Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Морские гетеротрофные микроорганизмы - продуценты физиологические активных веществ

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Морские гетеротрофные микроорганизмы - продуценты физиологические активных веществ"

РГВ од

На правах рукописи

Михайлов Валерий Викторович

МОРСКИЕ ГЕТЕРОТРОФНЫЕ МИКРООРГАНИЗМЫ -ПРОДУЦЕНТЫ ФИЗИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ

03.00.07 - микробиология 03.00.18 - гидробиология

Автореферат

дссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Владивосток - 1995

Диссертация выполнена в Тихоокеанском институте биоорганической химии Дальневосточного отделения Российской Академии Наук (ТИБОХ ДВО РАН), г. Владивосток

Официальные оппоненты:

Г.П. Сомов, доктор медицинских наук, профессор, акдемик РАМН,

лауреат Государственной премии И.Е. Мишустина, доктор биологических наук В.Г. Тарасов, доктор биологических наук

Ведущая организация - Институт микробиологии РАН, г. Москва

Зашита состоится " 8 " декабря 1995 г. в 10 часов на заседании диссертационного совета Д 003.66. 01 Института биологии моря ДВО РАН по адресу: 690041, Владивосток-41, ул. Пальчевского, 17.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биологии моря ДВО РАН.

Автореферат разослан " / " ноября 1995 г.

Ученый секретарь дисертационного совета, кандидат биологических наук

Л.Л. Будникова

Общая характеристика работы

Широкое распространение среди исследователей микромира получила точка зрения о морских микроорганизмах как прокариотах и грибах, попавших в море со стоками рек или в результате эолового переноса. Это глубоко ошибочное представление основано на игнорировании того, что экосистемы океана, являясь древнейшими на Земле, имеют отличную от суши биоту (Мишустина et at., 1985). Развитие наших знаний показывает, что морской среде обитания присущи особые таксоны архей, бактерий, а также грибов и других микроскопических эука-риот.

Только в начале нашего века и, особенно, в конце 40-х и 50-х годов, пионерами мирской ш1куоСииЛС.ПШ, та:""": как F П Исячмисо. B.C. Бугкевич и К.Э. Зобелл, были сформулированы критерии, нозьолиишие юииршь об истинно морских микроорганизмах (бактериях).

Морские микроорганизмы являются важной составной частью морских экосистем и играют существенную роль в процессах трансформации и минерализации органического материала в морской среде.

Морфологические и физиолого-биохимические признаки и свойства морских микроорганизмов обусловлены влиянием таких специфических факторов среды обитания, как высокая концентрация солей, гидростатическое давление, низкие температуры, неравномерное поступление питательных веществ (Forster, 1887; Исаченко, 1914; ZoBell, 1946; Monta, 1975; и др.).

Характерной особенностью микроорганизмов, обитающих в море, помимо психро-, гало-, и барофильности и толерантности, является также наличие у них комплекса гидролитических ферментов, которые участвуют в процессах микробной деградации молекул агара, хитина, каррагинана, крахмала, нуклеиновых кислот (Yaphe, Baxter, 1955; Kjellerberg, Hakansson, 1977; Austin, 1988; Bianchi, 1995).

Микроорганизмы морской среды способны синтезировать разнообразные биоактивные вторичные метаболиты. Первым сообщил об антагонистических свойствах морских бактерий (против возбудителей чумы и холеры) де Гиакса (de Giaxa, 1889).Только спустя много лет К. Зобелл и его сотрудники (ZoBell, 1946; ZoBell, Upham, 1944; Rosenfeld, ZoBell, 1947), а также другие исследователи (Grein, Meyers, 1958; Baain et al., 1966; Baslow, 1969) вернулись к этому вопросу.

В 1966 году было сообщено о выделении из "Pseudomonas bromouíilis" антибиотика (2,3,4-трибромо-5(Ггидрокси-2',4'-дибромофенил)-пиррол), действующего в очень низких концентрациях на грамположительные тест-культуры (Burkholder et al., 1966). Это был первый случай выделения из облигатной морской бактерии антибиотика, структуру которого удалось установить, причем она оказалась уникальной.

Последнее десятилетие ознаменовалось, без преувеличения сказать, сенсационными открытиями бактериальных продуцентов тетродотоксина (Noguchi et al., 1987; Yasumoto et al., 1986; Siniidu et al., 1987), сакситоксина (Kodama et al., 1990), эйкозапентаеновой кислоты (Yazawa et al., 1988), то есть тех веществ, которые издавна считались метаболитами морских животных, а не их бактериальных симбионтов. Эти примеры говорят о том, что сейчас в химии морских природных соединений наступило время пересмотра казавшихся незыблемыми утверждений.

Многие соединения, изолированные из морских гетеротрофных бактерий, оказались уникальными по своей структуре и/или физиологическому действию (обзоры: Okami, 1993; Fenical, 1993). Например, аминокислотный сиквенс ингибиторов протеаз из Alteromonas sp. показал, что они эволюционно отдалены от ингибиторов протеаз, синтезируемых наземными организмами (Imada et al., 1985; Iniada et al., 1986). Этот, и другие примеры, которые можно привести, показывают, что морские гетеротрофные бактерии синтезируют уникальные по своей структуре и действию вещества, которые не были обнаружены у наземных прокариот, несмотря на более чем полувековую историю таких поисков.

Недостаточно известно о специфических естественных факторах роста и развития морских гетеротрофных бактерий. Обычные среды не могут в полной мере заменить морские источники питания для этих бактерий (сульфатированные полисахариды, морские протеины и т.п.). Поэтому, только около 1% морских микроорганизмов растет в "стандартных" лабораторных условиях и может быть достаточно полно изучено (Austin, 1988; Okami, 1993; Fenical, 1993).

Морская микробиология и химия морских природных соединений развиваются сейчас быстрыми темпами, являясь основой для морской биотехнологии.

Однако, успех на этом пути может быть достигнут только при фундаментальном изучении биологии морских микроорганизмов. Первостепенную роль в этих фундаментальных исследованиях должны играть коллекции культур. Многие

страны поддерживают исследования в области морской микробиологии и биотехнологии. В России же, являющейся морской державой, такие исследовании

почти не ведутся.

Актуальность темы. В последнее время показано, что морские гетеротрофные микроорганизмы являются источниками уникальных по структуре и действию соединений. Поиск продуцентов биоактивных метаболитов и изучение методов хранения, культуральных, физиологических, биохимических, макро- и гт^кр^'^пфопогических. иммунологических, иммунохимических, химических, 1енс1ичс^кнл и л^илеппепятт ""М"™ и ирилнакоь »¡ргдуцгит^в пр^т-п»«-ляется важной задачей. Актуальность таких работ связана и с прикладными аспектами, среди которых можно выделить получение ферментов с новыми свойствами, антиопухолевых веществ и т.п. Нельзя не учитывать и экологическое значение таких работ.

Цель исследований - изучение физиологии, биохимии и генетики морских гетеротрофных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов - продуцентов первичных и вторичных биоактивных метаболитов с особым акцептом на новые формы. Научные основы биотехнологий и применение новых видов морских бактерий в хозяйственной деятельности человека.

Конкретно были поставлены следующие вдачи: 1 Создать коллекцию морских гетеротрофных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов (в основном, бактерий), изолированных из различных регионов Мирового океана. Основное внимание уделить микроорга-1Ш мам, ассоциированным с морскими животными.

2. Начать работы по систематике, таксономии и идентификации изолированных штаммов бактерий.

3. Осуществить поиск среди микроорганизмов моря продуцентов практически важных первичных (ферментов) и вторичных (антибиотиков, цшотоксинов) метаболитов.

4. Разработать экспресс-методы скрининга биоактивных веществ (БАБ) из морских микробов. 1

5. Определить и оптимизировать условия культивирования микробных продуцентов БАВ.

6. Разработать рекомендации по применению и технологии выпуска некоторые БАВ морских микроорганизмов.

7. Оценить перспективность этого направления морской микробиологии.

Объекты и методы исследований В качестве объектов исследования были использованы фирмикугы и про-теобактерии из созданной Коллекции морских микроорганизмов (КММ) ТИБОХ ДВО РАН. Они были изолированы из всех районов Мирового океана, за исключением Арктики и Антарктики. Особое внимание было уделено облигатным морским бактериям родов Alteromonas, Vibrio, Deleya и некоторым другим, а также га-лотолерантным штаммам видов рода Bacillus и актиномицетам.

Для выделения штаммов использовали метод прямого посева из образцов морской воды, грунта или гомогенатов животных на среду Горбенко (Горбенко, 1961) и среду, предложенную японскими авторами (Youshimizu, Kimura, 1976) с добавлением натуральной морской воды. Инокулированные чашки Петри инкубировали при температуре 25-30°С в течение 7-14 (30) суток.

Идентификацию штаммов проводили с помощью общепринятых методик (Bergey's Manual of Systematic Bacteriology, 1984, 1986; Методы общей бактериологии, 1983, 1984). Препараты ДНК выделяли по методу Мармура (Marmur, 1961). Степень очистки проверяли спектрофотометрически. Определение нуклео-тидного состава проводили с помощью метода термической денатурации в разбавленных средах растворах. Очищенный препарат ДНК в концентрации 20 мкг/мл помещали в кюветы автоматического регистрирующего спектрофотометра "Pye Unicam SP 1800" и прогревали со скоростью 0,5-1,0°С/мин. Гиперхромный эффект регистрировали при A2eo (Marmur, Doty, 1962). Расчет содержания ГЦ-пар осуществляли по формуле: ГЦ моль% =2,08 х ТГ£Л - 106,4, где Тш - средняя температура плавления (Owen et al., 1969). В качестве внутреннего стандарта использовали ДНК Escherichia coli В (Sigma, США). Молекулярную гибридизацию

ДНК проводили, используя спектрофотометрический метод (de Ley et al., 1970). Размер генома у исследованных штаммов бактерий определяли спектрофотомет-рнчески (Gillis et al., 1970).

Определение антимикробной активности экстрактов микроорганизмов проводили, как правило, методом диффузии в агаре. В качестве тест-культур ис-пользовхти Escherichia coli К-13, Pseudomonas aeruginosa АТСС 27853, Staphylococcus aureus АТСС 21027, Bacillus subtUis KMM 430, Candida albicans KMM Y 5 и, иногда, некоторые другие культуры.

Скрининг продуцентов БАВ проводили, обычно, следующим образом. Ак-сеническими культурами засевали колбы Эрленмейера объемом 250 мл (по 100 мл спегты. той же. что и для выделения штаммов) и инкубировали на качалке (160-1S0 сСДиш) при 25-2S°C. Поел* i п суток я кочбн «»»ивяли пи so мл оута-нола и перемешивали содержимое магнитной мешалкой. Затем колбы замораживали (12 ч, -40°С). После разморозки бутанольный экстракт упаривали на роторном испарителе, сухой остаток взвешивали и растворяли в дистиллированной воде до концентрации 4 мг/мл и тестировали, обычно, по следующим параметрам: антимикробная активность, токсичность (для мышей), гемолиз (эритроцитов), цитотоксичность (на клетках карциномы Эрлиха) и некоторым друтим параметрам. В работе применяли и другие микробилогнческие, химические и инструментальные методы, в том числе предложенные нами. Некоторые из этих методов по необходимости очень кратко изложены ниже по тексту в соответствующих разделах автореферата.

Научная новизна и теоретическая значимость работы

Создана Коллекция морских микроорганизмов, содержащая около 8 000

штаммов.

Обнаружена капсула у представителей рода Alteromonas. Капсульные полисахариды выделены и охарактеризованы. В их составе идентифицированы редкие моносахариды, например, 2-амино-2-дезокси-Ь-гулуроновая кислота, 3,6-дезокси-З-амино-О-галактоза, ацилированная остатком 4-гидроксибутановой кислоты, впервые обнаруженной у бактерий. Показано, что состав капсул не может служить таксономической характеристикой.

