Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

МОРФОЛОГИЧЕСКИ АТИПИЧНЫЕ ФОРМЫ КЛУБЕНЬКОВЫХ БАКТЕРИЙ

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "МОРФОЛОГИЧЕСКИ АТИПИЧНЫЕ ФОРМЫ КЛУБЕНЬКОВЫХ БАКТЕРИЙ"

МИНИСТЕРСТВО СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА СССР

МОСКОВСКАЯ ОРДЕНА ЛЕНИНА И ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННАЯ АКАДЕМИЯ имени К, А. ТИМИРЯЗЕВА

На правах рукописи

ИГНАТОВА Ирина Юрьевна

МОРФОЛОГИЧЕСКИ АТИПИЧНЫЕ ФОРМЫ КЛУБЕНЬКОВЫХ БАКТЕРИЙ

Специальность 03.00.07 — микробиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

МОСКВА — Ш2

ч

Работа выполнена в Моекобской сельскохозяйствениол академик им. К. А. Тимирязева.

Научный руководитель — доктор биологических наук, профессор В. К. Шнльникова.

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор А. А, Авакян, кандидат биологических наук Б. И. Голод.

Ведущее учреждение — Всесоюзный научно-исследователь-скиЯ институт сельскохозяйственной микробиологии.

Зашита диссертации состоится « » . ЬС**?^^*^'. .

1982 г. в с /3. » час. на заседании Специализированного совета К-120.35.06 в Московской сельскохозяйственной академии им. К. А. Тимирязева (127550, Москва, Тимирязевская ул., 52, корп. 9).

Автореферат разослан « . , . 1982 г.

С диссертацией можно ознакомиться в ЦНБ ТСХА.

Ученый секретарь

Специализированного совета — кандидат биологических наук доцент

В. Г. Марьей ко

Актуальность проблемы. Большие резервы в обеспечении почвы азотом сосредоточены в биологической фиксации атмосферного азота, в частности сим биотической, осуществляемой клубеньковыми бактериями в симбиозе с бобовыми растения* ми (Мишустин, Шильннкова, 1973; Мишустин, 1979). Полноценное использование ризобнй зависит от понимания их взаимоотношений'с бобовыми растениями, умения управлять процессом жизнедеятельности симбионтов в естественных условиях и при производственном культивировании (Доросинскнй, 1970).

Клубеньковые бактерии характеризуются сложным циклом онтогенеза {Израильский с соавт,, 1933; Jordan, 1962). Знание этого цикла может облегчить управление их жизнедеятельностью. На полиморфизм ризобий безусловно влияет двойственный характер их существования в природе — сапро-фитизм в отсутствии растения-хозяина н снмбпотрофнзм при его наличии. Кроме того, в почве и ткаин растення-хозянпа могут создаваться условия, требующие приспособительных потенций микроорганизмов. Это п колебания температуры, и воздействие продуктов метаболизма растений н почвенных микроорганизмов, и различных препаратов химической промышленности, все шире применяющихся в сельском хозяйстве.

Являясь неспоро образующими, клубеньковые бактерии тем не менее выживают в условиях почвы, сохраняя жизнеспособность. В связи с этим можно предположить, что оии должны иметь в онтогенезе формы, устойчнвые'к факторам воздействия внешней среды. Такой способностью к псрснстенции обладают Л-формы бактерий, которые можно рассматривать как одну из форм сохранения вида в природе (Тимаков, Каган, 1973; Прозоровский с соавт., 1981).

Несмотря на упоминание отдельными авторами (Cabezas de Herrera, 1956; Яковлева, 1975) возможности существования Л-форм в цикле развития рнзобнй, в литературе отсутствуют сведения о наличии у них процесса Л-трансформацин, не разработаны приемы получения Л-форм н не известны их свойства. Изучение процесса Л-трансформании у клубеньковых бактерий представляет интерес не только в плане познания

Цзпт?, Kijrn б^'.Г'т'"'^ " !. f 1. f •• •■> i • . i

онтогенеза. Получение in vitro морфологически атипичных форм, характерных для отдельных этапов процесса Л-транс-формацин, может пролить свет на природу устойчивости рп-зобнй к неблагоприятным условиям почвы, служить основанием рекомендаций приготовления эффективных бактерпаль-ных препаратов.

Разработка способов получения морфологически атипичных форм может позволить решать вопросы практического значения, например, такие, как уточнение способности к азот-фнксацнн искусственно полученных бактерондних форм, или такие, как выяснение устойчивости рнзобий к фагам, которые, как известно, являются неблагоприятным фактором ири производстве нитрагина.

Цель и задачи исследований. Цель работы — установление способности клубеньковых бактерий к процессу Л-траисфор-машш под действием Л-трансформирующих агентов в условиях in vitro.

Для выполнения работы были поставлены следующие задачи: ■*

1. Изучение влияния Л-трансформнрующих агентов на pit-зобни и разработка способов получения морфологически атипичных форм, представляющих отдельные этапы процесса Л-трансформацнн.

