Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Мутанты с повышеннным содержанием лизина у этанолусваивающих дрожжей Candida utilis

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Мутанты с повышеннным содержанием лизина у этанолусваивающих дрожжей Candida utilis"

ВСЕРОССИЙСКИЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ

ГЕНЕТИКИ И СЕЛЕКЦИИ - ПРОМЫШЛЕННЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ

на правах рукописи

ПРОСВИРОВА Татьяна Юрьевна

МУТАНТЫ С ПОВЫШЕННЫМ СОДЕРЖАНИЕМ ЛИЗИНА У ЭТАНОЛУСВАИВАЮЩИХ ДРОЖЖЕЙ CANDIDA UTILIS

03.00.15 — ГЕНЕТИКА

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 1994

Работа выполнена в секторе генетики метилотрофных дрожжей Научно-исследовательского института генетики и селекции промышленных микроорганизмов.

Научный руководитель доктор биологических наук Толсторуков И. И.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук Тер-Аванесян М. М. кандидат биологических наук Гусятинер М. М.

Ведущая организация — кафедра генетики Московского государственного университета.

Защита диссертации состоится 1994 г.

в ' /_часов на заседании специализированного совета

Д. 098.12.01 при Научно-исследовательском институте генетик» и селекции промышленных микроорганизмов по адресу: 113545, Москва, 1-й Дорожный проезд, д. 1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Научно-исследовательского института генетики и ,селекции промышленных микроорганизмов.

Диссертация разослана « ^ » Сё^т-с 1994

г.

Ученый секретарь специализированного совета кандидат биологических наук

/) а!I / / Щербакова В. И

1Щ1

Актуальность 1£мы. Одно из перспективных направлений

«технологического использования дрожжей - получение кормового и пияевого белка из дрожжевых клеток. Необходимость получения

~ белка из одноклеточных микроорганизмов вызвана недостаточным

удержанием белка и некоторых незаменимых аминокислот в растительных эрмах. Cnoqo6HocTb ряда дрожжей усваивать непищевое сырье (гидролизаты эевесины,метанол, этанол, углеводороды) и высокое содержание белка в ■юмассе (от 45 до 60%) обуславливает перспективность использования их качестве продуцентов микробного белка. Дрожжи Candida utills :пользуют для промышленного получения кормового и пищевого белка на ганоле. В нашей стране освоено производство кормового белка "Эприна" i основе этанола. В качестве продуцента в этом процессе используют рожжи С. utili3, которые характеризуются высоким выходом биомассы при зсте на этаноле (70 - 75%), и высоким (до 55%) содержанием белка в ломассе.

Ценность белка в большой степени зависит от содержания незаминимых ■шнокислот, самой дефицитной из которых является лизин. Один из эзможных путей повышения содержания лизина в дрожжевом белке эздание мутантов, обладающих способностью к сверхсинтезу лизина. Для элучения продуцентов лизина у дрожжей используют методы селекции ггуляторных мутантов с нарушенным механизмом ретроингибирования юсинтеза аминокислоты конечным продуктом. К повышенному биосинтезу лзина приводят также мутации, блокирующие катаболизм лизина на ранних гапах. Такие мутанты - продуценты лизина были получены для ряда рожжей: Saccharomyces cerevisiae, Candida pelliculosa, Yarrowia Lpolytica и др..

Цеди и задачи рдбптн. Целью данной работы являлось получение у эомышленных штаммов этанолу сваивахщих дрожжей Candida utilis мутантов,

способных к повышенному биосинтезу лизина. Для достижения этой це.] были поставлены следующие задачи:

1. Изучение селективных условий для получения мутантов С. иЗДИз устойчивых к структурному аналогу лизина, Б-(2-аминоэтил)-11-цистет (АЭЦ).

2. Получение и анализ АЭЦ-устойчивых мутантов с повышеннь содержанием лизина.

3.Получение мутантов с нарушенным катаболизмом лизина.

4. Получение и анализ мутаций АЭЦ-устойчивости у мутантов нарушенным катаболизмом лизина.

5. Изучение технологических свойств наиболее продуктивных по лизи) мутантов в условиях непрерывного культивирования.

Научная новизна работы Для промышленных штаммов С. иЪ111а ВСБ-651 УФА-2 получена коллекция спонтанных и индуцированных стабильщ мутантов, устойчивых к Б-г-аминозтил-Ь-цистеину, с повышенным 1 сравнению с родительскими штаммами уровнем биосинтеза лизинг содержащих в пуле свободных аминокислот до 20-40 мг лизина в рассче-на 1 г сухой биомассы, что в 10-20 раз превосходит содержат свободного лизина в пуле родительских штаммов. У штамма ВСБ-*6! получены стабильные мутанты с нарушенным катаболизмом лизина (Ьус-). результате поэтапной селекции на основе Ьус-мутантов получены культур! несущие одновременно мутации нарушения катаболизма лизина устойчивости к аналогу. Показано положительное влияние мутации I катаболизму лизина на уровень внутриклеточного свободного лизина аналогорезистентных мутантов. Двойные мутанты накапливали в клеточж пуле до 40-60 мг лизина в рассчете на 1 г сухой биомассы, что в 20-; оаз выше уровня свободного лизина у родительских штаммов. Повышен) уровня свободного лизина у мутантов приводило к повышению суммарного

содержания лизина в биомассе и клеточном белке. У мутантов содержание лизина в клеточном белке составляет 11,0-14,4%, при 7,8-8,5% низина в белке у родительских штаммов.

Практическая ценность работы. Полученные у мутантов С. иШ1а соличества лизина в клеточном белке полностью снимают имеющийся в <астоящее время дефицит лизина в клеточном белке заводских продуцентов. Сорошие результаты по сохранению селектируемого признака, ростовых сарактеристик и конкурентоспособность при непрерывном культивировании в гтерильных и нестерильных условиях на ферментерах "Биофло", показанные [ри анализе одного из мутантов, свидетельствуют о потенциальной юзможности использования таких мутантов в промышленном производстве.

йпрр^йция результатов И публикации. Результаты настоящей работы окладывались на межлабораторных семинарах ВНИИ генетики.

Основные материалы диссертации опубликованы в двух печатных работах, аявке на патент ВО N 93019585 (подана 15 мая 1993г.)

Структура и объем работы, Дисертация состоит из следующих разделов: ведение, обзор литературы, материалы и методы, результаты исследований их обсуждение, список литературы. Работа проиллюстрирована рисунками таблицами.

Материалы И методы. Штаммы дрожжей, использованные в работе: глекционный штамм-продуцент С. игШз ВСБ-651, предложенный ^ециалистами "Вниисинтезбелок" для использования на Башкирском БХК для элучения "Элрина"; штамм С. и1111з УФЙ-2 (депонирован под номером ВКПМ -2126) изолирован нами из популяции промышленного ферментера шкирского БХК.

Среды: Полная среда (г/л): бактопептон - 10, дрожжевой экстракт - 5, покоэа - 20. Минимальная среда (г/л): КН2Р04 - 1, МгЭСМ - 0,5, Саб12 -1, (НН4)2Б04 - 3,5, витамины. 50 -минимальная среда с глюкозой (1%).

БЕ - минимальная среда с этанолом (1Ж). БН -минимальная среда глюкозой (13!) и аминокислотой в качестве единственного источника азот в йонцентрации 1г/л.

