Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Na, K-зависимая аденозинтрифосфатаза

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Na, K-зависимая аденозинтрифосфатаза"

I- • 'л ж 1 РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК

ИНСТИТУТ БИОХИМИИ им. А.Н. БАХА

На правах рукописи

ЛОПИНА ОЛЬГА ДМИТРИЕВНА

№,К-ЗАВИСИМАЯ АДЕНОЗИНТРИФОСФАТАЗА: МОЛЕКУЛЯРНЫЕ МЕХАНИЗМЫ РЕГУЛЯЦИИ АКТИВНОСТИ

(03.00.04 - биохимия)

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Москва, 1998

Общая характеристика работы.

Актуальность проблемы. Характерной особенностью живых клеток является их способность поддерживать в цитоплазме определенную концентрацию некоторых катионов, отличающуюся от их концентрации во внеклеточном пространстве. Обеспечивается это, с одной стороны, за счет низкой проницаемости клеточных мембран для катионов. Однако, в определенных условиях потоки ионов через мембрану значительно возрастают благодаря функционированию регулируемых ионных каналов. Эти катионные потоки, направленные по храдиенту концентраций, компенсируются благодаря работе так называемых ионных насосов, осуществляющих перенос катионов в противоположном направлении. Они представляют собой встроенные в мембрану ферменты (катион-транспортирующие АТФазы), сопрягающие перенос катионов с гидролизом аденозинтрифосфата.

Среди ион-транспортируюпщх АТФаз выделяют семейство родственных АТФаз Р-типа (Е1-Е2 типа), к которому относятся Иа,К-АТФаза, встроенная в плазматическую мембрану клеток животных, Н,К-АТФаза клеток слизистой оболочки желудка, Са-АТФаза плазматйчьской мембраны и мембраны эндоллазматического ретикулума, Н-АТФазы грибов и растений, а также некоторые АТФазы бактерий [1].

Все ион-транспортирующие АТФазы Р-типа содержат каталитическую субъединицу с молекулярной массой около 100 кДа, которая в процессе катализа подвергается циклическому фосфоршшрованию-дефосфорилированию по остатку аспарагиновой кислоты. Характерной особенностью АТФаз Р-типа является также наличие двух конформаций фермента, Е1 и Е2, которые различаются по сродству к переносимым катионам и последовательно сменяют друг друга в процессе каталитического цикла. Между отдельными представителями этого семейства наблюдается значительная гомология в первичной структуре каталитической субъединицы.

Одним из наиболее изученных представителей семейства АТФаз Р-типа является ИаД-АТФаза, обеспечивающая перенос ионов Ыа+ из клетки наружу, а ионов К+ - в обратном направлении. В составе ИаД-АТФазы обнаружено два типа субъединиц: а-субъединица (каталитическая) с молекулярной массой около 100 кДа и (З-субъединица, гликопротеид с молекулярной массой около 55 кДа (белковая часть имеет молекулярную массу около 30 кДа). Эта субьединица не принимает непосредственного участия в катализе, но оказывает влияние на свойства а-субъединицы и, по-видимому, необходима для правильного ее встраивания в мембрану после синтеза.

Каталитический цикл ^К-АТФазы описывается кинетической схемой, предложенной в середине 60-х годов и по имени авторов получившей название схемы Поста-Олберса. Схема удовлетворительно описывает основные экспериментальные данные, полученные при

Са,фосфолипид-зависимьши лротеинкиназами. Логика исследований требует установления самого факта фосфорилирования этого фермента под действием протешшшаз, а также изучения влияния фосфорилирования на ферментативную активность. Данные о возможном вовлечении неизвестных ранее белков, обладающих мелиттин-подобными детерминантами, в процесс передачи сигнала к Н,К-АТФазе слизистой оболочки желудка, ближайшей родственнице ЫаД-АТФазы, предполагает наличие других путей регуляции этих ферментов. Возможное участие таких белков в регуляции активности ион-транспортирующих АТФаз Р-типа подтверждается обнаружением ингибирующего действия мелиттина, амфипатического пептида из яда пчелы, на активность Ка,К~, Н,К- и Са-АТФазы саркоплазматического ретикулума, а также выявлением в центре связывания мелиттина последовательности, консервативной для всех АТФаз Р-типа. Таким образом, имеющиеся в настоящее время экспериментальные данные свидетельствуют, что активность ион-транспортирующих АТФаз может регулироваться! с использованием различных механизмов, которые в настоящее время недостаточно хорошо изучены.

Цель и задачи исследования. Цель настоящей работы заключалась в изучении механизмов регуляции активности Ыа,К-АТФазы с особым вниманием к регуляции, осуществляемой на уровне изменения четвертичной структуры фермента, а также в результате взаимодействия ЫаД-АТФазы с регуляторными белками. При выполнении работы были поставлены следующие задачи:

1. Установить, какие изоформы а- и р-субъединиц входят в состав Иа,К-АТФазы из солевых желез уток и провести сравнение его кинетических свойств со свойствами №,К-АТФазы из почек млекопитающих, представляющей собой изофермент а1р1-типа.

2. Сравнить четвертичную структуру и зависимости активности от концентрации АТФ для мембраносвязанной и солюбилизированной №,К-АТФазы, охарактеризовав взаимосвязь между субстратной зависимостью и четвертичной структурой фермента.

3. Для изучения характера кооперативное™, обнаруженной для субстратной кривой, исследовать связывание АТФ и его аналогов с мембраносвязанной №,К-АТФазой в широком диапазоне концентраций.

4. С использованием физических методов определить четвертичную структуру мембраносвязанной Ыа,К-АТФазы в присутствии различных концентраций АТФ и его аналогов.

5. Установить, фосфоршшруется ли Ыа,К-АТФаза под действием протеинкиназ А и С, а также выяснить, как фосфорилирование влияет на активность Ыа,К-АТФазы.

6. Для выявления потенциальных белков-регуляторов ион-транспортирующих АТФаз Р-типа, исследовать характер ингибирования

мелитгином, связываясь с центрами низкого сродства.

Разработан метод очисиси и впервые выделен белок, взаимодействующий с антителами на мелиттин и с ион-трансиортирукяцими АТФазами Р-типа.

Апробация работы. Результаты работы были представлены на Ежегодных Всесоюзных конференциях по транспортным АТФазам (Тарту 1980; Коктебель 1981), на XVI съезде Федерации Европейских биохимических обществ (Москва, 1984), на VI съезде Европейских нейрохимических обществ (Прага, 1986), на VI, VII, VHI, IX и X Объединенных симпозиумах биохимических обществ СССР и ГДР (Ваймар, 1979; Таллин, 1981; Рига, 1985; Йена, 1987; Ташкент, 1989), на V, VI, VII и VIE международных конференциях, посвященных механизму функционирования ИаД-АТФазы (Орхус, Дания, 1987; Вудс-Холл, США, 1990; Тудсмус, Германия, 1994; Мар-Дель-Плато, Аргентина, 1996), на Ежегодном 39 симпозиуме биофизического общества США. (Сан-Франциско, 1995), на П съезде Российского биохимического общества при РАН (Москва, 1997).