2. Изучение культуральных, морфологических н анатомических свойств полученных in vitro морфологически атипичных форм рнзобий и сравнение их с исходными культурами.

3. Анализ способности к стабилизации п реверсии морфологически атипичных форм клубеньковых бактерий в условиях чистых культур п при пассировании через растение-хозяина.

Научная новизна. Впервые в лабораторных условиях иод действием Л-трансформирующих агентов получены различные морфологически атипичные формы рнзобий гороха, люцерны, люпина. Установлено, что эти формы представляют собой отдельные этапы процесса Л-трансформации. Разработаны способы получения морфологически атипичных форм рнзобий. С помощью методов фазово-контрастной, электронной трансмиссионной it сканирующей микроскопии изучен характер влияния различных Л-трансформирующнх агентов и условий культивирования на культуральные, морфолого-анатомиче-ские н физиологические свойства рнзобий. Отмечено, что все искусственно полученные формы отдельных этапов процесса Л-трансформацнн клубеньковых бактерий являются жизнеспособными вариантами, имеющими сходство с формами, существующими в природе. Изучен процесс инфицирования растений люцерны различными морфологически атипичными формами гомологичных рнзобий. Проведено сравнение виру-

лентных свойств морфологически атипичных форм и интакт-ных клеток ризобий люцерны. Рассмотрена способность к стабилизации н реверсии морфологически атипичных форм ризобий гороха, люцерны, люпина.

Практическая ценность. Полученные результаты позволяют рассматривать явление Л-трансформации как процесс сохранения вида в природе, присущий не только патогенным, но и сапрофитным микроорганизмам в неблагоприятных условиях в почве. Разработанные способы получения морфологически атипичных форм клубеньковых бактерий гороха, люцерны, люпина рекомендуется использовать при изучении их онтогенеза в чистой культуре и почве. Поскольку морфологически атипичные формы ризобий, частично или полностью утратившие клеточную стенку, сохраняют вирулентность, не исключена возможность использования подобных форм при производственном культивировании в процессе приготовления бактериальных препаратов'.

Апробация работы. Основные материалы диссертации доложены на научных конференциях молодых ученых ВНИИ риса г. Краснодар (10—11 марта 1981 г.) и ТСХЛ (9—11 нюня 1981 г.), а также на совместном заседании кафедр микробиологии и агрохимии (27 октября 1981 г.).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 3 статьи.

Объем работы. Диссертация состоит из 145 страниц машинописного текста, 13 таблиц, 23 рисунков. Список литературы содержит 407 наименований, в том числе 236 зарубежных авторов.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИИ

Использовали эффективные (эф.) и неэффективные (неэф.) штаммы клубеньковых бактерий коллекции культур ВНИИ сельскохозяйственной микробиологии (г. Пушкин Ленинградской обл.): Rhizobium leguminosarum — штаммы 245а эф. и 224 6 неэф., Rh. meliloti — штаммы 34 эф., 441 эф. и L5-30 эф., Rh. lupini — штаммы 359 а эф. и 400 неэф. Штаммы быстрорастущих культур выращивали и хранили на бобовом агаре, медленнорастущих — на среде Н. М. Лазаревой (1953).

Неблагоприятные условия культивирования, вызывающие гетероморфный рост бактерии (Пешков, 1954), создавали на среде Исварана (Iswaran et al„ 1973) it Кларка и Мальфа (Clark, Maalfe, 1967) путем снижения парциального давления кислорода, изменением температуры культивирования п истощением среды. Определение оптимальных для Л-транс-формации ризобий условий культивирования осуществляли на среде Исварана (1,3% агара) с добавлением нормальной лошадиной сыворотки в дозе 4% и NaC! в дозе 2,5%. В ка. 3

честве Л-индукторов использовали пенициллин в концентрациях 100, ISO, 200, 250, 500 и 1000 Ед/мл и антибиотики, встречающиеся в почве (неомицин, стрептомицин, мономицин, тетрациклин, пенициллин, левомнцетнн, эритромицин), а также глицин в широком диапазоне концентраипft от 4% до 0,01%.

Формы несбалансированного роста получали путем длп-,тельного'(в течение 1 мес.) культивирования на среде Исва-рана с добавлением глицина в дозе 0,1% и градиента концентраций этой аминокислоты (0—0,3%). Для получения сферо-пластоподобных форм использовали методы Вейса (Weiss, 1976) в модификации О. В, Филатовой (1980), Кона (Kohn, 1960) и Мейера (Meyer et al., 1961) в модификации С. Я. Дн-тяткнна (1965) с последующим высевом на среду Кларка и Мальфа (0,6% агара) с градиентами концентраций пенициллина'(0—100 Ед/мл), глнцина (0—03 %), лпзоцнма (0— 100 мкг/мл), NaCl (0—0,5%) и сыворотки (0—10%). Незавершенные Л-формы получали на среде Исварана с добавлением глицина в дозе 0,1% и сменой температур культивирования (первые две недели при 28®, две последующие — при 4°С). Зернистые формы получали путем пассирования в жидкой среде Кларка и Мальфа с добавлением последовательно возрастающих концентраций глицина (от 0,05 до 1,0%), как на фоне сыворотки (10%) п NaCl (0,5%),таки без них. Фильтрующиеся формы получали фильтрацией суспензии культур через бактериальные фильтры (поры 0,3 мкм).