Температура инкубирования клеток во всех случаях, кроме специалья оговоренных, составляла ЗОоС.

Анализ чувствительности штаммов к структурному аналогу лизина 3-(2-аминоэтил)-Ь-цистеину, проводили, изучая динамику роста культу! При изучении влияния источников углерода клетки выращивали в жидк< минимальной среде с различными источниками углерода (1%) и АЭЦ концентрации 0,1 г/л, на качалке. При изучении влияния аминокисяс клетки выращивали в жидкой среде БО, добавляя аминокислоты концентрации 0,1 г/л, и на средах того же состава с АЭЦ в концентрац! 0,1 г/л, на качалке. Через 19 ч. инкубации определяли оптическз плотность. При изучении влияния источников азота клетки выращивали жидкой среде БЫ с различными аминокислотами и АЭЦ в концентрации 0 г/л, на качалке. Через 30 ч. инкубации измеряли оптическую плотность.

Мутации индуцировали Н-метил-Ы'-нитро-Янитрозогуа- нидином (НГ 6-гидроксиламинопурином (ГАП) и УФ.

АЭЦ-резистентные мутанты получали на агаризованной минимальн! среде, содержащей АЭЦ в концентрации 0,1 - 12 мг/л: высевали интактн] или мутагенизированные клетки, инкубировали при 37 оС, через 4-7 сут отбирали аналогорезистентные клоны. Источники углерода и азота меняли зависимости от условий эксперимента.

Способность мутантов к повышенной секреции лизина выявляли по способности поддерживать рост ауксотрофных по лизину дрожжей минимальной среде, не содержащей лизин. В качестве штамма-индикато использовали лизин зависимый мутант Р. те№апоПса МН4-643.

Для анализа содержания лизина в клеточном пуле и культуральной

жидкости-, клетки выращивали на качалке при 250 об/мин в течение 0-38 часов в жидкой среде БЕ, осаждали центрифугированием, отбирая упернатант для анализа культуральной жидкости. Клетки дважды промывали олодной водой и экстрагировали из них свободные аминокислоты в течение 0 мин водой при 10.0 оС.. После окончания экстракции биомассу осаждали ентрифугированием, отбирая супернатант — экстракт свободных минокислот.

йликвоту выращенных клеток осаждали на мембранные фильтры "Миллипор 5" , высушивали до постоянного веса. По разнице весов определяли вес ухой биомассы. Сухую биомассу, снятую с фильтров, использовали для пределения содержания общего лизина в белке, для чего биомассу змельчали и гидролизовали 6 н НС1.

Содержание лизина в культуральной жидкости (в мг/л) и в клеточном уле свободных аминокислот (в мг на г сухой биомассы) определяли гтодом тонкослойной хроматографии, калориметрическим методом и с спользованием аминокислотного анализатора. Содержание общего лизина в глке анализировали при помощи аминокислотного анализатора.

При анализе утилизации С14 меченого лизина культуры выращивали в лдкой минимальной среде в течение 20 ч. при аэрации. Выросшие клетки ромывали водой, переносили в минимальную среду без источников азота и ■жубировали при аэрации в течение 2-3 ч., затем осаждали и переносили минимальную среду с лизином в качестве источника азота с добавленным количестве 0,21 мг/л 14С меченым лизином с удельной активностью 340 31/ тМ. Клетки выращивали при аэрации в течение 24 ч., периодически гбирая пробы для хроматографмческого анализа. Хроматографические 1астинки после разделения экспонировали с рентгеновской пленкой в гандартных условиях при комнатной температуре.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

1.ПРОДУКТИВНОСТЬ ПО ЛИЗИНУ штаммов С. UTILIS.

Содержание лизина в биомассе различных штаммов С. utllia по литературным и патентным данным оценивается в 35-41 мг на 1 г биомассы (3,5-4,1*). или около 80 мг на 1г клеточного белка (85S).

Штамм ВСБ-651 - основной продуцент, засеваемый в промышленные дрожжерастильные аппараты Башкирского биохимкомбината, вырабатывающего "Зприн". Промышленное получение биомассы дрожжей в условия» непрерывного нестерильного процесса предопределяет возможность автоселекции и накопления наиболее устойчивых быстрорастущих потомкое исходного штамма. Используя метод, диагностики видов и штаммов дрожжей, основанный на определении их чувствительности к специально подобранном! набору дрожжевых штаммов-киллеров, анализировали популяцик производственных штаммов из аппаратов Башкирского БКК. При анализе большого количества клонов была выделена доминирующая культура (более 80% популяции), по данным киллертипирования отличающаяся от штамма

Таблица 1.

Содержание лизина в штаммах дрожжей C.utilis.

Содержа- Содержа- Содержа-

ние лизи- ние обще- ние обще-

Штамм на в кле- го лизина го лизина

точном в сухой в % от

пуле биомассе суммы ами-

(мг/г)Ь (мг/г) ,М нокислот

C.utilis ВСБ-651 1,7 31,8 8,1

C.utilis УФА- 2* 2,7 30,5 8,2

-"- 14* 1,0 25,7 7,7

16* 3,6 30,7 8,0

-"- 19* 0,9 23,9 7,6

-"- 51* 2,1 26,7 8,1

C.utilis ВСБ-726 0,9 17,0 7,4

- Культуры, изолированные Ферментера.

при анализе популяции заводского

S

СБ-651, однако по физиологическим свойствам относящаяся к виду С. tilia. Один из изолятов этой культуры, обозначенный как УФА-2, был спользован нами для селекции АЭЦ-устойчивых мутантов. Содержание изина в клетках штаммов ВСБ-651, УФА-2, ряда других изолированных в езультате киллертипирования культур (относящихся к виду С. utilis), а акже одного из перспективных штаммов C.utilia ВСБ-726, при росте на реде SE, приводится в табл. 1.

2.ИНГИБИРУКШЕ ВЛИЯНИЕ S-(2-АМИКОЭТИЛ)-L-ЦИСТЕИНА (АЭЦ) НД РОСТ ШТАММА С. UTILIS ВСБ-651.

Ингибирующее влияние структурного аналога лизина

-(2-аминоэтил)-11-цистеина на рост штамма ВСБ-651 в стандартных словиях, на среде SD при температуре ЗОоС, недостаточно эффективно точки зрения отбора устойчивых мутантов. Как видно из графиков на <с. 1, при концентрации АЭЦ 3 г/л подавление роста наблюдали только в гчение первых 20 часов. Повышение концентрации АЭЦ до 10 г/л также не збеспечивало эффективного подавления роста клеток: на агаризованной зеде клеток рост отдельных колоний наблюдали через 3 суток, а через 8 гток наблюдали образование сплошного газона.

Для оптимизации условий селекции был проведен поиск Факторов, эвышакщих чувствительность исходных культур к аналогу. Анализировали шяние таких Факторов как температура культивирования, наличие в >еде аминокислот, использование тех или иных источников углерода и зота.

Мы наблюдали незначительное повышение чувствительности штамма :Б-651 к АЭЦ при использовании мальтозы в качестве источника углерода 1ри сохранении высоких ростовых характеристик в отсутствии аналога).

качестве источника азота, содержащей различные концентрации АЭЦ: а, б контроль (без АЭЦ); в.е) 0,1 г/л; г,ж) 1,0 г/л; д,з) 3,0 г/л Температура культивирования: а,в,г,д) ЗОоС; б,е,ж,з) 37оС.

