадЮР-МР] и а$и!СР-МР2-кодирующие плазм иды добавлялись к трансфекшюнной смеси в разных соотношениях Н серии опытов отношение аяи!СР-М11 и аки1СР-МР2 к целевому белкл. сшигочу с МЗ?5МЛ. оставляло 3:1. 10:1 и 50:1. Количество плаз милы, кодирующей М355^Л-актнн. оставалось постоянным на протяжении всей серии опытов '>го необходимое лребоваиие. так как ири значительном уменьшении количеслш химерного белка появляется пероятность компенсации отрицательного воздействия теграмеризаиин флюоресцентной метки за счез блокирования образования трехмерной агрегации иной структуры посредством взаичоиенегвия с избытком клеточного актина

EGFP

M355NA

'IVAÍ "-'i,' ШШШш »sp

тт рг V-'« ЩРШШ Á.4Í4'. .. L- tu'', . .■:■■

У1.-. •• ppVC Щ&ШШ

&¡M mm?'

УдМ

тШШш

3:1

10:1

50:1

10:1

Гис. 5 Meícu 1пгроо.]Н11)чгрим« мпок.

Первый столбец ~ хпоОражение в зеленом тчаи. второй - в краеноч СОоку

y*aiíi~io соотношение таит ó при

mpaníifieKwu Л - Г, Меченне (1-актнна в фнбробластах человека Прелсзалтены различные соотношения флюорссиешиого Гчхтка. сшитою с Р-ata ином, и белка -лочошнка.. Aiperarni*. заметно» n »е.тепом канале из первой горизонта-ТН рисунков -красная флюоресценция, но )бужлзечая сипим спетом и заметная н!-за очень высокой локальной конненГранин белка Д - Г. Мечен не т> Галин - евчзямюшего белка Taui4. НС - 3. Использование Оннистрошгого ректора в мезоне гетсроолxrovtrp них меюк. При использовании вектора, не солер¡кашею белка - помощника, наблюдается агрегация красною сигнала (верхняя горизонталь) При лоб.зялгиии гена, кодирующего белок - помощник, в та>чилу н нослелукнней трансформации лгиной конструкцией <{ ибробласток илблмластм совпадение распределения зеленого и красного флюореспетнм* сигналов в клетке.

Контрольный опыт, в котором фибробласты 1рансформ кропались только плаз мидам и. кодирующими М355МА-актин и HGFP-актнн, показали, что химерный белок вызывает сильную агрегацию в цитоплазме фиброблаегов линии L429. Добавление избытка пдазмиды. кодирующей asu!CP-NFl, к трансфекцнонной смеси вело к выравниванию распределения «зеленых» и «красных» актиновы\ филамснтов. пропорциональном) количеству добавлетгого asu)CP-NFl. Выводы были сделаны на основе сравнения фотографий Применение 50-кратного избытка пллзмнды. колируюшей asulCP-NR привело к получению тождественных снимков в красном и зеленом фильтрах. Одинаково пыпгшвло распределение актина в фнбриллач. клеточном кортексе и отростках клеток. В контрольных экспериментах. где вместо нлазчилы, зкспрессируюшсй asulCP-NFl. добавлялась гшазмида. несущая неродственный GFP-полобный белок (fKIFP либо зеленый мутант белка DsR&i -AG4) улучшения распределения не наблюдаюсь.

Добавление другого белка-помои шика- asiiiCP-NF2 к зкспрссснонной системе M355NA-акзнн обладало сходным действием па распределение меченого актина в клетке. Однако, при работе с asiilCP-NFI был выявлен один недостаток системы - в присутствии asu1CP-NF2 яркость флюоресцентного сигнала была в 2-3 раза ниже, чем при использовании asulCI'-NFt.

Хярастеризации гезеропл и гом еров In vitro.