Проведен сравнительный анализ спектров 31Р-ЯМР высокого разрешения интактных клеток бактерий рода Акеготопаъ. Показано, что спектры альтеромо-над обладают характеристичностью и отличаются от спектров других бактерий.

Жирные кислоты альтеромонад могут служить таксономическим маркером

рода.

Описаны 2 новых вида рода Акеготопаь - А. й'Ыиша и А. /иГфпеа.

Показано, что многие штаммы морских бактерий таксономически оригинальны и не могут быть идентифицированы с помощью обычно используемых таксономических ключей.

Показано, что количественный и качественный состав микроорганизмов, ассоциированных с морскими животными, существенно отличается от состава воды и грунта в местах их обитания. Это свидетельствует о специфичности взаимодействия микро- и макробионтов. Механизм подобного взаимодействия может быть следующим. Галактозо- и сиалоспецифический лектины, выделенные нами из япономорской мидии, способны агглютинировать бактерии, ассоциированные с этим моллюском, но не патогенные для человека и животных бактериальные тест-культуры. По-видимому, лектины играют определенную роль в регуляции таксономического и количественного состава микробного комплекса организма-хозяина. Один из лектинов взаимодействует исключительно с грамположитель-ными бактериями, другой - преимущественно с грамотрицательными.

Тестирование около 8000 штаммов микроорганизмов на способность синтезировать БАВ позволило сделать некоторые заключения о распространении микробных продуцентов. Наиболее распространенными метаболитами микроорганизмов являются цитотоксические соединения. Это необычно, и отличает морские бактерии от микробов почвы, где преобладают продуценты антибиотиков, и от пресноводных микроорганизмов, где, по нашим данным о бактериях озера Байкал, преобладают продуценты ферментов. Большинство цитотоксинов обнаружено в экстрактах бактерий из донных осадков, мягких кораллов и морских звезд. Велико число продуцентов антимикробных соединений, выделенных из асцидий, горгонарий, морской воды и донных осадков. Большое количество микробных продуцентов иммунотропных соединений обнаружено в ассоциативных комплексах бактерий с альционариями, асцидиями, ракообразными, но их

гораздо меньше в комплексе бактерий губок и морской воды. Штаммы из губок,

-6-

донных осадков, асцидий, кишечнополостных и морской воды показали способность ингибировать активность ферментов репродуктивного цикла вирусов, в частности, обратной транскриптазы, РНК-полимеразы и тимидинкиназы.

Получены и описаны бактериальные продуценты щелочной фосфатазы с уникально высокой активностью и другими редкими свойствами, полиуридил-специфической рибонуклеази и дру|их РНК-аз, эластазы, «-галактозидаз, новых рестриктаз, тирозиназ и некоторых других ферментов.

Обнаружены штаммы, продуцирующие рН-зависимые цитостатики, амико-умацины, сурфактины, новые антибиотики итуринового ряда, новый антибиотик пальмнромицин. Впервые показано, что бромдифениловые эфиры синтезируются не морс"5г-;:? jxjua z "" я»^твпияпьнммн симбионтами.

Сделано заключение о перспективное i и мор^кл:-: микиоим

ганизмов как продуцентов БАВ.

Практическое значение Получено 4 авторских свидетельства СССР и 2 патента РФ. Некоторые БАВ из морских бактерий выпускаются ТИБОХ ДВО РАН.

Основные положения, выносимые пп защиту

1. Количественный и качественный состав, микроорганизмов, ассоциированных с морскими животными, существенно отличается от состава воды и грунта н местах их обитания, что свидетельствует о специфичности взаимодействия микро- и макробионтов. которое може1 осуществляться на основе углевод-лектпнлого механизма.

2. Морские микроорганизмы способны продуцировать уникальные по своим свойствам ферменты: щелочные фосфатазы, полиуридил-специфцческук) ри-бонуклеазу и другие РНК-азы, новые ргстрцктазы и другие энзимы.

3. На основании скрининга получены бактериальные продуценты рН-зависимых ц!П остатков, новых антибиотиков. Штаммы рода Vibrio, ассоциированные с губками рода Dysidea, синтезируют бромдифениловые эфиры, которые ранее считали типичными метаболитами этих губок.

4. Морские гетеротрофные аэробные и факультативно-анаэробные бактерии являются перспективными источниками биологически активных первичных и вторичных соединений.

Апробация. Материалы диссертации были представлены на Всесоюзном совещании "Биологически активные вещества гидробионтов при комплексной утилизации ресурсов океана", ТИНРО, Владивосток, 1988; Всесоюзной конференции "Биосинтез ферментов микроорганизмами", ВМО, Ташкент, 1988; International Marine Biotechnology Conference, October 13-16, 1991, Baltimore, Maryland, USA; 4th International Porifera Congress, Sponge in Time and Space, April 1923, 1993, University of Amsterdam, Amsterdam, The Netherlands; Second International Symposium of Bioorganic Chemistry, June 6-10, Fukuoka, Japan, 1993; Bridges of the Science between North America and the Russian Far East. 45-th Arctic Science Conference, 25-27 August, Anchorage, Alaska, USA, 29 August - 2 September, Vladivostok, Russia, 1994 и некоторых других собраниях ученых.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 38 статей и более 20 тезисов докладов.

Структура и объем. Диссертация состоит из введения, 6 глав, заключения, выводов и списка цитированной литературы из 510 наименований (465 - на иностранных языках). Работа изложена на 235 страницах, куда входят 11 рисунков и 28 таблиц (в экспериментальной части).

Автору принадлежит разработка программы, конкретных задач и методов исследований, анализ и обобщение полученных результатов, выводы работы. Экспериментальные данные получены автором и под его руководством сотрудниками Лаборатории морской микробиологии Тихоокеанского института биоорганической химии Дальневосточного отделения Российской Академии Наук (г. Владивосток), а также при участии автора в работах других лабораторий ТИБОХ ДВО РАН, Australian Institute of Marine Science (Townsville, Queensland) и Harbor Branch Océanographie Institution Inc. (Fort-Pierce, Florida, USA).

Автор выражает свою искреннюю признательность директору ТИБОХ ДВО РАН, Председателю ДВО РАН, Вице-президенту РАН академику Г.Б.Елякову за всестороннюю поддержку исследований. Автор приносит благодарность директору Института микробиологии РАН академику М.В. Иванову, доктору биологи

ческих наук И.Е. Мишустиной. Автор благодарит за помощь и участие в работе сотрудников Лаборатории морской микробиологии, зав. лабораторией химии микробных метаболитов Т.А. Кузнецову и сотрудников этой лаборатории, коллег из других лабораторий ТИБОХ, ИНМИ РАН, ИБФМ РАН, МГУ им. М.В. Ломоносова и зарубежных коллег.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 1. Коллекция морских микроорганизмов

Для осуществления научного процесса необходимо, чтобы описанные или упомянутые в публикациях микробные штаммы были доступны для независимого изучения. Поэтому необходимо поддерживать и сохранять описанные и другие к>ЛЫ> pLI, ПОТСИЦПЗЛТЛТЯ ""ТТНМ? ЛИ Пппмыпшенносш. медицины, ССЛЬСКСГО "" зяйства и научных исследований. Эти важнейшие для микробиологов задачи выполняют коллекции культур, в которых собирают и постоянно поддерживают хорошо изученные, аутентичные штаммы вирусов, прокариот, а также культуры животных и растительных клеток.

Первым, кто стал обеспечивать ученых проверенными культурами, был Ф. Крал (1846-1911), живший в Праге. В 1915 году его коллекция была переведена Э. Прибрамом в Венский университет. Другая старейшая коллекция, CBS, основанная в 1906 году, и поныне существует в Баарне (Голландия). Об истории и состоянии коллекционного дела сообщается в ряде обзоров (Porter, 1976; Kirsop, 19S3; Malik, Claas, 1987; Sly, 1984; Kalakoutskii, 1993).

Микробные коллекции - что живые библиотеки, постоянный источник штаммов для сравнения. Коллекции культур выполняют также и роль экспертных центров в области систематики, таксономии, идентификации и хранении микроорганизмов.

В знак признания важности работ в области коллекционного дела Международным союзом микробиологических наук (IUMS) и Международным союзом биологических наук (IUBS) была создана Всемирная федерация коллекций культур (WFCC).

Коллекция морских микроорганизмов ТИБОХ ДВО РАН стала создаваться автором и сотрудниками лаборатории морской микробиологии с 1985 года. Этот

год был благоприятен для начала такой работы, так как появилось специализированное для химических, биохимических и микробиологических исследований судно - "Академик Опарин"-. Это позволило собирать и изучать микроорганизмы практически из любых регионов Мирового океана. Маршруты НИС "Академик Опарин" отмечены сплошными линиями на рис. 1.

Рис. 1. Схема маршрутов НИС "Академик Опарин"

Сейчас коллекция является членом WFCC, имеет официальный акроним КММ и регистрационный номер 644 (World Directory of Collections of Cultures of Microorganisms, 4 Ed., 1993, WFCC WDCM),

КММ содержит около 8000 штаммов морских гетеротрофных аэробных и факультативно-анаэробных бактерий (в основном), а также грибов-микромицетов (с дрожжами). Это практически единственная в России коллекция, целиком специализирующаяся на морских микроорганизмах.

Результаты исследований, которые велись в основном по трем направлениям - систематика, изучение симбиоза, биотехнология, позволили отметить ряд

общих закономерностей, которые кратко упомянуты в тексте автореферата. Можно отметить и такие, например, наблюдения. Продуценты ферментов значительно чаще встречаются среди бактерий, обитающих в борсальных областях океана, а антибиотиков, наоборот, - в тропической зоне. Бактерии, синтезирующие высоко активные щелочные ф.н-фатачы. чаще всею ассоциированы с моллюсками, a пролупентоп хитинолитических фермстиа си ле! искать среди свободно жипуших микроорганизмов.

Нелыя не сказатт eine о некоторых других функциях KM M как коллекции. Это сохранение и изучение Ьноралюобр.нпя на üiamac, чем) придается очен:, важное значение такими международными организациями как UN IIP. ILMS, IL'ßS т" ' 1 ».ТСС ,-„ ¿u-2;, ■■ ^лпогический аспект такой

работы. Этот аспект состоит в следующем:

1. KM M имеет подборку штаммов и ассоциаций микроорганизмов, способных деградировать нефть и нефтепродукты, другие поллютанты, а также сорбировать тяжелые металлы.

2. Если есть микробный продуцент какого-либо полезного вещества, то нет необходимости (чему прекрасный пример микробное получение эйкозапентае-новои кислоты, которую ранее добывали из рыб) нарушать струкп'ру и гомео-стаз в экосистемах моря (и суши).

Эти примеры относятся скорее к области охраны окружающей среды. Собственно ..коло!ическое шаченне i'^eei изучение рочи БД!) морских микроорганизмов в экосистемах, которое по существу еще только начинается.

Коллекция морских мт poopi лпизмов I ПБОХ ЛВО РАН послужила основой для проведения академических и прикладных исследовании в области морской микрооиоло!пи и. частично, »иои-хнолегтт *Ч»П1ие результаты поиска микробных продуценшь bAii среди ирио ir.mic i..ik» SOI'" пмамчо» К M N1 иредемн-лены в табл. 1.

2._ Бактериальные продуценты ферментов.

¡LIUuaivneiцы liic.IQ4Iплч фосфата i.

