Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Мутанты SACCРAROMYCES CEREVSSIAE. Функционально связанные с CHL4-геном, кодирующим компонент дрожжевого кинетохора

ВАК РФ 03.00.25, Гистология, цитология, клеточная биология

Автореферат диссертации по теме "Мутанты SACCРAROMYCES CEREVSSIAE. Функционально связанные с CHL4-геном, кодирующим компонент дрожжевого кинетохора"

институт иитологии российской академии наук

и« На правах рукописи

КОРЯБИН

Максим Юрьевич

МУТАНТЫ 5ДССНАйОМУСЕ5 СЕЙЕУ151АЕ. ФУНКЦИОНАЛЬНО СВЯЗАННЫЕ С СНШ -ГЕНОМ. КОДПРУЮШПМ КОМПОНЕНТ ДРОЖЖЕВОГО КПНЕТОХОРА

03.00.25 - Клеточная биология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук

санкт-петербург 1995

Работа выполнена в Лаборатории генетики митоза Института цитологии РАН, Санкт-Петербург, и в Институте прикладной микробиологии, Вюгеп1гит, Университета г. Базеля, Швейцария.

Научный руководитель: доктор биологических наук Ларионов В.Л.,

Официальные оппоненты: доктор биологических наук Томилин Н.В.,

кандидат биологических наук Яровой Б.Ф.

Ведущее учреждение: Биолого-почвенный факультет

Санкт-Петербургского государственного университета

Защита состоится 1 ЭЭ^ода в /Зч.

на заседании Диссертационного совета Д.002.73.01 Института цитологии РАН по адресу: Санкт-Петербург, Тихорецкий пр., д. 4.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института цитологии РАН

Реферат разослан ^ ?1ЭЭ^года.

Учёный секретарь Диссертационного совета д.б.н. Л.Н.Писарева

© Институт цитологии РАН, 1995

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

В настоящее время в молекулярной и клеточной биологии большое внимание уделяется изучению процессов, связанных с репродукцией клеток и передачей генетической информации от материнской клетки к дочерним. Двумя такими процессами у эукариотических организмов являются вегетативное клеточное деление или митоз и генеративное деление, приводящее к образованию половых клеток - мейоз. В результате этих процессов происходит распределение содержащих генетическую информацию молекул ДНК, ассоциированных в сложные надмолекулярные структуры - хромосомы. Оба эти процесса являются регулярными и служат как средством передачи идентичной генетической информации в ряду поколений вегетативных клеток (митоз), так и средством осуществления генетического многообразия популяции (мейоз). Механизмы репликации и сегрегации эукариотических хромосом в митозе и мейозе остаются малоизученными. Основные трудности их изучения заключаются в а) огромных размерах эукариотических хромосом, б) значительном числе c/5-актив-ных элементов, принимающих участие в репликации и сегрегации хромосом, и в) в сложности организации митотического и мейотического аппарата, число trans-активных элементов которого (как структурных, так и регуляторных) к настоящему времени ещё не поддаётся точному определению.

Пекарские дрожжи, Saccharomyces cerevisiae, являются чрезвычайно удобным объектом для изучения репликации и сегрегации хромосом. Именно у этого объекта впервые были выделены и исследованы eis-активные молекулярные структуры, необходимые для осуществления названых выше процессов. К их числу принадлежат хромосомные репликаторы или ARS-элементы, центромеры, и теломеры. Клонирование этих последовательностей открыло широкий спектр возможностей для изучения процессов митоза и мейоза, позволяя создавать высоко избирательные селекционные системы для идентификации frans-активных элементов этих процессов, давая возможность моделировать эти процессы, в том числе создавать искусственные хромосомоподобные конструкции с заданными параметрами, как, например, искусственные кольцевые или линейные минихромосомы с устойчивой структурой. Другим преимуществом S. cerevisiae как объекта для изучения процессов репликации и сегрегации хромосом является то, что дрожжевые клетки, в отличие от клеток высших эукариот, способны к вегетативному делению как в гаплоидном так и в ди- или полиплоидном состоянии, а также, в большинстве случаев, легко переносят анеуплоидное состояние. Эти замечательные осо-

х

бенности пекарских дрожжей делают данный организм удобной моделью для исследования событий, связанных как с потерями хромосом, так и с их нерасхождением в митозе или мейозе.

К настоящему времени известно значительное число генов, контролирующих процесс сегрегации хромосом у S.cerevisiae. Одним из таких генов является ген CHL4, мутанты по которому впервые были получены в Лаборатории генетики митоза ИЦ РАН. Замечательной особенностью одной из мутаций в этом гене, chl4-1, является относительно стабильное поддержание мутантными клетками дицентрических плазмид без перестроек. Эта особенность делает CHL4 особенно ценным объектом для изучения контроля митотической сегрегации хромосом. Продукт гена CHL4 предположительно является компонентом дрожжевого кинетохора.

Цели и задачи исследования

Целью данной работы является изучение природы мутации chl4-1, а также более детальное выяснение места CHL4 в митозе путём поиска клеточных компонентов, взаимодействующих с продуктом гена CHL4.

В связи с этим, задачи исследования определены следующим образом:

1) клонировать мутантную аллель гена CHL4 (chl4-1), определить природу мутации и её влияние на состав и структуру экспрессируемого белка;

2) получить коллекцию мутантов, проявляющий фенотип синтетической летальности в сочетании с мутацией chl4-1;

3) провести генетический анализ синтетических деталей, выявив их основные характеристики;

4) провести более детальный анализ мутанта с наиболее ярким и устойчивым фенотипом синтетической летальности, охарактеризовав его на уровне ДНК и аминокислотной последовательности.

Научная новизна полученных результатов

Клонирована мутантная аллель гена CHL4 - chl4-1, проведена точная локализация сайта мутации, показано, что мутация представляет собой делецию одного основания, вызывающую сдвиг рамки считывания, который приводит к экспрессии укороченного белка, лишённого участка, содержащего гипотетический сайт связывания с ДНК.

