Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

NADH:цитохром С-редуктаза люминесцирующей бактерии Vibrio harveyi, ее роль в биолюминесценции in vivo и in vitro

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "NADH:цитохром С-редуктаза люминесцирующей бактерии Vibrio harveyi, ее роль в биолюминесценции in vivo и in vitro"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ИНСТИТУТ ХИМИЧЕСКОЙ ФИЗИКИ ИМЕНИ Н.И.СЕМЕНОВА

па правах рукописи

Бокша Ирина Сергеевне

NADH-.ÜHTGXPOM С-РЕДУКТАЗА ЛЮМИНЕСЦИРУЮЩЕЙ БАКТЕРИИ VIBWO HÁRVEYI, ЕЕ РОЛЬ В БИОЛЮМИНЕСЦЕНЦИИ IN VIVO И IN VITRO

(&00.02 - биофизика 03.00.07 - микробиологи^

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

с

Москва 1995

«

Pacora выполнена в Институте химической физики им. Н.Н.Семенова РАН/';

' I

Научный консультант: доктор биологических иау;

Профессор б.Д.СамуИЛЦ;;

Официальные оппоненты: ___Л°*ТРР биологических наук

, В ГМ. Андреев"

кандидат биологических наук Fi. С Лебедеи

Ведущее учреждение: Российский Государственный.

Медицинский Университет,

Л.нцчга диссертации-^остоитей '122? "■ ^S/ictSfiJi " 199.£ №да в "/¡f' часов на :iaiтлаии» диссертационного Совета Д.002.26.07 в Институте химической физики • им. Н.'Н.Семенопа РАН (Москва, ул.Косьиина, 4) 1 -

С диссертации! можно ознакомиться в библиотеке Huciitrji^ хям^ческсй. физики им' Н.Н.Семенона РАН—

Автореферат разослан

Учевдй Секретарь,

кандидат химических наук М.А.Снотряева

В последние годы исследования физиологии и биохимии светящихся бактерий уступили места молекуллрио-генегнческим работам, однако существуют пробелы в изучении электрои-трансиоргных систем этих бактерий (Nealson, 1993). Хотя люмкнесцирующие бактерии находяу все более широкое применение в санитарной микробиологии и экологии (Родинева и.др., 1995), мало изучен вопрос о взаимодействии их люминесцентной системы и энергетического метаболизма клеток (Wada et al., 1992). Мало сведений о регуляции сопряжения люминесцентной системы с другими электрон-транспортными системами на уровне флавопротеинов и ÑADH-завнсимых оксидоредуктаз, в том -числе о ÑADH.mrroxpoM с-редуктазе.

, . Углубление знаний о месте люминесцентной системы в энергетическом обмене клеток светящихся бактерий и о влиянии различных факторов на биолюминесценцию in vivo позволит перейти к прогнозированию эффективности биолюминесцентных датчиков для анализа новых классов соединений, а также к созданию на основе - ферментов дюминесцирующих бактерий цозых аналитических систем.

цель работы * ■

Целью данной работы было изучение NADH:mrroxpoM с-редуктазы и выявление ее роли в биолюминесценции в условиях in vivo и in vitro. Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:

1. Выяснить, существует ли непосредственное взаимодействие белковых компонентов люминесцентной системы и дыхательной цепи.

Решение этой задачи включало следующие этапы:

- очистка NADIl-зависимой . цитохром с-редуктазы из люминссцирующей бактерии Vibrio harveyi, ее характеристика;

- очистка люциферазы из V.harveyi;

- исследование взаимодействия очищенных NADH.'iiJrroxpóM с-редуктазы и люциферазы in vitro.

2. Исследовать изменение биолюминесценции клеток в условиях стимуляции мембранного транспорта электронов.

Для этого:

, - изучить влияние разобщителей окислительного фосфорилирования и других мембраногропных агентов на люминесценцию клеток, определить возможные мишени действия этих веществ в клетках;

- исследовать влияние искусственно наведенной 'трансмембранной разности электрохимических потенциалов Н+ на интенсивность биолюминесценции In vivo.

-Л.. 'НШг?. ^ ^ /

Из люмннесвдрующей бактерии V.harveyi впервые выделена, очищена и охарактеризована NADH-зависимая оксидоредуктаза, высокоспецифичная к цитохрому с. •

Обнаружено, что эта редуктаза стимулирует активность высокосчшценной люциферазы из этой же' бактерия in vitro. При объединении люциферазы с

t

1

ÑADI I.цитохром с-редукт'азой изменяются кинетические характеристики редуктазы. В услоннях стимуляции мембранного транспорта электронов (при наложении "не запирающего" трансмембранного градиента рН) наблюдается возрастание ншепсивности биолюминесценции клеток. . i

Показано ингибнрующге действие низкомолекулярных спиртов , на биолюминесценцию клеток, которое снижается при добавлении ионола. ' ¡

НАУ ЧНО-НРАКТИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ РАБСИЛЫ / \ |