Щелочная фосфптаза (КФ 3.1.3.1, фосфопиро;кыа моноэфиров орюфос-форной кислоты) - достаточно хорошо изученный фермент. Он выделен из бактерий, грибов, тканей животных и человека (McComb et al., 1979). Несмотря на

это, широкое применение щелочных фосфатаз (ЩФ) в различных областях биохимического анализа и медицины вызывает необходимость поиска новых источ-ни

Табл. 1. Результаты скрининга микроорганизмов-продуцентов БАВ

Продукция Количество штаммов

Рибонуклеазы 102

Дезоксирибонуклеазы 300

а-Галактозидазы 53

Эластазы 2

Новые реетриктазы 3

Щелочные фосфатазы 50

Каррагиназы 4

a-N-Ацетилгалактозаминидазы 100

Хитинолитичеекие ферменты 200

ß-Тирозиназы 5

Антиопухолевые соединения против: карциномы Эрлиха лейкемии Р-388 1400 10

Кардиотонические соединения 5

Ингибиторы а- и ß-глюкозидаз 22

Ингибиторы вирусной ревертазы 100

Действие против вирусов HSV-1, FELV, F-59, Р-28 7

Антимикробная активность против S. aureus, В. subtilis, Е. coli, P. P.aeruginosa, С. albicans, Aspergillus nidu-lans, Xanthomonas spp. и др. 1327

ков этого фермента, которые продуцировали бы ЩФ с более высокой активностью и различными свойствами. Наименее изученными объектами являются морские микроорганизмы. Сообщение о том, что ферменты фосфорного обмена играют определенную роль в строительстве моллюсками своих раковин (Conzales de Canales, Martin del Rio, 1985), натолкнуло на мысль о том, что продуцентов ЩФ следует искать среди бактерий-ассоциантов морских моллюсков. Эта мысль оказалась плодотворной.

На способность продуцировать ЩФ исследовано несколько сотен штаммов бактерий, изолированных, в основном, из япономорской мидии Crenomytilus gray-anus. Для определения активности ЩФ был разработан экспресс-метод с использованием 96-ячеистых планшетов фирмы "Dynatech" (Швейцария), применяемых для иммуноферментного анализа, фосфатлзную активность определяли непосредственно в суспензии клеток и культуральной жидкости. Штаммы выращивали в жидкой среде на качалках (120 об/мип) при температуре 25°С 24 ч. Центрифугировали при 4000 g 30 мин и доводили 0,1 М трис-НС1-буфером, рН 8,8, до плотности суспензии 10 клеток/мл. К 50 мкл бактериальной суспензии или культуральной жидкости прибавляли 100 мкл 0,1 М трис-ИС], рН 8,8, и 20 мкл 5 мМ дшг'птри^рли соли ¡iu^a :::ггр"ф"»иип(Ьосфата (п-НФФ) ("Serva", ФРГ). Интенсивность окраски определяли через ¡0. 2? л чии «р» а« 4-А балльной системе. Для определения относительной активности микроорганизмов готовили суспензию, содержащую одинаковое количество клеток в 1 мл, плотность которой определяли с помощью "Specol-H" (ФРГ) при 660 нм (при пропускании = 60). Интенсивность окраски измеряли после 10 мин инкубирования при 20°С на "Multiskan" (Финляндия) при 405 нм. За специфическую активность микроорганизмов принимали количество единиц активности, приходящееся на "п" число клеток. За единицу активности принимали количество фермента, содержащегося в клетках, способного гидролизовать 1 нмоль п-НФФ. Для определения термостабильности фосфатаз суспензию клеток прогревали при 5Ь-60°С в течение 10, 20, 30 и 40 мин, после чего определяли активность фермента.

В таксономическом отношении наиболее активными продуцентами ЩФ оказались представители родов Vibrio, Aiieromonas и Bacillus (рис. 2).

В результате работы было отобрано для дальнейшего изучения 3 штамма-продуцента ЩФ.

Штамм Alteromonas sp. (A.elyakovii sp. nov., Биология моря, 1996, в печати) КММ 162 был выделен из целомической жидкости мидии в 1986 году. Штамм поддерживали на плотной питательной среде следующего состава (г/л): пептон -5,0, дрожжевой экстракт - 2,5, глюкоза - 1,0, К2НРОц - 0,3, MgS04 - 0,05, агар-агар - 15,0, морская вода - 500 мл, дистиллированная вода - 500 мл. Эта же среда была использована в качестве исходной для оптимизации биосинтеза ЩФ мето-

100 80 60 40 20 0

SL

_LlHl

8 9

Рис. 2. Распространение продуцентов щелочных фосфатаз у представителей различных групп микроорганизмов, выделенных из мидий Crenomytilus grayanus.

Микроорганизмы: 1 - Vibrio, 2 - Pseudomonas-Alteromonas, 3 - Bacillus, 4 - En-terobacteriaceae, 5 - Flavobacterium, 6 - Aeromonas, 7 • Micrococcus, 8 - кори-неформы, 9 - дрожжи.

□ - суммарное число штаммов отдельных таксономических групп,

Щ - число штаммов, показавших активность в этих группах.

дом математического планирования. Опыты по выращиванию штамма в колбах на качалках (120 об/мин) при 25°С 24 ч проводили в соответствии с матрицей планирования полного факторного эксперимента (Максимов, Федоров, 1969; Максимов, 1980) (табл. 2-6).

Проведенные исследования позволили предложить оптимизированный состав питательной среды для биосинтеза ЩФ (в граммах на литр): пептон - 6,0, дрожжевой экстракт - 3,0, морская вода - 750 мл, дистиллированная вода - 250 мл. Использование этой среды позволило повысить выход ферментативной активности приблизительно в 6 раз (с 5 до 30 ед/мл белка). Исследованная ЩФ из морской бактерии была очищена в 1075 раз. Фермент с удельной активностью 6000-6700 ед/мг белка свободен от нуклеазных примесей и по данным ДСН-электрофореза (Laemmli, 1970) представляет собой гомогенный препарат. Как видно из рис. 3, ЩФ КММ 162 проявляет активность в широком диапазоне рН 7,5-11,0 с максимумом при рН 9,5-9.8 в присутствии 1 мМ MgCl2. Активность фермента в значительной степени зависит от концентрации и типа ионов, введенных в реакционную среду. Из исследованных катионов наибольшим активирующим действием на фосфатазную активность обладает Mg2+, в меньшей степени активирующее влияние оказывают катионы Ni2+, Мп2+, Са2+ и Со2+. Ион Zn2+ казывает значительное ингибирующее действие на фермент. ЭДТК в концентрации 1 мМ полностью подавляет активность ЩФ. Молекулярная масса ЩФ

Таблица 2. Факторы варьирования и их концентрации на верхнем и нижнем уровнях в

Факторы варьирования Варианты матриц 1 вариант | 11 вариант | 111 вариант IV вариант

3 фактора 4 фактора

+ + + +

Морская вода, % X, 0 50 25 1 75

_КНз.РО,_, г/л_____ Пептон, г/л Дрожжевой экстракт, г/л и Х2 " д., __0 2 0,2 ^ я " 4,5 " ™ 2 1 ' 1 1 : ,' 1 I оо| 1 1 С"', I 6,"

Мг£04, г/л х6 0 1,0 0,75 2 25

Глюкоза г/л I X, 0 Г 1,0 0 1,0

Таблица 3. Влияние морской воды (Х|), КН2РО4 (Хг) и пептон:! (X3) на синтез общего

__" •'-""••чую Ферментативную активность (I вариант)_

Г... .4.;:.-. '"Лгт*«"«» тонцёп Гии^г... «»«»« • > тмтпол «"Т"?"*»" •»«тийНОСТЬ,

/'/■'с* » / \/

Х| х2 Х3 мг/мл (Х±5П,|), /V, '"и

ед/ VI

1,10+0,87/79

2,8111,39/49 1.29+1,31/101 2,79±1,56/56 2,47±2,09/84,6

4,0±1,9/47,5 3,95+1,76/116

0,31±0,79/254 5,76±3,2/55 0,54±3,18/588 5,24+2,55/49 0,47+1,17/250 5.45+3,68/67 6,13+3,44 /56

У=2,49+0,9 Х|+0.49 X,

У=3,05+2,61 X,

Таблиц.-! 4 Влияние дрожжевого экстракта (ХД глюкоз!,I (X,) и (Х„) на синтез ___общего белка и ферментативную активность (Н вариант)

Строка

ат]зииа

нтрация общего белка,

(хГ х5 х„ мг,' мл (Х+3, |), /'V, "/„ ел/м1 белка <Х±£»,,). / V, %

1 - 1,68+0,61/36 5,46+1.95/36

2 1 ! 74+1.87/107 4,5+2,55/57

+ I), 1 «±0.37 - 203 4,08±6,7/ 164

4 + + - 1,96+1,63/83 5,47±2,91 /53

5 - - + 1,51±1,07/71 3,48±2,82/81

6 f + 2,7Г,±1,12/10 5,51+2,4/43

- + + 0,9710 74/76 4.29+1,21 /28

8 + + 1,76+0,81/46 8,26+7,8/94

У= 1,52+0,49 Х.,-0,35 Х6 Уравнение регрессии не содержит значимых коэффициентов

+

+

+

+

Таблица 5. Влияние пептона (Х3), дрожжевого экстракта (Х4) и глюкозы (Х5) на синтез _общего белка и ферментативную активность (III вариант)_

Строка Матрица Концентрация общего белка, мг/мл (Х±5„.,), /V, % Удельная ферментативная активность, ед/мг белка (Х+Йп1), / V, %

Х3 х4 Х5

1 - - - . 0,49±0,22/45 4,2±1,66/39

2 + - - 1,42±0,61 / 43 5,07±1,71 /34

3 - + - 1,29±0,43/33 6,0614,06/67

4 + + - 1,4910,66/44 7,41±3,43/20

5 - - + 0,60+0,21/36 4,01+1,45/36

6 + - + 1,50±0,74/49 5,18+1,49/29

7 - + + 1,21±0,49/40 5,28±1,51/28.6

8 + + + 1,52+0,65/43 6,8±3,32/49

Y= 1,28+0,29 Хз+0,19 Х4 Y=5,57+0,61 Хз+0,88 Х4

Таблица 6. Влияние морской воды {Х[), пептона (Хз), дрожжевого экстракта (Х4) и А^БО,! (Х6) на синтез общего белка и ферментативную активность (IV вариант)

Строка Матрица Концентрация общего белка, Удельная ферментативная активность

X, Хз х4 Х6 мг/мл (Х±5„.|), /V, % ед/мг белка (X±S„.,), / V, %

1 - - - - 0,83Ю,47/57 20,3±10,45/52

2 + - - 1,0±0,61/61 9,3±8,1 / 87

3 - + - 1,40+0,31/220 9,6±1,40/15

4 + + - 2,47*0,15/6 2,87+1,42/49

5 - - + 1,47+0,29/19 10,9±1,25/11,5

6 + - + 2,27±0,93/41 4,03±2,94/73

7 - + + 1,93+0,21/11 10,9+22/20

8 + + + 2,52+0,87/26 5,33+2,55/48

9 - - - + 1,23+0,32/26 13,4315,25/38

10 + - - + 1,3710,23/17 5,812,23/38

И - + - + 1,18±0,13/11 15,7+2,5/16

12 + + - + 2,1210,44/21 4,4+2,54/53

13 - - + + 1,37+0,38/28 13,1714,1/31

14 + - + + 1,6710,45/27 5,23+0,57/11

15 - + + + 1,9710,61/31 11,8+4,69/40

16 + + + + 2,4810,08/3 3,3712,08/62

Y=l,71 +0,28 X, + 0,3 Х2 + 0,26 Х4 - 0,29 Х3Х6 Y=9,19-4 X,- 1,4 Х3Х4Х6

КММ 162, определенная гель-фильтрацией на колонке с сефадексом G-150, составляет 90 кДа. Исследование субъединичного строения фермента методом ДСН-электрофореза показало, что ЩФ состоит из двух идентичных полипептидных цепей, молекулярная масса каждой из которых равна 45 кДа. Обнаружено, что ЩФ КММ 162 является термостабильным белком. Как видно из рис.4, пре-инкубация фермента в течение 15 мин в интервале температур 25-60°С практически не снижает фосфатазную активность. В то же время аналогичная преинку-баиия фермента в присутствии сульфореагентов (20 мМ p-меркаптоэтанола или дшиогреитола) приводит с повышением температуры ирепнкубации к существенному снижению фосфатазной активности, которая при температуре 55-60°С

ИНаКИШЦруСТГГТ """"П'Чьн, ioy,^.',).

