Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Морфо-функциональное состояние тромбоцитовпри экспериментальной гиперхолестеринемии и стрессе

ВАК РФ 03.00.11, Эмбриология, гистология и цитология

Автореферат диссертации по теме "Морфо-функциональное состояние тромбоцитовпри экспериментальной гиперхолестеринемии и стрессе"

КИ1ВСЫСИЙ УН1ВЕРСИТЕТ шеш ТАРАСА ШЕВЧЕНКА

На правах рукопису

ПОРАДУН ОЛЕНА М И К О Л АIВ Н А

МОРФО - ФУИКЦЮНАЛЬНИЙ СТАН ТРОМБОЦИТ1В ПРИ ЕКСПЕРИМЕНТАЛЫНЙ ППЕРХОЛЕСТЕРИНЕМЙ

ТА СТРЕС1

03.00.11. - ембрюлопя, пстолопя 1 цитолопя

АВТОРЕФЕРАТ

дисертацп на здобуття паукового ступеня кандидата бюлолчних наук

Кшв - 1996

Дисертац1ек> е рукопис

Робота викоиана в лаборатори патоморфологп УкраУнського науково-дослщного шституту кардиологи 'щ.акад.М.Д.Стражеска

Науковий кершник: доктор медичних наук

ГАВРИШ Олексаидр Семенович

Науковий консультант: доктор медичних наук

ЛУТАЙ Мнхайло 1ларшнович

Офщн'пн.опоненти:

Провшна оргашзацш

Лауреат преми ¡м.О.О.Богомольця, доктор медичних наук ПОЛ1ЩУК Людмила Захартна

доктор бюлопчних наук МИХАЙЛОВСЬКА Елеонора Володимнршна

Науково-доашдний ¡нститут ен-докринологн та обмшу речовин АМН УкраТни (м.Кшв)

^За^ист дисертацп вЦбудеться "

1996 ро-

ку о^-^тодиш на зааданш спещал130ван01 ВченоТ ради Д.01.01.13 при Кшвському ушверситет1 ¡меш Тараса Шевченка за адресою: пр. Глушкова, 2. НД1 ф1зюлогн Кшвського ушверситету ¡меш Тараса Шевченка (ими.504).

3 дисертац1ею можна ознайомитись в б1блютещ Кшвського ушверситету ¡меш Тараса Шевченка за адресою: вул. Володи-мирська, 64. Вщгукй на автореферат надсилати за адресою: 252033, м.Кшв, вул.Володимирська, 60.

Автореферат розкланий

Вчешш секретар спсщал^зовано! ВченоУ ради, канд. бюлопчних наук

" сШ"

1996 року

Г.В.Островська

ЗЛГАЛЬНЛ ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОГИ

Актуалыпсть теми. Тромбоцита е ключевого ланкою спсте-ми гемостазу, як! штегрують його клггиши та гуморальш фактори, беруть активну участь в ¡мунних реакциях оргашзму, коордпнаци регуляторних функцш ендотелпо та пластичних процеав у судии-нш стшщ (и.ВасНтоп I сшвавт.,1993). Тромбоцита накопичують фактори системи задания кров! та бюлопчно активш речовини, що вившьшоються або катабол1зуються у вщповщних умовах (О.Б.Самаль1 сптавт.,1990).

Подразнення тромбоцита спричишое Ух дестабипзацйо, що супроводжуеться складною морфо-функцюнальпого реакщпо, шд час якоУ сиостер1гасться модш}нкащя гтпкокалжсу та плазмалеми, порушуеться актившсть асоцшованих з нею фермента, що сприяе активаци та агрегащУ тромбоцита, шдвищуеться концснтращя ¡ошв кальцпо, що стимулюе Ц1 процеси (В.О.Люсов 1 сшвавт.,1988; В.О.Алмазов, 1991). В результат! агрегащя тромбоцита 1 реакщя вившьнепня набувають аутокатал1тичного характеру з вторинпим залученням до пе'{ сусщшх кров'яиих пластинок та ендотелюцита (В.О.Нагорнев, 1991 ;Е. I. \Vatts, 1992). Причинами дестабш1заци тромбоцита можуть слугувати, наприклад, тдвищення р1вня ате-рогенних лтопроте'цив або жирних кислот у кров1, нейро-гуморальш зрушення гид час стресорних сташв. В результат по-верхня тромбоцита перетворюеться на функцюнально активне поле, на якому вщбуваеться активащя та взаемод1я фактора системи задания кров1 (О.Н.Юпмов 1 сшвавт.,1995; А.ТЬогпаэ 1 сшвавт.,1993). Проте характер 1 тоню мехашзми морфо-функцюналышх зм1п тромбоципв периферичноУ кров1 на ]мзних етапах експериментального атеросклерозу, а також шд впливом стресу випчеш недостатньо, що й визначило актуалыпсть пронеде-ного дослщжеиня.

Мета та запдашш дослщження. Мета роботи - вивчення морфо-функцюнального стану тромбоцита периферичноУ кров! при диференцшованому га комплексному вплив! гшерхолестерп-немн (ГХЕ) та емоцшно-больового стресу (ЕБС), Для досягнення мети були вшначеш гаю завдання :

1. Вирчити структурно-функцюналып особливосп тромбоципв штактнлх крол1в, провести дослщження Ух фермеитних систем

та ультраструктур, як1 визначають реактившсть кров'яних пластинок.

2. Дослщити ультраструктурно-цитохЫчш особливосл та реактившсть тромбощтв в динамкц розвитку експериментально'1 алшентарноУ ГХЕ.

3. Встановити структурно-функцюнальну перебудову тромбощтв за умов ЕБС.

4. Влвчити комплексний вгшив хрошчноУ ГХЕ та ЕБС на ультраструктуру, регулятора! система та реактившсть тромбощтв перифернчно'У кровь

5. Проанал1зувати мехашзми дестабшзацп тромбощтв за умов патологи, що моделювалась.