Также незначительное повышение чувствительности штамма к АЭ наблюдали при добавлении в среду некоторых аминокислот, каких ка аспарагиновая кислота, лейцин, норвалин. Остальные аминокислоты либ повышали аналогоустойчивость штаммов (например аргинин), либо, большинстве своем, не оказывали заметного влияния. Чувствительность штамма к АЭЦ заметно возрастала при повыиени температуры культивирования. Как видно из приведенных на рис.1 кривы роста, при повышении температуры до 37оС на среде Бй АЭЦ в концентраци 0,1 г/л подавляет рост клеток в течение 48 часов, а при концентрат 3,0 г/л - в течение 66 часов.

Наиболее эффективный фактор, повышающий чувствитель- ность штамма АЭЦ - использование аминокислот в качестве единственных источнике азота. В качестве источника азота штамм ВСБ-651 утилизирует практичес* все аминокислоты, слабый рост наблюдали на среде с цистеино» треонином, триптофаном, гистидином> фенилаланином, тирозином. Наиболс заметное подавление роста штамма ВСБ-651 АЭЦ в жидкой среде наблюдали

при использовании в качестве единственного источника азота спарагиновой кислоты, изолейцина, метионина, аланина, лейцина, валина, грина, фенилаланина, глицина, глутаминовой кислоты и пролина. Уценивали чувствительность штамма ВСБ-651 к АЭЦ в концентрации 0,1 г/л \ ага£изованных средах SN с различными аминокислотами при температуре якубирования 37оС. Рост клеток анализировали после 7 суток адбирования. Наибольшая чувствительность штамма ВСБ-651 к АЭЦ в этих гловиях наблюдалась при использовании в качестве источников азота 1утаминовой кислоты, аспарагиновой кислоты, пролина и лейцина. Анализ юнтанных АЭЦ-резистентных мутантов, отобранных на средах SN с 1зличными аминокислотами не выявил заметных различий среди них в эодуктивности по лизину. Мутанты в равной степени были нестабильны по :лектируемому признаку. Отобранные на средах SN АЭЦ-резистентные гтанты, обладали АЭЦ-устойчивостью не только на среде SN с данной 1инокислотой, но и на средах SN с другими аминокислотами в качестве [инственных источников азота.

Изучали динамику роста штамма ВСБ-651 в жидкой среде SN с |утаминовой кислотой, аспарагиновой кислотой, пролином или лейцином в 1честве единственных источников азота, содержащей АЭЦ в концентрации 1 г/л. Клетки выращивали при ЗОоС, в условиях аэрации, периодически •бирая пробы для определения оптической плотности. Максимальная вствительность штамма ВСБ-651 к АЭЦ в условиях эксперимента м.рис.2) наблюдалась на среде с лейцином в качестве единственного точника азота: рост штамма полностью подавлялся в течение 190 часов, и использовании глутаминовой кислоты в качестве источника азота давление роста наблюдали в течение 160 часов, аспарагиновой кислоты -0 часов, пролина - 75 часов.

пролин, в) аспарагиновая кислота, г) глутаминовая кислота, д) лейцин.

Для дальнейшей селекции АЭЦ-резистентных мутантов в качест источника азота использовали гдутаминовую кислоту, так-как она являет более эффективным источником азота для штамма ВСБ-651.

Анализ чувствительности штамма ВСБ-651 к АЭЦ на агаризовакных сред. БИ с глутаминовой кислотой в качестве источника азота и при температу; 37оС, при использовании глюкозы и мальтозы в качестве источник углерода, показал, что влияние источников углерода на Фонё влиян источника азота и температуры на чувствительность штамма к А незначительно и в условиях данного эксперимента не проявлялось.

В результате определения селективных Факторов, повышаю« чувствительность штамма ВСБ-651 к АЭЦ, для проведения дальнейш селекции АЭЦ-резистентных мутантов были выбраны следующие услови минимальная среда с глюкозой в качестве источника углерода глутаминовой кислотой в качестве единственного источника азот температура, культивирования 37оС. Концентрация АЭЦ на первом этапе

селекции составляла 0,3 г/л: при этой концентрации в выбранных елективных условиях на агариэованной среде наблюдали длительное (около суток) подавление роста клеток штамма ВСБ-651, после чего начиналось ыщепление растущих колоний АЭЦ-резистенткых мутантов.

Штамм УФА-2, как и штамм ВСБ-651, был слабочувствителен к нгибирующему действию АЭЦ. Чувствительность штамма УФА-2 к АЭЦ так е возрастала на средах БН с аминокислотами, в частности с глутаминовой ислотой, хотя штамм УФА-2 был более устойчив к аналогу. Отбор ЭЦ-реэистентных мутантов штамма УФА-2 проводили в тех. же селективных словиях, что и ВСБ- 651, но начальная концентрация АЭЦ составляла 3 /к.

3. ПОЛУЧЕНИЕ И ИЗУЧЕНИЕ АЭЦ-УСТОЙЧИВЫХ МУТАНТОВ ШТАММОВ ВСБ-651 И &А-2.

йэп-угтойчивие мутанты итамма ВСБ-651. Было получено 450 спонтанных 197 индуцированных НГ (90 мг/л) мутантов штамма ВСБ-651, устойчивых к ,3 г/л АЭЦ. Из них после пересевов устойчивость к АЭЦ сохраняли 117 26%) спонтанных мутантов и 61 (31%) индуцированных мутантов. По гзультатам ауксонографического анализа было выделено 85 спонтанных и Г индуцированных мутантов поддерживающих рост клеток лизинзависимого гетера. Это свойство коррелировало с повышенным содержанием лизина в где клеток, выращенных на среде БЕ. У 78 спонтанных и 35 <дуиированных мутантов содержание лизина в пуле было повышено по >авнению _с родительским штаммом в 3 - 5 раз и составляло 3,5 - 16,0 (ллиграмм лизина на грамм сухой биомассы (мг/г). Содержание лизина в 'льтуральной жидкости мутантов было незначительным - от 2 до 10 мг/л. некоторых случаях отбор по устойчивости к АЭЦ приводил к получению 'тантов с повышенным содержанием аргинина и орнитина: соответственно в

2,5-3 раза и 4-8 раз по сравнению с родительским штаммом, содержав! аргинина 3,3 - 5,6 мг/г и орнитина - 0,5 - 0,8 мг/г.

В целях стабилизации мутаций и дополнительного повышен! внутриклеточного пула лизина, мутанты последовательно пересевали среды с возрастающей концентрацией АЭЦ, до 3,0 г/л. Отобранные с 3 г, АЭЦ культуры клонировали и у отдельных клонов анализировали содержан: лизина в пуле клеток и в культуральной жидкости. Как и ожидалось, большинства мутантов, отобранных с 3,0 г/л АЭЦ, наблюдало дополнительное повышение продуктивности по лизину. В табл. 2 приведе характеристики наиболее активных мутантов. Результаты анализа обще пула сободных аминокислот на аминокислтном анализаторе показали, ч повышение внутриклеточного пула лизина не снижало внутриклеточный п остальных аминокислот.