На основе сопряженных реакций с участием ферментов люминесцирукйцих бактерий >» различных ЬМр(Р)П-зависнмых оксидоредуктаз созданы MHOI очнелепные пмсокоспсцифнчныс а1Гал|[Т1Птсскне-снстемы,-.а_1оь1.л1;слг,_.qioco6— 'определения N11, защищенный авторским свидетельством (Бокша и др., 1992). В свяли, с этим выделение гомогенной NADH-завнсимой цитохром с-редуктазЫ и описание ее снонстп, возможно, окажется полезным для конструирования новых аналитических систем на основе биолюминесценции. . j ' i

Выяснение условий, от которых зависит интенсивность люминесценции светящихся бс.мерпп, а также Кыявлеште взаимосвязи люминесцентной системы со структурно-функциональным состоянием клеточных мембран необходимы, для распространения бнолюмннесцентного анализа на новые соединения, в частнорти, цонофо),hi, каналоформерм, другие мсмСрапотронные агенты.

Данные о влияния нонола па подавление биолюминесценции спиртами, в частности, _ лганолом, возможно, окажутся полезными в поиске путей защиты от этанола клеток мнкроорглннзмов-продуцентои этанола.в целях повышения .выхода целевого продукта. " . . '' ' I "i

ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ, ВШЮСИМЬШ ;ÍIA ЗАЩИТУ: ¡ : j

(. Предложен метод выделения NADH: пигохром с-рсдуктззы из Vibrio harvkyi. . Этим методом впервые очищена [«'охарактеризовала NÁDH:«HToxpoM с-редуктаза V.harvcyi. ¡ ,¡

2. ÑADIÍ: цитохром с-редуктаза взаимодействует с люцнфс|мзоп. . 3. Разобщители окислительного фосфорклнрования ншибируют биолюминесценцию вследствие их протонофорного действия на клеточные мембраны Интенсивность биолюминесценции изменяется при искусственном наведении трансМембранИоГо

протонного градиента:' --------! . » i

4. Выдтиастся гипотеза о сгязи дыхатсльклй; js _.Л!оМннегце|гтиои -%электрои-трднсиортных цепей V.harveyi к о регуляции бнолюмииесцотГии бактсрилльиътг — клеток погрела ном трапемембрашнл о протонного градиента.

АПРОБАЦИЯ ДИССЕРТАЦИОННОГО МАТЕРИАЛА j

Результаты исследования_б мл и доложены на Всесоюзном Симпозиуме

—чВно>;е.ч1Глюмннесцснция в медицине и сельском хозяйстве" (Ташкент, 1986). 115 научной конференции молодых учены*, биологического факультета МТУ "Проблемы современной биологии" (Москва, 1984), IV Всесоюзной межуниверситетской конференции по биологии метки', ТГУ, (Тбилиси, 1Ü85) VII Всесоюзном съезде ВМС) "Достижения микробиологии практике" (Алма-Ата, 1!>85), научной конференции "Кинетика и механизм э.&ктропного переноса О

белковых системах и их моделях" (Вильнюс, 1985), Всесоюзной школе по биохемилюминесценцин (Красноярск, 1986), конкурсе работ в ИХФ РАН (Москна, 1992). . '

.г., /;? i г. :. т:;.:: '7 ПУВЛИКАДИИ.

По материалам диссертации опубликовано 8 печатных работ, включая 1 авторское ' свидетельство. .

7.':'7-7;7-\СГ№УКЛУР4'Й ОВ>ШРАБОТЫ.' ,

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, обсуждения результатов, выводов И списка литературы, содержащего 201 наименования. ' •. . " ■

Работа изложена на 12(5 страницах машинописного текста, иллюстрирована 22 рисунками и 7 таблицами.

7-?-'тг..'г;7:'"^'содержание,работы/.„..;'

•->,-> МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

. Объектом исследования служили Mopciaie люминесцирующне бактерии Vibrio harveyí штамм MAV (392) и Vibrio fischen штамм N6, полученные из коллекции культур микроорганизмов кафедры микробиологии МГУ.

Бактерии выращивали в реакторе объемом 100 л в жидкой среде следующего состава: NaCl - ЗОг/л, Na2HP04 ■ 5,3г/л, (NH4)J!P04 - 0,5г/л, MgS04 -0,1г/л, FeS0^7H¡0 - 0,001г/л, глицерин - 0,3мл/л, дрожжевой экстракт -0,5г/л, пептон - !,0г/л, ~рН 7,4 с перемешиванием, при температуре 26°С и аэрации 40% насыщения 0,2 (V.fischeri) или температуре 28°С и аэрации 60% насыщения (V.harveyi), а также в колбах Эрленмейра на качалке.

Рост и биомассу .контролировали по . оптической плотности при 660лм на спектрофотометре и но шпенсивности биолюминесценции. Клетки, отделенные от куяьгуралышн жидкости на сепараторе, разрушали осмотическим шоком и ультразвуковой обработкой. . . ■

Клеточлые стенки и другие крупные фрагменты удаляли центрифугированием при 13 000g 1 ч. Субклеточные частицы осаждали центрифугированием при 100 000g 1ч. "

•____ Активность NADH: цитохром с-редуктазы с цртохромом • с и другими

акцепторами ' электронов определяли спектрофотометрически на двух-лучеи'ом спектрофотометре Beckman-26 rio нарастанию поглощения при 550нм (для восстановленной формы цитохрома с) или при соответствующих длинах волн для других акцепторов электронов. Активность выражали В нмоль восстановленного цитохрома с* мин^'мг белка*' (Gilewicz et al., 1979)..