Рие. 3 Зависимость активности щелочной Рис. 4 Зависимость термостабнлыюсти фосфата.чы А тас1ео(1И КММ 162 от щелочной фосфатазы А.тасЛеойИ рН. КММ 162 от температуры.

о - инкубация фермента в течение 15 минут; и - инкубация с добавлением 20 мМ меркаптоэтанола.

ЩФ КММ 162 проявляет широкую субстратную специфичность по отношению к спиртовым остаткам в сложных моноэфирах ортофосфорной кислоты. Фермент практически с одинаковой скоростью расщепляет ГТНФФ, АМФ, НАД Ф. Другие исследованные субстраты гидролизуются фосфатазой медленнее. То обстоятельство, что ЩФ КММ 162 обладает способностью с высокой эффективностью расщеплять 3',5'-фосфатмононуклеотиды и инактивируется при 60°С в присутствии сульфореагентов, было использовано нами да я быстрого получения

меченых фрагментов ДНК фага X. Установлено, что использование бактериальной ЩФ КММ 162 приводит к практически полному удалению 5'-фосфатных концевых групп EcoRI фрагментов ДНК, что определяет высокую эффективность последующего введения метки. Следует отметить, что высоко активная ЩФ из морской бактерии КММ 162 может быть использована не только для быстрого получения меченых молекул нуклеиновых кислот, но и в иммунологических исследованиях, вследствие своей высокой активности.

Первоначально продуцент этой ЩФ был определен как Acinetobacter sp., затем как Altéramenos macleodii, но по данным ДНК-ДНК-гибридизации штамм, вероятно, относится к новому виду альтеромонад. Фенотипически он отличается от других бактерий этого рода наличием капсулы .

Из целомической жидкости мидии C.grayanus был выделен штамм КММ 296 грамотрицательной морской галофильной бактерии. Клетки имеют 1-2 полярных жгутика и до 2-х латеральных. Молярный процент Г+Ц в ДНК - 65,0. По своим свойствам штамм был идентифицирован как Deleya marina. Из штамма выделена внутриклеточная ЩФ с уникально высокой активностью 15000 ед/мг белка. Фермент стабилен при рН 6,0-11,0 и проявляет максимальную активность в 1,0 M диэтаноламинном буфере при рН 10,3 в отсутствии двухвалентных катионов металлов. Добавление в инкубационную смесь 5 мМ ЭДТК не оказывает ингибирующего действия на фермент. ЩФ термостабильна (в интервале от 20 до 50°С), но теряет 80% своей активности при прогреве при 60°С. ЩФ, выделенная из штамма КММ 296, отличается от описанных ранее ЩФ, изолированных из морских микроорганизмов (Kobori, Taga, 1980), а также из других организмов (Зуева et al., 1993) своей исключительно высокой удельной активностью. ЩФ из Deleya marina КММ 296 пригодна для получения конъюгатов и может быть успешно использована как в иммуноферментном анализе, так и в генно-инженерных исследованиях.

Из 150 штаммов микроорганизмов, выделенных из морской воды, донных осадков и беспозвоночных, в результате скрининга было отобрано 11 штаммов, продуцирующих ЩФ с удельной активностью не ниже 5 ед/мг белка (в сыром экстракте). Для выделения фермента использовали штамм Alteromonas sp. КММ 518, уровень ферментативной активности которого был стабилен в процессе мно-

гократных пересевов. Суммарная схема выделения ЩФ представлена в табл. 6. В этапы очистки входило получение сырого экстракта и последующее хроматогра-фирование на ДЭАЭЦ и голубой сефарозе. Предварительные исследования показали, что ультразвуковая обработка микробной массы и экстракция белка буферным раствором приводила к высвобождению почти 90% белка, обладающего активностью щелочной фосфатазы, при этом экстрагировалось не более 20-25'/с общею белка биомассы. Столь эффективная экстракция ЩФ, вероятно, связана с тем, что используемый штамм относится к грамотрицательным бактериям, у которых данный фермент локализован в периплазме (Нерре1, 1970). Удельная активность очищенной ЩФ составила 1112 ед/мг белка.

(эплипи / Схема очитки шьЛ ;;; ^"««п» лякт*пми пакгииш/шл aV.

КММ 518

Стадия очистки Белок, мг Удельная активность, ед/мг Активность, ед. Степень очистки Выход, %

Экстракт 1240 5,5 6820 1 100

ДЭАЭ-целлюлоза 49,6 • 110 5456 20 90

Ультрафильтрация 31,8 165 5251 30 77

Голубая сефароза 2,4 1112 2660 202 39

Выделенный фермент может с успехом применяться в иммунологии и других областях биохимического анализа. Метод очистки несложен, используемые сорбенты широко доступны. Источник фермента - морская бактерия Alteromona.% sp КММ 518 - содержит щелочную фосфатазу с достаточно высокой удельной акшвностыо. Штамм был выделен из морской губки llaliclona sp., взятой с глубины 120 м в районе о.Итуруп (Курильские острова). Это гетеротрофная аэробная бактерия, имеюшая олин полярный неочехленный жгутик и 39,0 моль% ГЦ в ДНК. Не растет без ионов натрия в среде.

Таким образом, морские гетеротрофные бактерии являются весьма перспективными источниками щелочных фосфатаз.

2.2. Продуценты нуклеаз 2.2.1. Продуценты эндонухлеаз рестрикции При исследовании бактериальных штаммов морского происхождения был обнаружен штамм Vibrio nereis КММ 936. Из него была выделена по описанному ранее методу (Greene et al., 1978) новая рестриктаза Vnel, названная согласно общепринятой номенклатуре (Maxani, Gilbert, 1980). При определении специфичности фермента было установлено, что данная рестриктаза расщепляет ДНК pBR322 в трех местах, ДНК фага X в четырех местах и не имеет сайта узнавания на ДНК SV40. Сравнение этих данных с табличными (Kissler et al., 1985) показало, что существует единственная последовательность, имеющая такую частоту встречаемости: GTGCAC.

Аналогичным образом была выделена новая рестриктаза VspI из Vibrio sp. КММ 937. Данный фермент линеаризует ДНК pBR322 и имеет 17 сайтов узнавания на ДНК фага X. Сравнение этих данных с табличными показало, что существует единственная последовательность, имеющая такую частоту встречаемости: АТТААТ. Это было одним из первых случаев выделения рестриктаз из облигатно морских бактерий. Штаммы были изолированы из морской воды бухты Троица залива Посьет Японского моря в 1986 году и идентифицированы по фено- и ге-нотипическим свойствам.

В дальнейшем, среди облигатно морских бактерий (в основном, родов AI-teromonas и Marinomonas) и галотолерантных видов рода Bacillus были обнаружены продуценты изошизомеров известных рестриктаз: Nael, Xhol, PstI, Eco RH, Avaiii, Sau3AI, Sau961, BstXI, Ball, Pvul, BamHI, Xbal. Некоторые продуценты из КММ более перспективны, так как непатогенны. Необходимо отметить, что успехи генетической инженерии в значительной степени связаны с открытием и выделением эндонуклеаз рестрикции, которые широко используются в решении прикладных и фундаментальных задач. Серьезный анализ в этом плане морских микроорганизмов еще только начинается.

2.2.2. Бактерии - продуценты рибонуклеаз и дезоксирибонуклеаз Значительный интерес, проявляемый в последние годы к изучению рибонуклеаз, определяется не только их важностью в метаболизме нуклеиновых кис-

лот, но также широким использованием этих ферментов в структурных исследованиях. Необходимо отметить, что подавляющая часть обзоров и экспериментальных работ посвящена изучению свойств РНК-аз человека, животных (Безбородова, 1991), а также микроорганизмов наземного происхождения (Нуклеазы микроорганизмов. 1974). Рибо1гуклеазы морских микроорганизмов изучены очень слабо. В этой связи представляет несомненный интерес изучение способности морских микроорганизмов синтезировать рибонуклеазы и исследование особенностей распространения РНК-аз среди морских микроорганизмов, как свободно живущих, так и ассоциированных с морскими животными. Своеобразие среды их обитания - широкий температурный диапазон, высокая концентрация солей. ¡швьпхггтгчос гидиос^'пгт?'-''«»' давление - позволяют предположить наличие у морских микроорганизмов гНк-aj с сгл" v* необычиь;:,;" с?"мствами.

Целью работы явилось изучение распространения PHk-аз среди морских микроорганизмов-ассоциантов некоторых видов губок и асцидий Тихого и Индийского океанов, мидий (С. grayanus), населяющих прибрежные районы Японского моря, а также свободно живущих микроорганизмов, обитающих в морской воде. Губки и асцидии рода Didemnum были собраны во время экспедиционных рейсов НИС "Академик Опарин". Мидии и асцидии Halocynthia aurantium собраны водолазами в бухте Троица залива Петра Великого Японского моря на глубине 5-10 м. Микроорганизмы были выделены прямыми высевами из проб воды и гомогенатов животных на плотные питательные среды (Горбенко, 1961; Youshimizu, Kimura, 1976). Идентификацию проводили по определителю- Берги. Обнаружение индуцированных рибонуклеаз проводили на агаре с добавлением РНК (250 мг/мл) и толуидинового синего (100 мг/л). При положительной реакции тестируемого микроорганизма изменялся цвет питательной среды.

Для определения активности РНК-аз бактерии выращивали в жидкой питательной среде в 1 л колбах Эрленмейера с объемом среды 500 мл на качалке (120 об/мин) при 25°С в течение суток.

Активность РНК-аз определяли по количеству образующихся в процессе реакции продуктов ферментативного гидролиза высокополимерной дрожжевой РНК, не осаждаемых 0,5 М хлорной кислотой спектрофотометрически. За единицу активности принимали такое количество фермента, которое за 15 минут

инкубации при 37°С приводило к увеличению на 1 СЮ2бо низкомолекулярных продуктов гидролиза РНК (длина оптического пути 1 см). Концентрацию белка определяли по методу Бредфорд (ВгесШэг<1, 1976). Изучение распространения РНК-аз среди микроорганизмов-ассоциантов и свободноживущих бактерий показало, что среди изученных микроорганизмов в значительной степени преобладают штаммы, продуцирующие рибонуклеазы в культуральную среду (табл. 8).

Таблица 8. Распространение рибонуклеаз среди свободноживущих бактерий и микроор-

ганизмов - ассоциантов морских животных

Источник выделения Изучено i Рибонуклеазы Изучено i Индуцибельные

штаммов ^внеклеточные, 1 0/ 1 /о внутриклеточные^ штаммов! рибонуклеазы i

Морская вода 145 ! 14,0 1 3,4 145 ¡ 14,2 i

Мидия СгепотцШи.& gra.yan.us Асцидия На1осупШа аигапНит Асцидии (10 образцов) 235 ¡ 18,7 13 i 7,7 20 t 30,0 19,5 23,0 25Т0 235 ¡ 20,0 108 ¡ 9,3 1эг ! res" 1

Губки: СИопёгосШсНа сопсгезсепз Verongia зр. Dictiod.en.dnHa эр. йепйг'Ма йр. i 12 j 8,3 i i 0,23 0,24 » 1 • 1 t 1 1

Tí "Г 14,2 ( r 0,32 1 J 1

19 T 10,3 t r 0,12 t \

Губки (4 образца) 36 Т 15,4 i ^ 0,42" 1 i

В то же время у микроорганизмов-ассоциантов асцидий и мидий довольно велико количество штаммов, синтезирующих внутриклеточную РНК-азу. Среди штаммов, выделенных из губок и воды, бактерии, синтезирующие внутриклеточные РНК-азы, практически не обнаружены. Относительно высокая частота встречаемости штаммов, продуцирующих РНК-азы во внеклеточную среду, отмечено для представителей рода Bacillus (53,6% от числа штаммов данного рода) (табл.9).

