Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Мягкая порация бислойных фосфолипидных мембран при температуре фазового перехода липида из жидко-кристаллического состояния в гель

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Мягкая порация бислойных фосфолипидных мембран при температуре фазового перехода липида из жидко-кристаллического состояния в гель"

На правах рукописи

№С

НОРИК Владимир Петрович /

Мягкая порация бислойных фосфолипидных мембран при температуре фазового перехода липида из жидко-кристаллического состояния в гель

03 00 02-Биофизика

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

□□3064Т0В

Москва 2007

003064706

Работа выполнена на кафедре медицинской и биологической Физики Московской медицинской академии им И М Сеченова

Научные руководители

Доктор биологических наук, профессор Антонов Валерий Федорович Доктор физико-математических наук, профессор Козлова Елена Карловна

Официальные оппоненты

Доктор биологических наук, профессор Иванов И И Кандидат физико-математических наук, Соколов В.С

Ведущая организация - Институт Теоретической и экспериментальной биофизики РАН, Пущино.

Защита состоится 24 мая 2007 года в 14'00 часов

На заседании Диссертационного Совета

Д 501 001 96 при Московском Государственном университете им M В Ломоносова

Адрес 119899, Москва, Воробьевы горы, МГУ, Биологический факультет, аудитория Новая

Автореферат разослан « »_2007 года

Ученый секретарь ,

Диссертационного совета, профессор

i '

Актуальность проблемы. Бимолекулярный слой липидов в клеточной мембране определяет барьерные функции живой клетки В области биофизики ионных каналов в течение последних лет достигнут существенный прогресс. Частично это обусловлено достижениями рентгеноструктурных исследований мембранных белков и липидов (Michel, 1983), обнаружение генетически обусловленного контроля синтеза некоторых канальных белков (Agre,2002), а также компьютерного моделирования работы одиночных ионных каналов (Mountsen, 1998) Однако происхождение и эволюция чисто липидных пор остаются до настоящего времени слабо изученными

В последнее время широкое применение в экспериментальной биологии и медицине получила электропорация клеточных мембран, обусловленная электрическим пробоем липидного бислоя (Абидор и др 1982)

Ранее в нашей лаборатории было обнаружено принципиальное сходство в эволюции липидных пор, возникающих при электропорации и при фазовом переходе липидов Мягкая порация бислоя, не требующая электрической предобработки мембран, обнаружена при фазовом переходе мембранных липидов (Антонов В Ф и др, 1992, Антонов В Ф, 1998) и осмотическом набухании липидных везикул (Taupm С et al, 1975) Одиночные липидные проводящие поры в плоских бислойных липидных мембранах (пБЛМ), обнаруженные впервые при фазовом переходе дистеароилфосфатидилхолина из жидкокристаллического состояния в гель (Antonov et al, 1980), имеют общий с электропорацией механизм возникновения, обусловленный превращением исходно гидрофобной поры в гидрофильную с последующим закрытием ее или разрывом бислоя Разрыв бислоя теоретически был предсказан Дерягиным и сотрудниками на основе концепции критической поры (Дерягин и Гутоп, 1962, Дерягин и Прохоров, 1981)

Цель и задачи исследования. Основной целью работы являлось экспериментальное исследование явления мягкой порации липидных мембран, основанного на структурных перестройках липидного бислоя в результате фазового перехода мембранных фосфолипидов из жидкокристаллического состояния в гель-состояние Важной особенностью мягкой порации в отличие от электропорации является то, что помимо отсутствия электрического пробоя бислоя, структурные перестройки клеточных мембран, сопряженные с фазовыми переходами мембранных липидов, протекают при физиологических температурах В случае изотермического фазового перехода заряженного бислоя, обусловленного ионами Са2+, требуются физиологические концентрации двухвалентных ионов (Антонов В Ф и др, 1992) В связи с этим основной задачей исследования было экспериментальное изучение механизма рождения и эволюции липидных пор в условиях фазового перехода липидов в пБЛМ из жидкокристаллического состояния в гелеобразное при малом непробойном электрическом напряжении на мембране В качестве объекта изучения был выбран синтетический дипальмитоилфосфатидилхолин, один из основных фосфолипидов клеточной мембраны, а также гидрогенизированный яичный лецитин

Для достижения цели были поставлены следующие задачи

- исследовать электрические характеристики (интегральную проводимость, флуктуации тока и электрическую емкость) пБЛМ при фазовом переходе липида,

- провести калибровку размера одиночных липидных пор с использованием в качестве пробных частиц электронейтральных полимерных молекул полиэтиленгликоля в диапазоне радиусов от 0,60 нм (ПЭГ300) до 2,10 нм (ПЭГ6000) с шагом ~ 0,15 нм;

- исследовать ионную селективность одиночных липидных пор в ряду одновалентных катионов ЬГ, Ыа+, К+, Шэ+, Се"1"

Научная новизна

Предложен способ мягкой порации липидного бислоя, основанный на фазовом переходе мембранных фосфолипидов из жидкокристаллического состояния в гель В отличие от электропорации метод мягкой порации позволяет получать липидные поры в условиях физиологических значений мембранного потенциала (10-100 мВ)

Установлено, что при температуре фазового перехода дипальмитоилафосфатидилхолина (ДПФХ) имеет место снижение электрической емкости пБЛМ приблизительно на 14 %, что согласуется с данными рентгеноструктурного анализа по толщине бислоя из ДПФХ для фазового перехода жидкое-твердое (Геннис П, 1997)

Показано, что значительные флуктуации тока, свидетельствующие о рождении липидных пор при температуратурном фазовом переходе, обусловлены структурными перестройками бислоя в относительно узком температурном интервале ±2 °С относительно температуры основного фазового перехода

Исследована проводимость одиночных липидных пор в ряду одновалентных катионов вы СМа вк 0Г(Ь 0Сз=1 0,9 0,4 0,4 0,3 Данный ряд соответствует XI ряду в классификации Эйзенмана (Е^ептапп в, 1962) Катионы подразделяются на две группы относительно высокая проводимость для 1д+ и и низкая для К+, Шэ+ и Сб+ Обнаруженный ряд селективности свидетельствует о том, что пора является гидрофильной Гидрофильность поры подтверждается линейным характером вольтамперных характеристик пор

Впервые проведена калибровка размера липидных пор Экспериментальное определение размеров пор производилось путем регистрации флуктуаций тока в пБЛМ, находящихся в 20%-ном водном растворе полиэтиленгликоля определенной молекулярной массы Определено, что радиус липидной поры лежит в пределах радиуса молекул ПЭГ-1450, ПЭГ-2000 и ПЭГ-3350 (от 1,22нм до 1,63нм)

Практическая значимость работы

Основной областью приложения результатов работы является липосомология Способность липосом взаимодействовать с клетками, перенося свое содержимое через барьер плазматической мембраны в цитоплазму, привлекает к ним исследователей, занимающихся клеточной биологией Этот процесс используется для изучения слияния клеток, в генной инженерии - для введения внутрь клетки генетического материала, в фармакологии - для обычного и направленного транспорта лекарственных соединений Термочувствительность липосом широко используется в онкологии при гипертермическом воздействии на опухоли Апробация работы

Результаты работы были опубликованы в 7 научных статьях в журналах «Биофизика» и «European Biophysics Journal», обсуждены на III Съезде биофизиков России (Воронеж,2004), II Евразийском конгрессе по медицинской физике и инженерии «Медицинская физика - 2005» Москва 21-24 июня 2005 г, на заседаниях секции биофизики Московского общества испытателей природы 2000-2003г