Получена коллекция из трёх мутантов ccl (от chl4 co-lethality), проявляющих фенотип синтетической летальности в сочетании с мутацией chl4-1. Для всех трёх мутаций показана моногенная природа, а также принадлежность их к разным группам комплементации.

Клонирован и секвенирован один из генов, принадлежащих к ccl коллекции - CCL1. Показано, что данному гену соответствует открытая рамка

считывания длиной 1392 п.о., кодирующая белок с молекулярным весом 53433 Дальтон, содержащий вероятные сайты фосфориляции протеин киназами (казеин-киназой II, протеин-киназой С и тирозин-киназой), а также две последовательности, возможно формирующие структуры типа лейциновых молний.

Установлено, что ген ССИ является необходимым для жизнедеятельности клетки, поскольку полная его делеция ведёт к гибели клеток. Сделаны наблюдения свидетельствующие в пользу того, что мутация в гене СС1.1 ведёт к несогласованию процессов почкообразования и митоза, которое приводит к гибели клеток в отсутствие продукта гена СН1.4.

Показано, что мутация в гене ССИ (сс11-1) ведёт к снижению стабильности поддержания центромерных плазмид, что позволяет сделать предположение о вовлечённости продукта данного гена в митоз, а также фенотипически сближает этот ген с СН!_ генами.

Практическая ценность работы

В работе получена коллекция мутантов по генам, вовлечённым в процесс репродукции дрожжевых клеток. Из самого метода селекции мутантов следует вывод о функциональной связи соответствующих генов с СН1.4, продукт которого, предположительно, является компонентом кинетохора и, таким образом, непосредственно вовлечён в процесс сегрегации хромосом. Обнаружение мутантов по СС1. генам, по крайней мере, один из которых, ССИ, описан впервые, расширяет поле исследования процессов митоза.

Дрожжевые штаммы, несущие точковые и делеционные мутации в гене ССИ, могут быть использованы в изучении процессов регуляции и координации клеточного цикла дрожжей, а именно почкообразования и сегрегации хромосом.

Апробация работы

Всего по теме дисертации опубликовано 4 работы. Главные результаты исследований публикуются в международном журнале. Результаты отдельных экспериментов были доложены на Международной конференции по генетике и молекулярной биологии дрожжей (Вена, 1992). Апробация работы проведена на заседании Лаборатории генетики митоза Института цитологии РАН 2 ноября 1995 г.

Объём и структура диссертации

Диссертация состоит из введёния, обзора литературы, изложения методов и результатов экспериментов, обсуждения результатов, выводов и списка цитируемой литературы, содержащего 154 источника. Работа изложена на 102 страницах машинописного текста и иллюстрирована 20 рисунками и 6 таблицами.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы

Штаммы и условия культивирования. В настоящей работе использовались гаплоидные штаммы дрожжей Saccharomyces cerevisiae с мутацией ch!4-1: 19А-К58 (MATct ura3-52 Ieu2 his3-A200 trp 1-281 Iys2 ade2-101 met2 chl4-1) и 1A-K72 (MATa ura3-52 ieu2 met2 Iys2 chl4-1), созданные на основе штамма CL4 [Kouprina et al., 1988]. В работе использовались стандартные среды для культивирования дрожжей S. cerevisiae [Захаров и др., 1984; Sherman et al., 1986]. Среда с 5-фторооротовой кислотой (5FOA) содержит 1 г/л 5FOA и 50 мкг/мл урацила [Sikorski and Boeke, 1991]. Для клонирования ДНК и в качестве штамма-хозяина для плазмид был использован штамм Е. coll DH5a. При работе с бактериальными штаммами использовались стандартные жидкие и твёрдые среды для культивирования Е. coli на основе 2xYT [Sambrook et al., 1989].

Ппазмиды, дрожжевая трансформация. В работе использовался ряд широко распространённых дрожжевых и бактериальных плазмид. В качестве челночных центромерных векторов применялись центромер-ные плазмиды из серии pRS, созданные на основе pBLUESCRIPT и содержащие последовательности, необходимые для размножения в Е. coli, кассету для клонирования в полилинкер на основе гена lacZ Е. coli, а также дрожжевые последовательности CEN6 и ARS Н1 для репликации и стабильного поддержания в дрожжах в количестве 1-2 копий на клетку. Кроме того, указанные плазмиды содержат дрожжевые селективные маркеры: pRS413- HIS3, pRS414-TRP1, pRS415- LEU2 и pRS416- URA3 [Sikorski and Hieter, 1989]. Ген CHL4 вводился в дрожжевые клетки в составе плазмиды pRS415+CHL4 [Kouprina et al., 1993] или плазмиды pRS416+CHL4. Обе плазмиды созданы на основе векторов pRS415 или pRS416 и содержат фрагмент дрожжевой ДНК длиной Зт. п. о., включающий в себя 1374 п. о. последовательность гена CHL4. Трансформация дрожжей S. cerevisiae осуществлялась согласно методике, включающей в себя обработку клеток ацетатом лития с использованием однонитевых молекул ДНК в качестве носителя [Schiestl and Gietz, 1989].

Клонирование мутантной аллели гена CHL4. Клонирование му-тантной аллели гена CHL4 (ch)4-1) проводилось ло методу заполнения разрыва (gap repair) [Rothstein, 1991]. Для точной локализации участка, содержащего мутацию, была совершена серия замен ряда участков плазмиды, содержащей аллель ch!4-1, на соответствующие участки плазмиды pRS415+CHL4. Результирующие рекомбинантные плазмиды были транс-

формированы в штамм 1А-К72 для определения их способности компле-ментировать chl4-1 мутацию. Нуклеотидная последовательность участка ДНК, содержащего chl4-1 мутацию, была определена по методу Сэнгера [Sanger et at., 1977] с использованием набора для секвенирования Dye deoxy terminator cycle sequencing kit и системы для секвенирования ДНК 373А производства фирмы Applied Biosystems.