Вирулентность морфологических вариантов ризобий люцерны (штамм 441) определяли в стерильном лабораторном опыте с растениями люцерны Medicado sativa. Стерилизацию осуществляли по Натману (Nutman>1949). Проростки иноку-лировали из расчета 20—30 тыс. клеток ризобий (определено методом посева) на одно растение (Калниньш с соавт,, 1973). Опыт (5-кратная повторность) проводили на среде С. Л. Ков-ровцевой (1933) под ксеноновымн лампами при длине светового дня 16 час на кафедре микробиологии ТСХЛ. О вирулентности исследуемых форм судили по сроку появления и количеству специфически искривленных корневых волосков и образовавшихся клубеньков.

Определение азотфнксирующей активности морфологически атипичных форм клубеньковых бактерий люцерны (штамм L5-30) осуществляли ацетиленовым методом (Калининская с соавт. 1973).

Культуральные и морфологические признаки ризобий на разных этапах Л-трансформации исследовали с помощью фа-зово-контрастной микроскопии. Изучен не структурной организации осуществляли путем приготовления и просмотра препаратов целых клеток (Бирюзова с соавт., 1963) и ультратон-

кнх срезов (Константинова с соавт., 1975) морфологически атипичных форм рнзобин с помощью электронного микроскопа JEM-100B при инструментальном увеличении .30000. Наблюдения за поверхностью и формой клеток проводили методом сканирующей электронной микроскопии на микроскопе «Jeol (JSA1-50 А)» н «Hitachi».

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Разработка способов получения морфологически- атипичных форм клубеньковых бактерий под влиянием JI-трансформирующих факторов ■

Основой предположения возможности процесса Л-транс-форманин у рнзобин в природных условиях под действием Л-трансформирующих агентов, присутствующих в почве, послужило наличие в цикле их развития форм разнообразных размеров к конфигурации. Поскольку вероятность присутст-гшн в почве пенициллина как метаболита почвенных микроорганизмов не вызывает сомнений, и кроме того, известен универсальный Л-'трансформирующнн эффект этого антибиотика, была предпринята попытка получения in vitro Л-вариантов рнзобнй под действием пенициллина в различных концентрациях, Обнаружено (табл. 1), что пенициллин не вызывал

Таблица

Влияние пенициллина на образование форм несбалансированного роста (HP) у клубеньковых бактерий

Штамм

Концентрация пешшпллпна (Ел/мл)

О I 1001 150 200 1 250 500 I ] ООО

Rhizobium Icfiuminosa-

nim. 215 а Rhizobium kguminosa-

cum, 221 С.....

Riitzobittm mcHloti, 441 Rhizobium meliloti, 31 . Rliizoblttm lupini, ЗГ)9а . Rhizobium lupini, 400 . .

Б ■ Б Б Б . Б __ г

Б Б Б Б Б, HP __ _

Б Б Б Б Б, HP .— *

D Г» Б Б Б, HP —

Б Б Б Б. HP — —

Б HP '-

— отсутствие роста; Б — рост неизмененных бактериальных форм.

Л-трансформирующего' эффекта у рнзобий. Было отмечено лишь незначительное изменение морфологии отдельных клеток популяции у всех культур, за исключением ризобнй гороха, штамм 215а. Эти изменения выражались в образовании разбухших, удлиненных, иногда искривленных клеток (фор-ми несбалансированного роста) на фоне неизмененных палочковидных. Исследуемые штаммы характеризовались ннднви-

дуальной чувствительностью к различным концентрациям пенициллина.

Неспособность ризобий к Л-трансформашш под действием пенициллина можно объяснить их экологической приспособленностью к данному антибиотику. Это совпадает с мнением исследователей (Sen, Nandt, 1961), отмечающих высокую устойчивость ризобий к пенициллину.

Характер влияния пеомицииа, стрептомицина, моиомиии-на, тетрациклина, пенициллина и эритромицина, известных своим возможным Л-трансформирующнм действием в отношении патогенных микроорганизмов, а также присутствием в почве и вероятным влиянием на метаболизм ризобий (Schre-ven, 1964; Schwinghamer, 1968) представлен в табл. 2. Куль-туральные и морфологические свойства культур изучены на границе и пне зон бактериостатнческого действия антибиотиков. Наибольшие изменения этих признаков были отмечены у ризобий гороха (штамм 245а) и люцерны (штамм 441) на среде со с^ептомииином, мономнцнном н тетрациклином. Из результатов табл. 2 видно, что в вариантах, где исследуемый

Таблица 2

Влияние антибиотиков на образование форм несбалансированного роста (HP) у ризобий на среде И свара на с сывороткой

Штамм ¿ 3 SI Э i с s о — £■3 u S ¿ = S § Í s S s e? y — С a * Г* О о «а О = <=: - о _ о. а M — с я с. s m г

