Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Морфология слизистой оболочки желудка и двенадцатиперстной кишки мышей при гастродуоденопатиях и их коррекции производным фосфорилацетилгидразида

ВАК РФ 03.00.25, Гистология, цитология, клеточная биология

Автореферат диссертации по теме "Морфология слизистой оболочки желудка и двенадцатиперстной кишки мышей при гастродуоденопатиях и их коррекции производным фосфорилацетилгидразида"

003483532

На правах рукописи

ЛИТЮШКИНА АЛЕКСАНДРА АЛЕКСАНДРОВНА

МОРФОЛОГИЯ СЛИЗИСТОЙ ОБОЛОЧКИ ЖЕЛУДКА И ДВЕНАДЦАТИПЕРСТНОЙ КИШКИ МЫШЕЙ ПРИ ГАСТРОДУОДЕНОПАТИЯХ И ИХ КОРРЕКЦИИ ПРОИЗВОДНЫМ ФОСФОРИЛАЦЕТИЛГИДРАЗИДА

03.00.25 - гистология, цитология, клеточная биология 14.00.25 - фармакология, клиническая фармакология

Автореферат 1 9 Н ОЯ '^ПО

•w ^ О <J

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Саранск-2009

003483532

Работа выполнена на кафедре цитология, гистологии и эмбриологии ГОУВПО «Мордовский государственный университет имени Н.П.Огарева»

Научные руководители: доктор биологических наук, профессор

Балашов Владимир Павлокич доктор медицинских наук Чистяков Сергей Иванович Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор

Ерёмина Елена Юрьевна доктор медицинских наук, профессор Серпов Лев Николаевич

Ведущее учреждение: ГОУВПО «Российский государственный меди-

цинский университет федерального агентств по здравоохранению и социальному развитию»

Защита диссертации состоится «04» декабря 2009 г. в «Ю00» часов на заседании диссертационного'совета Д. 212.117.01 при ГОУВПО «Мордовский госудгрственный университет имени Н.П. Огарева» по адресу: 430005, г. Саранск, ул. Большевистская, 68.

Автореферат диссертации опубликован на официальном сайте ГОУВПО «Мордовский государственный университет им. Н.Г1. Огарева» www.mrsu.ru E-mail: dsovet@mrsu.ru

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУВПО «Мордовский государственный университет имени Н.П. Огарева»

Автореферат разослан «_» 2009 года.

Учёный секретарь

диссертационного совета,

доктор биологических наук, профессор

Тельцов JI.II.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования. Исследование изменений структурро-функциональной организации органов и тканей в условиях воздействия разнообразных факторов внешней среды представляет собой важнейшее направление морфологических исследований (Сапин М.Р., 2000). К структурам, наиболее чувствительным к воздействию факторов внешней, среды, относятся слизистые оболочки органов желудочно-кишечного тракта. Это определяет широкое распространение среди трудоспособного населения развитых стран состояний, сопровождающихся нарушением целостности слизистой оболочки желудка и двенадцатиперстной кишки и представляет собой серьёзную медицинскую и социальную проблему (Ткаченко Е.И., 1995; Кононов A.B., 2004; Михайлов А.П., 2004; Козырев М.А., 2007).

Процессы повреждения в гастродуоденальной зоне являются объектом пристального морфологического, клинического и эндоскопического исследования (Аруин Л.И., 1998; Голофеевский В.Ю., 2005; Васильев Ю.В., 2008). Особое место среди причин, способствующих развитию дефектов слизистой оболочки, отводится стрессовым воздействиям (Маслова М.Н., 2005; Калинин A.B., 2004, 2008) и влиянию лекарственных препаратов, в частности, нестероидных противовоспалительных средств и глюкокортикоидов (Гурин H.H., 1998; Полунина Т.Е., 1997; Васильев Ю.В., 2003; Бандурина Т.Ю., 2004; Ткаченко Е.И., 2006).

Учитывая широкую распространенность эрозивно-язвенных дефектов слизистой оболочки желудка и двенадцатиперстной кишки, представляется актуальным не только исследование морфологии слизистых оболочек в динамике формирования зон повреждения, но и определение критериев данных состояний (Калинин А.В.с соавт., 1983; Косько Е.В., 1984; Нефёдова Е.А. с соавт., 1984; Хомерики С.Г., 1989; Насонов-ЕЛ., 2000; Ткаченко Е.И., 2008; McNamara, D., 2004). Не менее актуальной является разработка новых средств фармакологической коррекции. Изучение новых фармакологических средств обычно проводится с применением морфологических методов исследования.

Последняя задача определяется тем, что, несмотря на широкие возможности в лечении патологии желудка и 12-перстной кишки (Гребнёв AJI., Шептулин A.A., 1993; Григорьев П.Я., 1995; Григорьев П.Я., Яковенко Э.П., 1996), остается много сложностей в фармакологической коррекции поражений слизистой оболочки данного отдела желудочно-кишечного тракта. Ведущими в терапии являются препараты, влияющие на секреторную функцию желудка, на pH желудочного сока и подавляющие: жизнедеятельность H.pylori (при её обнаружении). Однако в литературе всё чаще появляются данные о недостаточной эффективности традиционных средств и большом количестве побочных эффектов на фоне их использования; (Серебрянская М.В. и др., 1993; Зайцева Е.И., 1994; Аруин Л.И., 2004; Подопригорова В.Г., 2004; Ryan R., 1993). К наиболее распространённым побочным эффектам относятся: формирование грубого рубца на месте язвы, новообразования, атро-

фия, слизистой оболочки желудка, тошнота, головная боль, диарея, снижение артериального давления, брадикардия, нарушения ритма и проводимости, снижение содержания гонадотропинов, блокада рецепторов андрогенов у мужчин, супрессия местного иммунитета. В связи с этим высказывается мнение,, что препараты с антисекреторной активностью не могут являться универсальным средством лечения, тем более что процессы клеточной защиты протекают независимо от выработки кислоты в желудке (Арутюнян В.М. и др., 1989).