Получение и отбор сс! мутаций. Мутации, летальные в сочетании с chl4-1 мутацией (синтетические летали) были индуцированы в штамме 19А-К58, предварительно трансформированном плазмидой pRS416+CHL4. Индукция мутаций осуществлялась облучением клеток ультрафиолетовым светом в водной суспензии. Отбор синтетических леталей осуществлялся с использованием метода обратной селекции на среде с 5-фторо-оротовой кислотой (5FOA), который основывается на том, что 5FOA является аналогом субстрата для продукта гена URA3, превращающего 5FOA в вещество токсичное для клетки. Вследствие этого, на среде, содержащей 5FOA, могут выживать только клетки с дефектным геном URA3.

Генетический анализ. В данной работе использовались стандартные методы генетического анализа S. cerevisiae, такие как метод селективных сред и тетрадный анализ гибридов [Захаров и др., 1984; Sherman et al., 1986]. Разделение тетрад осуществлялось с использованием микроманипулятора системы МСМ фирмы Singer. Определение стабильности плазмид в дрожжевых штаммах осуществлялось следующим образом: 1) клетки выращивались на среде, селективной по отношению к плазмид-ному маркеру; 2) методом истощающего штриха клетки высевались на полную среду для получения большого числа отдельных колоний; 3) клетки из отдельных колоний, выросших на полной среде, по шаблону переносились на среду, селективную по отношению к плазмидному маркеру. Стабильность плазмиды определялась как

N* Nl +N",

где N* - количество колоний, способных расти на селективной среде (содержащих плазмиду), N" - количество колоний не способных расти на этой среде, то есть потерявших плазмиду [Kouprina et al, 1988].

Флюоресцентная микроскопия. Для флюоресцентной микроскопии использовался метод окраски ДНК фиксированных клеток 4',6'-диамидино -2-фенипиндолом (DAPI) [Shero et al., 1991]. Клетки наблюдали в видимом и ультрафиолетовом свете с использованием микроскопа Zeiss Axioskop (фазовый контраст, увеличение ЮОх).

Клонирование аллели дикого типа гена CCL1. Для этой цели была использована библиотека дрожжевого генома, созданная на базе вектора pRS413 и содержащая вставки ДНК размером 5-9т. п. о. (продукты частичного расщепления тотального препарата геномной ДНК S. cerevisiae рестрикционным ферментом Sau3A1) в BamHI сайт полилинкера. Геномная библиотека была любезно предоставлена Хорстом Пиком (Horst Pick, Institut für Antgewandte Mikrobiologie, Biozentrum der Universität Basel, Basel, Schweiz). Геномный клон, комплементирующий мутацию сс11-1, был субклонирован для точной локализации предполагаемого гена CCL1. Для подготовки к секвенированию была определена точная рестрикционная карта данного участка ДНК (и короткие, длиной 300-1000 п.о., перекрывающиеся фрагменты были введены в состав векторов pUC19 или pGEM-7Zf(+). Определение нукпеотидной последовательности (секвени-рование) осуществлялось по методу, упомянутому выше. Использовались стандартные "прямой" и "обратный" праймеры. Отдельные участки секвенировались повторно с использованием синтетических праймеров.

Компьютерный анализ. Компьютерный анализ нукпеотидной и соответствующей аминокислотной последовательностей, включал в себя поиск гомологичных последовательностей в базах данных Genebank, EMBL и Swiss Prot, поиск характерных ДНК и аминокислотных мотивов с использованием программы FASTA [Pearson and Lipman, 1988], а также программ DNA Strider™ (для Macintosh) и Profilegraph (K.O.Hofmann, Institut für Biochemie, Universität Köln).

Хромосомная локализация CCL1. В целях локализации гена CCL1 на одной из 16 хромосом S.cerevisiae интактные хромосоМбгдрожжей были разделены с использованием метода электрофореза в переменном поле [Carle and Olson, 1984]. В качестве зондов использовалась ДНК плазмид pDL.16 (содержит ДНК последовательности, фланкирующие CCL1, а также последовательность гена URA3) и pRS406 (содержит только последовательность гена URA3).

Результаты исследования

Мутация сс14-1 приводит к экспрессии белка с С-кониевой деле-цией. Мутантная аллель гена CHL4 (chl4-1) была клонирована, сайт мутации локализован в пределах Neo I - Xba I фрагмента длиной 315 п.о. (Рис. 1). Плазмида, содержащая chl4-1 аллель, получила название рМ.

Секвенирование Neo I - Xba I фрагмента из состава плазмиды рМ показало наличие делеции единственной пары нуклеотидов на участке из 5 адениновых оснований, расположенном через 77 пар оснований после

о

Ndel Neo! B¡;1I1 Neo I Xba 1 Sph 1 Xba I |

I !

i

plAl ... .. -

¡ p2A2--

| рЗАЗ +

I p4A4 ................|

| Рисунок 1. Локализация мутации chl4-1 в составе плазмиды рМ. Ука-i |зана открытая рамка считывания CHL4 и рестрикционные сайты, по которым производилось клонирование фрагментов. Горизонтальные отрезки под рамкой считывания соответствуют фрагментам ДНК, использованным для конструирования плазмид, названия которых указаны слева от отрезков. Знаки "+" и "-" справа от отрезков означают комплементацию мутации chl4-1 или её отсутствие при замене данного фрагмента на [соответствующий фрагмент дикого типа. Затенённым полем отмечена ¡область локализации мутации (Ncol -Xbal фрагмент длиной 315 п.о.).

Neo I сайта. В результате этой делеции происходит сдвиг рамки считывания, который приводит ктерминации трансляции через 6 оснований после сайта мутации. Продуктом мутантной chl4-1 аллели в итоге является значительно укороченный белок, лишённый 159 С-концевых аминокислотных остатков (т.е. более 1/3 длины), включая вероятный сайт связывания ДНК (НТН-мотив).