Наукова новизна роботи. Вперше шляхом використання су-часних морфолопчних пiдxoдiв вивчено морфо-функщональш аспект» дестабшзацп тромбощтв при виб1рковому та комплексному вплив1 ГХЕ га ЕБС, проведено пор{вняльний ашипз змш ппко-калжсу та мембранних структур тромбоцитов, Ух енергетичного забезпечепня та здатност кумулювати бюлопчно активш речови-ни. Вивчено стан систем, якт визначаюгь функцюнальну актившеть тромбощтв 1 Ух реактившсть гид час взаемоди м1ж собою в кров1 та з чужорщною поверхнею. Встановлено морфо-функщональш змши, найбшьш важлшм дья дестабшзацл тромбощтв, та най-в1ропдншп мехашзми Ух реал1зацп за умов ГХЕ та ЕБС.

Тсоретичне та практнчне значения. Вивчення ультраструкту-ри тромбоцит шляхом використання сучасних електронно-мифоскошчних методик ¡стотно розширюе уявлення про функцио кров'яних пластинок \ мехашзми Ух активащУ за умов норми та патологи. Здатшсть ГХЕ та ЕБС зминовати концеитращю та розподш некомпенсованих вит'емних заряд1в в ппкокалша пояс-шоють зпиження 2-потенщалу й таким чином посилепня адгезивное™ тромбоципв. Пщтвердження можливосп вмникнепня в тромбоцитах дисбалансу м1ж актившетю адешлатцпклази (АЦ) та фосфодиестерази циюичних нуклеотид1в (ФДЕ), що визначають стаи регуляторних систем, якг включаються шд час рецептор-опосередкованих вплив1в, конкретизують мехаш'зми дестабшзащУ тромбоципв при ГХЕ та ЕБС.Проведеш дослщженпя об'ективують шформацпо про здатшсть тромбоцитов депонувати та катабол1зу-вати бюлопчно активш речовини, а також про шляхи Ух вившьнеи-

ия п оточуюче середовшде. Анал1з енергетичного метабол13му тромбоцит, нанвшсть в кров1 Ух дегенеративних та молодих форм свщчить про вплив ГХЕ та ЕБС на тривалкть життевого циклу кров'яних пластинок.

Практичне значения роботи визначаеться конкретизатцею стввщношення \пж структурно-метабол1чними змшами та функ-цюналышм станом тромбоцит, а також можливктю накреслити патогенетично обгрунтоваш шдходи до корекцн виявлених пору-шень. Результата роботи можна використати шд час наукових дослщжень рол1 тромбоците в патогенез! ¡шем1чноУ хвороби серця. Отримаш даш можуть бути впроваджеш в педагопчний процес у вузах в1дпов1дного профшо.

Основш пауков! положения, як! винесено иа захист:

1. Структурно-функцюнальш змши тромбоцит перифе-ричноУ кров1 в динам1щ розвитку пперхолестеринем1У мають фаз-ний характер.

2. Емоцшно-больовий стрес е фактором зриву вщносноУ адаптаци тромбоцит до хрошчноУ гшерхолестеринем1У.

3. Морфо-функцшнальш екв1валенти змш систем тромбоцит, яю йизначають Ух реактившсть, за умов виб!ркового та комплексного вплив1в пперхолестеринем!У та емоцшно-больового стресу е стереотипними I вщр1зняються сш'ввадношенням адап-тивних 1 патолопчних зрушень.

Апробащя роботи. Дисертац1я апробована на науковШ кон-ференци клннко-експериментальних вцщшв УкраУнського НД1 кардюлогц ¡м.акад.М.Д.Стражеска 20 травня 1996 р. Основш ма-тер1али викладено та обговорено на науково-практичних конфе-ренщях в УкраУнському НД1 кардюлоги ¡м.акад.М.Д.Стражеска (КиУв, 1993; 1994), науков1й конференцн анатом1в,пстолопв I тоио-графоанатолпв УкраУни (Льв1в, 1995).

Публжаци. За матер1алами дисертацп опублшовано 6 наукових праць.

Обсяг та структура дисертаци. Дисертащя викладена на 151 сторшщ машинописного тексту, складаеться ¡з вступу, роздшт "Огляд л1тератури", "Матер1али та методи доашдження", "Результата власних дослщжень" (7 тдроздшв), "Обговорення отриманих результат", висновюв та списку л1тератури, який мктить 137 джерел втшзняних та ¡ноземних авторов. Робота

2-6-253 7/, з

прошюстрована 11 таблицами, 44 мжрофотогра^мями, 9 графками та 5 пстограмами.

ЗМ1СТ РОБОТИ

МАТЕР1АЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛ1ДЖЕННЯ. Дослвди проведено на 84 безпородних кролях-самцях, з яких 15 тварин склали контрольну трупу .

ГХЕ вщтворювали шляхом утримання тварин на атероген-шй д1ет1 (перорально 0,3 г холестерину _ иигляд! суспензп на со-няшниковш олнна 1,0 кг маси тша тварини щодня). Спостереження проведено в динамщ1 - через два тижш, один мюяць, два М1сящ та чотири мкящ в\д початку екслерименту. Вм1ст холестерину в плазм1 кров1 тварин визначали за методом 1лька (А.А.Покровський, 1969).

Емоцшно-больовий стрес моделювали за модифшованою методикою Ф.З.Меерсона (1984), який запропонував емоцшно-больове подразнення за допомогою електричного струму. 3 шею метою сеаиси електро-больового подразнення проводилися з неод-наковими пром1жками часу - в1д одшеУ до трьох д1б. Тривалють кожного сеансу складала в середньому одну гогтииу — ¿агальнш кшькосп сеанав, що дор1вшовала восьми - дев'яти. У межах кожного сеансу схема електро-больового подразнення була гщибрана емшрично та складалася з р1зних за тривалктю перюдав електро-подразнення, яю чергувалися випадково. Пром1жки м1ж подраз-неннями тривалл вщ 10 с до 3 хв. Тривалшть електроподразнення коливалася в межах вщ 4 до 20 с. При цьому допом1жним ор1енти-ром слугували поведшков1 реакщУ тварин, яю виявлялиея руховим збудженням. Параметрн електричного подразнення були пдабраш з врахуванням даних лтератури. Максимальна вихщна напруга доршшовала 50 В, що забезпечувало ¡мпульси постшного струму силою до 5 шА задано! тривалость

Основним критер1*ем вщтворення стресу слугували змши концентрацп в плазкп кров1 11-оксикортикостеро'1ддв, яку визначали флюорометричним методом за Ю.О.Панковим \ сшвавт. (1965). В наших дослщах було показано, що у ¡нтактних тварин р1вень 11-оксикортикостерощв в плазм1 кров1 до впливу стресу становив 15,4±1,9 мкт/100 Л!л, а одноразовая стресорний вплив збшьшував цеи ноказник до 50,4+4,7 мкг/100 мл, тобто практично в три рази.