В меньшей степени это характерно для бактерий родов Vibrio и Photobacte-ríiim, среди которых способность синтезировать внеклеточные РНК-азы отмечена у 21,8% штаммов. В отличие от этих бактериальных клеток штаммы родов Altero-

Таблица 9. Систематическое положение морских микроорганизмов, синтезирующих

внеклеточные рибош /клеазы

Систематическое положение Изучено штаммов Количество штаммов, синтезирующих РНКазы, %

Alteromonas-Pseudomonas 42 23,5

Vibrio- Photobacterium 32 21,8

Fiavobacterium-Cytophaga 18 14,2

Bacillus 26 53,6

Atcatigenes 5 0

Acinetobacter 8 0

Enterobacter 12 16,7

9 0

Arthrobacter in О

Streptomyces 3 33,3

monas и Pseudomonas продуцировали только внутриклеточные РНК-азы (23,5% штаммов). Полученные нами данные хорошо согласуются с результатами предыдущих исследований, где на большом количестве штаммов было показано, что способность секретировать рибонуклеазы наиболее широко распространена у

спорообразующих бактерий, причем для бацилл, выделенных из воды, свойственно наличие высокой РНК-азной активности. Для неспоровых видов активность РНК-аз была выражена слабее (Юсупова. 1964; Нуклеазы микроорганизмов, 1974). Способность синтезировать РНК-азы у флавобактерий, альтеромонад, вибрионов, выделенных из морской среды обитания, согласно имеющимся в литературе сведениям, изучена в меньшей степени (Bengis-Garber, 1985; Chiura et al., 1988; Girones et ai. 1989). Среди 500 изученных нами штаммов, распределенных на 10 родов, у представителей коринеформных бактерий, Acinetobacter, Alcali-genes морского происхождения способность синтезировать РНК-азы не была обнаружена, в отличие от альтеромонад, флавобактерий, вибрионов, бацилл. Эти результаты подтверждаются данным других исследователей, которые показали, что морские люминесцирующие бактерии семейства Vibrionaceae - V.hanv.yi и V.costicola синтезировали мембранно-связанную 5'-нуклеотидазу, а штамм Flavo-bacteriwn okeanokoites - сайт-специфическую дезоксирибонуклеазу (Bengis-Garber,

1985; Girones et al., 1989). Следует отметить, что в последние годы широко изучаются вопросы, связанные с инактивацией вирусов в морской воде. Было показано, что в этих процессах участвуют вибрионы, флавобактерии, цитофаги, но химическая природа секретируемых бактериями соединений и механизм этого процесса пока не установлены (Chiura el al., 1988; Girones et al., 1989). В этой связи представляется перспективным изучение влияния РНК-аз морских микроорганизмов на инактивацию вирусов.

В результате скрининга РНК-аз среди морских микроорганизмов было отобрано несколько штаммов, секретирующих РНК-азы (табл.10).

Таблица 10. Сравнительная оценка удельной активности РНКаз морских микроорганизмов

Систематическое положение Номер штамма Источник выделения Белок, мг/мл Удельная активность, ед/мг белка

Внутриклеточные рибонуклеазы

Alteromonas sp. KMM 216 На1осуп1Ма аигап- 1,6 58,

Нит

KMM 217 » 1,6 34,0

KMM 322 Морская вода 164 54,5

KMM 254 СШгеИпа то1исепз1в 3,6 61,0

Внеклеточные рибонуклеазы

Bacillus cereus KMM 437 Губка 0,035 291,0

B.pumilus KMM 438 Губка 0,090 138,5

KMM 439 Verongia sp. 0,065 138,0

KMM 440 йШюйепйпИа ¿р. 0,05 211,0

KMM 56 ОепйгЧа вр. 0,11 522,0

KMM 62 » 0,065 856,0

Bacillus sp. KMM 441 Морская вода 0,11 315,0

KMM 442 Губка 0,045 347,0

Vibrio sp. KMM 443 Морская вода 0,11 100,0

KMM 444 » 0,17 62,5

Из данных, приведенных в таблице, видно, что бактерии рода АНеготопаэ отличались способностью синтезировать внутриклеточные РНК-азы, тогда как вибрионы, выделенные преимущественно из морской воды, секретировали РНК-

азы в культуральную среду. Следует отметить, что удельная активность РНК-аз как у альтеромонад, так и у вибрионов была невелика. В этом исследовании бациллы характеризовались максимальной активностью рибонуклеаз: В. pumilus из губки Dendrilla sp. и Bacillus sp. из асцидий, обитающих в тропических районах Тихого океана. При исследовании физико-химических свойств внекле!очной РНК-азы из штамма В. pumilus КММ 62 оказалось, что фермеш по своим свойствам близок к известной РНК-азе из "В. intermedins" и В. pumilus наземного происхождения (Rushizky et al., 1964; Лещинская, 1975). Все перечисленные штаммы синтезировали низкомолекулярные РНК-азы с молекулярной массой 10-12 кДа. рчсшпы»ыи ^-фйсфг^п^фипные связи в РНК с оптимумом рН 8,5-8,8, активацию ферментов вызыьчли ашт ;г.тр!«« и .-ЫТА. Еще од;т". «ььы на изучению рибонуклеазной и дезоксирибонуклеазной активности бактерии, ассоциированных с морскими асцидиями - весьма своеобразными животными, "морскими лимонами", оболочка которых состоит из целлюлозы и имеет кислую реакцию.

Из образцов асцидий, обитающих в прибрежных районах Мальдивских и

Сейшельских островов и Австралии было выделено 232 штамма микроорганизмов и около 100 штаммов - из морской воды и донных осадков в местах обитания животных. Анализ таксономического состава бактерий показывает, что штаммы, ассоциированные с асцидиями, отличаются большим разнообразием. Микроорганизмы, относящиеся к родам Pseudomonas, A/caligcnes, Vibrio. Photobac-lerium, а также актиномицеты, были выделены преимущественно из образцов асцидий. Преобладающими микроорганизмами, независимо от источника выделения. были бактерии рода Bacillus.

В мвнеимости от источника выделения и таксономии штаммы имели различную нуклеазную активность. Из всех штаммов бактерий, выделенных из асцидий, продуцировали нуклеазы только бактерии родов Bacillus, Vibrio, Photobac-lerium. при этом вибрионы были активны только в отношении РНК. В образцах донных осадков активными были штаммы родов Bacillus и Micrococcus. Следует отметить, что одни и те же штаммы рода Bacillus были активны в отношении обоих субстратов: ДНК и РНК. Эта особенность донных микроорганизмов обусловлена, вероятно, спецификой их местообитания и физиологии. В то же время

активные штаммы, выделенные из асцидий (за исключением двух), проявили специфическую нуклеазную активность. Наиболее низкую активность показали штаммы, изолированные из морской воды, что подтверждает известные данные по более низкой физиологической активности свободноживущих микроорганизмов. Таким образом, нуклеазная активность бактерий, ассоциированных с морскими асцидиями, и микроорганизмов, изолированных из среды их обитания, связано в первую очередь с источником выделения, а также зависит от таксономического состава микробного комплекса того или иного биотопа.

В результате этих и некоторых других исследований из штамма Bacillus pumilus КММ 61 (губка, О.Мадагаскар) была выделена и охарактеризована РНК-аза с молекулярной массой (м.м.) 14 кДа, характерной особенностью которой является то, что в отсутствии NaCl фермент инактивируется, а из В. pumilus КММ 62 (губка, Сейшельские о-ва) - рибонуклеазы с м.м. 12,5 кДа. Ферменты с такой относительно небольшой молекулярной массой удобны для изучения и стали предметом исследований специалистов (Яковлев et al, 1993).

Особенно интересным оказался штамм Alteromonas haloplanktb КММ 223, синтезирующий полиуридил-специфическую эндорибонуклеазу (точнее, поли-уридилазу). Молярный процент ГЦ в ДНК штамма составляет 42,1. На основании изучения фенотипических свойств и изучения нуклеотидного состава и уровня сходства в нуклеотидных последовательностях ДНК штамма КММ 223 и типовых штаммов рода Alieromonas он был идентифицирован как A.haloplanktis. Уровень гибридизации штамма КММ 223 с типовым штаммом A.haloplanktis АТСС 14393 составил 61%, что свидетельствует о принадлежности штаммов к одному виду (табл. 11).

Штамм был выделен из пробы морской воды, отобранной в северозападной части Тихого океана на глубине 1950 м. Активность штамма КММ 223 была обнаружена при скрининге продуцентов специфических рибонуклеаз среди альтеро- и мариномонад. Он проявил уникальную активность при гидролизе по-лиуридиловой кислоты: скорость гидролиза Поли(У) более, чем десятикратно превышала таковые при расщеплении остальных субстратов другими бактериями, в том числе типовым штаммом вида А. haloplanktis АТСС 14393.

Таблица 11. Уровень ДНК-ДНК-гибридизации штамма КММ 223 и типовых штаммов

бактерий рода Alteromohas

Г + Ц, Гомология в ДНК, %

Штаммы моль% A.hatoplanktis АТСС 14393 A.macleodii АТСС 27126

A haloptanktis KXCC 14393 42 J 100

/1 macleodii АТСС 27126 45,3 12 100

A.tetraodonis IAM 14160 41,5 48 9

A.nigrvijaciens IAM 13010 41,7 33 9

КММ 223 42,1 61 15

Культивирование посевного материала просто в стерильной морской воде значительно \ociuvuijàZ~ tT,fH'ra- Ссылай ¿1рсдстг.г™"ет белок

субъединичного строения с м.м. 52 кДа, состоящий из двух идентичных испей 26 кДа каждая. Оптимум рН 8,2-8,5. Активность стимулируется катионами магния и ионами хлористого натрия в высокой концентрации (0,2-0,5 моль). Эндорибо-нуклеаза КММ 223 с высокой скоростью гидролизует полиуридиловую кислоту и практически не расщепляет Поли(А), Поли(Ц) и нативную и денатурированную ДНК. Гидролиз осуществляется по эндонуклеазному типу с образованием пента-нуклеотидов с 5'-фосфатными концевыми группами. Фермент также гидролизует альтернирующие гомополирибонуклеотиды: Поли(У)>Поли(АУ) 4:6> Поли(АУ) 9:1.

Эндонуклеазы микроорганизмов состашшют большую группу эндонуклеаз, однако большинство из них не имеет определенной специфичности (Нуклеазы: биологическая роль и практическое использование, 19S5). Среди них найден только один тип рибонуклеаз, обладающих высокой специфичностью - гуанил-рибонуклеазы. В литературе описаны эндорибонуклеазы, проявляющие специфичность к полиуридиловой кислоте, изолированные из эукариот (Donis-Keller, 1980; Bachmann et al., 1983; Quintaniila, Renart, 1982; Sen et al., 1991; Sideris, Fra-goulis, 1987).

Исследования нуклеаз и особенно специфических рибонуклеаз имеет большое научное и практическое значение в связи с использованием этих ферментов как инструментов при изучении структуры и функции нуклеиновых кислот и их комплексов с белками.

Результаты исследования нуклеазной активности морских бактерий показывают, что они могут служить источниками получения эндонуклеаз рестрикции, неспецифических внутриклеточных щелочных рибонуклеаз, а также высоко специфических рибонуклеаз.

2.3. Альтеромонады как,продуценты тирозиназ

Известно, что тирозиназы являются медьсодержащими ферментами и участвуют в биосинтезе меланина эу- и прокариот (Рубан, Лях, 1972; Бриттон, 1986). Тирозиназы обнаружены и изучены у различных микроорганизмов: "Vibrio tyrosinaticiis" (Pomerantz, Murthy, 1974), Bacillus cereus (Aronson, Vickers, 1965), Streptomyces sp. (Yoshimoto et al., 1985), Pseudomonas melanogenum (Yoshida et a!., 1974), Pseudomonas maltophilia (Пширков et al., 1982). Штамм бактерий Erwinia herbicola используется в промышленности как продуцент тирозиназы (Бест, 1988).