,.. В конце XX века в мировой медицинской практике заявило о себе новое направление в лечении эрозивно-язвенных поражений гастродуоденаль-ной зоны препаратами с антиоксидантной направленностью - природными и синтетическими антиоксидантами (INDEX MEDICUS, 1990-2000). Это направление базируется на многочисленных работах О значении ПОЛ и антиоксидантной системы в развитии повреждений желудка и двенадцатиперстной кишки (Бурлакова Е.Б., 1985; Звершхановский Ф.А., 1987, 1989; Подоприго-рова В.Г., 2004). В ряде работ последних лет (Зиганшина JI.E. <; соавт., 2002; Начкина Э.И., 2003) продемонстрировано положительное влияние препаратов с антиоксидантным действием на процессы заживления острых язв и эрозий желудочно-кишечного тракта.

Среди синтетических антиоксидантов перспективной для изучения является группа фосфорорганических неантихолинестеразных средств. Ранее проведённые исследования (Курмышева Т.В., 2005; Кулькова Н.П., 2007; Балашова Г.В. с соавт., 2007; Балашова Г.В., 2009) показали, что некоторые представители этой группы химических соединений проявляют антистрес-сорную и кардиопротекторную активность. Принимая во внимание, что механизмы фармакологических эффектов фосфорилацетогидразидов основаны на антиоксидантном и мембраностабилизирующем действии (Балашов В.П. с соавт., 2007), можно предположить их способность препятствовать повреждению слизистой оболочки желудочно-кишечного тракта.

Однако изучение влияния данных соединений на состояние слизистой оболочки гастродуоденальной зоны ранее не проводилось, что и определило выбор темы, постановку цели и задач данного исследования.

Цель работы: изучение изменений в слизистой оболочке желудка и 12-перстной кишки при экспериментальных острых, субхронических и хронических гастродуоденопатиях и на фоне введения трифторуксуснокислой соли 4-диметиламинофенил 2-хлорэтокси-фосфорилацетилгидразида (химического соединения 3635).

В соответствии с целью исследования были поставлены следующие задачи:

1. Оценить степень поражения слизистой оболочки гастродуоденальной зоны мышей в условиях иммобилизационного стресса, введения глюкокорти-коидов и нестероидных противовоспалительных препаратов без лечения и на фоне коррекции ХС 3635, используя морфометрические методы.

2. Исследовать строение слизистой оболочки желудка и двенадцатиперстной кишки мышей на модели гасггродуоденопатии, наиболее чувствительной к протективному действию ХС 3635.

3. Изучить зависимость эффекта ХС 3635 от величины введённой дозы и режима введения.

Научная новизна работы. Впервые показано гастродуоденопротектор-ное действие трифторуксуснокислой соли 4-диметиламинофенил-2-хлорэтокси-фосфорилацетилгидразида (ХС 3635) на моделях острых, подострых и хронических гастродуоденопатий. Приоритетными являются данные о сопоставимости гастродуоденопротекторного эффекта ХС 3635 и фамотидина. Выявлено, что гастропротекторный эффект исследуемого вещества носит дозозависимый характер. Показано, что одним из механизмов протекторного действия производного фосфорилацетилгидразида в отношении слизистой оболочки желудка и двенадцатиперстной кишки является его влияние на образование кислых муко-полисахаридов, входящих в состав защитного слизисто-бикарбонатного.барье-ра. При гастропатиях стрессорного генеза ХС 3635 снижает выраженность гипертрофии париетальных клеток фундальных желез желудка.

Научно-практическая значимость работы. Анализ полученных результатов может служить основанием для более глубокого и разностороннего изучения фармакологии фосфорилацетогидразидов. Основные результаты диссертационного исследования могут быть использованы специалистами, работающими в области неантихолинэсгеразных фосфорорганических соединений. Материалы работы могут быть использованы в учебном процессе медицинских, биологических и ветеринарных вузов, а также при написании учебных пособий.

Внедрение результатов работы. Результаты диссертационного исследования внедрены в научно-исследовательскую работу кафедры цитологии, гистологии и эмбриологии с курсом медицинской биологии и используются в учебном процессе на кафедре фармакологии Мордовского государственного университета имени. Н.П. Огарева.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Морфологические изменения слизистой оболочки желудка и 12-перстной кишки, вызванные стрессом и нестероидными противовоспалительными препаратами, коррегируются соединением 3635.

2. Вещество неэффективно при поражении слизистых оболочек, вызванном спирто-преднизолоновой смесью.

3. Эффект соединения 3635 носит дозозависимый характер и в разной степени проявляется как при профилактическом применении, так и при его введении после воздействия повреждающих факторов. 'д'!

Основные сведения об апробации работы. Материалы, представленные в диссертации, докладывались и обсуэдались на ежегодных Огарёвских чтениях и конференциях молодых учёных Мордовского государственного университета (Саранск, 2005-2008 гг.); II Беломорском симпозиуме - Всероссийской конференции с международным участием (Архангельск, 2007); VII съезде научного общества гастроэнтерологов России (Москва, 2007); XII Российском национальном конгрессе "Человек и лекарство" (Москва, 2007); V Всероссийской на-

учной конференции общих хирургов, объединённой с пленумом проблемных комиссий РАМН "Неотложная хирургия" и "Инфекция в хирургии" межведомственного научного совета по хирургии (Ростов-на-Дону, 2008); Российской конференции, посвящённой 75-летию профессора И.А.Сгуденцовой (Казань, 2008), II межрегиональной научной конференции «Актуальные проблемы медицинской науки ц образования» (Пенза, 2009).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 14 работ; 3 из них - в изданиях, рекомендованных ВАК.