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 108 страницах рукописи и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения полученных результатов, обсуждения, выводов и списка литературы

Материалы и методы исследования

Для формирования пБЛМ и липосом были выбраны цвиттерионный дипальмитоилфосфатидилхолин (Avanti) и природный липид гидрированный яичный лецитин (Avanti)

Термодинамические характеристики фазового перехода в липидном бислое определялись с помощью метода калориметрии В работе использовался дифференциальный адиабатный сканирующий микрокалориметр ДАСМ-4 (Пущино)

Плоские бислойные липидные мембраны формировали по методике Мюллера и др (1962) В качестве растворителя использовался н-декан

Регистрацию флуктуаций тока в режиме фиксации напряжения проводили с помощью прибора для измерения ионных токов (Пущино)

Оценка радиуса пор производилась тремя независимыми способами Радиус одиночных пор оценивали по амплитуде флуктуаций тока в режиме фиксации напряжения Достаточно большое значение проводимости позволили оценить размер пор методом, предложенным в работе (Eldndge С , Morowitz, 1978), в которой учитывается влияние электроосмоса Впервые использован метод оценки радиуса пор в липидном бислое по их проводимости в присутствии гидрофильных молекул полиэтиленгликоля различной молекулярной массы (ПЭГ300, ПЭГ600, ПЭГ1450, ПЭГ2000, ПЭГ3350 и ПЭГ6000 фирмы Sigma), гидродинамический радиус которых сравним с предполагаемыми радиусами липидных пор и достаточно хорошо определен (Моровец, 1967 , Kuga, 1981) Результаты

1.Термограммы БЛМ из ДПФХ в растворах одновалентных катионов.

На рис 1 представлена типичная термограмма суспензии липосом из ДПФХ в растворах 1 М хлоридов Li+, Na+, К+, Rb+, Cs+ На кривой видны два пика пик предперехода при 35,5°С и пик основного фазового перехода из ЖКС в гель при 41°С

Положение пиков одинаково для всех солей, кроме LiCl На рис 16 показано смещение обоих пиков в область более высоких температур при формировании БЛМ в растворе 1 М LiCl пик основного фазового перехода смещается до 43°С и пик предперехода до 40°С Это свидетельствует о более сильном взаимодействии Li+ с полярными группами молекул ДПФХ по сравнению с другими катионами, что, возможно, приводит к более плотной упаковке бислоя. Аналогичный сдвиг ранее наблюдался Cunningham et al, (1986)

а

20 30 40 50

60 70 температура, С 6

60 70 теипврвтура.'С

Рис 1 Термограммы дисперсии ДПФХ в водных 1 М растворах

электролитов (без буфера, pH 6,9) а) NaCl, KCl, RbCl, CsCl,T 6) LiCl

Таблица 1 Использованные в исследованиях липиды и их термодинамичесие параметры

Липид Т °с Тфп! °с ДН-ПредПрех0да( ккал/моль АН0СН0ВН0Г0 перехода, ккал/моль Размер кооперативной единицы

Дипальмитоилфос фатидилхолин (ДПФХ) 35,5 41,5 1,6 8,7 100

Гидрированный яичный лецитин (ГЯЛ) - 51 - 4,6 80

Тпп— температура предперехода ДПФХ, Тфп - температура основного фазового перехода ДПФХ

2.Электрическая емкость пБЛМ при температуре фазового перехода ДПФХ.

По данным рентгеноструктурного анализа (Геннис П, 1997) толщина липидного бислоя из ДПФХ при фазовом переходе из ЖКС в гель возрастает от 3,9 до 4,7 нм, т е приблизительно на 17% Поскольку состояние основного растворителя мембраны н-декана при этой температуре не изменяется, то можно ожидать приблизительно такого же уменьшения емкости в предположении постоянства диэлектрической проницаемости и площади пБЛМ Полученные экспериментально данные, показанные на рис 2, подтверждают это предположение

Суд »мкФ-'см1 0,60,5-

30 40 50 теш№1>атур*к°С

Рис 2 Температурные изменения удельной емкости пБЛМ из ДПФХ в водном 1 М растворе 1лС1, без буфера, рН 6,9

На рисунке видно, что действительно, в области основного фазового перехода ДПФХ имеет место снижение электрической емкости приблизительно на 14 %, что можно считать хорошим совпадением с данными рентгеноструктурного анализа (Геннис П, 1997), свидетельствующими об утолщении бислоя в результате перехода жирнокислотных радикалов в полностью транс-конформацию

З.Флуктуации тока и Б JIM при температуре фазового перехода из ЖКС в гель.

Ранее было обнаружено, что снижение температуры БЛМ из индивидуального динасыщенного 1,2-дистеарои л-srv-глицеро-З -фосфохолина сопровождается появлением флуктуаций тока в области температуры основного фазового перехода, что свидетельствует о рождении чисто липидных пор (Antonov et al,1980) Эти данные были подтверждены в работе (Boheim et al, 1980) с другим цвиттерионным фосфолипидом 1-стеароил-З-миристоил-глицеро-2-фосфохолином при температуре фазового перехода этого липида. Позднее удалось сформировать пБЛМ из фосфатидной кислоты и наблюдать флуктуации тока, индуцированные ионами Са2+ в изотермическом режиме (Antonov et al,1985)

На рис 3 представлены записи отдельных флуктуаций тока, регистрируемые нами в режиме фиксации напряжения на пБЛМ из ДПФХ при различных фиксированных температурах Как видно на рис За, флуктуации тока при температуре, превышающей температуру фазового перехода (50°С) практически отсутствуют и на гистограмме распределения тока (справа) единственный максимум лежит в области нулевых значений тока Флуктуации тока отсутствуют и при температуре ниже фазового перехода

При температуре основного фазового перехода, поддерживаемой термостатом с точностью 0,5°С, наблюдаются хорошо разрешенные флуктуации тока большой амплитуды Длительность одиночных флуктуаций может, достигать нескольких секунд (рис 36) Помимо одиночных регистрируются двух и трехуровневые флуктуации тока На гистограмме токов (справа), помимо нулевого значения, видны два максимума распределения Этот результат указывает на формирование кластера и/или коалесценцию пор Такое предположение подтверждается видом гистограммы токов при 1,5 и 3 нА

1 нА

10 с

1000

0

4ток,нА

Рис 3 Флуктуации и гистограммы тока в пБЛМ (при фиксированном напряжении 50 мВ) из ДПФХ в 1 М водном растворе 1лС1, (без буфера, рН 6,9) при различных фиксированных температурах а - 50°С (температура Т выше температуры ТФП основного фазового перехода Т > Тфп), б - 43°С (Т = Тфп), в - 33 °С (Т < Тфп) п - частота попадания значений тока в заданный интервал Частота стробирования 80 Гц

Ранее в опытах с пБЛМ из гидрированного яичного лецитина бьшо установлено (Аносов и др 1999), что флуктуации тока, обусловленные

одиночными липидными порами, имеют экспоненциально распределенные времена жизни пор в закрытом состоянии, что свидетельствует о независимом появлении липидных пор С учетом этого предполагалось независимое существование пор В наших опытах с ДПФХ (рис 36) видно, что поры могут открываться последовательно, а закрываться одновременно, что указывает на возможность их взаимодействия

Для подтверждения этого предположения рассмотрим распределение Пуассона для одиночных импульсов тока Как видно на рис. 36 (распределение флуктуаций в пределах пика считается гауссовым) уравнение Пуассона для этого случая имеет вид

P„=(vT)Kexp(-v-t)/n' (1)

где v - средняя скорость возникновения импульсов тока, т - средняя длительность импульсов

Следовательно, вероятность открытия двух пор Ръ отнесенная к вероятности открытия одной поры Pi, будет равна.