РЕГИСТРАЦИЯ БИОЛЮМИНЕСЦЕНЦИИ Активность лкщиферазы и люминесцентной системы определяли по интенсивности биолюминесценции на автоматическом люминометре LKB ' Wallac-1251, а также на неавтоматическом люминометре - модель 1250 или на люминометрической установке, состоящей из стандартных блоков. На этих

-О

приборах регистрирован! и интенсивность биолюминесценции j> живых бактериальных клето.с. ■ . i

При определении люцнферазнон активности в качестве восстанозктеля FMN использовали дитнЬннт натрия. При определении активности NADH-зависимой люмш|ссценг1к>й системы реакцию инициировали добавлением NADII. Активности выражали в чВ'мг белка"1 или в ква1гт*(с*мг белка)1. • !

При выделении фермс'нтов Использовали ; следующие методы фракционирования: дробное • осаждение сульфатом аммония, жидкостную хроматографию низкого давления, колоночную гель-фильтрацию-, колоночную ионообменную хроматографию, препаративный электрофорез в палиакриланидиом геле, колоночную гидрофобную хроматографию, нзоэлектрофокусирстание. —.—

Гель-фильтрацию просолили иа Ссфадексе Г-100, размер колонки 5х100сМ, в 0,02М Ыа-фосфагном буфере pH 7,1 с 10 "4М ДТТ. I

■ Ионообменную хроматографию проводили на ДЭАЭ-целлюлозе или ТЭАЭ-иеддюлозе (Серпацел) и ДЭАЭ-Трисакрилс (LKB), на колонке 2,5x5 см". Загрузку белком осуществляли u 0.02М Ка-фосфатном буфере pH 7,1 с 10 "4М ДТТ, :

Гидрофобную хроматографию на в-амино-п-октилсефарозе 4В проводила на колонке 1x5 см. Загрузку белком проводили в 0,05М Ыа-фосфатном буфере pH 7,1 с 10 -4М ДТТ- NADM.mrroxpoM с-редуктазу элюировалн градиентом 0-0,5% холата Na, а люниферазу - градиентом Тритона N-101 с 0,3% холЛта Na.

Диск-электрофорез в ПААГ проподили nb (Davis, 1964) , в -нсДснатурнруюшпх условиях, pH разделяющего геля 8,36, и по (Laemmly, 1970) -и денатурирующих условиях, с додецилсульфаюм Na. и маркерами молекулярных масс (Sifiina). . ' . - j. -, i

' Иаоэлектрофокуснрованне осуществляли на колонке LKB Amphoiine Ëlcctrofociising cohim.i 8100 с 2% амфолш.ов Amphoiine LKB 1809 в диапазоне:pi I 3,5-7 в градиенте концентрации сахарозы, а также на приборе LKB с горизонтально расположенным слоем поддерживающей среды (Ссфадькс Г-75 "superfinef) с амфолинамн Ampliolim; LKB (pH 3,5-9),Scrvalyt Serva (pH 3-6) или их аналогами (Хийу Калур, Эстония) или в горизонтально расположенном ПААГ, используя пластины Servalyt Prccotes Serva pH 3-6. i

Окрашенные красителем Кумасси голубым R.-250 гели после электрофорез.! или ИЭФ сканировали щ_асскгрофотометре Bcckman DU-8 при . длине полки

595пм. ' ' -—- ___________ • ■ '

Ферменты хр.ии.ти в лиофнлнзованном виде й;иГв "виде осадков 8 сульфате аммония. В опытах по исследованию изаимодсйсгвия люциферази с ЫА1)Н:цитохрим с-редукталой п растворе для совместней инкубации брались растворы этих ферментов в 0,1 M K-фосфатном буфере. pH 7,1 с К)4 M ДТТ. Инкубация нрочовдлась при 4°С. В качестве контроля служила ЫЛГ)Н:цнтохром с-редуктаза, нреннкубироьаниая 20-30 мин при 60пС.Разщща между величиной люцш|>сразной активности (измеряемой в роакщш с FMN, вссстановленИым дитионитом) в оптлте и соответствующем контроле считалась истинным приростом активности люциферазы (Äld,t).

г. При исследовании влияния спиртов, аонола, иоиофоров и наведенного трансмембранного потенциала использовались лиофилизованные клетки бактерий (препарат "Эколюм", МГУ) V.harvcyi MAV и V.fischen N6, МГУ, любезьо

I

I

предоставленные А.Д.Измайловым, МГУ. Перед опытами клетки выдерживали в 200 мМ буфере (К-фосфатиом, Tris-HCl или Na-цитратлом с соответствующим рН), содержащем 0,51М NaCl, и отминали тем же буфером от стабилизаторов; добавляемых при лиофилизации. ' * .