Для дальнейшей селекции были отобранны наиболее продуктивн: спонтанные мутанты N 4, 6, 18, 24. Эти мутанты не отличались высок стабильностью при хранении в неселективных условиях: урове внутриклеточного лизина у них падал после хранения в 1,4 - 1,7 раз. Д стабилизации признака клетки мутантов высевали на среду с 3 мг/мл АЭЦ облучали УФ. Использованная доза облучения обеспечивала выживаемость уровне 8 - 20% при росте клеток на полной среде. У каждого Штам отбирали по 100 клонов, выросших на селективной среде на 3-4 сутк После ряда проверок, клонирований с отбором стабильных вариантов бы получены культуры, сохраняющие высокий внутриклеточный пул лизина п культивировании и хранении (см. табл. 2). Полученные мутанты бы устойчивы к 10 г/л АЭЦ.

ДЭП-устойчивые мутанты УФА-2. Отбор мутантов штамма ЗФА-Й на перв этапе проводили на селективной среде с АЭЦ в концентрации 3 г/ Мутации индуцировали ГАП (250 мг/л) и НГ (90 мг/л). Всего было получе

Таблица 2.

зетовые характеристики и распределение лизина у штамма ВСБ-651 мутантов, устойчивых к 3 и 10 кг/мл АЭЦ.

Спорость Ьшп- Соири- Согои- Содерм- Рксчете Рмптм

роен « не ¿м- Ш 1131- >1« 1131- ие обще- сриирне старт

(титтда (1/ис) хэссн и 1 ме- и 1 II»- го 113Ш хошемм штспо

ч 1 (Г/К.1 »1101 !тп»1 > спо! «ободмго общего

«и 1ЦИСТ1 йганск или,Т шна,-5

(к/г),1 («Г/11,С («г/г|,в. (КГ/1)"* («Г/1)»»«

5СВ-651 0,23. 3,2 1,7 <2,0 31,8 >5,44 >101,8

1|М1та,гС-

1о4ш«е I

1 Г/1 №3:

I) пили.

4 ».0.« 3,2 23,0 3,0 1.0. 76,60

6 1.0. 2,9 26,5 3,5 1.0. 80,35

11 1.0. 2,Т 17,8 <2,0 1.0. >48,06

24 1.0. 2,0 18,1 <2,0 1.0. >52,48

82 1.0. 2,7 15,3 10,4 1.0. 51,Т1

«7 1.0. .2,1 13,1 4,4 1.0. 31,81

5) м»ГО.

в 1.0. 2,5 13,6 <2,0 1.0. >34,00

Я 1.0. 2,7 12,7 <2,0 1.0. >34.29

62 >.0. 2,) 12,3 <2,0 1.0. >35,67

111 1.0. » 2,3 10,6 3,0 1.0. 27,38

(щт.тс-

»|П!П (

10 Г/1 ЙЭП-

4-1 0,21 2,7 27,3 4,8 1.0. 78,61

4-! 0,20 3,4 41,2 3,0 47,1 14!,08 163,1

6-1 0,20 2,9 40,7 3,5 1.0. 121,53

6-10 0,21 2,8 43,4 3,0 1.0. 124,52

18-5 0,1! 2,5 28,0 <2,0 46,7 >70,00 >117,0

24-11 0,19 2,Т 26,5 <2,0 1.0. >76,95

24-17 0,20 2,8 32,6 4.3 <2,1 85,58 122,2

82-45 1.0. 2,7 23,3 40,5 1.0. 103,41

82-66 1.0. 2,7 5,1 66,5 1.0. 80,27

82-152 1.0. 3,0 21,3 46,5 1.0. 110,40

* - Измерение проводили в начале логарифмической Фазы.

- Не определялось. <** -Суммарное количество свободного лизина (Т,мг/л), 1родуцируемого клетками в литре культуры: Т = V * Ь+С. <#** - Суммарное количество общего лизина (Б.мг/л), 1родуцируемого клетками в литре культуры.Б = X* М + С.

34 индуцированных мутанта УФА-2, среди которых только 15 (41%)

гтантов сохраняли устойчивость к аналогу после клонирования.

собранные мутанты продуцировали от 2,0 до 11,5 мг лизина в пуле и до

0 мг/л лизина в

культуральной жидкости. Отобранные мутанты были нестабильны. Дл! повышения стабильности и продуктивности первичные мутанты пересевали I течение нескольких генераций на селективной среде с 5 мг/мл АЭЦ, е затем клонировали. Некоторые из отобранных на этом этапе культур, обладали более высокой продуктивностью по лизину (см. табл. 3).

У одного из отобранных мутантов (мутант 8, см. табл.3) поел« повторного НГ-мутагенеза были получены культуры, устойчивые к 10 мг/м1 АЭЦ. Среди них было выявлено 3 стабильных мутанта с более высоки> содержанием свободного лизина (мутанты 8-12, 8-14, 8-16, см. табл. 3).

Таблица 3.

Ростовые характеристики и распределение лизина у штамма УФА-2 и мутантов, устойчивых к 5 и -10 г/л АЭЦ.

Культура Скорость Накопле- Содержа- Содержа- Рассчетное

роста ние био- ние лизи- ние лизи- суммарное

(4-1) * массы на в* кле- на в куль- количество

(г/л), К точном туральной свободного

пуле жидкости лизина

(мг/г),Ь (мг/л),С (мг/л) ,Т

УФА-2 н. о. 3,2 2,7 <2,0 >8,64

Мутанты

УФА-2, ус-

тойчивые к

5г/л АЭЦ

2 н. 0. 3,1 10,6 <2,0 > 32,86

6 Н. О. 2,9 9,9 <2,0 -'28,71

8 н. О. 3,2 16,8 <2,0 >53,76

Мутанты

УФА-2-8,

устойчивые

к Юг/л АЭЦ

8-12 0,23 4,2 21,7 3.5 94.64

8-14 0,15 1,8 31,9 5,4 62, 82

8-16 0,18 2,8 21,8 3,0 64,04

* - Измерения проводили в начале логарифмической фазы роста.

Характеристики АЭЦ-устойЧИВЫХ мутантов, Повышение содержания лизинг К клеточном пуле приводит к повышению содержания этой аминокислоты I биомассе и клеточном белке 'см. табл. 2, 3, 4), В табл. 4 приводятся

данные аминокислотного анализа биомассы для штаммов ВСБ-651, УФА-2 и «которых их мутантов, выращенных на среде БЕ.

Как видно из табл. 2 и 3, повышение содержания лизина в клеточном :уле часто сопровождается некоторым уменьшением скорости роста и выхода >иомассы. Один из полученных мутантов (УФА-2-8-12) сохранял высокие »остовые характеристики родительского штамма (см.табл.3).

При повышении температуры культивирования до 37оС описываемые 1ЭЦ-резистентные мутанты как правило сохраняли способность к ювышенному синтезу и накоплению лизина в клеточном пуле. Более того, 1ри 37оС в ряде случаев наблюдали дополнительное повышение содержания шзина в пуле.

Секреция лизина АЭП-устойчивыми мутантами. Как отмечалось выше, |утанты ВСБ-651 и УФА-2, устойчивые к АЭЦ в концентрации до 3 и 5 г/л !а среде БЕ секретировали незначительные количества лизина: от 2 до 10 1г/л при росте на этаноле в течение 34-36 часов, т.е. при переходе к :тационарной фазе роста.