Получение мутантов ccl, Как указывалось выше, ch!4-1 мутация обладает уникальными свойствами, которые отсутствуют у других известных мутаций в гене CHL4. В то же время отсутствие реверсий этой мутации к дикому типу значительно облегчает работу со штаммами, её содержащими. Поэтому именно штамм с мутацией chl4-1 был выбран для проведения эксперимента по получению мутаций в генах прямо или косвенно взаимодействующих с CHL4. Мутации, летальные в сочетании с chl4-1 мутацией (синтетические летали) были индуцированы в штамме 19А-К58, предварительно трансформированном плазмидой pRS416+CHL4. Результатом селекции на 5-фторооротовой кислоте явился отбор 17-ти SFOA-негативных колоний из общего числа около 10 ООО Ura* колоний. В отобранных штаммах, получивших названия L1 - L17, была проведена проверка стабильности 5FOA" фенотипа. С этой целью клетки каждого

штамма выращивались в жидкой среде без урацила до плотности 107 клеток в мл и высевались на твёрдую среду с 5FOA. После 3-5 дней инкубации большинство штаммов дало значительное число вторичных колоний, демонстрируя высокий уровень фенотипической нестабильности, вероятно за счёт реверсии. Такие штаммы не использовались для дальнейшего анализа. Один из штаммов, L7, имел относительно стабильный 5FOA' фенотип, а два штамма, L1 и L15, были полностью стабильны.

Для того, чтобы проверить, вызван ли 5FOA" фенотип именно невозможностью утраты плазмидной копии гена URA3 дикого типа, а не иными возможными причинами, была проведена проверка 1) стабильности Ura* фенотипа в полученных штаммах при росте на среде без урацила или на полной среде, 2) наличия в клетках ллазмиды PRS416+CHL4 и 3) стабильности lira* фенотипа в диплоидах, полученных в результате скрещивания мутантных штаммов со штаммом дикого типа.

1) У всех трёх мутантных штаммов ни одной Ura~ колонии не было обнаружено среди 400-500 колоний, не зависимо от того, были ли клетки выращены на селективной или полной средах. Таким образом, 5FOA" фенотип полностью сцеплен со 100% стабильностью Ura* фенотипа.

2) Из клеток каждого мутантного штамма, выращенных на среде без урацила, была выделена плазмидная ДНК и трансформирована в E.coli. Все 6 изолятов дали ампициллин-устойчивые колонии E.coli, рестрикци-онный анализ плазмид, выделенных из бактерий, показал их полную идентичность с исходной pRS416+CHL4 плазмидой.

3) Все три мутантных штамма, L1, L7 и L1S, были скрещены с близкородственным штаммом 1А-К72 противоположного (МАТа) типа спаривания. В полученных в результате скрещивания диплоидных штаммах К101, К107 и К115, была определена стабильность Ura* фенотипа при росте на среде без урацила. Во всех трёх случаях наблюдалось выщепление Ura' колоний, хотя стабильность Ura4, фенотипа варьировала в довольно широких пределах.

Приведённые выше результаты свидетельствуют о том, что 5FOA" фенотип мутантных штаммов L1, L7 и L15 является рецессивным и обусловлен тем, что утрата клетками плазмиды pRS416+CHL4, а, следовательно, и аллели дикого тиап CHL4, приводит к гибели клеток. Таким образом, в этих мутантных штаммах аллель chl4-1 приобретает летальный фенотип (синтетическая летальность). Описанным мутантам были присвоены следующие имена: cell - штамм L15, ccl2 - штамм L1, и ccl3 - штамм L7 (от англ. chl4 co-lethallty)

е

Генетический анализ сс! мутантов. Для того, чтобы установить обусловлен ли проявляемый мутантными штаммами L1, L7 и L15 фенотип следствием моногенных мутаций, а также определить к скольким группам сцепления принадлежат данные мутации, был проведён их стандартный генетический анализ. Клетки трёх диплоидных штаммов (К101, К107 и К115) были подвергнуты споруляции и последующему тетрадному анализу (по 48 тетрад). Мейотические сегреганты всех трёх штаммов продемонстрировали достаточно высокий уровень выживаемости: 15 полных тетрад у К101, 10-у К107 и 12-уК115. Во всех трёх случаях была обнаружена ясно выраженная сегрегация 2 : 2 5FOA* и 5FOA" мейотических спор. 5FOA негативные сегреганты всех трёх мутантов были скрещены между собой для проведения комплементационного анализа. Во всех скрещиваниях было обнаружено, что гибриды сегрегантов разных исходных диплоидов оказались способными расти на среде с 5FOA, в то время, как гибриды сегрегантов одного и того же исходного диплоида - нет.

Исходя из приведённых выше результатов может считаться установленной идентификация трёх моногенных мутаций, принадлежащих к трём различным группам комплементации, эти мутации получили названия сс11-1 (штамм L15), сс!2-1 (штамм L1) и сс13-1 (штамм L7).

В отношении мутанта сс11 был также проведён комплементационный тест на аллелизм с ch!4. Для этого штамм 1D-K115 (МАТа ch!4-1 ura3-52 ссИ-1 [pRS416 +CHL4]) был скрещен со штаммом дикого типа 4C-K6Q. Анализ мейотических спор полученного диплоидного штамма К315, гетерозиготного как по chl4, так и по ссИ, показал наличие тетрад с расщепленим по признаку устойчивости/чувствительности к 5FOA 2 : 2, 3 : 1 и 4 : 0, что свидетельствует о том, что мутации ссИ-1 и chl4-1 расположены в несцепленных друг с другом локусах.