В отсутствие воздействий химических, веществ регистрировали стабильный уровень биолюминесценции в течение 15 мин. Мерой эффекта слу ила величина остаточной светоэмцссии через 5 мин после добавки в реакционную смесь исследуемых веществ. Уровень начальной светоэмлсаш (до добавки) принимали за 100%. /

i Разобщители, деканаль и ионол растворяли в этаноле или изонропаноле, метаноле, (три этом контролем служил чистый растворитель. Концентрацию белка в растворах определяли по (Bradford, 1976), а также спектрофотометрически при 280 ни. ■

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

, 1Л Выделение и очистка NADH¡ цитохром с-рёдуктазы.

В соответствии с поставленной-задачей разработаны два пути очистки NADH: цитохром é-редуктазы V.harveyi (рис. 1). При этом общими являются этапы фракционирования клеточного гомогената сульфатом аммония и колоночной хроматографии (гель-фнльтрации и ионообменной хроматографии). В результате этих трех _ этапов достигается очистка редуктазы в 60 раз, судя по. удельной редуктазной активности, а выход фермента составляет около 7% (табл. 1)-

Таблица Í. Выделение »-«чистка NADHmirroxpoM с-редуктазы из Vibrio harveyi.

.Стадия очистки. Объем (ил) Белок (иг) Активность

удельная (ед/иг) общая (ед)

Го.чогенаг 310 2620,0 1,59 4Í60

Осадок после диализа 27 648,0 1,02 700

ХроматЛ-рафня на Сефадексе Г-100 170 42,0 11,30 475

Хроматография на ДЭАЭ-целлюлозе so 3,-2 95,00 304

. Далее этары очистки различались: для получения фермента,' гомогенного при '-ЭФ в ПААГ в цеденатурнрующнх условиях, использовался препаративный Эф в ПААГ; для получения НАОН:цитохром с-редуктазы без примесной люциферазноя активности в количествах, необходимы* для исследования взаимодействия с люциферазой, исложзовали гидрофобную хроматографию на 8-и-аминооктилсефарозе 4В.

1.2 Характеристика ЫАОМцнгохром с-редуктазы.

Изоэлектрическая точк§ нативной гомогенной ЫАОН:цитохром с-редуктазы составляет 4,5±0,1. Фермент характеризуется величинами Кт для МАШ! 5,0±0,4 мкМ, для шггохрома с 1,6±0,4 мкМ. Низкие величины Кт свидетельствуют о высокой субстратной специфичности фермента.

О

су

Рис.í Схгна очистки N'ADHmiiToxpoM с-редуктааы

Актишюсть с NADU более чем на порядок превосходит активное г ь с NADPH. NA D1J -оксидазная актишюсть il а два порядка ниже, чем ЫЛОПцигохром с-редуктазная активность. Низкая NADH-оксидазная активность' спндете чьстнует о том, что .редуктаза не относится к цитозоЛьНым NADH-оксидазам. NADII:unroxpoM с-рсдуктаза активируется при добавлении FMN. Этим редуктаза нл V.harveyi напоминает NADH-дегидрогенаэы, выделенные из других микр организмов и теряющие в ходе выделения и очистки флавшюиый кофактор, нехоиалситно связанный с ферментом (Bertrand et al., 1980, Yagi.et al., 1988). По-видимому, этим >çe объясняется тот факт, что в спектре поглощения очищенной натнвной редуктазы не выявлено .полос поглощения, свидетельствующих о наличии хромофорных кофакторов. NADH:mrroxpoM с-редуктаза .V.harveyi специфична к FMN (активность с FAD в пять раз ниже, чем с FMN) и, вероятно, содержит по меньшей мере две субъединицы (судя по данным ЭФ в 11ААГ с ДДС-Na). Этим она похожа на NADH-дегидрогеназы других микроорганизмов, выделенные в отдельный класс NADH-зависимых оксидоредуктаз (Yagi et al., 1988).

Огдимум рН для активности редуктазы в фосфатном буфере составляет 7,157,25, а в iYfb-HCl-буфере - 8,0-8,2, причем в оптимуме рН фермент более активен в Tris-HCl-буфере. ■ .

Таблица 2 Влияние различных акцепторцв электронов, флавииов и о-фепантро.иша uâ активность NADIImirtorpoM с-редуктазы V.harveyi.

Акцептор Кофактор Ингибитор Активность образца (ед/иг)

цитохром с FMN 1,20

цитохром с —TAD 0,24

ДФИФ (10~< М) 1,32

феррицианид (Ю-4 М) 1,45

ТМФД (104 М) 4,80

цито-.ром с FMN о-фенантролин (1мкМ) 0,60

цитохром с FMN о-фенантролин (2мкМ) 0,40

цитохром с FMN о-фенантролин (ЗмкМ) 0,30

Способность к взаимодействию с FMN и искусственными акцепторами электронов (феррицианидом, ДФИФ, ТМФД), тп-ибирование о-фенантролином (табл.2) - все эти свойства NADH:itirroxpoM с-редуктазы V.harveyi близки к •.свойствам NADfi-зависимых оксидоредуктаз других микроорганизмов (Pilkington et al„ 19Sl,Xu et al„ 1992).