Мутанты ВСБ-651, устойчивые к 10 г/л АЭЦ (см. табл.2),также слабо :екретировали лизин на среде БЕ. На третьи сутки роста содержание изина в культуральной жидкости достигало 6,5 - 17,4 мг/л. Содержание изина в культуральной жидкости у некоторых штаммов возрастало при ювышении температуры культивирования: клетки, растущие при 37оС :екретировали до 50-65 мл/л лизина. При этом содержание лизина в неточном пуле уменьшалось до 3,0 - 4,5 мг/г.

'дин из спонтанных мутантов, 651-82, устойчивый к 3,0 г/л АЭЦ, екретировал более 10 мг/л лизина (см. табл. 2). Мутант был стаёилен ри хранении и пересевах. Для этого мутанта получали спонтанные мутанты стойчивые к 10 г/л АЭЦ. Было отобрано и проанализированно 160 колоний,

Таблица 4.

Аминокислотный состав биомассы родительских штаммов ВСБ-651, УФА-2 и АЭЦ-устойчивых мутантов 651-4-3, 651-18-5, УФА-2-8-12.

Амино- Содержание аминокислоты (в 5! от суммы аминокислот)

кислоты

ВСБ-651 УФА-2 651-4-3 651-18-5 УФА-2-8-12

аспартат 10,9 9,8 9,9 10,3 9,2

треонин 7,0 6,6 6,9 5,9 5,7

серин 6,1 5,7 5,9 5,2. 5,3

глутамат 14,5 16,5 13,2 13,9 17,9 '

глицин 4,2 3,5 3,8 4,0 3.9

аланин 6,1 6,1 5,5 5,4 6,3

валин 5,5 5,7 5,5 6,1 5,0

метионин 1,0 1,0 0,9 1,1 1,1

изолейцин 4,6 4,7 4,3 5.0 4,4

лейцин 8,4 7,6 7,0 8,0 7,7

тирозин 4,3 4,2 3,6 4,3 3,9

Фенилаланин 5,2 5,6 4,0 4,8 4,3

гистидин 3,6 3,6 3,8 3,6 3,0

лизин 8,1 8,2 14,4 13,7 12,3

аргинин 6,7 7,8 7,9 5,2 6,2

пролин 3,8 3,4 3,4 3,5 3,8

всего 100% 100% 100% 100% 100%

растущих на селективной среде с 10 г/л АЭЦ. Минимальный уровен! секретируемого этими мутантами лизина составлял 4,2 мг/л, максимальны! - 66,5 мг/л, при содержании лизина в пуле у этих мутантов от 5,1 мг/г до 23,3 мг/г. Характерно, что мутанты с более активной секрецией лизинг отличались более низшим содержанием лизина в пуле. Накопление лизина ] культуральной жидкости сопровождалось уменьшением содержания свободное лизина в клетках. При этом суммарная продуктивность лизинг (внутриклеточного и секреторного) не превышала в расчете на суху! биомассу 45 чг/г. Характеристики наиболее продуктивных изолято1 приведены в табл. 2.

На рис. 3 в виде гистограммы приведены сравнительные характеристик! продуктивности по лизину мутантов, устойчивых к различным концентрация» АЭЦ. Повышение йЭЦ-резистентности сопровождается повышением продукцш лизина, при этом в большинстве случаев наблюдается снижение выходе биомассы. У мутантов, устойчивых к 10 г/л АЭЦ

16 *

Рис. 3. Характеристики мутантов штаммов ВСБ-651Щ] и УФА-2 Г^З. устойчивых к различным

концентрациям АЭЦ: А-накопление биомассы (г/л); В- 1)содержание свободного клеточного лизина в биомас- се (мг/г, ИИ): 2) Рассчетное количество

свободного лизина,

продуцируемого клетками в литре культуры гмг/.п.1 п

полученЪ 10-20 кратное повышение содержания свободного лизина по :равнению с родительскими штаммами ВСБ-651 и УФА-2.

4.МУТАНТЫ ШТАММА ВСБ-651 С НАРУШЕННЫМ КАТАБОЛИЗМОМ ЛИЗИНА.

Утилизация лизина штаммом ВСБ-651. Штамм С. цЦНа ВСБ-651 способен гсваивать лизин только в качестве источника азота. Из проверенных штермедиатов катаболизма лизина он использовал в качестве источника 1эота 5-аминовалерат, Ы-а-ацетиллизин (слабо), а-аминоадипат (слабо) !см. табл. 5) Ни один из указанных интермедиатов не накапливался при зосте штамма на среде БН с лизином или на среде с добавлением лизина » концентрации 10 г/л. Анализ культуральной жидкости и экстракта »нутриклеточного пула проводили при промоии тонкослойной хроматографии.

Превращения экзогенного 14С меченого лизина анализировали 1ВТорадиографически также с помощью тонкослойной хроматографии.

Таблица 5.

Рост штамма ВСБ-651 и Ьус- мутантов на различных источниках азота.

штаммы Ы-источники ВСБ-651 10 51 65 101 110 129 171

аммоний 4 4 4 + 4 4 4 4

Ь-лизин 4 0. к. - - - -4 - -

Л-2-ацетиллизин 4- о.к. - - - - - -

А-аминоадтпат -4 - - - - - - -

5 -аминовалерат 4- 4- 4- 4- 4- 4- 4- 4-

о.к. - Через 3-5 суток инкубации начинали выщепляться растущие колонии.

+ - Хороший рост. - . - Отсутствие роста. +- - Слабый рост. -+ - Очень слабый рост.

Меченый 14С лизин добавляли к клеткам, растущим на среде с лизином £ качестве единственного источника азота или углерода. Клетки инкубировали в течение 24 часов, периодически отбирая пробы. На рис. А приведены радиоавтографы хроматограмм клеточных экстрактов у. культуральной жидкости штамма ВСБ-651, растущего на среде с лизином I качестве источника азота (I) и источника углерода (II). На среде с аммонием утилизация экзогенного лизина в качестве источника углерода е клетках практически не происходит: меченый лизин, хотя и поглощается клетками, остается в пуле и культуральной жидкости в неизменном виде. При росте штамма ВСБ-651 на среде БЫ с лизином 14С меченый лизин поел« внесения его в среду быстро поглощается клетками. При этом, лиэиь претерпевает различные превращения, в результате которых как внутр» клеток, так и в среде накапливаются меченые интермедиаты, различающиес? по хроматографической подвижности.

подучен-ие индуинрованных мутантов ВС£-651... ыя усваивающих лизин : качестве единственного источника алаха. < Ьус-мутанты) . Для получени» ЬУс-мутантов штамма ВСБ-651 клетки обрабатывали ИГ и рассевали на

1В

# • ч.

%

1#мШ* -о,

у ** „ СЗ-СГНйь

Рис. 5. Радиоавтографы хроматограмм клеточных экстрактов (КЭ) и :ультуральной жидкости (КЖ) штамма БСБ-651, растущего на среде с 14С |еченым лизином в качестве источника азота (I) или углерода (II). ¡роматографическое разделение проводили в системе

13опропанол-этилацетат-аммиак-вода. Время после начала инкубации с |еченым лизином: 1 - 1ч., 2 - 2ч., 3 - 24ч. На дорожке К указаны юложения маркеров: а) лизина, б) оЬ-ацети л лизина, в) 6,-ацети л лизина, г) 1иацетиллизина.