Rhizobium Icgurmnosa-

rum, 245 а..... Б, HP HP HP HP Б Б Б, HP

Rhizobium leguminosa-

rum. 221 fi ... . . Б, HP Б, HP Б, HP Б, HP В Б б; HP

Rhizobium meliloti, 441 G, HP HP HP HP Б Б, HP б

Rhizobium meliloti,'34 Б, HP Б, HP Б, HP Б, HP Б Б Б, HP

Rhizobtum lupini, 359 a . Б, HP Б Б, HP Б Б Б Б, HP

Rhizobium lupini, 400 . . Б, HP Б Б.НР Б, HP Б, HP Б, HP Б.НР

Б — рост неизмененных бактериальных форм.

штамм был не чувствителен к антибиотику, культура характеризовалась неизмененным ростом. В вариантах, где отмечалась чувствительность, в зоне ингнбнровання популяции на фоне неизмененных форм встречалось значительное количество форм несбалансированного роста. В вариантах с наибольшими изменениями морфологических свойств практически вся популяция была представлена формами несбалансированного роста. Эффект добавления к среде солевого стабилизатора на фоне антибиотиков и сыворотки был изучен толь-С-

ко у штаммов, где ранее были выявлены наибольшие изменения в характере роста культуры.

При добавлении к.среде NaCl в дозе 2,5% ризобии гороха ' утрачивали способность развиваться, а люцерны — подвергались сильному, вплоть до полного, угнетению. Таким образом, действие антибиотиков порознь, а также при комбинировании с сывороткой п стабилизатором не вызывало у ризобий характерного для многих патогенных микроорганизмов процесса. Л-трансформации.

Известен Л-трансформирующий эффект глицина (Прозоровский с соавт., Для рнзобий эта аминокислота может служить Л-тр^^>орматором в природных условиях, так как она содержнЛД\ клеточном соке бобовых растений (Асеева с соавт., Кретович с соавт., 1970) и накапливается с ризосфере (Мнльто с соавт., 1975, 1976). При изучении Л-трансформирующей способности глнцина в отношении ризобий в условиях in vitro, было установлено, что высокое (4, 2, 1 н 0,5%) его содержание в среде полностью ингибиро-вало рост всех штаммов, что согласуется с данными некоторых авторов (Skinner et al„ 1977). Длительное пассирование ризобий на среде с низкими (0,05 и 0,01%) концентрациями глицина вызывало незначительные изменения в характере их роста: уменьшалось слизеобразование, исчезала четко очерченная граница колонии со средой. При мнкроскопнрованни клеток из колоний обнаружены формы несбалансированного роста на фоне неизмененных палочковидных. Оптимальной для Л-трансформации оказалась концентрация глнцина 0,1%. Сильнее на присутствие глицина реагировали 245а, 441, ■L5—30 и 400 штаммы. Это выражалось в появлении колоний с унлогненпым, но не врастающим в агар центром. В них практически отсутствовали неизмененные клетки. Отмечалось значительное количество* форм несбалансированного роста. На электроннограммах ви'диы клетки с частично нарушенной клеточной стенкой. Нарушение структуры пептндогликаиа привело к отслоению наружной мембраны от цитоплазматнче-екой н расширению пернплазматического пространства (Кац, 1У80). Нуклеоид занимает" значительную часть клетки. Происходит «выброс мембранных структур». Встречаются элементарные тела. Все эти изменения присущи начальному этапу цикла Л-трансформации (Прозоровский с соавт., 1981). Об изменении морфологии клеток исследуемых культур под действием глнцина свидетельствуют н результаты сканирующей микроскопии; выявлены клетки разной формы и размеров, а также процесс почкования, характерный для цикла Л-транс-формаипн {Кац с соавт., 1977). Итак, под действием глицина получены формы несбалансированного роста, свойственные начальному этапу процесса Л-трансформации. При действии

низких (4*С) температур на ризобнн в присутствии глицина появились структуры, характерные для процесса незавершенной Л-трансформации (подтверждено результатами фазово-ионтрастной, сканирующей н • трансмиссионной электронной микроскопии). Особенно глубокие изменения морфологии'наблюдались у ризобнн люпина и люцерны. В микроколониях практически отсутствовали палочковидные формы. Основная' масса популяции была представлена клетками овоидной формы с неодинаковой оптической плотностью, что свидетельствовало о разной степени лизиса клеточных стенок. На элек-троннограммах выявлены клетки, характерные для процесса незавершенной Л-трансформацнн: клетоа^я стенка лизнро-вана, нуклеоид разрыхлен, периплазм а у "ское пространство увеличено, происходит «выброс» большого количества мембранных структур и образование элементарных тел. За счет утраты ригидного компонента клеточной стенки клетки нередко приобретают причудливую форму.

Известен Л-трансформирующий эффект при комбинировании Л-трансформаторов, например, лнзоцима, пенициллина и глицина ( МасЫГ е1 а!., 1967). Используемые варианты сред культивирования представлены в табл. Все штаммы прак-

Тэ-блица 3.