Ингибирова1те активности о-фенантролином может, указывать на то, что ферментативная активность зависит от неготового железа или редуктаза имеет участок связывания хинона. Ингибированиё о-фенантролином описано также для ферментов из Microcystis aeruginosa (ЫАОРН:хинон-оксидоредуктаза), из Bacillus steavothermophilus и других микроорганизмов (Mains et al., 1980, Johnson, Kuby, 1985). ' . " -

Молекулярная масса NA D H: цитохром с-редуктазы, по данным гель-фильтрации на сефадексе Г-100 с белковыми стандартами, составляет 35,5±2 кД. Она близка, но не равна по величине молекулярным массам некоторых NADH:FMN оксидоредуктаз (Duane 1975, Jablonski 1978) из люминесцирующих бактерий и

■ О-

о

8

о

NADII:uiiT0xp0M с-редукт'азм, служащей компонентом диоксигеназной системы — нслюмннссцирующего Pseudomonas arviila (Imagauchi, Ftijisava, 1978). j

Имеются указания на мембранную локализацию NADH:miroxpoM с-редуиаз, относящихся к оксшсназиым системам; а также на связь с мембранами некоторых оксидоредукта.» люмипесцнрующнх бактерии. . , '•;•.-•*

Двукратное повышение выхода редуктазы при обработке ультразвуком гомогеиага клеток V.harveyi, получепиого осмотическим шоком, выделение редуктазы, снизанной, с цитохромом с (наблюдаемое в опытах | по фракцнопнровашцо клеточного гомогената сульфатом аммония, гель-фильтрацией и ИОХ), а также способность редуктазы^ связываться с гидрофобным носителем 8-

амнно-п-октнлссфарозсн 1В - все эти факУьТТЖТтдстельствуют-о- лнпофильноегк--'

'фермента. и, возможно, об ассоциации его с клеточными мембранами. j

Ь!АГ)П:ц|[Тохром с-редуктаза элюируется с 8-амнно-н-октнлсефарозы холатом натрия, а люцифераза - Тритоном N-101. Различия в сродстве к гидрофобному носителю были использованы для разделения редуктазы к люциферазы. " j

Таким образом, благодаря выделению и очистке МЛОН.цчтохром с-редуктазы охарактеризованы ее свойства: она напоминает, аналогичные ферменты, выделенные из других бактерий. Второй путь очистки редуктазы, включающий . гидрофобную хроматографию, позволил получить достаточное количество редуюазы для исследования взаимодействия се с люциферазон in vitro. - ! 1

2. Взаимодействие люциферазы и №АОН:Цитохром с-редуктазы V.harveyi in -

vrmo ' j i

Исследование чыаимодейстпкя люциферазы и редуктазы проводилось в двух вариантах опытов: в присутствии в среде инкубации , мембранной фракции бактериальных (слеток V.harveyi (субклеточных частиц) И в1 ИХ отсутствие. ; В первом варианте опытов й> присутствии частиц) люциферазная активность стимулировалась При добавлении очищенной редуктазы. i Непосредственно после смешивания суспензии мембран и редуктазы наблюдалось возрастание люцнферазшй активности в 1,7 раза (табл. 3). 1

Стимуляция биолюминесценции в -1,8-5 раз достигалась при инкубации мембран и редуктазы в течение 2-3 суток при 2-4 "С. j

.Таблица 3 Влияние добавленной NADH:nirrojcpoM с-редукт»зы на люциферазную актигяоеть мембратгкьи частиц V.hsr.'eyi.

Лкщнфсраяная актисибсть fOTYiOffftmie ü rcto'poAio)

ПОСЛО Г.МеГ1ИН:|Н1!Я КОМЦОПСНТОС " 1,7

-icpt-л t cvnc.i 1.3

чер-'л 2 срок ' 5,0

'ICptM 3 rviOK 4,8

'u p<-.'l 4 rVTOK 2j9

_ "По отношению к феррпцитохрому с как субстрату кинетические характеристики ферментной системы, состоящей из люциферазы и КАОНщитохром с-редуктазы, отличались от кинетических констант чистой редуктазы: величина лш для 'цнтохрома составляла 1,210,1мкМ у чистой редуктазы 5,0±0,4мкМ. у объединенной ферментной системы. - Максимальная скорость восстановления

цитохромА, с снижалась при объединении редуктазы с лгоциферазой. Изменения . констант связывания альдегида и FMN при совместной инкубации люцнферазы с редуктазой не происходит. .

Во втором варианте опытов исследовалось взаимное влияние очищенных препаратов ЫАП)Н:цитохром с-редуктя.чьт и .игцифгразы: активность люцнферазы возрастала в 7 раз в ответ на добавление седукт<см. В контрольном опыте к люциферазе добавляли обработанную нагрева шем 20-30кгш при 60 °С редуктазу, при этом тоже наблюдалось увеличен!"* тюичфсразноц активности, но не более, чем

'вдвое. ...... .. -

Величина-- эффекта ""стимуляци/7 зависела от соотношения редуктазы и "ТГюциферазы и от времени инкубации (рис. 2) Оптимальным являлось соотношение . редуктазы и люциферазы (по белку) примерно 20:1. Эффект сохранялся во времени.