Публикации. Результаты работы представлены в 40 публикациях.

Объем и структура работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части (методы и материалы, результаты и их обсуждение), заключения, выводов и списка литературы (ссылок). В работе представлено рисунков и таблиц. Объем работы составляет страниц машинописного текста.

Экспериментальная часть.

Методы исследования. Основная часть работы проведена с использованием препарата Ка,К-АТФазы, полученного из солевых желез уток, выдержанных на диете с высоким содержанием NaCI [2]. Кроме того, в работе использовалась Ыа,К-АТФаза, полученная из почек собак по методу Йоргенсена [3], а также обогащенные активностью №,К-АТФазы фракции микросом из сердца морской свинки и мозга крыс, частично очищенный препарат Ыа,К-АТФазы из мозга крупного рогатого скота, фракция макросом из слизистой оболочки желудка, обогащенная Н,К-АТФазой, и фракция легкого саркоплазматического ретшсулума из скелетных мышц кролика, содержащая Са-АТФазу.

Белковый состав препаратов определяли методом ЭФ в ПААГ по Лэммли в присутствии ДДС. При проведении Вестерн-блот анализа белки, разделенные методом ЭФ, переносили путем блопинга на нитроцеллюлозные мембраны и обрабатывали специфическими антителами на соответствующие белки, а затем вторичными антителами, конъюгированными с пероксидазой, либо [U5I] протеином А., г

Определение N-концевых аминокислотных последовательностей а-и р-субьединиц очищенной ИаД-АТФазы из солевых желез утки проводили совместно с сотрудниками лаборатории профессора П.

80 раз.

Связывание [3Н]-уабаина с ИаД-АТФазой и ее №~зависимое фосфорилирование в присутствии [у-32Р]АТФ исследовали методом ультрафильтрации. Связывание АТФ и доугих нуклеотидов с препаратами ИаД-АТФазы регистрировали по вытеснешпо [у-32Р]АТФ при добавлении АТФ или аналогов нуклеотида с использованием метода проточного диализа [5]. Кроме того, связывание нуклеотидов изучали по изменению флуоресценции Ыа,К-АТФазы, ковалентно меченной флуоресцентной меткой 5-иодацетамидфлуоресцеином [6].

Протомерную форму ЫаД-АТФазы получали по методу Бразеруса и соавторов [7]. ЫаД-АТФазу, полученную в виде осадка после центрифугирования при 100 ООО солюбилизировали в растворе СцЕв-Эксперименты по. аналитическому центрифугированию проводили на ультрацентрифуге Весктап (модель Б),.. Образцы, содержащие белок, центрифугировали в двухсекторной ячейке при 48 ООО об/мин 1 ч. Движение белка регистрировали с помощью УФ-сканирующей системы при 280 им против раствора, не содержащего ИаДС-АТФазы. Коэффициент седиментации рассчитывали из графика, описывающего зависимость логарифма расстояния, пройденного белком, от времени центрифугирования.

Определение молекулярной массы мембраносвязанной Иа,К-АТФазы проводили методом радиоинактивации (метод молекулярной мишени), проверенным на большом количестве белков с известной молекулярной массой [8]. В работе использовали два тала источников энергии: линейный ускоритель электронов (установка Уолтона-Кокрофта, мощность излучения 2 Мрзд/мин) и "кобальтовую пушку" - б0Со-установку "ГУГ-120М" с мощностью 4. Мрад/мин - источник у-лучей. Облучение проводили в жидком азота и сухом льде с использованием поправочных коэффициентов 2,8 и 2, соответственно. Дозу радиации определяли с помощью дозиметра Фрике и контролировали с помощью внутреннего стандарта - фермента с известной молекулярной массой (алкогольдегидрогеназы), облучаемого параллельно.

Второй метод, использованный в работе для определения размеров молекулы Ыа,К-АТФазы - изучение временной зависимости затухания анизотропии фосфоресценции метки, ковалентно связанной с белком. В экспериментах использовали ИаД-АТФазу из солевых желез утки, меченную эозинизотиоцианатом (ЭИТЦ). Затухание анизотропии фосфоресценции регистрировали, используя лазерный фосфориметр, сконструированный в лаборатории Королевского колледжа Лондонского университета. Работа проводилась совместно с сотрудниками Лондонского университета профессором П. Квином и Д. МакСтеем. Фосфориметр соединялся с компьютером ШМ, с помощью которого проводилась регистрация и анализ полученных результатов. Образцы освещали вспышкой лазера ИО-УАв (длина волны 532 нм). Каждая кривая затухания анизотропии фосфоресценции была получена в результате 256 измерений в

мембраны примесных белков, 3) центрифугирование полученного , материала в градиенте плотности сахарозы. В результате использования обоих методов были получены достаточно чистые (более 90% чистоты по результатам ЭФ в ПААГ) мембранные препараты с высокой активностью №,К-АТФазы (максимальная активность около 30 мкмоль/мг белка в мин). Метод выделения ЫаД-АТФазы из почек млекопитающих получил широкое распространение, поэтому фермент из этого источника исследовался во многих лабораториях мира. В то же время изучению свойств фермента из солевых желез утки была посвящена лишь одна работа, в которой была определена чистота препарата (ЭФ в ПААГ), плотность уабаин-связывающих центров и Ыа-зависимых участков фосфоршгарования, а также Ы-концевая последовательность каталитической а-субъединицы (И аминокислот) [3]. Результаты этой работы свидетельствовали о том, что ИаД-АТФаза из солевых желез утки по некоторым свойствам отличается от фермента, полученного из почек млекопитающих. В частности, соотношение количества центров Независимого фосфорилирования и связывания специфического ингибитора уабаина для ИаД-АТФазы из солевых желез уток было равно 2, тогда как для ИаД-АТФазы из других источников, например, из почек млекопитающих, это соотношение составляет 1.

В 80-е годы было установлено, что как а-, так и (3-субъединица ИаД-АТФазы в различных тканях может быть представлена одной или несколькими изоформами (а1, ос2, аЗ и р1, Р2 и рЗ) в различных пропорциях [10]. По некоторым свойствам, например, то чувствительности к уабаину, ионам натрия, а также по молекулярной массе и электрофоретической подвижности изоформы каталитической субъединицы существенно различаются. Поскольку ЫаД-АТФаза из солевых желез отличалась от фермента, полученного из почек млекопитающих, было высказано предположение, что ферменты, полученные из этих тканей имеют различный изоферментный состав. В связи с этим мы сравнили основные свойства препарата Ыа,К-АТФазы из солевых желез утки со свойствами №,К-АТФазы, полученной из других источников.