Варианты комбинировании Л-трансформирующих агентов

варианта Осшшкая среда Псварана Факторы Л-трапа юрммпш

глншш, % ПСШ111НЛЛН11. ЕдУмл лпзиинм. м кг/мл

0,1 0.2 200 1 БОЛ 1000 1 1 10 100

1 +

2 ■ + + — + — — — —

3 + — — + — — — —

4 + т ■—* — -г — —'

5 + — + — —- —

0 + — + — + — — — —

7 + — + — — + — — —

• 8 + -I" — + —, — + — —

и + + — + — — — + —

10 + + — + --. — — — +

и + + — — + — + — —

12 + + — — + — — + —

13 + + — — + — — — +

14 + + — — - + + — —

15 + — + + — + — —

-I--наличие компонента в среде;--отсутствие компонента в среде.

тнческн одинаково реагировали на действие Л-нидукторов, поэтому в качестве примера опишем характер их влияния на ризобин люцерны. Из данных табл. 3 и 4 видно, что при комбинированном действии Л-трансформаторов изменялась

Т а б л и ц а 4

Влияние комбинирования факторов Л-трансформации на клубеньковые бактерии люцерны, штамм L5-30

Вариант питательной срсдц

Наличие Форма роста клеток

Вариант питательной среды

Наличие Форма роста клеток

1

+ + +

Б

HP HP

о 10 м 13

13

14 13

+ +

+ +

HP

HP

4

5 ++HP

- "гА —

а + | hp

--отсутствие роста культуры; + —пеннгнбнрозашшй рост;

+ 4--рист культуры сильно ннгнбнрован; Б —рост неизмененных

бактериальных форм; IIP — несбалансированный рост.

морфология клеток {варианты 2, 3, 5, 8, 9, 11), что выражалось и появлении форм несбалансированного роста. Воздействие высоких доз Л-трансформаторов вызывало угнетение роста популяции вплоть до полного. Результаты фазово-конт-растнои, электронной просвечивающей п сканирующей микроскопии подтвердили наличие-форм несбалансированного роста в вариантах с невысокими дозами Л-трансформаторов,

Образование сферо- и протопластов может предшествовать процессу Л-трансформаннн (Федорова, 1965; Прозоровский, 1970). Из данных табл. 5 видно, что пенициллин, как н лнзо-ци.м не оказывает дополнительного Л-трансформирующего эффекта на сферопласты ризобий. Наибольшие изменения отмечены в вариантах с введением в среду глннппа. Добавление NaCl (0—0,5%) не вызывало изменений в характере роста культур. Это согласуется с данными о том, что для культивирования многих грамотрннательных бактерий солевой стабилизатор не обязателен (Тпмаков, Каган, 1У61). Во всех вариантах с внесением сыворотки ннгнбнрующнй эффект Л-трансформаторов снижался, что способствовало созданию благоприятных условий для реверсии, Совместное действие лнзоцима и глицина вызывало появление зернистых форм (элементарных тел) на фоне форм несбалансированного роста. Появление структур зернистого характера подтверждает Л-трансформирующий эффект комплексного воздействия лнзоцима и глицина.

Зернистые формы являются характерным элементом Л-культуры (Кац с соавт., 1981). Для их получения был проведен эксперимент с ризобпямн люцерны, штамм L5-30, Л-трансформируюший эффект глицина наблюдали уже в пер-,

Таблица 5

Влияние Л-трансформируюшик агентов в градиенте концентраций па сферопласты клубеньковых бактерий,

культивируемые на среде Кларка и Мальфа

Варианты Псслсдуемая культура

К 1ь теШоН штамм 1,5-30 Шь 1ир1п! штамм 400 Ш]. кйшшпозагит штамм 245 а М. теШои штамм 411

характер ИЯГПбИ- роваипя формы роста характер нпгибл-ровапия форми роста характер ннгнбн-рования форми роста характер иншбн-ровапня форми роста

Пенициллин ......... Г>, НР ++ С. НР Б, НР Б, НР

Пеннинллин+глшшн ' + С. НР С, НР С, НР + + С, НР

Пеншшллни+глнцнн+лнзоинм . . + + С, НР, 3 + + С, НР, 3 ++ С, НР, 3 + + С, НР, 3

Г1 спи ни л л ни+ гл и аи и ■+ли з о ни м+ С, НР, 3

+МяС1...... . . . , + + С, НР, 3 + + С, НР, 3 + + С, НР + +

НшЛИЛЛИП-Ь ГЛИЦИН-ГЛ1Г30Ц1Ш +

■ +КаС1+НЛС ....... + С, НР + С. НР + + С. НР.-З + С, НР, 3

' Глицин* . . ......... ' с + + с + + ' С, НР + + С

' Глншш+лизоинч....... + + 3 • + + С, 3 ++ 'ВС. 3 + + 3

Глицин+лазошш+КаС! . . . . + + 3,'С + + с з + + Щщг С.Н. 11Р + + С, 3

Гл нцнп+л н юцнм+N а С1+11Л С + С, НР + С, НР + + С, 3, НР

Лнзоинм .......... + С, НР + С, НР + С; НР + С, НР

Лизоиим-г^аС!....... С. НР + С, НР + С, НР + С, НР

Л«}оиим+КаС1+ПЛС..... + НР + ИР + С, НР + С. ИР

11ЛС— нормальная лошадиная сыворотка; — —отсутствие ннгибировання рост?; -|—незначительное ингибл-роваиие; +Н—сильное шнибированнс; Ь —рост неизменённых бактериальных форм; 11Р — несбалансированный рост; С —рост сферопласюподобних форм; 3 —рост зериисшх структур.