' . Таким образом, можно заключить, что происходит взаимодействие NADH:mrroxpoM с-редуктазы И люциферазы, выражающееся в возрастании биолюминесцентной активности системы in vitro. Эффект более выражен в опытах • с мембранными частицами.

Для объяснения стимуляции лгоциферазпой активности можно предположить, что NADH:n¡rroxpoM с-редуктаза образует комплекс с лгоциферазой. Свободный FMNHj легко подвергается автоокислепип кислородом. Автоокисление FMNH2 предотвращается NADI'.nirroxt_-: с.-редуктазо'1, в результате чего FMNH2 используется в. люмиле сцецтной реакции.

То, что эффект стимуляции лгоциферззнои активности сохраняется во времени, свидетельствует, возможно, в пользу юаимной стабилизации активных ферментов, что бьпзо показано при реконструкции монооксигеназнмх систем микросом (Гузов и др., 1993).

NADH-зависимзя люминесценция при объединении NADH:unToxpoM с-редуктазы с люциферазой возрастает более чем в 50 раз, -что свидетельствует о реконструкции монооксигеназной цепи переноса электронов, питаемой электронами от NADH. Это объясняется тем, что NADH:miToxpoM с-редуктаза, катализируя окислите NADH и восстановление экзогенного FMN, снабжает люциферазу FMHH2.^

С 'известной осторожностью экстраполируя дащше, получешше in vitro и свидетельствующие о непосредственном взаимодействии люциферазы с NADH шитохррм.с-редуктазО)Т, на процессы in vivo, можно предполож!ггь, что в багсгериалышх "клетках прн изменении реркима аэрации происходит перераспределение потоков электронов между лгоциферазой и цйтохромом с, осуществляемое, при физическом контакте белков переносчиков электронов -люцнферазы и NADH:u!rroxpoM с-редуктазы.' 3. Влияние трансмембранного протонного граф >а па на люглинесценцию

клеток v.harvey1 и whsemm Известно, что трансмембранный градиент Н+, генерируемый при действии, электрон-транспортных цепей, оказывает влияние на скорость переноса электронов^ При снятии градиента Н+ разобщителями-протонофорами скорость дыхания бактериальных и митохондриальных мембран возрастает.

¿

>

Рис.2 Зависимость активности очищенной люцнферази от концентрация добавленной NADH:mrroxpoM с-редуктазы V.harveyi. Коицеитгацни Люциферазы 0,5иг/мл, концентрации редуктазы составлял!) в опытах 1-

S соответственно 1,0; 2.5: 5.0: 6.0; 10,0 и 12,0иг/ил.--—-

ууа^игстд - «срез 1ч после сигдшввния НШШИНШ " 1 сутки (—.....! - череа 2 суток

В настоящей работе исследовано влияние протоНофоров на-биолюминесценцию клеток V.harveyi и V.fischeri.

Рис.За показывает, что биолюминесценция клеток V.harveyi ингнбируется ПХФ, ХКФ и грамицидином D. На основании полученных нами результатов, а также анализа литературных дашых (Алам, 1982, Grogan, 1984, Малков', 1985, Wada et al., 1992, Simpson, 1993) можно полагать, что ингибирующее действие разобщителей-протонофоров ХКФ, ПХФ, и каналоформера грамицидина D в микромолярных концентрациях на биолюминесценцию клеток V.harveyi и V.fischeri обусловлено специфическим протонофорпым влиянием на мембраны i слеток. Это согласуется - с - полученными ранее (Малков, 1986) данными о том, что Тннгйбирующпе концентрации разобщителей ХКФ и ДПФ лп vitro на 2 порядка-выше, чем in vivo.

Ингибиругощге действие ХКФ и ПХФ снижается при увеличении рП среды.инкубации Клеток от 6,0 до 7,4. Это может быть обусловлено рН-зависимым изменением "протонофорной активности разобщителей, максимум которой соответствует их величинам рК.

При добавлении деканаля к клеткам, биолюминесценция которых подавлена разобщителем, наблюдался кратковременный всплеск биолюминесценции до начального уровня (обратимость ингибирования) (Рис. 36). Объяснением наблюдаемому явлению служит ранее высказанное предположение Грогана (Grogan, 1984) о том, что подавление мембранного синтеза АТР в результате разобщения является причиной- снижения синтеза субстрата люциферазы, альдегида, при участии ; ATP-NADPH-зависимого ферментного комплекса и как следствие этого'-наблюдается подавление биолюминесценции.

Таким образом^ влияние протонофоров на биолюминесценцию клеток может быть опосредовано системой биосинтеза алифатического альдегида, и, хотя в этих условиях стимулируется транспорт, электронов по мембранным электрон-транспортным цепям, биолюминесценция клеток ингибируется.

Кроме того, разобщители могут подавлять актсшность люциферазы, что было показано ранее (Малков, 1986) .

Другой способ создания условий, активирующих мембранные электрон-транспортные цепи, работа которых связана с генерацией градие!гта Н+, основан на создании искусственного "не запирающего" трансмембранного рН: наложение искусственной разности рН на мембране клеток путем их быстрого перевода из кнелойередыз-более-щелб'шую изотоническую среду.

