Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Направленная реконструкция корового белка вируса гепатита В (HBcAg)

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Направленная реконструкция корового белка вируса гепатита В (HBcAg)"

Г{кщ$#ЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ ' НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ МОЛЕКУЛЯРНОЙ БИОЛОГИИ, НПО "ВЕКТОР" .

На правах рукописи

КАРПЕНКО Лариса Ивановна

НАПРАВЛЕННАЯ РЕКОНСТРУКЦИЯ КОРОВОГО БЕЛКА ВИРУСА ГЕПАТИТА В ( НВсА?) •

03.00.03. - Молекулярная биология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Кольцово - 1993

Работа выполнена.в научна-исследовательской конструкторско-технологическом институте биологически активных веществ. НПО "Вектор" "«'

Научные руководители: кандидат биологических наук

Ильичев А.Р., доктор химических наук Петренко В..А.

Официальные оппоненты: доктор биологических'наук, ' чл.-корр. РАЕН, профессор Мертвецов Н.П, кандидат биологических наук Рязанкина О.И., НИИ молекулярной биологии'

Ведущая организация: Институт цитологии и генетики

СО РАН

/ г ^ (7 (? сс

Защита состоится 1993 г. в£ часов

на заседании специализированного совета K098.08.0i в НИИ молекулярной биологии С 633159,. п..Кольцово Новосибирского р-на Новосибирской обл.)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НИИ молекулярной биологии НПО "Вектор".

Автореферат разослан "сг: '-Ш^^тъ г.

Нченый-секретарь.. специализированного .совете/ /? П Вубина Т.Н.

ОШАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТА

Актуальность проблемы.

В последнее время широко используется технология рекоьйи-иантной ДНК для получения гибридных белковых молекул, содержащие эпитопы инфекционных агентов и являквдхся потенциальными компонентами вакцин или тест-систем. Представляется весьма перспективным использование в качестве носителей эпигонов пустых вирусных капсидов. Они состоят из множества мономерных субъединиц, что обеспечивает высокую эффективность представления антигенных детерминант в фиксированней канфермации. Критическим моментом при конструировании таких "искусственных" антигенов является выбор района в белке-нссителе. подходящего для встройки нейтрализухздего эпитопз. Естройка не доляка нарушать самоорганизацию белка-носителя и находиться на его поверхности ч антигеннс-активной зоне.

Цель работы.

Цель настоящей работы заключалась в конструировании химерных вариантов HBcAg, выяснении влияния встроек на его структуру и совершенствовании методической ба8ы, используемой для создания гибридных белков.

Научная новиана и практическая ценность работа

Pas работала мутационная система, позволякш исследовать "bridge"-мутагенез. Получены данные о факторах, влияетих не. его эффективность. Показано, что важная роль в процессе мутагенеза принадлежит системе рекомбинации клетки.

Получены рекомбинантные плазмиды, напраэлякшие синтез з Е. coli керового белка вируса гепатита В (НВсАг) и НВеА*. СС-яарулвна новая антигенная детерминанта на N-конце HBeAg. Пскд-заио. что М-конец НЕсАг ке экспонирован на поверхности

Подучены рекомбинантные плазмиды, направляйте синтез г S. тс1: хиуриих в.грчантоп НЕсА*, содержала а области чсо аминокислоты iAr'), либо на месте делеции 81-¿0 аыинские-ютиых остатков ( АКСО, зпитоп вируса яаура >F\£V VP1 COG-ЕС?), . .тл М-ке.чме iv-дко ¿-галзктевндазы. ^сследога.чы иггигениы*

^ - ».«'■•'j^i "-'^Г4»! JII'CCТ^ И ИХ ^2ПЮНОСТЬ

Апробация работы.