Труднообъяснимая разница в и н ген сини остях флюоресценции меченых бел кия н присутствии asulCP -NF1 и asulCP -NF2 натолкнула нас на мысль исследовать свойства гстероолигомеров. образующихся в клегках мчекопитаюшихся, in vitro. Для создания свободных гегероолигочероп была создана конструкция, содержащая белок M355NA. несуший 6-ти гнетидиновмй довесок на N-койне белка. Клеткн трансфепировались плазмп пой, содержащей вышеописанную конструкцию, либо смесью нлапмпа, несущих 6-His-M355NA и asulCP -NF1 либо asutCP -MF2 в 50-крагиом избытке. Ilo со!реванни белка 6-His.-M355NA и гетцнч1лигомеры 10 К несущие смесь белков fi-Mis-M355NA и asulCP -NF!) и Г02 (6-Mis-VI3i5NA с astilCP -NF2) быгтп выделены с помощью кобальт - содержащей смолы из соответствующих клеточных днзатов ¡¿ыто выделено приблизительно равное количество всех трех белков

Для сравнения интенсивности флюоресценции 6-His-M155N/V Г(Н и Г(>2, образны выравнивались но поглощению на длине водим 540 им Флюоресценция также возбуждалась свепом 540нм К нашему удивлению, яркость флюоресценции ГО) была наибольшей. 6-His-M355NA м Г02 были соответственно в 2 4 и 10 2 раза более тусклыми. Кривые абсорбции и коэффициенты мкетиикнни для бел кои М155МЛ и asnlCP-NF2. выделенных нз Е.счИ, достаточно близки (коэффициенты жетинкцни составляют 55.000 М^см^лля M355NA и

19

60.000 M"1 см"' для asulCP-NF2). Таким образом. в случае ГОД 75% света поглощается нефлюоресиентным белком-помоштжом. в то время как ГО! поглаигает свет исключительно та счет флюоресцентного M355NA. Принимая это во внимание, мы должны нормализовать разницу- во флюоресценции, полученную в опыте с измерением яркости, то есть разделить полученную разницу 10.2 на 4.3. Таким образом, истинная разница наблюдаемой яркости флюоресценции должна составить 2,4 раза, что хорошо соответствует предыдущим наблюдениям по мечению актина в живых клетках.

Тетрамеркая природа GFP-полобггых белкоа кораллов мешает наблюдению свойств отдельных субьединиц белков, Чате всего мы наблюдаем кумулятивные свойства результата взаимодействий подчас разных типов хромофоров, сильно сближенных в пространстве и ориентированных определенным образом по отношению друг к другу. Так, в зрелом белке DsRed около половины хромофоров не проходят стадию расширения ароматической структуры хромофора, приводящую к сдвигу максимума флюоресценции в красную область спектра. Пик абсорбции в синей области спектра остается достаточно значительным в зрелом белке. Тем не менее, флюоресценция DsRed преимущественно красная, что объясняется эффективным переносом энергии, поглощенной «зелеными» хромофорами на «красный» хромофор В нашей работе показано, что отделение хромофора белка M355NA от других хромофор-солержашнх молекул {как в ГО!) приводит к заметному увеличению квантового выхода флюорееке] шик Наиболее приемлемое объяснение этого факта- наличие эффективного переноса энергии между одинаковыми хромофорами теграмера M3Î5NA (PRET), ведущего к частичной потере энергии, В таком случае, нефлюоресцснтные субьедннниы Г02 служат «энергетическими ловушками», уменьшающими конечный квантовый выход флюоресценции. Для объяснения сниженного квантового выхода флюоресценции M355NA по сравнению с ГО! возможно и более сложное объяснение. Форма спектров абсорбция и флюоресценции свидетельствует о гомогенности популяции хромофоров белка Тем не менее, эффект увеличения квантового выхода флюоресценции, наблюдаемый при освещении M355NA и исходного белка asulCP тштенсивным зеленым светом свидетельствует о существовании части хромофоров в нефлюоресненпном либо слабофлюореснекгном состоянии. Наблюдаемое увеличение интенсивности флюоресценции в 1,5-2.0 раза должно со<тгветствоваггь 30%-50% слабофлюоресцеигньк хромофоров. Таким образом, каждый теграмер M355NA доджей содержать 1-2 иефлюореспетныч мономера которые могли бы играть роль при относительном уменьшении квашадото выхода. Таким образом, безхромофорные аналоги флюоресцентных белков могут быть использованы для