Модель комплексного впливу ГХЕ та ЕБС вщтворювали шляхом двомюячного утримання тварин на атерогеннш д1ет! та приеднант через ппсть тижшв вщ початку дослщу стресорпих вгшив1в, як1 тривали впродовж двох останшх тижшв хрошчного екперименту.

Матер1алом для дослщжень слугувала кров тварин, отрима-на з крайово'У вени вуха.

Реактившсть тромбоцита визначали за допомогою лю-мшесцентно-мшроскошчного експрес-методу оцшки Ух морфо-функцюнального стану (ОЛ.Ладшш \ сшвавт.,1988) на люмшес-центному мжроскош МЛ-2.

Люмшесцентно-м1кроскошчне виявлення бтгешшх ампив проводили за методом О.Егапко, Ь.Ка1запеп в модифжащУ е.М.КрохшоУ (1973).

Адгезившсть тромбоцита визначали за Ух прикртленшш до силжонованого скельця (О.Ю.Васильева \ сшвавт.,1983).

Для електронно-мжроскогпчного та електронио-цитох1м1чного дослщжень тромбоцити видшяли шляхом диферен-цШованого центрифугування кров1 з в1дповщшш фжсатором (в залежност? вщ потреб методики) та визначали за Г.Гайером (1974) реакци"шоздатш групи глжокалжсу за допомогою реаюш зв'язування зал1за; актившсть: АЦ, ФДЕ, лужноУ фосфатази, моно-амшооксидази (МАО); наявшсть лшдав в мембран!. Концентра-цио юшв кальцио визначали за методом А. гесЬте181ег (1979).

ГПсля проведения цитсшлпчних реакцш матер1ал додатково фжсували 1% розчином 0б04 у вщпов!дному буферу обезводшова-ли та пом1щали в епоксидш смоли (Б.Ужл1,1973). Ультратонк1 зр1зи, отримаш на ультратом! ЬКВ-8800,неконтрастоваш та кон-трастоваш урашлацетатом 1 цитратом свинцю, переглядали та фо-тографували на електронному мнсроскош ЭМ-125.'

Використовували описов1 та морфометричш методи дослщжень.Вивчали стан глжокалжсу та плазмалеми. Пщрахову-вали вщсотковий вмкт тромбоцита рпних функцюнальних клаав (ФКТ), середню кшьюсть адгезованих поодиноких кров'яних пластинок та Ух агрегата в одному пол! зору, вкпст а-гранул 1 прьинх тшець. 1<лльк1сть зворотньо та незворотиьо активованнх форм сшвв|'дносили до загальноУ кшькосп ФКТ, яку приймали за 100%, а кшьюсть зворотньо та незворотиьо агрегованих тромбоцита 1 аг-

регата мегатромбоцита з разними ФКТ сшввдаюсили до загальноУ кшькосп агрегата кров'яних пластинок. Вм1ст в тромбоцитах продукту реакцн оцшювали нашвкшьшсним методом (Г\Г.Автандтов,1973).

Цифров1 даш обробляли за допомогою метод1в вар'шцШноУ статистики з обчисленням критерпо в1рогщност1 р1зниць за Стью-дентом. В1роп'дною вважали р1зницю при р < 0,05.

РЕЗУЛЬТАТИ ВЛАСНИХ ДОСЛЩЖЕНЬ ТА IX ОБГОВОРЕННЯ Морфо-функщоналышй стан тромбощтв в рвш строки екс-нерименталыюУ пнерхолестеринсми

Дослщження показали, що атерогенна д^ета пщвищуе рь вень холестерину в плазм1 кров1 експериментальних тварин з 1,9 ± 0,1 мМоль/л в нор\п до 10,4±1,1мМоль/л через два тижш ГХЕ, через М1сяць дослщу - 14,2±0,7мМоль/л, два мюящ ГХЕ - 16,0±2,0 мМоль/л, чотири \псящ ГХЕ- 14,б±2,9 мМоль/л.

Даш свпловоУ, лгомшесцентноУ та електронкоУ м1кроскопи свщчать про стадшшсть переб1гу процесу дестабшзашУ морфо-функцшнального стану тромбоцита. Анал1з розподшу кров'яних пластинок за функцюналышми класами, проведений за допомогою люмшесцентних та електронних тромбоцитограм, виявив так! Ух змши. Вщсотковий вм1ст спочиваючих тромбоцита при дзотижне-вш ГХЕ пор1вняно з нормою знижуеться у швтора - два рази, через мкяць спостережень - майже в три рази та бшьш, як у два раз» пор1вияно з двотижневою ГХЕ. Шсля двох лисящв дослщжень Ух кшьккть шдвшцуеться, але становить лише приблизно половину контрольно! велпчини. Через чотири мкящ ГХЕ вм1ст спочиваючих тромбощтв знов набувае тенденцп до зниження (мал.1). Змши вщсоткового вмюту активованих форм тромбоцита мають схожий характер, але протилежну спрямовашсть (мал.2). Зростання кшькосп незворотньо активованих кров'яних пластинок теля мюяця, ГХЕ шшереджае збтьшення кшькоал зворотньо активованих. Через два лпеяф ГХЕ вм1ст зворотньо активованих форм, навпаки, переважле над незворотньо активованими, а теля чогирьох ьпеящв ГХЕ щ показники зр1вшоються (мал.2).

Кшькчсть агрегата тромбощтв в периферичнш кров1, за данный люмшесцентноУ мшроскопи, достовфно зростае через два

(о

1

I

О, <4.