Структура и объём работы. Диссертация изложена на 167 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы (глава 1), описания материалов и методов исследования (глава 2), изложения результатов собственных исследований (главы 3,4,5,6), обсуждения результатов (глава 7), выводов, практических рекомендаций, указателя литературы. Библиографический указатель включает 288 источников, в том числе 81 иностранный и 207 отечественных. Диссертация иллюстрирована 24 таблицами, 46 рисунками.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования.

Исследуемое соединение - трифторуксуснокислая соль' 4-диметиламинофенил 2-хлорэтоксифосфорилацетилгидразида (ХС 3635) -синтезированию' в Казанском технологическом университете под руководством к.х.н. Р:И.Тарасовой (1989). Структура исследуемого соединения представлена ниже:

снз

\ /ОС2Н4С1

снз/

^СН2СМНЖ2 СР3СООН

о

о

Рис. I. Трифторуксуснокислая соль 4 - диметиламинофенил - 2 - хлорэ-токсифосфорилацетилгидразйда (ХС 3635).

Соединение представляет собой белый кристаллический порошок без запаха, температура плавления -- 19-20 С0, температура кипения 235-236 С0 при атмосферном давлении. Растворимо в воде и органических растворителях. В работе использовали субстанцию, предоставленную автором. Соединение вводили животным в двух режимах: 1) профилактически - до воздействия повреждающего фактора в дозах 10"5 и 10"6 моль/кг (4,3 и 0,43 мг/кг); 2) после воздействия повреждающего фактора (в "лечебном" режиме) в дозе 10" 5 моль/кг (4,3 мг/кг).

Препаратом сравнения служил Н2 - блокатор гистаминовых рецепторов фамотидин. В эксперименте использовали официнальную жидкую лекарст-

венную форму препарата фирмы Гедеон Рихтер (Венгрия) для парентерального применения. Препарат применяли в половинной среднетерапевтической дозе 0,125 мг/кг (~ 0,5 х 10"6 моль/кг). Более высокие дозы нами не использовались в связи с выраженными побочными эффектами в предварительных опытах (острое расширение желудка и кишечника).

Характеристика подопытных животных. Работа выполнена на 237 половозрелых белых мышах массой 20-25г. Все подопытные животные были разбиты на группы и серии, данные о которых приведены в таблице 1.

Таблица 1.

Распределение животных по экспериментальным группам. "

Раздел исследования Условия эксперимента (серии) > Число мышей

I Интактный контроль 18

Интактные животные+ 0,9% раствор ЫаС1 в/м 20

Интактные животные+ 0,9% раствор ЫаС1 в/б 20

II Стресс + 0,9% раствор №С1 20

Стресс + фамотидин (0,125 мг/кг, профилактика) 16

Стресс +ХС 3635 (4,3 мг/кг, профилактика) 16

Стресс + ХС 3635 (0,43 мг/кг, профилактика) 16

Стресс+ХС 3635 (4,3 мг/кг, лечение) 16

III Диклофенак + 0,9% раствор ИаС1 16

Диклофенак + фамотидин (профилактика) 16

Диклофенак + 3635 (4,3 мг/кг) (профилактика) 16 !

Диклофенак + 3635 (0,43мг/кг) (профилактика) 16

Диклофенак + 3635 (4,3 мг/кг) (лечение) 16

IV Спирт и преднюолон + 0,9% раствор ЫаС1 5

Спирт и преднизолон +3635(4,Змг/кг)(проф) 5

Спирт и преднизолон+3635 (0,43мг/кг)(проф) 5 ...

Итого 237

Методы экспериментальных исследований. Животных 1-го раздела, составляющих "интактный - контроль", забивали на 4 день наблюдения. Животных 2-го раздела подвергали иммобилизации по Оез1с1ега1о О. & а!., (1974) в положении "на спине" (3 дня по 3 часа). Третий раздел составили мыши, которым моделировали НПВП-индуцированную гастродуоденопатию путём внутримышечного введения диклофенак-натрия в дозе 5,0 мг/кг в течение трёх дней. Животных 2 и 3 разделов выводили из эксперимента на 4-е сутки (при профилактическом введении испытуемых соединений) и на 7-е сутки (при изучении ХС3635 в "лечебном" режиме). В четвёртом разделе работы изучали гастро-дуоденопротекторное действие ХС 3635 на модели острого спирто-преднизолонового повреждения слизистой оболочки гастродуоденальной зоны (А.В.Стефаиов, 2001). После 24-часового голодания внутрижелудочно однократно вводили смесь преднизолона в дозе 20,0 мг/кг и 80% этилового

спирта из расчёта 0,12 мл на 20 г массы тела животного. Животных выводили из опыта через 24 часа после введения ульцерогенного агента.

Выведение мышей из эксперимента осуществлялся гильотинным методом после предварительной внутрибрюшинной инъекции 50,0 мг/кг тиопентал-натрия. Брюшную полость вскрывали и визуально оценивали состояние органов желудочно-кишечного тракта: наличие внутрибрюшного кровотечения, перфорации и пенетрации. Далее желудок и 12-перстную кишку размещали на пенопластовом столике, производили разрез по продольной оси и с помощью стереоскопического микроскопа МБС-9 осуществляли макроморфометрическую оценку состояния их слизистой оболочки.