P-JP{=vx/2 (2)

Для среднего времени жизни поры в открытом состоянии т=2с и v=0,23c_1 Р2/Р\=0,23, из чего следует, что вероятность одновременного существования двух пор в мембране должно быть приблизительно в четыре раза меньше вероятности существования одной поры Однако сравнение площадей под пиками гистограммы (см гистограммы на рис 36) показывает, что их площади приблизительно равны, что противоречит предположению о независимости липидных пор Эти данные свидетельствуют о зависимом существовании пор и это вывод согласуется с гипотезой Freeman et al, (1994) о коалесценции пор

Таким образом полученные нами данные указывают на то, что структурные перестройки липидного бислоя при температуре основного фазового перехода липида сопровождается появлением долгоживущих гидрофильных пор с тенденцией к их слиянию

4.Вольтамперная характеристика пБЛМ из ДПФХ при температуре основного Фазового перехода.

■ ■ <■■ .1 Ьь.4«

№

1 нА

1 с

лл

........

'»».«».М», ш>|| .1^« Я1> (.>й|и,»|И»<1>ч.*»«1|..||1(.*1Л*«»(.1ш1|. к ЩI, |||.||||.|*4«|М1ш1*

-10мВ ;

1

-ШиВ,»^,,,,, ьймМаап! мя-мД«— .««».^«ии*» «^м». .М-1ч

Рис 4 Флуктуации тока в пБЛМ из ДПФХ при фиксированной температуре 43,0±0,5°С при различных значениях фиксированного напряжения на мембране Горизонтальные линии - нулевой уровень Среда содержала водный раствор 1М 1лС1, без буфера, рН 6,9

В ходе эксперимента пБЛМ из ДПФХ формировались при температуре выше температуры основного фазового перехода - ТфП, после чего температура снижалась до ТфП и поддерживалась термостатом в течение всего эксперимента

На рисунке 4 представлены типичные записи флуктуаций тока, регистрируемых в пБЛМ при различных значениях фиксированного мембранного потенциала Можно видеть снижение амплитуды флуктуаций с уменьшением напряжения (рис 4 а, б, в), исчезновение флуктуаций при нулевом потенциале и нарастание амплитуды флуктуаций тока противоположного направления при смене знака напряжения (три нижних записи)

Как видно на рисунке 5 ВАХ пБЛМ при ТфП линейны в диапазоне напряжений ±100мВ и проходит через начало координат Крутизна ВАХ сохраняя линейный характер, снижается с уменьшением концентрации электролита (не показано) Линейный характер ВАХ свидетельствует о независимости проводимости липидной поры от напряжений в изученном диапазоне

ток, нА~~ ' " ' — — • — -

4

2

О

-2

-4

Рис 5 Вольтамперная характеристика одиночной поры в пБЛМ из ДПФХ при температуре фазового перехода (каждая точка построена по 150 измерениям) Среда 1 М 1лС1, без буфера, рН 6,9

5.Ионная селективность одиночной липидной поры.

Единичные флуктуации тока в режиме фиксации напряжения, которые были использованы для оценки катионной селективности одиночных липидных пор, регистрировали в одномолярных растворах 1лС1, №С1, КС1,

Ш)С1, СбС1 Ранее было показано, что пБЛМ из фосфолипидов при Т=ТфП обладают катионной селективностью (Петров и др 1976), однако систематических опытов в ряду всех физиологически важных одновалентных катионов не проводилось

Результаты исследования проводимости отдельных пор в растворах

различных катионов представлены в табл 2 Показаны средние значения

проводимости пор при Т=ТфП в растворе соответствующего катиона

Таблица 2 Проводимость одиночных липидных пор в пБЛМ из ДПФХ

перехода ДПФХ. Среда содержала 1 М !3 буфера

при температуре основного фазового соответствующего хлорида, рН 6,9, б;

Катион Проводимость поры, нСм

1л+ 31+15 (250)*

Иа+ 28±16 (90)

К+ 12+2 (80)

12±4 (49)

С8+ 10±6 (40)

* в скобках указано число пор

Как видно, катионы подразделяются на две группы относительно высокая проводимость для ЬГ и Ка+ и низкая для К+, Шу и Сэ+ Проводимость одиночных липидных пор в ряду одновалентных катионов Сь, 0Ка Ок'Ощ, С1с5=1 0,9 0,4 0,4 0,3 Данный ряд соответствует XI ряду в классификации Эйзенмана (Е^епшапп в, 1962) Обнаруженный ряд селективности свидетельствует о том, что пора является гидрофильной Об этом свидетельствует также омический характер проводимости

б.Количественная оценка радиуса липидной поры.

Экспериментальное определение размеров пор производилось тремя независимыми методами В первом случае применяли метод, предложенный Меггкак ег а1 (1991) путем регистрации флуктуаций тока в ионных каналах из белка порина, встроенных в пБЛМ, находящихся в растворе соли с

добавлением 20% полиэтиленгликоля (ПЭГ) определенной молекулярной массы На рис 7 представлены записи тока на мембране в серии опытов с частицами ПЭГ различного гидродинамического радиуса

1 нА]_

1 с

ПЭГ30° (0,6 нм)

ПЭГ600(0,78нИ) ПЭГ 1450

г (1,05 нм)

Д ПЭГ 2000 (1,22 „и)

ПЭГ 3350 (1>63нм)

ж Р1 II ПЭГ6000(2,10нм) .....^ ^ J ........ I и..,;:;.....,:

Рис 6 Флуктуации тока в режиме фиксации напряжения на пБЛМ из ДПФХ с содержанием в среде 20 % по весу полиэтиленгликолей (ПЭГ) различной молекулярной массы при 43±0,5°С а - базовый раствор(1 М 1лС1, без буфера, рН 6,9), б, в, г, д, е, ж - в базовый раствор добавлены ПЭГ Фиксированное напряжение 50 мВ Разрывы на кривых г, д, е составляют не менее 25 минут Среднее время жизни пБЛМ при температуре фазового перехода ~30 мин

В контроле регистрировали флуктуации тока пБЛМ в растворе 1лС1 при

температуре основного фазового перехода ДПФХ (рис 6а)

Последовательное добавление ПЭГ-300 и ПЭГ-600 приводит к постепенному

снижению амплитуды флуктуаций. (рис 66 и 6в) В растворах ПЭГ-1450,

ПЭГ-2000 и ПЭГ-3350 флуктуации тока исчезают (рис 6г, д, е) В растворе

ПЭГ-6000 вновь появились флуктуации тока с амплитудой близкой к

исходной Полученные данные следует трактовать следующим образом Исходно электрический ток в порах переносится в основном катионами 1л+ Добавление в раствор ПЭГ-300 и ПЭГ-600 сопровождается вхождением нейтральных молекул полиэтиленгликоля в просвет поры и снижением тока через пору В растворах ПЭГ-1450, ПЭГ-2000 и ПЭГ-3350 липидные поры заполняются молекулами полиэтиленгликоля, и ток через мембрану блокируется Отметим, что полная блокада липидных пор молекулами ПЭГ строго определенного размера обнаружена впервые Принципиально важным является следующий результат, где молекулы большего размера ПЭГ-6000 с радиусом 2,10 нм восстанавливают картину флуктуаций тока, близкую к исходной Эффект блокирования-деблокирования липидных пор молекулами ПЭГ свидетельствуют о чисто стерическом взаимодействии молекул ПЭГ с липидными порами Исходя из этого, можно утверждать, что размер пор лежит в пределах от 1,05 нм до 1,63 нм