Результаты работы докладывались на Всесозных конференциях: "Новейшие методы биоинженерии" (Пуиино,1991), "Новые направления биотехнологии" (Пущине,1992), "Вопросы ветеринарной вирусологии, микробиологии и бпизоотслогии" (Покров,1992); на Шждународном симпозиуме "Syntheti с ol i gonucl eoti des: prob-!errs and frontiers of practical application" (Москва, 1991) на научных конференциях НПО "Вектор".

Публикации.

По материалам диссертации опубликовано 2 статьи и тезисы шести докладов.

Объем и структура диссертации.

Диссертационная работа ИБЛОжэна на ИЗ страницах машинописного текста; состоит из введения, 3-х глаь, выводов, заключения списка цитируемой литературы из 133 наименований и содержит 3 таблицы и 28 рисунков.

Содержание работы.

' 1. Мутагенез in vivo, индуцированный олигонуклеотидами и, направленный на места разрыва двуспиральной ДНК ("bridge"-му-танез).

Данная часть работы посвящена разработке мутационной системы, позволяющей исследовать генетические последствия взаимодействия одигонуклеотидов с расщепленной двуцепочечной матрицей. Система была сконструирована по аналогии с описанной Иандески (Mandecky V. ,1986). Сконструированная нами модельная плазмида ркМ2 ( производная pUC18) имела вставку штидина в начале гена g-галактозидазы. что обеспечило возникновение уникаль ного Ва.*яН1 сайта и превращение в 1 ас- тип. Структуру слигонук-леотидов-мутаге:!ое (рис.1) спланировали таким образом, чтобы индуцировать делецию цитидинового звена в BamHl сайте, в результате которой происходит восстановление рамки считывания lacZ. Олкгонуклеотиды отличались по длине и наличию или отсутствию зтильных групп на межнуклеотидном фосфате. Ранее, в работах (Петренко Е А. и др. .1988) было показано, что в сайт-ло-кадизованном мутагенезе та фагах фосфотриэфирные олигонуклео-

-э-

РМИ2___СЙДАСАССТАТСАССЛТССАТТДСССАТССАСТСССССТССТГГГЙСААССТ. . .3'

а) CATfiCTCCTAGCTAATCCCTA-GTCACCCGCACCAAAATCTTG-5'

б ) GATACTGCTACCTftATGCCTA-CTCACCCGCACCAAAATCXTG - 5'

в > САТ,АСТССТАССТАЛТСССТА-СТСДСССССАССАААДТСТТС-5' at

г) GATACTGGTAGCTAATCCCTfl-CTCACCCGCACCAAAATGTTC-3'

et

д) GATACTGGTAGCTAATGCCTA-GTGACCGCCACCAAA-S'

dt et

a) GCTAGCTAATCCCTA-GTCACCGGCAGCAAAATGTTG -3'

at

с) GGT,AGCTAATC CCTA - GTG ACCCC CAGC^AAA - 5 *

et at

Рис. 1. Структура олигонуклеотидов-мутагенов и N-концевогс участка гена lacZ в ДНК рМ2 (зерхняя цепь): et - обозначает положение этиаьной группы на меянуклеотидном зссфате.

тиды (ФАО)-являются более сильными мутагенами, чем их фосфсди-эфирные аналоги. Мутагенез проводили путем трансформации клеток Е. col i денатурированной нагреванием смесью линеаризованной по BamHl сайту ДНК рМШ и олигонуклеотида-мутагена. Эффективность мутагенеза выражали в £-ном отношении синих (му-тантных) колоний к общему числу клонов.

В результате сравнительного исследования мутагенных свойств олигонуклеотидов было обнаружено, что если фосфодиз-Фирный олигснуклеотид индуцирует примерно 50S уровень мутаций (табл. 1), то введение фосфотриэфирного узла на 5',3'-конец или на оба конца олигомера одновременно повышает выход мутантсэ до 61,65 и 777. соответственно. Причиной повышения эффективности мугенеза является, по-видимому, преимущественная репарация не-мутантной нити гетеродуплекса и устойчивость к репарации му-тантнсй нити.

