Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Морфо-функциональный анализ роста колоний бактерий рода PROTEUS

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Морфо-функциональный анализ роста колоний бактерий рода PROTEUS"

rv

CT

О

c>

'•О

На нравах pyunnucn УДК 576.951.47:576.8.093.031

ПАЛ1(ИН Алексей Леонидович

МОРФО-ФУНКЦИОНАЛЬНЫЙ АНАЛИЗ РОСТА КОЛОНИЙ БАКТЕРИЙ РОДА PROTEUS

(03.00.07 — микробиология)

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Ипамоио 1007

Работа выполнена и Ивановской государственной медицинской академии им. А. С. БУБНОВА.

Научные руководители:

академик Петровской академии наук и искусств, доктор медицинских наук, профессор В. М. Бондаренко,

доктор медицинских наук, профессор А. А. Миронов.

Официальные оппоненты:

доктор медицинских паук, профессор А. С. Бычков,

доктор медицинских паук, профессор В. Г. Лиходед.

Ведущая организация —

МНИИЭМ России им. Г. Н. Габрического.

Защита состоится « т2?3. » . . . 1997 г.

в «... » час. на заседании специализированного совета при ММА им. И. М. Сеченова /11988/ Москва, ул. Б. Пироговская, д. 2/6.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотке ММА им. И. М. Сеченова.

Автореферат разослан « Ж. » it^v/k^-^à . 1997 г.

Ученый секретарь специализированного совета доцент

А. Ю. МИРОНОВ

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ. В последние года особо важное значение в клинике приобретают заболевания,■ вызываемые условно патогенными бактериями, в том числе и представителями рода Proteus (Бондаренко В.М. и др., 1987,1994).Протеи обладают высокой и к тому же постоянно возрастающей устойчивостью к применяемым на практике антибактериальным препаратам, поэтому лечебные мероприятия, проводимые на фоне уже развивающегося процесса, нередко не только мало эффективны, но и при недостаточно рациональном их проведении зачастую усугубляют этот Процесс. Повышается • число септических осложнений, обусловленных данным возбудителем (Швиденко О.И. 1988).

У бактерий рода Proteus обнаружен ряд факторов' пато-генности. Для штаммов Р.vulgaris и P.mirabilis, инициирующих кишечные заболевания (Агеева P.A. ,1988), характерно наличие ST и LT энтеротоксинов. Штаммы, изолированные при пневмониях, пиелонефрите«, воспалительных процессах нижнего отдела урогенитального тракта и остеомиелитах, характеризуются наличием гемолитической, уреазной и выраженной проте-азной активностью (Mobley. et.ol.,1987, Peerbrooms P.L. et. ol;, 1981) . Исходя из того, что некоторые штаммы протеев дополнительно к ферментам патогенности имеют высокую колонизирующую и инвазивную способность, очевидно, что они способны вызвать тяжелый гнойно-воспалительный процесс.

В связи с указанным важное значение имеет разработка методов рациональной профилактики и лечения протейной инфекции. Успехи в этом направлении связаны с детальньм изучением биологии возбудителя, характеристики его патогенных свойств в зависимости от состояния окружающей среда и организма хозяина.

В последние годы показано, что иммобилизированные состояния являются естественной формой обитания микроорганизмов. Именно при образовании колоний микробная клетка реализует ряд своеобразных морфологических и физиологических потенций, которые не обнаруживаются при изучении бульонных культур. Рост развитие и дифференциация бактериальных коло-: ний относятся к недостаточно- изученным разделам общей и медицинской микробиологии.

Подавление адгезии, колонизации и связанных с ними дальнейших процессов развития токсико-инфекционных заболеваний рассматривается как радикальный способ прерывания инфекции и эпидемического процесса.

Расшифровка закономерностей формирования, роста и развития колоний любого микроорганизма ваяна как в плане по-, знания биологии возбудителя, так .и разработки вопросов, связанных с проблемами культивирования производственных штаммов, получения оптимальных количеств биомассы, преодо-• ления диссоциативных процессов, происходящих на популяиион-ном уровне и их использования в процессах разработки рациональных лечебно-профилактических мероприятий.

ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ. Целью исследования явилось изучение морфо-функциональных и некоторых биологических особенностей бактерий рода Proteus, проявляющихся при формировании микро- и макроколоний на плотной питательной среде.

Для достижения поставленной цели мы считали необходи-1ш решить следующие ЗАДАЧИ:

1. Изучение морфо-функциональных особенностей бактериальных клеток протеев при формировании макро- и микроколо-

ний на плотной питательной среде.

2. Исследование процесса диссоциации роста■и развития популяции бактерий рода Proteus, выявляемых в динамике культивирования на плотной питательной среде.