Второй и третий способы суммированы в таблице 3

Таблица 3 Радиусы липидных пор в пБЛМ из ДПФХ, регистрируемых пр! температуре основного фазового перехода ДПФХ в 1М растворах одновалентны? катионов Толщина бислоя 5 нм |

Катион Расчет радиуса поры по проводимости отдельных пор, нм Расчет радиуса поры по работе Илдридж, Моровиц, нм Оценка радиуса поры по результатам эксперимента с ПЭГ, нм

1л+ 2,1+0,9 1,4 1,05 * ПЭГ-1440 1,22 ПЭГ-2000 1,69 ПЭГ-3 550

Ыа+ 1,9+0,8 1,5 -

К+ 1,0+0,2 1,4 -

Шэ+ 1,0±0,3 1,3 -

Сз+ 0,9±0,4 1,3 -

Среднее значение - 1,4±0,1 1,3±0 3

"Гидродинамические радиусы молекул ПЭГ, блокирующих проводимость липидных пор (см рис 6)

7. Краевое натяжение пор.

Основным отличием мягкой порации от электропорации является низкое (<100мВ) значение мембранного потенциала Высокое пороговое значение напряжения (>230мВ) на мембране в случае электропорации сопровождается появлением большого количества пор более 105 на пБЛМ площадью 1мм2 (Glaser RW et al, 1988), что затрудняет возможность регистрации одиночных пор В случае мягкой порация получено небольшое количество хорошо разрешенных пор

Согласно Freeman et al, (1994) в стационарных условиях в нулевом приближении напряжения на мембране количество N одиночных липидных пор может быть найдено по формуле

N=nohexp(-r/Xr) (3)

где П()=1,21024 м"1 - начальное значение плотности вероятности рождения поры, г=1 нм - радиус поры, кг=кТ12щ&Ъ 10"пм - характеристическая длина в пространстве радиусов, к - постоянная Больцмана, Т - абсолютная температура, у - краевое натяжение поры Как было показано ранее ,в случае мягкой порации величина N поддается непосредственному подсчету (рис 3) , что позволяет сравнить теорию с экспериментом

Таблица 4 Количество и краевое натяжение одиночных липидных пор при температуре основного фазового перехода ДПФХ в 1М растворах одновалентных катионов_______

Электролит Количество пор, оцененных экспериментально по флуктуациям тока (на одну мембрану) Краевое натяжение поры, Н (х10"п)

LiCl 36±7 (7)* 0,95

NaCl 12±5 (7) 0,98

KCl 10±4 (7) 0,98

RbCl 7±3 (6) 1,00

CsCl 4±2 (8) 1,02

*Количество пБЛМ Время жизни мембран приблизительно одинаково

Из табличных данных следует, что величина краевого натяжения поры хорошо согласуется с данными известными в литературе (см Freeman et al ,1984) Данные позволяют сделать вывод о том, что теория Freeman et al применима для оценки краевого натяжения чисто липидных пор в условиях мягкой порации, когда можно пренебречь мембранным потенциалом, амплитуда которого много ниже порогового значения электрического пробоя В этот диапазон попадают все физиологически значимые мембранные потенциалы, включая потенциалы покоя и действия в электрофизиологии Интересно отметить, что краевое натяжение чисто липидной поры обладает некоторой ионной избирательностью

Популяция чисто липидных пор в плоской бислойной липидной мембране из ДПФХ, сформированной по методике Мюллера и др. при фазовом переходе липида из жидкокристаллического состояния в гель, характеризуется следующими численными значениями

Численные значения параметров при Т>Тф,

Символ Значение Величина

Ам Площадь пБЛМ 1 мм2

г ^уд Удельная емкость мембраны 0,31 10"2Ф/м2

h Толщина бислоя 5 нм

Минимальный радиус поры 1,3 нм

Y Краевое натяжение поры 1 10"11 H

с Поверхностное натяжение бислоя 1 10"3Н/м

Гкрит Критический радиус поры 10 нм

Тфп Температура основного фазового перехода 43°С

h - расчет по формуле плоского конденсатора из данных по емкости пБЛМ

Гмин - расчет по проводимости единичной поры, определенной по

флуктуациям тока (Антонов, 1992)

у - расчет по формуле Freeman et al (1984)

с> - расчет по формуле Лапласа (Tien, 1974)

гкрит- расчет по формуле Дерягина и др (1987)

ТфП - прямое измерение методом дифференциальной сканирующей

калориметрии

Обсуждение

Полученные нами экспериментальные данные об эволюции одиночных липидных пор в условиях мягкой порации позволяют ответить на несколько вопросов, связанных с порацией липидного бислоя в отсутствии белков-каналоформеров При мягкой порации в условиях фазового перехода из жидкокристаллического состояния в гель удается получить на мембране небольшое количество хорошо разрешенных и долгоживущих чисто липидных пор

Поскольку в условиях мягкой порации мембранный потенциал не играет существенной роли в определении физического состояния липидного билоя, торегистрируемые одиночные поры могут стабилизироваться только краевым натяжением поры Количественная оценка краевого натяжения поры может быть произведена согласно Freeman et al (1984) по количеству пор приходящихся на одну мембрану Проведенные нами расчеты показали хорошее соответствие полученных нами данных с оценками краевого натяжения пор известными в литературе

Впервые проведенная количественная оценка радиуса чисто липидных пор тремя независимыми методами показала хорошее согласие между этими методами Средняя величина равна 1,3 нм, что согласуется с оценкой одиночных липидных пор наблюдаемых при электропорации (Меликов, 2003)

Выводы.

1 Исследована электрическая проводимость плоских бислойных липидных мембран из дипальмитоилфосфатидилхолина при температуре основного фазового перехода липида Обнаружена популяция чисто липидных одиночных пор, насчитывающая до 50 пор на одну мембрану площадью 1 мм2 Поры не обнаруживаются при температурах выше и ниже температуры основного фазового перехода липида Поры не обнаруживаются

также при добавлении в мембранный раствор холестерина в концентрации 50 мольных %, блокирующей фазовый переход липидов

2 Проведена калибровка радиуса пор тремя независимыми методами по проводимости одиночной поре, по методу Илдриджа и Моровица с учетом электроосмоса в поре и путем использования калиброванных частиц ПЭГ с радиусами от 0,6 до 21 нм В последнем случае экспериментальное определение размеров пор производилось путем регистрации флуктуаций тока в пБЛМ, находящихся в водных растворах ПЭГ Определено, что проводимость чисто липидной поры блокируются частицами ПЭГ с радиусами от 1,05 нм до 1,63 нм, что свидетельствует, по-видимому о соответствии радиуса поры радиусу частицы ПЭГ Все три метода дали совпадающие результаты Средний радиус поры оказался равным 1,3 нм

3 Впервые экспериментально определены числовые параметры, необходимые для расчета краевого натяжения поры В соответствии с теорией Freeman et al (1984) произведен расчет краевого натяжения поры равного 1 10"11 Н, что совпадает с известными литературными данными Расчетная величина краевого натяжения поры оказалась зависимой от одновалентных катионов в ряду Li+>Na+>K+>Rb+>Cs+

4 Исследована ионная селективность чисто липидных пор в ряду одновалентных катионов путем регистрации проводимости одиночных пор Показано, что ряд селективности определенной по проводимости соответствует GL, GNa GK GRb GCs=l 0,9 0,4 0,4 0,3