При мутаганеаз на плаэмиде рШС выход мутантов практически 4*í ¡зависит ст наличия 5'-концевого фосфата (табл. 2;. Эти дан-тч чогут свидетельствовать л тем, что з используемой систем»

таблииа

Зависимость эффективности мутагенеза от длины олигонукпео-тида и наличия зтильной группы на межнуклеотиднон фосфате.

олигс- длина в Количество Выход мутантоЕ

нуклеотид» нуклеотидах этильнйх групп ( в )»«

с 42 0 50, С \_<\. 4 (7:

6 42 1 61, 3 \_ + \. 2, 3 (4!

Ь 42 1 65. 3 9.2 (4)

Г 42 2 77, 0 6, 0 (13

д 36 2 45, 6 + 7, 5 (7!

е 36 2 40. 3 10. 9 (6

ж 30 £ Е, 3 \. + \. 6.6 (7

» Структура олигонуклестидов приведена на рис. 1. »« срелкее арифметическое и стандартная ошибка по результатам нескольких опытов (количество опытов указано в скобках), в каждом опыте сделано не кенее 2х высевов клеток Е. coli JM103, трансформированных порознь.

Таблица 2

Зависимость эффективности мутагенеза от наличия концевог 5--Фосфата у олигонуклеотида-мутагена

Наличие 5'-фосфата Выход мутантов (В У.)

77.0 \_*\ .6,0 С.З-,

•* 69,£ + \.!1,! (4;

Примечание: Использовали олигонуклеотид-нутагек 4ü-nep (рис.1 п. Трансформировали клетки Е. coli JK103.

олигонуклеотид выполняет лишь роль временной матрицы, напр ляшей репарацию противоположной нити ДНК. Эффективность мутагенеза, индуцируемого ФАО. заметно пал

: уменьшением их длина При длине олигсмера ниже 30 звеньев фовень мутагенеза станозится едза заметным. Этот факт можно объяснить, предположив участие гомологичной рекомбинации и, з lac.THocTH, белка RecA, который катализирует рекомбинацию со скоростью, пропорциональной участку гомологии, с нилним преде-юм куклеотидной последовательности, не способной к еларива-nw, в 30 пар нуклеотидоВ (Ланцов Е А. ,1985).

Другое подтверждение участия рекомбинации в мутагене!?'?, инду-и:роганном CAO, получено при трансформации смесью ДЖ и элигонуклвогилсв -Rec+ и Ree- штаммов £. cci i. Скззадссг. '¡тс на ■иазмиде мутагенез преходит эффективно только в Ree- итаммах . габл. 3). Таким образом, полученные данные дают :;сненая;н гседполодить, что' в процессе мутагенеза двуцепочечней ДНК 1зя роль принадлежит системе рекомбинации бактериальной .клетки.

Таблица 3

Влияние дефекта в Ree системе клетки на эффективность мутагенеза

примечание: Использовали олигонуклоотид-мутаген 42-мер (рис.1 г).

2. Конструирование и свойства гибридных частиц HEcAg.

2.1. Клонирование и экспрессия в E-coli гена HEcAg.

!!а первом этапе данного раздела работы стояла задача получения ре ко мб и ант них плазмид, направляющих в Е. col; г.пггез рокзмсинантного !írcA,j. соответстзуксего по своим свойствам природному. Для зтого были сконструированы плагмидн, в которых ген :ЕоАй находился под контролем промоторов Ptac и ?!зс 'рис. 2.3). плазмиде пКЛЕс чуклостидная последовательность i,Qüa НБсая

Штамм Е.coli

Выход мутантов (a Z )

JM 103

JM 109 (гесА-) DH5 -F' (гесА-)

77,0 +6.0 (13) 0.5 +1.7 (4) 4.5 +4.3 (4)

Рио.2. Схема конструирования плазмиды рКНВс.