Таблица С

Способность зернистых форм клубеньковых бактерий люцерны (штамм 15*30) проникать через бактериальные фильтры (пори 0,3 мш)

Высев досле фильтрации Модификация среды Кларка и Мальфа Время появления первых колоний (сутки) Форма (роста культуры

с основного пассажа на среду повтори ость опыта

•1 2 3 4 5 1 I 1 2 3 4 5

С фактором Л-трансфорчашш 0,1% глицина (1,3% агара) 5 0 0 _ ,1 lA з 3 _ 3

Без фактора Л-трзнсформашш Без тлицина (¡,3% агара) 5 С 6 7 •1 3,НР 3 3 3 3

3 — аруьтуры крине того характера; IIP — несбалансированный рост;--отсутствие роста.

вичном пысеве, где на фоне палочковидных клеток появлялось значительное количество зернистых форм н форм несбалансированного роста. Однако уже во 2-м пассаже популяция клеток состояла пз однородных зернистых структур. Дальнейшее пассирование как с постоянными, так и возрастающими концентрациями глицина не влияло на морфологию ризобий, представленных популяцией зернистых форм. Не вызывало дополнительных изменений и введение в среду лизоцнма, сыворотки и МаС|. Такая устойчивость культуры к возрастающим концентрациям глицина и добавлению на фоне глнннна лнзоцима связана с процессом Л-транс<Ьормации, в результате которого, как известно, в десятки и Жтнн раз повышается устойчивость Л-варнантов к агентамДРь^вавшнм этот процесс (Тнмаков, Каган, 1973). При установлении способности зернистых форм проникать сквозь■ бактериальные фильтры (табл. 6) было отмечено, что исходные формы не способны к этому, в то время как зерннстые этой способностью обладают. После фильтрации темпы роста зернистых форм замедлялись как на среде с фактором Л-трансформации, так н без него. Примечательно, что процесс реверсии отсутствовал на среде без фактора Л-трансформацни. Возможность достижения этого процесса только при создании дополнительных условий, о которых будет сказано ниже, позволяет рассматривать зернистые формы как условностабнльную Л-фор-му.

Стабилизация и реверсия морфологически, атипичных форм клубеньковых бактерий

Способность бактерий длительно сохраняться и перевиваться в Л-форме без реверсии к исходному виду считается процессом стабилизации ^¡епез, 1939), а процесс восстановления бактериальных клеток в исходную форму из Л-фор-мы — реверсией (01епез, \УешЬег£ег, 1951), К формам несбалансированного роста относятся близкие к Л-варнаитам культуры, не способные длительно перевариваться, несмотря на продолжающееся воздействие Л-трансформнруюшего фактора (Прозоровский, 1970). Мам также не удалось стабилизировать формы несбалансированного роста. Уже в первых пассажах наблюдалось угнетение роста популяции. Реверсия протекала быстро и легко. Уже в 1-м (штаммы 245а, 441 и Ь5-30) пли во 2-м (штамм 400) пассажах при исключении из среды глицина все формы несбалансированного роста превращались в обычные палочковидные. Быстрота реверсии указанных , форм совпадает с последними данными по этому вопросу (Прозоровский с соавт., 1981): Не удалось стабилизировать также и формы незавершенного цикла Л-трансформации, и сфероидастоиодобпые тела. При пересеве наблюдалось угне-<12

тение популяции, а во-2-м пассаже рост практически отсутствовал, Культуры-ревертаиты были получены у незавершенных Л-форм и у сфероиластоподобных форм во 2-м пассаже. Несколько снижена способность к реверсии у сферопластопо-добных форм в вариантах с комплексным воздействием глицина и лнзоиима: ревертанты получены в 3-м пассаже. Зернистые формы ризобий способны длительно перевиваться в условиях действия фактора Л-трансформацин. Возможность же достижения процесса реверсии этих форм лишь при создании доиолннтельиых^словнй культивирования (увеличения содержания агара ;а*>ставе среды до 2%) при исключении из среды фактора А^^^чсформацнп подтверждает факт условной стабильности пол^гнных вариантов. Указанные условия способствовали появлению форм несбалансированного роста (1—2 пассаж), которые впоследствии (3-й пассаж) превращались в палочковидные формы. При изучении способности к стабилизации и реверсии фильтрующихся форм ризобий было установлено, что при высеве фильтрата на среду с 0,1% глицина рост культуры сильно ннгибнрован и во 2-м пассаже отсутствовал. Реверсия была достигнута при исключении из среды Л-трансформатора н увеличении содержания агара до 2%.