На фотографиях, полученных с помощью электронного микроскопа, препарат ИаД-АТФазы из солевых желез утки выглядит так же, как щрепарат из медуллярного слоя почек млекопитающих: он представляет собой главным образом незамкнутые мембранные структуры, расположенные слоями. Отсутствие замкнутых везикул в препарате подтверждается тем, что соединения, увеличивающие проницаемость мембран (низкие концентрации детергентов, аламетицин, валиномищш), не влияют на активность №,К-АТФазы. Методом ЭФ в ПААГ в присутствии ДЦС в препарате выявляются белки с молекулярной массой около 100 и 55 кД (рис. 1, дорожка 1): в сумме эти два белка составляют от 90 до 95 % от общего количества белков препарата (результаты получены

активностью ИаД-АТФазы, методом ЭФ в ПААГ. После разделения белков был проведен Вестерн-блот анализ с идентификацией а-субъединиц с помощью антител, специфичных по отношению к а1- (рис. 1Б), а2- (рис. 1В) и аЗ- (рис. 1Г) субъединицам (использовались коммерческие антитела). Из рисунка видно, что в препаратах аксолеммы мозга, где присутствуют все типы а-субъединиц, белок с молекулярной массой около 100 кДа реагирует со всеми тремя типами антител (дорожка 3 на рис. 1Б, В и Г), тогда как во фракции микросом из серпа быка (дорожка 4) белок с такой молекулярной массой взаимодействует только с антителами на а1- и а2-субьединицы. В препаратах очищенной ИаД-АТФазы из почек собаки и солевых желез утки а-субъединица реагирует только с антителами на а1-изоформу.

Использование методов генной инженерии позволило в конце 80-х годов установить первичную структуру изоформ а- и Р-субъединиц АТФазы. Существенные различия в первичной структуре отдельных изоформ были обнаружены в Ы-кондевом фрагменте обеих субъединиц [10]. Совместно с сотрудниками лаборатории профессора П. Джонсона (Университет штата Огайо, Афины, Огайо) мы провели определение концевой аминокислотной последовательности а- и Р-субъединиц Ыа,К-АТФазы из солевых желез утки. Эти результаты в сравнении с данными о М-концевой аминокислотной последовательности трех изоформ а-субъединицы Ыа,К-АТФазы крысы представлены на рис. 2.

Утка(1) вИОКУЕРТА? в - ЕНбУК

Утка(2) вЯИКУЕТТА ? в - Е

Крыса, «1 ОЬВКУЕРААУ Э - Е Н б О К

Крыса, о2 в К Е I У в РААТ ТАЕ - N00

Крыса, аЗ КОЕК .........в в

Рисунок 2. И-концевые аминокислотные последовательности а-субъединицы Ыа,К-АТФазы из солевых желез утки и различных изоформ этой субъедицы из крысы. Утка (1) - собственные данные, утка (2) - данные Хопкинса и соавторов [2]. Данные о И-концевой последовательности изоформ а-субъединицы из тканей крысы взяты из обзора Свиднер [10].

Из рис. 2 видно, что И-концевая аминокислотная последовательность а-субъединицы ИаД-АТФазы из солевых желез утки (16 аминокислотных остатков) имеет значительное сходство с >1-концевой аминокислотной последовательностью а1-изоформы крысы. По сравнению с Л-концевой последовательностью а1-изоформы в а-субъединице №,К-АТФазы из солевых желез утки обнаруживаются различия лишь по двум аминокислотным остаткам (аланин в 8-м положении заменен на треонин, а аспарагиновая кислота в 15-м положении - на валин). В то же время по сравнению с Ы-концевой последовательностью а2-изоформы крысы в №

Б

90 150

[NaCI], мМ

30 [KCl], мМ

2000

•3 1500

1000

10 20 [NaCI], мМ

Рисунок 4. А — зависимость активности Ыа,К-АТФазы из солевых желез утки (о) и мозга быка (•) от соотношения ионов Na+ и К+ в среде инкубации, Б - зависимость активности ИаД-АТФазы из солевых желез утаи (о) и почек собаки (•) от концентрации NaCI в присутствии 10 мМ KCl.

сравнительное исследование кинетических свойств фермента из этого источника. Сравнение чувствительности Ыа,К-АТФазы из солевых желез утки, мозга, сердца и почек к ионам натрия и специфическому ингибитору фермента уабаину подтвердило, что ИаД-АТФаза из этого источника содержит а 1-субъединицу. Так, из сравнения зависимости активности Ыа,К-АТФазы из солевых желез утки и мозга быка от соотношения ионов ЫаиКв среде следует, что фермент из солевых желез утки имеет более высокую чувствительность к Ыа+ по сравнению с ИаД-АТФазой из мозга быка (рис. 4А). Известно, что препараты №,К-АТФазы из мозга содержат значительные количества ой- и аЗ-изоформ фермента, менее чувствительных к ионам Иа+. Чувствительность ЫаД-АТФазы из почек собаки и солевых желез утки к Иа* практически одинакова: зависимость активности от концентрации №+ в присутствии 10 мМ КС1 описывается в обоих случаях сигмоидой со величиной Ко,5 около 5 мМ (рис. 4Б).

Ыа,К-АТФаза из солевых желез утки и почек собаки имеет также одинаковую чувствительность к уабаину: кривые связывания уабаина для обоих препаратов почти идентичны и характеризуются Кд=10"6 М. Зависимость ингибирования ИаД-АТФазы из солевых желез утки от концентрации уабаина также однофазна с Ьо, близкой к Кд (около 10"6 М, рис. 5А). Таким образом, Иа,К-АТФаза из солевых желез утки, как и фермент из почек собаки, содержащий а1-субъединицу, имеет один тип уабаин-связывающих центров с низким сродством к ингибитору. В то же время в препарате мшфосом из сердца морской свинки, где по литературным данным присутствуют две изоформы а-субъединицы (а1 и а2) было выявлено два типа уабаин-связывающих центров с величинами

Таблица 1. Плотность активных центров №,К-АТФазы и число их оборотов в препаратах фермента из почек собаки и солевых желез утки.

Солевые железы Почки собаки

Максимальная скорость (мкмоль/мин мг белка) 26,7 ±0,5 26,0 ± 0,8

Количество уабаин-связывающих центров (нмоль/мг белка) 2,70 ±0,02 2,78 ± 0,03

Количество центров Независимого фосфорилнрования (нмоль/мг белка) 2,68 ± 0,02 2,55±0,05

Число оборотов фермента (мин-1) 9965 9756

г ° 1500-1 S с ш ® 10005 ¡Е '. g 500- о 5 ьй 2 0 _

I-1-1-1-1-1-1-1-1

О 0,5 1,0 1,5 2,0

концентрация АТР, мМ

Рисунок 6. Зависимость активное™ ИаД-АТФазы из солевых желез утки и почек собаки от концентрации АТФ. Представление кривой с промежуточным плато в ввде суммы гиперболы и сигмовды: 1 -гиперболическая составляющая; 2 - сигмоидальная составляющая.

2. Зависимость активности №.К-АТФазы от концентрации субстрата.

Каталитический цикл Ыа,К-АТФазы описывается схемой, предложенной в начале 60-х годов (схема Поста-Олберса). По мере появления новых экспериментальных данных в схему вносились дополнения и уточнения, однако принципиальных изменений она не претерпела. Здесь излагается одна из версий этой схемы [12].