Все три исходных мутанта были тестированы на способность к росту при повышенной температуре. В качестве позитивного контроля использовался исходный штамм 19А-К58. Было обнаружено, что штаммы L1 и L15 (сс!2-1 и ссИ-1 мутации, соответственно), но не L7 (мутация сс13-1) проявляли ярко выраженный температурочувствительный (Ts) фенотип, т.е. были неспособны расти при температуре 37°С, в то время как различий в скорости роста этих штаммов и 19А-К58 не наблюдалось. Аналогичный эксперимент, но с инкубацией в течение 5-10 дней при пониженной, 11°С, температуре не выявил каких либо различий в скорости роста мутантных штаммов и 19А-К58. Тем не менее, последующий анализ митотических сегрегантов гибридов первого поколения (штаммы К101 и К115) показал как отсутствие косегрегации Ts и 5FOA" фенотипов, так и

о

отсутствие 2 : 2 сегрегации самого Ts фенотипа. Более того, в потомстве гибридов второго поколения (штамм К201 - гибрид от скрещивания 1С-К101 и 1А-К72, штамм К215 - гибрид от скрещивания 1D-K115 и 1А-К72) сегреганты с Ts фенотипом вообще не обнаружены. Это обстоятельство свидетельствует о том, что Ts фенотип исходных штаммов L1 и L15 не сцеплен с мутациями сс11-1 и сс12-1 и, весьма вероятно, является либо следствием ненаследуемых повреждений, полученных в процессе мутагенеза, либо имеет полигенную природу.

Цитологический анализ клеток сс11 мутанта. Микроскопический анализ популяций клеток двойного сс11 и chl4 мутанта (штамм 8В-К215) проводился в видимом и ультрафиолетовом свете для изучения морфологии клеток и распределения ДНК внутри них. Прохождение ядром клетки той или иной стадии митоза регистрировалось по положению и количеству массивов ДНК, флюоресцирующих в ультрафиолетовом свете. Так, 1) клетки с единственным массивом ДНК вблизи центра клетки относились к различным стадиям G<|, S и ранней С2 фаз клеточного цикла; 2) клетки с массивом ДНК, расположенном в шейке почки, и, как правило, имеющим вытянутую форму, относились к ранним стадиям митоза (М) -про- и, возможно, метафазе; 3) клетки с сильно вытянутым гантеле-видным массивом ДНК, протянувшимся из материнской клетки в почку, а также клетки с двумя полностью разделёнными массивами ДНК, один из которых расположен в материнской клетке, а другой - в почке, относились к поздним стадиям митоза - ана- и телофазам. Наблюдения в видимом свете не обнаружили никаких значительных отклонений от нормы (в качестве контроля использовались клетки близкородственных штаммов 19А-К58 и 1А-К72), в то время как наблюдения в ультрафиолетовом свете показали наличие в популяции значительного числа клеток с аберрантной митотической морфологией. Частота клеток, находящихся в различных стадиях митотического деления ядра (мета-, ана- и телофазы), однако, при этом имевших лишь зачаточную или слабо развившуюся почку составляли 10-20% от всей клеточной популяции (Рис. 2). Клетки, имевшие тот же самый фенотип, обнаружены и при анализе штамма 3D-K315 (CHL4 сс11-1) однако на этот раз их частота не превышала 5%. Предположительно, раннее вхождение в митоз является характерной особенностью клеток сс11 мутанта, благополучное завершение такого митоза возможно лишь при наличии продукта CHL4 дикого типа, отсутствие этого белка (в двойном сс11 chl4-1 мутанте при потере плазмидной копии гена) ведёт к остановке деления и, соответственно, к накоплению в популяции клеток двойного мутанта клеток с аберрантной морфологией, хо

А: Фазово-контрастная микроскопия

=■ Флюоресцентная микроскопия

Рисунок 2. Клетки с аберрантным митотическим фенотипом1 в попу-тяции клеток штамма 8В-К215 (сЖ4-1 сс11-1 [рК5416+СН1_4]). Представлены /икрофотографии одного и того же поля сделанные А) в условиях; освещения видимым светом (фазово-контрастная микроскопия) и Б) в; условиях освещения ультрафиолетовым светом. Стрелками выделены:

1 - нормальный митоз (метафаза);

2 - нормальный митоз (ана- или телофаза):

3 - аберрантный митоз: раннее вхождение в митоз, почка находится; 13 ранней стадии развития, ядро - в метафазе митоза;

4а и 46 - аберрантный митоз: раннее вхождение в митоз и заверше-|ие кариокинеза, почка находится на ранней стадии развития деление 1доа завершено;

5 - аберрантный митоз: одиночное ядро находится в молодой почке.

Клонирование CCL1. Наиболее выраженным и стабильным фенотипом синтетической летальности в сочетании с ch!4-1 обладает мутация есИ-1, поэтому дальнейшее внимание было сосредоточено на изучении именно этой мутации. Следующим шагом на этом пути стало клонирование соответствующего гена. Штамм 1D-K115 (МАТа ura3-52 his3-A200 chl4-1 ссИ-1 [pRS416+CHL4]) был трансформирован геномной библиотекой, отбор трансформантов проводился на среде без гистидина. Общее числс трансформантов при трёхкратной повторности эксперимента составляло примерно 10 ООО колоний. Колонии трансформантов были перенесены методом отпечатков на среду с 5FOA, с которой после 5 дней инкубации были отобраны 32 жизнеспособные колонии. Из клеток всех 32 5FOA* His" трансформантов плазмидная ДНК была выделена, перетрансформирована в E.coli и подвергнута рестрикционному анализу. Было обнаружено, что 24 клона из 32 совершенно идентичны друг другу и при расщеплении рестриктазами Hindlll и Xbal дают набор фрагментов, включающий в себя фрагменты вектора pRS413, а также фрагменты, соответствующие геномной вставке в плазмиде pRS416+CHL4 с геном CHL4 и фланкирующими его участками. Подобные клоны могли возникнуть за счёт рекомбинации между pRS416+CHL4 и pRS413 или её производной. Феномен, подобный этому, наблюдался и ранее при работе с мутантами по гену CHL4 (данные не опубликованы). Столь высокая частота рекомбинации между плазми-дами пока не имеет никакого убедительного объяснения, тем более, что уровень хромосомной митотической и мейотической рекомбинации у chl4 мутантов не отличается от клеток дикого типа [Kouprina et al., 1993].