полносты» соответствовала природной. В плазмиде pUHBc первых тр ARO HBcAg заменены 17-ю АКО е-гадактозидазы. Уровень продукции EBcAg, направляемой рКНВс составлял 5*, а в случае dUHBc -16* от суммарного клеточного белка. При гель-фильтрации на сецек-риле S-500 рекомбинантный HBcAg выходит впереди всех белкор Lccii. С помощью электронной микрофотографии показано, что оь собирается в частицы диаметром 24 нм, по форме и морфологии подобные природному кору.

2.2. Исследование N-конда HBcAg.

Оба рекомбинантных белка (HBcAg и HBcAN-lacZ) при им-цунодиффувии по Ухтерлони образовывали полосы преципитации с антисывороткой к HBcAg В иммунобдоттинге. после электрофорезе

з денатурирующих условиях, оба белка слабо выявлялись антителами к HBcAg, 'но хорошо реагировали с антителами к HBeAg [растворимая форма HBcAg). При использовании моноклональных антител (ША) Е1А7, была получена иная картина. MRA Е1А7 выявляли з иммуноблоттинге только HBcAg (продукт рКНВс) и не вьнз-

sarahi

\ят

HBcAg(4-183 AtC)

SamHI PamHI Hlnatll

-J Уо

Рис. 3. Схема конструирования pUHBc. А 5

S^-x lü3 j Рис. 4. Иммунсблоттинг белков псслэ

: разделения в 15£-ном ПААГ:

.-я» а) с антисывсротксй к КВеА?-,

б) с моноклинальными антителами ElА7 1.3 - лизат клеток Е. сс! i, трансфср-— в§ мирсванных p'JKBc,

7" 2,1 - лизат илетск £. col i. тралефор-** ■ мирозанких р.ЧНВс.

21,

Jé*

лялк HBciN-lacZ (продукт рШБс) (рис.4). Поскольку эти беля отличаются только N-концом, мы предположили, что именно N-kok цевые АКО HBcAg участвуют в формировании антигенной ветермк нанты. узнаваемой МКА Е1А7. Для исследования поведения ре ко у бинантных оелков в нативных условиях в реакции с моноклрнальн ми антителами, был неоходим положительный контроль HBeAg.

Известно, что HBeAg можно получить путем укорочения КБсАе по 144-ю АК (Inada Т. ,1989). Опираясь на этот факт, мы сконст руировали плазмиды рКНВе и pUHBe, содержащие кодирующую часть гена HBeAg (соответствующую 1 -144 АКО HBcAg). Продукты экспрессии обеих этих, плазмид реагировали в иммуноблот-тинге с антисывороткой к HBeAg. Однако МКА Е1А7 выявляли только HBeAg (продукт рКНВе) и не взаимодействовали с HBe¿N-l (прейте pUKBe) (рис.5). Аналогичные результаты были получен е ИЗ-А (т.е. в нативных условиях): HBe£N-lac2 не ингибирова связывание МКА Е1А7 с природным HBeAg, фиксированном на под

Рис. 5. Имуноблоттинг белков с анти вороткой к HBeAg (а) и моноклональ ными антителами Е1А7 (б). Пифрами обозначены лизаты клеток Е. col i, трансформированных следуюп ми плазмидами:

1 - pUC19, 2.4 - pUHBe, 3,5 - рКНВ

ложке (оис. 6).