В процессе каталитического цикла происходят изменения

активности Ыа,К-АТФазы от концентрации АТФ должна описываться гиперболой. Однако, большинство исследователей сообщает, что зависимость активности №,К-АТФазы от концентрации АТФ в координатах Лайнуивера-Берка имеет вид двух пересекающихся прямых (отрицательная кооператавностъ). Для объяснения такой формы субстратной зависимости были предложены следующие гипотезы: 1) присутствие в препаратах фермента двух изоформ с разным сродством к АТФ; 2) наличие алпостерического центра для АТФ с низким сродством к нуклеотиду. Первое объяснение оказалось несостоятельным, поскольку установлено, что сложная зависимость активности от концентрации АТФ характерна для очищенных препаратов фермента, содержащих только а1-изоформу. Второе объяснение до недавнего времени не имело достаточных экспериментальных доказательств. В середине 70-х годов Кантли и соавторы предложили модификацию схемы Олберса-Поста, объясняющую отрицательную кооперативность по субстрату на основе релаксационной кинетики [13]. Модификация заключалась во введении нескольких постулатов: 1) Е1-конформация фермента характеризуется высоким сродством к АТФ, а Е2 - низким; 2) Е2-Е1 переход в каталитическом цикле является скорость-лимитирующим; 2) связывание АТФ с центром низкого сродства, расположенным на Е2-конформации, ускоряет Е2->Е1 переход. Ускорение Е2-Е1 перехода за счет связывания АТФ в центре низкого сродства было подтверждено экспериментально [14].

Несмотря на то, что схема Кантли хорошо описывает субстратную зависимость с отрицательной кооперативностью, имеется ряд результатов, не согласующихся с этой схемой. В частности, в соответствии со схемой Кантли №,К-АТФаза функционирует как протомер ар. К сегодняшнему времени, однако, имеется большое количество данных, свидетельствующих о том, что №,К-АТФаза является олигомером типа (оф)ц, где п=2 или 4, со взаимодействующими а-субъединицами [15]. Кроме того, график Скэтчарда для связывания АТФ с №,К-АТФазой в присутствии К+ не является линейным [16], что противоречит схеме Кантли, поскольку свидетельствует о возникновении отрицательных, кооперативных взаимодействий между АТФ-связывающими центрами уже на уровне связывания субстрата.

Теоретический анализ субстратных кривых, имеющих промежуточное плато, показывает, что в этом случае фермент должен иметь более, чем два типа субстрат-связывающих центров [17]. С позиций стационарной кинетики промежуточное плато может объясняться наличием трех мест присоединения субстрата к одному белку, находящемуся в различных конформационных состояниях на разных стадиях цикла. Зависимость с промежуточным плато может проявляться при функционировании олигомерного фермента с числом взаимодействующих активных центров не менее трех, когда в процессе насыщения активных центров кооперативные взаимодействия сначала носят отрицательный, а затем положительный характер [18]. И, наконец,

0,10- у

а °'ов:

0,02- Г 1/АТР

1 у\ Г1 1 1 11 1 1 м |

>1 0 1 2 3 4 5

Р1/мг белка ч ж*

0,20-

Б

Г

£

концентрация АТР, ММ

-1-

воо

аао

1/АТР

-1 о 1 ГТТ1

«0-

мкмоль Р1/мг белка ч

/ I

_концентрации АТР. мМ

5 2&0 *00 ' ©¿О ' 800 100»

Рисунок. 7. Зависимость активности ИаД-АТФазы от концентрации АТФ для мембраносвяз энного (А) и солюбилизированного (Б) фермента. Вставки: график Лайнуивера-Берка для обозначенной кружком области концентраций АТФ (0,2-50 мкМ) для мембраносвязанной (слева) и солюбшшзированной (справа) ЫаД-АТФазы.

солюбилизация, приводящая к сохранению только протомерной формы фермента (оф), устраняет сигмоидальную компоненту, но не устраняет отрицательную кооперативное», можно полагать, что отрицательная кооперативность характерна для протомера. Положительная кооперативность по субстрату, наблюдаемая в области высоких концентраций АТФ как сигмоидальная составляющая кривой, является, по-видимому, результатом взаимодействия протомеров в олигомерном комплексе ИаД-АТФазы, присутствующем в мембраносвязанной препарате фермента.

Тот факт, что субстратная зависимость для протомерной формы ИаД-АТФазы (оф) представляет собой кривую с отрицательной кооперативностью, можно объяснить либо тем, что протомер помимо гидролитического центра содержит еще аллостерический центр для АТФ, либо тем, что протомер гидролизует АТФ в соответствии со схемой Кантли, и наблюдаемая отрицательная кооперативность является кинетической.

300-

100"

увеличение концентрации АТФ сопровождается ростом интенсивности флуоресценции, имеющим сигмоидальный характер и достигающим максимума при концентрации АТФ около б мМ (рис. 9).

Рисунок 8. Влияние различных концентраций ионов К+ и АТФ на флуоресценцию ЫаД-АТФазы, модифицированной ИАФ.

Чтобы убедиться, что флуоресцентный метод адекватно характеризует связывание АТФ, мы сопоставили кривую, описывающую связывание АТФ и полученную флуоресцентным методом, с кривой, описывающей связывание с ферментом [у-32Р]АТФ. Для изучения связывания радиоактивной АТФ с очищенной Ыа,К-АТФазой из солевых желез утки мы использовали метод проточного диализа [5]. В силу того, что в экспериментах такого рода допускается ограниченное разведение радиоактивного соединения немеченым лигандом, мы разбили весь диапазон концентраций АТФ (0,2 мкМ - 2 мМ) на три части (0,2-10 мкМ, 10-100 мкМ и 100-2000 мкМ) и исследовали связывание АТФ в каждом диапазоне концентраций в отдельном эксперименте при одинаковой удельной радиоактивности нуклеотида. Совмещение трех полученных частей кривой проводилось на основе значений, полученных для крайних и повторяющихся концентраций в каждом диапазоне (например, связывание АТФ при концентрации 10 мкМ исследовалось в 1 и 2 диапазоне,

С использованием флуоресцентного метода мы изучили также связывание высоких концентраций ЛТФ с натриевой конформацией фермента. Из литературы известно, что в диапазоне концентраций 0,2-10 мкМ на натриевой конформации фермента обнаруживается только один тип участков связывания нуклеотида. Однако при добавлении АТф к На,К-АТФазе, модифицированной ИАФ, мы наблюдали рост , интенсивности флуоресценции » области концентраций АТФ 1-8 мМ, причем зависимость флуоресценции от концентрации нуклеотида имела сигмоидальный характер. Эти данные свидетельствуют о том, что центры низкого сродства к АТФ с положительными кооперативными взаимодействиями между ними присутствуют и на натриевой конформации КаДС-АТФазы. Более подробный анализ области низких концентраций АТФ (0,2-10 мкМ) с использованием [у-32Р]АТФ подтвердил литературные данные о нелинейности графика Скэтчарда для №,К-АТФазы в присутствии ионов калия (рис. 10). Однако, мы обнаружили также, что нелинейным является и график Скэтчарда для связывания АТФ с натриевой конформацией фермента (рис. 10).