наблюдения и выявления свойств индивидуальных хромофоров, что может быть полезным при изучении белков, содержащих погтуляпнн различных хромофорных групп.

Чсчениетубулии-спязываюшего Ледка Tmi34.

Адекватность метода гетероолигомерного мечения была дополнительно промерена лля другого ш ггоидалматп чес кого белка. В качестве модельной' целевого белка на этот раз был использован тубулин-сназывающий белок Тди34 Известно, что функция данного белка ис пару имелся при сщивкс с белком FGFP Как и в предыдущем эксперименте для выявлении нстинного распределения целевою белка в клетке применялась о ч поперчен нал трансфскция с химерным белком RGFP- Таи34 При трансфекции клеток химерным белком M35?NA-Tau34 была хорошо видна плотная красная сеть фнламентов . окружавших ядро, и не входящих в более тонкую езруктуру, образованную F.GFP- Таи34 Добавление белка-помотпнка asulCP-NF! в десятикратном избытке привело к более правильному связыванию M355NA- Таи34 с микротрубочками. Распределение M355NA - Таи34 и KGFP - Таи.14 стало сходным. Добавление в грансфек! тонную смесь плазмилы. кодирующей FGFP. вместо iisulCP-NFl не приводило к улучшению распрелелення целевого белка, меченою M355NA.

Сниапнс бкцнетронного вектора на ос»« fte asulCP-NF,

Одним из кари аилов упрощения процедуры трансформации клеток и одновременно поддержания постоянного соотношения концентраций флюоресцентного белка и белка-и омой шика в клетке является создание бииистро иного вектора содержащего гены сразу обоих GFP-подобных белков.

Нами был создан вектор па основе IRES (lolemal Ribosoirie fintry Sire) последовательности, содержащий гены asulCP-NFl и M355NA, Ген M355NA. продукт которого должен присутствовать в клетке в меньшем количестве, был помешен иод трансляционным ко1тгролем [RFS последовательности. Нужно отметть. что. если при траисфскини дпумя плазмидами можно наблюдать клетки, где (очевидным обраюч сосано Kiel иге продуктов генов изменяется в пользу какого-либо гена, то при использовании бннистрониой конструкции соотношение продуктов экспрессии генов контролируется в каждой отдельно взятой клетке. Поэтому для получения требуемого избытка продукта гена белка-помощника ею рассчетное количество не должно быть столь завышеным. как в сл\час с использованием двух плазмид. В модельном эксперименте ген белка M355N А бмл сплайсирован с актиновым геном, и трансформация производилась смесью плазмнд. содержа! иен, кроме вышеописанной конструкции, ген химерного белка ЕС! FP-актин. В качестве отрицательного контроля была испольтмшапа конструкция, содержащая лишь ген белка М355МА-актии под контролем IRFS-

последовательности. Было показано, что, в то время как в клетках, не содержащих белка-помошиика. агрегашм красного флюоресце!ттого продукта была очень зачетна, в опытных клетках распределение красного н зеленого флюоресцентного сигнала совпадало. Данный результат говорит о полпенни достаточного количества продукта экспрессии гена белка -помощника в клетке для ©су шест влети блокировки олигомеризанио»тых поверхностей химерного белка M355NA-aKTHH,

Заключение.