Одна из оставшихся 8 плазмид по результатам рестрикционного анализа содержала в себе ген CHL4. Соответствие этих фрагментов CHL4 было также подтверждено путём блот-гибридизации с использованием в качестве зонда фрагмента гена CHL4. Ещё 6 плазмид не содержали последовательности гена CHL4, что также было подтверждено блот-гибридиза-цией, но при повторной трансформации в 1D-K115 не комплементировали его 5FOA" фенотипа. Все эти плазмиды не использовались в дальнейшем анализе.

Единственная плазмида, рТ16, повторная трансформация которой в штамм 1D-K115 привела к появлению у этого штамма 5FOA* фенотипа, была использована для дальнейшего анализа. Поскольку данная плазмида не содержала последовательности гена CHL4, имелись основания предполагать, что комплементация синтетической летальности происходит за счёт присутствующей в составе этой плазмиды копии гена CCL1 дикого типа, комплементирующей ссИ-1 мутацию. Клетки штамма 1D-K115, 12

содержащие обе плазмиды были выращены на среде без урацила и ги-:тидина (селекция по обеим плазмидам), клонированы истощающим итрихом на полной среде, и методом отпечатков перенесены на среду без 'рацила (селекция по pRS416+CHL4) и на среду без гистидина (селекция ю рТ16). Было обнаружено, что данный штамм может выщеплять мито-■ические сегреганты либо с Ura либо с His" фенотипом, возникающие в зезультате утраты плазмиды pRS416+CHL4 или рТ16, соответственно. Однако, среди более, чем 1 ООО митотических сегрегантов не было обнару-кено ни одного двойного Ura" His' ауксотрофа, то есть жизнеспособные :егреганты, потерявшие обе плазмиды, рТ16 и pRS416+CHL4, в популяции :тсутствовали. При проведении аналогичного эксперимента с Ura' мито-чческими сегрегантами, в их потомстве не было обнаружено ни одной ■lis колонии. Таким образом, было доказано, что клетки двойного ch!<s-1 :г,ии мутанта являются жизнеспособными только в присутствии любой 'з .озух плазмид: pRS416+CHL4 или рТ16. Эти результаты в сочетании с фиведёнными выше данными указывают на присутствие в составе плаз-лиды рТ16 геномного клона, комплементирующего мутацию сс!1-1. Плаз-лида рТ16 содержала геномный клон размером около 7,5 т.п.о. Для более очной локализации CCL1 гена в составе рТ16 плазмида была подвергнута 1астичному расщеплению рестриктазой EcoRI и отдельные фрагменты IHK размером от 1,5 до 4,5 т.п.о. были выделены из агарозного геля, очи-цены и клонированы в EcoR! сзйт полилинкера плазмиды pRS413. Только >дна плазмида, pT16-R2, содержащая геномную вставку длиной 4,1 т.п.о., ¡казалась способной комплементировать мутацию сс11-1, в то время, как >яд других плазмидных клонов либо давал частичную комплементацию, 1ибо вообще не комплементировал фенотип синтетической летальности. Эти данные свидетельствуют в пользу локализации гена CCL1 в пределах ;,1 т.п.о. вставки, входящей в состав плазмиды pT16-R2, поэтому эта тазмида и была использована для дальнейшего анализа.

Секвенирование гена CCL1. Определение нуклеотидной последова-ельности 4,1 т.п.о. EcoRI - BamHI геномного фрагмента в составе плаз-1иды pT1S-R2 производилось по методу Сэнгера, как указано выше. Для юдготовки к секвенированию была определена точная рестрикционная арта данного участка ДНК (использовались рестриктазы Bglll, EcoRI, IcoRV, Hincll и Hindlll) и короткие, длиной 300 -1000 п.о., перекры-;ающиеся фрагменты были переклонированы в состав векторов pUC19 1ЛИ pGEM-7Zf(+). При работе с синтетическими олигонуклеотидами в ачестве матрицы использовалась исходная плазмида рТ16. Стратегия еквенирования проиллюстрирована на Рисунке 3.

I шм

I I

Ык/ 51ч

1м/ .4*

Слот чи

■ '¿.л Ж

НтсН

«да

■Чи, п 1Ш>

й(|Л1

15М

Л\аП I П/к,

1„>Ш ЛЛ7. .ЛЙЙ Ш> ,\<р/ -М'/ I

ССЫ

.«¿о/ ГЛ'У.^

Ь\р1

о ям

Ш11 зп-х

\ilel

зш

ЬатШ 4<Ц(>

Гл«Ш

зт

Х/Л! .«V

! рА\2100 | .........1

рВ1000

Рисунок 3. Рестрикционная карта и стратегия секвенирования | геномного фрагмента, содержащего открытые рамки считывания СС1.1 и ¡ОЯР2. Расстояния указаны в парах оснований от рестрикционного сайта |ЕсоРг1, расположенного левее ССМ. Протяжённость открытых рамок считывания: ССМ - от позиции 675 до 2067, СЖР2 - от позиции 2830 до 2164. Под рестрикционной картой стрелками указаны положения нуклеотидных последовательностей, определённых при секвенировании отдельных субклонов. Направление от 5'-конца к З'-концу. Положения последовательностей, определённых с использованием синтетических олигонуклеоти-дов обозначены пунктирными стрелками с указанием названий олигонук-леотидных праймеров. Также указаны фрагменты, использованные в составе плазмид рАЫ2100 и рВЮО для точной локализации ССМ внутри секвенированного фрагмента.___