Рисунок 10. График Скэтчарда для связывания АТФ с ИаД-АТФазой в присутствии КС1 ( О - 1 мМ, о - 10 мМ) и в присутствии 50 мМ №С1 ( • ). Концентрация АТФ изменялась в диапазоне 0,2-10 мкМ. Эксперименты проводились с использованием метода проточного диализа и [у-32Р]АТФ.

Таким образом, кривую, описывающую связывание АТФ с калиевой и натриевой конформацией ИаД-АТФазы, как и зависимость активности ИаД-АТФазы от концентрации АТФ, можно представить в виде суммы кривой, характеризующейся отрицательной кооперативжгстъю, и сигмоиды. Это свидетельствует о том, что и калиевая, и натриевая

Сравнение структуры азотистого основания АТФ (АДФ) и ЦТФ (см. рис. 11), кривые связывания которых с №,К-АТФазой характеризуются промежуточным шито, со структурой азотистых оснований других нуклеотидов показывает, что хотя АТФ и АДФ содержат пуриновый цикл, а ЦТФ - пиримидиновый, они имеют определенное структурное сходство, а именно: аминогруппу в шестом положении иуринового цикла (в четвертом-пиримидинового) и расположенный рядом непротонировашшй при нейтральных рН атом азота (первый атом азота пуринового цикла или третий атом азота пиримидинового). Поскольку АДФ связывается со взаимодействующими центрами низкого сродства почти так же хорошо, как АТФ, а АМФ не связывается с ними вообще ;(или, связываясь, не обеспечивает взаимодействия между центрами), можно предполагать, что для связывания с центром низкого сродства или для проявления взаимодействия между протомерами необходимо наличие минимум двух фосфатных остатков в концевой части молекулы, АТФ. Однако метилен-АТФ, имеющий три фосфатных остатка в терминальной части молекулы, практически не связывается со взаимодействующими центрами низкого сродства, поэтому можно заключить, что в связывании с этими центрами важную роль играет атом кислорода, находящийся в молекуле АТФ между ¡1 и у атомами фосфора.

Рисунок 11. Структура АТФ и его аналогов. 1- окси-АТФ; 2 - метокси-АТФ; 3 - карбоксиметокси-АТФ.

В связывании с центрами высокого сродства важную роль играет наличие в молекуле субстрата пиримидинового цикла - ЦТФ связывается с центрами высокого сродства намного хуже, чем АТФ. АДФ также

как и концентрации, обеспечивающие этот эффект (10-20 мкМ), сравнимы с таковыми для АТФ. Активирующий эффект ЦТФ менее выражен (около 60% от эффекта АТФ) и обеспечивается при более высоких концентрациях. Неспособный протонироватъся метокси-АТФ вообще не активировал фосфатазную реакцию. Эти данные подтверждают, что наличие протонированнош азота в первом положении пуринового кольца играет важную роль в связывании с АТФ с центром высокого сродства. Известно, что переход фермента из калиевой конформации в натриевую происходит с потерей,,;протона [19]. Возможно, атом азота, находящийся в первом положении пуринового цикла молекулы АТФ, связанной с ферментом, принимает участие в акцептировании этого протона, облегчая таким образом переход фермента в другую конформацию.

4. Четвертичная структура мембраносвязанной Ка,К-АТФазы.

Определение четвертичной структуры (молекулярной массы) мембраных белков представляет собой сложную экспериментальную задачу, поскольку использование классических методов, применяемых для растворимых белков (седиментационный анализ, гель-фильтрация), в этом случае вызывает значительные затруднения. Для определения четвертичной структуры мембраносвязанной №,К-АТФазы мы выбрали два метода: определение молекулярного размера мишени с использованием метода радиоинактивации и измерение вращательной подвижности молекулы фермента в мембране, которое осуществляется путем анализа кривой, описывающей затухание во времени анизотропии фосфоресценции метки, ковалекгно связанной с ферментом.

Метод радиоинактивации основан на том, что при прохождении пучка частиц высокой энергии через биологический образец происходит поглощение энергии молекулой фермента и ее ионизация, приводящая к разрушению молекулы и к ингибированию активности. Вероятность столкновения частицы с молекулой фермента зависит от размеров последней. Величина остаточной ферментативной активности экспоненциально зависит от дозы облучения (А=А„ е ~то, где V - объем молекулы, чувствительный к облучению, а О - доза радиации). При соблюдении некоторых ограничений график, описывающий зависимость логарифма остаточной активности от полученной дозы радиации, представляет собой прямую линию. Зная дозу радиации, вызывающую снижение активности до 37% от исходной величины, можно с использованием эмпирической формулы рассчитать объем и массу молекулы фермента.

Используя метод радиоинактивации, мы определили размеры Ыа,К-АТФазы при пиролизе АТФ и ЦТФ, двух субстратов этого фермента, зависимость скорости , гидролиза и связывания которых от их концентрации характеризуется кривой с промежуточным плато. Кроме того, была определена молекулярная масса фермента, находящегося в

радиоинактивации определяется не молекулярная масса всего протомера, а только молекулярная масса входящей в его состав каталитической субъединицы, поскольку разрушение Р-субъединицы не влияет на активность фермента. Известно, например, что полный, , гидролиз р-субъединицы папаином не сказывается на активности Na,K-AT<j^t3bi [21].

Таким образом, метод радиоинактивации показал, что гидролиз низких и высоких концентраций АТФ осуществляется структурами, которые по молекулярной массе различаются в 1,6 раза, что подтверждает нашу гипотезу о участии олигомерной формы №,К-АТФазы в гидролизе высоких концентраций АТФ.

Известно, что изменение микровязкости липидного бислоя (микроокружения мембранных белков) может оказывать влияние на степень их олигомеризации. Одним из факторов, влияющих на микровязкость бислоя, является температура. Используя метод радиоинактивации, мы обнаружили, что снижение температуры увеличивает молекулярную массу Ыа,К-АТФазы. Размер молекулярной мишени увеличивается от 200 кДа (при 37°) до 330-360 кДа (при 8°), причем резкое изменение молекулярной массы наблюдается при температурах ниже 18-20°, в области которых выявлены существенные перестройки в липидном бислое препарата ИаД-АТФазы.

Вторым методом, который был использован для выяснения олигомерной структуры ИаД-АТФазы в различных конформационных состояниях, является метод, позволяющий регистрировать затухание анизотропии фосфоресценции метки, ковалентно связанной с Na,K-АТФазой.

Регистрация кривой затухания анизотропии фосфоресценции с высоким временным разрешением позволяет определить вращательную подвижность белков в мембране. Для использования этого подхода необходимо включить в молекулу белка фосфоресценгную метку, имеющую большое время жизни возбужденного состояния. С этой целью чаще всего используются производные эозина или эритрозина. Если метка связана с вращающейся частицей, то после поглощения возбуждающего поляризованного света она успеет изменить свое положение в пространстве до излучения фосфоресценции. Поэтому излученный свет' в разные моменты времени буйт иметь разную интенсивность в плоскостях, направленных параллельно и перпендикулярно плоскости поляризации возбуждающего света. В " силу* ' этого : интенсивности параллельно и перпендикулярно поляризованного излученного свста во времени будут меняться так, что анизотропия фосфоресценции r(t); рассчитываемая по следующей формуле, будет уменьшаться во времени экспоненциально.