3. Детальный анализ механизма диссоциации роста и условий формирования атипичных макроколоний на модели Proteus mirabilis.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА. Впервые установлено, что рост и развитие микроколонии протеев представляет собой последовательную совокупность процёссов, реализующих построение определенных взаимосвязанных структур, формирующих типичную или атипичную морфологию макроколонии.

Детально описаны процессы формирования микро- и макроколоний бактерий рода Proteus. При исследовании процесса роения протея на плотной питательной среде в условиях микрокамеры показано, что процесс роения наблюдается только после обогащения среды кислородом. Оксигенация среды ускоряет этапы формирования микроколоний. Для нероящегося штамма характерна меньшая длительность периода адаптации.

• Впервые обнаружен диссоциативный процесс спорадически возникающий в популяции атипичной макроколонии, связанный с образованием оригинальной морфологически обособленной 'субпопуляции", формирующейся в придонном слое среды. Выявлены фенотипические особенности (дифференциальные признаки), отличающие возникающую бактериальную "субпопулядаю" от . популяции .бактерий основной колонии.

Математический анализ свидетельствует о том, что час-гота возникновения фенотипического кластера совпадает с частотой выделения культур рода Proteus в клинике.

Описана динамика роста и дана расшифровка механизмов взаимодействия клеток при формировании впервые обнаруженных спиральных форм колоний протея, состоящих из переплетенных жгутов бактериальных клеток и скрученных жгутиков.

"ТЕОРЕТИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ РАБОТЫ Работа является фундаментальной. Разработанный автором методический подход к изучению формирования колоний протея и возникновению оригинального фенотипического кластера мсжет быть использован в лабораториях, занимающихся исследованием роста и развития колоний у других родов бактерий.

Данные об динамике высеваемости протея и временные параметры появления субпопуляции диссоциативных спиральных форм колоний, регистрация периодов возникновения. "субпопуляций", определение моментов перехода от рояния к консолидации могут -быть полезными при прогнозировании профилактических мер по предупреждению протейной инфекции. ■

Материалы диссертации доложены и обсуждены на 14 научных совещаниях, конференциях и симпозиумах. Полученные в результате данного исследования материалы важны для понимания закономерностей процесса диссоциации у бактерий в процессе роста и формирования микро и макроколоний протея. Данные используются в лекционном материале, на практических занятиях по микробиологии в Ивановском государственном медицинском институте, Ивановском государственном университете и Ивановском сельскохозяйственном институте.

ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ. 1. Н«ро- и макроколонии бактерий рода Proteus в процессе роста проходят последовательные характерные фазы развития. Морфо-функциональный анализ начальных стадий формирования микро-

колонии позволяет прогнозировать будущую структуру макроколонии. В процессе развития макроколонии наблюдается значительный полиморфизм клеток и закономерная укладка бактерий в смежных участках макрокалонии.

2. Процесс роения бактерий рода Proteus имеет ряд свойств, общих с автоволновыми колебаниями: наличие сплошного движущегося фронта, переходного процесса, повышение скорости движения с увеличением диффузии, наличие зоны невозбудимости, образование ревербератора.

3. Для протеев характерен оригинальный диссоциативный процесс связанный с возникновением особой субпопуляции отличающейся придонным ростом клеток, гетерогенных по морфологическим признакам, образованием своеобразных клеточных "канатов" в пределе« макроколонии и особыми биохимическими свойствами. При этом вместо кольцевидной макроколонии образуются спиральные и другие атипичные.формы колоний.

4. Образование диссоциативной субпопуляции носит спорадический характер и ее появление в процессе пересевов в эксперименте совпадает с частотой регистрации "вспыиек" протейной инфекции.

ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ РАБОТЫ ДОЛОЖЕНЫ НА: Конференции молодых научных работников ИГМИ им. А.С.Бубнова г.Иваново, 1984; всесоюзном совещаний "Цитология микроорганизмов", г.Пущино, 1984; конференции молодых ученых ИГМИ им. А.С.Бубнова, г.Иваново, 1985, международном семинаре "Магнитобиология и роль межпланетного магнитного поля в биодинамике", Москва, 1985; конференция молодых ученых ИГМИ им. А.С.Бубнова, г.Иваново, 1986, областной конференции молодых ученых по общественно-политическим' и научно- техниче-

ским проблемам, г.Иваново, 1986; 1-й съезде эпидемиологов, инфекционистов и гигиенистов Туркменистана, Ашхабад, 1986; всесоюзном совещании молодых ученых, Тбилиси, 1987; научно-техническом семинаре "Электронная микроскопия для исследования функциональных изменений структуры клетки при различных возбудителях", г.Иваново, 1987; научной конференции мо--лодых ученых ИГШ, г.Иваново, 1987; всесоюзной конференции по актуальным вопросам клинической микробиологии в неинфекционной клинике, Барнаул, 1987; III-ей областной конференции молодых ученых по актуальным общественно-политическим и научно-техническим проблемам, г.Иваново, 1988; всесоюзной школе-семинаре "Непериодические быстро протекающие явления в окружающей среде", Томск, 1988; научно-практической конференции "Эпидемиология/ клиника, диагностика и профилакти- . ка инфекционных болезней взрослых и детей", Иваново, 1989.