Для характеристики макроскопических изменений в слизистой оболочке желудка и 12-перстной кишки по методике Виноградова В.А. (1983) определяли: 1) количество эрозий; 2) количество язвенных дефектов; 3) тяжесть поражения; 4) частоту поражения; 5) множественность поражения; 6) интегральный показатель - язвенный индекс. Оценивалась также летальность животных.

Тяжесть поражения (ТП) характеризовали средним баллом: неравномерная пятнистая окраска слизистой гастродуоденальной зоны с очагами гиперемии, точечными кровоизлияниями, отечностью количественно не учитывались (0 баллов); наличие на этом фоне мелких эрозий расценивали как эрозивный гастро-дуоденит (1 балл); при обнаружении единичных язв, множественных язв, пенет-рирующих или прободных язв поражение оценивали соответственно в 2, 3 или 4 балла. Частоту поражения (ЧП) вычисляли как отношение числа ямвотных с язвами к общему числу животных в группе. Множественность поражения (МП) расчитывали как отношение числа язв у всех мышей к числу животных в группе. Суммарный показатель - язвенный индекс (ЯИ) - вычисляли по формуле ТП+ЧП+МП.

Для гистологического исследования фрагменты фундального отдела желудка и проксимальной части двенадцатиперстной кишки мышей фиксировали в 10% растворе формалина, приготовленного на фосфатном буфере (рН=7,2-7,4), обезвоживали в спиртах возрастающей концентрации и заливали а парафин. На санном микротоме готовили срезы толщиной 5-7 мкм. Окраску осуществляли гематоксилином и эозином, а также альциановым синим с последующей микроскопией.

Фотосъёмку препаратов производили цифровой камерой САМ V 200 (Vision, Австрия) с последующей обработкой изображения в Adobe Photoshop 7,0 и морфометрическим исследованием при помощи программы Видеотесг - Мастер Морфология (2005) и микрометр-окуляра. Результаты морфометрии обработаны статистически: t-критерий Сгьюдента и "Хи-квадрат".

Результаты исследований

Воздействие хронического иммобилизационного стресса на слизистую оболочку желудка и двенадцатиперстной кишки по выраженности повреждения несколько различалось. В желудке у всех животных отмечались участки

гиперемии, точечных кровоизлияний и эрозии. Язвы были редки и единичны. Изменения дуоденальной области заключались в формировании повреждений только эрозивного характера, причём интенсивность поражения была более чем в два раза выше аналогичного показателя в слизистой оболочке желудка (таблица 2).

Морфологические изменения в слизистой оболочке желудка 'заключались в разрушении клеток призматического секреторного эпителия. Имел место отёк собственной пластинки и её инфильтрация лейкоцитами. Достаточно часто встречалась дилатация мелких сосудов собственной пластинки слизистой как проявление нарушений микроциркуляции, ведущих к формированию эрозий. Кроме того, отмечалась гипертрофия париетальных клеток фун-дальных желез (рис.2). Последний факт, очевидно, объясняется тем, что при стрессе не угнетается синтез соляной кислоты обкладочными клетками, но тормозится секреция продукта. Это согласуется с данными о различии механизмов синтеза и выделения секрета париетальными клетками собственных желез желудка (Гайтон А.К., Холл Д.Э., 2008).

Таблица 2.

Влияние ХС 3635 на развитие стресс-опосредованных гастродуоденопатий у мышей

Показатель Контроль Фамотидин ХС 3635 0,43 мг/кг проф. ХС 3635 4,3 мг/кг, проф. ХС 3635 4,3 мг/кг, леч.

Жел. 12-п.к. Жел. 12-п.к. Жел. 12-п.к. Жел. 12-п.к. Жел. 12-п.к.

Тяжесть поражения 1,25± 0,25* 1±0* 0,б25± 0,18 0,625± 0,18* 0* 0,125± 0,125* 0 0 0 . 0

Частота поражения 0,125 0 0 0 0 0 0 0 0 0

Множественность поражения 0,625 0 0 0 0 0 0 ■0 0 0

Язвенный индекс 2,0 1 0,625 0,625 0 0,125 0 0 0 0

Среднее число язв 0,625± 0,625 0 0 0 0 0 0 0 0 0

Среднее число эрозий 2,625± 0,532* 5,87± 1,32* 1,13± 0,40* 1,0± 0,38* 0* 0,125± 0,125* 0 0 0 0

Летальность |2 (25%) 0 (0%) 2(25%) 0 (0%) 0 (0%)

Примечание: Жел. - желудок; 12-п.к. - 12-перстная кишка; а - отличия от соответствующих показателей у интактных животных достоверны при р<0,05; * - отличия от соответствующих показателей у животных группы стресс-контроля достоверны при р<0,05.

При микроскопическом изучении препаратов слизистой ободочки 12-перстной кишки животных, подвергнутых хроническому иммобилизацион-

ному стрессу, были выявлены изменения, сходные с таковыми при изучении слизистой оболочки желудка. В области эрозий отмечались значительные повреждения ворсинок, которые затрагивали как покровный эпителий, так и собственную пластинку слизистой. Во всех изученных препаратах наблюдали выраженный отёк, часто приводящий к нарушению целостности ворсинок. Отдельные ворсинки были существенно редуцированы. Собственная пластинка слизистой оболочки на значительном протяжении содержала множественные скопления лейкоцитов.

30 25 20 15 10 5

о

Рис.2. Морфометрическая характеристика париетальных клеток фун-дальных желёз желудка при стрессе и коррекции фамотидином (0,125 мг/кг) и ХС 3635 (4,3 мг/кг).