5 Совокупность полученных и литературных данных подтверждает применимость концепции критической поры как критерия структурной прочности плоской БЛМ в условиях электрического пробоя и мягкой порации В то время как при электрическом пробое стабильность БЛМ определяется в основном поверхностным натяжением бислоя, в случае мягкой порации основную роль играет линейное натяжение поры

Список опубликованных статей по теме диссертации

1 Богатырева Н Э , Норик В П, Какушкина М Л, Антонов В Ф Обнаружение фазы интердигитации в суспензии липосом из гидрированного яичного лецитина Доклады МОИП Общая биология 2001 Депонировано ВИНИТИ №1565-В2001 С 11-13

2 Антонов В.Ф , Норик В.П., Аносов А А , Корепанова Е А, Смирнова ЕЮ Electrical capacitance of lipid bilayer membrane of hydrogenated egg lecithm at the temperature phase transition European Biophysics Journal (2003) 32 #1 P 55-59

3 Антонов В Ф, Аносов А А, Норик В П, Корепанова Е А, Смирнова Е Ю Электрическая емкость бислойных липидных мембран из гидрированного яичного лецитина при фазовом переходе из жидкокристаллического состояния в гель Биофизика М 2003 Т 48, № 2, С 240-245

4 В Ф Антонов, А А Аносов, В П Норик, Е Ю Смирнова Мягкая порация плоских бислойных липидных мембран из дипальмитоилфосфатидилхолина при температуре фазового перехода из жидкокристаллического состояния в гель Биофизика, 2005, Т 50, вып 5, с 867-877

5 Valery F Antonov,Andrej A Anosov,Vladimir Р Nonk,Elena Y Smirnova Soft perforation of planar bilayer lipid membranes of dipalmitoylphosphatidylcholine at the temperature of the phase transition from liquid crystalline to the gel state European Biophysics Journal (2005)

6 В Ф Антонов, А А Аносов, В.П Норик, В АЛарнышков Экспериментальное определении размеров липидных пор, возникающих при температуре фазового перехода липидов III Съезд биофизиков России (Воронеж,2004) Тезисы докладов, С 181

7 В Ф. Антонов, А А Аносов, В П Норик, Е Ю Смирнова, О Ю Немченко Мягкая порация мембран и адресная дставка лекарства II Евразийский конгресс по медицинской физике и инженерии «Медицинская физика -2005» Москва 21-24 июня 2005 г

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Норик, Владимир Петрович

Введение

Часть 1. Обзор литературы

1. Энергия липидной поры

2. Электрический пробой мембран

3. Липидные поры при фазовом переходе

4. Температурный фазовый переход мембранных липидов

5. Липидные поры и проницаемость мембран

6. Оценка количества возникающих липидных пор

Часть 2. Материалы и методы

1. Калориметрические измерения

2. Методика формирования бислойных липидных мембран

3. Установка для измерений электрических характеристик БЛМ

4. Определение размера липидных пор

Часть 3. Электрическая емкость бислойных липидных мембран .50 Часть 4. Экспериментальное исследование мягкой порации липидного бислоя

1.Термограммы БЛМ из ДПФХ в растворах одновалентных катионов.

2. Электрическая емкость пБЛМ при температуре фазового перехода ДПФХ

3.Флуктуации тока пБЛМ при температуре фазового перехода из ЖКС в гель

4.Вольтамперная характеристика иБЛМ из ДПФХ при температуре основного фазового перехода

5.Ионная селективность чисто липидной поры.

6.Количествениая оценка радиуса липидной поры

7. Краевое натяжение пор

ОБСУЖДЕНИЕ . 81~~

Выводы

Введение Диссертация по биологии, на тему "Мягкая порация бислойных фосфолипидных мембран при температуре фазового перехода липида из жидко-кристаллического состояния в гель"

Широкое применение в экспериментальной биологии и медицине в настоящее время получили различные методы преодоления основного структурного барьера живой клетки -липидного бимолекулярного слоя. Они играют ключевую роль при направленной доставке лекарственных веществ и генетического материала, слиянии мембран в целях биотехнологии, ожоговых и низкотемпературных воздействиях, а также массивном радиационном облучении тканей [72]. Значительный интерес в патологии представляют исследования биофизических механизмов рождения и залечивания пор, возникающих в липидном бислое [95]. В медицине получили широкое распространение методы, основанные на использовании обратимого электрического пробоя мембран в сильном электрическом поле [1, 32]. В последнее время все большее внимание уделяется методам мягкой порации липидного бислоя при фазовых превращениях мембранных липидов [34], осмотическом набухании липидных везикул [89], механическом натяжении липидного бислоя [55]. Биофизический механизм всех видов порации включает в качестве необходимого элемента превращение первичной гидрофобной поры в гидрофильную пору с последующим ростом поры до критического уровня и разрывом бислоя, или восстановлением структуры бислоя в результате затекания поры. Возможность диффузионного затекания пор принципиально отличает липидную пору от многочисленных белковых пор, где механизм затекания отсутствует. Эффективное затекание липидных пор лежит в основе устойчивости клеточных мембран при различных патологических изменениях клеточной структуры, а критерий критической поры может быть использован для количественной оценки устойчивости бислоя [4].

В отличие от электропорации, методы мягкой порации исследованы недостаточно. Следует отметить, что электропорация сопряжена с необходимостью использования электрического пробоя бислоя, что не может не сказаться на физиологических свойствах клеточных мембран, клеток в целом и включенным в липидные везикулы лекарств и генетического материала. Поэтому все больший интерес представляют методы мягкой порации, из которых технически наиболее прост метод порации, основанный на структурных изменениях при фазовом переходе мембранных липидов. Порация, основанная на фазовом переходе мембранных липидов имеет самостоятельное значение, поскольку обнаружена взаимосвязь между температурой обитания пойкилотермных животных и липидным составом клеточных мембран [68].Эта зависимость прослеживается также у бактерий [12]. У гомойотермных животных важную роль в физиологии сна играет изотермический фазовый переход липидов, индуцированный ионами

Са [64] .В клинической медицине широкое применение нашел метод сочетанного действия гипертермии опухоли с введением в нее нагруженных антибиотиками липосом. Липидный бислой липосом образован липидами с фазовым переходом в области гипертермических температур. Это способствует эффективному освобождению антибиотка непосредственно в опухоли [65].

В области биофизики ионных каналов в течение последних нескольких лет достигнут существенный прогресс. Частично это обусловлено достижениями рентгеноструктурных исследований мембранных белков и липидов [77], установки генетически обусловленного синтеза некоторых канальных белков [33], а также компьютерного моделирования работы одиночных ионных каналов [79, 80]. Эти достижения значительно расширили наши представления о молекулярной структуре ионных каналов. Однако функциональные особенности работы каналов остаются до настоящего времени недостаточно изученными.

Изучение ионных токов, текущих через одиночные каналы в клеточной мембране является традиционным методом изучения функциональных особенностей ионных каналов. До настоящего времени эта техника является наиболее надежным и проверенным способом регистрации электрической активности клеток [27].

В последнее время широкое применение в экспериментальной биологии и медицине получила электропорация клеточных мембран [72]. Как известно, в основе электропорации лежит явление обратимого электрического пробоя липидного бислоя [46,47]. Ранее в работах В.Ф.Антонова и соавторов [34] было обнаружено принципиальное сходство в эволюции липидных пор, возникающих при электропорации и фазовом переходе липидов. Одиночные липидные проводящие поры в плоских бислойных липидных мембранах (пБЛМ), обнаруженные впервые при фазовом переходе дистеароилфосфатидилхолина из жидкокристаллического состояния в гель [34], имеют общий с электропорацией механизм возникновения, обусловленный превращением гидрофобной поры в гидрофильную с последующим затеканием ее или разрывом бислоя. Развитие поры зависит от критических параметров: энергетического барьера и критического радиуса поры.