При исследовании в нативных условиях .в ИФА поведения рекомО иантного КВсА? окавалось, что ни полноценный HBcAg ■ (продук рКНВе), ни КБсйК-]ас2 (продукт рЦНВс) не взаимодействовали с МКА Е1А7 (рис.7): Очевидно, И-конец капсида НВсАе недоступе МКА Е1А7 и не экс—онировая на поверхности частицы. Таким обра

г *

I / '

г /

У

I_

-!-I-1-1-1-1—-7-(-»миап *>|ХМ

• » ' ' • 1о0.п

'ис. 6. Зависимость связывания моноклональных антител Е1А7 с НВеАе, фиксированным на полистироле, от разведения клеточных лизатов, юдержащих рекомбинантныэ ШЛЮ-1ас2 (продукт рЦНВе) - (•) или ВеАе (продукт рККВе) - (о) в конкурентном ИФА. Ъ оси абсцисс - разведения в 1 о?2п; по оси ординат - процент :вязывания МКА Е1А7 с НВзАе, фиксированным на подложке.

юм, М-конец НВсАе, по всей видимости, не является удачным <есгом для встройки вирусных зпитопов.

2. 3. Получение НВсАе, несущего детерминанту вируса ящура.

Для встройки зпитопов мы выбрали иммунодоминактую об-

1асть НВсАя б районе 75-85 АКО (петля е1), которая прегстаЕЛ1'-'-¡а на поверхности кора (Апгог Р. ,1Р8£!. Ллг. этого, г >лигонуклеотиднаправлекного метагенеза был гведек сак-

изменения аминокислотной последовать Л!-нгсти НЪо',г.

5 качестве юзслыюго пептида г.иг. вне гая рпнтс г 1. •. ¿елка ур1 вируса якура ( огрсткг.а нстроиж к'-т-тоти.-к:.;:

юследоватедыюсти. код»*.; -гаей зпитсп В£Л\ била п;с-рел'?ни ■ гамошью "Ьпаге"-мутагенеза (рис. 8). Этот облагает спг«,-

¡еденными достоинствами по сравнению с клениреганием с помещу ШК-лигавы. Для. работы требуется только один олигонуклеотид;

\

Рис. 7. ИФА лизатов клеток Е. col i с пс.молья МКА El Д7.

Клетки Е. coli, трансформированные (о) - рКНБс ,

(•) - pUHBc, (Л) - рКНВе. По оси абсцисс - разведение соотве'

ствутазего антигена в 1 ozfk, по оси ординат - оптическая

плотность.

мша с1м«м a im xnol rwmciion ш»

pKXBc

ii 11 Г» T» >0 ti •> II К i

ItOfl » í D l V \

ГС5Ав«в АССТДСГА-1

ссскъясм

i г o r i - j » o i v V\

ТТСвААСАГССАЛГС rCCA«SGACC7AGTA -J -AACCTTCTASSTWiACCT CCTTG'IATCAT -

» Y t O I I I » P

»•- ттваАлв*1ССА*1САавт*СА л acasa а а atcatc всгсссгса лова асстлсга -з-

l«MTI-«trrrme е||0ОЛ»С|«ОН<М аоо-тоо vrtrumi

_ л~<сляс*л*псг*мс*л*л»яыл СШСКСЯКглАШ_J

• Mut« гмоумммм ira«»Mi> »»*»•

Itc« VMCWÍTMMM !!•««••<) IM«

-.•"она конструирования cüiEc-FVLlV к "mcsjj "Ьг: пае" - му?аг-? ньзл.

5? необходимости в использовании ДНК-лигази и ПНКааы; вставка ;егда находится е правильной ориентации, что облегчает отбор шов сс встройкой.

Сконструированные плазмиды pKHBc-FMDV и pUHBc-FMDV направ-ш1 синтез гибридных белков, которые при иммуноблоттинге реа-фовали как с антисывороткой к HBeAg, так и антисывороткой к Л FMDV. Однако, при попытке выделить гибридные белки чистом виде оказалось, что они не растворимы и целиком ое-исгся в составе дебриса. Растворения гибридных белков можно ■jj.o достигнуть обработкой дебриса 8М мочевиной или 6М гуанк-ин хлоридом, однако высокая гидрофобность не позволяла з<йек-ивно отделить их от белков Е. col i. Причиной сильного изменении

ДМ РВШШШ ->С.'"Ы1

НВс(4- 61) PJQC нвс(90-163,< НбсО-б!)