В контрольном эксперименте было проведено исследование зависимости биолюминесценции in vivo от рН среды, в которой суспендированы клегки. Оно показало, что в диапазоне рН 6,0-8,0 в Tris-цитратном буфере с. 0 51М NaCl интенсивность биолюминесценции клеток V.harveyi меняется незначительно.

При быстром переводе меток .из буферного раствора с рН 7,0-8,0 в раствор с рН 6,0-7,0 (т.е. при создании искусственного "запирающего" трансмембранного градиент Н+) наблюдалось необратимое падение интенсивности

биолюминесценции (данные графически не показаны).

:Ют!1 ХК?

<1о1

5нчн-

А

ЮнкМПХЧ \

гр.В

«я*

Б

50X 2>СтМ • 38% <0,0

5 нин

¿&каналь * ■

- /— /V

^ ?ОнкМ,пк? ■ " ¿екрналь б^нкН

Рвс.З Илией, ныс бЕолзоиниссценцни (I) клеток У.ЬагуеуГври добавлении ХКФ, ПХФ

НИ ГраМНЦИДШЮ Р (гр.О). Клетки инкубировали в 200мМ буферном растворе фосфат? натрия с 0,51М КаС1 1Трн рНб,0 I опыте Л и при рН7,4 в опыте Б. 0 процентах отисчен остаточный уровень люминесценция. , '

Однако при быстрой переводе клеток из буферного раствора срН 6,0-7,0 в . раствор с pH 8,0, т.е. при создан™ искусственного "не запирающего" . траисмембранного градиента Н+, наблюдалось временное возрастание интенсивности биолюминесценции (рис. 4).

Итак, наложенный ДрН с ориентацией, способствующей выносу "Н+ из клетки, может стимулировать ее биолюминесценцию. 4. Влияние низкомолекулярных спиртов и нонола на биолюминесценцию

клеток.

Имеется много работ, посвященных исследованиям нарушемй, вызываемых -спиртами, особенно, этанолом, в мембранах, в частности, у микроорганизмов (Salguero et al., 1988, Wang Da-Cheng et al., 1993). Влияние"этанола исследовалось и на люминесцирутощих бактериях. Этанол - универсальный растворитель для гидрофобных соединений, анализируемых с помощью биолюминесцентных датчиков.

• Низкомолекулярные спирты подавляют люминесценцию светящихся - бактерий (Dickson* et al., 1984). Подавление люминесценции объясняли денатурацией люциферазы и ее комплекса с субстратом. . .

Для того, чтобы выяснить, действительно ли в бактериальных клетках мишенью • действия низкомолекулярных спиртов является непосредственно лгоцнфераза, нами был применен мембраиотропиый агент ионол, о котором известно, что он защищает клетки высших организмов от токсического воздействия этанола (Миненкова и др., 1985).

ИЛнол снижает ингибирующее действие изопропанола и. этанола на биолюминесценцию. ^леток (рис. 5); причем эффект зависит от концентрации нонола. В системе in - vitro (ЫАОН:РММ-оксидоредуктаза+люцифераза) такого эффекта .не обнаруживалось: наблюдалось аддитивное ингибирование биолюминесценции ионолом и спиртам!. . .

Таким образом, можно заключить, что в живых Клетках одной из мишеней действия мембранотропных "агентов (низкомолекулярных спиртов, нонола, и, как показано выше, ио^форов, каиалоформера грамицидина D), служит мембрана, опосредующая их влияние на биолюминесценцию.

Из' результатов экспериментов можно сделать вывод: для поддержания биолюминесценции " в живых клетках необходима структурно-функциональНая целостность клеточной .мембрапы. ' ' ~ ~ ""Ранее отмечалось, что подавление этанолом биолюминесценции происходит значительно сильнее,, чей дыхания (поглощения кислорода Клетками) (Kessler, 1968). Исходя из полученных в настоящей работе данных о взаимодействии NADH:mrroxpoM с-редукталы с люциферазой, чувствительность люминесцентной системы бактерий к этанолу можно объяснить ее большей зависимостью, но сравнению с дыхательной системой, от структурной целостнрсти мембраны.

I

5mkh,

........

Рис.4 Иикиснме бвсиозшшесцелщш (/) кдгтох V.harveyi, вызвмшое нзмеиышеи pH

среды инкубации

(200мМ-цтрапгый буф^р, содержащий 0.5*мМ NaCl) от 6,0 до 7,0 (а) йли до 7,8 (й,в) • при добавлении Tris-буфера (200мМ), содержащего 0,51М NaCl. Вертикальными стрелками указан момент измене:шя рН.

IS

&0 , [этанол] , , [кзопропана\]г \>'/

Рис.5 Влияпие нопола па ннгибнрованпе биолюминесценции клеток У.Кагуеу! этанолом

и изопропаполом (% от исходного уровня): а - зависимость остаючиой свстоэмиссии клеток от концентрации отанола; б - птанол+2* 10 5М ионола;

п - зависимость остаточной светоэмнссии клеток от концентральи чзощюпанота, г - изонропапол+1(НМ ионола.