ОВЬЕМ И СТРУКТУРА РАБОТЫ. Диссертация состоит из вве- ' дения, 6 глав, заключения, выводов, указателя литературы, приложения. Содержит 173 листов машинописи, иллюстрирована 13 таблицами, 32 рисунками. Указатель литературы состоит из 132 источников, 70 отечественных и 62 иностранных.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Материалом настоящего исследования послужили 110 диких • штамма Proteus miralilis, которые были выделены бактериоло-гаческой лабораторией I городской клинической больницы. Для изучения морфологии бактерий были использованы роящдеся штампы Р. miralilis, условно обозначенные нами номерами СП-10, №2, 13, 14, 15. К)эоме того с бактериями штамма СП-10

были проведены исследования изменений формы макро и микроколоний с использованием цейтраферной киносъемки; с помощью ежедневных пересевов изучены отличия структуры колонии, биохимических и функциональных характеристик бактерий при обычном росте и при образовании "субпопуляций". Биохимические свойства соответствующих штаммов были изучены с применением автоматической системы фирмы ABBOTT США.

Для обнаружения возможных изменений процесса роения при образовании макроколоний использовали культивированные бактерии на плотной среде следующего состава: гидролизат кильки - 17,9г, агар-агар - 11,2г (оба производства Дагестанского НИИ питательных сред, одной партии изготовления), натрия хлорид - 5,9г, фенол - 0,75г, вода - 1000,Ог; рН -7,3. Фенол добавляли в стерильную питательную среду до разлива. Толшина слоя питательной Среды была одинаковой во всех опытах, так как заливка велась дозировано.

Для инокуляции использовали бульонную культуру в возрасте 18 часов. Посев производился уколом иглы, которая проходила через всю тслщу агара до дна чашки Петри. Засеянные чашки помещались в термостат при температуре 37°С.

' В течение пятилетнего периода с 8.08.83 по 7.07.88 года 5 раз в неделю засевалось 10 чашек Петри, что позволяло наблюдать динамику образования "субпопуляции"' протейных бактерий в течение 1184 дней. За этот период зарегистрировано 186 дней, в которые наблюдалось 499 случаев формирования "субпопуляций" протея.

■ Кроме того из общего числа штаммов было исследовано 28 с целью определения их способности к образованию "субпопулянии". Эти группы колоний, соответствуют колониям индикаторного штамма. Каждый из них инокулировался 5 раз.

Всего таким образом проведено 340 исследований.

Результаты ежедневных наблюдений за динамикой образования "субпопуляций" были сопоставлены с данными бактериологических исследований, проведенных в областной клинической больнице г.Иваново, которые были любезно предоставлены" нам зав. Кузнецовой JI.B. Проводился подсчет количества совпадений образования "субпопуляции" и случаев высевания протея в клинике. При этом учитывались совпадения со сдвигом i (5-1) день и совпадения без сдвигов по времени.

Нами проанализирована выборка высеваемости протея в период с 8.08.83 по 31:12.88. Из 177486 исследований, проведенных в лаборатории, протей был обнаружен в 1570 случаях. Сопоставлены анализ проведенный на материале, полученном с августа 1983 года по апрель 1986 года. В этот период зарегистрировано 133 дня, в которые была обнаружена "субпопуляция". Всего выявлено 368 случаев формирования "субпопуляции". В то же время число случаев выделения протея составило 180, а всего положительных результатов зарегистрировано 269.

. Кроме этого сравнение этих данных проведено с использованием критерия знаков (И.И.Конышева и М.В.Земскова, Ив-ГУ), которая основана на нулевой гипотезе, предполагающей отсутствие различий между двумя разновидностями объектов. Данные результаты обрабатывали на ЭВМ ЕС-1060 в диалоговой системе.

Для изучения влияния различных условий культивирования и мутагенных факторов на формирование макроколоний проведены эксперименты при проведении которых было заселено 894 чашки. Для оценки влияния фенола на рост бактерий использовались концентрации его от 0,01мг до 0,14мг на 100мл мясо-