Развитие методов прижизненной порации клеточных мембран сопряжено с необходимостью создания наряду с электропорацией других методов, лишенных очевидных недостатков электропорации. С учетом вышеизложенного предпочтение все более отдается методам мягкой порации. Основной целью работы являлось экспериментальное исследование явления мягкой порации липидных мембран, основанного на структурных перестройках липидного бислоя в результате фазового перехода мембранных фосфолипидов из жидкокристаллического состояния в гель-состояние. Важной особенностью мягкой порации в отличие от электропорации является то, что помимо отсутствия электрического пробоя бислоя, структурные перестройки клеточных мембран, сопряженные с фазовыми переходами мембранных липидов, протекают при физиологических температурах. В случае изотермического фазового перехода заряженного бислоя, обусловленного ионами Са2+, требуются физиологические концентрации двухвалентных ионов [5].

Для достижения цели были поставлены следующие задачи:

- исследовать электрические характеристики (интегральную проводимость, флуктуации тока и электрическую емкость) пБЛМ при фазовом переходе липида;

- провести калибровку размера одиночных липидных пор с использованием в качестве пробных частиц электронейтральных полимерных молекул полиэтиленгликоля в диапазоне радиусов от 0,60 нм (ПЭГЗОО) до 2,10 нм (ПЭГ6000) с шагом -0,15 нм;

- исследовать ионную селективность одиночных липидных пор в ряду одновалентных катионов: Li+, Na+, К+, Rb+, Cs+;

- проверить оценочные параметри теории Freeman et al., для расчета краевого натяжения чисто липидной поры.

Заключение Диссертация по теме "Биофизика", Норик, Владимир Петрович

Выводы.

1. Исследована электрическая проводимость плоских бислойных липидных мембран из дипальмитоилфосфатидилхолина при температуре основного фазового перехода липида. Обнаружена популяция чисто липидных одиночных пор, насчитывающая до 50 л пор на одну мембрану площадью 1 мм . Поры не обнаруживаются при температурах много выше и много ниже температуры основного фазового перехода липида. Поры не обнаруживаются также при добавлении в мембранный раствор холестерина в концентрации 50 мольных %, блокирующей фазовый переход липидов.

2. Проведена калибровка радиуса пор тремя независимыми методами: по проводимости одиночной поры, по методу Ипдриджа и Моровица с учетом электроосмоса в поре и путем использования калиброванных частиц полиэтиленгликоля с радиусами от 0,6 до 21 нм. В последнем случае экспериментальное определение размеров пор производилось путем регистрации флуктуаций тока в пБЛМ, находящихся в водных растворах ПЭГ. Определено, что проводимость чисто липидной поры блокируются частицами ПЭГ с радиусами от 1,05 нм до 1,63 нм, что свидетельствует, по-видимому о соответствии радиуса поры радиусу частицы ПЭГ. Все три метода дали совпадающие результаты. Средний радиус поры оказался равным 1,3 нм.

3. Впервые экспериментально определены числовые параметры, необходимые для расчета краевого натяжения поры. В соответствии с теорией Freeman et al (1984) [57] произведен расчет краевого натяжения поры равного МО"11 Н, что совпадает с известными литературными данными.Расчетная величина краевого натяжения поры оказалась чувствительной к одновалентных катионам в ряду Li+>Na+>K+>Rb+>Cs+.

4. Исследована ионная селективность чисто липидных пор в ряду одновалентных катионов путем регистрации проводимости одиночных пор. Показано, что ряд селективности, определенный по проводимости соответствует XI ряду в классификации Эйзенмана и равен GLi:GNa:GK:GRb:Gcs=l:0,9:0,4:0,4:0,3.

5. Совокупность полученных и литературных данных подтверждает применимость концепции критической поры как критерия структурной прочности плоской БЛМ в условиях электрического пробоя и мягкой порации. В то время как при электрическом пробое стабильность БЛМ определяется в основном поверхностным натяжением бислоя, в случае мягкой порации основную роль играет линейное натяжение поры.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Норик, Владимир Петрович, Москва

1. Абидор И.Г., Аракелян В.Б., Пастушенко В.Ф., Тарасевич М.Р., Черномордик J1.B., Чизмаджев Ю.А. Электрический пробой бислойных липидных мембран. //ДАН СССР, т. 240, №3, с. 733-736.

2. Аносов A.A., Богатырева Н.Э., Черныш A.M., Антонов В.Ф. // Биофизика. 1999. №.44. с.887-891.

3. Антонов В.Ф. Липиды и ионная проницаемость мембран. // М. Наука. 1982. 150с.

4. Антонов В.Ф. Липидные поры: стабильность и проницаемость мембран. // Соросоский образовательный журнал, №10,1998,10-17.

5. Антонов В.Ф., Смирнова Е.Ю., Шевченко Е.В. Липидные мембраны при фазовых превращениях.// М.: Наука, 1992.123 с.

6. Белоус A.M., Бондаренко В.А. Структурные перестройки биомембран при охлаждении. // Киев: Наук, думка, 1982,254с.

7. Берестовский Г.Н., Терноский В.И., Катаев A.A. Учет полидисперсности полимеров необходимое условие при определении с их помощью диаметра водных пор в клеточных оболочках и мембранах./ Биофизика, 2000, т.45, №1, с.69-78.

8. Бронштейн В.Л., Исерович П.Г. Физико-математическая модель макроскопической поры в липидном бислое при фазовом переходе.// Криобиология. №6, 1983, с.22-24

9. Владимиров Ю. А. и др. Биофизика. М., 1983, 272с.

10. Акимов В. Н., Владимиров Ю. А. Фазовые переходы в поверхностно-заряженных мембранах//Биологич. мембраны. 1989.Т. 6,N 7. С. 765772.

11. Гегузин Я.Е., Кривоглаз М.А. Движение макровключений в твердых телах. //М.: Металлургия. 1971. 343с.

12. Геннис Р. Биомембраны: молекулярная структура и функции.// Москва «Мир». 1997.

13. Дарст Р. Ионоселективные электроды. М. Мир. 1972

14. Дерягин Б.В., Чураев И. В., Муллер В. М. Поверхностные силы. //М., Наука. 1987.400 С.

15. Козлов М. М., Маркин В. С. Упругие свойства мембран: монослои, бислой, везикулы//Биологич. мембраны. 1988. Т. 5. С. 1013-1029.

16. Красильников О.В., де Круз Ж.Б., Ногуейра P.A. Как измерить диаметр каждого входа у ионного канала, регистрируя только его проводимость?//Биофизика. 1998. с.299-303.

17. Ландау JI. Д. , Лифшиц Е. М. Теория упругости // М. , Наука. 1967. с.246

18. Лев А. А. Ионная избирательность клеточных мембран //М. Наука. 1975. 323 С.

19. Лейкин С. Л, Глазер Р. В., Черномордик Л. В. Механизм образования пор при электрическом пробое мембран // Биологич. мембраны. 1986. Т. 3. С. 944-951.

20. Маркин B.C., Козлов М.М. Статистика пор в бислойных липидных мембранах. //Биологические мембраны. 1985. т.2. с.205-223.