Окраска альциановым синим позволила выявить, что стресс приводил к уменьшению числа поверхностных эпителиоцитов и шеечных мукоцитов, продуцирующих слизь в фундальном отделе желудка. Аналогичным образом снижалась слизеобразующая активность бокаловидных клеток в проксимальной части 12-перстной кишки. Морфометрическая оценка доли площади фотокадров, окрашенных альциановым синим, свидетельствует о статистической значимости выявленного эффекта стресса (рис.3).

2,

Площадь защиты,%

1,

о,

г *

/-а- 1

сЕ клеток, мкм

8 клеток, мкм2

8 ядер, мкм2

□ Интактные ■Стресс-контроль

ШСтресс+фамотидин ОСтресс+ХС 3635

51^

ХС3635 ХС 3635

Интактные Стресс Фамотидин профилактика лечение

I Ш желудок И12-псрстнаи кишка!

Рис.3. Состояние слизистого барьера гастродуоденальной зоны при стрессе и коррекции: фамотидином (0,125 мг/кг), ХС 3635 (4,3 мг/кг) в профилактическом и лечебном режимах введения.

Выявив основные морфологические изменения слизистой оболочки желудка и 12-перстной кишки в условиях стресса, мы приступили к решению задачи по оценке протекторных свойств ХС 3635 в сравнении с активностью Н2-блокатора фамотидина. Введение фармакологических агентов осуществляли за 15 минут до иммобилизации животных (профилактически). Результаты анализа состояния слизистых оболочек подопытных животных приведены в таблице 2.

Макроморфологическая оценка состояния слизистой оболочки фун-дального отдела желудка на фоне использования ХС 3635 в дозах 4,3 и 0,43 мг/кг свидетельствует об отсутствии язвенных и эрозивных повреждений. В связи с этим все расчётные показатели были равны нулю. Применение препарата сравнения позволило предупредить формирование язвенных повреждений слизистой оболочки желудка, тогда как эрозивные повреждения встречались с частотой 1,13±0,40, что определило небольшой уровень "тяжести повреждения" и "язвенного индекса".

Микроморфологическая картина слизистой желудка при коррекции ХС 3635 была близка к нормальной, характерной для животных интактного контроля. Покровный эпителий характеризовался высокой степенью сохранности. Выраженность отёка собственной пластинки и лейкоцитарной инфильтрации заметно варьировала от нормальной картины до состояния, наблюдаемого при стресс-индуцированных повреждениях. Однако такие зоны повреждения были относительно невелики. На фоне терапии фамотидином также снижалась степень стресс-опосредованных структурных изменений, но в собственной пластинке чаще обнаруживались зоны отека в местах расположения гемокапилляров.

Важным свойством ХС 3635 и фамотидина была их способность предупреждать формирование гипертрофии париетальных клеток, что характерно для животных группы стресс-контроля (рис. 2). При профилактическом введении ХС 3635 отмечалась нормализация состояния слизистого барьера (рис. 3). На микропрепаратах, окрашенных альциановым синим, выявлялась окраска в просвете фундальных желёз и в виде тонкого слоя на поверхности слизистой оболочки. Фамотидин не препятствовал разрушению слизистого барьера при стрессе.

На слизистую оболочку 12-перстной кишки ХС 3635 оказывало эффект в зависимости от величины введенной дозы (таблица 2). У животных, получавших исследуемое соединение в дозе 4,3 мг/кг (профилактически), макро-морфометрия не выявила язв и эрозий в слизистой оболочке органа. Все интегральные показатели оказались равны 0. При снижении дозы ХС 3635 до 0,43 мг/кг дуоденопротекторный эффект вещества несколько снизился и примерно соответствовал эффекту препарата сравнения.

Микроскопическое исследование слизистой оболочки 12-перстной кишки подтвердило заметные дуоденопротекторные свойства ХС3635. У животных, получавших исследуемое вещество, эпителий ворсинок не претерпевал существенных изменений. Отек собственной пластинки слизистой был выражен слабо, а инфильтрация лейкоцитами встречалась редко, и площадь таких участков на гистологических срезах была невелика. На фоне использования фамотидина отмеченные структурные особенности характеризовались большим полиморфизмом.

Использование фамотидина позволяло обеспечить не только целостность ворсинок 12-перстной кишки, но и поддержать сохранность защитного слизистого барьера. На поверхности ворсинок прослеживается тонкий, но достаточно чёткий и непрерывный слой кислых мукополисахаридов, выявляется значительное количество активных бокаловидных клеток. Близкая картина при окраске альциановым синим была выявлена и у мышей, получавших терапию ХС 3635 (4,3 мг/кг профилактически). Однако вследствие большего полиморфизма морфологической картины нам не удалось подтвердить её статистическую значимость, даже при условии близкого значения средней величины показателей "площадь защиты" у животных, получавших исследуемое вещество и препарат сравнения (рис. 3).

Таким образом, полученные данные свидетельствуют о наличии гаст-родуоДенопротекторных свойств у производного фенилфосфорилуксусной кислоты при стресс-индуцированном повреждении органон желудочно-кишечного тракта. В связи с этим на следующем этапе исследования мы предприняли попытку оценить структурные изменения слизистых оболочек желудка и 12-перстной кишки при действии нестероидных противовоспалительных средств. В качестве повреждающего агента в этом разделе исследования мышам парентерально вводили диклофенак-натрия. Результаты мак-роморфологического анализа состояния слизистой оболочки органов желудка в условиях данной экспериментальной модели приведены в таблице 3.

Таблица 3.

Влияние соединения 3635 на развитие НПВП-опосредованных гастродуоденопатий у мышей

Показатель Контроль Фамотидин хсзе 0,43 м про< >35 г/кг ). ХСЗ< 4,3 мг про( >35 /кг, ХС 3635 4,3 мг/кг, леч.