90 80 70 60 50 40 30 20 10 0

1 "^¿а^^

Л*!*"!

Ш

□ Неактивован!

□ А гр е го в а н I

О Д е г рзнульован1

г3^

3^1,1 ¿ъ

Контроль

2 ти ж н 1 ГХЕ

1 м ¡ся ц ь ГХЕ

2 м ¡ся ц I ГХЕ

4 м ¡ся ц I ГХЕ

ЕБС

2 М 1ся Ц1 ГХЕ + ЕБ С

Мал. 1. Зм1ни вм!сту неакгивованих, агрегованих I дегранульованих тромбоците при ^ диференцшованому та комплексному вплив1 ГХЕ та ЕБС за даними електронноТ мкроскопп.

70 60 50 40 30 20 10

НА

□ЗА □ НА

Д—|

Контроль

2 тижн1 ГХЕ

1 М1СЯЦЬ ГХЕ

2 шсяф ГХЕ

4 М1Слц1 ГХЕ

ЕБС

2 ьмсящ ГХЕ+ЕБС

Мал.2. Зм1ни вмюту активованих (А) тромбоцита та Тх зворотньо (ЗА) та незворотньо (НА) активованих форм при диференцмованому та комплексному вплив1 ГХЕ та ЕБС.

мюящ дослщу (норма - 1,5±0,2%; два тижш ГХЕ - 6,6+1,1%; один ьисяць ГХЕ -12,3+0,6%; два мгсящ ГХЕ - 14,9±0,3%). Шсля чоти-рим1сячно-1 ГХЕ IX вмют знижуеться до 11,0±0,2%. За електронно-мжроскошчними даними кшьюсть тромбоцитарних комплекав достовфно збшьшуеться лише шсля мюяця ГХЕ, пот1м настае перюд вщносно'1 стабинзаци Тх в\псту. I тшьки через чотири мкящ ГХЕ кшьюсть агрегата кров'яних пластинок знову зростае (мал. 1).При цьому частка незворотшх агрегага е бшьшою вщ зво-ротшх, як1 переважають лише у тварин з двомгсячною ГХЕ (мал.З).

Отже, лиж результатами люмшесцентно- та електронно-М1кроскошчного анал1зу цих показниюв е розб1жносп, зумовлеш неоднаковою дозволяючою здатшстю й технолопчними особли-востями методик: при електроншй мжроскош1 тест проводиться шсля префжсацн дослщжуваного об'екту, при люмшесцентнш -прижиттсво, коли тромбоцита ще збер1гають реактившсть.

Отримаш дан! дозволяють констатувати так! вар!анти пере-будови й ушкоджень глжокалжсу: поверхнев1 та глибою змши, осередкове руйнування глжокалжсу, поява локальних депозит!в, нашарування на його поверхш аморфних слабкоосмюфшьних суб-станцш. Для поверхневих змш характерен пом1рш нер1вном1рш ко-ливання електронноТ щшьноеп та товщини шару глжокалжсу, а також концентраци некомпенсованих вщ'емних заряд1в, як1 вияв-ляються за допомогою реакци зв'язування зал1за. При глибших змшах щ явища посилюються аж до виникнення дшянок ущшь-непня чи рарифжацп з р1з'ким зниженням спорщненост1 до феризо-лю. Подальше посилення деструктивних зрушень зумовлюе осередкове руйнування глжокалжсу з оголениям плазматичноТ мембрани, що р1зко пщвшцуе и доступшсть для дестабгазуючих фактор1в, як1 накопичуються в кров1 при ГХЕ. Наступний вар1ант змш полягас в появ1 на поверхш кров'яних пластинок пухких слабкоосмюфшьних вщкладень, яю практично нереагують з феризолем. В одних випад-ках вони мають' локальний характер, в шших - вкривають п всю, ¡золюючи вщ звичгого ото1,ення та шби "екранують" тромбоцита. Оиисаш види перебудови глжокалжсу спостер1гаються вже при нанменш тривалш ди ГХЕ. 3 продовженням п впливу переважають ' Т1, що мають деструктивну та. дестабшзуючу спрямовашсть - глибою змпш та руйнування гл!кокалжсу.

о» *

80 70 60 50 40 30 20 10 0

-X,

Л

-Х-,

Г

ИЗАг О НАг

т

г™

т

Контроль 2 тижж ГХЕ 1 мгсяць 2 мшяц| 4 м1сяц'| ЕБС 2 мгсящ

ГХЕ ГХЕ ГХЕ ГХЕ+ЕБС

Мал.З. ЗмЫи вм'юту зворотньо (ЗАг) та незворотньо (НАг) агрегованих тромбоцилв при диференцмованому та комплексному вплив1 ГХЕ та ЕБС.

-X,

X

1

X

1

X

□ ачранули

□ ЩШЫА тгпьця

Л

X

!_т

2 ши ГХЕ

1 мюяць ГХЕ

2мюяц|" ГХЕ

Контроль

Мал.4. Зм1ни вмюту а-гранул ! щтьних ттець при селективней I комплексна ди ГХЕ та ЕБС

4 г.*Лсяц| ГХЕ

ЕБС

2 г.'.!сяц|' ГХЕ+ЕБС

Нани дослщження шдтверджують модифжуючий вплив ГХЕ на плазмалему. Ознаки и надмирного насичення холестерином у вигляд1 мультиламелярних утворень або стовщень виявляються у тварин вже з миимальним строком ГХЕ, посилюються вщповщно тривалост1 дослщу, назважаючи на вщносну стабшзацто ртня холестерину в плазм1 кров1 шсля першого мшяця експерименту.

Змши ппкокалжсу та плазмалеми безпосередньо впливають на функцюнальш властивосп рецепторного апарату та пов'язаних з ним ензим!в (О.М.Юимов,1995; J.A.Koedam,1991). I дшсно, в ди-намщ1 розвитку ГХЕ спостер1гаеться тенденщя до зниження актив-ност! АЦ на плазмалем1, починаючи з двотижнево'У ГХЕ. Проте теля другого \исяця ГХЕ послабления и активування припиняеть-ся. Через чотири мгсящ ГХЕ актившсть АЦ пор1Вняно з поперед-н1ми спостереженнями значно знижуеться.ПодШш тенденщ'У змши активное™ на плазматичнш мембран! тромбоцит!в спостер1гаються 1 в АТФази. Натомють зростае актившсть лужноУ фосфатази, за винятком двом1сячного строку.