полную среду для получения отдельных колоний. Выросшие колонии 1ерепечатывали на селективные среды и отбирали мутанты, не растущие на :реде БН с лизином. Мутанта пересевали и клонировали на полной среде, ювторно проверяя фенотип на селективных средах. В результате двух >пытов по мутагенезу было проанализировано 7,3 * 10 4 колоний, выросших юсле обработки мутагеном. После анализа роста выделенных Ьус-мутантов :начала на твердых, а затем в жидких средах с лизином, ЭЕ и в среде >ез источников азота было отобрано б мутантов, не способных 'тилизировать лизин (Ш 10, 51, 65, 101, 129, 171), и один мутант, :лабо утилизирующий лизин (Я 110) (см. табл. 5).

По скорости роста и выходу биомассы на средах SD и SE Ьус-мутанты н отличаются от штамма ВСБ-651. Ьус-мутанты сохраняют способност усваивать аминокислоты (за исключением лизина) в качестве источнико азота, однако, их рост на аминокислотах несколько медленнее, чем родительского штамма. Все Ьус-мутанты более чувствительны ингибируюшему действию АЭЦ, чем родительский штамм ВСБ-651.

При росте на среде SD с 10 мМ лизином Ьус-мутанты поглощаю экзогенный лизин и накапливают его в клетках в больших количествах чем родительский штамм (см. табл. 6). Сравнение содержания свободног лизина в клетках у Ьус-мутантов и штамма ВСБ-651 при росте на среде S и БЕ показало, что 1ус-мутации практически не влияют на количеств лизина в клетках. Содержание лизина в пуле у мутантов составляет 0,8 1,6 мг/г.

Таблица 6.

Содержание внутриклеточного лизина у Ьус- мутантов при росте на среде SD с 10 мМ лизина.

Штамм ВСБ-651 10 51 65 101 110 129 171

пул лизина (мг/г) 41 ,0 62,2 71,0 115,1 59, 3 83,5 85,5 57,4

Методом авторадиографии сравнивали превращения 14С меченого лизин в клетках Ьус-мутантов и родительского штамма ВСБ-651. При росте н среде ВН с лизином, превращения лизина у мутантов заблокированы (рис 7). Меченый лизин быстро поглощается клетками мутантов. Большая част поглощенного меченого лизина накапливается клетками в неизменном виде Ьуи-мутанты накапливают в клеточном пуле один или два интермедиата которые после длительного культивирования частично секретируются культуральную среду У мутанта Ьус- N 110, слабо утилизирующего лизин наблюдается медленное превращение меченого лизина и накоплени интермедиатов катаболизма в клеточном экстракте

Рис. 5. Радиоавтографы хроматограмм клеточных экстрактов (КЭ) и :ультуральной жидкости (КЖ) штамма ВСБ-651 (1) и Ьус-мутантов: 10 (2), .1 (3), 65 (4), 101 (5), 110 (6), 129 (7), 171 (8). Клетки росли на греде с 14C меченым лизином в качестве источника азота. ;роматографическое разделение проводили в системе

[зопропанол-этилацетат-аммиак-вода. Время после начала инкубации с 14С [еченым лизином: А - 2 ч. , В - 24ч. На дорожке К указаны положения аркеров: а) лизина,б) «t-ацетиллизина, в) fc-ацетиллизина, г) ,иацети ллизина.

и культуральной жидкости.

Способность Ьус-мутантов поглодать и накапливать экзогенный лизин в

клеточном пуле, сохранение ими чувствительности к аналогу лизина 'АЭЦ, а также данные авторадиографии по превращению 14С меченого лизинг свидетельствуют, что у этих мутантов действительно имеются нарушена катаболизма лизина.

5. МУТАЦИИ АЭЦ-УСТОИЧИВОСТИ У МУТАНТОВ С НАРУШЕННЫМ КАТАБОЛИЗМО» ЛИЗИНА.

Получение и анализ двойных мутантов. Комбинация мутаций устойчивост» к аналогу лизина и мутаций, блокирующих катаболизм лизина, можез приводить к дополнительному повышению продуктивности по лизину. Полученные нами мутанты Ьус-, штамма ВСБ-651 использовали в качеств« исходных культур для получения двойных мутантов, обладающю одновременно устойчивостью к АЭЦ и нарушениями катаболизма лизина.

Спонтанные АЭЦ-резистентные мутации у Ьус-мутантов на всех этапа) получали на среде БН с глутаминовой кислотой, при 35 - 37оС. На перво* этапе отбирали мутанты, устойчивые к 0,1 г/л АЭЦ. Большинстве отобранных АЭЦ-резистентных мутантов сохраняло Ьус-Фенотип. При росте на среде БЕ двойные мутанты содержали от 4,5 до 9,6 мг/г лизина I клеточном пуле, секретируя незначительные количества лизина £ культуральную среду, от 2,0 до 4,6 мг/л. Повышенный уровень лизина £ клетке коррелировал со способностью мутантов вызывать рост лизинзависимой тест-культуры. Также как и некоторые одиночные АЭЦ-устойчивые мутанты, отдельные двойные мутанты отличались повышенны», содержанием аргинина и орнитина в клеточном пуле.

После нескольких проверок для дальнейшей селекции у каждогс родительского штамма (Ьус-) было выделено 1-2 наиболее продуктивных » стабильных двойных мутанта, которые были исходными для селекци» мутантов устойчивых к 3,0 г/л АЭЦ. Полученные двойные мутанты,

устойчивые к 3.0 г/л АЭЦ, содержали от 5,0 до 27,5 мг/г лизина в |уле при незначительной секреции лизина в культуральнув среДу (до 4 1Г/л). Среди них для проведения дальнейшей селекци отобрали мутант 1тамма Ьус- N 51: N 51-2-32. После ряда пересевов он сохранял гтабильно высокий уровень внутриклеточного лизина, 36,9 мг/г (среднее 1начение по трем определениям).

У культуры 51-2-32 получали мутанты, устойчивые к 9 и 12 г/л АЭЦ при емпературе 35оС. Было отобрано 4 колонии с 9 г/л АЭЦ (Ш 1-4) и 4 ;олонии с 12 г/л АЭЦ (Ш 5-8). Отобранные колонии -различались по юрфологии: некоторые из них имели неровную, бородавчатую поверхность, ультуры были расклонированы на полной среде и брло проанализировано по 0 клонов от каждого мутанта. Были выделены наиболее продуктивные, :табильные клоны от мутанта 3 (Ы 3-1 и 3-2) и от мутанта 8 (И 8-1, 8-2, :м. табл. 7). У мутантов снижена скорость роста по сравнению со штаммом СБ-651. При переходе к стационарной фазе роста мутанты продолжают акапливать лизин в клетке, практически не секретируя его в ультуральную среду: концентрация лизина в культуральной жидкости после 0 часов роста не превышала 4,5 - 6,0 мг/л. При повышении температуры

Таблица 7.

Накопление биомассы и распределение свободного лизина у двойных мутантов, устойчивых к 9 и 12 г/л АЭЦ.