пептонного агара. Для оценки влияния желчи ("желчь медицинская") использовались концентрации от 0,01мг до 4,5мг МПА. Для исследования влияния плотности Среда содержание агара изменялось с 2,2 до 3,6г на 100мл мясопептонного бульона. Показатель рН Среда изменялся в пределах от 5,35 до 9,5 (данный параметр контролировался рН-менром марки рН-121). Для исследования влияния температуры на протейные бактерии проанализирован диапазон температур от 20 до 44°С. культивирование проводилось в термостате марки ТС-80У 42. Облучение ультрафиолетовыми лучами проводилось бактерицидной лампой ОКН-11 с расстояния 30см при экспозиции 5, 10, 20, 30 мин. Облучение радиоактивным кобальтом Со (доза 88 рад) проводилась кобальтовой пушкой Луч-1 при экспозиции ' 5, 10, 20, 30, 40 мин. Исследования проведены на базе радиологического отделения онкологического диспансера г.Иваново (выражаем глубокую благодарность асс. В.М.Анисимову). Для изучения свойств и дифференциальных признаков бактерий, входящих в состав основной колонии и субпопуляции, использовались следуюцие тесты: 1) культивирование с феноловым красным на среде следующего состава: вода-ЮОО.Ог, гидрози-лат кильки - 0,5мг, феноловый красный - 0,4г, 45 чашек; 2) исследование изменений цвета тетразслиев в зависимости от возраста культур - 294 чашки. Для проведения последнего теста использовались следующие соли тетразолия: тетразолие-вый синий диформазан, тетранитрютетразолий синий, синий мо-нонитротетразолиевый, синий неотетразолиевый, М-нитротетразолий фиолетовый, Н-нитротетразолий фиолетовый, синий моно-нитротетразслиевый,. нитротетразол синий (фирма Яеако1 -Чехословакия). Указанные индикаторы разводились в 0,1 М фосфатном буфере (рН-7,3) в концентрации 2,5 мг в 15

мл. Регистрация изменений цвета проводилась с использованием спектрофотометра СФ-46 на соответствующей длине волны для каждой соли тетразолия.

• Для исследования поведения одиночных бактерий в процессе формирования ими микроколоний мы использовали метод цейтрафферной киносъемки, культивируемых в специальной мик- ■ рокамере, которая была и изготовлена на основе промышленного термостолика; Последний модифицировался путем применения термического регулятора, что обеспечивало повышенную ( ± 0,1°С) точность поддержания температуры. При изготовлении микрокамеры использовались покровные стекла толщиной не более 0.17мм, размером 24x24 мм. Общая толщина камеры не превышала 1,1-1,2 мм. Ее рабочая глубина составляла 0,2-0,3 мм. Все это позволило использовать для микросъемки иммерсионные объективы.

Для наблюдения и фотосъемки использовалась микроустановка МКУ-1 (ЛСМО), (мы приносим глубокую благодарность асс. О.Ю.Кузнецову за помощь в проведении этой работы) . Нами было обнаружено, что протей не сохраняет способность к роению при культивировании в микрокамерах, приготовленных обычным способом.' Для адаптации среды к нашим исследованиям мы использовали следующую методику посева (рац. предложение ИГМИ №1641 от 22.04.85). Готовились два агаровых пласта, толщина каждого из которых соответствовала толщине пленки, образующейся на бактериологической петле после ее изъятия из расплавленного агара. На первый пласт бактерии засева-■лись методом стекающей капли, после чего он накрывался вторь« агаровьы пластом.

В ряде случаев мясопептонный агар, предназначенный в качестве питательного субстрата для приготовления микрока-

меры, готовился следующим образом (рад. предложение ИГМИ № 1901 от 6.10.88). Приготовленная Среда расплавлялась над пламенем спиртовки, но не доводилась до кипения. Через полученный расплав при помощи пастеровской пипетки, соединенной с резиновым' резервуаром, продувался кислород в объеме

3

100 см на 2 мл среды. Далее изготавливалась Ш-образная камера Пешкова.

Съемка проводилась с использованием коррегирующего фильтра ЖЗС-1 на фотопленку "Микрат-300" с экспозицией 10 сек и интервалом между кадрами 10 мин. При исследовании начальных этапов развития микроколонии изучены 723 бактерии, сделано 1447 измерений. В ходе исследования всех этапов роения было проведено 1055 измерений бактериальных клеток штамма P.mirabilis СП-10 и 1440 измерений штамма P.mirabilis № 2.

Для исследования упаковки клеток и общей структуры макроколоний протея был использован метод препаратов отпечатков. Всего было измерено 418 клеток в 5 разных участках макроколонии (край, область консолидации, зона прилежащая к месту инокуляции и т.д.).

Пространственная организация роящегося края макроколонии изучалась с помощью сканирующей электронной микроскопии. Взятие проводилось таким образом, чтобы на каждом препарате находились клетки только данного участка колонии и отсутствовали микроорганизмы из соседних зон (рац. предложение ИШИ № 1814 от 02. 04. 87). Для этих целей из макроколонии аккуратно вырезались пластинки мясопелтонного агара толщиной 1,5- 2,0 мм вместе с находящимися на ней бактериями.