В наших дослщах виявлено шдвшцення концентращУ Са2+ на плазмалем1 та ¡нших мембранах тромбощтв, яке вщповщае трива-лост! ГХЕ. Це зумовлюе активування ФДЕ, на що вказують й даш л1тератури (Д.Теппермен \ сшвавт.,1989). Вже теля двох тижшв ГХЕ актившсть ФДЕ в цитоплазм! та матрика а-гранул зростае й поступово посилюеться до кшця дослщження.Таким чином, дисбаланс у функцюнуванш АЦ I ФДЕ - ферментних систем, ям визна-чають р1вень цАМФ, в дйнам1Щ розвитку ГХЕ дозволяе пояснити змши кшы<ост1 тромбоцитарних агрега^в, а також сшввщношення \пж IX зворотньо та незворотньо агрегованими формами.

Нааи'дком зрушень систем, яю визначають стан реактивности тромбощтв за умов тривалоУ ГХЕ, слщ вважати появу екзо-цитозу секреторних. гранул з млявим перебшом. Морфолопчними екв1валентами секрещУ такого типу е, по-перше, дилатащя еле-мент1в зв'язаноУ з поверхнею системи канал1в (ЗПСК), яка посилюеться по мгр1 тривалослт ГХЕ та лише теля двох мюящв стае' дещо пом1рною. По-друге, поява в Ух просвп-ах електроннощшьно-го матер1алу. По-трете, зниження кшькост! а-гранул 1 щшьних тшець, за винятком двомкячноУ ГХЕ, коли Ух вмшт нав!ть переви-щуе нормальний (мал.4). I, насамкшець, яшсш змши вм1сту а-

гранул \ щшьних тшець: вщповщно гомогешзащя Матриксу та ре-дукщя електроннощшьноУ серцевини.

Доказом саме млявого перебшу екзоцитозу може слугувати той факт, що дегранульоваш форми тромбоцитш становлять неве-лику частку серед ¡нших ФКТ (мал.1). Кр1м того, наявшсть подо-вжених а-гранул з виростами, под1бними до псевдоподш, також може свщчити про повшьну реакцш вившьнення. Це явище зумо-влене зниженням в'язкост1 актингранулярного гелю, яке вщбу-ваеться в результат! тдвищення р1вня кальцш в цитозол! (Д.Теппермен I ст'вавт.,1989). Внаслщок цього дитоскелет втрачае здатшсть перем1щувати гранул», порушуючи процес секреци за участю ЗПСК, що, вважають, забезпечуе його миттевкть (В.К.Вашкшель \ сшвавт., 1982). Можливо саме тому в динамщ1 ро-звитку ГХЕ вщповщно до зростання електронноУ щшьносп цито-плазми збшьшуеться частка подовжених а-гранул. Водночас гомогешзащя матриксу цих органел е ознакою готовности кров'яних пластинок до екзоцитозу (Р.Нагпвоп 1 сшвавт.,1990).Проте розши-рення ЗПСК перешкоджае зв'язуванню а елемент з секреторними гранулами, тобто здшсненшо реакщУ вившьнення (В.К.Вашкшель \ сшвавт., ¡982). Отже, в умовах тривалоУ ГХЕ реал1зусться альтерна-тивний шлях секрещУ а-гранул без учасп ЗПСК, на що вказують й шин дослщники (Е.Мо^епз1егп,1985). Це явище можна пояснити, вважаючи, що хрошчна ГХЕ - подразшоючий фактор, ¡нтен-сившсть котрого недостатия для розвитку повноцшноУ реакщУ ви-киду, проте здатна ш'дтримувати екзоцитоз з млявим неребшом.

Початкове пщвищення внутр1шньотромбоцитарноУ кон-центращУ юшв кальцно активуе глжогенол1з (ГГ.Стрижак 1 сшвавт., 1986; К.М.Лакш,1988), вщповщно знижуючи кшьюсть гранул ппкогену, що вщм1чаеться при двотижневш та, частково, при одномкячнш ГХЕ. Це мае адаптивне значения, тому що поси-люеться енергозабезпечення тромбоцита. Але вже за одно- та двомюячноУ ГХЕ й особливо теля чотирьох мкящв пщ впливом надм1рного надходження кальцно в кров'яш пластинки запаси * лабшьного глжогену виснажуються та утворюються його форми, яю важко утшпзуються. Зумовлене дисбалансом активное™ АЦ 1 ФДЕ ймов1рне зниження вмкту цАМФ також сприяе падшню р1вня пнкогенол1зу (P.E.Stenberg, 1984). Кр1м того, в умовах чоти-рим!сячноУ ГХЕ включения кальцпо виявляються в м1тохондр1ях,

що, поряд з IX деструкщею, може негативно позначитися на ресин-тез1 АТФ (Б.Оггепшз \ сшвавт.,1992).

Порушення мехашзм1в стабгшзащУ морфо-функцюнального стану тромбоцита позначилось на гомеостаз! в них бюлопчно активних речовин. При двотижневш ГХЕ у вщповщь на деяке пщвищения вм1сту в кров'яних пластинках норадреналшу спо-стер1гаеться компенсаторне активування МАО, що пщтримуе адек-ватний баланс бюгенних амиив.ГОсля кисяця ГХЕ низька ак-тившсть МАО сприяе шдвищенню вмюту бюгенних акпшв в тромбоцитах,очевидно, внаслщок порушення сшввщношення м1х Ух де-понуванням та катабол1змом. Залежшсть активное^ МАО вщ стану щшышх тшець 1 мггохондрш, серед значноУ частки котрих наявш деструктивш змши, зумовлюе подальший дисбаланс вказаних про-цес^в при бшьш тривалш дн ГХЕ.