Жел. 12-п.к. Жел. 12-п.к. Жел. 12- п.к. Жел. 12-п.к. Жел. 12-п.к.

Тяжесть поражения 1,375± 0,26* 1±0» 0,625± 0,18* 0,5± 0,19* 0,5± 0,18* 0 0,375± 0,18* 0 0,5± 0,18* 0

Частота поражения 0,25 0 0 0 0 0 0 0 0 0

Множественность поражения 0,375 0 0 0 0 0 0 0 0 0

Язвенный индекс 2,0 .....1 0,625 0,5 0,5 0 0,375 0 0,5 0

Среднее число язв 0,375± 0,26 о 0 0 0 0 0 0 0 0

Среднее число ' ' ■ 'эрозий 3,25± < 1,19",; 3,75±> 1,4' 1;375± ,0,59 1,375± 0,65 1,125± 0,44 0 0,625± 0,38 0 1,0± 0,42 0

Летальность 0(0%) 0 (0%) 0(0%) 0 (0%) 0(0%)

Примечание: а — отличия от соответствующих показателей у интактных животнь1х достоверны при р<0,05; * - отличия от соответствующих показателей у животных группы НПВП-контроля достоверны при р<0,05.

У животных, получавших диклофенак-натрия, выявлялись признаки повреждения слизистой оболочки фундального отдела желудка в виде острых множественных эрозий и язв. Среднее число язв было невелико, но эрозивные повреждения характеризовались большой площадью и числом.

При микроскопическом исследовании отмечались дистрофические изменения эпителия, выявлялись клетки с интенсивно окрашенной цитоплазмой и пикнотичным базофильным фрагментированным ядром. Для собственной пластинки слизистой оболочки желудка был характерен значительный отёк и очаги лейкоцитарной инфильтрации.

В строении фундальных желёз желудка при моделировании НПВП-гастропатии выраженных изменений не отмечено. Проведённая морфометрия париетальных клеток не выявила значимых различий диаметров клеток, ядер и их площадей у мышей групп интактного контроля и НПВП-контроля (рис.4). При действии нестероидного противовоспалительного средства в слизистой оболочке фундального отдела желудка отмечалась тенденция к угнетению слизеобразования, однако морфометрия не подтвердила статистическую значимость этого явления (рис. 5).

ХС 3635 при введении мышам в профилактическом режиме в дозе 4,3 мг/кг в условиях данной модели гастропатии по своим протекторным свойствам превосходило фамотидин (таблица 3). Показатель «тяжесть поражения» снижался в 3,5 раза, «язвенный индекс» в 5 раз, а «частота поражения», «множественность поражения» и «среднее число язв» были равны нулю. ХС 3635 позволило в 5 раз уменьшить среднее число эрозий, тогда как фамотидин обеспечил снижение этой величины только в 2 раза.

□ Интактные ИНПВГ1-контроль

ИНПВЛ+фамогидин ПНПВП+ХСЗбЗЗ

Рис.4. Морфометрическая характеристика париетальных клеток фундальных желёз желудка при НПВП-гастропатии и её коррекции фамотиди-ном (0,125 мг/кг) и ХС 3635 (4,3 мг/кг).

Микроморфологически отмечалось поддержание целостности слизистой оболочки желудка. При терапии ХС 3635 для поверхностного эпителия была характерна высокая степень сохранности. В собственной пластинке

слизистой оболочки отмечалось уменьшение отёка. Степень лейкоцитарной инфильтрации варьировала от умеренной до незначительной.

Влияние ХС 3635 (4,3 мг/кг) на состояние париетальных клеток фун-дальных желёз отмечено не было. Диаметры клеток, площади цитоплазмы и аналогичные характеристики ядер в микропрепаратах слизистой оболочки желудка у интактных животных, в серии НПВП-контроль, на фоне введения фамотидина и ХС 3635 между собой не различались (рис.4). При изучении состояния защитного слизистого барьера в желудке на фоне профилактического введения ХС 3635 достоверных данных о нормализации слизеобразо-вания также получено не было, хотя можно говорить о некоторой тенденции к нормализации слизистого барьера (рис. 5).

Площадь 2 защиты,%

1,

О,

контроль профилактика лечение

I Шжелудок Ч2-парстная кишка I

Рис.5. Состояние слизистого барьера гастродуоденальной зоны у мышей при НПВП-гастродуоденопатии и коррекции фамотидином (0,125 мг/кг) и ХС3635 (4,3 мг/кг) в профилактическом и лечебном режимах введения.

При уменьшении дозы ХС 3635 до 0,43 мг/кг и замене режима введения вещества на "лечебный" выраженность протекторного действия вещества заметно уменьшалась, что свидетельствует о дозозависимости его действия.

В слизистой оболочке 12-перстной кишки наиболее типичным ответом на введение животным диклофенак-натрия были многочисленные эрозии. Язвенные дефекты отсутствовали. В связи с этим все оцениваемые показатели, характеризующие процессы язвообразования («тяжесть поражения», «множественность поражения»), были равны нулю.

При гистологическом исследовании выявлены общие черты НПВП-индуцированных дуоденопатий, характеризующиеся множественными повреждениями ворсинок. В большинстве препаратов отмечались выраженная лейкоцитарная инфильтрация и сильный отёк собственной пластинки с нарушением их целостности. Отек нередко распространялся до подслизистой основы. Окраска микропрепаратов альциановым синим выявила значительное уменьшение количества слизи на поверхности слизистой оболочки, а также значительное снижение числа активных бокаловидных 1шеток (рис. 5).