Для освобождения поверхности бактерий от мощного слоя

слизи в некоторых случаях мы использовали кактусовые иглы, которыми либо аккуратно очищали поверхность блока, либо игла вкалывалась в агаровый блок и. выдвигала на противоположную поверхность образца достаточно большие группы бактерий. Проверка данной методики показала, что пространственная организация и взаиморасположение микроорганизмов в этих группах изменялась незначительно. Всего исследовано 44 блока, выделенных • из различных участков макроколонии. После указанных выше манипуляций или без их использования образцы помещались в 2,5% раствор глутарового альдегида на 0,1 M фосфатном буфере (рН 7,-3) на 24 часа. Далее препараты обезвоживались в восходящих концентрациях этанола и просматривались в сканирующих электронных микроскопах Hitachi S-405А, JET -ЮОСХ и Tesla В-300.

Ультраструктура протейных бактерий изучалась с помощью просвечивающей электронной микроскопии. Для этой цели колония заливалась 2,5% раствором глутарового альдегида на 0,1 M фосфатном буфере (рН 7,3) на 2 часа. Затем из интересующего нас участка аккуратно; сохраняя пространственное взаиморасположение клеток и их агрегатов, вырезался агаровый блок, который после отмывки в буфере постфиксировался в 1% буферном растворе четырехокиси осмия, обезвоживался в восходящих концентрациях этанола л заливался в смесь эпона Микротом LKB-III (Швеция), контрастировались уронилацета-том и цитратом свинца и исследовались в просвечивающем электронном микроскопе ЭБМ-100 Ж (г.Сумы) . Полученные микрофотографии были подвергнуты морфометрической и статистической обработке в соответствии со стандартной методикой. Всего проведено 1763 клеток.

РЕЗУЛЬТАТЫ ПРОВЕРЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

При изучении процесса формирования микроколоний протея при росте на плотной питательной среде обнаружено, что исследуемые штаммы образуют типичные для этой формы бактерий концентрические колонии с характерными неровными кольцами. Исследованы роящиеся колонии двух видов: колонии с непрерывно двигающимся фронтом роения и колонии, у которых процесс роения периодически останавливаются.

В результате пятилетних, практически непрерывных экспериментах обнаружено, что периодически наряду с концентрическими колониями протея образуются макроколонии с измененной структурой. Диссоциация связана с образованием в придонном слое среды особой "субпопуляции" бактерий, которая бактериостатически воздействуют на основную колонию. Сформированная субпопуляция таким образом влияет на основную колонию, что последняя принимает форму спирали. Роение имеется как в основной колонии, так и. в придонно расположенной диссоциативной "субпопуляции".

Появление описываемого феномена носит спорадический характер. Частота и интенсивность выделения диссоциативной "субпопуляции" зависит от времени суток. Длительность циклов выделения подобных структур составляет около 5 дней. Проверка диких штаммов на способность к образованию "субпопуляции" показала, что более трети их обладают указанной потенцией.

Выявлены дифференциальные признаки, отличакщие "субпопуляции" от основной колонии. Они включают большую, чем у основной колонии, скорость распространения бактерий

по дну чашки Петри, указанные выше особенности образования макроколонии, увеличенную способность к закислению среда, отсутствием реакции с солями тетразолиев ( последнее не зависело от сохранения жизнеспособности бактериальными клетками) .

Выявленные дифференциальные признаки, в том числе и по размеру бактерий, исчезают через 18 часов после появления описываемой структуры. Поэтому образование диссоциативной субпопуляции можно отнести к изменению фенотипа, что позволяет для более точного обозначения обнаруженной нами добавочной колонии ввести термин фенотипическая "субпопуляция".

Изменение условий культивирования и параметров среда, а также воздействие ультрафиолетовым излучением и гамма излучением не привели к возникновению сходного эффекта.

б ходе наблюдения за ростом бактерий протея на поверхности плотной питательной среда обнаружены атипичные макроколонии, форма которых (двойные и удлиненные колонии) свидетельствует о проявлении полиморфизма и гетерогенности популяции протея.

Анализ начальных стадий рюста бактерий роящяхся. штаммов протея на плотной питательной среде и процесса формирования микроколоний показал, что независимо от условий культивирования при образовании микроколонии происходит закономерная смена поведенческих реакций бактерий протея. Мы исследовали следугадие фазы процесса формирования микроколонии: 1)1ад - фаза; 2) медленный рост; 3) 1од - фаза; 4) активация движения бактерий; 5) стационарная фаза. Характерные является определенная зональность распределения бактерий протея различной длины в пределах микроколонии. На самом краю, как правило, расположены длинные бактерии. Эти

нитевидные микроорганизмы двигаются наиболее интенсивно. Лишь в одном из экспериментов удалось зарегистрировать активное перемещение бактерий, длина которых не превышала 4 мкм. Движение клеток начинается только после накопления определенной массы колонии.