Относительно недавно выделен новый вид морских бактерий Shewanella colwelliana, ассоциированных с устрицей Crassostrea virginica (Coyne et ai, 1989), которые синтезируют меланин и тирозиназы двух видов MelA и MelB с различными функциями (Weiner et al., 1991). Модельные эксперименты выявили участие тирозиназ этих бактерий в процессе метаморфоза личинок устрицы и адгезии их к субстратам. Бактерии Alteromonas nigrifaciens и A.haloplanktis способны образовывать меланоидный пигмент (Baumann et al., 1984). Недавно выделен буро-пигментированный штамм Alteromonas sp. 2-40, способный разлагать агар (Andrykovitch, Marx, 1988), из клеток которого выделена и охарактеризована истинная тирозиназа (Kelley et al., 1990).

Тирозиназы микроорганизмов используются для получения L-ДОФА, который применяется в качестве фармакологического средства при таких заболеваниях, как болезнь Паркинсона и галакторея (Рубан, Лях, 1972). Производные L-ДОФА в определенных условиях могут оказывать радиорезистентное и противоопухолевое действие (Wick, 1978). Таким образом, тирозиназы представляют интерес как в плане изучения меланогенеза бактерий, так и в биотехнологическом аспекте.

Для изучения было отобрано 5 штаммов меланогенных альтеромонад, ассоциированных с некоторыми беспозвоночными, обитающими в Японском море.

В работе использовали также типовые штаммы A.nigrifaciens IAM 13010 и

A.haloplanktis АТСС 14393.

Для определения уровня тирозиназной активности испытуемые бактерии выращивали на средах различного состава: среда с тирозином (среда Т) и среда с аргинином (среда А) (Pomerantz, Murthy, 1974), среда Y-K (Youshimizu, Kinuira. 1976) и среда Y-K с добавлением 0,1 мл 1%-ного раствора сернокислой мели на I л среды (среда Y-K + Си2+). Раствор CuS04 в такой же пропорции добавляли и в среды А и Т. Все используемые среды содержали 750 мл морской воды на 1 л среды. Активность тирозиназ в супернатанте разрушенных клеток бактерий и кутьтупальной жидкости определяли спектрофотометрически по образованию дофилри.ч;а ¡п L тирлчимя и» изыхшим) методу (Нлпгтя11(/.. iviuiu.j, 1"71) Р качестве кофактора использовали L-ДОФА. За единицу активности принимали количество фермента, необходимого для образования дофахрома из тирозина со скоростью 1 мкмоль/мин. Коэффициент молярной абсорбции дофахрома при 475 нм был равен 3700. Белок определяли по методу Лоури (Lowry et al., 1951). В качестве стандарта использовали бычий сывороточный альбумин. В результате скрининга установлено, что все исследованные буропигментированные альтеро-монады синтезируют тирозиназы. Среди них обнаружен штамм КММ 638 с очень высоким уровнем активности. Общая активность в клетках, выращенных на среде с аргинином, составляет 90,1 ед/мл, а удельная - 25,2 ед/мг белка.

Проведенные исследования говорят о перспективности меланогенных альтеромонад как источников тирозиназ.

2.4. Продуценты других ферментов

Описан галоголерантньш штдмм ВаеШнч pumilus КММ 451, синтезирующий эласгизу с высокой удельной активностью 120 ед/мг белка. Гидролиз нерастворимого фибриллярного белка эластина - довольно редкое свойство. Эласгазы применяются в промышленности и медицине (Фогарти, 1986). Особенностью данного фермента является сохранение 85% активности при наличии в среде 0,5% хлористого натрия, что отличает его от эластаз из других источников (Никитин, 1986). Возможно, здесь сказывается морское происхождение штамма.

Штамм Alteromonas sp. KMM 162, синтезирующий высокоактивную щелочную фосфатазу (см. раздел 2.1.)» продуцирует также [5-1,3-эндоглюканазу при добавлении в ср?еду ламинарана - резервного полисахарида бурых водорослей. Разработан метод культивирования штамма, позволяющий с высоким выходом получать оба энзима. Подобная глюканаза впервые выделена из морской бактерии. По типу действия и свойствам она близка эндо-р-1,3-глюканазам моских беспозвоночных. Не исключено, что исследуемые бактерии и моские моллюски составляют симбиотрофную систему, где микробные глюканазы используются как пищеварительные ферменты.

Изучено также распространение и таксономический состав бактериальных продуцентов а-галактозидаз, a-N-ацетилгалактозаминидаз, каррагиназ и хитин-литических ферментов (Иванова et al., 1992; Бакунина et al., 1994; Лукьянов et al., 1994).

3. Морские гетеротрофные микроорганизмы как продуценты вторичных метаболитов В последнее время среди морских гетеротрофных бактерий описано немало продуцентов низкомолекулярных БАБ (Fenical, Jensen, 1992; Fenical, 1993; Okami, 1993). В этом разделе автореферата кратко изложены данные о наиболее изученных продуцентах вторичных БАВ из КММ.

3.1. Новый антибиотик пальмиромицин из морского изолята Streptomyces pluricolorescens Во время 9-го экспедиционного рейса НИС "Академик Опарин" из пробы морского грунта (коралловый песок, 0,5 м, 10 мая 1989 г., о. Пальмира, архипелаг Л айн, США) был вьщелен антибиотик-продуцирующий актиномицет (рабочий номер 9BS12A). Штамм идентифицирован с помощью общепринятых методик (Shirling, Gottlieb, 1966; Lechvalier, 1989; Гаузе et al., 1983; Hasegawa et al., 1983; Marmur, 1961). Морфологические наблюдения проводили с помощью светового и электронного микроскопов при росте культуры на различных средах до 21 суток. Штамм имеет прямые цепочки спор на воздушном мицелии (RF), мутовки отсутствуют, споры гладкие. Споры на субстратном мицелии отсутству-

ют. Гифы субстратного и воздушного мицелия не фрагментируются. Спорангии, склероции и зооспоры не обнаружены.

Штамм угнетает рост (метод агаровых блоков, Егоров et al., 1969) Bacillus licheniformis BKM 511, Arthrobacter globif ormis В KM 281, Micrococcus roseas 1145, Streptomyces flavofuscus 20M п не действует на рост грамотрицательных тест-культур. Культуральные свойства штамма представлены в табл. 12.

Таблица 12. Культуральные признаки штамма 9BS12A

Среда Рост Воздушный Субстратный Растворимый

мицелии мииелии пигмент

Неорганический агар 1 хороший Бледно-желтый Красно-коричневый Красно-коричневый

Дгяп Чянека .'.^v.HrTV' ЖОПТПКИТи-1\ muuf.i". НРТ

Овсяный агар (ISP, среда 3) хороший Желтовато-серый Коричневый Коричневый

Глкжозо- хороший Желтовато-серый Коричневый Коричневый

аспа_рагиновыи агар

Глицерин-нитратный умеренный Желтый Желто- Желто-

агар коричневыи коричневыи

Органический агар хороший Серо-желтый Красно-коричневый Розово-коричневый

Штамм утилизирует сахарозу, галактозу, трегалозу, фруктозу, аспарагин; не утилизирует мезо-инозит, маннит, L-рамнозу, раффинозу, D-мелицитозу, D-мелибиозу, эдонит; гидролизует пектин, крахмал, декстран, эластин; обладает ннтратредукцией, продуцирует сероводород, не имеет лецитиназы и липазы; растет при 7.5% NaCl в среде, не растет при 0,01% NaNi и 0,1% фенола, не растет при 45"С.

Штамм содержит LL-диаминопимелиновую кислоту в клеточной стенке

(КС), что соответствует типу 1 КС. Молярный процент ГЦ равен 64,3. Не образует меланоидного пигмента на среде с тирозином (1SP, среда 7), оптимум температур для роста 25-30°С.

Эти данные позволили идентифицировать данный штамм как Streptomyces pluricolorescens Okcimi et Umezawa 1956. Штамм хранится в коллекции под номером КММ А1 (=ВКМ Ас-1354Д). От типового штамма S.pluricolorescens 91-Т-1=ВНИИА 1077=АТСС 19798 (ISP 5019) штамм КММ А1 отличается кремовым

оттенком воздушного мицелия на некоторых средах, утилизацией некоторых Сахаров, высокой галотолерантностью и более низким молярным процентом ГЦ.

Условия культивирования: Посевной материал культивировали 4 суток на качалке на среде с глицерином, затем по 10 мл его помещали в колбы Эрлен-мейера на 250 мл со 100 мл питательной среды следующего состава (в г): пептон - 5,0, дрожжевой экстракт - 1,5, глюкоза - 1,0, К2НРО4 - 0,1, MgS04 0,1, морская вода - 500 мл (или 500 мл водопроводной воды с 15 г NaCl), дистиллированная вода - 500 мл. Культивировали на качалке 3 суток при 180 об/мин и 28 °С.

Новый антибиотик был назван пальмиромицином (palmyromycin). Это белок с м.м. 85 кДа, состоящий из 5 одинаковых субъединиц с м.м. 18 кДа. Паль-миромицин ингибирует рост и развитие B.subtilis и S.aureiis в концентрациях менее, чем 1 мкг/мл. Антибиотик не имеет протеолитической и цитотоксической активности. Условия выделения антибиотика описаны в статье (Мальцев et а/., ХПС, № 2, 1991).

3.2. Изучение галотолерантных бацилл

Среди бактерий, ассоциированных с мадагаскарской морской губкой Dendrilla sp., синтезировавших антимикробные соединения, более подробно были изучены 2 штамма - КММ 56 и КММ 62. Сравнение их морфологических, куль-туральных, физиолого-биохимических и генетических свойств со свойствами типового штамма Bacillus pumilus АТСС 706] позволило отнести их к этому виду. Штаммы КММ 56 и КММ 62 синтезировали антибиотики как при выращивании в стационарных условиях, так и на качалке. Из культуральной жидкости обоих штаммов после хроматографии на колонках и высокоэффективной жидкостной хроматографии было выделено 2 вещества. По данным УФ-, масс-спектрометрии, ЯМР 'Н- и пС-спектроскопии они оказались идентичными ами-коумацинам В и F. Амикоумацины A-G - вещества изокумаринового ряда - были впервые выделены японскими авторами из почвенного штамма В.pumilus AI-77 (Shimojima ei al., 1982, 1984). По данным этих исследователей только амикоума-цин А проявлял антимикробную активность. Нами показано, что амикоумацин В (первоначально названный дендрилломицином) обладает антибиотическими

свойствами (табл. 13) и особенно эффективно действует против фитопатогенных ксантомонад.

Таблица 13. Спектр антимикробного действия амикоумацина В

Тест-микроорганизм Минимальная ингибирующая концентрация, мкг/мл

Bacillus subtilis КММ 430 4 OU

B.subtilis АТСС 6633 100

Candida albicans КММ Y 1 400

Corynebacterium michiganense КММ 435 400

Escherichia coli K-13 1000

E mit К MM 43 i 400

Micrococcus luteus BKM B-109 '.2

Proteus vulgaris KMM 432 400

Pseudomonas aeruginosa KMM 433 400

Staphylococcus aureus 209 200

S.aureus ATCC 21027 500

Xanthomonas spp. KMM 434, 440, 445 6

Другие галотолерантные бациллы (отобранные по признаку устойчивости к 10% NaCl в среде), такие, как В. licheni/ormis KM M 45b, В. pumilus КММ 150, В. subtilis КММ 457 синтезировали рН-зависимые цитотоксины, депсипеитиды, новые антибиотики итуринового ряда с сильной фунгицидной активностью (Elyakov et al., 1994). Большинство этих веществ отличается от известных ранее, выделенных из почвенных бацилл, небольшими структурными вариациями.

Клетки немногих валидных видов ^атгилл встречаются в море: B.subtilis, B.lichenifonnis, B.pumilus, B.sphaericus, B.firmus, B.lentus и. иногда, B.cereus (Boudabous, Bianchi, 1979; и др.). Считается, что морские изоляты не отличаются от стандартных видов. Есть и присущие только этой среде обитания виды: штаммы "M" (Bonde, 1981), "B.epiphytus", "B.fiUcolonicus", "B.cirroflagellosus", "B.marinus" (ZoBell, Uphain, 1944; Ruger, Richter, 1979).