- m-J©h

r(t) I(t)v +21ф!>,1. где I(t)v и I(t)h есть значения интенсивностей фосфоресценции в момент времени t после возбуждения, наблюдаемые через поляризатор, ориентированный параллельно (v) и перпендикулярно (h) по отношению к

движение протомерной и олигомерной формы ИаД-АТФазы. Поскольку в 50% растворе глицерина, который существенно замедляет движение мебранных фрагментов, параметры, характеризующие вращательную подвижность быстрой и медленной компонент, не изменялись, можно думать, что подвижность мембранных фрагментов не вносит вклад в движение метки. В 2% растворе детергента С12Е9, исчезает остаточный компонент, и кривая затухания анизотропии в большинстве случаев хорошо описывается одной экспонентой. Эти данные свидетельствуют в пользу того, что быстрая и медленная компоненты кривой, описывающей затухание анизотропии фосфоресценции, принадлежат протомерной и олигомерной формам фермента, соответственно.

Таблица 3. Параметры, характеризующие подвижность ИаД-АТФазы, меченой ЭИТЦ, в натриевой и калиевой конформации при температуре 20°.

Конформация Ф](мкс) Фг(мкс) а] а2 к

е1 (натриевая) 14 190 0,68 0,05 ОД 5

Е2(калиевая) 16 260 0,72 0,12 0,16

Рисунок 13. Кривая затухания анизотропии фосфоресценции На,К-АТФазы, меченой ЭИТЦ, в присутствии ЫаС1 при рН 7,0 и температурах 2 (1), 20 (2) и 42° (3). Точки соответствуют данным измерения, кривые проведены в соответствии с двухкомпонентной экспоненциальной зависимостью.

Мы провели измерение вращательной подвижности Ыа,К-АТФазы, меченой ЭИТЦ, в среде с и К+ при различных рН. Известно, что изменение рН среды от 6,0 до 8,5 незначительно влияет на микровязкость липидного бислоя, а направлено главным образом на ¡информацию фермента. Ранее было показано, что защелачивание среды» способствует переходу фермента из конформации Е2 в Е1 (из калиевой конформации в

изменяется как при переходе из El в Е2-конформацию, так и для одной конформации при изменении рН, причем повышение рН увеличивает радиус натриевого конформера, но уменьшает размеры калиевого конформера. Это означает, что изменение рН может по-разному влиять на олигомеризацию натриевой и калиевой конформации фермента. В результате при рН 6,0 радиус калиевого конформера оказывается значительно большим, чем радиус натриевого конформера. В то же время при рН 8,5 радиусы олигомеров в обоих конформациях примерно одинаковы (радиус составляет 9,3 нм для натриевой формы и 9,7 нм для калиевой).

Добавление АТФ в различных концентрациях незначительно влияет соотношение между популяциями вращающихся частиц и на их размеры.

Полученные нами данные по изучению вращательной подвижности №,К-АТФазы показывают, что в мембранном препарате №,К-АТФазы в среде с ионами Na, К и АТФ присутствуют два типа частиц с различной вращательной подвижностью. Рассчитанный радиус медленно вращающейся частицы соответствует размеру протомервдй формы Na,K-АТФазы, а медленно вращающиеся частицы представляют собой, по-видимому, олигомерную форму фермента.

5.Фосфорилирование На.К-АТФазы из солевых желез утки под действием цАМФ-зависимой и Са.Фосфолипид-зависимой протеинкиназы. Влияние фосфорилирования на активность фермента.

Многочисленные экспериментальные данные свидетельствуют, что in vivo активность №,К-АТФазы изменяется под действием физиологически активных соединений, являющихся активаторами протеинкиназ А и С - цАМФ и форболовых эфиров [24]. Это позволило предположить, что обе протеинкиназы могут фосфоршшровать Na,K-АТФазу, влияя при этом на ее активность. Действительно, преинкубация очищенной ИаД-АТФазы из солевых желез утки и почек собаки с цАМФ-зависимой протеинкиназой и [у-згР]АТФ в присутствии 0,1-0,4% растворов детергентов (тритон Х-100, Луброл WX, CHAPS, и-октилглюкозид) сопровождалось включением 32Р в а-субъединицу Иа,К-АТФазы (рис. 14А, дорожка 4). Включение метки в а-субъединицу не наблюдалось, если в среде инкубации отсутствовали цАМФ, протеинкиназа А или детергент (рис. 14А, дорожки 5, 2, 3 соответственно). (З-Субъединица ИаД-АТФазы протеинкиназой А не фосфорилируется. Стехиометрия фосфорилирования а-субъединицы увеличивалась в том случае, если проводилось фосфорилирование неактивного фермента, например, стехиометрия фосфорилирования в присутствии 0,2% тритона Х-100, который полностью инактивирует фермент, была значительно выше, чем в среде с 0,4% CHAPS, который в меньшей степени влияет на ферментативную активность. Сравнение уровня АТФ в среде инкубации в конце эксперимента показало, что в том случае, если фермент инкубировался в

CHAPS сопровождается прогрессивной потерей активности ИаД-АТФазы: при стехиометрии фосфорилирования 0,5 моль/моль а-субъединицы наблюдается 50% ингибирование активности Ка,К-АТФазы.

Преинкубация №Д-АТФазы с Са,фосфолипид-зависимой гфотешшшазой и [у-32Р]-АТФ также приводит к включению метки в а-субъединицу фермента (рис. 14Б, дорожка 3). р-субъединица протеиякиназой С не фосфоридаруется. Включеше .метки происходит только в том случае, если в среде инкубации присутствует Са 2+ (рис. 14Б, сравнить дорожки 2 и 3). Добавление .ааолектина (фосфолидид из^ соевых бобов) несколько увеличивает интенсивность- фосфорилирования, однако оно осуществляется и в его отсутствие (рис. 14Б, дорожки 3 и 4). Этот факт, во-видимому, объясняется присутствием в препарате эндогенных фосфолятгадов. Протеинкиназа С фосфорилирует а-субъединицу Na,K-АТФазыг '-более с интенсивно , вн . том случае, если фермент был преинжубирован с- уабаином, нежели в среде без уабаина и в присутствии ионов NabMg^ й К . Сравнение концентрации АТФ в конце эксперимента в этих двух пробах подтверждает, что разница в стехиометрии фосфорилирования объясняется потреблением АТФ в процессе инкубации активной №,К-АТФазой.

Протеинкиназа С, как и протеинкиназа А, фосфорилирует остатки серина и треонина а-субъединицы ШД-АТФазы из солевых желез утки. Максимальная стехиометрия фосфорилирования ИаД-АТФазы протеинкиназой С составляет около 1 моль/моль а-субъединицы фермента. Фосфоршшрование Na.K-АТФазы со стехиометрией 0,5 моль/моль вызывало 40% потерю ферментативной активности.