ХС 3635 при НПВП-индуцированных дуоденопатиях по своей эффективности превосходило фамотидин (табл. 3). У животных, получавших терапию исследуемым соединением, в отличие от мышей, получавших фамотидин, при-

знаков эрозивно-язвенного поражения выявлено не было. Все количественные показатели, характеризующие состояние слизистой оболочки, были равны нулю. При изменении режима введения изучаемого соединения, а также при использовании десятикратно меньшей дозы, эффективность ХС 3635 сохранялась на высоком уровне.

При микроскопическом исследовании слизистой оболочки 12-перстной кишки животных опытной группы эпителиальный покров ворсинок, строение собственной и мышечной пластинок не имели выраженных признаков повреждения. Встречающиеся участки отёка в собственной пластинке были относительно небольшими, выраженность лейкоцитарной инфильтрации варьировала, но её очаги преимущественно были невелики.

Состояние слизистого барьера у животных, получавших ХС 3635, было почти идентичным его состоянию у животных фуппы интактного контроля. При этом эффект исследуемого вещества не уступал эффекту препарата сравнения и проявлялся не только в профилактическом, но и в лечебном режиме введения.

Спирто-преднизолоновая модель язвообразования характеризовалась формированием дефектов слизистой оболочки лишь в желудке. Степень повреждения была умеренной. При проведении макроморфометрии на поверхности органа обнаруживались лишь эрозивные дефекты. Производное фенилфосфорилуксус-ной кислоты ни в одной из изученных дозировок в условиях данной экспериментальной модели статистически значимого протекторного эффекта не оказало. Следует отметить только то, что более высокая доза продемонстрировала тенденцию к более значительному гастропротекторному эффекту.

Таким образом, неблагоприятные факторы внешней среды (хронический стресс, нестероидные противовоспалительные средства, спирт и глюкокорти-коиды) в различной степени нарушают структурно-функциональную организацию слизистых оболочек желудка и 12-перстной кишки. Трифторуксуснокислая соль 4-диметиламинофенил-2-хлорэтокси-фосфорилацетилгидразида (видимо, подобно ближайшим структурным аналогам), обладающая вегетотропными и антиоксидантными свойствами (Семина И.И., 2000; Семина И.И. с соавт., 2002; Балашов В.П. с соавт., 2007), обеспечивает механизмы цитопротективного действия в гастродуоденальной зоне на моделях субхронического (НПВП-индуцированного) и хронического (стресс-индуцированного) повреждения. При остром повреждении (спирто-преднизолоновая модель) исследуемое вещество оказалось неэффективным. В условиях стрессового и НПВП-индуцированнЬго повреждения слизистых желудка и 12-перстной кишки гастродуоденопротек-торное действие изучаемого вещества было сопоставимо, а иногда даже превосходило эффект Нг-блокатора фамотидина.

ВЫВОДЫ

1. Иммобилизационный стресс у мышей способствует развитию эрозивно-язвенных повреждений в слизистой оболочке фундального отдела желудка. Повреждается эпителий желудочных ямок, снижается интенсивность слизеобразования. Развивается отек и лейкоцитарная инфильтрация

собственной пластинки слизистой. В фундальных железах желудка происходит гипертрофия париетальных клеток.

2. В условиях стресса в слизистой оболочке двенадцатиперстной кишки чаще встречаются эрозивные дефекты при практически полном отсутствии язвенных дефектов. Наиболее значимыми структурными изменениями при этом являются: разрушение отдельных ворсинок вследствие отека собственной пластинки слизистой, повреждение покровного эпителия и снижение слизеобразующей активности бокаловидных клеток.

3. На модели НПВП-повреждения морфологические изменения слизистой оболочки желудка и двенадцатиперстной кишки в целом были подобны изменениям при стресс-индуцированном повреждении, однако париетальные клетки фундальных желез не реагировали гипертрофией, а снижение интенсивности слезеобразования шеечными мукоцитами и эпителиоциггами желудка имело лишь характер выраженной тенденции.

4. При действии спирто-преднизолоновой смеси у животных развиваются повреждения эрозивного характера лишь в слизистой оболочке желудка, при этом отмечается наименьшая тяжесть поражения по сравнению с другими моделями гастропатии. • . : п •

5. Соединение 3635 проявляет заметные протекторные свойства на моделях хронических, субхронических и острых гастропатий в диапазоне доз 10"5 -110~б моль/кг как в профилактическом, так и в лечебном режимах введения; Вещество уменьшает степень отека собственной пластинки слизистой оболочки и ее лейкоцитарную инфильтрацию и способствует сохранению целостности эпителия при стрессорном и НПВП-индуцированном повреждении. В условиях стресса эффект соединения проявляется нормализацией слизеобразующей активности шеечных мукоцитов и покровных эпителиоцитов желудка, а также снижением степени гипертрофии париетальных клеток фундальных желез.

6. Соединение 3635 эффективно предупреждает эрозивные повреждения слизистой оболочки двенадцатиперстной кишки. На модели НПВП-гастропатии эффект соединения зависит от дозы, тогда как при стресс-индуцированной гастропатии дозы 10"5 и 10"6 моль/кг были изоэффекгивны. Исследуемое вещество нормализует секреторную активность бокаловидных клеток, нарушенную введением нестероидного противовоспалительного Средства.

7. При остром повреждении слизистой оболочки желудка спирто-преднизолоновой смесью ХС 3635 не оказывает гастропротекторных свойств ни в одной из изученных доз (105 - 10"6 моль/кг).

Практические рекомендации

Изучаемое производное трифторуксусной кислоты проявило достаточно выраженные гастродуоденопротекторные свойства, что является основа-

нием для дальнейшего детального изучения механизма его действия на структуру и функцию других органов желудочно-кишечного тракта.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Балашова Г.В. Фармакологические способы антистрессорной защиты больных в периоперационном периоде / Г.В. Балашова, Т.И. Французо-ва, A.A. Литюшкина, С.И. Чистяков // Тез.докл. II Беломорского симпозиума. Всероссийск.конфер. с международн. участием. - Архангельск.-2007.-С. 191.