В нашем случае важен следующий аспект исследовании. Одни авторы считают, что синтез антибиотиков (и некоторых других вторичных метаболитов) дает определенные преимущества продуценту в борьбе за существование в природных

- зэ -

популяциях. Согласно другой точке зрения, антибиотики представляют собой "отбросы" метаболизма микроорганизмов и не имеют приспособительного значения. Проведенные нами исследования служат в пользу гипотезы, согласно которой образование антибиотиков следует рассматривать как закономерно закрепленную особенность обмена, играющую определенную физиологическую и/или экологическую роль.

3.3. Истинные продуценты бромдифениловых эфиров

Интересны взаимоотношения бактерий и морских губок. Бактерии служат главным источником питания губок (Сорокин, 1990). Губки имеют в своих клетках в качестве эндосимбионтов автотрофные цианобактерии и гетеротрофные бактерии. Бактерии находятся в бактериоцитах и мезохиле. Общее их число достигает миллиарда клеток на 1 г сырого веса губок, причем у некоторых губок биомасса бактерий составляет до 40% от массы животного. Функции "губочных" бактерий еще во многом не изучены, но показано, что они своими ферментами прочищают каналы внутри губки, поддерживая тем самым фильтрационную активность животного, а также усваивают растворенные и взвешенные органические вещества, наращивая свою биомассу, которая затем переваривается губкой. Симбионтные бактерии передаются потомству (Сорокин, 1990; Reiswig, 1975; Levi, Levi, 1965, 1976; Vacelet, 1971; Vacelet, Donaday, 1977; Wilkinson, 1978; Wilkinson, Garrone, 1980; Wilkinson et al., 1992).

Морские губки синтезируют беспрецедентное количество БАБ. Губки, представляется нам, являются природными ферментерами с весьма тонкой регуляцией происходящих процессов. Многие физиологически активные соединения, по-видимому, синтезируются не самими губками, а их микробными симбионтами.

В 1988 году появилось сообщение (Stierle et al., 1988) о том, что морские микрококки, обитающие в илах, синтезируют дикетопиперазины (биоактивные свойства пока не известны), ранее описанные как метаболиты губки Tedania ignis. Эта работа стимулировала изучение взаимоотношений губок и микробов.

Во время 9-го экспедиционного рейса (1989 г.) у берегов островов Офу и Тутуила (Восточное (Американское) Самоа) были отобраны два образца губки Dysidea sp. Ранее было показано, что губки этого рода синтезируют бромдифени-

. 34 -

ловые эфиры - сильные цитотоксины и антибиотики (Уткина et al., 1987). Из этих образцов было выделено 8 чистых культур бактерий, а затем изолирован тетрабромдифениловый эфир. Культуры были выращены в лабораторных условиях (100 ч, 30°С, без качания, в литровых колбах Эрленмейера с 500 мл среды) на среде: иепгон - 5,0 г, дрожжевой экстракт - 2,5 г, MgS04x7Hj0 - 0,1 г, морская вола - 1 л. По данным масс-спекгроыетрии резонансного захвата -электронов культуральная жидкость двух штаммов содержала небольшое количество тетраб-ромдифенилового эфира (рис. 5) и другие бромированные вещества.

ОН осн

I I 3

J I Rr

■ ' - ;г

iv^l í 'ч„.' 1

Вг' Br V"

!

Вг

Рис. 5. 3,5-Дибромо-2-(3',5'-дибромо-2'-метоксифенокси)фенол.

Эти культуры были чувствительны к 0-129, галофильны, росли при 3-10% NaCl в среде и рН 6-10. По фено- и тенотипическим признакам они были отнесены к роду Vibrio.

Это первое сообщение, когда строго доказано, что ранее описанные соединения синтезируются не губками, а их симбионтными бактериями. Возможно, что таким способом губка селекционирует комплекс своих микроорганизмов.

3.4. Другие исследования по изучению биосинтеза вторичных метаболитов морскими микроорганизмами

Ьолсе 10 лет назад лоягдппп, статья о синтезе палитоксина (одного из самых сильных небелковых природных токсинов) бактериями Vibrio sp.. ассоциированными с мягкими кораллами Palythoa sp. (Moor et al., 1982). Однако, строго это не было доказано и считается, что этот токсин синтезируется некоторыми морскими животными. Нами также была предпринята попытка доказать микробное происхождение палитоксина. Из токсичных образцов Palythoa spp. и Parazoanthus spp. были выделены îoKciiHHbie вибрионоподобные культуры. Этими штаммами заражали нетоксичные образцы тропических мягких кораллов и экземпляры род-

ственных и неродственных кораллам япономорских животных. После инкубации нетоксичные образцы кораллов и родственных им животных становились токсичными. В лабораторных условиях культуры также синтезировали токсические продукты, сходные по многим свойствам с палитоксином. Однако строгих доказательств синтеза бактериями этого токсина получить не удалось.

Около 20 лет назад М. Готье (Gauthier, 1977; Gauthier, Breittmayer, 1979) были описаны желтопигментированные виды Alterornonas citrea и A. aurantia. Некоторые другие альтеромонады в определенных условиях также могут накапливать желтоватые пигменты (Akagawa-Matsushita et ai, 1992; Kodama et al., 1993). Однако структура этих биоактивных пигментов остается неизвестной. Из австралийской губки в 1990 году был выделен штамм Alterornonas sp. КММ 636 также имеющий желтые колонии. Пигмент экстрагируется только щелочным метанолом, и, хотя очень слабо растворяется в воде, обладает цитотоксическим действием в низких концентрациях. Вещество чрезвычайно лабильно и с трудом поддается изучению.

Исследования биосинтеза физиологически активных веществ морскими грибами находятся еще в самом начале. В настоящее время в некоторых странах создано несколько специализированных лабораторий. Наши первые шаги в этом направлении позволили обнаружить штамм, синтезирующий в "морских" условиях культивирования большое количество эргостерина и необычные сульфатиро-ванные жирные кислоты.

Эти и другие работы ведутся и будут продолжены в ТИБОХ ДВО РАН.

Заключение

Токсины

I Хнничссккк

, \ „ __// Г "материалы для

Сргдстм радкацкошюй ищкго/ ; ^„„Г^есксго

' " I анализа -

I и Фукгиатда^ I диагностики^ _ >

Б^ишгчссак /ещмтм ЛЛ* генной инженера ' " Пептиды

ункции

/

/беспозвоночные,

¡/Теистическая инженерия

Рис. 6. Основные направления развития морской биотехнологии (Еляков Г.Б., Стоник В.А., Кузнецова Т.А., Михайлов В.В. Вестник РАН, 1993).

Морская микробиология и химия микробных метаболитов переживают

сейчас период подъема. Они являются основой для биотехнологических работ.

Судя по результатам исследований, перспективы этих наук просматриваются в

следующих направлениях

1. Поиск микробных продуцентов биоактивных веществ с необычной структурой и действие?.!.

2. Выявление микробных продуцентов метаболитов, ранее отмеченных для мак-рсб"с:ггсз моря.

3. Смещение научных интересоз в сторону изучения минорных, но высокоактивных соединений. Основную роль здесь должны сыграть молекулярная биология и генная инженерия.

4. Более масштабным! должны стать исследования сигнальных и регуляторных веществ. Большое внимание при этом привлекут метаболиты, участвующие в регуляции симбионтных взаимоотношений.

Не приходится сомневаться в том, что всестороннее изучение морских

микроорганизмов и их сообществ должно принести немало интересных откры-

тий. Успех на этом пути может быть достигнут только при фундаментальном исследовании биологии этих микроорганизмов.

Основные выводы.

1. На основании изучения микробов из созданной Коллекции морских микроорганизмов (акроним КММ, №644 во Всемирной федерации коллекций культур) показано, что они являются источниками ряда необычных биоактивных метаболитов. Недостаточно разработанные методы выделения, культивирования и хранения, а также таксономия микробов моря мешает их широкому применению.

2. Впервые проведен крупномасштабный поиск микробных продуцентов различных биоактивных веществ, изолированных из многих областей Мирового океана, различающихся биотическими и абиотическими факторами. Результаты исследований позволили отметить ряд общих закономерностей. Продуценты ферментов значительно чаще встречаются среди бактерий, обитающих в боре-альных областях океана, а цитотоксинов и антибиотиков, наоборот, - в тропической зоне. Микробные продуценты одних биоактивных метаболитов приурочены к определенной группе морских макробионтов, продуцентов же других метаболитов следует искать среди свободноживущих микроорганизмов. Таксономическое положение протеобактерий и фирмикут также имеет большое значение для осмысленного поиска бактерий, синтезирующих те или иные вещества.

3. Наиболее распространенными метаболитами морских микроорганизмов явились цитотоксические (антиопухолевые) соединения. Велико количество бактерий, синтезирующих вещества, способные ингибировать активность ферментов репродуктивного цикла вирусов. Дальнейшее изучение и осмысление этого явления может привести к открытиям общебиологического значения. Большинство цитотоксинов обнаружено в экстрактах бактерий, изолированных из донных осадков, мягких кораллов и морских звезд. Штаммы, ассоциированные с губками, кишечнополостными и асцидиями обладали антивирусной активностью. Велико число продуцентов антимикробных соединений, выделенных из асцидий, горгонарий, донных осадков и морской воды.

4. Показано, что количество и таксономический состав микроорганизмов, ассоциированных с морскими животными, существенно отличаются от количе-

ства и таксономического состава микроорганизмов воды и грунта в местах их обитания. Это свидетельствует о специфичности взаимодействия микро- и мак-

робионтоя. Это взаимодействие может осуществляться на основе углевод-лектинного механизма..

5. Получены и описаны продуценты высоко активных щелочных фосфатаз, РНК-аз, полиуридилазы, новых рсстрихтаз, мластазы и некоторых других ферментов, важных для науки и практики.

6. Обнаружены и изучены штаммы, продуцирующие pH-зависимые цитоста-тики, сурфактины, амнкоуманины, новые антибиотики итуринового ряда, новый антибиотик пальмиромицин.

Т.ПъКйслпг, ^"»«пмтгмилиишс ^ф,.,__: и« мопскими губ-

ками, как полагали ранее, а их бактериальными симииигилмн у^и llbri? первый подобный случай при изучении взаимоотношений губок и бактерий.

8. Проведен сравнительный анализ спектров 31Р-ЯМР высокого разрешения интактных клеток морских бактерий рода Alteromonas. Показано, что спектры альтеромонад обладают характеристичностью и отличаются от спектров других бактерий. У альтеромонад впервые обнаружена капсула; капсульные полисахариды выделены и охарактеризованы. Впервые изучен жирнокислотный состав целых клеток альтеромонад. Компьютерный анализ показал, что этот состав может служить таксономическим маркером рода. Описаны два новых вида бактерий рода Alieromonas, описание еще двух новых видов этих бактерий находится в печати.

Список статей, опубликованных по теме диссертации

1. Дегтярев С.Х., Репин В.Е., Речкунова H.H., Чижиков B.C., Малыгин Э.Г., Ми-

хайлов В.В., Рассказов U.A. Определение субстратной специфичности рест-рикционной эндонуклеазы VspI.//BnoopraH. химия, 1987, т. 13, № 3, с. 420421.

2. Дегтярев С.Х., Речкунова H.H., Нетесовз H.A., Чижиков В.Е., Малыгин Э.Г.,

Кочкин A.B., Михайлов В.В., Рассказов В.А. Установление специфичности эндонуклеазы рестрикции Vnel.// Биоорган, химия, 1987, т. 13, Na 3, с. 4/2423.

.3. Михайлов В.В., Кочкин A.B., Иванова Е.П. Сравнительное изучение микроорганизмов мидии и среды ее обитания.//Микробиология, 1988, т. 57, в. 1, с. 158-159.