Морфо-функцюнальш змши тромбоцита в умовах хрошч-ноУ ГХЕ позначилися також на Ух здатносп адгезуватися до чу-жорщноУ поверхш. Тенденщя до пщвищення кшькосп кров'яних пластинок, прикршлених до силжонованого скельця, виявляеться вже теля двотижневоУ ГХЕ та становить 20,8±1,3 (норма - 19,5±1,5), а через м1сяць ГХЕ вщмшносп вщ норми та попереднього строку ГХЕ стають статистично достов1рними - 25,6±0,7. Проте через два мкящ величина цього показника достов!рно зменшуеться до 11,2±1,3. П\сля чотиримюячноУ ГХЕ кшьюсть адгезованих тромбоцита знову зростае 1 становить 24,3±1,3.

Послабления адгезивноУ здатносл тромбоцита при дво-мюячнш ГХЕ можна пояснити Ух "екрануванням", яке, можливо, ¡золюе рецепторний апарат вщ мшрооточення. Це явище водночас супроводжуеться зниженням на плазмалем1 активное« лужноГ фос-фатази та гндвищенням и р1вня у АЦ, зменшенням юлькоеп а-гранул з гомогенним матриксом. Зумовлеш цими факторами ймов1рне пщвищення 2-потенц1алу кров'яних пластинок \ при-гшчення експреЫУ адгезивних бшюв на поверхш тромбоцита, очевидно, виявилися спроможними знизити Ух адгезившсть.

Одним з пайважлившшх компенсаторних явищ в умовах прискореного зносу та посилення адгезивност1 з неминучим скоро-ченням строку життя тромбоцита; е вихщ в кров Ух мегаформ, кшьюсть яких вщповщае змшам морфо-функцюнального стану тромбоцита в рпш строки ГХЕ, а в иор\п е статистично нечначу-

щою. Так, IX вмют збшьшуеться шсля двох тижшв 1 мюяця ГХЕ (вщповщно 0,5±0,1% та 1,6±0,1%), стабшзуеться через два М1сящ спостережень (1,2±0,2%) та знову достов1рно зростае в останшй груш дослвдв (6,0±0,4%).Поряд з1 збшьшенням кшькэст1 мегатром-бощгпв в кров1 виявляються IX агрегати з р1зними ФКТ, вмют яких стае статистично достов1рним шсля чотирьох мюящв ГХЕ (2,2±0,5%), що слщ вважати зривом адаптивноУ здатност! оргашзму.

Таким чином, в процеа перебудови тромбоцита пщ впли-вом ГХЕ виявляеться декшька стадш. В кшщ першого мюяця вщбуваеться р1зке зниження Ух компенсаторних можливостей, а реактившсть зростае. П1сля двомкячноУ ГХЕ спостер1гаеться ста-бшзащя стану кров'яних пластинок, яка через чотири мкящ експе-рименту переходить до стадп виснаження. Стан тромбоцита шсля двох мкящв експериментальноУ ГХЕ можна розглядати як прояв вщносноУ адаптащУ тромбоцитарноУ ланки гемостазу до ягасно нового р1вня фупкщонування завдяки мобшзащУ та напруженню компенсаторних мехашз\пв.

Змпш показшшв морфо-функщонального стану тромбо-

ЦИПВ ШД ВПЛНВОМ СМОЦШНО-бОЛЬОВОГО стрссу

Так само як I ГХЕ, стрес ¡стотно змшюе морфо-функщональний стан 1 реактившсть тромбоците. Проте шакший характер цього подразника зумовлгое певш кшьмсш та яюсш вщмшносп зрушень у кров'яних пластинках пор!вняно з ГХЕ.

При тривалосп ЕБС лише протягом двох тижшв кшьюсть спочиваючих тромбоците знижуеться, а кшыасть тромбоцитарних комплекав в кров1 зростае в бшьшш \iipi, шж у будь-якш груш з експерименталыюго ГХЕ (мал.1). При цьому кшькють незворотньо агрегованих тромбоцита приблизно в два рази перевищуе кшьюсть зворотньо агрегованих (мал.З). Серед змш глжокалжсу, яю скла-даготься з тих само морфо-функцюнальних вар!'анта, що й в умовах ГХЕ, переважають явища деструкщУ (глибою змши та осередкове руйнування). В плазматичшй мембраш, яка е головною мшешпо стресорного впливу ( W.L.Dean \ сшвавт.,1993) пщвищуеться кон-цснтращя юшв кальцно та виявляються змпш у функщонуванш р1зних ферментних систем, асоцшованих з нею: стимулящя лужноУ фосфатази, пригшчення активное^ АТФази та АЦ.

Стресорне гидвищення р1вня Са2+ в тромбоцитах е фактором адаптаци лише при достатнш потужносп енергозалежних ме-хашзкнв Ух депонування та видалення у позаклшшне середовище (€.1.Соколов,1991). Водночас нанн дослщження засвщчують р1зке зниження резерву глкогену, ознаки пперфункци та деструкци мпо-хондрш, пригшчення активное^ АТФази на плазматичшй мембран!, що в цшому обмежуе ефектившсть цих мехашзм^в i, як на-слщок, неминуче порушуе гомеостаз кальщю в тромбоцитах. В результат! весь комплекс процеав, яю опосередковуються цим вто-ринним месенджером, надкнрно стимулюеться, трансформуючись у фактор альтераци та посилення реактивное^ тромбощтв. Про це свщчить вища, шж в будь-якш серед експериментальних труп з ГХЕ кшью'сть тромбоцнгпв, адгезованих до сшнконованого скельця -27,4±1,1.Надлишок Са2+ сприяе активащУ ФДЕ. Враховуючи випе-реджаюче зростання активное^ цього ферменту пор1вняно з ак-тившетю АЦ, можна припустити, що загальний р1вень цАМФ за умов ЕБС знижуеться.

Пщ впливом Bcix цих подразниюв в тромбоцитах пщтри-муеться екзоцнтоз з млявим nepe6iroM, морфо-функцюнальними екв1валентами якого е зменшення кшькост! а-гранул i щшьних тшець (мал.4) поряд з редукщею Ух електроннощшьноУ серцевини, розширення елеменлв ЗПСК.