икс q к ii а г

5' - 1 cg agstac к a_acag 4а а атс ai cg ^tjtg 2t* cl ccatgtt i gtct tt 7 ag7agcg ag 3с

} *ГЮ-Г535? |

кс. 9. Схема конструирования векторов вамеозния.

физико-химических свойств белка, возможно, послужило образование кластера из четырех положительных зарядов в результг те внедрения эпитопа ящура Это могло привести к залипают белка на фосфолипиды мембран или к взаимодействию с отрицательным, кластером внутри белка и выпячиванию гидрофобных групп.

В дальнейшем.были сконструированы 2 вектора замещения, которые содержали вставку эпитопа FMDV на месте делеци: 81-90 АКО HEcAg (включающую одну из положительно заряженные Ал) (рис.9). С помощью иммуноблсттинга продемонстрирован! связывание гибридных белков с антисывороткой к HBeAg и с ан-тисыЕороткой к FM3V (рис. 10). Химерные белки находились ¡ растворимом виде в клетках Е. coi 1 и вели себя как частицы.

22 ■

А .

1 2 3

'Ы щ

тц

Щ

Hiiiü

Рис.10. Иммуноблсттикг белков после разделения с поли-акриламидном гело: а) взаимодействие с а-чтисывороткой с. НБоЛ; б) пзаимсдействие с антисывороткой к FMDV. Лизаты клотск Е.cali, трансформированных 1,4 - риНБс: 2.5 -rUHBc:ü9l-90)'-FVDV; 3.6 - рКНВс(Д81 -00} -FM3V.

и ультрацектрифугировании клеточных лиэатов, они оседали дно пробирки вместе с высокомолекулярными клеточными аг-гатами. При гель-фильтрации на сефакриле S-500 выходили г ободном объеме, обгоняя высокомолекулярные беяда Е. coi 1 ис. i!). Полученный рееультат говорит о том. что замещение итопом FMDV фрагмента области el HBoAg не нарушило сп~ссс-сть белка к самоорганизации. Более того, присоединение к концу химерного белка 17 АКО &-галактозидазы также не при-ло к нарушению самосборки.

Í £ 3 k 5 6

ас. за. Ьлектрофогее Оелков после гель-ья rniUKs: »«•• -^Xücr'l'.lf' ь- 500 Ы-ЮТС'* : . CV. : . " 1

.2,3.4,5 - номера фршс..:«, гыхсдяскх v сюсагнси-Ьъеме; б - лизат клеток Е. col > до хромат^гpa5.11.: стрелкой указано положение белка KBc(¿8!-90)-í'MDV

■ Таким образом, полученные данные указывают на возмс ность использования иммунодоминантной области е1 НВсАг ^ встройки чужеродных антигенных детерминант, не нарушая г этом способность белка к самоорганизации.

ВЫВОДЫ

1. Разработана мутационная система, позволяющая исследсвг генетические последствия взаимодействия олигонуклеотидов и фссэотриэфирных аналогов с расцепленной двуцепочечной ДНК.

С помощью созданной мутационной системы установлено, что:

а) фосфотриэфирные олигонуклг^тиды индуцируют мутации 6cj эффективно, чем их природные аналоги;

б) в процессе мутагенеза важная роль принадлежит системе с комбинации клетки.

2. С помогаю олигонуклоотид-напраЕленного мутагенеза по: чени векторы, обеспечивающие внедрение чужеродных эпитопов £ иммунодоминантный район корового антигена вируса гепатита ÍHBcAg),

3. Пзлучено шесть штаммов Е. col i, продуцирующих под контр лем tac и lac промоторов следующие варианты HBcAg:

а) НБсАг соответствующий природному;

б) HBcAg-FMDV - содержащий деторминамту вируса ящура (200-£ VP1 FfcEV) между 81 и 82 АКО HBcAg;

в) HBcAg(A81-90)-FKCV - содержащий ту же детерминанту, замен пцую 81-90 АКО HBcAg.