4. Моравская Н.О., Михайлов В.В. Сапрофитные грибы из бурых водорослей за-

лива Петра Великого Японского моря.//Биология моря, 1990, № 1, с. 72-74.

5. Иванова Е.П., Карякин A.A., Жигалина И.И., Михайлов Федосов Ю.В.,

Рассказов В.А., Еляков Г.Б. Оптимизация состава питательной среды для выращивания морской бактерии - продуцента щелочной фосфата-зы.//Микробиол. журнал, 1991, т. 53, в. 6, с. 46-50.

6. Федосов Ю.В., Михайлов В.В., Жигалина И.И., Иванова Е.П., Кожемяко В.А.,

Оноприенко Н.Б., Рассказов В.А., Еляков Г.Б. Высокоактивная щелочная фосфатаза из морской бактерии.//Докл.АН СССР, 1991, т. 320, N° 2, с. 485487.

7. Мальцев И.И., Кузнецова Т.А., Михайлов В.В., Еляков Г.Б. Новый антибио-

тик из морского стрептомицета.//Химия природн. соедин., 1991, № 2, с. 289299.

8. Афиятуллов Ш.Ш., Калиновская Н.И., Кузнецова Т.А., Иванова Е.П., Михай-

лов В.В. Антибиотики из штаммов Bacillus pumilus, выделенных из морской губки Dendrilla sp.//Химия природн. соедин.,1991, № 6, с. 866-867.

9. Elyakov G.В., Kuznetsova Т.А., Mikhailov V.V.,Maltsev I.I., Voinov V.G., Fe-doreyev S.A. Brominated diphenyl ethers from a marine bacterium associated with the sponge Dysideasp.//Experientia, 1991, v. 47, p. 632-633.

10. Voinov V.G., El'kin Yu.N., Kuznetsova T.A., Mal'tsev I.I., Mikhailov V.V., Sasunkevich V.A. Use of mass spectrometry for detection and identification of bromine-containing diphenyl ethers.//J.Chromatography, 1991, v. 586, p. 360-362.

11. Иванова Е.П., Михайлов B.B., Андреев JI.В. Морские бациллы и некоторые подходы к их идентификации.//Микробиол. журнал, 1991, № 1, с. 27-33.

12. Иванова Е.П., Киприанова Е.А., Аминин Д.Л., Михайлов В.В., Агафонова И.Ю. Биологическая активность микроорганизмов-ассоциантов мидии Crenomytilus grayanus.//Биотехнология и биотехника (BioT&BioE, Болгария), 1992, сер. А, № 1, с. 25-30.

13. Иванова Е.П., Фролова Г.М., Михайлов В.В., Горшкова Н.М., Направленный скрининг щелочных фосфатаз бактериального происхождения.//Прикл. био-хим. микробиол., 1992, т. 28, в. 5, с. 726-730.

14. Иванова Е.П., Михайлов В.В. Микроорганизмы - ассоцианты мидии Сгепо-mytihis grayanus и их гидролитическая активность.//Микробиология, 1992, т. 61, в. 3, с. 514-519.

15. Иванова Е.П., Бакунина И.Ю., Горшкова Н.М., Романенко Л.А., Михайлов В.В., Елякова JI.A., Парфенова В.В. Распространение хитин-разлагающих ферментов у морских и пресноводных микроорганизмов.//Биология моря,

1992, № 3-4, с. 69-75.

¡6. Е;шк<ш Г.Б., Сто;?":' В .Л , К ученой» MtuuuLuw 2.В. Пскстсрт.т- ^т"™« " перспективы исследований в области морской биохимии и 6иотехноли1ии.// Биоорган, химия, 1992, т. 18, № 10-11, с. 1424-1440.

17. Романенко JI.A., Михайлов В.В. Нуклеазная активность микроорганизмов, ассоциантов с морскими асцидиями.//Микробиология, 1992, т. 61, в. 1, с. 131-133.

18. Иванова Е.П., Исаков В.В., Михайлов В.В., Соколова С.В., Горшкова Н.М., Федосов Ю.В., Киприанова Е.А. Исследование морских микроорганизмов рода Alterornonas методом 31Р-ЯМР высокого разрешения.//Микробиология,

1993,т. 62, в. 2, с. 260-266.

19. Етяков Г.Б., Стоник В.А., Кузнецова Т.А., Михайлов В,В. Морская биохимия и биотехнология: достижения и перспективы.//Вестник РАН, 1993, т. 63, № 9, с. 797-802.

20. Иванова Е.П., Михайлов В.В., Кузнецова Т.А., Афиятуллов Ш.Ш., Кадцновс-кая Н.И., Еляков Г.Б., Киприанова Е.А., Гара1>ля А.Д. Гетеротрофные бактерии, ассоциированные с губкой Dendrilla sp. и их физиологическая активность.// Биология моря, 1993, № 3, с. 3-10.

21. Терентьев JI.J1., Терентьева Н.А., Шевченко Л.С., Беленева И.А., Михайлов В.В., Рассказов В.А. Очистка и некоторые свойства щелочной фосфатазы из морской бактерии.//Прикл. бпохпм. микробиол., 1994, т. 30, в. 3, с. 372-377.

22. Иванова Е.П., Горшкова Р.П., Михайлов В.В., Назаренко Е.Л., Зубков В.А.,

Киприанова Е.А., Леванова Г.Ф., Гарагуля А.Д., Колесова Э.А., Горшкова

Н.М. Сравнительное изучение трех штаммов морских бактерий рода Altero-

-41-

monas и характеристика их капсульных полисахаридов.//Микробиологии. 1994, т. 63, в. 2, с. 228-234.

23. Михайлов В.В., Иванова Е.П. Бактерии рода Alleromonas: систематика, физиологически активные соединения.//Биология моря, 1994, т. 20, № 3, с. 171180.

24. Романенко JI.A., Зелепуга Е.А., Козловская Э.П., Михайлов В.В. Тирозиназ-ная ак-тивность бактерий рода Alteromonas.//Ъпопоттля моря, 1994, т. 20, № 4, с. 260-263.

25. Иванова Е.П., Михайлов В.В., Плисова Е.Ю., Балабанова JI.A., Светашев В.И., Высоцкий М.В., Степаненко В.И., Рассказов В.А. Характеристика штамма морской бактерии Deleya marina - ассоцианта мидии Crenomytilus grayanits, продуцирующего высоко активную щелочную фосфатазу.//Биология моря, 1994, т. 20, № 5, с. 340-345.

26. Иванова Е.П., Романенко Л.А., Плисова Е.Ю., Федосов Ю.В., Михайлов В.В., Горшкова Н.М., Ивайловский В.В., Рассказов В.А. Распространение ри-бонуклеаз среди морских микроорганизмов.//Прикл. биохим. микробиол., 1994, т. 30, в. 3, с. 384-388.

27. Elyakov G.B., Kuznetsova Т.А., Stonik V.A, Mikhailov V.V. New trends of marine biotechnology development.//Pure & Appl. Chem., 1994, v. 66, N 4, p. 811-818.

28. Лукьянов П.А., Новикова О.Д., Михайлов В.В., Недашковская О.И., Соловьева Т.Ф., Оводов Ю.С. Каррагиназная активность бактериальных штаммов, ассоциированных с красными водорослями из района Курильских островов.// Биология моря, 1994, т. 20, № 6, с. 472-473.

29. Сова В.В., Елякова Л.А., Иванова Е.П., Федосов Ю.В., Михайлов В.В. Индуцированная р-1,3-глюканаза из морской бактерии Alíeromonas sp.//Биохимия, 1994, т. 59, в. 9, с. 1369-1374.

30. Бакунина И.Ю., Иванова Е.П., Михайлов В.В., Недашковская О.И., Горшкова Н.М., Парфенова В.В. Распространение a-N-ацетилгалактозаминидаз среди морских и пресноводных микроорганизмов.//Микробиология, 1994, т. 63, в. 5, с. 847-853.

31. Романенко Л.А., Иванова Е.П., Лысенко А.М., Михайлов В.В. Некоторые особенности грамотрицательных агарлитических бактерий из морской среды.// Микробиология, 1994, т. 63, в. 5, с. 940-944.

-42-

32. Романенко Jl.A., Лысенко А.М., Михайлов В.В., Курика A.B. Новый вид бу-ропигментированных агарлитических бактерий рода Alteromonas.// Микробиология, 1994, т. 63, в. 6, с. 1081-1087.

33. Михайлов В.В. Перспективы морской микробиологии в биотехнологии.//Сб. научных трудов "Моская микробиология", 1995, Изд-во Дальневосточного унта, Владивосток (Ред. И.Е. Мишустина), с. 9-14.

34. Еляков Г.Б., Кузнецова Т.А., Михайлов В.В., Мальцев И.И., Калиновская Н.И., Афиятуллов Ш.Ш., Недашковская О.И., Шевченко J1.C., Сметанина О.Ф., Романенко Л.А. Распостранение в морских симбионтных ассоциациях микроорганизмов, продуцирующих физиологически активные соединение.//' п. научных íwvmuó "Morles.! ? ? тгкр«Яилплтоя". 1995. Изд-во Дальневосточного ун-та, Владивосток (,Ред. И.Е. Мишусшна), с. 32-35.

35. Романенко Л.А., Михайлов В.В., Лысенко А.М., Степаненко В.И. Новый вид меланинсинтезирующих бактерий рода Alieromonas.//Микробиология, 1995, т. 64, № 1, с. 74-77.

36. Михайлов В.В., Кузнецова Т.А., Еляков Г.Б. Биоактивные метаболиты морских актиномицетов.//Биоорган. химия, 1995, т. 21, № 1, с. 3-8.

37. Олейникова Г.К., Шевченко Л.С., Кузнецова Т.А., Михайлов В.В. Новый фунгнцвдный препарат итуриновой группы, полученный из морского изолята Bacillus subiüis. Выделение, физико-химические и биохимические свойства, идентификация.//Антибиотики и химиотерапия, 1995, т. 40, № 2, с. 19-21.

38. Svetashev V.l., Vysotskii M.V., Ivanova Е.Р., Mikhaiiov V.V. Cellular fatty acids of Aherumonas species.//Syst. Appl. Microbiology, 1995, v. 18, № 1, p. 37-43.

Авторские свидельства и патенты

1. Еляков Г.Б., Михайлов В.В., Кузнецова Т.А., Стоник В.А., Анисимов M.M.//A.C. 1985 (для служебного пользования )

2. Дегтярев С.Х., Речкунова Н.И., Нетесова H.A., Малыгин Э.Г., Михайлов В.В.,

Рассказов В.А. Штамм Vibrio nereis - продуцент рестриктазы Vne I, узнающей и расщепляющей последовательность 5'-GTGGAG-3'.//А.с. № 1413954, 1986.

3. Дегтярев С.Х., Репин В.Е., Гайнулина М.Н., Речкунова Н.И., Михайлов В.В., Рассказов В.А., Щелкунов С.Н., Малыгин Э.Г. Штамм Vibrio sp. - продуцент

рестриктазы Vsp I, узнающей и расщепляющей последовательность 5'-АТТААТ-3'.// А.с. № 1413955, 1987.

4. Федосов Ю.В., Михайлов В.В., Жигалина И.И., Иванова Е.П., Рассказов В.А., Еляков Г.Б. Штамм бактерии Acinetobacter sp. - продуцент щелочной фосфата-зы и способ получения щелочной фосфатазы.//А.с. № 1489182, 1987.

5. Мальцев И.И., Кузнецова Т.А., Михайлов В.В., Еляков Г.Б. Штамм Streptomy-ces pluricolorescens - продуцент полипетидного антибиотика пальмиромици-на.//Патент Российской Федерации № 2022015,1992.

6. Романенко J1.A., Плисова Е.Ю., Федосов Ю.В., Михайлов В.В., Рассказов В.А., Еляков Г.Б. Штамм бактерии Altero/nonas haloplanktis - продуцент полиуридил-эндорибонуклеазы.//Патент Российской Федерации № 2026347, 1995.