Анализ полученной нуклеотидной последовательности показал наличие в составе 4,1 т.п.о. ЕсоИ-ВатН! фрагмента двух открытых рамок считывания длиной 1392 (СЖП) и 66$ (СЖЯ2) п.о., локализованных в разных цепях ДНК в ориентации "голова к голове" (Рис. 3). Размер остальных раккок считывания, обнаруженных в составе секвенированного фрагмента, не превышал 100 и.о., представляется крайне маловероятным то, чтобы эти короткие рамки считывания служили для кодирования белков. Для определения того, какая из двух длинных рамок считывания соответствует гену СС1.1, был проведён дополнительный комплементационный анализ с использованием 1) 2108 п.о. Ара1-№е1 фрагмента, содержащего

:сю ORF1, а также 325 п.о. З'-фланкирующей последовательности и коневой участок ORF2, или 2) 1038 т.п.о. Bglll фрагмента, содержащего всю )RF2, а также 250 п.о. З'-фланкирующей последовательности и 100 п.о. 5'-[зланкирующей последовательности, клонированных в состав вектора iRS416. Производные плазмиды назывались pAN2100 и рВЮОО, соответственно. Только pAN2100 оказалась способной к комплементации синте-ической летальности, в то время как рВЮОО - нет. Данное обстоятельно свидетельствует в пользу того, что именно ORF1, длиной 1392 п.о. оответствует гену CCL1.

Анализ последовательности CCL1. Компьютерный анализ нуклео-идной и аминокислотной последовательностей (базы данных Genebank, :MBL и Swiss-Prot по состоянию на 16 января 1995 года, а также поиск ха-•актерных мотивов ДНК с использованием программы FASTA) не выявил омологми ни с одной известной последовательностью, свидетельствуя о ом, что данный ген до сих пор не был известен, и что он не принадлежит im к одному из семейств генов с хорошо выраженными консервативными IHK доменами. Открытая рамка считывания CCL1 предположительно кодирует белок длиной 463 аминокислотных остатка и молекулярным весом >3 433 Дальтон. Аминокислотный состав белка отличается необычно 1Ысоким (14%) содержания лейцина. Поиск характерных аминокислотных мотивов показал наличие нескольких последовательностей, отвечающих :онсенсусам последовательностей, характерных для сайтов узнавания |ротеин-киназами: 1) сайт фосфорилирования казеин-киназой II в пози-(ии 24; 2) сайты фосфорилирования протеин-киназой С в позициях 149 1173; 3) сайт фосфорилирования тирозин-киназой в позиции 199.

Приведённые выше гомологии могут свидетельствовать о том, что ¡елок, кодируемый геном CCL1, является субстратом для протеин-киназ, газможно, что фосфорилирование и дефосфорилирование носит регуля-орный характер, однако, не следует переоценивать важность такого наблюдения, поскольку указанные здесь сайты узнавания имеют очень ши-юкое распространение среди всех классов белков. Поэтому наличие айтов фосфорилирования ещё не означает, что фосфорилирование име-т место в действительности. На участках в положениях 160-194 и 267-301 сно прослеживается периодичность расположения лейциновых остат-ов: если сгруппировать аминокислотные остатки на этих участках в груп-:ы по 7 (что соответствует двум полным виткам гипотетической а-спи->али), в начале каждой группы окажется лейциновый остаток, исключения оставляют триптофан на первом участке и изолейцин - на втором. Подобная периодичность характерна для белковых доменов, носящих назва-

X®

ние лейциновых молний (leucin zipper), обнаруженных в ряде ДНК-связы вающих регуляторных белков активных в состоянии димеров, при этом димеризация осуществляется по участкам лейциновых молний [Landshub et al., 1988]. Однако, нельзя наверняка судить что указанные участки белка, кодируемого CCL1, также способны формировать такие структуры.

Делеция гена CCL1. При in vitro конструировании делеционной аллели гена CCL1 1340 n.o. Clal-Bglll фрагмент, включающий в себя 96°/ рамки считывания гена CCL1 был удалён и заменён на 1,1 т.п.о. Clal-BamHl фрагмент из состава плазмиды pAS58, содержащий последовательность гена URA3 делеционная аллель гена CCL1 получила название сс11-Д1. 3,4 т.п.о. рестрикционный фрагмент, соответствующий этой аллели, был выделен из геля, очищен и трансформирован в диплоидный штамм К61. Присутствие обеих аллелей CCL1 и сс11-Д1 во всех трансформантах было установлено по гибридизации по Саузерну. Один из трансформантов, получивший название K61-DL15, был использован для тетрадного анализа, Все 28 проанализированных тетрад этого штамма содержали только по 2 жизнеспособные споры, в то время, как исходный штамм К61 продемонстрировал высокую выживаемость спор: более 90% тетрад содержал»« по 4 жизнеспособные споры, образовывавшие колонии одинаковой формь и размера. Все жизнеспособные споры из тетрадного анализа K61-DL1J имели Ura' фенотип, то есть содержали аллель дикого типа гена CCL1.

При микроскопическом наблюдении митотических сегрегантов К61-DL15, получивших, предположительно, делеционную аллель сс!1-Д1 былс обнаружено, что споры всё же прорастали и претерпевали несколько, не более 4, митотических делений, после чего прекращали делиться. Е сформированных этими спорами микроколониях обнаружено по 12-1С клеток, включая почки. Обнаружено, что клеточное деление, по видимому, было остановлено на стадии G2 или М, поскольку большинство клеток е микроколониях, если не все, имели т.н. фенотип "большой почки", характерный именно для этих стадий клеточного цикла S.cerevlsiae. Как бы то ни было, эти результаты указывают на то, что делеция гена CCL1 приводит к остановке клеточного цикла, следовательно ген CCL1 является необходимым для жизнедеятельности клеток.

Картирование гена CCL1. При гибридизации фрагментов ДНК, включающих последовательность гена CCL1 с хромосомной ДНК дрожжей, разделённой методом ортогонального пульс-фореза в переменном поле, установлено, что ген CCL1 расположен на одной из хромосом большого размера (IV или XII).