Культивирования "бактерий роящихся штаммов P.mirabilis на плотной питательной среде, обогащенной кислородом, «ю-зволило выявить ряд характерных особенностей процесса-формирования микроколоний в этих условиях.

Микроколония в своем образовании проходит те' же фазы развития, что и макроколония, однако переход от одного этапа к другому значительно ускоряется. При этом увеличивается пвдвикность бактерий и снижается их адгезивность к плотной питательной среде. Однако это сопровождается и более быстрой остановкой развития колонии (фаза стабилизации достигается скорее).

В этом случае двигаются не отдельные клетки, а их группы, объединенные в своеобразные плоты. На данном этапе бактерии в указанных условиях не прикрепляются к поверхности Среды. Хотя в дальнейшем скорость движения микроорганизмов постепенно снижается, однако некоторые бактерии в составе плота сохраняют свою активность, способствую передвижению соседних клеток. Фиксация плота к поверхности Среды сопровождается распадом длинных форм.

Рост микроколоний нероящегося в условиях данного эксперимента штамма P.miralilis №2 характеризуется меньшей длительностью периода адаптации и более быстрым началом деления клеток. Однако и период активного движения в этом случае заканчивается быстрее.

В процессе развития микроколонии обнаруживается от-

четливая закономерность в изменении длины бактерий. В фазу активации подвижности длина бактерии увеличивается, напротив, в фазу консолидации (резкого снижения двигательной активности) средняя длина клеток уменьшается. Данная закономерность проявляется независимо от условий культивирования. Анализ изменений удельной площади поверхности бактерий пс^азал. что при развитии роящихся штаммов этот параметр нарастает вплоть до момента начала стабилизации. При культивировании нероящегося штамма этот показатель во времени практически не меняется. Следовательно он не служит сигналом к образованию длинных форм бактерий.

Изучение' структуры ыакроколоний под световым микроскопом, а также в сканирующем и просвечивающихся электронных микроскопах показало, что в пределах колонии роящегося штамма протея имеется определенная зональность в распределении бактерий различной длины. Роящийся край колонии состоит в основном из длинных, часто свыше 50 мкм, бактерий. В зонах, расположенных ближе к центру (в участках консолидации) , вначале встречаются как длинные, так и короткие формы клеток. И чем проксимальнее расположен исследуемый участок, тем в большей степени среди бактерий преобладают короткие. Многие бактерии при этом плохо воспринимают ген-циан-виолет. И только в центральных участках, там где короткие бактерии составляют подавляющее большинство, тинкто-риальные свойства микробных клеток нормализуются и всё они прокрашиваются генциан-ви слетом. Морфометрический анализ показал, что средняя длина бактерий по направлению к центру колонии уменьшается. Полиморфность среди коротких бактерий ближе к периферии увеличивается, а у центра падает.

Оказалось, что роящейся край макроколонии представлен

трехмерным сплетением длинных бактерий, ориентация которых в пространстве довольно хаотична. Среди рыхлой фибриллярной структуры колонии все же встречаются отдельные более упакованные скопления бактерий, имеющих форму тяжей или пучков. Все бактериальные клетки на краю колонии взаимосвязаны как между собой, так и а основной массой колонии. На поверхности длинных бактерий хорошо выражены жгутики, которые тесно переплетены с подобными образованиями смежных бакте- • риальных клеток. Филаментозное сплетение прикрывает поверхность клеточной стенки и в своих узлах содержит значительные количества слизи. Содержание слизи увеличивается по направлению к центру. Участок консолидации, расположенный у края колонки, отличается.незначительным числом слоев бактерий (обычно не более двух). Нитевидные бактерии тесно сомкнуты друг с другом своими боковыми поверхностями и образуют плотную филаментозную придонную пластинку. Среди формирующих ее бактерий довольно много клеток, изогнутых в. виде дуги или петли. Придонная пластинка образована дискретными совокупностями длинных тесно сомкнутыми своими боками бактерий. Эти слои имеют разную ориентацию большей части клеток. Между этими слоями видны участки среды, не покрытые бактериями.

Число слоев клеток увеличивается по направлению к центру. Поверхность клеточных стенок отличается своеобразной гранулярностью и имеет ' небольшие ямки. Иногда бактерии вместе со слизью образуют своеобразные овоидной формы коконы. Поверхность кокона закрыта филаментозной пленкой. Большая часть волокон в коконе ориентирована радиально. На ультратонких срезах субмикроскопическая организация бактерий расположенных на соседних участках не имеет особенностей.

Для них присущ типичный набор внутриклеточных структур, свойственный бактериям протея. Среда бактерий, локализующихся ближе к поверхности встречаются осмиофильные и "светлые" клетки. Осмиофильные клетки обычно входят в состав плотов. Вокруг бактерий видны срезы жгутиков, ориентированных в самых различных направлениях. Жгутики участвуют в образовании отдельных групп бактерий - плотов путем переплетения со смежными бактериями. В светлых бактериях нуклеоид часто как бы перемешан с осмиофильным веществом цитоплазмы, • в цитоплазматическом матриксе встречаются просветления. Бактерии, принимающие участие в образовании плотов, имеют большее содержание жгутиков на своей поверхности. Кроме данных видов бактерий встречается определенное число частично лизированных клеток и переходные формы.