Штамм Накопле- Содержа- Содержание Рассчетное

ние био- ние лизи- лизина в суммарное

массы на в кле- культураль- количество

точном ной свободного

(г/л) пуле жидкости лизина

(мг/г) (мг/л) (мг/л)

ВСБ-651 3,1 1,2 <2.0 >3,72

3-1 2,5 46,4 6,0 122,00

3-2 2,7 53,7 4,0 148,99

8-1 2,2 49,1 5,6 113,62

8-2 2,3 52,0 6,0 125,60

инкубации до 37оС у полученных двойных мутантов снижался выхо, биомассы, при этом возрастал пул внутриклеточного лизина. В табл. 1 приводятся средние значения накопления биомассы и лизина некоторым двойными мутантами, полученными на различных этапах селекции, растущи при 37оС. В отличие от остальных мутантов штамм N 3-2 практически Н' растет при 37оС: максимальное значение накопления биомассы не превышал 0,8 г/л.

Для штаммов N 3-1, 3-2, 8-1 получали мутанты, устойчивые к 15 г/. АЭЦ. Мутанты получали при 35оС. Растущие колонии отбирали через 7 суто: инкубации. Среди отобранных 8 АЭЦ-резистентных колоний штамма N 3-1 : 12 - штамма N 8-1 не были выделены мутанты с дополнительным повышение] продуктивности по лизину. Среди 24 мутантов штамма N 3-2 выделили мутанта с повышенным уровнем лизина (см. табл.9). Мутанты, также как 1 штамм N 3-2, не росли при 37оС.

Таблица 8.

Содержание лизина в клеточном пуле и накопление биомассы у двойных мутантов, растущих при температуре 37оС.

Мутанты Содержание Накопление Рассчетное

лизина в биомассы суммарное

в клеточ- (г/л) количество

ном пуле свободного

мг/г) лизина (мг/л),Т

Мутанты

устойчивые к

0,1 мг/мл АЭЦ:

51-2 9,8 2,6 25,5

65-4 7,3 2,7 19,7

3 мг/мл АЭЦ:

51-2-32 32,2 2,7 86,9

-"- 9 мг/мл АЭЦ:

3-1 49,3 1,4 69,0

3-2 67,4 0,5 33,7

12 мг/мл АЭЦ:

8-1 56,3 1,3 73,2

8-2 55,7 1,4 78,0

На рис. 6 в виде гистограммы приведены сравнительные характеристик продуктивности по лизину двойных мутантов, устойчивых к различным

Таблица 9.

Содержание лизина в клеточном пуле и накопление биомассы у штамма N 3-2 и его мутантов, устойчивых к 15 г/л АЭЦ.

Содержание Накопление Рассчетное

Мутанты лизина в биомассы суммарное

пуле (мг/г) (г/л) количество свободного лизина (мг/л),Т

3-2 53,7 2,7 144,9

Мутанты

устойчивые к

15 мг/мл АЭЦ:

5 60,0 2,5 150,0

9 64,5 2,7 174,15

10-20 70,6 2,8 197,68

10-22 80,2 2,7 216,54

концентрациям АЭЦ. Также как и для собственно АЭЦ-уетойчивых утантов (см. рис.3), повышение АЭЦ-резистентности у двойных мутантов

тр/к)

Рис. 6. Характеристики

Ьус- мутантов, устойчивых к различным концентрациям АЭЦ: А-накопление биомассы (г/л); В-1)содержание свободного

клеточного лизина в биомассе

(мг/г, ; 2) Рассчетное

количество свободного лизина, продуцируемого клетками в литре культуры (мг/л,С

о Hi г

к

как правило сопровождается снижением уровня накопления биомасс! однако повышение содержания свободного лизина у двойных мутантов бол< значительно и превышает в 20-40 раз уровень родительских штаммов.

Доказательство сааал Lv.c-мутаиии £ повышенной продуктивностью i лизину 2. двойных мутантов. Повышенное содержание лизина в клетке двойных мутантов может быть как следствием исключительно мутащ резистентности к АЭЦ, так и результатом взаимодействием мутаций АЭ1 резистентности и мутаций Lyc-. Чтобы определить влияние Ьус-мутаций f продуктивность по лизину, мы получили ревертанты по признаку Ly у двойных мутантов N 3-1 и 3-2. Клетки высевали на среду SN с лизином облучали УФ (выживаемость составляла 22SS) и выращивали на чашках пр ЗОоС, отбирая вырастающие через 10 суток колонии. У штамма N 3-1 был отобрано 3 ревертанта, а у штамма N 3-2 - 8. Ревертанты сохранял устойчивость к АЭЦ в концентрации 9 г/л, но частично восстанавливал способность усваивать лизин: на жидкой среде SN с лизином большинств ревертантов

росли медленнее штамма ВСБ-651. Был проведен сравнительный анали продуктивности исходных двойных мутантов N 3-1 и 3-2 и полученных о них Lyc+ ревертантов в наибольшей степени восстановивших споеобност утилизировать лизин. Результаты анализа приведет! в табл. 10 из kotopoi видно, что у ревертантов Lyc+ на 20-30£ снижается содержани< внутриклеточного лизина по сравнению с исходными двойными мутантами. И: полученных результатов можно сделать вывод, что повышенна! продуктивность двойных мутантов - следствие влияния не только мутаци! АЭЦ-резистентности, но и мутации Lyc-. У ревертантов мутанта N 3-5 сохраняется чувствительность к температуре. Не исключено, чт< температурочувствительность мутанта N 3-2,может определяться действие» мутации АЭЦ-резистентности.

Таблица 10.

Содержание лизина в клеточном пуле, накопление биомассы на среде SE и значения оптической плотности (D) при росте на среде SN с лизином у итамма ВСБ-651, двойных мутантов N 3-1 и 3-2, и ревертантов по признаку Lye-.

Штамм Содержание лизина в клеточном пуле (мг/г) Накопление биомассы (г/л) D

ВСБ-651 1,9 3,2 5 70

3-1 47,6 2,8 0 05

3-1-2R 38,9 2,7 4 84

3-1-3R 33,9 2,8 4 81

3-2 55,0 2,8 0 05

3-2-5R 46,2 3,0 4 44

3-2-7R 43,8 2,7 4 66

6.ИЗУЧЕНИЕ ТЕХНОЛОГИЧЕСКИХ СВОЙСТВ МУТАНТОВ-ПРОДУЦЕНТОВ

проверяли в лабораторном 34оС. Штамм

льтивировали в течение 14 суток (336 часов) на среде с 1% этанолом, 4,0 - 4,1. В процессе культивирования достигались устойчивые мостатные режимы со скоростями протока от D = 0,05 до 0,30 1/ч. нные по хемостатному культивированию штамма УФА-2-8-12 представлены в бл. 14. По ростовым характеристикам штамм при культивировании на рментере "Биофло-1" не уступал контрольному штамму ВСБ-651, растущему тех же условиях (см. табл.12). Штамм УФА-2-8-12 анализировали также и непрерывном культивировании в нестерильных условиях; льтивирование проводили в ферментере "Биофло II" (рабочий объем 4 тра) в течение 150 ч. Содержание этанола в среде

ОБОГАЩЕННОЙ ЛИЗИНОМ БИОМАССЫ В УСЛОВИЯХ НЕПРЕРЫВНОГО КУЛЬТИВИРОВАНИЯ. Шхамл УФА-2-8-12. Технологические свойства штамма :ловиях непрерывного культивирования в стерильном грментере "Биофло-1" (рабочий объем 300 мл) при

Таблица 11.