Итак, очевидно, что в условиях чистых культур все полученные морфологические варианты за исключением зернистых форм не обладали способностью к стабилизации (табл. 7). Процесс реверсии был достигнут у всех форм. Однако в

Таблица 7

Стабильность и способность к реверсии морфологически атипичных форм клубеньковых бактерий

Морфологически атипичные форм и Стабилизация Реверсия Форма репер-тзнта

Форм» несбалансированного роста _ 1—2 пассаж Б

Незавершенные Л-формм , . . , — 2 пассаж Б

Сфе рои ласт о подобные формы . . — 2—3 пассаж Б

Условностабнльнис зернистые фор- Создание дополни-

мы .......... , , + Б

тельно х усло-

вий, 2—3 пае.

саж

Н—наличие стабилизации; — —отсутствие стабилизации; Б — рост неизмеиеииих палочковидных форм.

случае с зернистыми формами для его осуществления требовалось создание дополнительных условий культивирования.

Выявление способности морфологически атипичных форм к стабилизации и реверсии при пассировании через растение-хозяина показало, что все морфологические варианты сохра-

© О

о О ■е*

■о ы

сз

С со о о р

Б №

о

— — 5 й

га о Е а

С\ Сй м

о

Ё2 сл

О ■в* о С г>

СО о

□ •V

•в Е

о ■ р

•е-

о

о £

■в-

о

^ ^ — I— (О

^ о

о«

—л о

«1 о

1Д *■> —I О!

о

оо

о о » © я Ь »о ®

О КЗ Со' Ь № Ч

ЬЭ Ц1 .и

§ 8 а 3 .8

-.1 о V о

О — --1

О! ¿"1Ч

<~> о ю — Ъо Ъ

о

£

ад

'ё ;В

О м

■(• и

в

Ъ

о> £) 1 СП - ¿я.

о ю — Ъ Ъ Ъ

О

й) тэ

о а С

ОСщес количество корневых волосков <в зоне инфицирования (15 мм)

количество

% от общего

количество

% от обшсго

2 Г}

§ §Е

I = *§" 8 ^ 2 к в; о о Э

С

г>

количество

от общего

количество

% от общего

•е-

з-ё

Е Я о Н

= кн = ^

= '■> X К

К г>

количество

,% от волосков с инфекционным п нитями

количество

,% от волосков с инфекционными нитями

О

от

5 "2 <2 «

2 и

■е-о

"в 5 я 1

Э и и -Н

2 к *

5 I

" *

? а

л

■ 7! _ ±1 ^ «в*

н *

Т ё £ Е © к

5 =

ияли вирулентность (табл. 8) и были жизнеспособны. Процесс инфицирования очевидно связан с быстрой реверсией культур в исходную форму под действием усиления корневых выделений в иернод формирования боковых корней (van Egeraat, 1972; Мншустин с соавт,, 1978). При мнкроскопированнн суспензии из только что образовавшихся клубеньков установлено, что клетки имеют выраженную палочковидную форму. Особый интерес представляет выявленная относительно большая степень вирулентности зернистых форм рнзобпй но сравнению с исходными палочковидными, если принять за критерий вирулент11,<жь н степень специфической искривленности корневых во,пЩов (однако, по сроку появления первых клубеньков все были практически равными). Очевидно, в присутствии корневых выделений «оживление» происходит быстрее. Не исключено, что эта форма обычна для условий почвы и именно через нее осуществляется реверсия в подвижные мелкие формы, которые, как считает ряд исследователей (Dart, Mercer, 1964; Мншустин, Шнльнпкова, 1973), нрнчастны к процессу инфицирования корня.

Сравнительная характеристика морфологически атипичных ' форм и исходных культур клубеньковых бактерий

При сравнении культуральных и морфологических свойств исходных культур п полученных in vitro морфологически атипичных форм рнзобпй установлено, что последние отличаются от исходных. Изменялась форма и вид колоний, замедлялся темп их роста. Все морфологические варианты рнзобпй имели дефектную клеточную стенку или не имели ее, что вызывало резкое изменение формы клеток. Сравнение данных литературы (Bergersen, Brings, 1958; Jordan, Coulter, 1965; Schwinjj-hamer, 1968; Яковлева, 1975) о бактероидах как вариантах с дефектной клеточной стенкой н сильно измененной формой с полученными нами результатами убеждает в том, что формы несбалансированного роста могут рассматриваться аналогами бактероидов. Как известно, процессу, ннфнпировапнч предшествует мельчание клеток в зоне* корня (Dart, Mercer, 1964; Мншустин, Шнльнпкова, 1973). Аналогами подобных измельченных форм, существующих в природе, могут рассматриваться зернистые формы, полученные нами in vitro. Поскольку процесс Л-трасформацни состоит из чередующихся фаз с наличием характерных для каждого этапа морфологических вариантов, можно высказать предположение, что в естественных условиях под действием природных Л-трансфор-маторов у ризобнй происходит процесс Л-трансформации.