2. Балашова Г.В. Стресс-индуцированная патология: возможности фармакологической коррекции морфофункциональных нарушений / A.A. Литюшкина, Г.В. Балашова, A.A. Литюшкина, Т.И. Французова, С.И. Чистяков // Вестник интенсивной терапии. - 2007. - №6. - С.15.

3. Литюшкина A.A. Фармакопрофилактика гастродуоденальных кровотечений / A.A. Литюшкина, Г.В. Балашова, Р.И. Тарасова, В.П. Балашов, С.И. Чистяков // Тез. докл. II Беломорского симпозиума. Всерос-сийск.конфер. с международн. участием. - Архангельск. - 2007. -С.201.

4. Литюшкина A.A. Новые подходы к терапии острых стресс- и НПВП-индуцированных гастродуоденопатий / A.A. Литюшкина, Г.В. Балашова, Р.И. Тарасова, В.П. Балашов, С.И. Чистяков // Тез. докл. II Беломорского симпозиума. Всероссийск.конф. с международн. участием. - Архангельск. - 2007. - С.201.

5. Литюшкина A.A. Морфологическая картина слизистой желудка и 12-перстной кишки при медикаментозной коррекции гастродуоденопатий различного генеза / A.A. Литюшкина, Г.В. Балашова, Р.И. Тарасова, В.П. Балашов, С.И. Чистяков // Тез.докл.VII съезда научного общества гастроэнтерологов России. Экспериментальная и клиническая гастроэнтерология (приложение). - М.: Анахарсис. - 2007. - С. 84-85.

6. Литюшкина A.A. Метод коррекции стресс-индуцированных гастродуоденопатий / A.A. Литюшкина, В.П. Балашов, Р.И. Тарасова, Г.В. Балашова, С.И. Чистяков // Тез.докл XII Российского национального конгресса «Человек и лекарство». - Москва. - 2007. - С.841.

7. Литюшкина A.A. Экспериментальная коррекция гастродуоденопатий /A.A. Литюшкина, С.И. Чистяков, В.П. Балашов, М.И. Альмяшева, Г.П. Кулькова, Р.И. Тарасова, Ф.Р. Ахмеров, М.В. Кормачев, Г.С. Габдул-хаева, A.B. Панов, Ю.Л. Симунов, В.Г. Беляков, Д.А. Швец, Д.Ш. Ка-шаева // Казанский медицинский журнал. - 2007. - Том 88. - №4 (приложение). - С.71-72.

8. В.П. Балашов Морфология слизистой оболочки желудка мышей при стрессе и терапии производным фосфорилуксусной кислоты / В.П. Балашов, A.A. Литюшкина, С.И. Чистяков, М.И. Альмяшева, Г.В. Балашова, В.Н. Абрамов // Морфологические ведомости. -2008.-№1-2.- С.16-19.

9. Литюшкина A.A. Морфология слизистой оболочки желудка мышей при экспериментальной патологии и терапии / A.A. Литюшкина, Г.В. Балашова, В.П. Балашов, С.И. Чистяков, Р.И. Тарасова, В Д. Абрамов, И.С. Акимова // Морфология. - 2008. - №4. - С.78.

10. В.П.Балашов Стресс-протекторные свойства производных фосфори-луксусной кислоты / В.П. Балашов, A.A. Литюшкина, М.И. Альмяшева, Н.П. Шиханов, И.В. Гунькин, A.B. Балашов // Фармакология и токсикология фосфорорганических соединений и других биологически ак-

, тивных веществ. Материалы Российской конф., посвящённой 75-летию профессора И.А. Студенцовой. - Казань. - 2008. - Выпуск 4. - С.15.

11. Литюшкина A.A. Морфологические и фармакологические аспекты консервативной терапии гастропатий / A.A. Литюшкина // Материалы

г , Y Всероссийской научной конференции общих хирургов объединённой с пленумом проблемных комиссий РАМН «Неотложная хирургия» и «Инфекция в хирургии» межведомственного научного совета по хирургии. - Москва - Ростов-на-Дону. - 2008. - С.19-20.

12. Т.Н. Французова Перспективы антистрессорной защиты организма / Т.И. Французова, A.A. Литюшкина, С.И. Чистяков, В.П. Балашов // Материалы II Межрегиональной научной конференции «Актуальные проблемы медицинской науки и образования». - Пенза. - 2009. - С.259-260.

13. Литюшкина A.A. Новые варианты лечения НПВП-индуцированных гастропатий / A.A. Литюшкина, В.П. Балашов, С.И. Чистяков И Материалы II Межрегиональной научной конференции «Актуальные проблемы медицинской науки и образования». - Пенза. - 2009. - С.145-146.

14. Балашов В-Ц. Анализ морфофуикциональных аспектов адаптации органов и тканей белых мышей при хроническом стрессе / В.П. Балашов, М.Ц. Альмяшева, A.B. Балашов, И.В. Гунькин, A.A. Литюшкина, Л.В, Ванькова, Е.В. Блинова // Морфология. - 2009. -Т.136. -№4. - С.11.

Подписано в печать 28.10.09 г. Бумага офсетная. Формат 60x84 1/16. Гарнитура Тайме. Печать способом ризографии. Усл. печ. л. 1,34. Уч.- изд. л. 1,67. Тираж 100 экз. Заказ № 194.

Отпечатано с оригинала-макета заказчика в ООО «Референт» 430000, г. Саранск, пр. Ленина, 21. тел. (8342) 48-25-33