С поверхности колонию покрывает не имеющая перфорации мембрана, образованная внеклеточным веществом. Нам не удалось обнаружить существенной разницы в субмикроскопической организации бактерий разных штаммов.

Морфометрический анализ показал, что в зонах консолидации у более проксимально расположенных зонах диаметр бактерий увеличивается. Оказалось, что у нероящихся штаммов протея средний диаметр бактерий и выраженность их полиморфизма меньше, чем у роящихся. В£юме того, независимо от участка колонии более поверхностно располагаются бактерии с большим диаметром, чем клетки в белее глубоких слоях что, по видимому, обусловлено повышенной степенью полиморфизма клеток в этих слоях.

Проверка предположения об экзогенном характере описываемого явления путем сопоставления со значениями числа Вольфа л геомагнитным планетарным индексом не позволила

установить четко выраженной и достоверной связи между этими процессами. В то же время показано, что динамика роста образования фенотипической "субпопуляции" и динамика выделения Proteus в клинических условиях имеют сходный характер, что позволяет рассматривать эти процессы как взаимодополняющие и имевшие сходную причину. При учете особенностей клинического выделения протеев процент совпадения достигает 84%. -

При сопоставлении высеваемости протеев в различных отделениях за четырехлетний период установлено, что в некоторых случаях имеется значительная корреляция между рядом отделений (коэффициент корреляции от 0,300 до 0,679).

ТАКИМ ОБЕАЗСМ, в процессе проведения настоящего исследования было установлено, что микро- и макро колонии P.mirabilis проходят последовательные характерные фазы развития. Морфо-функциональный анализ начальных стадий формирования микроколонии позволяет прогнозировать будущую структуру ма1фоколонии. Обнаружены значительный полиморфизм клеток и закономерная укладка бактерий в смежных участках макроколонии. Процесс роения бактерий имеет ряд свойств, общих' с автоволновыми колебаниями: наличие сплошного движущегося фронта, переходного процесса, повышение скорости движения с увеличением диффузии, наличие зоны невозбудимости, образование ревербератора. Выявлена особая диссоциативная фенотипическая субпопуляция, отличающаяся придонным ростом колонии, большим полиморфизмом клеток, образованием своеобразных клеточных "канатов" в пределах макроколо-• нии и характерными биохимическими свойствами. При этом образуются оригинальные спиральные и другие атипичные форьм колоний. Феномен образования субпопуляции в пределах зна-

читального временного периода имеет спорадический характер. Путем регулярного ежедневного пересева бактерий P.merabilis обнаружено значимое сходство динамики появления диссоциативной субпопуляции в эксперименте и частоты высеваемос-ти возбудителя в бактериологической лаборатории клинической больницы.

ВЫВОДЫ

1. Впервые обнаружена способность роящихся штаммов P. mirabilis к фенотипической диссоциации, проявляющейся прорастанием в придонном слое плотной питательной среды оригинальных по морфологии ма!фоколоний субпопуляции, частота и интенсивность формирования которых имеет выраженную спорадичность и цикличность.

2. Дифференциальные признаки, отличавшие бактериальные клетки диссоциированной субпопуляции от бактерий основной колонии включают большую скорость роста, выраженную поли-морфность особей и их способность к формированию своеобразных "канатов" в области роящегося края, увеличенную способность к закислению среды и отсутствие реакции с солями тет-разолиев.

3. Установлено, что процесс роения бактерий P.mirabilis имеет некоторые обаие свойства с автоволновыми колебаниями: наличие сплошного движущегося слоя, переходного процесса, повышение скорости движения с увеличением диффузии, наличие зоны невозбудимости, образование ревербира-тора.

4. Разные участки колонии роящегося штамма P.mirabilis отличаются по морфологическому составу не только в зависи-

мости от фазы роения, но и в пределах однсй фазы. Роящийся фронт содержит бактерии, изогнутые как в вертикальном, так и в горизонтальном направлениях. В участке консолидации бактерии направлены вертикально к поверхности.,

5. Образование микроколоний нероящимися штаммами P.mirabilis отличаются меньшей длительностью периода адаптации по сравнению с рюящимися и более быстрым началом деления клеток. При этом не отмечается значительных изменений показателя удельной поверхности. Клетки отличаются меньшим полиморфизмом.'

6. Динамика образования фенотипическсй субпопуляции и частота выделения штаммов рода Proteus в клинических условиях имеют сходный характер, что позволяет рассматривать диссоциативный процесс в качестве прогностического, свидетельствующего об увеличении активности вегетирунздих клонов, изолируемых при воспалительных процессах различной локализации.