Стабильность центромерных плазмид у сс11 мутанта. Частью ге-етического анализа мутанта ссИ явилось наблюдение за поведением ентромерных плазмид в популяциях мутантных клеток. Как видно из аблицы 1, для мутантов ссИ характерно нестабильное поддержание цен-оомерных плазмид в митозе, что фенотипически сближает мутацию сс11-с chl4-1. Интересной особенностью штаммов с мутацией ссИ-1, однако, впяется то, что низкая стабильность центромерных плазмид у них (481%) сохраняется даже при наличии аллели гена CCL1 дикого типа (см. габильность pRS416+CHL4 в штамме 1D-K215, содержащем плазмиду Т16, стабильность рТ16 и pT16-R2 в этом же штамме и стабильность RS416+CHL4 в гибриде 13С-К315 X 2А-К72, гетерозиготном по гену CCL1).

Таблица 1. Стабильность центромерных плазмид в штаммах с мута-иями ссИ-1 и chl4-1.

Штамм (генотип) pRS416 + CHL4 j pRS416 рТ16 или pT16-R2

D-K215 (chl4-1 ссИ-1 pRS416 +CHL4]) 100% ! 52 ±11,2%* ! - 48 ± 6,5%

3B-K315 (chl4-1) 85 ± 2,6% 1 56 + 9,1% 92 i 6,0%

3C-K315 (ссИ-1) _ | 48 ± 6,6% -

3C-K315 X 2А-К72 ch!4-1/chl4-1 ccl1-1/CCL1) 61 ± 10,0% | -

-j-—-,—,---■ 1

- в знаменателе - стабильность pRS4l6+CHL4 в присутствии в 1етках плазмиды рТ16.

Это обстоятельство свидетельствует о том, что, хотя свойственный утации ссИ-1 фенотип синтетической летальности в сочетании с сЫ4-1 ацессивен по отношению к дикому типу (комплементируется аллелью СП, тем не менее фенотип низкой стабильности центромерных плазмид ссИ мутантов является доминантным. Возможно, что, как и в случае с т14-1, дефект продукта аллели ссИ-1 обусловлен не утратой функции (спрессируемым белком, а изменением этой функции, то есть мутантный 5лок становится токсичным для клетки. В отличие от рецессивной мута-4И сИ14-1 токсичный эффект мутации ссИ-1 не компенсируется (а, вернее, ¡мпенсируется лишь частично, в отношении только взаимодействия с 1)4-1, но не в отношении дестабилизации центромерных плазмид) тичием в клетке копии белка дикого типа. Нельзя исключать вероят-зсть того, что дестабилизация центромерных плазмид и синтетическая гтальность в сочетании с сЫ4-1 обуславливаются разными доменами :лка.

выводы

1. Клонирована мутантная аллель гена CHL4 - chl4-1. Показано, чт её причиной является делеция одого основания, которая вызывает сдви рамки считывания, ведущий к утрате белком участка, содержащег гипотетический сайт связывания ДНК.

2. Получена коллекция из трёх мутантов ccl (от chl4 co-lethality), прс являющих фенотип синтетической летальности в сочетании с мутацие chl4-1. Для всех трёх мутаций показана моногенная природа, а также при надлежность их к разным группам комплементации.

3. Клонирован и секвенирован один из генов, принадлежащих к сс коллекции - CCL1. Показано, что данному гену соответствует открыта! рамка считывания длиной 1392 п.о., кодирующая белок длиной 463 амино кислотных остатка и молекулярным весом 53 433 Дальтон, содержащи! вероятные сайты фосфорилирования протеин киназами (казеин-киназо! II, протеин-киназой С и тирозин-киназой), а также две последователь ности, возможно формирующие структуры типа лейциновых молний.

4. Продемонстрировано, что ген CCL1 является необходимым для жизнедеятельности клетки. Предположительно его роль заключается i координации процессов почкообразования и митоза.

5. Получены предварительные данные о картировании гена ОСИ i составе одной из дрохокевых хромосом наибольшего размера: IV или XII.

ПУБЛИКАЦИИ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

гприна Н.Ю., Кроль Е.С., Корябин М.Ю., Шестопалов Б.В., Блисковский В., Банников В.М., Гизатуллин Р.З., Кириллов А.Б., Кравцов В.Ю., зхарьев В.М., Хитер Ф., Ларионов В.Л. Новый ген, CHL15, контро--фующий репликацию хромосом у Saccharomyces cerevisiae. - Мол. юлогия, 1993, Т. 27, стр. 56Э-588.

трина Н.Ю., Кроль Е.С., Корябин М.Ю., Банников В.М., Кириллов А.Б., 1Харьев В.М., Ларионов В.Л. Стабильное поддержание дицентрических инихромосом у сЫ4-1 мутанта Saccharomyces cerevisiae. - Мол. биология, »93, Т. 27, стр.589-607.

oryabin М„ Kouprina N., Kroll Е., Larionov V. Chl4, a mutant of accharomyces cerevisiae, can stably maintain dicentric plasmids. 16th tsmationai conference on yeast gcnetics and molecular biology, Abstracts of apers, Vienna 1992. - Yeast, 1992, V. 8 Special issue, p. 333. oryabin M., Larionov V., Philippsen P. A new essential gene, CCL1, related to le chromosome segregation control gene CHL4. - Mol. Gen. Genet., 1995, in ness.

ouprina N., Tsouladze A., Koryabin M., Spencer F., Hieter P., Larionov V. lentification and genetic mapping of CHL genes controlling mitotic nromosome transmission in yeast. - Yeast, 1993, V. 9, p. 11-19. ouprina N., Kirillov A., Kroll E., Koryabin M., Shestopalov В., Bannikov V., akharycv V., Larionov V. Identification and cloning of the CHL4 gene controlling iromosome segregation in yeast. - Genetics, 1993, V. 135, p. 327-341.