Непрерывное культивирование в стерильных условиях штамма УФА-2 --8-12 на Ферметере "Биофло-1" (рабочий объем - 300 мл). Температура 34оС, рН 4,0-4,1, концентрация этанола IX.

Ско- Длитель- Выход Биомасса Белок Лизин

рость ность от (мг/мл) (по ---------------- --------

про- процесса эта- сумме свобод- - общий к от

тока (ч) нола а. к,) ный (мг/г) суммы

(1/ч) (%) (%5 (мг/г) а.к.

0.08 48 61 6.1 43.2 17.0 42.1 9.75

0.12 72 68 6.8 н. 0.* 20.2 н.о. н.о.

0.15 48 69 6.9 н. о. 22.1 н.о. н.о.

0.20 48 76 7.6 н. о. 25.3 н.о. н.о.

0.25 72 75 7.5 н.о. 29.2 н.о. н.о.

0.30 48 75 7.5 51.9 32.0 63.1 12.2

0.35 всего

вымывается 336 ч

* не определялось.

Таблица 12.

Непрерывное культивирование в стерильных условиях штамма ВСБ-651 на ферментере "БиоФло-1" (рабочий объем - 300 мл). Температура 34оС, рН 4,0-4,1, концентрация этанола 1%.

Ско- Длитель- Выход Биомасса Белок Лизин

рость ность от (мг/мл) (по

про- процесса эта- сумме свобод- общий % от

тока (ч) нола а. к.) ный (мг/г) суммы

(1/ч) (%) (%) (мг/г) а.к.

0.08 72 56 5.6 н.о. н. , о. н.о. н. о.

0.15 48 62 6.2 н.о. н. н.о. н. о.

0.18 72 65 6.5 н.о. 3. .3 н.о. н. , О.

0.22 48 68 6.8 н.о. г. .8 н.о. н. о.

0.25 48 72 7.2 н, 0. 3, .2 н. о. н. , о.

0.30 48 70 7.0 н.о. 3, .5 н. о. н. , о.

0.35 144 56 5.6 35.6 3, .7 32.0 8. .9

всего 480 ч.

составляло 2%. Температура культивирования - 34оС. Скорость прот' изменялась от 0,1 до 0,2 1/ч. Выход биомассы составлял 73-81%. Сред! содержание лизина в клеточном белке (от суммы аминокислот) - 11, Чистота культуры по данным микробиологического контроля составляла-' менее 92% (по клеткам). Как видно из приведенных данных, шъ УФА-2-8-12 имеет вполне удовлетворительные основные росто характеристики. Что касается содержания лизина, то как видно из

приведенных данных, штамм достоверно превосходит по этому признаку 1трольный штамм ВСБ-651, а также селекционированные перспективные 1ммы , например С.цгШз ВСБ-726 (см.табл.1). Проведенные ¡иссионные испытания в стерильных и нестерильных условиях юстатного культивирования штамма УФА-2-8-12 подтвердили, что по ювным производственным характеристикам этот штамм не уступает |ьтуре дрожжей, используемой в промышленном производстве, а по содержанию лизина достоверно превосходит заводской продуцент и ггие селекционируемые культуры, рекомендованные для производства )жжевого белка на этаноле. Штамм УФА-2-8-12 депонирован в коллекции >мышленных микроорганизмов под номером С.и-ЫИз ВКПМ у-2127. Остальные мутанты нуждаются в дополнительном анализе характеристик в ювиях непрерывного культивирования. Полученная коллекция мутантов >жжей С.и-ЫИз с повышенным содержанием лизина в биомассе и гточном белке может служить основой для создания промышленных штаммов юдуцентов обогащенного лизином белка.

ВЫВОДЫ

1. Для промышленных штаммов С. иМИз ВСБ-651 и УФА-2 определены ¡ективные условия для проведения позитивной селекции АЭЦ-резистентных гантов. Заметное повышение чувствительности к аналогу наблюдается при юльзовании в качестве единственных источников азота таких 1НОКИСЛОТ как аспарагиновая кислота, глутаминовая кислота, пролин или 1цин, а также при повышении температуры культивирования до 37оС.

2. Получена коллекция спонтанных и индуцированных АЭЦ-резистентных •антов штаммов ВСБ-651 и УФА-2, содержащих в пуле свободных

аминокислот до 20-43 мг лизина в рассчете на 1 г сухой биомассы, ч в 10-20 раз больше чем у родительских штаммов. Содержание лизина культуральной жидкости этих мутантов не превышало 5 мг/л. Б расчете литр культуры общая продуктивность по свободному лизину составляла 63 до 142 мг.

3. Получены АЭЦ-резистентных мутанты штамма ВСБ-651 секретирующие , 66,5 мг/л лизина в культуральную среду. Увеличение количества лизина среде сопровождалось -уменьшением содержания его в клеточном пуле, рассчете на литр культуры общая продуктивность по свободному лизину таких мутантов составляла 80 - 110 мг.

4. У штамма ВСБ-651 получены стабильные мутанты с блокированным I ранних этапах катаболизмом лизина (Ьус-). В результате поэтапн селекции получены мутанты, несущие одновременно мутации нарушен: катаболизма лизина и устойчивости к аналогу. Двойные мутан1 накапливали в клеточном пуле до 40-80 мг лизина в рассчете на 1 г сух' биомассы, практически не секретируя его в культуральную среду, рассчете на литр культуры общая продуктивность по свободному лизину двойных мутантов составляла от 114 до 216 мг. Показано положительн' влияние мутации по катаболизму лизина на уровень внутриклеточно: свободного лизина у аналогорезистентных мутантов.

5. Повышение уровня свободного лизина у мутантов приводило повышению суммарного содержания лизина в биомассе и клеточном белке, мутантов содержание лизина в клеточном белке составляет 11,0-14,4%, П] 7,8-8,5% лизина в белке у родительских штаммов. Повышение уров! свободного лизина у АЭЦ-резистентных мутантов сопровождалось большинстве случаев снижением скорости роста и выхода биомасс) особенно у двойных мутантов.

6. При анализе мутанта УФА-2-12 были доказаны хорошие результаты по охранению селектируемого признака, ростовых характеристик и знкурентоспособности при непрерывном культивировании в стерильных и гстерильных условиях на Ферментерах "Биофло", что свидетельствует о зтенциальной возможности использования таких мутантов в промышленном эоизводстве.

СПИСОК РАБОТ , ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1) Просвирова Т.Ю., Полодиенко О.Б., Толсторуков И.И,, Мутанты ■ ожжей Candida utilis с повышенным содержанием лизина, Биотехнология, '93, N 10, с. 10.

2) Просвирова Т.Ю., Толсторуков И.И., метаболизм лизина у дрожжей, отехнология, 1994, N 1, с. 2-11.

3) Толсторуков И.И., Просвирова Т.Ю., Полодиенко О.Б., Казанцева И., Цыганков Ю.Д., Стеркин В.И., Градова Н.Б., Сычев А.Е., Андреев С., Штамм дрожжей Candida utilis - продуцент кормового.белка, заявка

патент НО N 93019585 (от 16 апреля 1993г.).

Подписано к печати 12.09.94. Формат 60X84/16. Бумага офс. Печать офсетная. Усл. п. л. 1,86. Тираж 100. Зак. 2569.

Волгоградское арендное производственное полиграфическое предприятие «Офсет». 400001, г. Волгоград, ул. КИМ, 6.