6. Ингибирование Na.K- и Са-АТФазы мелиттином. выделение мелиттин-подобного белка и изучение его взаимодействия с ион-транспортирующими АТФазами.

Мелиттин - 26-членный пептид из яда пчелы, имеющий структуру амфипатической а-спирапи, способен реагировать с липидными бислоями, существенно изменяя как их физико-химические свойства, так и свойства интегральных мембранных белков. Мелиттин вызывает агрегацию белка полосы 3 эритроцитов, бактериороДопсина и Са-АТФазы саркоплазматического ретикулума. Кроме того, этот пептид специфически взаимодействует со многими белками: протеинкиназой С, фосфолипазой А2, киназой легких цепей миозина [26]. Эти данные позволили предположить, что мелиттин имитирует белковый модуль, присутствующий во многих белках и принимающий участие в белок-белковых взаимодействиях. С использованием антител против мелиттина методом иммуноаффинной хроматографии был выделен 28 кДа активатор фосфолипазы А-2, С-концевая часть молекулы которого представляет собой мелиттин [27].

Мелиттин ингибирует по крайней мере три АТФазы Р-типа: Na,K-

Кривые, описывающие развитие шггибирующего эффекта мелиттина на Na,К- и Са-АТФазу во времени, мохуг быта представлены в виде суммы двух экспонент. Анализ кривых ингибирования показывает, что быстрая фаза ингибирования обеих АТФаз является неполной, ее вклад при нейтральных рН составляет около 50%. Значения констант скоростей ингибирования для быстрой и медленной фаз при рН 7,0 равны соответственно 1,62 и 0,15 мин"1 для Ыа,К-АТФазы и 1,17 и 0,10мйн1 для

Са-АТФазы. .....

АТФ защйщает обе АТФазы от ингибирования мелитгином (рис. 15); заидатное действие АТФ на №,К-АТФазу связано с уменьшением константы скорости ингибирования в быстрой фазе: нри ¡повышении концентрации • чфслеотида в диапазоне 0,3-1,0 мМ константа скорости ингибирования в бйстрой фазе снижается почти в 10 раз й тшгибирование становится однофазным. В случае Са-АТФазы защитный эффект АТФ также направлен на быструю фазу ингибирования: при повышении концентрации АТФ доля активности, ингибируемой в быстрой фазе уменьшается, и ингибирование также становится однофазным. Для обеих АТФаз защитный эффект АТФ обусловлен его связыванием в центре

злектрофпреграмма авторадиограмма

М.М. кДа

-200-

i ; у: -Ш-

i ; -97-

1 É -66-

!| -4S-

* ш

SS i

12 3 4

I 2 3

! J

И

4

флуоресценция 51

0 -5 -10 -15 -20

К*

Na+ МПБ

itfiwH

МПБ

NaT

VulAWJ

Рис. 16. Выделение мелиттин-подобного белка из слизистой оболочки желудка кролика (А) и его влияние на флуоресценцию Н,К-АТФазы, модифицированной флуоресцеинизотиоцианатом (Б). 1 - фракция микросом из слизистой оболочки желудка кролика, 2 и 3 -супернатант и осадок после обработки этой фракции п-октилглюкозидом, 4 мелиттин--подобный белок, полученный после аффинной хроматографии фракции 3. Белки окрашены серебром.

только протомерная форма, также демонстрирует отрицательную кооперативностъ по связыванию АТФ - позволяет полагать, что отрицательная кооперативностъ, характерная для протомера, есть результат взаимодействия двух центров связывания АТФ, расположенных на протомере. Эти рассуждения приводят к заключению, что на протомерной форме фермента должен существовать аллостерический центр связывания АТФ.

Мы предполагаем, что лиганды, в присутствии которых происходит измерение активности, (АТФ в различных концевгграциях, Mgí+, Иа+ и К+ при их постоянном соотношении) не влияют на переход протомера в олигомер и обратно. Однако изменение других факторов, например, температуры, рН, а также изменение состояния лшщдного микроокружения может изменить соотношение между протомерной и олигомерной формой фермента, что приведет к изменению характера субстратной кривой. Высказанное нами предположение о том, что фермент присутствует в мембране в виде совокупности протомерной и олигомерной форм подтверждается данными по определению четвертичной структуры НаД-АТФазы.

Полученные нами результаты свидетельствуют, что характер положительных кооперативных взаимодействий зависит от структурных особенностей молекулы АТФ: дли связывания АТФ или проявления положительных кооперативных взаимодействий между этими центрами необходимо наличие в молекуле субстрата непротонированного атома азота в первом положении пуринового цикла и атома кислорода, находящегося между у и Р атомами фосфата' в терминальной части молекулы.

Тот факт, что ЫаД-АТФаза является субстратом для двух протеинкиназ - А и С, и что фосфорилйрование этими протеинкиназами ингибирует ферментативную активность, позволяет заключить^ Я дао активность этого фе|й4ёЙта может находиться под контролем двух этйх протеинкиназ и изменяться в ответ на изменение внутриклеточной концентрации вторичных мессенджеров.

Рисунок 17. Возможные пути регуляции активности КаД-АТФазы.

25. Beguin P., Beggah A., Chibalin A., Burgener-Kairuz P., Jasser F., Mathews P., Rossier B., Cotecchia S., Geering K. (1994) J. Biol. Chem., 269,2443724445.

26. Dempsey C. (1990)Biochim. Biophys. Acta, 1031,143-161.

27. Peitsch M., Bonier C„ Tschopp J. (1993) TIBS, 18, 292-293.

28. Cuppoletti J. (1990) Arch. Biochem. Biophys., 278,405-415.

29. Voss J., Birmachu W., Hussey D, Thomas D. (1991) Biochemistry, 30, 74987506. .. .

30. Cuppoletti J., Huang, H., Kaetzel, M., Malinowska, D. (1993) Am. J. Physiol., 264, G637-G644.

ВЫВОДЫ

1. КГ-концевая последовательность аминокислот; иммунохимический анализ, а также чувствительность к уабаину и ионам № свидетельствуют, что а-субъединица Ыа,К-АТФазы из солевых желез утки относится к классу а1-изоформ. №-концевая последовательность аминокислот р-субъединицы №,К-АТФазы из этой ткани характерна для класса р1-изоформ.

2. Зависимость активности Ыа,К-АТФазы от концентрации АТФ описьтается кривой с промежуточным плато. Она может быть представлена в виде суммы кривой с отрицательной кооперахивностью и сигмоиды, которые насыщаются в области низких (0,2-200,:мкМ) и высоких (0,2-2 мМ) концентраций АТФ соответственно. Для солюбилизированной протомерной формы Ка,К-АТФазы зависимость активности от концентрации АТФ имеет вид кривой с отрицательной кооперативностью.

3. Концентрационная зависимость связывания АТФ с №,К-АТФазой описывается кривой с промежуточным плато. Связывание АТФ в присутствии как так и К+ характеризуется отрицательной кооперативностью в области низких концентраций и положительной - в области высоких концентраций нуклеотида, свидетельствуя о возникновении обоих типов кооперативности на уровне связывания АТФ с №,К-АТФазой.