21. Меликов К.Ч., Самсонов A.B., Пирутин С.Н., Фролов В.А. Исследование индуцированных электрическим полем малых флуктуаций проводимости бислойных липидных мембран. // Биологические мембраны. 1999. т. 16 №1, с.95-102

22. Моравец Г. Макромолекулы в растворе. М.: Мир, 1967. 398с.

23. Пастушенко В.Ф., Черномордик Л.В., Чизмаджев Ю.А. Определение линейного натяжения бислойных липидных мембран по времени ихжизни в электрическом поле. // Биологические мембраны. 1985. т.2., с.813-819.

24. Петров В.В., Мольнар A.A., Иванов A.C., Предводителев Д.А., Антонов В.Ф. Появление одиночных липидных каналов ионной проводимости в немодифицированных бислойных мембранах при температуре фазового перехода. // ДАН СССР, 1978, т.239, №5, с. 12451247.

25. Петров В.В., Осин Н.С., Предводителев Д.А., Антонов В.Ф. Ионная проницаемость бислойных мембран из синтетических фосфолипидов в области фазового перехода. //Биофизика, 1978, т.1, с.61-65.

26. Смирнова Е.Ю., Шевченко Е.В., Антонов В.Ф. Модель формирования одиночных ионных каналов при фазовом переходе бислойных липидных мембранах. Биофизика. 1992. Т.37, с. 394 ВИНИТИ № 4801-В91.

27. Хилле Б. Мембраны: ионные каналы. М. Мир. 1981.

28. Черномордик Л.В., Сухарев С.И., Абидор И.Г. Долгоживущие дефекты в липидных бислоях после обратимого электрического пробоя. Биологические мембраны. 1984, т.1, с. 1230-1237.

29. Чизмаджев Ю.А., Черномордик Л.В., Пастушенко В.Ф., Абидор И.Г. Электрический пробой бислойных липидных мембран // Биофизика мембран. Т.2. Ионные каналы и их модели. М. , ВИНИТИ. 1982. С. 161-266.

30. Шевченко Е.В., Смирнова Е.Ю., Черныш A.M., Антонов В.Ф. Влияние электрического поля на фазовые свойства БЛМ из фосфатидной кислоты. // Структурные особенности и функциональные свойства биологических систем. М. Наука. 1987. С.30-33.

31. Шевченко Е.В. Поры и стабильность бислойных липидных мембран в области фазового перехода гель-жидкий кристалл. Дис. д-ра биол. Наук. М.1993.

32. Agre P. Aquaporin water channels: from atomic stricture to clinical medicine.2006,2(4), 266-276.

33. Antonov V.F., Petrov V.V., Molnar A.A., Predvoditelev D.A., Ivanov A.S. The appearance of single-ion channels in unmodified lipid bilaer membranes at the phase transition temperature.// 1980, Nature. 1980. V.283. P.585-588.

34. Antonov V.F., Shevchenko E.V., Kozhomkulov E.T., Molnar A.A., Smirnova E.Yu. // Biochem Biophys Res Commun. 1985. V.133. P. 10981103.

35. Arakawa Т., Timasheff S.N. Mechanism of poly(ethylene glycol) interaction with proteins. Biochemistry. 1985. v.24, p.6756-6762.

36. Bangham A.D., de Gier J.O., Greville G.P. Osmotic properties and water permeability of phospholipid liquid crystals. Chem. Phys. Lipids. 61, 1967. v.l. p.225-246.

37. Benz R., Zimmerman U. (1981) High electric field effects on the cell membranes of Ha licys tic parvala. Planta 152, p. 314-318.

38. Benz R., Zimmerman U. The resealing process of lipid bilayers after reversible electrical breakdown. BBA, 640 (1981), 169-178.

39. Berezhkovskii A.M., Bezrukov S.M., Bicout D.J., Weiss G.H. The influence of polymer on the diffusion of a spherical tracer. J. Chem. Phys. 1999, v.lll, p.5641-5644.

40. Bezrukov S.M., Kasianowicz J.J. The charge state of an ion channel controls neutral polymer entry into its pore. Eur. Biophys. J. 1997, v.26, p.471-476.

41. Blume A. Apparent Molar Heat Capacities of Phospholipids in Aqueous Dispersion. Effects of Chain Length and Head Group Structure, Biochemistry, 22,5436-5442,1983.

42. Bockmann R.A., Hac A., Heimburg T., Grubmuller H. Effect of Sodium Chloride on a Lipid Bilayer. // Biophysical J. 2003, v.85, p. 1647-1655.

43. Boheim G., Hanke W., Eibl H. Lipid phase transition in planar lipid membrane and its effect in carrier-and pore-mediated ion transport // Proc. Natl. Acad. Sci USA. 1980. V.77. P.3403-3407 +6jiokhot

44. Braganza L. E., Blott B. H. , Col T. J. , Melville D. Dye permeability of phase transition in single binary component phospholipid bilayers // Bioohim. Biophys. Act a. 1983. V. 731. P. 137-144.

45. Chernomordik L.V., Sukharev I.S., Abidor I.G., Chizmadzhev Yu.A. The Study of the BLM Reversible Electrical Breakdown Mechanism in the Presence of U02+2 // Bioelectrochem Bioenerg. 1982. V.6. P. 149-155.

46. Chernomordik L.V., Kozlov M.M. The shape of lipid molecules and monolayer membrane fusion. BBA. 812. (1985).643-655.

47. Cunningham B.A., Shimotake J.E., Tamura-Lis W., Mastran T., Kwok J.T., Kaufman J.W., Lis L.J. // Chem Phys Lipids. 1986. V.39. P.135-143.

48. Derjaguin B.V., Prikhorov A.V. On the Theory of the Rupture of Black Films. J. of Colloid and Interface Science(1981). Vol.81, N 1, p. 108-115.

49. Dimitrov D.S., Jain R.K.(1984), Membrane stability, Biochimica et Biophysica acta, 779, (1984), .p.437-468.

50. Eisenmann G. // Biophys J (Suppl). 1962. P.259-323.

51. Elamrani K., Blume A. BBA. 1983, v.727, p.22-30

52. Elamrani K., Blume A. Phase transition kinetics of phosphatidic acid bilayers. A stopped-flow study of the electrostatically induced transition. Biochim. Biophys. Acta. 1984. V. 769. P. 578-584.

53. Eldridge C., Morowitz H.J. // J Theor Biol. 1978. V.73. P.539-548.

54. Evans E., Kwok R. Mechanical calorimetry of large DMPC vesicles in the phase transition region. // Biochemistry. 1982. V. 21. P. 4874-4879.

55. Fahey P.F., Webb W.W. Lateral diffusion in phospholipid bilayer membranes and multilamellar liquid crystals. Biochemistry, 1978, v. 17, 3046-3053.

56. Freeman S.A., Wang M.A., Weaver J.C. Theory of Electroporation of Planar Bilayer Membranes: Predictions of the Aqueous Area, Change in Capatitance, and Pore-Pore Separation // Biophys J. 1994. V.67. P.42-56.

57. Glaser R.W., Leikin S.L., Chernomordik L.V., Pastuschenko V.F., Sokirko A.V. Reversible electric breakdown of lipid bilayers: formation and evolution of pores// Biochim Biophys Acta. 1988. V.940. P.275-287.

58. Frenkel J. Kinetic Theory of Liquids; Dover: New York 1946, p.366.

59. Hui S. W. Geometry of phase separated domains in phospholipid bilayers by diffraction - contrast electronmicroscopy // Biophys. J. 1981. V. 34(3). P. 383-395.