¡Г,

выводы

1. Предложен метод выделения и очистки электрофор^тически | гомогенной ЫАОН:цитохром с-;редуктазьг из \ЧЬпо Ьагуеу!,} вклк^айщий | инкубацию бактериальных клеток в гипотонической среде, последующую ультразвуковую обработку, центрифушрование, осаждение с (ЫН^)з БО^, гель-фильтрацию, ИОХ и ЭФ в ПААГ. ,

2. Охарактеризованы свойства ЫАБНщитохром с-редуктазы из У.Ьагуеу!:; определена кажущаяся молекулярная масса нативного фермента, определены ИЭТ, Кт для ЫАОН и цитохрома с, активности с искусственными акцепторами электронов, опршумы рН для активности в различных буферных растворах н изучено влияние некоторых ингибиторов. ,

3. Установлено, ' что при объединении высокоочищенпых N А О Н: цит охром с-редуктазы и люциферазы У.ЬагУеу! возрастает активность, люциферазы и изменяются кинетические параметры редуктазы. Эти эффекты зарегистрированы как в буферном растворе, так и в суспензии мембран, выделенных из клеток У!Ьагуеу1. •

4. Показано, <:то разобщители окислительного фосфо^илирования ннгибируют биолюминесценцию клеток, действие разобщителей снижается при увеличении рН среды инкубации клеток У.ЬагУеу! от 6,0 до 7,5-8,0. Зарегистрировано изменение интенсивности биолюминесценции бактериальных клеток при искусственном наведении тренсмембранного протонного градиента на мембране.

5. Низкомолекулярные спирты иигибируют биолюминесценцию клеток У.Ьагуеу! и У.АэсЬеп. Иигибирующее действие спиртов снижается при добавлении ионола. Биолюминесценция в системе "дюцифераэа + ЫАВН^МЫ оксидоредуктаза" иьгибируется и сш.ртами, и ионолом: их вффекг аддитивен. Предполагается, что действие спиртов и ионола на биолюминесценцию клеток опосредовано клеточными мембранами.

/■?'.ггт-

ЫАО(Н)

ЫАПР(Ю

РМЫ

РМЫ(Н})

ИЭФ ■

ЦАЛГ

ИОХ

ХКФ ,

ПХФ

ДНФ

дтт _

ЦФИФ ТМФД

пат рк

нш'отинамидадешшдинуклеотид восстановленный никотинамидаден.щдинуклеотидфосфат восстановленный флавинмоноиуклеотид восстановленный лавинмоноиуклеотид изоэлектрофокусирование полиакриламидный гел^ иоиообменая хроматография М- хлоркарбонидфенилгндразоц пентахлорфенол динитрофенол дитиотреитол

2,6- дюслорфенолиндофеиол Ы.МХ.Ы'-тетраметил-п- фенилендиамив изоэлектрическая точка равновесная константа диссоциации

список райот» опуш11сова11нь1х ПО теме диссертации

1. Бокша И.С., Дшр'лои B.C., Егороп Н.С. Взаимодействие Цнтохрома с ч • „ бактериальной люциферазой./Биохимия',-1985."T.50,-Ñ{.-С.Í22-Í27 , ' ; 2. Бокша И.С. НАДН:цитохром с-редуктаза люминесцентной бактерий Beneckea (Vibrio) hafveyi. Деп.рутсонись ВИНИТИ N6014, 27авг.1984г., с.19-21

3. Бокша И.С., Мажуль М.М. Взаимодействие НАДН:цитохром с-редуктазы с суббактериальнымл частицами люминесцентных бактерий Vibrio harveyi.//Tc3ncw УНСъезда ВМО, 1985. т.2. о.25. "Наука" Казахстан, Алма-Ата. * '

■ 4. Бокша И.С., Данилов -В.С:;; Егоров Н.С. Ингибирование цитохромом с электрогпГО-трацспертнон Люмшесцентной цепи бактерий./Тезисы Конференции "Кинетика и механизм ■ электронного переноса в белковых системах и их ' моделях", 1985, апрель, с.89. Литва, Вильнюс.

; 5. Бокша И.С. Стимуляция активности люциферазы ферментом НАДН:цигохром с-редуктазой .из люминесцентных бактерий Beneckea (Vibrio) ЬагуеуУТруды IV . Всесоюзной межуниверситетской конференции по Биологии клетки ТГУ, Грузия, Тбилиси, 1985. с.97-98.

6. Бокша И.С.,. Данилов B.C., Лебедева Н.В. Биосенсор для. экрпресс-анализл ионов аммоний. //Ёиолопгческие nayKiñ'-Í992.-N5.-C.7t-77. ■7. Бокша ..И.С., Д aim лов B.C. {Биолгоминесцептный! . способ определения ионов. ..,' аммония в растворе. Заявка N 4802130/13 030306 16.03.90 Авт.Свид.1752766

бюл.К9229 05.11.92 '

. ,8¿ Бокша И.С.' Влияние спиртов и ионола на б астернальную биолюминесценцию. .//Биологические мембраны ,-1994,-r.ll.-Nl,rC.62-67.

2I.II.9£r> Объем. In; jsj 1gp. ICQ_Затг> 590 ''

•«•.•-. "Тшт:- Е7ДЩ: Орджоникидзе; 3 .. .

- . : '