4. Связывание АТФ с центрами низкого сродства или взаимодействие между ними обусловлено следующими структурными особенностями молекулы: 1) наличием депротонированного при нейтральных рН атома азота в первом положении пуринового цикла; 2) присутствием атома кислорода между р и у атомами фосфора в терминальной части молекулы.

5. Данные по радиоинактивации Ыа,К-АТФазы показывают, что молекулярная масса мембраносвязанного фермента, гидролизующего ЦТФ или АТФ в насыщающих концентрациях, в 1,6 раза превышает

4. Болдырев A.A., Лопина О.Д., Рубцов А.М., Свинухова И.А. (1983) Биохимия активного транспорта ионов и транспортные АТФазы. Москва изд. МГУ.

5. Boldyrev А., А., Lopina OD, Prökopjeva V. D. (1884)Diphenylhaxtriene and pyrene as a tool !or characterization of biological membrane. Biochem. int., 8,851-859. ' ' : . rf.

6. Boldyrev A:Ä:; Lopina Ö:B^ Gk^^ N;N.,BaiSnovaiLM.; Severin E.S.(1984)Na,Kidependeiit adenosinetriphospliätephosphohydrolase: activation of the phosphatase reaction by ATP analogs. FEBS Lett., 175, 303306. .>■-::

7. Лопина О.Д; Бйрайойа Л.А., Манохина Е.А. (1985) Действие аналогов АТФ наАТФазнуй) й фосфатазную активности ИаД-АТФазы солевых желез уййа; Укр. биохим. ж-л, 57,19-24.

8. Альтштейн С.А., Болдырев A.A., Лопина О.В., Рубцов A.M., Швец В.И. (1986) Характеристика Na,К-АТФазы из солевых желез. Биофизика, 31, 621-625. •

9. Лопина О.Д., Талаева С.Ю., Стецюк Н.У., Котлобай A.A., Болдырев A.A. (1986) Эндогенные уабаин-подобные вещества в тканях животных. Укр. биохим. ж-л, 58, 74-83.

10. Lopina O.D., Svinukhova I.A., Boldyrev А.A.(l 987) Mechanism of coupling of ion transport and ATP hydrolysis by the Na,K-ATPase system, hi "Methabolism and development of the nervous system" . Ed. S. Tucek, Praga, p. 295-299.

11. Болдырев А. А., Лопина О.Д., Свинухова И.А., Щеглова И.А., Северин С.Е. (1988) АТФ как модификатор №,К-АТФазы. Биомакромолекулы в методе спиновых меток и зондов. Ред. Лихтенштейн Г.И., Жданов Р. И., Москва, Наука, с. 93-108.

12. Boldyrev A.A., Lopina O.D., Svinukhova I.A. (1988) Mechanism of substratespecificity of the Na-pump. In: The Na-pump, part A: Molecular aspects, Alan R. Liss bic, New-York, p. 179-286.

13. Болдырев А.А.,;ЛЙ1ина О.Д., Свинухова И.А. (1989) Роль структуры субстрата »"фуайййЬМировании №,К-АТФазы. Биохимия, 54, 895-907.

14. Пиндель Е.В., Лопина О.Д., Болдырев A.A. (1990) Влияние температуры на конформационное состояние Ыа,К-АТФазы. Вестник МГУ, 16, 43-46.

15. Boldyrev A.A., Lopina O.D., Fedosova N.U. (1990) Na,K-ATPase: radiation inactivation studies. Biochem. Int., 21, 45-52.

16. Lopina O.D., Pindel E.B., Boldyrev A.A. (1990). Na,K-ATPase labelled with 5-iodoacetamidofluorescein: E2-E1 conformational transition induced by different nucleotides. FEBS Lett., 266, 75-77.

17. Liebman C., Schräder U., Schnittler M., Lopina O.D., Jankova Т., Menz P., Hoffmann S., Neubert К., Barth A. (1990) Low doses of beta-casomorphin-5 modulate the ouabain sensitivity of the guinea-pig cardiac Na,K-ATPase.

30. Cuppoletti J., Rubtsov A., Behbehani G., Lopina O. (1995) Interaction of potential regulatory protein with the gastric H/K-ATPase. Biophys. J., 68,2, A235.

31. Lopina O., Rubtsov A., Mollakova I., Petukhov S., Chibalin A., Nikashin A. (1995) Phosphorylation of alpha-subunit of Na,K-ATPase from duck salt gland and dog kidney by protein kinase A and C. Biophys. J., 68,2, A308.

32. Lopina O.D., Sarvazyan N., Askari A., Boldyrev АЛ. (1995) A comparative study of Na+/K+-ATPases of duck salt gland and canine kidney: implication for the enzyme's reaction mechanism. Arch. Biochim. Biophys., 321,429433.

33. Boldyrev A.A., Lopina O.D., KerneyM., JohnsonP. (1995) Characterization of the subunit isoforms of duck salt gland Na/K adenosine triphosphatase. Biochem. Biophys. Res. Соштш., 216,1048-1053.

34. Муртазина ДА., Петухов С.П., Лопина О.Д. (1997) Фосфорилирование Na Д-АТФазы из солевых желез утки цАМФ-зависимой протеинкиназой in vitro. П Съезд Биохимического общества РАН, ч. П стр. 338.

35. Лопина О.Д., Котлобай АЛ. (1997) Субстратная зависимость солюбилизированного альфа-бета протомера Na Д-АТФазы характеризуется отрицательной кооперативностью, но не промежуточным плато. П Съезд Биохимического общества РАН, ч. П стр. 333.

36. Мает Н.В., Шорина Е.А., Лопина О.Д., Рубцов А.М. (1997) Взаимодействие мелиттина с мембранами саркоплазматического ретикуиума: ингибирование и агрегация Са-АТФазы. П Съезд Биохимического общества РАН, ч. П, стр. 336.

37. Лопина О.Д., Рубцов A.M. (1997) Возможные пути регуляции активности ион-транспортирующих АТФаз Р-типа. П Съезд Биохимического общества РАН, ч. П, тезисы сими, довел., стр. 65.

38. Муртазина Д.А., Мает Н.В, Рубцов A.M., Лопина О.Д. (1997) Механизм ингабированижАТФаз Ei-Вг типа мелиттином. Биохимия, 62,1,66-75.

39. Shorina Е.A., MastN.V., Lopina O.D, Rubtsov, А.М. (1997) Melittin-induced inhibition and aggregation of Ca-ATPase in skeletal muscle sarcoplasmic reticulum: a comparative study. Biochemistry, 36,13455-13460.

40. Лопина О.Д., Рубцов А.М. Н,К-АТФаза и регуляция секреции НС1 слизистой оболочкой желудка (1997) Биохимия, 62, 1235-1242.

41. Boldyrev A., Kotlobay A., KurellaK., Lopina О., Sarvazyan N. (1997) А hypothetic to explain the non-Michaelis substrate dependence curve ofNa/K-ATPase. Ann. N.-Y. Acad. Sci., 834, 669-672.