Предложенный нами метод создания мономерных меток теоретически применим для любых интересующих исследователя олигоыернзутощихся GFP-подобных белков. Преимущество метода, по сравнению с подходом, реализующим создание истинной мономерной метки, состоит в простоте получения нсфлюоресцентного мутантного варианта белка. Тем не менее, предложенный метол следует рассматривать как временную меру до момента создания достаточного количества нстшнгых красных флюоресцентных мономерных белков. Изучение свойств ол игом ернзующихся ОГР-подоб(гы\ белков в контексте 11ефлкюресиектных бесхромофорных аналогов может быть использовано в работах биофизического профиля с целью выявления свойств индивидуальных хромофоров.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

Статьи

1. Ю.Г. Янушевич, М. Е. Булина, Н, Г. Гурская. А, П. СавнцкиЙ, К. А, Лукьянов. (2002) Выявление ключевых аминокислотных остатков, определяющих цвет зеленого и желтого флуоресцентных белков из кораллового полипа Zoanlluis, Биоорга н ическая химия;28(4) .303-7

2. Bulina М.Е.. Qiudakov D.M., Mudnk N.N.. Lukyanov K.A. (2002) Intercon vers ion of Arilhozoa GFP-llke fluorescent and non-fluorescent proteins by mutagenesis. BMC Biochcm., 3:7.

3. Bulina M,i£„ Vcrkliusha V.V., Siaroverov D.B.. Cltudukov D.M.. Lukyanov K.A. (2003) Heterooligomeric tagging diminishes non-specific aggregation of target proteins fused with Antliozoa fluorescent proteins. Biochcm, J., 371.109-141,

Тезисы докладов на конференции*.

1, Bulina М.Е., Cluidakov D.M.. Lukyanov S.A.. Lukyanov K.A. Interconversion of Antho/oa GFP-iike fluorescent and non-fluorescent proteins by mutagenesis. 12th International Symposium on Bioluminescence & Chemiluminesoenee. United Kingdom, Cambridge. 2002.

2, Bulina M.E.. Verkhuslia V.V., Staroverov D.B., Lukyanov S.A.. Lukyanov K.A. Approaches to overcome FP oligomcrization problem. FEUS Advanced Course "Monitoring Molecular interactions and Reactions in Living Celts "Wa gen in gen. The Netherlands, 2002,

3, Bulina M.E., Verkiiusha V.V.. Staroverov DB.. Lukyanov S.A., Lukyanov K.A. Novel ОГР-like markets for protein and eel] labeling. FUBS Advanced Course "Lipid Signalling and Membrane Traffic" Santa-Maria Imbaro, italy. 2003.

#20 7 и

Выводы

• Изучена возможность применения методов молекулярной эволюции для поиска аминокислотных положений, влияющих на изменение спектральных свойств флюоресцентных белков. Провешен филогенетический анализ групп зеленых и красных флюоресцентных белков твердых кораллов. Показано влияние направляющего отбора в ряду аминокислотных положений,

• Показана принципиальная возможность перехода между некоторыми из спектральных трупп флюоресцентных белков. Выявлены основные аминокислотные положения (63, 65, 63). влияющие на цвет флюоресценции для ряда флюоресцентных белков кораллов.

» Показана, что квантовый выход флюоресценции белков кораллов зависит от ми кроокружения хромофоробразующей триады аминокислот. Исследованы положения, отвечающие за переход между флюоресцентным и нефлюоресцентным состоянием вИР-подобных белков. Показана возможность перехода флюоресцентных белков в нефлюоресцентное состояние при изменении аминокислотного окружения хромофора (остатки 148,165, 167.203).

• На основе проведенной работы предложен метод получения псевдо-мономерных флюоресцентных меток для прижизненного мечения клеточных белков.

Подписано в печать 09.12.2003 Формат 60x88 1/16. Объем 1.5 п.л. Тираж КЮ экз. Заказ №115 Отпечатано в ООО «Соцветие красок» 119992 г.Москва, Ленинские горы, д. I Главное здание МГУ, к. 102