Список опубликованных работ по теме диссертации

1. Палкин А.Л. О способности бактерий рода Proteus к образованию спиральных макроколоний //Тезисы докладов конференции молодых научных работников ИГМИ им. А.С.Бубнова, Иваново, 2 апреля 1984 г.-с.17-18.

2. Палкин А.Л. Кольцевые и спиральные структуры в развитии популяции протея на плотных питательных средах //Всесоюзное совещание цитологии мшфоорганизйов: Тезисы докладов АН- СССР Научный центр биологических исследований.

- Душино, 1984.-с.48-50.

. 3. Палкин А.Л. Особенности формирования микроколоний протея //Физико-химические исследования патогенных энтеро-бактерий в процессе культивирования: Сборник научных трудов

- Иваново, 1985.-с.84-87.

4. Палкин А.Л. О возможности влияния геомагнитных полей на структуру популяции бактерий рода Proteus //Тезисы докладов научней конференции молодых ученых ИЩИ им. А.С.Бубнова 6-7 мая 1985. Иваново, 1985.-с.18-20.

5. Палкин А.Л. Автоволновые' процессы при формировании макроколоний роящихся форм бактерий рода Proteus //Тезисы докладов областной конференции молодых ученых ИГМИ им. А.С.Бубнова 20 февраля 1086 г.-Иваново, 1986.-с.53-58.

6. Палкин А.Л. Динамика изменения морфологической гетерогенности бактерий рода Proteus в процессе развития микроколонии //Ранняя диагностика клинических инфекций: Сб. научных трудов-г.Иваново,1986.-с.54-57.

7. Палкин А.Л. Выживаемость микроорганизмов на таблетках из каолиновой глины в условиях внешней Среда //Тезисы

докладов областной конференции молодых ученых по общественно-политическим и научно-техническим проблемам 26-28 ноября 1986г. -г.Иваново,1986.-с.209.

8. Палкин А.Л., Кузнецова Л.В. Диагностика выживаемости, видовой состав, некоторые биологические особенности бактерий рода протея //Тезисы докладов 1-го съезда эпидемиологов, инфекционистов и гигиенистов Туркменистана.-Ашхабад,986.-с.47.

9. Палкин А.Л. Периодически возникающие клеточные изменения P.mirabilis //Всесоюзное совещание молодых ученых, Сб. тезисов докладов.-Тбилиси,1987.-с.974-975.

10. Палкин А.Л. Особенности строения и клеточного состава роящегося края субпопуляции P.mirabilis //Тезисы докладов научной конференции молодых ученых ИГМИ им. А.С.бубнова 21 октября 1987 г.Иваново,1987.-с.18-19.

11. Палкин А.Л. Редко встречающиеся формы ма1фоколоний бактерий рода Proteus //Всесоюзная конференция "Актуальные вопросы клинической микрюбиологии в неинфекционной клинике: Сб. тезисов докладов.-Барнаул,1987.-с.47.

12. Палкин А.Л. Структура клеток роящегося штамма СП-10 // Ш-я областная конференция молодых ученых и специалистов по актуальным общественно-политическим и научно-техническим проблемам 22-23 апреля 1988.: Тезисы докладов-Иваново,1988.-с.55.

13. СЬдфнов С.Г., Палкин А.Л. Биологическая индикация неиндентифицированных процессов //Всесоюзная школа-семинар. Непериодические быстро протекающие явления в окружающей среде // Тезисы докладов-Томск,1988.-с.45-50.

14. Палкин А.Л.,Земскова М.Н. Характер взаимосвязи между активностью протея в условиях клиники и изменением

формы мшфоколоний индикаторного штамма P.mirabilis СП-10 //ВНИИТИ,Д-5785 В88Д988 г. , _

15. Палкин A.JI.,Кузнецова JI.B. Высеваемость протея в различных отделениях областной клинической ■ больницы г.Иваново. Д-1409 В-89,1989.

16. Олирнов С.Г., Палкин A.JI. Биологичекая индикация неидентифицированных процессов. ВИНИТИ № 7141 В-89, 1989г.

17. Бондаренко В.М., Палкин АЛ. и др. Развитие макроколоний Р. mi/LO&/fi$ на плотной питательной среде. Журн.микро-' библ. ,199б,стр.26 - 30.

• Автор выратлет глубокую благодарность проф.Смирнову С.Г.

«

за помощь оказанную при работе над диссертацией.

Подписано к печати 25.03.97г.Формат издания 60x841/16. П?ч.л. I,Г).Усл.п.л. 1,39,Заказ 734/р.Тираж ЮОэкз.

Типшта^нч 1'У КГ1К,г.Ипанопо,ул.Р.рмака,41.