При изучении физиологических признаков морфологически атипичных форм рнзобпй было установлено, что по сравнению с исходными культурами они имеют замедленный темп роста,

IG

нарушенный процесс-клеточного деления при сохранении способности к ядерному, своеобразие способов репродукции (неравновеликое деление, почкование). Кроме того, полученные формы обладают повышенной устойчивостью к пенициллину, глицину, лизоциму. Все эти изменения -характеризуют наличие процесса Л-трансформацнн. Изменение морфологии клеток при перенесении повышенных (37, 50° С) и пониженных (4°С) температур, по-видимому, является приспособительной реакцией культуры к неблагоприятным условиям (Пешков, 1966), поскольку при создании комплекса неблагоприятных условий (понижение температуры, с «жен не рН, истощение среды, снижение парциальиого-давлер^кислорода) возникали морфологически атипнчные форм»^'

Сравнение вирулентности и азотфнксирующей активности исходных и морфологически 'атипичных форм. показало, что последние сохраняли вирулентность и так же, как и палочковидные, не фиксировали азот в условиях чистой культуры. Вместе с тем зернистые формы проявляли некоторую азот-фнксирующую активность (осуществляли восстановление ацетилена в этилен). В трех проведенных экспериментах количество выделившегося этилена составляло соответственно 3, 4 и 11 нмоль/мг сухой биомассы.*

Выводы

1. Впервые в лабораторных условиях у клубеньковых бактерии люцерны,-гороха и люпина получены различные морфологически атипичные формы, представляющие собой отдельные этапы процесса Л-трансформации.

2. Классическая схема воспроизведения явления Л-транс-формацин, разработанная для многих патогенных микроорганизмов, не применима для клубеньковых бактерий. Вероятной причиной этого следует считать повышенную устойчивость клубеньковых бактерий к антибиотикам. * ...

3. Установлен Л-трансформирующий эффект глицина на клубеньковые бактерии люцерны, гороха и люпина. Выявлена оптимальная для Л-трансформашш концентрация этой аминокислоты.

4. Разработаны способы получения морфологически атипичных форм под действием Л-трансформнрующих агентов,

■ позволяющие культивировать клубеньковые бактерии в виде форм с качественно новой структурной организацией — с дефектной клеточной стенкой и без нее.

5. Экспериментально полученные формы несбалансированного роста, незавершенные Л-формы, сферорластоподобные тела и зернистые структуры являются жизнеспособными и имеют сходство в-строенин и свойствах с. бактероидами и • '1С

артроспорамн клубеньковых бактерии, существующими в природе.

6. Процесс инфицирования растения-хозяина .(изучен у люцерны), характеризующийся специфическим искривлением корневых волосков при инокуляции морфологически атипичными формами клубеньковых бактерий, такой же как и при заражении клетками исходного штамма,

7. Полученные под действием разного рода Л-нндукторов морфологически атипичные формы клубеньковых бактерии сохраняют вируленть ¿i'b, что связано с их быстрой реверсией в исходную бактеуд.^^ную форму.

8. Все некусствсЬиЖгголученные варианты клубеньковых бактерии, за исключением- зернистых форм, не способны к стабилизации в условиях воздействия фактора Л-трансформа-

UHH.

У. Полученные в эксперименте зернистые структуры есть основание рассматривать как условностабпльные Л-формы, так как для реверсии они требуют создания дополнительных условий культивирования — добавления в среду 2% агара.

10. Процесс реверсии может иметь место у всех морфологически атипичных форм при исключении из состава среды Л-нндукторов. Интенсивность процесса реверсии aamit-iii степени стабилизации культуры в Л-форме.

11. Изучение влияние Л-траисформнрующих агентов и условии культивирования на клубеньковые бактерии дае" основание предположить возможность существования процесса Л-трансформацнн у рнзобнй в почве, где могут быть созданы аналогичные условия.

Материалы диссертации опубликованы в работах

1. Игнатова И. IO. О возможности получения L-форм клубеньковых бактерий с помощью общепринятых ^трансформирующих средств воздействия. — Доклады ТСХЛ, 1980, вып. 263, с. 131 — 134.

2. Игнатова И. Ю., Филатова О. В. Разработка способов получения морфологически атипичных форм клубеньковых бактерий. Тезисы докладов на конференции молодых ученых.— Краснодар, ВНИИ рнса, 1981, с. 15—16.

3. Шильннкова В. К., Игнатова И. Ю.. Котлярова Г. А., Константинова Н. Д. Образование клубеньковыми бактериями морфологически атипичных форм в условиях in vitro.— Известия ТСХЛ, 1982, вып. 1, с. 16—22.

л ЮНОЙ 6/v—82 г. Объем 1 '/, »- л. Заказ 107G. Тираж 100

Типография Л1о;копскоП с.-х. академии им. К. Л. Тимирязева 12Г").Г)0, Москва П-л.-И, 'Iимкрязеискан ул., 44