Як i при хрошчшй ГХЕ, неминуче скороуення тривалост1 життя тромбощтв при стрес! супроводжуеться надходженням в крои Их молодих форм, BMicT яких становить 2,5±0,5%.

При хрошчному CTpeci в кров'яних пластинках виявляються й деям ознаки Ух адаптацп до нових умов оточуючого середовшца. Про це свщчить зниження пор\вннно з нормою вьисту бюгенних aMiHiB поряд з активуваиням МАО в щшьних тшьцях i неушкодже-них м1тохондр1ях.

Морфо-функцюналышй стой тромбощтв при комплекенш дн гтсрхолсстермпемн та стресу Комплексний вплив хрошчноУ ГХЕ та стресу зумовив ¡стотннш змши морфо-функщоналыюго стану тромбощтв, nix селективна д1я цих фактор1в. Це пщтверджуе припущення про взасмис потенциовання дестабшзуючих ефскт!в даних натогене-тичних чинниюв. Про цс свщчить бшьш значив, шж в ¡нших трупах

спостереження зниження кшькост! неактивованих (мал.1), зворот-ньо активованих (мал.2) та зворотньо агрегованих (мал.З) тромбоцита. HaTOMicTb кшьшсть незворотньо активованих (мал.2) i незворотньо агрегованих (мал.З) кров'яних пластинок достоверно зростае. Загальний вм1ст агрегата тромбоцита також стае вищпм за ГХЕ та ЕБС, хоча пор1вняно 3i стресом недостов1рно (мал. 1).

, Юлыасть мегаформ тромбоцита майже не вццлзняеться вщ, тако'1 при двомюячшй ГХЕ чи ЕБС .(1,9±0,5%), очевидно, набли-жаючись до меж1 можливостей орга!Йзму в цих умовах хрошчного напруження компенсаторпих процеав. Однак в цШ rpyni тварин мегатромбоцити часто були активованими. Кшьшсть Тх агрегата з pi3HHMH ФКТ становила 3,9±1,2%. Бшын того, в мегатромбоцитах виявлялись залишки органел материнськоУ клгпши. Появу незрших форм кров'яних пластинок слщ вважати не тшьки наслщком при-скореного зносу тромбоците та Ух видалення з кров1, але й ознакою ииснаження вщповщних мехашзм1в адаптацн (T.Hervig,1993).

Дестабшзащя тромбоците за цих умов спричишое млявий nepe6ir реакщУ вившьнення, морфо-функщональними екв1валента-ми котрого е pi3i<e розширення ЗПСК, велика кшьшсть подовжених зс-гранул з гомогенним матриксом низькоУ електронноУ щшьносп, редукщя електроннощшьноУ серцевини щшьних тшець, деструк-гивш зрушення в м1тохондр1ях, виснаження резерву р-глн<огену та шкопичення його форм, яш важко шдцаються утил1зашУ.

Наслщком хрошчного подразнення тромбоцита пщ впли-зом ГХЕ та ЕБС е порушення i'x здатносп пщтримувати гомеостаз Зюгенних aMiniB. Це пщтвержуеться зниженням в тромбоцитах miery а-гранул i щшьних тшець (мал.4), i'x пол1морф1змом, при-тйченням aKTHBiiocTi МАО поряд з р1зким зниженням вм1сту адре-шйну та cepoToniny й шдвищенням р1вня норадреналшу.

Комплексний вплив ГХЕ та ЕБС на тромбоцита реал1зуеть-:я, як i в попередшх трупах дослщження, насамперед через пору-иення глшокал1ксу та плазматичноУ мембрани. Явшца деструкщУ ■лн<окал1ксу зустр1чаються частше, а зумовлене ними оголения шазмалеми поеднуеться з и стовщеннями внаслщок убудовування ¡олестерину. Oniicani змши разом з пщвигценням активносп лужноУ [юсфатазн та концентращУ ioHiB кальцно на плазмалем1, ймов1рно, 1нижують заряд поверхш тромбоципв, посилюючи Ух адгезивш шастивосп (35,2±1,4 адгезованих тромбоцита в одному пол1 зору)

та порушуючи функци рецепторних структур. Про це свщчить не-внсока актившсть АЦ та АТФази на шй. У сукупностч з! зниженням активносп АЦ на шших мембранах тромбоцита нер!вном1рне ак-тивування ФДЕ в цитоплазм! та матрика а-гранул могло знижу-вати загальний р1вень цАМФ.

Неоднозначнють мехашзмш реал1заци дестабшзуючоУ дй ГХЕ та ЕБС на тромбоцита (Н.В.Сошна,1991; С.Еей \ сшвавт.,1991) визначае можливють взаемного потенщювання цьо-го ефекту при Ух поеднанш. Тому слщ вважати, що ЕБС посилюе патолопчш змши, зумовлеш ГХЕ, тим самим порушуючи вщносну стабшзащю морфо-функцюнального стану тромбоцита, яка на-ступас июля двом^сячноУ ГХЕ.

висновки

1. Тривалий вплив гтерхолестеринеми та стресу посилюе основш фупкцюпадьш властивосп тромбоцита: активацио, ад-гезио, агрегацио та вившьнення секреторних гранул. Змши тромбоцита при цьому забезпечуються комплексом стереотипних змш, яю вщр1зняються в кожнш з використаних моделей сшввщношен-ням адаптивних \ патолопчних зрушень.

2. Морфо-функцюнальними екв1валентами адаптивних зрушень в тромбоцитах за умов виб1ркового та комплексного впливу ГХЕ та ЕБС е: активування АЦ та МАО, зниження активное^ лужноУ фосфатази та ФДЕ, зменшення резерву лабшьного пшКоге-пу, ппертроф1я мГгохондрш, збшьшення юлькост1 а-гранул з при-родньою гетерогеншстю матриксу та об'ему електроннощшьно'1 серцевнни щшьних тшець.