4. Показано, что замещение эпитопом FMDV области 81-90 t КЗсАг, а также присоединение 17 АКО /-галактозидазы к N-kohl КБсА« не нарушает самосборку гибридного белка. В то жн время вставка этой детерминанты между 81-82 АКО судаствонно меня tic ¡'.ко-химические свойства НВсАг и нарусает его самосборку.

с. Сконструированы отаммы Е. col i. продуциругете рекомС ■га;-:т::нй HBeAg н его аналог, содержаний делоиию 3-х М-кснцень - Mut. Asp, : le. Ооиаруявно отличие антигенных сеойс

tx белков в реакции с моноклональными антителами Е1А7. Лока-ювана новая антигенная детерминанта НВеАс в области егс ганца. Установлено, что обнаруженный эпитоп является линей-t и влючает в себя по крайней мере один из 3-х делетирсван-: АКС.

6. Показано, что N-конец KBcAg не взаимодействует с МК/ i7 и, следовательно, не экспонирован на поверхности кап с ид а.

шовное содержание диссертации изложено в следующих 1ботах:

Карпенко JIЯ , Татьков G. И. Удобная мутационная система для изучения Rec-зависимого мутагенеза. // Актуальные проблемы биотехнологии. Отрасл. конф. мол. ученых. -Кольцово. -1990.-С. 23. '

Петренко Е А., Карпенко Л. И. , Татьков С. И., Смирнова О. Ю. , Кузьмичева Г. А., Ильичев А. А.. Мутагенез, индуцированный фосфотриэфирными аналогами олигонуклеотидов и направленный на места разрыва двуспиральной ДНК. // Молекул, генетика. -1991.-N. 10.-С. 19-22.

Petrenko V. А., Kuzmi cheva G. А. , Tatkov S. I. , Karpenko L. 1. J1 yi chev A. A. // I nvesti gati on of mutageru с propeti es cf el i gonucl eoti des anal cgues. // Syntheti с o) i gonucl eoti йег.: Problems and practical application. ! ntern. Svmp. Moscov. -

1991.-Oxford.-199!.-P. 8?.

Ильичев A. A. , Белявская E A. , Карпенко Л И. Вакцинная инженерия на основе белков вируса гепатита Б. • - Новеиш*.' методы бнсинкенсрии. Kokí. Путно. -19¿4. -М. - :9?г.. Карпенко Л И. . Каплина О. К. , Ильичев А. А. . Петренко L ;. Использование кэр-аитк. -.-на вируса гепатита, В в качестве носителя антигенной детерминанты белка VP1 вируса я^ура.// •Новые направления биотехнологии. -5-я Конф. Fcj. Сед. Пуиино. -

1992. -С. 61. .

6. Карпенко Л. И., Каплин Е С., Каплина О. Н., Ильичев А. А., Петренко а А. Экспонирование иммунодоминантного эпитош осолочечного белка УР1 вируса ящура в составе капсида хор-антигена вируса гепатита К// Вопросы ветеринарной вирусологии, микробиологии и эпизоотологии.-Конф. Покро] 1992.-4.1.-С. 175-176.

7. Рязанкин И. А., Карпенко Л. И. , Чикаев Е А. , Серегин С. С. Ильичев А. А. . Петренко Е А. Локализация М-концевого эпитопа НЕе-антигена вируса гепатита Е// Изучение я профилактика особо опасных вирусных инфекция. -Нонф. Кольцове. -1993. -С. 21.

8. Карпенко Л. И. , Рязанкин . А. , Чикаев Е А. , Серегин С. С.

эпитопа НВеАв вируса гепатита Е // Молекул, генетика. -1993. -N3. -0. 29-31.

Ильичев А. А., Петренко Е А. Локализация М-концевого