60. Israelashvili J. N., Pashley R. M. Measurement of the hydrophobic interaction between 2 hydrophobic aqueouselectrolyte solutions.// J.Coll. j.Sci. 1984. V. 98(2). P.

61. Israelashvili J. N., Mitchell D.J., Ninham B.W. Theory of selfassembly of lipid bilayers and vesicles. // Ibid., 1977, v.470, p.185-201.

62. Israelashvili J. N., Marcelja S., Horn R.G. Physical principles of membrane organization. Quart. Rev. Biophys. 1980. v. 13, p. 121-200.

63. Kharakoz D.P., Colotto A., Lohner K., Laggner P. Fluid-Gel Interphase Line Tension and Density Fluctuations in DPPC Multilamellar Vesicles. An Ultrasonic Study. J Physical Chemistry. 1993

64. Kong G., W. Petros, Colvin M., D. Needham and M. Devhirst. Efficacy of liposomes and hyperthermia in a human tumor: importens of triggered drug release . Cancer research, 2000, 60, 6950-6957

65. Kozlov M.M., Chernomordik L.V., Markin V. A mechanism of formation of protein-free regions in the red blood cell membrane: the rupture of the membrane: the membrane skeleton./ 1990, J. of Theorecal Biol., v.144, 347-365.

66. Krasilnikov O.V., Da Cruz J.B., Yuldasheva L.N., Nogueira R.A. A novel approach to study the geometry of the water lumen of ion channels: colicin la channels in planar lipid bilayers. J. Membr. Biol. 1998, v.161, p.83-92.

67. Krebs K.E., Phillips M.C. The Helical Hydrophobic Moments and Surface Activities of Serum Apolipoproteins. Biochim. Biophys. Acta. 1985. v.809, p.228-235.

68. Lawaczeck R. Defect structure in membranes. Ber.Bunsenges.Phys.Chem. 1988.v.92, p.961-963

69. Lee A.G. Lipid phase transition and phase diagram. I. Lipid. Phase transitions. // Biochem. et biophys. Acta. 1977. v.472. p.237-281.

70. Lee A.G. Interactions of Lipids and Proteins: Some General Principles. J.Bioenerg. and Biomemb., v. 19, p.581-603.

71. Lee R.C., Hannig J. // Surgical Res. 2001. V.25.P.297-305.

72. Luzzatti V., DeRosz M., Gulik A., Gambacorta A. Polar Lipids of Thermofilic Procariotic Organismus: Chemical and Physical Structure, Ann. Rev. Biophys. Chem., 1987, v.16, p.25-47.

73. MacKinnon R. Nobel Lecture. Potassium channels and the atomic basis of selective ion conduction. Biosci. Report, 2004,24(2), 75-100

74. Marra J., Israelachvili J. Direct Measurements of Forces between Phosphatidylcholine and Phosphatidylethanolamine Bilayers in Aqueous Electrolyte Solutions.//Biochemistry 1985, v.24, p.4608-4618.

75. Mcintosh T.J., Simon S.A., McDonald R.C. // Biochim. Biophys. Acta, 1980. V.577, P.445-463

76. Merzliak P.G., Yuldasheva L.N., Rodrigues C.G., Carneiro C.M., Krasilnikov O.V., Bezrukov S.M. Polymeric Nonelectrolytes to Prode Pore Geometry: Application to the á-Toxin Transmembrane Channel./ J. Biophys. 1999, v.11, p.3023-3033.

77. Michel H. Crystallization of Membrane Proteins. 1983. TIBS, v.8, p.56-59.

78. Montal M. Formation of bimolecular membranes from lipid monolayers // Msthods of Enzymology. 1974. V. 32. Biomeiribranes. Part B. N.-Y. P. 545 554.

79. Mouritsen O.G. Bloom M. Mattress model of lipid protein Interactions in Membranes. Biophys., 1984. v.46., p. 141-153.

80. Mouritsen O.G. Theoretical models of phospholipid phase transitions. Chemistry and physics of lipids. 57 (1991), p. 179-194.

81. Mueller P., Rudin D.O., Tien H.Ti., Wescott W.C. Reconstruction of cell membranes structure in vitro and its transformation into an excitable system. Nature. 1962. Vol.l94.p.705-709.

82. Papahadjopoulos D. Effect of bivalent cations and protems on thermotropic properties of phospholipid membranes, j. Colloid. Interface Sci. 1977. V. 58. P. 459-470.

83. Pastushenko V.F., Chizmadzhev Yu.A., Arakelyan V.B. Electric Breakdown of Bilayer Lipid Membranes.II.Calculation of the membrane lifetime in the steady-stable diffusion approximation. Bioelectrochem. Bioenergl979., v.6, p.53-63.

84. Petrov A.G., Mitov M.D., Derzhansky A.I. 1980. Edge energy and pore stability in bilayer lipid membranes In Advances in Liquid Crystal Research and Applications, p. 695-737, Oxford/Budapest.

85. Pohl P., Saparov S.M., Antonenko Y.N. The size of the unstirred layer as a function of the solute diffusion coefficient. Biophys. J. 1998, v.75, p. 14031409.

86. Powell K.T., Weaver J.C. Transient aqueous pores in bilayer membranes: a statistical theory. Bioelectrochem. Bioenerg. J., 1986. № 15, p. 211-227.

87. Prats M., Tocanne J.E, Teissie J. //Biochimie, 1989. V.71. P. 33-36.

88. Rubenstein J.R, Smith B.A., McConnel H.M. Lateral diffusion in binary mixtures of cholesterol and phosphatidylcholines./ Proc. Natl. Acad. Set. USA, 1979, v.76, №1, p.15-18

89. Taupin C. , Dvolaitzky M. , Sauterey C. The osmotic pressure induced pores in phospholipid vesicles. // Biochemistry, 1975, v. 14, №21 p. 47714775.

90. Tien H. T. Black lipid membranes in aqueous media: interfacial free energy measurements and effect of surfactants on film formation and stability. The Journal of Physical Chemistry, v. 71, p.3395-3402.

91. Tien H. Ti. Bi layer lipid membranes. // Theory and practicl. Marcel Dekker. N.-Y. 1974.

92. Tokumasu F., Jin A.J., Dvorak J.A. Lipid membrane phase behaviour elucidated in real time by controlled environment atomic force microscopy. J. Electron Microscopy. 2002, v.51(l), p. 1-9.

93. Vladimirov Yu.A.1983, Stud.Biophys. v.94, p.l 15-116.

94. Wang Y., Taraoka I. Computer simulation of semibilute polymer solutions in confined geometry: pore as a microscopic probe. Macromolecules. 1997, v.30, p.8473-8477.

95. Weaver J.C. Electroporation: a general phenomenon for manipulating cells and tissues. J. Cell. Biochem., 1993, V. 51, N 4, P. 426-435.

96. Winterhalter M., Helfrich W. Effect of voltage on pores in membranes. Rapid communications. Physical review A., (1987), v.36, p.5874-5876.

97. Zimmerman U., Pilwat G., Riemann F. (1974). Dielectric breakdown of the cell membranes. Biophys.J., 14, p. 881-889.

98. Zimmerberg J., Parsegian V.A. Polymer inaccessible volume changes during opening and closing of a voltage-dependent ionic channel. Nature. 1986, v.323, p.36-39.

99. Zingsheim H.P, Neher E. The equivalence of fluctuation analysis and chemical relaxation measurements: a kinetic study of ion pore formation in thin lipid membranes. Biophysical Chemistry. 2 (1974). P. 197202