3. Найбшып значущими патогенетичними чинниками дестабЫзацм тромбоцита е: деструктивш змши ппкокалксу з оголениям плазмалеми, зрушення сшввщношення активност1 АЦ 1 ФДЕ в бк останньоУ, надм1рне накопичення у внутршньоклтш-ному середовииц ¡ошв кальщю, порушення депонування та ката-бол1зму бюгенних амйив, дезоргашзащя процест енергетичного забезпечення функци тромбоцита.

4. Воображениям зрушень тромбоците, зумовлених впли-вом гтерхолестеринеми та емоцшно-больового стресу е пере-розподш Тх за фушсцюнальними класами, а саме: зниження вкйсту

яеактивованих та зворотньо активованих форм,'збшьшення за-гально! кшькост! активованих кров'яних пластинок I незворотшх =1грегат1в. Хрошчне подразнення тромбощтв в умовах тривалоТ ди пперхолестеринеми та стресу спричинюе млявий перебег секрецп, що призводить до IX виснаження та компенсаторного виходу в кров молодих форм - мегатромбоцита.

5. Насичення плазмалеми та мембрани ЗПСК холестерином г стимулюючим фактором морфо-функцюнальноТ перебудови громбоцита в умовах хрошчно'1 пперхолестеринеми. При цьому в змшах кров'яних пластинок вщстежуеться стадшшсть: через два гижш дослщження переважають явища адаптацн; теля мкяця до-мшуготь змнги патолопчного характеру, в кшщ двошсячноУ пперхолестеринеми спостерпаеться стабшзащя '/х стану, яка зриваеться гпсля чотиримкячного перебування експериментальних тварин на атерогеншй д1е'п.

6. Бшьш впражений пор'ишяно з пперхолестеринем1ею цестабЫзуючий вплив емоцшно-больового стресу на тромбоцита зумовлений не ттьки прямою модифнсуючою д1ею на плазматичну мембрану стресорних фактор1в, але й порушенням у робот1 фер-ментних систем, функцюнально пов'язаних з плазмалемою: активу-занням лужно» фосфатази, дисбалансом активност1 АЦ та ФДЕ та гндьищенням в шй концентрацн юшв кальцпо.

7. Поеднання хрошчно! пперхолестеринеми та стресу поенное дестабшзацно морфо-функцюнального стану тромбоцита Ш]:мвняно з селективним впливом цих фактор1в, здатних до взаем-юго потенцновання патолопчних ефекта, що гпдтверджуеться )ривом стану стабшзацн кров'яних пластинок при нашаровувашп ;моцшно-больового стресу на гшерхолестеринелшо.

СПИСОК ПАУКОВИХ ПРАЦЬ, ОПУБЛ1КОВАНИХ ЗА МАТЕР1АЛАМИ ДИСЕРТАЦП

1. Структурно-функциональное состояние тромбоцитов при ;ронической ишемйческой болезни сердца//Клинич. медицина. -.993. - №5. - С.33-41 (ствавт.: О.С.Гавриш, О.В.Серпенко, Г.Ыващенко)

2. Функциональная морфология тромбоцитов при различных формах ишемической болезни сердца //Укр. кардшл. журнал. -1994. - №1. - С.83-89 (сшвавт.: О.С.Гавриш, О.В.Серпенко)

3. Морфофункциональные изменения сосудистого эндотелш и тромбоцитарного звена гемостаза при хроническом стрессе // Укр. кардюл. журнал. - 1995. -№5. - С.55-59 (сгйвавт.: О.С.Гавриш, О.В.Курченко, Н.А.Ящук)

4. Морфология и реактивность тромбоцитов в условиях ко ронарной недостаточности // Материалы науч.-практич. конферен ции "Применение электронной микроскопии в медицине". Киев 1992. - С.11 (сшвавт.: О.С.Гавриш, ТЛЛващенко, Г.А.Лебединська)

5.0собливост1 морфофункцюнального стану тромбоцит!! при хрошчнш ¡шем1чнш XBopoöi серця Н Тези допов1дей ГУ зЪдэ кард1олопв Украши. Дн1пропетровськ, 1993. - С.115 (сшвавт. О.В.Серпенко)

6. Функциональная морфология тромбоцитов при эмоцио нально-болевом стрессе // Матер1али пленуму правлшня Укр. наук товариства кардюлопв "Гостра та хрон1чна серцева недостатшсть раптова смерть". Кшв, 1995. - С.28 (сшват.: О.С.Гавриш О.В.Курченко)

Порадун Е.Н Морфо-функциоиалыше состояние тромбоцитов при экспериментальной гиперхолестеринемии и стрессе. Рукопись. Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.11. - эмбриология, гистология и цитология. Киевский университет имени Тараса Шевченко, Киев, 1996.

, Защищается рукопись дисертации и 6 опубликованных научных работ, в которых изложены и обощены результаты исследований ультраструктурных и функциональных факторов, определяющих нарушения реактивности тромбоцитов при алиментарной гиперхолестеринемии и стрессе. Определены морфо-функцпональные эквиваленты адаптационной и патологической перестройки тромбоцитов в условиях дифференцированного и комплексного влияния гиперхолестеринемии и стресса. При совместном воздействии этих патогенетических факторов наблюдался неадднтивный эффект па реактивность тромбоцитов. Установлена фазпость структурно-функциональных изменений тромбоцитов в динамике развития гиперхолестеринемии.

Poradun О.М. Morplio-functional condition of platelets in experimental hypercholesterolemia and under stress. The manuscript .Thesis to obtain scientific degree of Master of Biological Science in the speciality 03.00.11. - embriology, histology and cytology. Taras Shevchenko Kyiv University, Kyiv, 1996.

The thesis manuscript and 6 published studies, accounting and generalizing the data obtained are defended. The ultrastructural and functional factors determing disoders of platelets' reactivity in alimentary hypercholesterolemia and stress have been investigated and analisc'd. The adapt and pathological morplio-functional equivalents of platelets' changes under separated and simultaneous hypercholesterolemia and stress influence were defined.In condition of simultanious influence of those pathogenetic factors the nonadditive effect on platelets' reactivity was observed. The fases of structural-functional platelets' changes in dinamic of experimental hypercholesterolemia were determed.

Ключов1 слова: тромбоцит», ультраструктура, реактившеть, пперхолестеринемп!, стрес